Genexpressionsanalyse boviner mesenchymaler Stammzellen und deren in vitro differenzierten Folgelinien Dissertation zur Erlangung des Grades Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) am Fachbereich Biologie der Johannes Gutenberg-Universität in Mainz Martin Schulze Geboren am 05. April 1981 in Essen Mainz, August 2015 I DEKAN UND PRÜFUNGSKOMMISSION Dekan: Prof. Dr. XXX 1. Berichterstatter: Prof. Dr. XXX 2. Berichterstatter: Prof. Dr. XXX Tag der mündlichen Prüfung: II INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS 1 Einleitung ...................................................................................................................... 1 1.1 Stammzellen und ihre Nutzung in Medizin und Forschung ......................... 1 1.2 Mesenchymale Stammzellen als Vertreter der adulten Stammzellen ........... 6 1.3 Genexpressionsanalyse im Hochdurchsatz mittels Microarrays und Sequenziertechniken der neuen Generation ............................................................... 11 1.4 Bioinformatische Auswertung von NGS Daten zur Genexpressionsanalyse 21 1.5 Zielsetzung ........................................................................................................... 23 2 Material und Methoden ............................................................................................. 25 2.1 Isolation Mesenchymaler Stammzellen aus dem Knochenmark des Rindes 25 2.2 Charakterisierung der Zellkulturen ................................................................. 26 2.2.1 Immunohistochemische Färbungen von undifferenzierten MSC ........ 27 2.2.2 Charakterisierung von MSC durch Nachweis zelllinientypischer Transkripte mittels RT-PRC und Sanger Sequenzierung ..................................... 28 2.3 Differenzierung Mesenchymaler Stammzellen .............................................. 31 2.3.1 In vitro Differenzierung von undifferenzierten MSC zu Adipozyten . 31 2.3.2 In vitro Differenzierung von undifferenzierten MSC zu Osteoblasten 32 2.3.3 In vitro Differenzierung von undifferenzierten MSC zu Chondrozyten 33 2.4 Charakterisierung von aus MSC differenzierten Folgelinien ....................... 34 2.4.1 Nachweis chondrogener Differenzierung durch Alcian Blue Färbung 34 2.4.2 Nachweis Adipogener Differenzierung durch Oil Red O Färbung ..... 35 2.4.3 Nachweis Osteogener Differenzierung durch Alzarin Red S Färbung 35 2.5 Herstellung, Hybridisierung und Auswertung von Plasmid – DNA Microarrays zur Genexpressionsanalye ...................................................................... 36 III INHALTSVERZEICHNIS 2.5.1 Gewinnung der Plasmid – DNA Sonden durch Retransformation chemisch kompetenter Zellen ................................................................................... 37 2.5.2 Isolation von Plasmid-DNA im 96er Format .......................................... 38 2.5.3 Herstellen der Plasmid-DNA Microarrays durch Spotten .................... 38 2.5.4 Lineare Amplifikation von mRNA in zwei aufeinanderfolgenden Schritten ....................................................................................................................... 39 2.5.5 Hybridisierung, Scan und Auslesen der Plasmid-DNA Microarrays . 41 2.5.6 Auswertung der Plasmid-DNA Microarrays .......................................... 42 2.6 Genexpressionsanalyse mittels Illumina NGS Sequenzierungen (RNA – Seq) 43 2.6.1 Kartierung von Sequenzen gegen annotierte Bereiche des Rindergenoms mit Hilfe der CLC Genomics Workbench ......................................... 46 2.6.2 BLASTn Abgleich der Illumina Sequenzen mit der NCBI Unigene Datenbank des Rindes ............................................................................................... 47 2.6.3 Assemblierung von Illumina Sequenzen und Annotation der Contigs mittels BLASTn Abgleich mit der Refseq RNA Datenbank ................................. 49 2.6.4 Bestimmung differenzieller Genexpression ............................................ 50 2.7 Einordnung der Genexpressionsprofile in einen übergeordneten biologischen Kontext ...................................................................................................... 51 2.7.1 GLobaler Vergleich der Genexpressionsprofile ...................................... 52 2.7.2 Analyse der Genexpression – FAC der 100 stärkstexprimierten Gene mittels DAVID ............................................................................................................ 53 2.7.3 Analyse differenziell exprimierter Gene – Abgleich mit biologischen Pathways und Zuordnen der Genontologie ........................................................... 54 2.7.4 Assemblierung von unkartierten Sequenzen und Charakterisierung noch nicht annotierter Transkripte .......................................................................... 