LÍVIA CARNEIRO FIDÉLIS SILVA DIVERSIDADE MICROBIANA DE LODO NITRIFICANTE ACLIMATADO À ALTAS CONCENTRAÇÕES SALINAS Dissertação apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola, para obtenção do título de Magister Scientiae . VIÇOSA MINAS GERAIS – BRASIL 2015 Dedico esta dissertação aos meus pais, Ana Lúcia e Gilmar, e à minha irmã Luísa, que são a razão do meu viver e o motivo de eu querer ser sempre uma pessoa melhor. ii AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus, por ter me permitido chegar até aqui, me abençoando e guiando meus passos, me indicando sempre a melhor direção. Aos meus pais, Ana Lúcia e Gilmar, por me apoiarem e estarem sempre ao meu lado, nos momentos felizes e principalmente nos de angústia e desespero, além do amor e carinho incondicionais. À minha irmã Luísa, pelas risadas e pelo companheirismo, e por se espelhar em mim, me fazendo ser sempre uma pessoa melhor. A toda minha família, que mesmo de longe sempre me apoiou com palavras de carinho e incentivo. Ao Igor, meu grande amor, por todo amor, carinho, companheirismo e compreensão durante esses anos, e principalmente nesses últimos meses em que o estresse se tornou constante. Aos meus orientadores Cynthia e Sérgio, por todas as oportunidades concedidas, ensinamentos e pela confiança em mim depositada. À Helena, que de estagiária se tornou uma grande amiga. Obrigada por todas as risadas e momentos de descontração no meio dessa atmosfera de nervosismo. Ao Roberto, agradeço pela amizade, confiança e por toda a ajuda durante os experimentos. À Mariana e Juliana, amigas de graduação, pós-graduação, e da vida! Sem vocês os dias de trabalho não seriam os mesmos! Aos amigos do LIVM, por terem feito parte dessa experiência maravilhosa, por tornar os dias mais divertidos e contribuírem direta ou indiretamente para a realização deste trabalho. Aos meus amigos de longe, que estão sempre perto, por todo apoio, carinho, risadas, noites de jogos e pela amizade de sempre e pra sempre. Aos amigos que viçosa me deu, por fazerem meus finais de semana mais felizes e menos solitários. A CAPES e PETROBRÁS pelo financiamento do projeto e pela bolsa concedida. iii Enfim, agradeço a todos que contribuíram para a realização deste trabalho! iv BIOGRAFIA Lívia Carneiro Fidélis Silva, nascida em 11 de setembro de 1989, natural de Carangola, estado de Minas Gerais, filha de Gilmar Fernandes da Silva e Ana Lúcia Carneiro Fidélis Silva. Cursou o ensino fundamental na Escola Estadual Nascimento Leal, situada em Alvorada, distrito de Carangola. Em 2004 ingressou na Escola Estadual Emília Esteves Marques, localizada em Carangola, onde concluiu o ensino médio. Formou-se em Bacharel em Bioquímica pela Universidade Federal de Viçosa no ano de 2013. Durante a graduação foi estagiária do Laboratório de Imunovirologia Molecular, onde teve bolsa de iniciação científica pela FUNARBE durante seis meses, e bolsa de iniciação cientifica pela PETROBRÁS durante dois anos. Os resultados obtidos neste período foram apresentados em diferentes congressos de âmbito regional, nacional e internacional. No segundo semestre de 2013 ingressou no Mestrado no programa de Pós-Graduação Microbiologia Agrícola pela mesma instituição de ensino. v ÍNDICE LISTA DE FIGURAS ...........................................................................................viii LISTA DE TABELAS .............................................................................................x RESUMO ..............................................................................................................xii ABSTRACT .........................................................................................................xiv 1. Introdução ......................................................................................................1 2. Revisão bibliográfica ....................................................................................3 2.1. Água de produção....................................................................................3 2.2. Processo biológico de lodos ativados .....................................................4 2.3. Remoção biológica de nitrogênio ............................................................5 2.3.1. Nitrificação ............................................................................................6 2.3.2. Processo ANAMMOX ..........................................................................8 2.3.3. Nitrificação heterotrófica ......................................................................8 2.4. Remoção biológica de nitrogênio versus salinidade ..............................9 2.5. O estudo da diversidade microbiana ....................................................11 2.5.1. Índices de diversidade .......................................................................13 2.5.2. Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) .................14 2.5.3. Flow-fluorescence in situ hybridization (Flow-FISH) ........................16 3. Objetivos ......................................................................................................18 3.1. Objetivos gerais .....................................................................................18 3.2. Objetivos específicos .............................................................................18 4. Metodologia .................................................................................................19 4.1. Coleta da amostra de lodo ....................................................................19 4.2. Aclimatação do lodo ..............................................................................19 4.3. Avaliação do processo de nitrificação ...................................................19 vi 4.4. Coleta das amostras para análises moleculares ..................................20 4.5. Extração de DNA das amostras de lodo aclimatado ............................20 4.6. Amplificação dos genes RNAr 16S .......................................................21 4.7. Eletroforese em gel de gradiente desnaturante – DGGE ....................22 4.8. Sequenciamento massivo do gene RNAr 16S de bacteria e archaea 22 4.9. Análise dos dados de sequenciamento ................................................23 4.10. Flow-FISH ..............................................................................................24 5. Resultados e discussão .............................................................................26 5.1. Aclimatação à altas salinidades e nitrificação ......................................26 5.2. Extração de DNA e amplificação dos genes RNAr 16S de archaea e bacteria ..............................................................................................................26 5.3. DGGE .....................................................................................................28 5.4. Sequenciamento parcial da região RNAr 16S de bacteria e archaea .30 5.4.1. Composição da comunidade microbiana do lodo .............................32 5.4.1.1. Bactéria .......................................................................................32 5.4.1.2. Archaea .......................................................................................38 5.4.2. Remoção biológica de nitrogênio ......................................................41 5.4.2.1. Microrganismos nitrificantes convencionais ..............................41 5.4.2.2. Microrganismos ANAMMOX ......................................................43 5.4.2.3. Microrganismos nitrificantes heterotróficos ...............................43 5.4.3. Análise da diversidade microbiana....................................................45 5.4.3.1. Índices de diversidade ................................................................45 5.4.3.2. Análise de similaridade...............................................................47 5.4.3.3. Curvas de rarefação ...................................................................48 5.4.4. Flow-FISH ...........................................................................................50 6. Conclusões ..................................................................................................56 7. Referências ..................................................................................................57 8. Anexos ..........................................................................................................73 vii LISTA DE FIGURAS Figura 1. Esquema do sistema de lodos ativados ................................................5 Figura 2. Equilíbrio da amônia livre e do íon amônio em função do pH do meio. .................................................................................................................................6 Figura 3. Atividade biológica em resposta ao aumento da concentração salina ...............................................................................................................................10 Figura 4. Esquema representando amplicons de PCR de mesmo tamanho com sequências nucleotídicas diferentes analisados em: A) eletroforese em gel de agarose e B) eletroforese em gel de gradiente desnaturante ............................15 Figura 5. Esquema representando a desnaturação parcial e completa da dupla fita de DNA ao longo do gradiente desnaturante. ...............................................15 Figura 6. Extração de DNA total das amostras de lodo com 25, 50, 75, 100, 105, 115 e 125 g.L-1 de NaCl. ..............................................................................27