Universidade Federal do Rio Grande do Sul Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular Filogeografia e Sistemática Molecular de Schizolobium parahyba (Vell.) Blake (Guapuruvu) através do sequenciamento de regiões cloroplásticas e nucleares Andreia Carina Turchetto Zolet Orientador: Dr. Rogério Margis Co-Orientadora: Dra. Márcia Margis-Pinheiro Tese de doutorado Porto Alegre 2009 Universidade Federal do Rio Grande do Sul Instituto de Biociências Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular Filogeografia e Sistemática Molecular de Schizolobium parahyba (Vell.) Blake (Guapuruvu) através do sequenciamento de regiões cloroplásticas e nucleares. Andreia Carine Turchetto Zolet Orientador: Dr. Rogério Margis Co-Orientadora: Dra. Márcia Margis-Pinheiro Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular da UFRGS como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Ciências. Porto Alegre Agosto de 2009 Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Genomas e Populações de Plantas do Centro de Biotecnologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul e também é parte do projeto SEEDSOURCE, subvencionado por: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e European Commission Sixth Framework Programme (EU-FP6). Agradecimentos Inicio agradecendo a todas as pessoas e instituições que tornaram possível o desenvolvimento deste trabalho que, de alguma maneira, me auxiliaram para o desenvolvimento do mesmo. Ao meu orientador Rogério Margis por ter me aceito em seu laboratório e acreditado no meu trabalho. Pela sua excelente orientação e por ser um exemplo de orientador, professor e pesquisador. Por jamais ter deixado faltar qualquer coisa necessária para o trabalho e pelo acompanhamento diário no desenvolvimento do mesmo, inclusive nas coletas. À minha co-orientadora Marcia Márgis-Pinheiro pela sua dedicação, carinho, pela força, apoio e pelos seus ensinamentos. Por acompanhar de perto o trabalho, ler os artigos e também pela ajuda nas coletas. Aos professores do Departamento de Genética e do Centro de Biotecnologia da UFRGS, ministrantes das disciplinas cursadas durante o doutorado que contribuíram para a minha formação. À Fernanda Cruz por ter sido a minha melhor estagiária. Pela dedicação ao trabalho e pelos excelentes PCRs e géis que fez durante sua estada no laboratório. Muitos dos resultados obtidos são graças á sua fiel ajuda. Aos meus colegas e amigos do laboratório de Genomas e Populações de Plantas: Fernanda, Claúdia, Franceli, Cintia, Guilherme Loss, Guilherme Cordenonsi, Júlio Cesar, Matheus, Felipe pela amizade, carinho e pelas grandes discussões científicas, filosóficas e muitos outros assuntos que tornaram nossos dias de trabalhos 4 muito melhores. Pelas colaborações quando precisei de ajuda para guardar um PCR, tirar foto de gel, etc. Em especial à Franceli, Claudia (Júlia), Fernanda e Cintia, meninas tão especiais que conheci há pouco tempo, mas que já estão no meu coração como verdadeiras irmãs. Pelo carinho que me dedicam e pela ajuda sempre que eu preciso. Valeu amigonas! Aos amigos e vizinhos do Laboratório de Biologia Molecular Vegetal, dos professores Giancarlo Pascuali e Jeverson Frazon, pela amizade, parceria e pelos vários momentos em que precisei alguma coisa emprestada e todos sempre foram muito gentis e solidários. A todos os amigos e colegas do Núcleo de Genômica Funcional de Plantas, pela amizade e pelas trocas de conhecimentos durante todo esse tempo. Agradeço com muito carinho ao Elmo e à Elen, pela dedicação e eficiência com que fazem seu trabalho. Pela recepção sempre cordial e pronta para ajudar. Ao Fabiano Salgueiro, pela ajuda nas coletas e pelas discussões sobre o trabalho. Ao Giovanni G. Vendramin por ter me recebido em seu laboratório e pelas correções de um dos artigos. Ao Marcelo Simon pela grande ajuda na realização de algumas análises e também pelas correções de um dos artigos. Aos pesquisadores Maristerra Lemes, Rogério Gribel, Carlos Navarro, Renato Valencia e Poliane Alfenas pelas coletas e envio de amostras. À minha grande amiga Fernanda Sperb, uma pessoa muito especial e querida, que considero uma irmã, pela sua amizade e carinho. Pelos nossos cafés de final 5 de tarde, pelos bate-papos que me ajudaram a discontrair e com certeza me fez muito mais feliz. Obrigada amiga! À minha querida irmã Caroline pelo seu amor e carinho, pelo apoio em todas as horas e pela grande ajuda na realização de algumas análises, pelas discussões sobre o trabalho...enfim, obrigada maninha! Aos meus pais Vera e Alcides por terem me ensinado os grandes valores da vida, pelo amor, carinho e compreensão, que mesmo estando distantes, sempre estiveram presentes em todos os momentos. Obrigada meus amores! Ao meu marido Renato por todo o amor que me fez ter forças sufuciente para enfrentar qualquer obstáculo. Pelo apoio, incentivo e confiança que sempre me dedicou. Pelo apoio técnico em informática e pelo apoio moral nas horas difíceis. Meu amor, você é incrível! Obrigada por ser essa pessoa maravilhosa e que me faz acreditar mais em mim mesma. Te Amo! 6 Sumário RESUMO .............................................................................................................................. 