Place de la biologie moléculaire dans l’épidémiologie, le diagnostic et l’évaluation de la chimiorésistance du paludisme en République Démocratique du Congo Dieudonné Mvumbi Makaba, MD, MSc. Département des Sciences de Base Faculté de Médecine Université de Kinshasa Thèse soutenue et défendue publiquement en vue de l'obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales (PhD) Promoteur: Co-promoteur: Marie-Pierre Hayette, PhD Jean-Marie Kayembe, PhD Ulg Unikin Thèse Place de la biologie moléculaire dans l’épidémiologie, le diagnostic et l’évaluation de la chimiorésistance du paludisme en République Démocratique du Congo Par Dieudonné Mvumbi Makaba Présentée et soutenue publiquement en vue de l'obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales (PhD) Le 11 février 2017 Composition du Jury : 1. Professeur Marie-Pierre Hayette, Université de Liège (promoteur) 2. Professeur Jean-Marie Kayembe, Université de Kinshasa (co-promoteur) 3. Professeur Hippolyte Situakibanza, Université de Kinshasa 4. Professeur Gauthier Mesia, Université de Kinshasa 5. Professeur Patrick De Mol, Université de Liège 6. Professeur Dieudonné Mumba, Université de Kinshasa 7. Professeur Prosper Lukusa, Katholieke Universiteit Leuven Université de Kinshasa Faculté de Médecine Département des Sciences de Base Service de Biologie Moléculaire Place de la biologie moléculaire dans l’épidémiologie, le diagnostic et l’évaluation de la chimiorésistance du paludisme en République Démocratique du Congo Dieudonné Mvumbi Makaba Promoteur Co-promoteur Marie-Pierre Hayette, PhD Jean-Marie Kayembe N., PhD A ma famille … Table des matières Liste des figures iii Liste des tableaux iv Liste des abréviations v Remerciements vi Résumé ix Introduction………………………………………………………….1 Partie I: Etat des connaissances……………………………………3 I.1. Le paludisme: de l'antiquité à nos jours…………..……… 4 I.2. Des parasites en cause………………………….………….8 I.3.Approche diagnostique……………………………………14 I.4. Des molécules antipaludiques……………………………28 I.5. De la résistance aux antipaludiques……………………...33 I.5.1. Des marqueurs moléculaires de la résistance…...36 I.5.2. Des données disponibles sur la résistance moléculaire aux antipaludiques en RD Congo……………….......66 Etude 1: Falciparum malaria molecular drug resistance in the Democratic Republic of Congo: a systematic review…..…..67 Partie II: Du diagnostic et de l’épidémiologie moléculaires du paludisme en RDC………………………………………………………….…….75 II.1. Introduction…………………………………………….76 II.2. Objectifs………………………………………………..80 II.3. Etude 2: Comparaison de deux techniques d'extraction d'ADN plasmodial à partir des gouttes épaisses…………...……..…..82 i II.4. Etude 3: Real-time PCR when using archived thick blood films as source of DNA compared to microscopy for malaria diagnosis in Kinshasa, DR Congo …………………………………………88 II.5. Etude 4: High prevalence of falciparum malaria in asymptomatic individuals in Democratic Republic of Congo…………...….98 II.6. Etude 5: Investigation on possible transmission of monkeys' plasmodium to human in a populations living in the equatorial rainforest of the Democratic republic of Congo…………….104 Partie III : De la chimiorésistance moléculaire de Plasmodium falciparum en RDC………………………………………………………………..109 III.1. Introduction……………………………………………110 III.2. Objectifs……………………………………………….112 III.4. Etude 6: Assessment of pfcrt 72-76 haplotypes eight years after chloroquine withdrawal in Kinshasa, Democratic Republic of Congo III.5.Etude7: Molecular surveillance of Plasmodium falciparum resistance to artemisinin-based combination therapies in the Democratic Republic of Congo………………………….…121 Partie IV: Discussion générale et conclusion……………………..140 Perspectives…………………………………………………………149 Références……………………………………………..……………151 ii Liste des figures Figure 1. Stratégie technique mondiale de lutte contre le paludisme de l’OMS Figure 2. Distribution mondiale du paludisme du milieu du XIXe siècle à 2007 Figure 3.Paludisme versus pauvreté. Figure 4. Cycle de vie du Plasmodium chez l’homme et chez le moustique Figure 5. Fréquences et distribution des allèles du groupe sanguin Duffy Figure 6. Distribution spatiale de P. vivax en 2010 Figure 7. Phylogénie schématique des plasmodiums des mammifères Figure 8. Préparation de la goutte épaisse et du frottis mince Figure 9. QBC malaria tube de chez Woodley laboratory diagnostics Figure 10. Composition et mécanisme de détection des tests immunochromatographiques pour le paludisme. Figure 11. Configuration et interprétation des résultats de 2 types de TDR commerciaux Figure 12. Différentes étapes du processus de la PCR Figure 13. Agents se liant à l’ADN double brin Figure 14. Hydrolyse et hybridation de 2 sondes Figure 15. Représentation schématique de la démarche pour le développement d’une PCR diagnostique Figure 