Thesis Analyse de l'expression de BARD1 dans le cancer du poumon et le cancer colorectal ZHANG, Yong Qiang Abstract Les cancers du poumon et colorectaux sont les types de cancers les plus fréquents et les plus mortels. Plusieurs marqueurs pronostiques et prédictifs pour le cancer du poumon, de type "non-small cell lung cancer" (NSCLC), ont été identifiés récemment, parmi eux, BRCA1. BRCA1 est un suppresseur de tumeur, qui joue un rôle dans la réparation de l'ADN et dans la division cellulaire. La stabilité de la protéine BRCA1 dépend de son interaction avec une autre protéine, nommée BARD1. L'hétérodimère BARD1-BRCA1 a une activité d'ubiquitine-ligase E3, qui est responsable de toutes les fonctions oncosuppressives de BRCA1. Nous avons donc étudié l'expression de BARD1 et de BRCA1 dans des tissus de 100 cas de NSCLC et de 140 cas de cancers colorectaux. Des analyses par immuno-histochimie, basées sur la comparaison de plusieurs anticorps détectant des régions différentes de la protéine BARD1, ont mis en évidence que des formes de BARD1 aberrantes, mais pas la bona fide BARD1, sont exprimées dans ces cancers. Or, l'expression d'aucun antigène de BARD1 ne démontrait une corrélation avec l'expression de BRCA1. [...] Reference ZHANG, Yong Qiang. Analyse de l'expression de BARD1 dans le cancer du poumon et le cancer colorectal. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2010, no. Méd. 10625 URN : urn:nbn:ch:unige-118800 DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:11880 Available at: http://archive-ouverte.unige.ch/unige:11880 Disclaimer: layout of this document may differ from the published version. 1 / 1 Section de médecine Clinique Département de Gynécologie et Obstétrique Laboratoire de Gynécologie et Obstétrique Moléculaire Thèse préparée sous la direction du Professeur Olivier Irion et du Docteur Irmgard Irminger-Finger Analyse de l'expression de BARD1 dans le Cancer du Poumon et le Cancer Colorectal Thèse présentée à la Faculté de Médecine de l'Université de Genève pour obtenir le grade de Docteur en médecine par Yong Qiang ZHANG de Beijing (Chine) Thèse n° 10625 Genève 2010 i Dedicated specifically to My wife and my daughter, for supporting my study abroad wholeheartedly ii ACKNOWLEDGEMENTS In the first place, I would like to record my gratitude to my thesis supervisor, Dr. Irmgard Irminger-Finger, for her supervision, advice, and guidance of this research, as well as giving me extraordinary experiences throughout my two-year work and study. I sincerely express my thanks to Professor Olivier Irion for being my thesis director and for welcoming me to the Laboratory of Molecular Gynecology and Obstetrics. It is them who lead me into a science research world, which is very different from my clinical work field. Thanks for the help and support in both study and life during my stay in Geneva. I would like to thank Professor Paul Bischof and Professor Werner Schlegel for accepting to be my thesis jury. I would like to give credit to all previous and present members of the Laboratory of Molecular Gynecology and Obstetrics who helped me in various ways: specifically Dr. Eva Dizin-Bernabeu, and all others, Arwen Conod, Luciana Romano, Furaha Detraz, Filippo Molica, Dan Liu, Lin Li, JianYu Wu. I gratefully thank Dr. S Picciau, and Professor Luigi Atzuri, Andrea Bianco, Alvin M. Malkinson, and Regine Schneider-Stock for their precious collaboration. Great thanks to Dr. Michel Boulvain for his excellent support and help with the statistical analysis. Many thanks to Dr. Jean-Claude Pache for the help with his expertise on pathology. Last but not least, I also would like to thank Dr. Marie Cohen for her kindness and support, and Alice Neequaye for her joyous accompany and support. iii Investigation of BARD1 Expression in Non-Small Cell Lung Cancer and Colorectal Cancer CONTENTS Page I. Abbreviations 1 II. Summary in French 2 III. Introduction in French 4 IV. Summary in English 9 V. Introduction in English 11 1. BARD1 and its diverse functions 11 1.1. Structure of BARD1 11 1.2. Tissue distribution and cellular localization of BARD1 14 1.3. BARD1 knockout in animals and plants 16 1.4. Biological functions of BARD1 17 1.4.1. BRCA1-dependent functions of BARD1 17 1.4.1.1. Functions of the BRCA1-BARD1 heterodimer 17 1.4.1.2. Formation and regulation of BRCA1-BARD1 activity 19 1.4.1.3. The BRCA1-BARD1 targets and their associated functions 19 1.4.2. BRCA1-independent functions of BARD1 26 1.4.2.1. BARD1 and p53 26 1.4.2.2. BARD1 and NF-κB 29 1.5. Genetic and epigenetic modifications of BARD1 in cancer 30 1.5.1. BARD1 mutations, polymorphisms and cancer 30 1.5.2. BARD1 spliced isoforms and cancer 33 2. Cancers investigated in this study 36 2.1. Cancer occurrence and classification 36 iv 2.2. Non-small cell lung cancer 38 2.3. Colorectal cancer 39 3. Background of this study 40 VI. Materials and methods 46 1. Patients characteristics 46 1.1. Non-small cell lung cancer patients 