+ r UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS TESIS DOCTORAL iMIIII,lIuthIhIun * 53O9578561~ UNIVERSIDAD COMPLUTENSE PREVENCION DE SIGNOS DE TOlERANCIA Y ABSTll~4ENC]A OPIOJIDEDirectora:POR Dra.CLONU3INA,M. Isabel MartínNIMODII’INOFontelles Y DILTIAZEM. 01 q y /~ y Profesora Titular FERNANDO LOPEZ REDONDO MADRID 1991. rú$Z tv= Ah A mis padres y hermano AGRADECIMIENTOS Quiero expresar mi agradecimiento a todas aquellas personas que de una u otra forma me ayudaron durante la realización de la presente Tesis Doctoral. Por los medios que me ofrecieron, por sus consejos y por su interés. Especialmente a todo el personal del Departamento de Farmacología de la Facultad de Medicina, quienes depositaron su confianza en mí y me brindaron la oportunidad de continuar avanzando en el mundo de la investigación. De una forma muy especial, a la Dra. M8 Isabel Martín, que ha sabido dirigir este trabajo con un entrañable entusiasmo y eficacia, ofreciéndome en todo momento su tiempo, comprensión y apoyo. También, al Dr. Pedro Lorenzo, Director del Departamento de Farmacología que desde el principio me facilitó todos los medios disponibles para la realización de esta Tesis. Al Departamento de Biología Animal II <Fisiología Animal) por su tutoría y por permitirme presentar esta Tesis. Gracias a los que convivieron conmigo todo este tiempo y tuvieran que soportarme: M~ Isabel Colado, M~ José Alfaro, Victor del Val y Carlos Goicoechea, todos ellos buenos compañeros de laboratorio. Tampoco puedo olvidar a mis colegas del Departamento de Biología Vegetal II de la Facultad de Farmacia, donde aprendí a realizar un trabajo científico y donde me inicié en el intrigante mundo de la investigación, ya que siempre se preocuparon por mí. No debemos olvidarnos de aquellos laboratorios que generosamente nos ofrecieron los fármacos que hemos empleado: Química Farmaceútica Bayer, Laboratorios Boehringer-lngelheim y Laboratorios Dr. Esteve. El presente trabajo ha sido subvencionado parcialmente por el Fondo de Investigaciones Sanitarias de la Seguridad Social. Y ha contado con una Beca Predoctoral de la Universidad Complutense y una ayuda de la Caja de Madrid. INDICE 1. INTRODUCCION . 1 1.1 OPIACEOS . 2 - Aspectos históricos de los opiáceos 2 - Receptores opioides 3 - Acciones farmacológicas de los opiáceos 6 - Teoría del receptor 11 - Mecanismos de los cambios de sensibilidad celular 12 - Medida de la tolerancia y la dependencia opioide 17 - Mecanismos celulares de la tolerancia y la dependencia 19 - Sistema nervioso periférico.lleon. Conducto deferente 24 - Sistema nervioso central 35 - Alteraciones en los sistemas de neurotransmisores 40 1.2. CALCIO 45 - El calcio como un modulador de la función celular 45 - Canales de calcio 50 - Fármacos antagonistas de calcio 55 - Relación de los antagonistas de calcio con los adrenoceptores 65 1.3. CALCIO Y OPIACEOS 65 - Calcio y acciones agudas de los opiáceos 65 - Relación entre tolerancia, dependencia y calcio 67 - Estudios subcelulares 68 - Adaptación a la pérdida subcelular de calcio 70 - Implicaciones funcionales de la alteración del metabolismo del calcio 70 2. OBJETIVOS 73 3. MATERIAL Y METODOS 75 3.1. ESTUDIOS EN íLEON DE COBAYO 76 3.1.1. Aislamiento y montaje de la preparación fibra longitudinal plexo mientérico de íleon de cobayo (PL-PM) 76 3.1.2. Inducción de tolerancia a la morfina 80 3.1.3. Valoración de la tolerancia 80 3.1.4. Efecto de la clonidina, el nimodipino y el diltiazem sobre la contracción de la preparación FL-PM 81 3.1.5. Modificación de la tolerancia en la preparación PL-PM por los distintos tratamientos 81 3.1.6. Valoración de la dependencia a la morfina 82 3.1.6.1. Por administración de naloxona in vitro 82 3.1.6.2. Por retirada del depósito de morfina in vivo 83 3.1.7. Efecto de la clonidina, el nimodipino y el diltiazem sobre la abstinencia a la morfina 84 3.1.7.1. Administración in vitro 84 3.1.7.2. Tratamientos in vivo 84 3.2. VALORACION DE LOS SIGNOS DE ABSTINENCIA A LA MORFINA EN RATA 85 3.3. ESTUDIO DE LOS NIVELES DE MONOAMINAS EN SISTEMA NERVIOSO CENTRAL DE RATA 87 3.3.1. Aislamiento de las estructuras del SNC 88 3.3.2. Extracción y análisis de las monoaminas en las distintas estructuras del SNC de rata 88 3.4. FARMACOS Y REACTIVOS EMPLEADOS .... 91 3.5. TRATAMIENTO ESTADíSTICO DE LOS RESULTADOS 92 4. RESULTADOS 94 4.1. ESTUDIOS EN íLEON DE COBAYO 95 4.1.1. Desarrollo de tolerancia en la preparación FL-PM 95 4.1 .2. Efecto de la clonidina, el nimodipino y el diltiazem sobre la preparación PL-PM estimulada eléctricamente 97 4.1.3. Modificación de la tolerancia por los distintos tratamientos .... 