BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HÀ MINH HIỂN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT PHENOL TỪ NHỰA VÀ VỎ QUẢ MÙ U ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh- Năm 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HÀ MINH HIỂN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT PHENOL TỪ NHỰA VÀ VỎ QUẢ MÙ U ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc Mã số: 62.73.15.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ 2. TS. Nguyễn Văn Thị TP Hồ Chí Minh- Năm 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Minh Hiển Hà Minh Hiển MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa i Lời cam đoan ii Mục lục iii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iv Danh mục các bảng vii Danh mục các hình, biểu đồ, sơ đồ, đồ thị ix MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Sơ lược về cây Mù u 4 1.2. Sơ lược về hợp chất phenol 13 1.3. Tình hình nghiên cứu về hợp chất phenol từ quả Mù u 16 1.4. Một số phương pháp phân tích hợp chất phenol từ Mù u 19 1.5. Một số khái niệm về chất chuẩn đối chiếu 21 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. Đối tượng 26 2.2. Nguyên vật liệu 26 2.3. Dung môi, hóa chất và thiết bị thí nghiệm 27 2.4. Phương pháp nghiên cứu 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 41 3.1. Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u 41 3.2. Thử tác dụng kháng khuẩn các cao chiết từ nhựa và vỏ quả Mù u 44 3.3. Phân lập các hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u 45 3.4. Xác định cấu trúc các hợp chất phenol phân lập được 48 3.5. Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu 61 3.6. Xây dựng và thẩm định phương pháp GC-MS xác định calophyllolid trong cao 76 methanol chiết từ nhựa Mù u (Phương pháp 1) 3.7. Xây dựng và thẩm định phương pháp GC-MS xác định calophyllolid trong vỏ quả Mù 83 u (Phương pháp 2) 3.8. Xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC-DAD định lượng calophyllolid trong chế 89 phẩm dầu Mù u Inopilo CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 96 4.1. Chiết xuất hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u 96 4.2. Thử tác dụng kháng khuẩn các cao chiết từ nhựa và vỏ quả Mù u 97 4.3. Phân lập hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u 97 4.4. Xác định cấu trúc hợp chất phenol phân lập được bằng phương pháp phổ nghiệm 98 4.5. Xác định thành phần hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u 102 4.6. Thiết lập chất chuẩn đối chiếu 106 4.7. Các phương pháp ghép nối sắc ký-phổ nghiệm xác định hợp chất phenol trong nhựa, vỏ 108 quả Mù u và thuốc từ Mù u KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 110 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMDIS Automated Mass spectral Deconvolution and Identification System br Đỉnh giãn rộng (broad) CDCl3 Cloroform deuteri hóa CD3OD Methanol deuteri hóa 13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 COSY COrrelation SpectroscopY d Đỉnh đôi (doublet) dd Đỉnh đôi kép (doublet of doublets) DAD Detector dãy diod quang (Diode Array Detector) DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO-d6 Dimethyl sulfoxid deuteri hóa EI-MS Phổ khối lượng-ion hóa bắn phá electron (Electron Impact Mass Spectrometry) EMEA European Medicines Agency ESI-MS Phổ khối lượng-ion hóa phun mù electron (Electrospray Ionization-Mass Spectrometry) EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol EU Liên minh châu Âu (European Union) FDA Cơ quan Thực Dược phẩm Hoa kỳ (Food and Drug Administration) FHH Forum for the Harmonization of Herbal Medicine FTIR Hồng ngoại chuyển đổi Fourier (Fourier Transform Infrared) GC-MS Sắc ký khí ghép khối phổ (Gas Chromatography- Mass Spectrometry) HIV Human Immunodeficiency Virus HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence 1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence HRESI-TOFMS Phổ khối lượng thời gian bay-ion hóa phun mù electron phân giải cao (High Resolution Electrospray