Analyse der Struktur, Funktion und Evolution der Astacin-Protein-Familie Frank Möhrlen Heidelberg, 2002 INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung der Doktorwürde der Naturwissenschaftlich-mathematischen Gesamtfakultät der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg vorgelegt von Frank Möhrlen aus Heidelberg Tag der mündlichen Prüfung: 28.06.2002 Thema Analyse der Struktur, Funktion und Evolution der Astacin-Protein-Familie Gutachter: Prof. Dr. Robert Zwilling Prof. Dr. Richard Herrmann Die vorliegende Arbeit wurde am Lehrstuhl Physiologie des Instituts für Zoologie der Universität Heidelberg unter der wissenschaftlichen Leitung von Prof. Dr. R. Zwilling angefertigt. Für die Überlassung des interessanten Themas und die Betreuung meiner Arbeit gilt Herrn Prof. Dr. Robert Zwilling mein bester Dank. Prof. Dr. Richard Herrmann danke ich für die Übernahme des Koreferates. Ich möchte auch allen herzlich danken, die darüber hinaus diese Arbeit unterstützt haben: Prof. Dr. Werner Müller für die weitere Bereitstellung meines Arbeitsplatzes und die Förderung nach der Emeritierung von Prof. Dr. R. Zwilling. Der Landesgraduiertenförderung Baden-Württemberg für die einjährige finanzielle Unterstützung. Priv. Doz. Dr. Günter Vogt für die wertvolle Unterstützung und seine Diskussionsbereitschaft bei den Flusskrebs-Arbeiten. Vom deutschen Krebsforschungszentrum Dr. Martina Schnölzer für die gute Zusammenarbeit bei den massenspektrometrischen Analysen, Dr. Hans-Richard Rackwitz für die Peptidsynthesen und Dr. Hans Heid für die Durchführung der Edman-Sequenzierungen. Prof. Dr. Günter Plickert (Univerität Köln) für die schöne Zusammenarbeit im Rahmen der Hydractinia Astacine. Dr. Harald Hutter vom MPI für medizinische Forschung in Heidelberg für die Einführung in die Mikroinjektionstechnik und GFP-Analyse bei C. elegans. Prof. Dr. Vitalinao Pallini und Dr. Luca Bini (Universität Siena) für die Zusammenarbeit bei den 2D-Elektrophoresen. Dr. Uri Frank für die vielen Gespräche und Diskussionen, sowie die gemeinsame Arbeit im „Labor 403“. Prof. Dr. Monika Hassel, Prof. Dr. Thomas Leitz und Dr. Gebhard Geier die mir in ihrer Heidelberger Zeit in vielen Diskussionen wichtige Anregungen gaben. Allen ehemaligen Mitgliedern des Labors “Zwilling” Anja, Stefanie, Tobias, Patrick und die Ehemaligen in der Physiologie Lutz, Heike, Jürgen, Steffi und Tobias. Für die gute Arbeitsatmosphäre im „Labor 403“ Regina, Jasenka, Mark, Ibrahim und Gabi. Rüdi für die Hilfe bei der Korrektur des Manuskripts. Und nicht zuletzt meiner Frau Claudia und meinen Eltern, dass ihr immer für mich da wart. INHALTSVERZEICHNIS I. ZUSAMMENFASSUNG 1 II. EINLEITUNG 3 1. Strukturelle und funktionelle Vielfalt proteolytischer Enzyme 3 2. Klassen proteolytischer Enzyme 4 3. Die Astacin-Protein-Familie 5 4. Die Metzinkine 8 5. Ausgangspunkt und Problemstellung 9 III. MATERIAL UND METHODEN 11 1. Allgemeine Materialien 11 1.1. Geräte 11 1.2. Chemikalien und Artikel 11 1.3. Puffer und Lösungen 12 1.4. Bakterienstämme 12 1.5. Cosmide 12 1.6. Plasmide 12 1.7. Oligonukleotide 12 1.8. Enzyme und Produkte für molekularbiologische Methoden 15 1.9. Peptide 16 2. Tierhaltung 16 2.1. Hydractinia echinata 16 2.2. Caenorhabditis elegans 17 2.3. Astacus astacus 18 3. Allgemeine molekularbiologische Methoden 18 3.1. Arbeiten mit Escherichia coli 18 3.2. RNA-Isolierung 20 3.3. DNA-Isolierung 21 3.4. Reverse Transkription und Polymerasekettenreaktion 21 3.5. Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) 23 3.6. Gelelektrophorese und Klonierung von DNA 25 3.7. DNA-Sequenzierung 27 4. Allgemeine biochemische Methoden 27 4.1. Herstellung von Antikörpern 27 4.2. Protein-Isolierung 28 4.3. SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 29 4.4. Immunoblot 30 5. Zweidimensionale (2D-) Gelelektrophorese 31 5.1. 2D-Gelelektrophorese nach der IPG-SDS-PAGE Methode 31 5.2. Westernblot von 2D-Gelen 34 5.3. Immunoblot von 2D-Gelen 34 5.4. Mikrosequenzierung 35 5.5. Massenspektrometrische Analyse 35 6. Chromatographische Methoden 36 6.1. Gewinnung des Krebstrypsins durch Affinitätschromatographie 36 6.2. Gewinnung des Astacins durch Ionenaustausch-Chromatographie und Gelfiltration 37 6.3. Reinigung von Astacin und Astacin-homologen Proteinen durch Affinitätschromatographie 37 7. Aktivitätsmessung proteolytischer Enzyme 37 7.1. Aktivitätsmessung von Trypsin mit BAPNA 38 7.2. Aktivitätsmessung von Astacin mit STANA 38 7.3. Aktivitätsmessungen mit dansylierten Substraten 38 7.4. Aktivitätsmessungen mit FITC-Casein 38 8. GFP-Fusionsproteine und Expressionsnachweis in C. elegans 39 8.1. Expressionsvektoren 39 8.2. Herstellung der Injektionslösung 39 8.3. Herstellung der Injektionskanülen 39 8.4. Injektion 39 8.5. Identifizierung von Transformanten 40 8.6. Dokumentation 40 9. Expressionsnachweis durch in situ Hybridisierung in Hydractinia echinata 40 9.1. Vorbehandlung der Tiere 40 9.2. Herstellung der in situ Sonden 41 9.3. In situ Hybridisierung 41 10. Präparation und Immunhistochemie von Astacus astacus 41 10.1. Magensaftentnahme und Präparation des Hepatopankreas 41 10.2. Herstellung von Paraffin-Schnitten 42 10.3. Übersichtsfärbungen 42 10.4. Immunhistochemie 43 11. Proteolyse und massenspektrometrische Analyse von Modellpeptiden 44 11.1. Spaltungsversuche mit synthetischen Modellpeptiden 44 11.2. MALDI-TOF Massenspektrometrie 44 12. Computergestützte Analysen 44 12.1. Programme für molekulargenetische Analysen 44 12.2. Datenbankanalyse Astacin-homologer Gene 45 12.3. Phylogenetische Analyse 46 12.4. C. elegans und das Internet 46 IV. ERGEBNISSE 48 1. Astacin-homologe Proteine in C. elegans 48 1.1. Datenbankanalyse 48 1.2. Transkriptom-Analyse 51 1.2.1. RT-PCR und EST-Projekte 51 1.2.2. Abgleich der cDNA mit den genomischen Sequenzdaten 55 1.3. Funktions-Analyse 57 1.3.1. GFP-Fusionsproteine 57 1.3.2. Auswertung der GFP, RNAi und microarray Projekte 62 1.4. Proteom-Analyse 65 2. Astacin-homologe Proteine in Hydractinia echinata 74 2.1. RT-PCR/RACE 74 2.2. Klonierung und Sequenzdaten von Hydractinia echinata Astacin 1 und 2 75 2.3. In situ Hybridisierung 79 3. Datenbankanalyse und phylogenetische Analyse 82 3.1. Identifizierung Astacin-homologer Gene (BLAST, FASTA) 82 3.2. Analyse der Domänenstruktur 87 3.3. Molekularphylogenetische Analyse 91 4. Aktivierung von Pro-Astacin 99 4.1. Immunhistochemie 99 4.2. Immunoblotting 103 4.3. Analyse der Aktivierungsstelle (Prozessierung) 