55 2.8 Übersicht über die bioinformatischen Hilfsmittel .......................................... 57 2.9 Puffer und Lösungen .......................................................................................... 59 3 Ergebnisse .................................................................................................................... 60 3.1 Isolierung und in vitro Kultur Mesenchymaler Stammzellen ....................... 60 3.2 Charakterisierung Mesenchymaler Stammzellen .......................................... 61 3.2.1 Nachweis MSC typischer Antigene mittels Immunohistochemie und Test auf Mycoplasmen Kontamination ................................................................... 61 3.2.2 Nachweis MSC typischer Transkripte durch RT-PCR ........................... 62 3.3 In vitro Differenzierung der MSC ..................................................................... 65 3.3.1 Adipogene Differenzierung der MSC ...................................................... 65 IV INHALTSVERZEICHNIS 3.3.2 Osteogene Differenzierung der MSC ....................................................... 66 3.3.3 Chondrogene Differenzierung der MSC.................................................. 68 3.4 RNA - Präparation und RNA - Amplifizierung ............................................. 69 3.4.1 Präparation von Gesamt-RNA aus Zellkulturen .................................... 70 3.4.2 Lineare Amplifikation von RNA .............................................................. 71 3.5 Bestimmung differenzieller Genexpression mittels Plasmid - DNA Microarrays ...................................................................................................................... 73 3.5.1 Herstellung der Plasmid-DNA Microarrays ........................................... 74 3.5.2 Bestimmung differenzieller Genexpression mittels Microarrays – Vergleich von undifferenzierten MSC und Osteoblasten ..................................... 76 3.5.3 Bestimmung differenzieller Genexpression mittels Microarrays – Vergleich von undifferenzierten MSC und Chondrozyten .................................. 77 3.5.4 Bestimmung differenzieller Genexpression mittels Microarrays – Vergleich von undifferenzierten MSC und Adipozyten ...................................... 79 3.6 Genexpressionsanalyse mittels Illumina Hochdurchsatz Sequenzierung – Prozessieren der Rohdaten ............................................................................................ 79 3.6.1 Prozessieren der Rohdaten und Annotation der Sequenzen – Kartierung gegen das Rindergenom........................................................................ 81 3.6.2 Prozessieren der Rohdaten und Annotation der Sequenzen – BLASTn Abgleich mit der UG-Datenbank des Rindes ......................................................... 82 3.6.3 Prozessieren der Rohdaten, Assemblierung und Annotation der Konsenussequenzen – BLASTn Abgleich mit der refseq-RNA Datenbank ....... 83 3.6.4 Globaler Vergleich der Experssionsprofile aller Zelllinien ................... 84 3.7 Read-Count basierte Analyse der Genexpression mittels RNA-Seq ........... 86 3.7.1 Expression von zelllinientypisch exprimierten Markergenen .............. 87 3.7.2 Funktionelle Annotation stark exprimierter Gene – Junge MSC ......... 90 3.7.3 Funktionelle Annotation stark exprimierter Gene – Adipogenese ...... 92 3.7.4 Funktionelle Annotation stark exprimierter Gene – Osteogenese ....... 94 3.7.5 Funktionelle Annotation stark exprimierter Gene – alte MSC ............. 97 3.7.6 Funktionelle Annotation stark exprimierter Gene – Chondrogenese . 99 3.8 Analyse differenziell exprimierter Gene mittels RNA-Seq ......................... 100 3.8.1 Differenzielle erhöhte Genexpression in jungen MSC ......................... 103 3.8.2 Differenziell erhöhte Genexpression in Adipozyten ........................... 105 3.8.3 Differenziell erhöhte Genexpression in Osteoblasten und alten MSC 107 3.8.4 Differenziell erhöhte Genexpression in Chondrozyten ....................... 110 V INHALTSVERZEICHNIS 3.9 Charakterisierung unbekannter Transkripte ................................................ 110 4 Diskussion ................................................................................................................. 116 4.1 Primärkultur undifferenzierter MSC ............................................................. 117 4.2 In vitro Differenzierung von MSC und Genexpressions-analyse differenzierungsspezifischer Markergene ................................................................. 120 4.2.1 Adipogene Differenzierung von MSC ................................................... 121 4.2.2 Osteogene Differenzierung von MSC .................................................... 122 4.2.3 Chondrogene Differenzierung von MSC ..............................................