46 1.2. Colorectal cancer patients 48 2. Mouse model of lung cancer 49 3. Immunohistochemistry 49 3.1. Immunohistostaining 49 3.2. Analysis and semi-quantitation of immunohistochemistry 50 4. Reverse transcription and PCR 51 5. DNA purification, cloning and sequencing 52 6. Statistical analysis 53 VII. Results 54 1. Investigation of BARD1 expression in human NSCLC 54 1.1. All NSCLC samples express BARD1 epitopes 54 1.2. Non-coordinate expression of BARD1 and BRCA1 59 1.3. BARD1 isoforms more expressed in tumor than peri-tumor tissues and more elevated in female than male patients 59 1.4. Correlation of BARD1 protein expression with clinicopathological characteristics and patients prognosis 62 1.5. Sequential expression of BARD1 epitopes at different stages of tumorigenesis in a mouse model of lung cancer 68 1.6. Structure of BARD1 isoforms expressed in NSCLC 70 2. Investigation of BARD1 expression in colorectal cancer 75 2.1. BARD1 protein level expressed in colorectal cancer samples 75 2.2. Non-coordinate expression of BARD1 and BRCA1 80 2.3. Correlation of BARD1 protein expression with clinicopathological characteristics and patients prognosis 81 v 2.4. Structure of BARD1 isoforms expressed in colorectal cancer 83 2.5. Similar BARD1 expression patterns observed in tissues from males and females 85 VIII. Discussion 88 IX. Perspectives and goals 93 X. Conclusions 94 XI. References 95 XII. Appendix 107 vi Abbreviations AJCC American Joint Committee on Cancer ANK Ankyrin domain BARD1 BRCA1-associated RING domain protein 1 BRCA1 Breast cancer susceptibility gene 1 BRCA2 Breast cancer susceptibility gene 2 BRCT BRCA1 carboxy-terminal domain DAB Diaminobenzidine tetrahydrocholoride DFS Disease-free survival DSBs Double strand breaks EGFR Epidermal growth factor receptor EtBr Ethidium bromide FL Full length GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase IHC Immunohistochemistry MW Molecular weight NES Nuclear export signal NLS Nuclear localization signal NSCLC Non-small cell lung cancer OS Overall survival RING RING (really interesting new gene) domain RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction SNP Single-nucleotide polymorphism WHO World health organization 1 Résumé Les cancers du poumon et colorectaux sont les types de cancers les plus fréquents et les plus mortels. Plusieurs marqueurs pronostiques et prédictifs pour le cancer du poumon, de type "non-small cell lung cancer" (NSCLC), ont été identifiés récemment, parmi eux, BRCA1. BRCA1 est un suppresseur de tumeur, qui joue un rôle dans la réparation de l’ADN et dans la division cellulaire. La stabilité de la protéine BRCA1 dépend de son interaction avec une autre protéine, nommée BARD1. L’hétérodimère BARD1-BRCA1 a une activité d’ubiquitine-ligase E3, qui est responsable de toutes les fonctions oncosuppressives de BRCA1. Nous avons donc étudié l’expression de BARD1 et de BRCA1 dans des tissus de 100 cas de NSCLC et de 140 cas de cancers colorectaux. Des analyses par immuno-histochimie, basées sur la comparaison de plusieurs anticorps détectant des régions différentes de la protéine BARD1, ont mis en évidence que des formes de BARD1 aberrantes, mais pas la bona fide BARD1, sont exprimées dans ces cancers. Or, l’expression d’aucun antigène de BARD1 ne démontrait une corrélation avec l’expression de BRCA1. Ceci suggère que la fonction d’ubiquitine-ligase E3 de l’hétéromère BARD1-BRCA1 soit compromise dans des cellules de ces cancers. Nous avons déterminé la structure des ARN messagers de BARD1 de 20 cas de NSCLC et 20 cas de cancer colorectaux. En plus des isoformes que nous avions décrites auparavant dans des cancer gynécologiques, nous avons identifié deux nouvelles formes de BARD1, les isoformes κ et π, dans des tumeurs de NSCLC et colorectales. Toutes les isoformes étaient surproduites exclusivement dans les tumeurs colorectales, par contre, pour NSCLC, toutes les formes de BARD1 étaient exprimées dans la tumeur et dans le tissu normal adjacent avec l’exception de l’isoforme π, qu’on ne trouvait que dans les tissus tumoraux. Ceci suggère que l’expression des isoformes de BARD1 serait modulée par des facteurs dépendant du type de tissu et de pathologie. L’expression de BARD1, ainsi que de BRCA1, peuvent être modulées par les oestrogènes via le récepteur aux oestrogènes (ER). Nous avons trouvé que ER-α était exprimé dans des tissus de poumons mais pas colorectaux. Il est donc possible que BARD1 joue un rôle 2 dans la voie de signalisation des oestrogènes, qui est soupçonnée d’être responsable de la prédisposition élevée des femmes au cancer des poumons. Il est très intéressant, que l’expression des différentes combinaisons d’isoformes soit corrélée au pronostique du patient. Ainsi, l’expression des epitopes encodés par l’exon 3 et le début de l’exon 4, qui est compatible avec l’expression de l’isoforme π, est corrélée avec un mauvais pronostique chez les patients de NSCLC et de cancer colorectaux.