Universidad del País Vasco Facultad de Medicina y Enfermería Departamento de Fisiología Antitumoral actions of Vismia baccifera on human hepatocellular carcinoma HepG2 Tesis doctoral para optar al grado de Doctor, presentada por: Jenifer Trepiana Arín Leioa, Julio 2016 Directores de tesis: Mª Begoña Ruiz Larrea José Ignacio Ruiz Sanz (c)2016 JENIFER TREPIANA ARIN In order to conduct this Doctoral Thesis I have been awarded a Predoctoral Research Training grant by the University of the Basque Country, UPV/EHU during the period 2012-2016. In addition, I have also been awarded a mobility grant for researchers from the University of the Basque Country, UPV/EHU for a three months stay in the INSERM VINCO U916, Institute Bergonié, Bordeaux, France, under the supervision of Dr. Mojgan Djavaheri-Mergny. This work was supported by research grants from the Basque Country Government (Department of Education, Universities and Research, ref. IT687-13, and DCIT, ref. S- PE12UN056), and University of the Basque Country, UPV/EHU (CLUMBER UFI11/20). Technical and human support provided by SGIKer (UPV/EHU, MICINN, GV/EJ, ESF) is gratefully acknowledged. AGRADECIMIENTOS Ante todo me gustaría agradecer a mis directores de tesis, Mª Bego y José Ignacio, por permitirme formar parte del grupo de investigación y por enseñarme a lo largo de estos años. Gracias por vuestra disponibilidad, por vuestra ayuda y por vuestros consejos durante todo el doctorado. También me gustaría agradecer a Mojgan Djavaheri-Mergny, por darme la oportunidad de pasar tres meses en el laboratorio del Instituto Bergonié de Burdeos. Muchas gracias por todo lo que me has enseñado y el buen trato recibido durante toda la estancia, tanto por tu parte como por la de los compañeros del laboratorio. Agradecer a toda la gente del ”labo”, tanto a los que ya estaban cuando llegué como a los que acaban de empezar. En especial, a todo el grupo de “Radicales libres” por el buen ambiente, que ha sido mucho mejor de lo que me podría haber imaginado. En primer lugar a Oihana, porque fuiste la primera persona que conocí en el laboratorio y por enseñarme tan bien durante mis primeros meses. A Susana, por todo lo que me has ayudado, por tu alegría y por todas las horas que hemos compartido. A Irantzu, por todas esas charlas en el despacho y por el ánimo que me has dado. En definitiva, a todos los “Radicales”, porque ya podría trabajar siempre con gente como vosotros. A Josean, por todo lo que me has ayudado con los cultivos celulares durante estos años, y por estar siempre dispuesto a echar una mano. A todos los del grupo de “Colesterol”, del primero al último, porque después de pasar tanto tiempo juntos os habéis convertido en algo más que compañeros de trabajo. Siempre voy a recordar esas celebraciones y despedidas con todos los de “Radicales” y “Colesterol”, algunas con “gincana” y regalo de embutidos incluidos. A todos los que ya han terminado su etapa en el laboratorio. En especial a Juan, porque sigues siendo el alma positiva incluso cuando estás a miles de kilómetros; así da gusto. A mis amigos, por su interés en mis investigaciones. En especial a los de Miranda, que siempre han creído que voy a llegar lejos. A mis padres y hermanas, por apoyarme y mostrar tanto interés en mis experimentos. A mi hermana Juncal y mi cuñado Víctor, por preguntarme cada día “¿Qué tal tus células?”, y por escuchar mis “batallitas” en el laboratorio. Gracias a todos por vuestro apoyo y ánimo, porque sin vosotros no hubiese llegado hasta aquí. Y por último, me gustaría agradecer de forma especial a Iñaki. Gracias por escucharme siempre y haberme ayudado en los días más duros. Porque has conseguido que sobretodo estos últimos meses hayan sido más llevaderos con todas esas “risotadas” y “chanzas” juntos, que me hacen desconectar del trabajo cuando estás a mi lado. A todos vosotros, gracias. Jenifer. TABLE OF CONTENTS Table of contents TABLE OF CONTENTS ABBREVIATIONS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 25 RESUMEN --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 31 1. INTRODUCTION ---------------------------------------------------------------------------------------------- 41 1.1. Traditional medicine and Vismia baccifera ---------------------------------------------------- 43 1.2. Polyphenols as chemotherapeutic agents ----------------------------------------------------- 45 1.3. ROS sources in hepatocarcinoma cell lines ---------------------------------------------------- 48 1.4. ROS influence in the main transduction pathways implicated in HCC ----------------- 50 1.4.1. PI3K/Akt pathway -------------------------------------------------------------------------- 51 1.4.2. The MAPK pathway ------------------------------------------------------------------------ 54 1.4.3. MAPK pathway regulated by ROS ------------------------------------------------------ 56 1.5. Cell cycle control and ROS ------------------------------------------------------------------------- 59 1.5.1. Cyclin-CDK complexes --------------------------------------------------------------------- 59 1.5.2. The G1 checkpoint -------------------------------------------------------------------------- 60 1.5.3. Control of S phase -------------------------------------------------------------------------- 66 1.5.4. The G2 checkpoint -------------------------------------------------------------------------- 66 1.5.5. DNA damage response -------------------------------------------------------------------- 68 1.6. Endoplasmic reticulum stress --------------------------------------------------------------------- 70 1.6.1. IRE1-XBP1 pathway ------------------------------------------------------------------------ 71 1.6.2. PERK-eIF2α-ATF4-CHOP ------------------------------------------------------------------- 72 1.6.3. ATF6 -------------------------------------------------------------------------------------------- 73 1.6.4. The role of ROS in ER stress -------------------------------------------------------------- 74 1.7. Autophagy ---------------------------------------------------------------------------------------------- 75 1.7.1. Mechanism of autophagy ---------------------------------------------------------------- 76 1.7.2. The role of ROS in autophagy ----------------------------------------------------------- 77 2. HYPOTHESIS AND OBJECTIVES -------------------------------------------------------------------------- 83 19 Table of contents 3. MATERIALS AND METHODS ------------------------------------------------------------------------------ 87 3.1. Materials ------------------------------------------------------------------------------------------------ 89 3.2. Methods ------------------------------------------------------------------------------------------------ 89 3.2.1. Preparation of Vismia baccifera extract ---------------------------------------------- 89 3.2.2. Characterization of the total antioxidant activity ---------------------------------- 90 3.2.2.1. ABTS+ radical cation decolorization assay -------------------------------- 90 3.2.2.2. Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) ---------------------------- 91 3.2.3. Culture and maintenance of cell lines ------------------------------------------------- 91 3.2.4. Cytotoxicity assay --------------------------------------------------------------------------- 92 3.2.5. Intracellular ROS detection -------------------------------------------------------------- 92 - 3.2.6. Mitochondrial O2 detection ----------------------------------------------------------- 93 3.2.7. Mitochondrial membrane potential (Δψm) ----------------------------------------- 93 3.2.8. Cell cycle analysis --------------------------------------------------------------------------- 94 3.2.9. Caspase activities --------------------------------------------------------------------------- 94 3.2.10. Sample preparation for transmission electron microscopy ------------------- 95 3.2.11. Scratch wound assay --------------------------------------------------------------------- 96 3.2.12. Transwell migration and invasion assay -------------------------------------------- 96 3.2.13. Antioxidant enzyme activities --------------------------------------------------------- 97 3.2.13.1. Superoxide dismutase (SOD) ----------------------------------------------- 97 3.2.13.2. Glutathione peroxidase (GPx) --------------------------------------------- 98 3.2.14. Determination of GSH and GSSG levels --------------------------------------------- 99 3.2.15. H2O2 measurement --------------------------------------------------------------------- 100 3.2.16. Protein immunodetection by western blot --------------------------------------- 101 3.2.17. Samples preparation for immunofluorescence confocal microscopy ----- 102 3.2.18. XBP1 alternative splicing determination by RT-PCR ---------------------------- 103 3.2.19. Adhesion assay --------------------------------------------------------------------------- 105 3.2.20. Statistical analysis ------------------------------------------------------------------------ 105 20 Table of contents 4. RESULTS ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 107 4.1. Cytotoxic actions of V. baccifera on human hepatocarcinoma HepG2 cell line ---- 109 4.1.1. Cell toxicity ---------------------------------------------------------------------------------- 109 - 4.1.2. Intracellular ROS and mitochondrial O2 --------------------------------------------