16. Représentation schématique d’une PCR nichée Figure 17. Différents types de thermocycleurs Figure 18. Classification des molécules antipaludiques dérivés quinoléiques Figure 19: Structure chimique de quelques nouvelles molécules antipaludiques Figure 20. Chronologie de l’apparition des résistances aux antipaludiques Figure 21. Apparition et expansion de la chloroquinorésistance Figure 22. Représentation du chromosome 7 de P. falciparum Figure 23. Localisation du pfmdr1 sur le chromosome 5 de P. falciparum Figure 24. Distributions des haplotypes pfcrt Figure 25. Mortalité du paludisme dans le monde en 2013 Figure 26. Faciès épidémiologiques du paludisme en Afrique Figure 27. Proportion des infections dues à P. falciparum en RDC Figure 28. Stratification de la RDC selon le taux de prévalence parasitaire iii Liste des tableaux Tableau 1. Vision de l’OMS d’ici l’an 2030 Tableau 2 : Gènes impliqués dans la résistance de P. falciparum iv Liste des abréviations ADN: Acide desoxyribonucléique ARN: Acide ribonucléique ASAQ: Artésunate-Amodiaquine CTA : Combinaisons thérapeutiques à base d’artémisinine EDS: Enquête démographique et sanitaire GE : Goutte épaisse HRP-2: Histidine rich protein 2 LAMP: Loop-mediated isothermal amplification OMS: Organisation mondiale de la santé PCR: Polymerase chain reaction Pfcrt : Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter Pfdhfr : Plasmodium falciparum dihydrofolate reductase Pfdhps : Plasmodium falciparum dihydropteroate synthetase Pfmdr1: Plasmodium falciparum multidrug resistance 1 PNLP : Programme national de lutte contre le paludisme RDC: République Démocratique du Congo SNIS: Système national d’informations sanitaires SP: Sulfadoxine-pyriméthamine TDR: Test de diagnostic rapide WWARN: Worldwide antimalarial resistance network v Remerciements Avant toute chose j’aimerai témoigner ma reconnaissance aux diverses personnes, qui par leur soutien et leur apport, ont permis la concrétisation de ce travail. Il nous faut ici les remercier. Premièrement je tiens à remercier les professeurs Jean-Marie Kayembe et Marie- Pierre Hayette pour avoir accepé de co-diriger ce travail. Merci particulièrement au professeur Jean-Marie Kayembe car en dépit de ses multiples tâches et responsabilités tant cliniques qu’académiques, il a toujours trouvé du temps à me consacrer pour discuter de cette thèse avec bonne humeur. Vous avez été un modèle pour moi jadis, vous l’êtes encore aujourd’hui et vous le demeurerez longtemps encore ! Je remercie également de manière particulière le Professeur Marie-Pierre Hayette pour son accueil chaleureux dans le Service de Microbiologie Clinique du CHU de Liège, où grâce à elle je ne m’y suis à aucun moment senti comme un étranger. Bien au contraire ! Votre grande sympathie associée à vos qualités scientifiques remarquables demeureront un exemple à vie à mes yeux. Merci à vous deux pour avoir disponibilisé de votre temps, pour avoir manifesté beaucoup de patience à mon égard et surtout pour votre encadrement qui fait de moi ce jour un meilleur « scientifique » que je ne l’étais hier. Ma reconnaissance est dirigée vers le Professeur Patrick De Mol, réel inspirateur de cette thèse, qui en coulisse ou de visu a toujours été de bon conseil. La pertinence de vos remarques et de vos orientations raisonneront encore longtemps dans mon esprit. Je ne peux omettre de citer les professeurs du Département des Sciences de Base, encadreurs proches et du quotidien, ainsi que les autres membres du corps vi scientifique de notre cher Département qui ont vu germer ce travail de sa conception jusqu’à son terme. C’est grâce aux échanges répétés de tous les jours avec vous tous que ce travail a pu prendre forme et ainsi se matérialiser. Je pense aux Professeurs Richard Kalala, Baudoin Buassa, Georges Mvumbi, Francis Nsimba, Pius Kabututu, Tite Mikobi, Eric Kamangu ainsi qu’aux chefs de travaux Nathalie Nseka, Koy Deume, Jackin Kambale, Nonga Bolenketa et aux assistants Doudou Yobi, Vicento Diabeno et aux autres que je ne saurai tous énumérer ici. Ma reconnaissance va également à mes Maîtres de la Faculté de Médecine de l’Université de Kinshasa, qui à chaque niveau de mon cursus académique, m’ont gratifiés de leurs conseils et remarques m’ayant permis d’acquérir les compétences suffisantes afin d’exécuter et de rédiger ce travail. Je me permet de citer ici quelques uns d’entre eux: Professeurs Hipolyte Situakibanza, Gauthier Mesia, Célestin Nsibu, Emile Okitolonda, Désiré Mashinda, Ernest Sumaili, Dieudonné Mumba, Gilbert Mananga. A tous les collègues et collaborateurs du CHU de Liège qui m’ont si gentiment « adopté » je dis également un grand merci. Je pense ici spécialement à Raphael Boreux, Laetitia Levaux, Julie Descy, Cécile Meex, Sébastien Bontemps, Rosalie Sacheli, Pascale Huynen, Marie