Phylogeny and sequestration of iridoid glycosides in selected genera of the Mecininae (Coleoptera, Curculionidae) with particular focus on their host plant relationship Dissertation Zur Erlangung der Würde des Doktors der Naturwissenschaften des Fachbereichs Biologie, der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften, der Universität Hamburg vorgelegt von Christian Ulrich Baden aus Hamburg Hamburg, im August 2011 April 18, 2011 To Whom It May Concern: I have read over the Ph.D. thesis of Christian Baden entitled, 'Phylogeny and sequestration of iridoidglycosides in selected genera of the Mecininae (Coleoptera, Curculionidae) with particular focus on their host plant relationship'. As a native speaker of English, I attest to the quality of Mr. Baden's English. Sincerely, Scott T. Kelley Associate Professor Department of Biology San Diego State University 5500 Campanile Drive San Diego, CA 92182-4614 5500 Campanile Drive, San Diego, CA 92182-4614 Tel (619) 594-5371 FAX (619) 594-5676 Aufführung der in Anspruch genommenen fremden Hilfen In den Kapiteln 2 und 3 hat Herr Dr. Stephan Franke die GC, GC/MS und HPLC/MS mit mir zusammen und teilweise alleine bedient. Des Weiteren hat er bei der Zuordnung der chemischen Stoffe geholfen. In Kapitel 4 hat Dr. Ralph Peters mir bei der Realisierung des Olfaktometers und bei der statistischen Auswertung geholfen. In Kapitel 5 hat mich Viola Boxberger an einigen Tagen bei den Arbeiten im Feld unterstützt. Wenn Käfer nicht von mir gesammelt wurden, so ist dies innerhalb der Arbeit vermerkt. Table of contents Zusammenfassung 5 Summary 8 General Introduction 11 Chapter 1: The phylogeny of some Mecininae (Coleoptera, Curculionidae) genera based 31 on CO I/II and EF1-α gene sequences Chapter 2: Differing patterns of sequestration of iridoid glycosides in the Mecininae 46 (Coleoptera, Curculionidae) Chapter 3: Differing patterns of sequestration of iridoid glycosides in the species Cionus 58 hortulanus (FOURCROY, 1785) (Coleoptera, Curculionidae) Chapter 4: The characteristics of host plant specificity and host plant switch within the 68 genus Cionus CLAIRVILLE (Coleoptera, Curculionidae) inferred from olfactory tests Chapter 5: Dispersal behaviour of two Cionus species CLAIRVILLE (Coleoptera, 77 Curculionidae) taken from Scrophularia nodosa and released on Verbascum nigrum General Discussion 85 References 97 Zusammenfassung Iridoidglykoside (IGs) sind sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe, die in einer Vielzahl von Pflanzenfamilien vorkommen und deren biologisch aktive Form das toxische Aglycon ist. Die Toxizität des Aglycons beruht auf seiner denaturierenden Wirkung auf Nukleinsäuren, Aminosäuren und Proteinen, welche es alkyliert und so irreversible Querverbindungen erzeugt. Die wohl am besten untersuchten und am weitesten verbreiteten IGs sind Aucubin und Catalpol. Trotz ihrer Toxizität gibt es viele spezialisierte Herbivore, die sich von Pflanzen, die IGs produzieren, ernähren und sich auf diesen entwickeln. Die meisten dieser herbivoren Insekten sind Schmetterlinge (Lepidoptera) und Käfer (Coleoptera). Zusätzlich sequestrieren die meisten dieser Vertreter die IGs sogar um sich selbst gegen Prädatoren und Bakterien zu schützen. Tatsächlich zeigen alle bisher untersuchten spezialisierten Gattungen dieses Verhalten. Innerhalb der Mecininae (Coleoptera, Curculionidae) gibt es mehrere Gattungen, die ausschließlich auf IG-haltigen (Aucubin, Catalpol und Antirrhinosid) Pflanzen leben: Mecinus GERMAR 1821, Rhinusa STEPHENS 1829, Gymnetron SCHÖNHERR 1825 (alles Mecinini), Cionus CLAIRVILLE & SCHELLENBERG 1798 und Cleopus DEJEAN 1821 (beide Cionini). Die hier vorliegende Arbeit hat sich eingehend mit diesen Gattungen beschäftigt. Zunächst wurde ein Stammbaum der 27 zur Verfügung stehenden Arten auf der Basis von mitochondrialer (COI/II) und nukleärer (EF-1α) DNS erstellt. Dieser Stammbaum zeigt zum Einen, dass die Gattung Rhinusa nicht monophyletisch ist, sondern dass die Arten, die sich auf Verbascum und Scrophularia entwickeln, näher mit der Gattung Gymnetron verwandt sind, als mit den anderen Rhinusa-Arten. Desweiteren gehören die Gymnetron-Arten die auf Plantago leben zu der Gattung Mecinus, genau wie Caldara (2001) es postulierte. Weiterhin sind Cionus schultzei und Rhinusa tetrum ab. plagiellum eigenständige Arten letztere als Rhinusa fuscescens bereits von ROSENSCHÖLD (1838) beschrieben. Beide wurden bisher eher als Unterarten oder Aberrationen angesehen. Ein gewichtigeres Resultat ist aber, dass es bei den Mecinini nur wenige Wirtpflanzenwechsel gab und diese jedes Mal eine Radiation nach sich zogen während es bei den Cionini regelmäßiger zu Wirtspflanzenwechseln kam, welche sich aber nur zwischen Verbascum und Scrophularia abspielten. 