Lire la première partie de la thèse IV. Métabolisme de la BP2 et du BPS dans des modèles in vitro issus de l’Homme et du poisson zèbre utilisés dans l’évaluation toxicologique et le criblage des substances à activité œstrogénique Article 3 Cell-specific biotransformation of benzophenone 2 and Bisphenol-S in zebrafish and human in vitro models used for toxicity and estrogenicity screening Vincent Le Fola,b,c, Selim Aït-Aïssaa,*, Nicolas Cabatonb,c, Laurence Dolob,c, Marina Grimaldid, Patrick Balaguerd, Elisabeth Perdub,c, Laurent Debrauwerb,c, François Briona, Daniel Zalkob,c,* a Institut National de l’Environnement Industriel et des Risques (INERIS), Unité Écotoxicologie in vitro et in vivo, F-60550 Verneuil-en-Halatte, France b INRA, UMR1331, Toxalim, Research Centre in Food Toxicology, F-31027 Toulouse, France c Toulouse University, INP, UMR 1331 TOXALIM, F-31000 Toulouse, France. d Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U896, Institut Régional de Cancérologie de Montpellier, Université Montpellier 1, F-34298 Montpellier, France. * corresponding authors: E-mail: [email protected], phone +33 561 285 004, fax +33 561 285 244 E-mail: [email protected], phone +33 344 556 511, fax +33 344 556 767 185 L’étude du devenir de la BP2 et du BPS dans différents modèles in vitro du poisson zèbre fait suite à la mise en évidence des différences de réponse œstrogénique observées entre les modèles cellulaires, larvaires et adultes. En complément de ces modèles poisson zèbre, cette étude de devenir de la BP2 et du BPS a également été conduite dans des modèles in vitro humain d’origine hépatique ou mammaire et couramment utilisés dans l’évaluation toxicologique du potentiel œstrogénique des xénobiotiques. Présentation de l’article Plusieurs bio-essais in vitro ont été développés dans différentes espèces afin de mettre en évidence le potentiel œstrogénique de composés chimiques. Il a été montré que l’espèce de laquelle provienne les cellules, les sous-types d’ER correspondants et le contexte cellulaire sont des paramètres influençant le degré d’activation des ER par des composés chimiques (Matthews et al. 2000; Menuet et al. 2002; Cosnefroy et al. 2009; Cosnefroy et al. 2012; Miyagawa et al. 2014). Alors que l’absorption cellulaire et la biotransformation des xénobiotiques sont également des paramètres clefs pouvant modifier le potentiel œstrogénique de ces substances (Jacobs et al. 2013), très peu d’études rendent compte de la caractérisation des capacités de biotransformation des bio-essais utilisés. C’est pourquoi nous avons caractérisés les capacités de biotransformation de huit modèles in vitro issus du poisson zèbre et de l’Homme par l’étude du devenir de deux substances chimiques « émergeantes », la benzophénone 2 et le bisphénol S. Quatre modèles cellulaires hépatiques du poisson zèbre ont été utilisés à savoir la culture primaire d’hépatocytes (PZFH), les lignées cellulaires transfectées ZELH-zfERα et ZELH- zfERβ, et la lignée cellulaire ZFL de laquelle sont issues les cellules transfectées ZELH-zfERs. Concernant les modèles cellulaires hépatiques humains, les lignées HepG2 et HepaRG ont été utilisées. Enfin, cette étude comparative de biotransformation a intégré deux modèles d’origine humaine de criblage des xéno-œstrogènes, à savoir les lignées mammaires MELN et T47D-KBLuc. L’étude de la biotransformation de la BP2 et du BPS radiomarqués a été réalisée au moyen de techniques analytiques (radio-CLHP, spectrométrie de masse haute résolution) et biochimiques (hydrolyses enzymatiques). L’étude du devenir de la BP2 et du BPS a mis en évidence la nature glucurono- et sulfoconjuguée de l’ensemble de métabolites produits, bien que la formation d’un métabolite hydroxylé de la BP2 ne puisse être écartée pour la lignée cellulaire T47D-KBLuc. Bien que des enzymes de phase I fonctionnelles aient été rapportées pour certains de ces modèles cellulaires, la nature conjuguée prépondérante peut s’expliquer facilement par la présence de groupements hydroxyles libres pour la BP2 et le BPS, qui facilite les réactions de phase II sans fonctionnalisation préalable via des réactions de phase I. Deux modèles cellulaires se distinguent des autres par leur forte capacité de biotransformation, à savoir le modèle de culture primaire d’hépatocytes de poisson zèbre (PZFH) et la lignée cellulaire 186 HepaRG. Ce résultat, logique, tient à la nature même des cultures primaires, qui sont généralement dotées de capacités enzymatiques mieux préservées que celles des lignées cellulaires issues du même tissu. Le modèle de lignée HepaRG est quant à lui de mieux en mieux reconnu pour ses capacités de biotransformation proches de celles observées in vivo (Aninat et al. 2006; Antherieu et al. 2012). Bien que les