Tesis de Maestría en Biotecnología Facultad de Ciencias Universidad de la República Selección de bacterias ácido lácticas (LAB) y adjuntas (NSLAB) autóctonas de leche y queso, para el control de Clostridium spp. responsables del defecto de “hinchazón tardía” Lic. Bq. Jorge Olivera Rodi Tutor: Dra. Stella Reginensi Co-tutor: Dr. Pedro Díaz Gadea Unidad de Tecnología de los Alimentos Facultad de Agronomía Agradecimientos A mi Tutora de Tesis de Maestría Stella Reginensi, por darme la oportunidad de realizar mi Tesis de Grado y Posgrado en la Unidad de Tecnología de los Alimentos, Facultad de Agronomía, ser fuente de inspiración en mi formación académica y profesional, así como por el conocimiento brindado. Asimismo, quiero destacar la figura de Jorge Bermúdez, quien me brindó la posibilidad de realizar mi Tesis de Maestría en la temática planteada, guio mi formación académica y fue un pilar fundamental de la Unidad de Tecnología de los Alimentos. Agradezco a mi Co-tutor de Tesis Pedro Díaz Gadea de la Cátedra de Bioquímica del Departamento de Biología Vegetal de Facultad de Agronomía por su guía y asesoramiento en los procesos de extracción y purificación de los compuestos anticlostridiales. Quiero agradecer a CSIC haber financiado esta investigación por medio del Programa CSIC Iniciación a la Investigación y a la Comisión de Posgrado de Biotecnología por las Alícuotas de Apoyo Económico asignadas. Mi agradecimiento a Madelón Portela de la Unidad de Bioquímica y Proteómica Analíticas (UBYPA) del Instituto Pasteur de Montevideo, quien realizó los análisis de espectrometría de masas. Por otra parte, deseo mencionar a María Julia Pianzzola, Gabriela Irazoqui y Silvana Alborés de la Facultad de Química por aceptar integrar el Tribunal evaluador de esta Tesis, así como por los consejos y devoluciones recibidos. Al resto de mis compañeros de la Unidad de Tecnología de los Alimentos, Marcela González, Jimena Viejo, Nancy Scaronne y Carlos Mattos quienes al igual que Stella Reginensi, me han apoyado a lo largo de todos estos años y con los cuales he compartido tantos momentos. A mis padres Julia Rodi y Héctor Olivera, en reconocimiento a su apoyo, guía, comprensión y estímulo para que siguiera avanzando en mi formación académica. También agradezco a amigos y compañeros de Facultad de Ciencias y Facultad de Agronomía por los momentos compartidos y el ánimo brindado. Índice Índice de Figuras 5 Índice de Tablas 10 Resumen 11 Abreviaciones 12 1. Introducción 13 1.1 Quesos: definición y proceso de elaboración 13 1.2 Clasificación de quesos 19 1.3 Defectos en quesos 20 1.4 Defecto de hinchazón tardía 23 1.4.1 Generalidades 23 1.4.2 Factores que afectan el desarrollo de hinchazón tardía 26 1.5 Características del género Clostridium 29 1.6 Esporulación y germinación en Clostridium spp. 31 1.7 Métodos de control del desarrollo de Clostridium spp. 34 1.8 Fuentes de contaminación y estrategias de control a nivel del tambo 38 1.9 Bacterias ácido lácticas 42 1.9.1 Cultivos iniciadores 44 1.9.2 Clasificación de cultivos iniciadores 45 1.9.3 Desarrollo y contribución de las NSLAB en quesos 48 1.9.4 Actividad antimicrobiana de bacterias ácido lácticas 50 1.9.4.1 Ácidos orgánicos 51 1.9.4.2 Peróxido de hidrógeno 53 1.9.4.3 Acetaldehído, diacetilo y acetoína 53 1.9.4.4 Reuterina 54 1.9.4.5 Reutericiclina 56 1 1.9.4.6 D-aminoácidos 56 1.9.4.7 Bacteriocinas 57 1.9.4.7.1 Mecanismos de acción 57 1.9.4.7.2 Clasificación de las bacteriocinas 58 1.9.4.7.4 Estrategias para incorporar las bacteriocinas en los alimentos 62 1.9.5 Bacterias ácido lácticas con acción anticlostridial 63 2. Objetivo general 67 2.1 Objetivos específicos 67 3. Materiales y métodos 68 3.1 Obtención y procesamiento de muestras 68 3.2 Determinación del NMP de esporas 68 3.3 Aislamiento de cepas LAB y NSLAB 68 3.4 Selección de cepas de bacterias ácido lácticas con actividad anticlostridial 68 3.4.1 Técnica de confrontación por estrías 69 3.4.2 Método de difusión en placa 69 3.4.3 Método de la doble capa de agar 69 3.5 Identificación y caracterización genotípica de las cepas con actividad 70 anticlostridial 3.5.1 Extracción de ADN genómico 70 3.5.2 Secuenciación del gen del ARNr 16S 70 3.5.3 Caracterización mediante técnicas de fingerprinting 71 3.5.3.1 Caracterización genotípica mediante RAPD-S1 y RAPD-S4 71 3.5.3.2 Caracterización genotípica por (GTG)5-PCR 71 3.5.3.3 Caracterización genotípica por BOX-PCR 71 3.5.3.4 Análisis de los perfiles de fingerprinting 72 3.5.4 Identificación por técnicas de PCR especie-específicas 72 3.6 Determinación de los mecanismos de acción inhibitoria 73 2 3.7 Evaluación de la acción inhibitoria de los sobrenadantes de cepas LAB