Acyl-CoA Dehydrogenases: Mechanistic studies on Medium Chain Acyl-CoA Dehydrogenase Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) an der Universität Konstanz (Fachbereich Biologie) vorgelegt von Vasile Robert Gradinaru Konstanz, im Juni 2005 Tag der mündlichen Prüfung : 9. November 2005 Referent: Prof. Dr. Sandro Ghisla Referent: Prof. Dr. Peter Macheroux Acknowledgements I am greatly indebted to my supervisor, Prof. Dr. Sandro Ghisla, for his advice and support. He has been an excellent supervisor providing insightful comments and constructive criticism throughout this PhD project. I would also like to thank my colleagues in the Universities of Konstanz and Iasi for their advice, encouragement and friendship, without which I would certainly not have completed this thesis. In particular, I would like to thank Prof. Dr. Richard Schowen, Prof. Dr. Peter Macheroux, Prof. Dr. Colin Thorpe, Prof. Dr. Jung-Ja. Kim, Prof. Dr. Tatiana Nicolaescu, Prof. Dr. Constantin Ciugureanu, Prof. Dr. Robert Bach, Dr. Olga Dmitrenko, Susanne Feindler-Boeckh, Gudrun Vogt, Elmi Leisner, Karl Janko, Lili Smau, Nasser Ibrahim, Phaneeswara Rao Kommoju, Sudarshan Rao Ande, Lakshminarayana Kaza, Cosmin Pocanschi, Paula Bulieris for their active interest during the course of this project. My gratitude also goes to Prof. Alexandru Cecal for encouraging me to embark on this PhD. I express my loving thanks to my wife Luiza whose love, support, patience and understanding made this work easier. Above all, I wish to express my sincerest gratitude to my parents, who made my studies possible and who have always encouraged me. This study was financiarlly supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Gh 2/6-4). Parts of this study are to be published or have been published: 1 Gradinaru, R., Kieweg, V., Küchler, B. & Ghisla, S. (2002) On the role of the 376-functional group in catalysis by medium chain acyl-CoA-dehydrogenase. In Flavins and Flavoproteins. Proceedings of the 14th International Symposium, Cambridge, UK (Chapman, S., Perham, R., Scrutton, N., eds.), Agency for Scientific Publishers, Berlin, pp.193-198. 2 Gradinaru, R., Dmitrenko, O., Lakshmi Narayana, K., Bach, R. D. & Ghisla, S. (2005) Role of the active center Thr168-flavinN(5) H-bond in MCAD catalysis, In Flavins and Flavoproteins. Proceedings of the 15th International Symposium (17-25 April, Shonan-Japan) in press. 3 Gradinaru, R., Kieweg, V., Schowen, R. & Ghisla, S. (2005) Human Medium- Chain Acyl-CoA Dehydrogenase, Proton Inventory Studies on the Dehydrogenation Mechanism of the Glu376Gln Mutant (Biochemistry). 4 Gradinaru, R., Dmitrenko, O., Bach, R. D. & Ghisla, S. (2005) Mechanisms and properties of medium-chain acyl-CoA dehydrogenase: Role of the active center Thr168-flavinN(5) H-bond in catalysis (Biochemistry). 5 Gradinaru, R., Dmitrenko, O., Bach, R. D. & Ghisla, S. Mechanisms and properties of medium-chain acyl-CoA dehydrogenase: Role of the active center Thr136-flavinN(1) H-bond in catalysis (manuscript under preparation). I ABBREVIATIONS ACADs Acyl-CoA dehydrogenases ATP Adenosine triphosphate bp Basepairs BSA Bovine serum albumine CoA Coenzyme A C4CoA Butyryl-CoA C6CoA Hexanoyl-CoA C8CoA Octanoyl-CoA C10CoA Decanoyl-CoA C12CoA Lauroyl-CoA C14CoA Myristoyl-CoA C16CoA Palmitoyl-CoA C18CoA Stearoyl-CoA C20CoA Arachidoyl-CoA CPT I Carnitine palmityol transferase I DAAO D-Amino-Acid Oxidase e Extinction coefficient ETF Electron transfer flavoprotein ETF:QO ETF:coenzyme Q oxidoreductase FAD Flavinadenindinucleotide FcPF6 Ferriceniumhexafluorphosphate FMN Flavinmononucleotide FPLC Fast protein liquid chromatography HPLC High performance liquid chromatography IPTG Isopropyl-b-D-1-Thiogalactopyranoside LCAD Long Chain Acyl-CoA Dehydrogenase Ka Acidity constant Kd, app Apparent dissociation constant KDa Kilo Dalton KPi Potassium phosphate buffer Km Michaelis-Menten constant MW Molecular weight MCAD Medium Chain Acyl-CoA Dehydrogenase MCADD Medium Chain Acyl-CoA Dehydrogenase Deficiency PCR Polymerase chain reaction SCAD Short Chain Acyl-CoA Dehydrogenase SIDS Sudden Infant Death Syndrome SDS Sodium Dodecyl Sulfate SDS-PAGE SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis TO Turnover Number VLCAD Very Long Chain Acyl-CoA Dehydrogenase Vmax Maximum velocity II SHORT HAND SYMBOLS FOR AMINO ACIDS One letter Three letter Amino Acid A Ala Alanine R Arg Arginine N Asn Asparagine D Asp Aspartic acid B Asx Asn or Asp C Cys Cysteine Q Gln Glutamine E Glu Glutamic acid Z Glx Gln or Glu G Gly Glycine H His Histidine I Ile Isoleucine L Leu Leucine K Lys Lysine M Met Methionine F Phe Phenylalanine P Pro Proline S Ser Serine T Thr Threonine W Trp Tryptophan Y Tyr Tyrosine V Val Valine III ZUSAMMENFASSUNG Acyl-CoA Dehydrogenasen bilden eine Familie von Flavoproteinen, welche