BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phí Thị Cẩm Miện XÂY DỰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ NHẬN DẠNG VÀ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG BẢO TỒN LOÀI XÁO TAM PHÂN (Paramignya trimera) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI, 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phí Thị Cẩm Miện Xây dựng chỉ thị phân tử nhận dạng và nghiên cứu nhân giống bảo tồn loài Xáo tam phân (Paramignya trimera) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Chu Hoàng Hà Hà Nội, 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Chu Hoàng Hà. Các kết quả thu được trong luận án Hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Phí Thị Cẩm Miện ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận án, tôi xin trân trọng cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. Chu Hoàng Hà, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình thực hiện Luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Các Thầy Cô giáo, các anh chị và các bạn đồng nghiệp tại Viện Công nghệ sinh học; Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, sinh hoạt chuyên môn và thực hiện Luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn đến Học Viện Khoa học và Công Nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện Luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Chương trình dự án Việt Bỉ (AI Programe-VNUA, 2014-2019) đã hỗ trợ kinh phí cho đề tài “A study of phylogenetics and biopharmaceutical properties of the Vietnamese traditional medicinal plants belonging to the genus Paramignya for the development of hepatoprotective nutraceuticals” giai đoạn 2018-2019 để giúp tôi có nguồn kinh phí thực hiện các nội dung nghiên cứu của Luận án. Sau cùng, từ tận đáy lòng, tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi hoàn thành Luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn ! Phí Thị Cẩm Miện iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii MỤC LỤC ................................................................................................................. iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................ vi DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................... vii DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. ix MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu......................................................................................... 2 2.1. Mục tiêu tổng quát ........................................................................................... 2 2.2. Mục tiêu cụ thể ................................................................................................. 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ......................................................................... 2 3.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................................. 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn .............................................................................................. 3 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài ................................................... 3 4.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................... 3 4.2. Phạm vi nghiên cứu .......................................................................................... 3 5. Những đóng góp mới của luận án .................................................................... 4 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 5 1.1. Giới thiệu chung về chi Paramignya ............................................................... 5 1.1.1. Đặc điểm sinh học của chi Paramignya ........................................................... 5 1.1.2. Một số thành phần hóa học và hoạtt tính sinh học chi Paramignya ................. 8 1.2. Cây Xáo tam phân (P. trimera), phân loại, đặc điểm sinh học và hoạt chất sinh học ................................................................................................... 11 1.2.1. Nguồn gốc, phân bố, vị trí phân loại Xáo tam phân ...................................... 11 1.2.2. Đặc điểm thực vật học của cây Xáo tam phân tại Việt Nam ......................... 11 1.2.3. Nghiên cứu về hoạt tính sinh dược học của cây Xáo tam phân ..................... 16 1.3. Các phương pháp trong nghiên cứu phân loại ở thực vật .............................. 20 1.3.1. Các chỉ thị đặc điểm ở thực vật ...................................................................... 20 iv 1.3.2. DNA barcode và ứng dụng của DNA barcode để nhận dạng và phân biệt loài ........................................................................................................... 25 1.3.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong xác định quan hệ tiến hóa ............................ 31 1.3.4. Đánh giá đa dạng di truyền quần thể ở thực vật ............................................ 34 1.3.5. Các nghiên cứu về hệ thống học, DNA barcodes của các loài thuộc chi Paramignya và loài P. trimera ........................................................................ 36 1.4. Nhân giống loài Xáo tam phân ...................................................................... 37 1.4.2. Nhân giống Xáo tam phân trong tự nhiên ...................................................... 49 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 52 2.1. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 52 2.1.1. Vật liệu cho nghiên cứu vị trí phân loại và quan hệ phát sinh của các mẫu thu thập ................................................................................................... 52 2.1.2. Vật liệu cho nghiên cứu nhân nhanh in vitro mẫu Xáo tam phân .................. 52 2.1.3. Các chỉ thị phân tử DNA ................................................................................ 53 2.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 57 2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................................ 57 2.3.1. Phương pháp điều tra, thu thập mẫu và xây dựng bản đồ phân bố ................ 57 2.3.2. Phương pháp mô tả hình thái ......................................................................... 58 2.3.3. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số ............................................................ 58 2.3.4. PCR nhân các vùng microsatellite bằng các chỉ thị SSR ............................... 58 2.3.5. PCR nhân các vùng chỉ thị phân tử ................................................................ 59 2.3.6. Giải trình tự và đăng ký trình tự..................................................................... 59 2.3.7. Phương pháp phân tích dữ liệu trình tự.......................................................... 60 2.4. Phương pháp nhân giống in vitro cây Xáo tam phân ..................................... 66 2.4.1. Phương pháp tạo vật liệu khởi đầu nhân giống in vitro Xáo tam phân ......... 66 2.4.2. Ảnh hưởng của nền môi trường tới khả năng sinh trưởng Xáo tam phân trong điều kiện in vitro ................................................................................... 67 2.4.3. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo Xáo tam phân............................................ 67 2.4.4. Ảnh hưởng của nhóm cytokinins và auxin tới khả năng nhân nhanh Xáo tam phân ......................................................................................................... 68 2.4.5. Ảnh hưởng của nhóm auxin tới khả năng hình thành rễ Xáo tam phân ........ 68 2.4.6. Phương pháp bố trí và xử lý thí nghiệm ........................................................ 69 v CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................ 70 3.1. Khảo sát sự phân bố và đặc điểm hình thái của các mẫu thuộc chi Paramignya tại Khánh Hòa và Lâm Đồng .................................................... 70 3.1.1. Khảo sát thành phần loài và sự phân bố của các mẫu nghiên cứu ................. 70 3.1.2. Đặc điểm hình thái của các mẫu thuộc chi Paramignya ................................ 75 3.2. Tách chiết DNA tổng số, nhận dạng loài thông qua chỉ thị barcode ............. 81 3.3. Xác định đa dạng di truyền của các mẫu Xáo tam phân dựa vào chỉ thị SSR ..... 81 3.4. Nghiên cứu chỉ thị DNA và nhận dạng loài ................................................... 86 3.4.1. PCR và xác định trình tự các vùng chỉ thị DNA ............................................. 86 3.4.2. Nhận dạng loài dựa vào công cụ MEGABLAST .......................................... 88 3.5. Xây dựng chỉ thị DNA để nhận dạng Xáo tam phân P. trimera .................... 95 3.5.1. Khảo sát dữ liệu DNA mã vạch của các loài thuộc chi Paramignya ............. 95 3.5.2.