UNIVERSIDAD DE OVIEDO DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO EN BIOLOGÍA FUNCIONAL Y MOLECULAR Identificación y estudio de las interacciones virus-célula del vesivirus de conejo (RaV) José Arrojo Fernández 2015 RESUMEN DEL CONTENIDO DE TESIS DOCTORAL 1.- Título de la Tesis Español: Identificación y estudio de las Inglés: Identifying and functionally interacciones virus-célula del vesivirus de characterizing viral-host interactions for rabbit conejo (RaV) vesivirus (RaV) 2.- Autor Nombre: JOSE ARROJO FERNANDEZ DNI/Pasaporte/NIE: Programa de Doctorado: Biología funcional y molecular (interdepartamental) Órgano responsable: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR RESUMEN (en español) Los calicivirus son virus RNA de cadena sencilla y polaridad positiva que actúan como F agentes patógenos en animales y humanos. El rango de huésped y el tropismo celular, O así como el desarrollo de la infección, dependen en gran medida de la interacción con R proteínas del huésped. - En la presente memoria de tesis doctoral se describen las estrategias desarrolladas para M la identificación de proteínas celulares que interaccionan con secuencias próximas a los A extremos 5’ y 3’ del genoma del RaV y con las proteínas virales NS5, NS6/7 y VP1 del T mismo virus. - Para el estudio de las interacciones RNA viral-proteína celular se desarrolló una V cromatografía de afinidad a RNA biotinilado utilizando extractos citoplasmáticos de O células susceptibles y permisivas a la infección por RaV, que fueron incubados con A RNAs sintéticos que presentaban secuencias de los extremos del genoma del virus. Las - proteínas purificadas se analizaron e identificaron por espectrometría de masas. En total 0 se consiguieron identificar 28 proteínas que presentaban diferente afinidad por 1 secuencias del extremo 3’ o 5’. 0 Para la identificación de las interacciones proteína viral-proteína celular se generaron - líneas celulares modificadas establemente que expresaran, de manera independiente, las B proteínas virales NS5, NS6/7 y VP1 de forma inducible y fusionadas a una etiqueta I peptídica (C-TAP) para la purificación por afinidad en tándem (TAP). Se purificaron S proteínas celulares unidas a NS5 y VP1, que fueron analizadas e identificadas por espectrometría de masas. En conjunto se identificaron 5 proteínas celulares capaces de interaccionar con VP1 y 3 con NS5. Al ser el RaV uno de los pocos modelos de calicivirus que puede ser propagado en cultivos celulares, se pudo estudiar la función de las proteínas PABP y hnRNPK en la infección. La proteína PABP, identificada por su interacción con secuencias próximas al extremo 3’ del genoma del RaV, fue silenciada en cultivos celulares y la posterior infección dio lugar a un descenso en el título viral, lo que indica un papel relevante de esta proteína celular en la propagación del virus. La proteína hnRNPK se identificó por su interacción con secuencias de la región 5’ del genoma del RaV, y el silenciamiento de su expresión causó un aumento del título viral, sugiriendo que esta proteína juega un papel negativo en la propagación del RaV. Con los resultados obtenidos en esta tesis doctoral se abren nuevas vías para el estudio de los procesos moleculares de replicación de RNA, traducción y formación de nuevas partículas virales en la infección por calicivirus, así como para el desarrollo de estrategias antivirales basadas en la acción de proteínas celulares durante la infección. RESUMEN (en Inglés) Caliciviruses are single-stranded, positive sense RNA viruses pathogenic to humans and other animals. Their host range and cellular tropism, as well as their infection process, depend to a great extent on the interaction of viral components with host proteins. This doctoral dissertation describes the strategies followed to identify cellular proteins able to interact with sequences near the 5’ and 3’ ends of the RaV genome, as well as with the RaV proteins NS5, NS6/7 and VP1. In order to study the viral RNA–host cell protein interactions, affinity chromatography with biotinylated RNA, using cytoplasmic extracts of cultured cells susceptible and permissive to RaV infection, were used. These extracts were incubated with synthetic RNAs sequences corresponding the terminal ends of the viral genome. Proteins which co-purified with the RNA were analyzed and identified by mass spectrometry. In total 28 proteins, with different affinities for sequences of the 5’ or 3’ ends of the viral genome, were identified. For the identification of viral protein-host protein interactions, stable cell lines were developed for an inducible, and independent, expression of NS5, NS6/7 and VP1 viral proteins labeled with a peptide tag (C-TAP) for tandem affinity purification (TAP). Cellular proteins bound to NS5 and VP1 were purified