104 4.4. Massenspektrometrische Analyse 107 V. DISKUSSION 109 1. Astacin-homologe Proteine in C. elegans 109 2. Astacin-homologe Proteine in Hydractinia echinata 117 3. Molekularphylogenetische und strukturelle Untersuchungen der Astacin-Protein-Familie 119 4. Aktivierung von Pro-Astacin 125 VI. LITERATUR 129 VII. ANHANG 139 1. Abkürzungen 139 2. Aminosäuren und Nukleotide 140 3. Abbildungsverzeichnis 141 4. Tabellenverzeichnis 142 5. Eigene Publikationen und Kongressberichte 143 6. Sequenzdaten 144 6.1. Sequenzdaten der Astacin-homologen Gene von C. elegans 144 6.2. Korrigierte Proteinsequenzen von C. elegans (FASTA Format) 177 6.3. Sequenzvergleich der Protease-Domänen der Astacin-Protein-Familie 181 I. Zusammenfassung 1 I. ZUSAMMENFASSUNG Astacin (E.C. 3.4.24.21) aus dem Kaumagen des Flusskrebses Astacus astacus L. ist der Prototyp einer Familie von Zink-Endopeptidasen (Familie M12A, nach der Nomenklatur von Rawlings und Barrett), deren Mitglieder bei Vertebraten, Invertebraten und Bakterien gefunden werden. Die Mehrzahl der bisher beschriebenen Astacine enthalten dabei neben einem katalytischen Modul, der eigentlichen Astacin-Domäne, noch weitere Domänen die der Verankerung in der Zellmembran oder regulatorischen Aufgaben, etwa im Rahmen der Morphogenese und Differenzierung, dienen. In den letzten Jahren haben insbesonders die Genom- und Transkriptom-Analysen vieler Organismen die Anzahl annotierter Sequenzen, die Astacin-ähnliche Domänen enthalten, stark anwachsen lassen. (1) Bei dem Nematoden Caenorhabditis elegans konnte durch Datenbanksuchen mit dem BLAST-Algorithmus die überraschend große Zahl von 40 Astacin-homologen Genen identifiziert werden. Die Transkriptom-Analyse durch RT-PCR Experimente sowie die Auswertung der EST-Sequenzen und der microarray Ergebnisse von Kim et al. (2001) ergab, dass mit Ausnahme eines Pseudogens alle anderen Astacin-homologen Proteine auch tatsächlich exprimiert werden. Die gefundenen cDNA-Sequenzen wichen dabei zum Teil erheblich von den Spleißvorhersagen der wormpep oder Genie Gene Datenbanken ab und wurden für eine richtige Übersetzung der Transkripte in Protein-Sequenzen anhand der experimentellen Daten korrigiert. Um erste Aussagen über die Funktion dieser Proteine machen zu können erfolgte an ausgewählten Beispielen die Lokalisierung in vivo durch GFP-Reporter-Proteine. Anhand des Expressionmusters konnte für zwei Proteine auf eine Verdauungsfunktion und auf eine entwicklungsrelevante Rolle geschlossen werden. Die Auswertung der RNAi Untersuchungen von Maeda et al. (2001) und der microarray Analyse von Jiang et al. (2001) legen dabei für einige weitere Astacin-homologe Proteine in C. elegans eine entwicklungssteuernde Funktion nahe. Bei einer Proteom-Analyse durch 2D-Elektrophorese konnten zwar keine Astacin-homologen Proteine identifiziert, jedoch einige neue Proteine der C. elegans Proteinkarte (reference map) zugeordnet werden. (2) Aus den Basisgruppen des Tierreichs (z.B. Cnidaria) lagen bisher kaum Daten über Astacin-homologe Proteine vor. Hier konnten nun zwei neue Astacin-homologe Gene bei dem Modellorganismus Hydractinia echinata (Cnidaria, Hydrozoa) charakterisiert werden, die als Hydractinia echinata Astacin