8 ABSTRACT ....................................................................................................................... 10 CAPÍTULO I: INTRODUÇÃO GERAL ........................................................................ 12 FAMÍLIA FABACEAE .......................................................................................................... 13 GÊNERO SCHIZOLOBIUM.................................................................................................... 14 FLORESTAS NEOTROPICAIS ............................................................................................... 21 ESTUDO DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE HÍDRICO EM PLANTAS ........................... 23 ESTUDOS FILOGEOGRÁFICOS ............................................................................................ 25 SISTEMÁTICA MOLECULAR............................................................................................... 26 MARCADORES MOLECULARES.......................................................................................... 27 OBJETIVO GERAL.............................................................................................................. 29 CAPÍTULO II: THE EVOLUTION OF PYRROLINE-5-CARBOXYLATE SYNTHASE IN PLANTS: A KEY ENZYME IN PROLINE SYNTHESIS ................ 30 CAPÍTULO III: MOLECULAR SYSTEMATICS AND EVOLUTIONARY HISTORY OF NEOTROPICAL TREE SCHIZOLOBIUM (FABACEAE- CAESALPINIOIDEAE) INFERRED FROM NUCLEAR AND CHLOROPLAST DNA SEQUENCES. .......................................................................................................... 42 CAPÍTULO IV: PHYLOGEOGRAPHY OF THE DISJUNCT NEOTROPICAL TREES SCHIZOLOBIUM (CAESALPINIOIDEAE) SUGGESTS PAST INTERCONNECTIONS BETWEEN AMAZONIAN AND ATLANTIC FORESTS 81 CAPÍTULO V: CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................. 115 ESTUDO DE GENES RELACIONADOS AO ESTRESSE HÍDRICO PARA ESPÉCIES ARBÓREAS.... 117 ESTUDO DE SISTEMÁTICA MOLECULAR, BIOGEOGRAFIA E FILOGEOGRAFIA ................... 120 CAPÍTULO VI: REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DOS CAPÍTULOS I E V .. 125 ANEXO I .......................................................................................................................... 137 7 Resumo A Floresta Atlântica e a Floresta Amazônica estão entre as maiores e mais diversas florestas tropicais do mundo, com muitas de suas espécies apresentando distribuição disjunta. O estudo genético molecular dessas espécies é interessante, pois podem fornecer informações sobre o relacionamento histórico entre essas diferentes regiões geográficas. Entretanto, ainda poucos são os estudos sobre a distribuição da estrutura genética nestas áreas, principalmente para espécies vegetais. O estudo da diversidade genética em espécies arbóreas é de grande importância para a manutenção das fontes de germoplasma a serem usados em práticas de reflorestamento e para espécies com uma ampla distribuição geográfica que ocupam diferentes habitats que são componentes chaves na composição de diversos ecossistemas. O gênero Schizolobium (Caesapinioideae) apresenta ampla distribuição nos Neotrópicos e devido ao seu rápido crescimento é amplamente utilizado em programas de reflorestamento, além de apresentar importância econômica pela utilização da madeira. O presente estudo apresenta a primeira análise genética molecular do gênero Schizolobium, incluindo uma ampla amostragem de populações ao longo de sua distribuição geográfica. Um conjunto de 11 marcadores moleculares (cpDNA e ITS) foram usados para investigar a evolução, posição sistemática, estimar o tempo de divergência entre as duas variedades, verificar um possível evento de especiação, estudar os padrões biogeográficos entre as florestas Atlântica e Amazônica, além de investigar a estrutura filogeográfica em Schizolobium. Marcadores não-neutros também foram estudados na tentativa de serem usados para investigar a variação adaptativa relacionada ao estresse hídrico. Sequências parciais dos genes P5CS de quatro espécies arbóreas (Schizolobium parahyba, Ceiba pentandra, Bombacopsis quinata e Cedrela Odorata) foram clonadas, seqüenciadas e comparadas com sequências de outras espécies. A análise filogenética indicou que eventos de duplicação ocorreram várias vezes e em diferentes frequências ao longo da evolução das