Sorbonne Université́ École Doctorale ED515 – Complexité́ du vivant INSERM UMRS 933 : Physiopathologie des maladies génétiques d'expression pédiatrique Mécanismes physiopathologiques impliqués dans la différenciation du tractus génital masculin Matthieu Peycelon Thèse de Doctorat de Génétique Humaine Dirigée par Pr. Jean-Pierre Siffroi Présentée et soutenue publiquement le 19 décembre 2019 Devant un jury composé de : Brigitte BENZACKEN PU-PH Université Paris 13 Rapporteur Anne-Françoise SPINOIT Professeur Université de Gand Rapporteur Irène NETCHINE PU-PH Université Paris 6 Examinateur Nicolas KALFA PU-PH Université de Montpellier Examinateur Alaa EL GHONEIMI PU-PH Université Paris 7 Président Jean-Pierre SIFFROI PU-PH Université Paris 6 Directeur de thèse Sorbonne Université́ École Doctorale ED515 – Complexité́ du vivant INSERM UMRS 933 : Physiopathologie des maladies génétiques d'expression pédiatrique Mécanismes physiopathologiques impliqués dans la différenciation du tractus génital masculin Matthieu Peycelon Thèse de Doctorat de Génétique Humaine Dirigée par Pr. Jean-Pierre Siffroi Présentée et soutenue publiquement le 19 décembre 2019 Devant un jury composé de : Brigitte BENZACKEN PU-PH Université Paris 13 Rapporteur Anne-Françoise SPINOIT Professeur Université de Gand Rapporteur Irène NETCHINE PU-PH Université Paris 6 Examinateur Nicolas KALFA PU-PH Université de Montpellier Examinateur Alaa EL GHONEIMI PU-PH Université Paris 7 Président Jean-Pierre SIFFROI PU-PH Université Paris 6 Directeur de thèse Ce travail de thèse a été réalisé́ sous la direction du Professeur Jean-Pierre Siffroi, au sein de l’unité́ mixte de recherche INSERM / Sorbonne Université UMR_S933 dirigée par le Professeur Serge Amselem. Adresse : Département de Génétique Médicale, Hôpital Armand Trousseau ; 26 avenue du Docteur Arnold Netter, 75012, Paris. 1 Car des Sciences à l’Art, il n’y a qu’un pas. The important thing is not to stop questioning. Curiosity has its own reason for existence. One cannot help but be in awe when he contemplates the mysteries of eternity, of life, of the marvelous structure of reality. It is enough if one tries merely to comprehend a little of this mystery each day. Albert Einstein Great things are done by a series of small things brought together. Vincent Van Gogh 2 Remerciements A Monsieur le Professeur Jean-Pierre Siffroi, Pour l’honneur que vous m’avez fait en acceptant de diriger cette thèse. Nous nous connaissons et travaillons ensemble depuis huit ans et vous n’avez jamais cessé de m’aider, me conseiller, m’encourager en toute bienveillance. Votre soutien est inestimable. Veuillez trouver ici l’expression de mes sincères remerciements et de mon plus profond respect. A Monsieur le Professeur Alaa El Ghoneimi Pour l’honneur que vous me faites de présider cette thèse. Vous m’avez appris l’excellence chirurgicale, la rigueur scientifique et surtout l’intégrité. Travailler dans votre service à vos côtés est une fierté quotidienne. Veuillez trouver dans ce travail l’expression de mon admiration et de mes salutations les plus respectueuses. A Madame le Professeur Brigitte Benzacken Pour l’honneur de bien vouloir juger cette thèse. La cytogénétique et la biologie moléculaire sont parfois bien éloignées de ma pratique quotidienne. J’espère que vous saurez apprécier ce travail de chirurgien. Veuillez trouver ici le témoignage de ma sincère gratitude. A Madame le Professeur Anne-Françoise Spinoit Pour l’honneur d’être rapporteur de ce travail de thèse. Tu es un modèle en Europe pour les jeunes urologues à travers tes nombreuses publications, tes travaux de recherche fondamentale et ton dynamisme qui a, depuis longtemps, dépassé les frontières belges. Merci pour ton aide et tes conseils depuis notre rencontre à Gênes. Trouve ici l’expression de mes plus vifs remerciements. 3 A Madame le Professeur Irène Netchine Pour l’honneur de faire partie de ce jury. L’endocrinologie pédiatrique est une des pierres angulaires de la prise en charge multidisciplinaire des patients porteurs d’une anomalie du développement génital. Je suis honoré de votre présence Soyez assuré de mon sincère respect et de ma profonde reconnaissance. A Monsieur le Professeur Nicolas Kalfa, Pour avoir accepté de faire partie de ce jury, Ta présence est un honneur et un plaisir. Tes travaux débutés au C.H.U. de Montpellier puis à U.C.S.F. ont toujours été un modèle dans mon parcours et j’admire ton enthousiasme, ta rigueur et ton incroyable pédagogie. Sois assuré de ma sincère estime et de ma respectueuse reconnaissance. Aux patients et à leur famille, Et à ma devise, pas toujours respectée : Ce qui vaut la peine d'être fait vaut la peine d'être bien fait. Nicolas Poussin (1594-1665) – Correspondance (Ch. Jouanny, Paris, J. Schemit, 1911) (Archives de l'Art français, nouvelle période, t. V, 1911.) 