UNIVERSITE DE TUNIS EL MANAR Ecole Doctorale des Sciences Biologiques et AIX-MARSEILLE UNIVERSITE Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé THESE DE DOCTORAT EN COTUTELLE En Vue de l’obtention de grade de Docteur de l’Université de Tunis et d’Aix-Marseille Université Spécialités: Microbiologie / Pathologie humaine et maladies infectieuses Déterminisme du support moléculaire et de l’épidémiologie de la résistance aux ȕ-lactamines chez des bacilles à Gram négatif isolés dans des hôpitaux tunisiens et libyens Présentée par: Najla MATHLOUTHI Composition du Jury: Pr. Imane ZOUARI Université Tunis el Manar Président de Jury Dr. Marie KEMPF Université d’Angers Rapporteur Dr. Taoufik GHRAIRI Université Tunis el Manar Rapporteur Pr. Philippe COLSON Université d’Aix-Marseille Examinateur Pr. Mr. Jean-Marc ROLAIN Université d’Aix-Marseille Directeur de Thèse Dr. Chedly CHOUCHANI Université de Carthage Directeur de Thèse (8 Avril 2017) SOMMAIRE AVANT PROPOS ...................................................................... 3 RESUME .................................................................................... 4 SUMMARY ................................................................................ 5 INTRODUCTION ..................................................................... 7 CHAPITRE I: Revue: L’émergence et la dissémination des carbapénèmases produites par les bacilles à Gram négatifs dans les pays du bassin méditerranéen ............................................... 15 Article 1: Prevalence and emergence of carbapenemases producing Gram-negative bacteria in Mediterranean basin ..... 17 CHAPITRE II: Etude du déterminisme génétique et de l’épidémiologie moléculaire de la résistance aux β-lactamines chez des souches d’Esherichia coli et de Klebsiella pneumonaie isolées dans des hôpitaux tunisiens et libyens ........................... 39 Article 2: Characteristics of Carbapenemase-and Extended- Spectrum β-Lactamase-producing Enterobacteriaceae isolated from Tunisian and Libyan Hospitals ......................................... 49 CHAPITRE III: Etude du déterminisme génétique et de l’épidémiologie moléculaire de la résistance aux β-lactamines chez des souches d’Acinetobacter baumannii et de Pseudomonas aeruginosa isolées dans des hôpitaux tunisiens et libyens ........ 61 1 Article 3: Emergence of Carbapenem-Resistant Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii Clinical Isolates Collected from Some Libyan Hospitals ..................................... 77 Article4: Early detection of metallo--lactamase NDM-1 and OXA-23 carbapenemase-producing Acinetobacter baumannii in Libyan hospitals ......................................................................... 87 Article 5: Incidence of OXA-23 and OXA-58 carbapenemases co-expressed in clinical isolates of Acinetobacter baumannii in Tunisia ....................................................................................... 95 Chapitre VI (Annexe): Travaux sur la description et le séquençage des génomes de nouvelles espèces ....................... 123 Article 6: Genome sequence and description of Mobilicoccus massiliensis sp. nov. isolated from the stool of a Nigerien male suffering from a severe form of acute malnutrition ‘‘kwashiorkor’’ ........................................................................ 127 Article 7: Genome sequence and description of Paenibacillus ihuae strain GD6 sp. nov. isolated from the stool of a 62-year-old man, France ............................................................................. 157 CONCLUSION ET PERSPECTIVES ................................. 185 REMERCIEMENTS ............................................................ 191 2 AVANT PROPOS Le format de présentation de cette thèse correspond à une recommandation à la spécialité Pathologie Humaine et Maladies infectieuses, à l’intérieur du Master des Sciences de la Vie et de la Santé qui dépend de l’Ecole Doctorale des Sciences de la Vie de Marseille. Le candidat est amené à respecter les règles qui lui sont imposées et qui comportent un format de thèse utilisé dans le Nord de l’Europe et qui permet un meilleur rangement que les thèses traditionnelles. Par ailleurs, la partie introduction et bibliographie est remplacée par une revue envoyée dans un journal afin de permettre une évaluation extérieure de la qualité de la revue et de permettre à l’étudiant de commencer le plus tôt possible une bibliographie sur le domaine de cette thèse. Par ailleurs, la thèse est présentée sur article publié, accepté, ou soumis associé d’un bref commentaire donnant le sens général du travail. Cette forme de présentation a paru plus en adéquation avec les exigences de la compétition internationale et permet de se concentrer sur des travaux qui bénéficieront