103 4.1.3.1. Modificación de la tolerancia a la morfina por la clonidina 103 4.1.3.2. Modificación de la tolerancia a la morfina por el nimodipino 104 4.1.3.3. Modificación de la tolerancia a la morfina por el diltiazem 106 4.1.4. Estudio de la abstinencia inducida por naloxona 111 4.1.4.1. Tratamientos in vitro 111 4.1.4.1.1. Efecto de la clonidina sobre ia dependencia a la morfina 113 4.1.4.1.2. Efecto del nimodipino sobre la dependencia a la morfina 115 4.1.4.1.3. Efecto del diltiazem sobre la dependencia a la morfina, 117 4.1.4.2. Tratamientos 4, vivo 119 4.1.4.2.1. Efecto de la clonidina sobre la dependencia a la morfina 119 4.1.4,2.2. Efecto del nimodipino sobre la dependencia a la morfina 120 4.1.4.2.3, Efecto del diltiazem sobre la dependencia a la morfina. 121 4.1.5. Estudio de la abstinencia inducida por retirada del depósito de morfina 123 4.2. VALORACION DE LOS SIGNOS DE ABSTINENCIA A LA MORFINA EN LA RATA 123 4.3. NIVELES DE MONOAMINAS EN SISTEMA NERVIOSO CENTRAL DE RATA 127 4.3.1. Niveles de 5-hidroxitriptamina y ácido 5-hidroxiindolacético 127 4.3.2. Niveles de noradrenalina 142 5. DISCUSION 147 5.1. De los estudios en íleon 148 5.2. De los estudios de comportamiento 155 5.3. De los niveles de monoamínas ... 158 6. RESUMEN 165 7. CONCLUSIONES 169 8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 171 1. INTRODUCCION 2 1.1. OPIACEOS. Asoectos históricos Históricamente, el médico ha tenido en el opio (jugo de Papaver somnhferum) una base de actuación a la que recurrir contra el dolor. Aunque los efectos psicológicos del opio ya eran conocidos por los antiguos sumerios, la primera referencia escrita se encuentra en los documentos de Teofrasto en el siglo III a.C. Los médicos árabes conocían bien las propiedades del opio y fueron los que introdujeron su uso en oriente para combatir la disentería. Paracelso (1493-1541) popularizó su uso en Europa, donde estaba muy desacreditado debido a su toxicidad, y llegó a denominarlo “piedra de la inmortalidad”. Fue el primero que utilizó el opio en forma de tintura (láudano). Thomas Sydenham, ya en pleno siglo XV1I, escribió: “entrelos remedios puestos por Dios al servicio de la humanidad, no hay ninguno tan eficaz como el opio para aliviar los sufrimientos de los hombres. Como muestra de esta eclosión y fama del producto, personajes célebres como Armand de Duplessis y el Cardenal Richelieu se encontraban entre sus consumidores habituales. En el siglo XIX se aislaron los primeros alcaloides del opio. En 1806 Sertúrner aisló la morfina (llamada así por Morfeo, dios del sueño); en 1832 Robiquet lo hizo con la codeína y en 1846 Merck con la papaverina. A partir de entonces el uso de los alcaloides puros, en lugar de preparados de opio crudo comenzaron a difundirse por todo el mundo médico, Con la aparición de la formas de administración parenteral, se originó una nueva y más grave forma de adicción. El problema de la adicción a opiáceos estimuló la búsqueda de otros analgésicos, que fueran potentes y que carecieran de este efecto adverso. En 1951 Eckenhoff y colaboradores usaron la nalorfina como antídoto del envenenamiento . 3 producido por morfina. En 1953 Wikler y colaboradores demostraron que en adictos, la nalorfina desencadenaba un síndrome de abstinencia; y en 1954 Lasagna y Beecher informaron que la nalorfina tenía acción analgésica, a pesar de que producía ansiedad y disforia, por lo que no era clínicamente útil como analgésico. Esto estimuló aún más los estudios sobre el tema, que condujeron a la aparición de nuevos fármacos, como el antagonista naloxona, o compuestos con acciones mixtas como la pentazocina, el butorfanol o la buprenorlina. Investigaciones llevadas a cabo por W.R. MARTíN (1967) concluían que las complejas interacciones entre los fármacos tipo morfina y los agonistas/antagonistas mixtos se podían explicar por la existencia de un tipo de receptor para opiáceos y fármacos afines. Así, en la década de los 70, diferentes grupos de investigadores (PERT y SNYDER, 1973; SIMON, HILLER y EDELMAN, 1973; TERENIUS, 1973) describieron independientemente lugares de unión estereoespecíficos y saturables para opiáceos en mamífero (JAFEE y MARTíN, 1986). Casi paralelamente, Hughes y Kosterlitz y sus colaboradores aislaron en el encéfalo de cerdo dos pentapéptidos (Leu-encefalina y Met-encefalina) que mostraban acción analoga a la de la morfina en Oeon de cobayo (HUOHES y col., 1975). En el mismo año, Goldstein y colaboradores aislaron a partir de la hipófisis, sustancias de características similares (CCX y col., 1975). Posteriormente se ha comprobado que existen tresfamilias de péptidos opioides y múltiples tipos de receptores para ellos (JAFFE y MARTIN, 1986). Receotores ooioides Actualmentese considera la existenciade 5 tipos de receptores opioides: mu(a), della (6), kappa (¡c), sigma <a) y epsion <E) (W.R. MARTIN y col., 1976; WUSTER y col., .