4 Résumé Introduction. L’hypospadias est la malformation congénitale la plus fréquente des organes génitaux externes du garçon. Il faut bien distinguer deux grands cadres cliniques, dont la prise en charge est nettement différente : (1) les hypospadias distaux et isolés chez les garçons, qui représentent environ quatre cas sur cinq des hypospadias dans leur ensemble. Ils n’entraînent pas, en l’état des connaissances actuelles, de troubles mictionnels, de dysfonction érectile ou d’hypofertilité à l’âge adulte. Néanmoins, leur correction chirurgicale est nécessaire et sera expliquée lors d’une consultation avec un urologue pédiatre ; (2) Les anomalies les plus sévères, qu’il est convenu d’appeler anomalie du développement sexuel (ADS) ou Disorders of Sex Development (DSD) dans la littérature anglo-saxonne, requièrent une prise en charge pluridisciplinaire avec des praticiens familiers de ce type de pathologies afin d’éviter les erreurs et le retard diagnostique. L’incidence de tous les types d’hypospadias est en constante augmentation depuis deux décennies mais son étiopathogénie reste encore largement discutée, faisant intervenir des facteurs endocriniens, génétiques, vasculaires et environnementaux. Les causes génétiques de l’hypospadias, qui est donc une anomalie qui apparaît au cours de l’embryogenèse sous l’influence probable des pics d’hormone chorionique gonadotrophique (hCG) pendant le premier trimestre de grossesse qui stimulent la production de testostérone fœtale, sont encore peu explorées et probablement sous-estimées. Objectifs. L’objectif principal était d’étudier les mécanismes génétiques impliqués dans la différenciation sexuelle masculine pour comprendre le développement normal et pathologique de l’appareil génito-urinaire masculin humain. Objectifs secondaires : - Colliger tous les cas d’hypospadias nés à Paris depuis 2011 en se concentrant sur les cas familiaux ou consanguins - Rechercher l’existence éventuelle de mutations somatiques au niveau du tissu urogénital dans des gènes portés par le chromosome X ou affectés par des mutations à transmission dominante. Trois gènes candidats, connus pour être impliqués dans 5 la genèse de l’hypospadias, ont été sélectionnés et sont tous les liés au métabolisme des androgènes (AR, MAMLD1 et NR5A1) - Réaliser une étude pangénomique par puce à ADN « SNP » chez des enfants nés avec un hypospadias distal isolé et leurs parents puis réaliser une étude par WES pour les cas familiaux et consanguins - Identifier, enfin, une potentielle association entre le taux sérique maternel d’hormone chorionique gonatrophique béta libre (hCGb) et la survenue d’un hypospadias. Matériels et méthodes. Une première cohorte de 284 patients pris en charge pour chirurgie d’hypospadias a été établie depuis 2011 dans laquelle 223 garçons présentent un hypospadias distal isolé sans consanguinité ni origine familiale. L’ADN germinal de ces patients a été extrait des lymphocytes sanguins selon la technique habituelle. Un caryotype standard puis une analyse pangénomique par puce à ADN « SNP 12 chips (Illumina®) » ont été réalisés pour tous les patients. Les familles des 33 premiers cas ont été sélectionnées chronologiquement pour bénéficier d’un séquençage des trois gènes candidats à partir de l’ADN des lymphocytes sanguins, des fibroblastes issus d’une culture de biopsie de prépuce et des frottis urétraux réalisés lors de l’intervention chirurgicale. Les cas familiaux et consanguins ont eu un recherche de nouveaux gènes par Whole Exome Sequencing (WES). Une seconde cohorte de 1311 femmes enceintes qui ont donné naissance à un enfant vivant unique de sexe masculin avec une malformation congénitale a été établie entre 2011 et 2016 d’après le registre francilien REMAPAR. Ont été extraites les données cliniques et paracliniques des 170 garçons nés avec un hypospadias isolé, confirmé par l’examen clinique d’un chirurgien pédiatrique. Les taux sériques de la sous-section béta d’hCG libre ont été obtenus par un laboratoire centralisé. Les multiples de la médiane (MoM) de la béta-hCG libre obtenues entre la 10ème et la 13ème semaine d’aménorrhée ont été comparées entre les garçons porteurs d’un hypospadias et le groupe contrôle. Le test statistique a inclus une régression quantile en évaluant par ailleurs les confondants potentiels liés à la dysfonction placentaire. Cohorte Exome 6 Résultats. 1) Les techniques d’extraction d’ADN sanguin et préputial (N=33) ont été qualitativement et quantitativement satisfaisantes ; en revanche, l’extraction d’ADN à partir de cellules urétrales a présenté un rendement faible et peu reproductible. Nous avons réalisé la mise au point de l’amplification et du séquençage des trois gènes à partir du matériel génomique