Institut für Nutzpflanzenwissenschaften und Ressourcenschutz - Fachbereich Pflanzenernährung - der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Entwicklung, Optimierung, Validierung und Automatisierung eines Immunoassays zur sensitiven Detektion des endokrinen Disruptors 17 β-Östradiol im Wasserkreislauf Inaugural – Dissertation zur Erlangung des Grades Doktor der Agrarwissenschaften (Dr. agr.) der Hohen Landwirtschaftlichen Fakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität zu Bonn vorgelegt am 14.12.2006 von Therese Hintemann aus Bonn Referent: PD Dr. R.J. Schneider Korreferent: Prof. Dr. W. Amelung Tag der mündlichen Prüfung: 09. Februar 2007 Unsinn und Sinn Du suchst und suchst. Und kannst den Sinn nicht finden. Gib’s auf; denn so wirst du ihn nicht ergründen. Pfeif dir ein Liedchen, träume vor dich in, wie oft enthüllt im Un-Sinn sich der Sinn! (Mascha Kaléko) Zusammenfassung Entwicklung, Optimierung, Validierung und Automatisierung eines Immunoassays zur sensitiven Detektion des endokrinen Disruptors 17 β-Östradiol im Wasserkreislauf Über kommunale Abwässer und die Ausbringung tierischer Düngemittel (z.B. Gülle und Mist) kann das natürliche Sexualhormon 17 β-Östradiol (E2) in den Wasserkreislauf gelangen und stellt dort auf Grund seiner hohen endokrinen Wirksamkeit ein Risikopotential für Mensch und Umwelt dar. Bisher werden zur Bestimmung von E2- Konzentrationen in der Regel zeit- und kostenaufwändige chromatographische Verfahren angewendet. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einfacher, sensitiver sowie zeit- und kostengünstiger Messverfahren, welche eine Routineüberwachung von Gewässern praktikabel machen. Im Rahmen dieser Studie wurde ein Immunoassay (ELISA) für die sensitive Detektion von E2 im Wasserkreislauf entwickelt. Bei der Optimierung wurden die Effekte der Faktoren Inkubationszeit und Tracerverdünnung auf die Nachweisempfindlichkeit quantifiziert, von denen letzterer den größten Einfluss aufwies. Ebenfalls wurde der Effekt von Matrix und Konservierungsmethoden für die Proben auf die messbaren E2-Konzentrationen untersucht. Es zeigte sich, dass Matrixeffekte zu Fehlern bei der Bestimmung der E2- Konzentration führten und Lagerungseffekte durch die hier untersuchten Konservierungsmethoden nicht ausgeschlossen werden konnten. Zur Erhöhung der Präzision und damit der Nachweisempfindlichkeit wurde der entwickelte manuelle E2-ELISA automatisiert. In Zusammenarbeit mit der Firma quo data wurde ein Immunoassay-Automat (ESTR-A-LISER) entwickelt und für die automatische Durchführung des E2-ELISA optimiert. Basis dieses Automaten ist eine Pipettiereinheit, die randomisiertes Arbeiten sowie eine zeit- und mengenexakte Pipettierung ermöglichen soll. Ebenfalls in die Arbeitsstation integriert sind ein Photometer, das die automatische Messung der optischen Dichte zulässt und eine Auswertesoftware, welche Trendkorrekturen vornimmt. In einer Feldstudie zur Validierung beider Messverfahren wurden die E2-Konzentrationen in Oberflächengewässern und Kläranlagenabläufen mit dem ELISA zum einen nach einer Anreicherung der Proben manuell, zum anderen direkt mit Hilfe des ESTR-A-LISER bestimmt. Dabei konnte mit Anreicherung der Proben bei manueller Durchführung eine Nachweisgrenze von 0,14 ng L-1 erreicht werden. Mit dem Automaten wurden, bei probenspezifischer Berechnung, Nachweisgrenzen bis zu 0,3 ng L-1 erreicht und zusätzlich das 95 %-Konfidenzinterval der Messwerte ermittelt. Beide Messmethoden zeigten eine gute Übereinstimung der Ergebnisse. In den Kläranlagenabläufen konnten E2- Konzentrationen von 0,6 ng L-1 bis 51 ng L-1 nachgewiesen werden, während in den Oberflächengewässern zwischen 0,2 und 9,2 ng L-1 gemessen wurden. Die in dieser Studie entwickelten Messverfahren für E2 stellen beide einfache und kostengünstige Instrumente dar. Dies ermöglicht zukünftig die Schaffung einer breiten und repräsentativen Datengrundlage über die E2-Belastungen in Gewässern und deren Zuläufen, welche für die Risikobewertung und damit für einen nachhaltigen Gewässerschutz unabdingbar ist. Abstract Development, optimisation, validation and automation of an immunoassay for the sensitive detection of the endocrine disruptor 17 β-estradiol in the water cycle The endogenous sex hormone 17 β-estradiol (E2) can enter the water cycle via sewage and organic fertiliser, thus posing a potential risk for humans and the environment because it is one of the most potent endocrine disrupting compounds. E2 concentrations are currently measured using time consuming and expensive chromatographic methods. Therefore, the aim of this study was to develop analytical methods that are simple, sensitive, as well as efficient and less expensive. Within the scope of this work, an immunoassay (ELISA) was developed and optimised for the