- TESIS DOCTORAL - PhD thesis (international mention) Estudio de la diversidad de levaduras en uva de cultivo ecológico y convencional en Galicia: patrones biogeográficos e influencia en las características químicas y sensoriales del vino David Castrillo Cachón Study of yeast diversity in organic and conventional grapes from Galicia: biogeographic patterns and influence on the chemical and sensory characteristics of wine - INGENIERÍA DE BIOSISTEMAS - Directora: Dra. Pilar Blanco Camba Tutor: Dr. Juan José Rubio Coque León, 2018 A todos los que como yo en su momento no pudimos iniciar una tesis, Y a los que alguna vez quiebran tus alas y sugieren que no lo conseguirás. Agradecimientos A mi familia, especialmente a Aida y Dani A mi buen amigo Sergio Vélez por ser la razón de iniciar este camino A mi directora Pilar y a todos aquellos que hemos compartido tiempo y conocimiento en la EVEGA: a mi amigo desde entonces Rodrigo por su talento, a Eva, Noemi, Mónica, Mar, María… Por su gran apoyo y trabajo en micro. A los doctores/as Yoli, Emilia, Emiliano, Jose... A los/las de química: Dani, Mónica, Pilar, Elvira, Mariajo… A los/las de viticultura, campo y bodega: Ángela, María, Pili, Tino, Mikel, Manuel... A Maria José, Mimi y Juan… A Andrea, a mis amigos y a todos aquellos que he conocido dentro y fuera de la EVEGA, en las estancias nacionales e Este estudio fue financiado por el proyecto RTA2012- internacionales (Marco, 00021-C03-01 del INIA (Instituto Nacional de Investigación Lorenzo, Alice, Laura, y Tecnología Agroalimentaria) cofinanciado con fondos Mikhayla, Vasilis, Mar…) FEDER. David Castrillo agradece al Instituto Nacional de por su afecto y ayuda. Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), a Thanks to Bauer FF. and la Axencia Galega de Calidade Alimentaria AGACAL, al Varela C. for drawing up the Fondo Social Europeo y al Fondo Europeo de Desarrollo report for international Regional su contrato predoctoral FPI. Gracias a los mention. productores Esther Teixeiro Lemos, Roberto Regal, Cooperativa Cume do Avia, Víctor Diéguez, Begoña Troncoso, María del Carmen Álvarez, José Luis Mateo y José dos Santos Diz por permitirnos recoger muestras en sus explotaciones y a las bodegas de producción ecológica Adega Beatriz, Corisca, Cume do Avia, Diego de Lemos, Pazo de Vieite y Quinta da Muradela, por permitirnos tomar muestras en sus instalaciones. Gracias a los Consellos Reguladores de las Denominaciones de Origen Monterrei, Rías Baixas, Ribeira Sacra, Ribeiro Valdeorras y a las bodegas que amablemente facilitaron las muestras de vino. David Castrillo Cachón, 2018 4 Estudio de la diversidad de levaduras en uva de cultivo ecológico y convencional en Galicia: patrones biogeográficos e influencia en las características químicas y sensoriales del vino Abreviaturas Alb: variedad de uva Albariño Bra: variedad de uva Brancellao Con: convencional, de producción convencional DO: Denominación de Origen DOs: Denominaciones de Origen Eco: ecológico, de producción ecológica FA: fermentación alcohólica Fi: fase inicial de la fermentación Ff: fase final de la fermentación FML: fermentación maloláctica Ft: fase tumultuosa de la fermentación Men: variedad de uva Mencía Mo: Denominación de Origen Monterrei NLV/mL: número de levaduras viables por mililitro Org: ecológica/o (del inglés organic) Ri: Denominación de Origen Ribeiro RB: Denominación de Origen Rías Baixas RS: Denominación de Origen Ribeira Sacra Trx: variedad de uva Treixadura UFC/mL: unidades formadoras de colonia por mililitro VD: Denominación de Origen Valdeorras Codificación UNESCO Conforme a lo establecido en el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, el código UNESCO en el que mejor se puede englobar esta tesis doctoral es: 330992 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA DE LOS PROCESOS FERMENTATIVOS. David Castrillo Cachón, 2018 5 Índice Índice Abreviaturas 5 Codificación UNESCO 5 Summary; PhD thesis (international mention) 10 Introduction 10 Justification and aims 13 Methodology 14 Results and discussion 19 Conclusions 32 Prospects for the future 34 Acknowledgments 34 References 35 Resumen 38 1. Introducción 41 1.1. La vitivinicultura ecológica en la actualidad 41 1.1.1. La vitivinicultura ecológica en el mundo, Europa y España 41 1.1.2. Particularidades de la vitivinicultura ecológica y legislación vigente 42 1.2. Efectos de la producción ecológica en la vitivinicultura 43 1.2.1. Efecto de la producción ecológica sobre la diversidad microbiana de la uva 44 1.2.2. Efecto de la producción ecológica sobre la composición química y la calidad del vino 45 1.2.3. Efecto de la producción ecológica sobre las propiedades saludables del vino y la percepción de los consumidores 47 1.3. Papel de las levaduras en la elaboración de los vinos 48 1.3.1. Origen de las levaduras presentes en la