Identifikation von Kardiomyozyten-Differenzierungs-Genen durch einen siRNA-basierenden Screeningansatz Inaugural-Dissertation Zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) An der Justus Liebig Universität Gießen Fachbereich 08 „Biologie und Chemie“ angefertigt am Max-Planck-Institut für Herz- und Lungenforschung Bad Nauheim vorgelegt von Stefanie Köhler-Bachmann aus Hilden März 2011 Dekan: Prof. Dr. Volkmar Wolters 1.Gutachter: Prof. Dr. Adriaan Dorresteijn 2.Gutachter: Prof. Dr. Dr. Thomas Braun Tag der mündlichen Prüfung: Unsere Bestimmung verfügt über uns, auch wenn wir sie noch nicht kennen; es ist die Zukunft, die unserm Heute die Regel gibt. Friedrich Nietzsche Menschliches, Allzumenschliches Inhalt Abkürzungen _____________________________________ 1 1. Einleitung ______________________________________ 3 1.1. Die frühe Entwicklung des Herzens ____________________________________ 5 1.1.1. Die Bildung der Keimblätter: Gastrulation in Vertebraten _______________ 6 1.1.2. Bildung des kardialen Mesoderms_______________________________________ 8 1.1.3. Frühe Morphogenese des embryonalen Herzens _______________________ 11 1.2. in vitro Differenzierung embryonaler Stammzellen _________________ 12 1.2.1. Differenzierung von Kardiomyozyten aus murinen Embryonalen Stammzellen __________________________________________________________ 14 1.3. RNA Interferenz ________________________________________________________ 16 1.3.1. Vektor-basierende Expressions-Systeme für Säugerzellen _____________ 21 1.3.2. siRNA Bibliotheken ____________________________________________________ 23 1.4. Fragestellung und Ziel der Arbeit _____________________________________ 24 2. Material und Methoden___________________________ 25 2.1. Chemikalien, Enzyme, Lösungen ______________________________________ 25 2.2. Arbeiten mit Nukleinsäuren ___________________________________________ 25 2.2.1. Sequenzspezifische Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen _ 25 2.2.2. Dephosphorylierung von 5'-Enden der DNA ____________________________ 25 2.2.3. Agarose-Gelelektrophorese ____________________________________________ 26 2.2.4. Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen _________________ 26 2.2.5. Paarung komplementärer DNA-Oligonukleotide („Annealing“) __________ 26 2.2.6. Phosphorylierung von DNA-Oligonukleotiden __________________________ 27 2.2.7. Ligation von DNA-Fragmenten _________________________________________ 27 2.2.8. Analytische Plasmid-Isolierung (Mini-Präparation) _____________________ 27 2.2.9. Präparative Plasmid-Isolierung (Maxi-Präparation) _____________________ 28 2.2.10. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren in Lösung ___________ 28 2.2.11. Sequenzierung von DNA _____________________________________________ 28 2.2.12. Isolation von Gesamt-RNA aus eukaryotischen Zellen _______________ 29 2.2.13. Fällung von RNA ____________________________________________________ 29 2.2.14. cDNA-Synthese mittels reverser Transkription_______________________ 29 2.2.15. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) nach (Saiki et al., 1986) ________ 30 2.2.16. Aufreinigung von PCR-Produkten ____________________________________ 32 2.2.17. λ-Exonuklease-Behandlung von PCR-Produkten _____________________ 33 2.3. Bakterien _______________________________________________________________ 33 2.3.1. Bakterienstämme ______________________________________________________ 33 2.3.2. Bakterienmedien ______________________________________________________ 33 2.3.3. Herstellung chemisch-kompetenter Bakterien__________________________ 34 2.3.4. Transformation von chemisch-kompetenten Bakterien _________________ 34 2.4. Zellkultur _______________________________________________________________ 35 2.4.1. Zelllinien ______________________________________________________________ 35 2.4.2. Zellkulturmedien, Lösungen und Reagenzien __________________________ 35 2.4.3. Kultivierung der Zellen ________________________________________________ 36 2.4.4. Passagieren von Zellen ________________________________________________ 36 2.4.5. Einfrieren und Auftauen von Zellen ____________________________________ 37 2.4.6. Transfektion von Zellen ________________________________________________ 37 2.4.7. G418-Selektion ________________________________________________________ 38 2.4.8. Puromyzin-Selektion ___________________________________________________ 38 2.4.9. in vitro Differenzierung von ES-Zellen _________________________________ 38 2.5. Viren ____________________________________________________________________ 39 2.5.1. Generierung lentiviraler Partikel _______________________________________ 39 2.5.2. Konzentrierung lentiviraler Partikel ____________________________________ 40 2.5.3. Bestimmung des Titers ________________________________________________ 40 Inhalt 2.5.4. Bestimmung der MOI für ES-Zellen ____________________________________ 40 2.6. Proteine ________________________________________________________________ 41 2.6.1. Isolation von Proteinen aus eukaryotischen Zellen _____________________ 41 2.6.2. Konzentrationsbestimmung von Proteinen in Lösung (nach Bradford, 1976) _________________________________________________ 42 2.6.3. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) nach (Laemmli, 1970) _________________________________________________ 42 2.6.4. Proteintransfer und -nachweis (Western-Blot (Immunoblot)) __________ 43 2.7. Histologische Techniken _______________________________________________ 44 2.7.1. Herstellung von Kryoschnitten _________________________________________ 44 2.8. Immunhistologische und Immunhistochemische Techniken _______ 44 2.8.1. Antikörper-Färbung von Kryoschnitten _________________________________ 44 2.8.2. Durchflußzytrometrie (FACS-Analyse) _________________________________ 46 2.8.3. Affymetrix Gene Chip Expressionsanalyse _____________________________ 47 2.9. Photodokumentation __________________________________________________ 47 3. Ergebnisse ____________________________________ 48 3.1. Charakterisierung der von embryonalen Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten _______________________________________________________________ 48 3.1.1. Die in vitro Generierung ESC-abgeleiteter Kardiomyozyten folgt einem spezifischen Muster und ist standardisierbar ___________________________ 48 3.1.2. in vitro generierte Kardiomyozytzen zeigen Charakteristika neonataler Herzmuskelzellen ______________________________________________________ 50 3.1.3. Die „Cardiac Bodies“ bestehen ausschließlich aus Kardiomyozyten ____ 53 3.2. Genomweite siRNA-vermittelte Gensuppression während der in vitro Differenzierung ESC-abgeleiteter Kardiomyozyten ___________________ 55 3.2.1. Die Komplexität der sh/siRNA Bibliothek wurde durch die Amplifikation nicht beeinträchtigt ____________________________________________________ 55 3.2.2. Die lentivirale Infektion interferiert nicht mit der Differenzierung ______ 55 3.2.3. Inhibition der kardiomyozytären Differenzierung in vitro durch siRNA-vermittelte Suppression von GATA4 _____________________________ 56 3.2.4. Identifikation kardioessentieller Gene im „batch-Verfahren“ ___________ 58 3.2.5. Identifikation funktionell relevanter Kandidatengene der frühen Kardiomyogenese mit Hilfe eines komplexen bioinformatischer Algorithmus ___________________________________________________________ 62 3.3. Der Screen zeigt eine hohe Repräsentanz bekannter kardiogenetisch essentieller Faktoren verschiedenster Proteinklassen und beteiligter Prozesse ___________________________________________________________ 66 3.4. Interferenz identifizierter individueller siRNAs mit der kardiomyozytären Differenzierung in vitro __________________________________ 69 3.5. Isolation und Identifikation angereicherter Knotenpunkte durch Annotationsverknüpfung nach GO (Gene Ontology) ________________________ 70 4. Diskussion ____________________________________ 77 4.1. In vitro generierte Kardiomyozyten eignen sich für die Identifikation pränatal kardiogenetisch essentieller Faktoren ___________ 77 4.2. Die genomweite siRNA-vermittelte Gensuppression im „batch- Verfahren“ eignet sich zur Identifikation von Genen, welche die Herzentwicklung beeinflussen _______________________________________________ 79 4.2.1. Die siRNA-vermittelte Suppression von GATA4 verhindert die kardiomyozytäre Differenzierung in vitro, aber nicht in vivo ___________ 79 4.2.2. Die Komplexität der lentiviralen sh/siRNA-Bibliothek bleibt auf zellulärer Ebene erhalten _____________________________________________ 81 4.2.3. Das Stadium der Testpopulationen definiert das entwicklungsbiologische Zeitfenster ____________________________________________________________ 82 Inhalt 4.3. Identifikation von Kandidatengenen durch einen bioinformatischer Algorithmus ___________________________________________________________________ 84 4.3.1. Die Identifikation der siRNAs wird durch die komplexe Verrechnung der Hybridisierungssignale erreicht ________________________________________ 84 4.3.2. Die Bestimmung der Anzahl der als essentiell identifizierten Kandidatengene ist von der Stringenz abhängig _______________________ 86 4.3.3. Der Abgleich der Screeningresultate mit Expressionsdaten verbessert die Qualität der Analyse und schließt falsch positive Kandidaten aus __ 87 4.4. Die Konsistenz des genomweiten Screens wird durch die theoretische und biologische Validierung verbessert ______________________ 88 4.4.1. Die Identifikation bekannter kardiogenetisch essentieller Gene demonstriert die Validität und die Potenz des in vitro Screens _________ 88 4.4.2. Die erfolgreiche Validierung