y 73 NSLAB sobre aislamientos de Clostridium nativos de productos lácteos 3.8 Cinéticas de crecimiento y producción de compuestos antimicrobianos 74 3.9 Purificación y caracterización de compuestos anticlostridiales 74 3.10 Evaluación de la sensibilidad de C. tyrobutyricum a la nisina 75 3.11 Determinación de la sensibilidad de cepas LAB y NSLAB a la lisozima 76 3.12 Evaluación de la actividad anticlostridial de la lisozima 76 3.13 Comparación de la acción anticlostridial de los sobrenadantes de cepas 77 LAB y NSLAB respecto a la lisozima y en combinación con ésta 4. Resultados y discusión 78 4.1 Determinación del NMP de esporas 78 4.2 Aislamiento y selección de cepas de bacterias ácido lácticas con actividad 78 anticlostridial 4.3 Identificación y diversidad genética de las cepas con actividad 84 anticlostridial 4.4 Determinación de los mecanismos de acción inhibitoria 90 4.5 Cinéticas de crecimiento y producción de compuestos antimicrobianos 96 4.6 Evaluación de la acción inhibitoria de los sobrenadantes de cepas LAB y 103 NSLAB sobre aislamientos de Clostridium nativos de productos lácteos 4.7 Purificación y caracterización de compuestos anticlostridiales 110 4.8 Evaluación de la sensibilidad de C. tyrobutyricum a la nisina 120 4.9 Evaluación de la actividad anticlostridial de las fracciones eluídas 120 4.10 Determinación de la sensibilidad de cepas LAB y NSLAB a la lisozima 122 4.11 Evaluación de la acción anticlostridial de la lisozima 124 4.12 Comparación de la acción anticlostridial de cepas LAB y NSLAB respecto 125 a la lisozima y en combinación con ésta 5. Conclusión y perspectivas futuras 128 6. Anexos 130 Anexo 1 130 Anexo 2.1 134 3 Anexo 2.2 150 Anexo 3 154 Anexo 4 158 7. Bibliografía 160 4 Índice de Figuras Figura 1. Reagrupación de las micelas de caseínas de la leche por 14 coagulación mixta. Figura 2. Etapas de la producción quesera en la elaboración de quesos 18 madurados. Figura 3. Fotos de quesos afectados por hinchazón tardía. 24 Figura 4. Fermentación ácido butírica. 31 Figura 5. Esquema de la estructura de la espora y micrografías 32 electrónicas de transmisión de esporas de C. tyrobutyricum. Figura 6. Etapas del proceso de esporulación bacteriana. 33 Figura 7. Proceso de germinación de esporas bacterianas. 34 Figura 8. Vías de contaminación de la leche cruda con esporas de 38 Clostridium spp. Figura 9. Balances químicos de las fermentaciones homoláctica y 43 heteroláctica. Figura 10. Recuento bacteriano (UFC/g) a lo largo del tiempo (días) de las 49 poblaciones LAB y NSLAB en queso. Figura 11. Compuestos antibacterianos generados a partir de la reuterina. 55 Figura 12. Clasificación de bacteriocinas sintetizadas por bacterias Gram- 59 positivas. Figura 13. Mecanismo de acción asociado a cada clase de bacteriocina. 61 Figura 14. Método de confrontación de estrías en agar MRS. 79 Figura 15. Método de difusión en discos en placas de agar RCM. 80 Figura 16. Gráfica del diámetro de halo de inhibición obtenido para cada 81 cepa por el método de difusión en agar. Figura 17. Método de la doble capa de agar. 82 Figura 18. Recuentos bacterianos (UFC/mL) de C. tyrobutyricum ATCC 25755 obtenidos en las placas correspondientes al método de la doble 83 capa. Figura 19. Predominio de cada especie respecto al total de aislamientos 84 BAL con actividad anticlostridial. 5 Figura 20. Porcentaje de cepas LAB y NSLAB con actividad anticlostridial 86 en leche, queso y suero lácteo. Figura 21. Dendrogramas construídos a partir de los perfiles de bandas de 87 las técnicas de Rep-PCR: BOX-PCR y (GTG)5-PCR. Figura 22. Dendrogramas construídos a partir de los perfiles de bandas de 88 las técnicas de RAPD-S1 y RAPD-S4. Figura 23. Cepas de BAL con acción anticlostridial causada solamente por 90 acidez. Figura 24. Determinación del mecanismo de inhibición de BAL C. 92 Figura 25. Placas correspondientes a la determinación de los mecanismos 94 de inhibición de las cepas L. casei 26 y L. casei 95. Figura 26. Determinación del mecanismo de inhibición de L. delbrueckii 95 subsp. bulgaricus 76. Figura 27. Cinética de crecimiento de L. casei 26. 97 Figura 28. Cinética de crecimiento de L. casei 95. 98 Figura 29. Cinética de crecimiento de L. delbrueckii subsp. bulgaricus 76. 102 Figura 30. Inhibición producida por los sobrenadantes de las cepas 26, 76, 103 95 y BAL C. Figura 31. Gráficas del diámetro de los halos (cm) producidos en cepas de Clostridium spp. en presencia de los sobrenadantes pertenecientes a los 105 aislamientos 26 y 95. Figura 32. Gráficas del diámetro de los halos (cm) producidos en cepas de Clostridium spp. en presencia de los sobrenadantes pertenecientes al 106 aislamiento 76 y la cepa BAL C.