5 Zusammenfassung Im Weiteren wurden chemische Analysen durchgeführt, um festzustellen, welche Rüsselkäfer-Arten IGs sequestrieren und bis zu welcher Konzentration dies geschieht. Es zeigte sich, dass die untersuchten Mecinini Arten weder Aucubin, Catalpol noch Antirrhinosid sequestrieren, was etwas Besonderes ist, da sie damit die einzigen auf IG-haltigen Pflanzen spezialisierten Insekten-Gattungen sind, die die Stoffe nicht sequestrieren. In den Cionini konnten dagegen IGs festgestellt werden, wobei Cionus Aucubin und Catalpol sequestriert und Cleopus nur Catalpol. Diese Tatsache deckt sich mit der Ökologie der Käfer, da die Mecinini einen sehr versteckten Generationszyklus besitzen und sich meist endophag ernähren, während sich die Cionini ektophag ernähren – sogar die auffällig gelben Larven. In der Gattung Cionus wird Catalpol immer effizienter sequestriert als Aucubin, jedoch kann beobachtet werden, dass Arten, die auf Scrophularia leben, normalerweise mehr Aucubin als Catalpol im Körper einlagern und es bei Arten, die auf Verbascum leben, genau umgekehrt ist. Diese Verteilung wird sogar zwischen den Populationen der einzigen Art, die auf beiden Pflanzen vorkommt (Cionus hortulanus), beobachtet. Die Ursache hierfür liegt aber nicht in den Konzentrationen der Wirtspflanzen, beide Arten zeigen ein ähnliches Konzentrationsverhältnis zwischen Aucubin und Catalpol. In einem weiteren Versuch wurde untersucht, ob das unterschiedliche Verhältnis der sequestrierten IGs ihre Ursache in den Pflanzen, oder in den Käfern hat. Dafür wurden befruchtete C. hortulanus Weibchen einer Population von S. nodosa gesammelt und für einen Generationszyklus auf S. nodosa bzw. V. nigrum gehalten. Während dieser Zeit wurden alle Lebensstadien der Käfer bis auf die Eier sowie die Wirtspflanze selbst beprobt. Es zeigte sich, dass die Unterschiede im Konzentrations-Verhältnis von Aucubin und Catalpol von der Pflanze abhängig sind und nicht vom Metabolismus der Käfer. Die Analysen ergaben nämlich wiederum, dass Tiere von Scrophularia mehr Aucubin und Tiere von Verbascum mehr Catalpol beinhalten. Dieses Verhältnis lässt sich auch hier nicht mit den Gehalten in den Pflanzen erklären, da sich jene kaum unterschieden. Die Konzentrationen in Männchen und Weibchen unterschieden sich nicht signifikant. Allerdings waren die Unterschiede in den IG- Konzentration selbst zwischen Käfern der gleichen Population, die sich an derselben Pflanze entwickelt hatten, sehr hoch. Weiterhin wurde ein olfaktorischer Versuch durchgeführt, um die Rolle der Pflanzendüfte für die Monophagie der Gattung Cionus zu erforschen. Untersucht wurden drei an Scrophularia lebende Arten (C. alauda, C. tuberculosus und C. scrophulariae) und eine von Verbascum (C. nigritarsis) sowie je eine Population von C. hortulanus von Scrophularia bzw. Verbascum. 6 Zusammenfassung Getestet wurden die Arten auf Scrophularia und Verbascum. Bei diesem Versuch zeigten alle Arten eine olfaktorische Reaktion auf die Pflanzendüfte und alle präferierten ihre Wirtspflanze. Die Wirtspflanzensuche ist also mit dem olfaktorischen Sinn gekoppelt. Da immer die eigene Wirtspflanze präferiert wurde, ist davon auszugehen, dass sich die Präferenz mit jedem Wirtspflanzenwechsel neu ausgebildet hat, oder diese Arten zu Reversionen neigen. Abschließend wurde noch getestet, ob C. hortulanus Populationen von S. nodosa im Freiland auf V. nigrum überleben können (wie es schon unter Laborbedingung in dieser Arbeit gezeigt wurde), um zu testen, ob hier bereits eine ökologische Speziation stattfinden könnte. Zusätzlich zu dieser Art wurde auch noch C. tuberculosus getestet, dessen Wirtpflanze S. nodosa ist. Jedoch gibt es einige alte Quellen, die diese Art auch an V. nigrum gefunden haben. Dafür habe ich Populationen aus dem Freiland entnommen. Die Tiere wurden individuell markiert und in einer Gegend mit circa 500 V. nigrum Pflanzen freigelassen. Das Monitoring dieser Tiere zeigt, dass C. hortulanus sich bald über die Pflanzen der Umgebung zu verteilen begann und sich dort augenscheinlich etablierte, während C. tuberculosus bald fast vollständig verschwunden war. Vermutlich toleriert letztere Art V. nigrum nur kurzzeitig als Wirtspflanze. Eine eventuelle ökologische Speziation der Art C. hortulanus konnte aber nicht festgestellt werden. 7 Summary Iridoide glycosides (IGs) are secondary plant compounds which occur in a high number of plant families. Their biologically active form is the toxic aglycone. The toxicity is caused by its denaturing effect on nucleic acids, amino acids and proteins, which get alkylated and thereby irreversible cross-linked. The best studied and most widespread IGs are aucubin and catalpol. Despite their toxicity many herbivores are specialised on IG containing plants. Most of these insects are Lepidoptera and Coleoptera. Actually