die a,b- Dehydrogenierung von Fettsäure-CoA Thioester. Die sogenannte “Medium Chain Acyl- CoA Dehydrogenase (MCAD) ist eines der am besten untersuchten Mitglieder dieser Familie. Die a,b-Dehydrogenierung beinhaltet die konzertierte Spaltung der a- und b-C-H Bindunges des Substrates. Dies geschieht indem eine Base am Aktivzentrum, Glu376-COO-, das a-H als Proton abspaltet. Damit gekoppelt ist die Übertragung eines Hydrids aus der Substrat b-Stellung auf die Flavin N(5) Funktion. In meiner Dissertation habe ich verschiedene Aspekte der Katalyse durch die MCAD untersucht. Hierzu wurde u.A. auch eine Mutante der MCAD erzeugt, die am C-Terminus einen sog. “His Tag“ trägt. Dies erleichtert die Reinigung von heterolog exprimiertem Protein. Zur Untersuchung des Mechanismus wurden vor allem Mutanten der E376- und der E99- Funktionen eingesetzt. Letztere befindet sich “am Boden” des Aktivzentrums und es wurde davon ausgegangen, dass es Ionisationsvorgänge innerhalb des Aktivzentrums beeeinflusst. Ein wesentlicher Teil der Studien betraf die E376Q-MCAD Mutation. Diese Mutante sollte eigentlich “tod” sein, denn das Glutamin hat keine basische Funktionen. Allerdings zeigt sie eine “residual “activity” im Bereiche von 1/100000 verglichen mit wtMCAD. Dies ist zwar ein kleiner Wert, ist jedoch um eine gleiche Grössenordnung grösser als die unkatalysierte Reaktion. Zum Studium des Mechanismus der Reaktion, die durch diese Mutante katalysiert wird, wurde die sog. “proton inventory technique” eingesetzt. Zudem wurde ermittelt, dass die Geschwindigkeit dieser Reaktion linear mit dem pH zunimmt. Dies legt eine Beteiligung von HO- nahe. Eine Vergleichbare Abhängigkeit wurde mit der Glu376Gln+Glu99Gly-MCAD Mutante beobachtet. Dies schliesst eine Beteiligung von Glu99 bei der Reaktion aus. Die E376Q-MCAD Mutante zeigt einen aussergewöhnlich grossen Lösungsmittelisotopeneffekt ≈ 8.5. Dies wird der Versänderung mehrerer H-Brücken im Verlaufe des Schrittes zugeschrieben. IV Eine weitere Untersuchung betrifft die Rolle einer “speziellen” Wasserstoff- brückenbindung zwischen N(5) des Flavinkofaktors und Thr168-OH. Eine funktionelle Gruppe, die eine ähnliche H-Brücke ausbilden kann ist inerhalb der ACAD-Familie konserviert (Thr oder Ser). Mit der T168A-MCAD Mutante, bei der diese H-Brücke nicht ausgebildet werden kann, sind zwei Arten von Effekt beobachtet worden: a) Einen Einfluss auf die Aktivierung des Substrates und auf das Redoxpotential des Flavins sowie b) eine Rolle bei der Optimierung der Orientierung zwischen substrat und Flavin. Ein weiteres Threonin (Thr136) moduliert das Redoxpotential des Flavins (≈ -30 mV im Vergleich zu wtMCAD =>1.4 Kcal·M-1). So wird z.B. bei der Thr136Ala Mutante der Kofaktor nur noch teilweise reduziert, was auf die Erniedrigung des Redoxpotentials zurückgeführt wird. Diese Experimente wurden durch theoretische Berechnungen unterstützt, die durch die Gruppe um Prof. R. Bach (Univ. Delaware, USA) durchgeführt wurden. V SUMMARY Acyl-CoA dehydrogenases constitute a family of flavoproteins that catalyze the a,b- dehydrogenation of fatty acid acyl-CoA thioesters. Medium chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) is one of the best-studied members of this family. The a,b- dehydrogenation reaction involves the concerted C-H bonds cleavage of the substrate. First, the active site base, Glu376-COO-, removes a proton by and then a hydride is transferred to the flavin N(5) position of FAD. In my thesis MCAD several mechanistic details of the dehydrogenation reaction for MCAD were investigated. For this, among other things, a mutant of MCAD was created, which carries a C-terminal “His Tag”. Addition of affinity His Tag facilitates purification of recombinant MCAD. For the investigation of the mechanism above several E376- or/and E99-MCAD mutants were used. Last one received an earlier attention since the Glu99 is located underneath of the active site of MCAD. This residue affects ionizations inside the active center cavity. Many studies were focused on E376Q-MCAD mutant. This mutant was highly inactive, because the glutamine does not play the role of the base. However its residual “activity” is 1/100000 of that of wtMCAD. This is a small value, but has the same order of magnitude as those found in non-catalyzed reactions. Proton inventory technique was suitable for mechanistic study of this mutant. Apart from this, it was observed that the log of rates of dehydrogenation increases linearly with the pH suggesting HO- as a reactant. A similar dependence was observed with Glu376Gln+Glu99Gly-MCAD. Thus, activity and reduction studies exclude Glu99 as a candidate for proton abstraction in the first step of dehydrogenation. E376Q-MCAD mutant reflected a large unexpected solvent isotope effect of ≈