sensitive detection of E2 in the water cycle. Furthermore, the influences of incubation time and tracer concentration on sensitivity were quantified, with the latter showing the more significant effect. Furthermore, the influence of matrix and sample conservation methods on the measurable E2 concentration were studied. The findings show that the matrix may influence the error of the results, and that the storage effects of the examined conservation methods cannot be neglected. The manual E2-ELISA was then automated in order to improve its precision and sensitivity. The automated instrument (ESTR-A-LISER) was developed in co-operation with the company quo data and optimised for the performance of the E2 ELISA. The ESTR-A- LISER consists of a robotic workstation which enables randomisation and accurate pipetting both in time and volume. A photometer for the direct measurement of optical density, as well as software which performs trend adjustments, are also included. During the field study E2 concentrations in several surface waters and effluents from sewage treatment plants were measured both using the manual ELISA (after enrichment of the samples) and directly using the ESTR-A-LISER. By preconcentration of the samples and applying the manual ELISA, a detection limit of 0.14 ng L-1 could be established. The ESTR-A-LISER enables sample specific detection limits down to 0.3 ng L-1 and additionally specifies the 95 % confidence level for the results. E2 concentrations in the effluent samples were between 0.6 ng L-1 and 51 ng L-1 and for surface waters between 0.2 und 9.2 ng L-1. Both the manual E2 ELISA developed in this study and its automation, are simple and cost effective instruments for the sensitive detection of E2. In the future this will allow the creation of a broad and representative data base on the occurence of E2 in water bodies and their influents which is indispensable for risk assessment and sustainable water protection. I Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ..........................................................................1 2 Grundlagen........................................................................3 2.1 Endokrine Disruptoren.............................................................................. 3 2.2 Das Hormon 17 β-Östradiol........................................................................ 4 2.2.1 Eintragswege in die Umwelt......................................................................... 7 2.2.1.1 Häusliche Abwässer .................................................................................... 7 2.2.1.2 Landwirtschaftliche Tierproduktion............................................................... 8 2.2.2 Abbau- und Sorptionsprozesse...................................................................10 2.2.2.1 Boden.........................................................................................................11 2.2.2.2 Kläranlagen ................................................................................................13 2.2.3 Auswirkungen auf die Umwelt.....................................................................18 2.2.4 Vorkommen in der aquatischen Umwelt......................................................22 2.3 Immunoassays..........................................................................................24 2.3.1 Testsysteme ...............................................................................................24 2.3.2 Antikörper ...................................................................................................28 2.3.3 Antigen-Antikörperbindung .........................................................................29 2.3.4 Affinitätslimitierung......................................................................................32 2.3.5 Sensitivität ..................................................................................................32 2.3.6 Auswertung von Immunoassays .................................................................34 2.3.6.1 4-Parameter-Kurve .....................................................................................34 2.3.6.2 Kenndaten ..................................................................................................37 2.3.7 Selektivität ..................................................................................................38 2.3.8 Validierung und Qualitätssicherungskonzepte ............................................39 2.3.9 Matrixeffekte...............................................................................................41 2.3.10 Lösungsmittel und Konservierungsmethoden .............................................43 2.3.11 Automatisierung von Immunoassays ..........................................................44