réactions de sulfatation soient fonctionnelles dans les modèles cellulaires du poisson zèbre, une proportion plus importante de métabolites sulfo-conjugués a été retrouvée dans les modèles cellulaires d’origine humaine. Toutefois, des différences de capacités de biotransformation aussi bien qualitatives que quantitatives ont été retrouvées aussi parmi les modèles d’origine humaine. Contrairement au modèle HepaRG, les modèles HepG2, MELN et T47D-KBLuc sont caractérisés par une capacité de sulfatation majoritaire. Les modèles cellulaires du poisson zèbre sont, quant à eux, caractérisés par des capacités de biotransformation davantage homogènes, prédominées par des réactions de glucuronoconjugaison. Les doubles transfections dans la lignée ZFL n’ont pas modifié les capacités de biotransformation des cellules ZELH-zfERs résultantes. De manière intéressante, la BP2 a été plus fortement biotransformée que le BPS quel que soit le modèle de culture cellulaire, à l’exception des modèles PZFH et HepaRG dotés des plus fortes capacités de biotransformation. Etant donné la similitude de structures chimiques entre les deux composés, ce résultat n’était pas attendu. En résumé, il est à noter que les modèles cellulaires hépatiques du poisson zèbre (PZFH, ZFL, ZELH- zfERα, ZELH-zfERβ2) et le modèle hépatique d’origine humaine HepaRG sont caractérisés par des réactions du glucuronoconjugaison majoritaires. A l’inverse, les modèles cellulaires humains hépatiques et mammaires (HepG2, MELN, T47D-KBLuc) sont caractérisés par des réactions de sulfonconjugaison majoritaires. Par conséquent, en terme de biotransformation de la BP2 et du BPS, les modèles cellulaires du poisson zèbre se rapprochent davantage du modèle cellulaire humain HepaRG que des autres modèles. Il convient de noter que pour le BPA, molécule xéno-œstrogène de référence, des travaux encore non publiés de l’INRA en collaboration avec l’université de Davis (CA, USA) montrent que les profils obtenus in vivo chez le primate (macaque Rhésus ; Vandevoort, Zalko et al. non publié) et les profils HepaRG soulignent la prédominance de la voie de glucuronidation, et qu’HepaRG est donc bien plus « fidèle » à la situation in vivo chez le primate, que ne le seraient des lignées exprimant davantage l’activité sulfo-transférase, vraisemblablement parce qu’elles ont perdu une partie de leurs capacités de glucuronidation (Perdu et Zalko, non publié). Bien qu’il soit reconnu que les capacités de biotransformation déterminent en partie les quantités de molécules actives atteignant leur(s) cible(s) moléculaire(s) et ainsi influencent les réponses biologiques et leur interprétation, très peu de modèles in vitro utilisés dans le criblage des xéno- œstrogènes n’ont fait l’objet d’une telle caractérisation. Par l’étude du devenir de la BP2 et du BPS, ce travail a contribué à caractériser les capacités de biotransformation de huit modèles cellulaires issus de l’Homme et du poisson zèbre et pour certains utilisés comme outil de criblage des xéno-œstrogènes. 187 En termes de biotransformation, ces résultats montrent, par ailleurs, l’intérêt que représentent ces modèles hépatiques du poisson zèbre dans l’étude du potentiel œstrogénique des composés chimiques. 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 Supplemental information In vitro assay HELN-hERα cells1 were used for luciferase assay to assess human ERα estrogenic potency of BP2 and BPS metabolites (BPS-monoG, BPS-monoS, BP2-monoG1, BP2-monoG2 and BP2-monoS). The metabolites were biochemically synthesized as previously described2. Synthesized [3H]-BP2 and [3H]- BPS glucuronides and sulfates were analyzed by the same HPLC systems as already described. Figure S1. Estrogenic activity of parent compounds (BP2 and BPS) (a) and their conjugated metabolites (b) in HELN-hERα assay. References 1. Escande, A.; Pillon, A.; Servant, N.; Cravedi, J. P.; Larrea, F.; Muhn, P.; Nicolas, J. C.; Cavailles, V.; Balaguer, P. Evaluation of ligand selectivity using reporter cell lines stably expressing estrogen receptor alpha or beta. Biochem. Pharmacol. 2006, 71 (10), 1459-1469. 2. Cabaton, N.; Zalko, D.; Rathahao, E.; Canlet, C.; Delous, G.; Chagnon, M. C.; Cravedi, J. P.; Perdu, E. Biotransformation of bisphenol F by human and rat liver subcellular fractions. Toxicol. In Vitro 2008, 22 (7), 1697-1704. 198 V. Métabolisme de la Benzophénone-2 et du Bisphénol S chez le poisson zèbre aux stades larvaires et adultes Article 4 Life-stage dependant biotransformation of BP2 and BPS in zebrafish supports the use of embryo model as an alternative to adult fish. Vincent Le Fola,b,c, François Briona*, Anne Hillenweckb,c, Elisabeth Perdub,c, Sandrine Bruelb,c Selim Aït-Aïssaa, Jean-Pierre Cravedib,c, Daniel Zalkob,c,* a Institut National