and identified by mass spectrometry. Five cellular proteins were identified due to their interaction with VP1 and 3 with NS5. Furthermore, since RaV is one of the few calicivirus models that can be propagated in cultured cells, the role that the cellular proteins PABP and hnRNPK play during the infection process were studied. PABP, which interacts with sequences close to the 3’ end of the viral genome, was silenced in cultured cells, resulting in a decrease of the viral titer after infection, which suggests a relevant role of this protein in viral propagation. hnRNPK interacted with sequences in the 5’ region of the RaV genome. Cultured cells in which this protein had been silenced displayed an increase in the viral titer, suggesting that hnRNPK has a negative effect on RaV propagation. These results open new possibilities for the study of the molecular processes involved in RaV RNA replication and translation, as well as in the formation of new viral particles during calicivirus infection. They could also provide a basis for the development of antiviral strategies based on the action of cellular proteins during the infection process. SR. DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR ABREVIATURAS BSA Seroalbúmina bovina BVDV Virus de la diarrea viral bovina CBP Péptido de unión a calmodulina CCAR2 Proteína reguladora de la apoptosis y ciclo celular 2 cDNA Ácido desoxirribonucleico complementario CMV Citomegalovirus CTP Citosín-trifosfato DARS Sintetasa de aspartil-ARNt DDX3X Helicasa de ARN DDX3 DNA Ácido desoxirribonucleico DMEM Medio de Eagle modificado por Dulbecco DMSO Dimetilsulfóxido DTT 1,4-Ditiotreitol ECACC European Collection of Cell Cultures (Colección Europea de Cultivos celulares) EDTA Ácido etilén-diaminotetraacético EGTA Ácido etilén-glicoltetraacético eIF Factor de iniciación de la traducción en eucariotas EIF2AK2 Quinasa 2 del factor de inicio de la traducción EIF2A ELAV1 Proteína similar a ELAV FCV Calicivirus felino FITC Isotiocianato de fluoresceína Flp Recombinasa flipasa FRT Diana de recombinación para la flipasa G3BP Proteína de unión a la proteína activadora de Ras-GTPasa gRNA RNA genómico HCV Virus de la hepatitis C HDLBP Proteína de unión a HDL HEK 293T Human Embryonic Kidney cells (Línea celular de riñón de embrión humano) HeLa S3 Línea celular derivada de un adenocarcinoma humano HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid HIV Virus de la inmunodeficiencia humana hnRNPA/B Ribonucleoproteína heterogénea nuclear A/B hnRNPA0 Ribonucleoproteína heterogénea nuclear A0 hnRNPA1 Ribonucleoproteína heterogénea nuclear A1 hnRNPA2/B1 Ribonucleoproteína heterogénea nuclear A2/B1 hnRNPK Ribonucleoproteína heterogénea nuclear K hnRNPL Ribonucleoproteína heterogénea nuclear L hnRNPQ Ribonucleoproteína heterogénea nuclear Q hnRNPU Ribonucleoproteína heterogénea nuclear U Hpi Horas post-infección Hpt Horas post-transfección HPV Virus del papiloma humano HSC70 Proteína del choque térmico semejante a 71kDa HSP90 Proteína del choque térmico de 90kDa i HSPA1A Proteína del choque térmico de 70kDa 1A HSPA1B Proteína del choque térmico de 70kDa 1B HuNoV Norovirus humano HuR Antígeno humano R IBV Virus de la bronquitis infecciosa aviar ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses (Comité internacional de taxonomía de virus) IGF2BP3 Proteína de unión al ARNm del factor de crecimiento similar a insulina 3 IgG Inmunoglobulina G ILF Factor de unión al enhancer de interleukina IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido IRES Internal ribosome entry site (sitio de entrada interna al ribosoma) JEV Virus de la encefalitis japonesa LARS Sintetasa de leucil-ARNt LB Medio de cultivo de Luria-Bertani LC Péptido líder de la cápsida MARS Sintetasa de metionil-ARNt MHV Virus de la hepatitis murina MNV Norovirus murino Moi Multiplicidad de infección MOPS Ácido 3-(N-morfolino)-proponasulfónico mRNA Ácido ribonucleico mensajero MTT 3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide NCBI National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional para la Información Biotecnológica) NF Factor nuclear NDV Virus de la enfermedad de Newcastle NS Proteína no estructural NTPs Nucleósidos trifosfato NV Virus Norwalk ORF Open reading frame (fase abierta de lectura) PABP Proteína de unión a poli-A PBS Tampón fosfato salino PCBP Proteína de unión a poli-C PCR Polymerase chain reaction (reacción en cadena de la polimerasa) PEC Calicivirus entérico porcino PKR Proteína quinasa activada por RNA Pol Polimerasa Pro Proteasa pro-pol Proteasa-polimerasa PTBP1 Proteína de unión a secuencias de poli-pirimidinas-1 Q-PCR PCR cuantitativa RaV Vesivirus de conejo RHDV Virus de la enfermedad hemorrágica del conejo RLR Rig-like receptor (Receptores tipo-RIG-I) RNA Ácido ribonucleico RNP Ribonucleoproteína