Ionization-Time Of Flight Mass Spectrometry) ICH Hội nghị quốc tế về hòa hợp (International Conference on Harmonization) ICP-MS Khối phổ plasma cảm ứng (Inductively Coupled Plasma- Mass Spectrometry) IR Hồng ngoại (Infrared) LC-MS Sắc ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography- Mass Spectrometry) m Đỉnh đa (multiplet) MDL Giới hạn phát hiện nhỏ nhất (Minimum Detection Limit) MeCN Acetonitril MeOH Methanol MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration) MRSA Staphylococcus aureus đề kháng methicilin (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry) NIST Viện Công nghệ và Tiêu chuẩn Quốc gia Hoa kỳ (National Institute of Standards and Technology) NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) Pđ. Phân đoạn PLE Chiết lỏng dưới áp suất (Pressurized Liquid Extraction) q Đỉnh bốn (quartet) Rf Hệ số di chuyển (Relative to front) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) s Đỉnh đơn (singlet) SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) SIM Ion lựa chọn kiểm tra (Selected Ion Monitoring) t Đỉnh ba (triplet) TGA Phân tích nhiệt trọng lượng (Thermogravimetric Analysis) TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) TMS Tetramethyl silan TT Thuốc thử tt/tt Thể tích/thể tích USP Dược điển Mỹ (United States Pharmacopoeia) UV-Vis Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet-Visible) VLC Sắc ký lỏng chân không (Vacuum Liquid Chromatography) WHO Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization) max Bước sóng hấp thu cực đại max Số sóng hấp thu cực đại DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng số Tên bảng Trang 1.1. Phân loại các hợp chất phenol theo Harborne 13 2.1. Tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn đối chiếu theo WHO 37 2.2. Các yếu tố và mức để chọn điều kiện xử lý mẫu 39 2.3. Thiết kế thí nghiệm chọn điều kiện xử lý mẫu 39 3.1. Kết quả chiết xuất hợp chất phenol từ vỏ quả Mù u bằng PLE và soxhlet 43 3.2. Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn của cao chiết từ nhựa và vỏ quả Mù u 44 3.3. Bảng dữ liệu phổ NMR của hợp chất N1 (CD3OD và DMSO-d6, máy 500 49 MHz) 3.4. Bảng dữ liệu phổ NMR của hợp chất N2 (CD3OD, máy 500 MHz) 51 3.5. Bảng dữ liệu phổ NMR của hợp chất N3 (CDCl3, máy 500 MHz) 54 3.6. Dữ liệu độ dài liên kết tiêu biểu của hợp chất N3 56 3.7. Dữ liệu độ dài và góc liên kết hydrogen của hợp chất N3 57 3.8. Bảng so sánh dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của calophyllolid điều chế 64 được với tài liệu tham khảo 3.9. Kết quả khảo sát % diện tích của các tạp chất hữu cơ tại một số bước sóng 66 3.10. Tính phù hợp của hệ thống HPLC-DAD (n=6) 67 3.11. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của tạp chất 1 (1); calophyllolid (2); tạp 69 chất 2 (3) 3.12. Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian của phương pháp 70 3.13. Độ tinh khiết calophyllolid trong quá trình đóng lọ 71 3.14. Kết quả xác định độ tinh khiết của calophyllolid tại 3 phòng thí nghiệm 72 3.15. Khảo sát chương trình nhiệt độ cột 76 3.16. Tính phù hợp của hệ thống GC-MS (n=6) trong phương pháp GC-MS 78 (phương pháp 1) 3.17. Tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của calophyllolid trong phương 80 pháp GC-MS (phương pháp 1) 3.18. Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian của phương pháp GC - 81 MS (phương pháp 1) 3.19. Kết quả độ đúng của phương pháp GC-MS (phương pháp 1) 82 3.20. Tính phù hợp của hệ thống GC-MS (n=6) trong phương pháp GC-MS 85 (phương pháp 1) 3.21. Tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của calophyllolid trong phương 85 pháp GC-MS (phương pháp 1) 3.22. Kết quả độ lặp lại của phương pháp GC-MS (phương pháp 2) 86 3.23. Kết quả độ đúng của phương pháp GC-MS (phương pháp 2) 87 3.24. Kết quả thí nghiệm chọn điều kiện chuẩn bị mẫu 90 3.25. Tính phù hợp của hệ thống HPLC-DAD (n=6) 90 3.26. Tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của calophyllolid trong phương 92 pháp HPLC-DAD 3.27.