vinificación 48 1.3.2. Dinámica de la población de levaduras en la vinificación 51 1.3.3. Transformaciones bioquímicas e interacciones de microorganismos en la vinificación 53 1.3.4. Efecto de la fermentación espontánea o dirigida por levaduras autóctonas sobre las características químicas y sensoriales del vino 55 1.4. Perfil aromático y sensorial de los vinos 56 1.4.1. Principales compuestos aromáticos de la uva y el vino 58 1.4.2. Metabolismo de las levaduras: contribución al perfil aromático y sensorial de los vinos 59 1.4.3. Contribución de la microbiota oral a la percepción del aroma del vino 66 1.5. La diferenciación, tipicidad y calidad de los vinos 66 1.5.1. Las levaduras como recurso microbiano en la diferenciación de los vinos 66 1.5.2. Contribución de las levaduras no-Saccharomyces a la calidad y tipicidad de los vinos 67 1.5.3. Particularidades de la inoculación de cepas no-Saccharomyces 70 1.5.4. El concepto de terroir microbiano y la tipicidad de los vinos 71 1.5.5. Levaduras alterantes de la calidad de los vinos 73 1.6. La viticultura ecológica y el sector del vino en Galicia 74 1.6.1. Principales variedades de vid de cultivo tradicional en Galicia 75 2. Justificación y objetivos 79 3. Material y métodos 82 David Castrillo Cachón, 2018 6 Estudio de la diversidad de levaduras en uva de cultivo ecológico y convencional en Galicia: patrones biogeográficos e influencia en las características químicas y sensoriales del vino 3.1. Origen de las uvas y diseño del muestreo 82 3.1.1. Datos climatológicos de las zonas de muestreo 82 3.1.2. Selección y características de las parcelas 84 3.2. Procesamiento de las muestras y análisis realizados 86 3.3. Análisis microbiológico 87 3.3.1. Medios de cultivo 87 3.3.2. Recuento y aislamiento de levaduras en uva, mosto y fermentación procedentes del viñedo 88 3.3.3. Recuento y aislamiento de cepas de S. cerevisiae en bodegas de producción ecológica 89 3.3.4. Caracterización tecnológica de las cepas de S. cerevisiae aisladas en bodegas de producción ecológica 90 3.3.5. Análisis microbiológico de vinos ecológicos y convencionales de las cinco DOs de Galicia 90 3.3.6. Identificación genética de las levaduras 91 3.4. Análisis químico 94 3.4.1. Análisis químico de la riqueza fenólica de la uva (Cromoenos) 94 3.4.2. Análisis químico de los mostos 95 3.4.3. Análisis químico de los vinos 95 3.4.4. Análisis de compuestos volátiles en vinos por cromatografía de gases (detección FID-MS) 95 3.5. Fermentaciones 97 3.5.1. Fermentaciones espontáneas naturales de mosto ecológico y convencional 97 3.5.2. Diversidad de levaduras S. cerevisiae en bodegas de producción ecológica 98 3.5.3. Fermentación de mosto Treixadura con levaduras no-Saccharomyces autóctonas de Galicia 99 3.5.4. Fermentación en bodega con las cepas de las levaduras seleccionadas 100 3.6. Análisis sensorial de los vinos 100 3.6.1. Análisis sensorial de vinos ecológicos y convencionales 100 3.6.2. Fichas de cata y proceso de evaluación 102 3.6.3. Análisis de las propiedades sensoriales de los vinos elaborados en EVEGA mediante inoculación secuencial de levaduras no-Saccharomyces y Saccharomyces 105 3.7. Análisis estadístico. 105 3.7.1. Análisis de varianza (ANOVA de una vía). 105 3.7.2. Índices de biodiversidad (H’, 1-D, E) 106 3.7.3. Análisis de similaridad (ANOSIM de una y dos vías) 106 3.7.4. Análisis de porcentajes de similaridad (SIMPER) 107 3.7.5. Análisis no paramétrico PERMANOVA (NPMANOVA) de una y dos vías 107 3.7.6. Análisis de Componentes Principales (ACP) y Análisis de Correspondencias (AC) 108 3.7.7. Análisis de Coordenadas Principales (ACoP) 108 3.7.8. Análisis de Correspondencia Canónica (ACC) 108 3.7.9. Análisis de correlación (Pearson) y regresión lineal de mínimos cuadrados (PLS) 109 3.7.10. Análisis de conglomerado jerárquico: dendrogramas y árboles filogenéticos 109 3.7.11. Análisis estadístico de los compuestos volátiles 109 3.7.12. Análisis estadístico de los datos obtenidos en el análisis sensorial 110 4. Resultados y discusión 113 4.1. Influencia del sistema de producción sobre las características de los mostos 113 4.1.1. D.O. Monterrei: variedades Treixadura y Mencía 113 4.1.2. D.O. Ribeiro: variedades Treixadura y Brancellao 114 4.1.3. D.O. Ribeira Sacra: variedad Mencía 115 4.1.4. D.O. Rías Baixas: variedades Albariño y Treixadura 116 David Castrillo Cachón, 2018 7 Índice 4.1.5. Caracterización fenólica de uvas tintas de cultivo ecológico y convencional 118 4.2. Diversidad de levaduras en uva, mosto y fermentación: influencia del sistema de producción 122 4.2.1. Influencia del sistema de cultivo en la población de levaduras en mostos: evaluación cuantitativa 122 4.2.2. Influencia del sistema de cultivo en la riqueza de especies de levadura 126 4.2.3. Diversidad de levaduras a nivel cualitativo: presencia de las distintas especies 131 4.2.4.