d’une diffusion internationale. Professeur Didier RAOULT 3 RESUME L’augmentation et la dissémination de la résistance aux β-lactamines chez les bacilles à Gram négatif, particulièrement les Entérobactéries, les bactéries du genre Pseudomonas et Acinetobacter, représentent un problème majeur de santé publique. Les infections nosocomiales causées par ces bactéries multi-résistantes (BMR) ont conduit à une augmentation de la mortalité, de la morbidité et du coût de traitement. L’utilisation abusive et non contrôlée de ces antibiotiques a grandement contribué à la large diffusion de cette résistance. Ainsi, face à cette préoccupation mondiale et suite à de nombreuses recommandations, plusieurs études épidémiologiques et moléculaires ont été rapportées afin de contrôler et de surveiller la diffusion et la dissémination des BMR. Contrairement à de nombreuses régions dans le monde, il existe peu d’informations concernant la caractérisation moléculaire des gènes de résistance aux β-lactamines des bacilles à Gram négatif isolés en Tunisie et surtout en Libye. C’est dans cette optique que ce projet de Thèse de Doctorat s’articule avec comme objectifs: (i) mettre en évidence la prévalence des bacilles à Gram négatifs multi-résistants isolés aux niveaux des hôpitaux tunisiens et libyens (ii) identifier le support génétique de la résistance aux β-lactamines de ces souches cliniques (iii) étudier la diversité clonale des souches multi-résistantes par typage moléculaire (iiii) étudier l’épidémiologie moléculaire de ces BMR en Tunisie et en Libye ainsi que dans le bassin méditerranéen afin de maîtriser le processus décisionnel du traitement et de limiter la dissémination des épidémies. Mots clés: bacilles à Gram-négatif, bassin méditerranéen, isolats cliniques multi-résistants aux β-lactamines, études moléculaires des mécanismes de résistance aux β-lactamines, études épidémiologiques. 4 SUMMARY The increase and spread of β-lactam resistance in gram negative bacteria especially Enterobacteriaceae, Pseudomonas and Acinetobacter (E.P.A) species have become a major concern worldwide. The hospital-acquired infections caused by MDR bacteria have led to an increase in mortality, morbidity and cost of treatment. The frequent misuse of antibiotic drug has greatly contributed to worldwide dissemination of antibiotics resistance. Front of this worldwide concern, and various recommendations, several epidemiological and molecular studies have been reported in order to control the spread and the dissemination of these MDR. Unlike many parts of the world, there is little information concerning the molecular characterization of the β-lactam resistance genes of Gram-negative bacilli isolated in Tunisia and especially in Libya. Therefore, it is in this context that the project of this thesis was conducted with essential objectives: (i) highlight the prevalence of multi-resistant Gram negative bacilli isolated in Tunisian and Libyan hospitals (ii) identify the genetic support of resistance to β-lactams of these clinical strains (iii) study the molecular epidemiology of these BMR in Tunisia and Libya as well as in the Mediterranean basin in order to control the decision-making process and to limit the spread of epidemics. Keywords: Gram-negative bacilli, mediterranean basin, clinical isolates multi-resistant to β-lactams, molecular studies of the mechanisms of β-lactam resistance, epidemiological studies. 5 INTRODUCTION La découverte des antibiotiques, notamment la pénicilline en 1928 a sans doute été l’une des avancées thérapeutiques les plus importantes du vingtième siècle. L’utilisation de ces agents anti- infectieux depuis les années 1940 a considérablement réduit le taux de morbidité et de mortalité liés aux maladies infectieuses [1]. Cependant, leur utilisation à grande échelle a également conduit à l’émergence de la résistance aux antibiotiques. Les premières bactéries résistantes ont été identifiées dès les années 1940, avec notamment l’émergence des Staphylococcus aureus résistants à la pénicilline dès 1947, soit seulement quatre années après l’utilisation à grande échelle de cet antibiotique [2]. A partir des années 1950, de nombreux antibiotiques ont été découverts ou synthétisés et le développement de chaque nouvelle classe a été suivi par l’apparition de l’émergence de nouveaux mécanismes de résistance entraînant la diffusion de bactéries pathogènes de plus en plus difficiles à traiter, comme ce fut le cas pour la méticilline G qui a été mise sur le marché en 1961 et suivie de la découverte de S. aureus résistant en 1962, pareillement pour l’ampicilline G qui a été mise sur le marché en 1962 et suivie de l’émergence d’Entérobactéries résistantes en 1964 puis des céphalosporines mis sur le marché en 1980 et suivis de l’émergence