Science and Education a New Dimension. Natural and Technical Sciences, V(14), Issue: 132, 2017 www.seanewdim.com Вплив умов отримання посівного матеріалу на біосинтетичну здатність продуценту рибофлавіну Eremothecium ashbyi В. Ю. Поліщук*, О. М. Дуган Національний технічний університет України «Київський політехнічний інститут імені Ігоря Сікорського» *Corresponding author. E-mail: [email protected] Paper received 21.06.17; Revised 26.06.17; Accepted for publication 28.06.17. Анотація. Досліджено зміну біосинтетичної здатності аскоміцета Eremothecium ashbyi за двома показниками: накопичення рибо- флавіну та біомаси. У зв’язку зі зниженням рівня біосинтезу вітаміну В2 запропоновано використання ультрафіолетового опромі- нення міцелію для підвищення біосинтетичної здатності. Встановлено вік та кількість посівного матеріалу, що вноситься у ферме- нтаційне середовище, які відповідають найбільшому накопиченню рибофлавіну та біомаси. Ключові слова: рибофлавін, Eremothecium ashbyi, посівний матеріал, біомаса, вік інокуляту. Вступ. Eremothecium ashbyi, виділений Guilliermond Матеріали та методи. Об’єктом дослідження був M.A. у 1935 році з коробочок бавовнику, на яких він Eremothecium ashbyi Guilliermond F-340, отриманий з паразитує, є одним з відомих продуцентів рибофлавіну, Всеросійської колекції промислових мікроорганізмів який використовується у промисловості для біотехноло- (таксономічне положення відповідно до міжнародної гічного отримання вітаміну В2. E. ashbyi здатен до по- бази систематики грибів САВІ Bioscience та бази даних надсинтезу рибофлавіну, який є одним із найважливі- CBS Database of Fungal Names, даний гриб віднесений до ших ростових факторів людини і тварин. Флавонопроте- Eremotheciaceae, Saccharomycetales, Saccharomycetidae, їни грають важливу роль у метаболізмі клітини. Актив- Saccharomycetes, Saccharomycotina, Ascomycota, Fungi ними групами більшості флавопротеїнів є нековалентно [7]). зв’язані флавінові кофактори – флавінмононуклеотид Штам гриба зберігали при кімнатній температурі на (ФМН) та флавінаденіндинуклеотид (ФАД). E. ashbyi, скошеному агаризованому глюкозо-пептонно- один з небагатьох продуцентів, здатен накопичувати до дріжджовому (ГПД) середовищі складу (у %): глюкоза – 30% ФАД від загальної кількості флавінів, що синтезу- 1,0; пептон – 0,3; дріжджовий екстракт – 0,5; агар – 2,0. ються. За допомогою E. ashbyi можна отримувати як Глибинне культивування E. ashbyi на рідкому ГПД кормовий рибофлавін, так і, при застосуванні певних середовищі здійснювали при 28ºС протягом 6 діб у коні- методів виділення та очистки, рибофлавін медичного чних колбах з 50 мл середовища в умовах постійного призначення. перемішування на орбітальній качалці зі швидкістю 180 Короткий огляд публікацій за темою. При здійс- обертів/хв. Середовища у колбах інокулювались попе- ненні глибинного культивування стан інокуляту має редньо отриманою на рідкому ГПД середовищі культу- велике значення для синтезу і накопичення біологічно- рою різного віку та у різній кількості. активних речовин. Зазвичай для засіву виробничого се- Кількість біомаси визначали ваговим методом після її редовища при глибинному способі культивування посі- відділення від культуральної рідини фільтруванням та вний матеріал готують також глибинним способом. Ета- висушування до сталої маси при 105ºС [8]. пи отримання посівної культури наступні: 1) оновлення Вміст рибофлавіну у культуральній рідині визначали вихідної культури на агаризованому середовищі; 2) ви- спектрофотометрично при λ = 450 нм після попередньо- рощування культури на рідкому середовищі в колбах на го гідролізу ФАД до ФМН протягом 12 годин у 10 % калці; 3) культивування продуцента в інокуляторі. Посі- ТХО [8, 9]. вна доза при засіві глибинною культурою зазвичай порі- Для дослідження впливу УФ-опромінення на синтез вняно велика - від 1 до 25%. Для продуценту Е. ashbyi у рибофлавіну вирощену на щільному поживному середо- публікаціях наводяться суперечливі дані. вищі культуру Eremothecium ashbyi засівали в колби на Так, у роботі [1] було показано, що для досягнення 100 мл з рідким ГПД середовищем, культивували 3 доби максимальної продуктивності Е. ashbyi Guilliermond на качалці при 180 об/хв при 28°С. Після чого культура- 1935 по рибофлавіну засів ферментаційного поживного льну рідину відцентрифуговували при 3000 об./хв про- середовища повинен проводитися свіжепророслими тягом 10 хв. з наступним промиванням стерильною дис- спорами гриба. У роботі [2] зазначається, що біосинтез тильованою водою, таким чином були отримані водні рибофлавіну однаково протікає на ферментаційному суспензії міцелію культури Eremothecium ashbyi. середовищі, засіяному 1-3 добовою культурою продуце- Водна суспензія продуценту або культура продуценту нту. Рекомендована кількість посівного матеріалу, що у середовищі культивування по 3 см3 розливалися у ча- вноситься у поживне середовище, становить 0,75 – 2% шки Петрі. Суспензія розподіляється по дну чашки тон- [3]. Проте сучасні автори у своїх дослідженнях викорис- ким шаром товщиною 0,1 мм. Чашки Петрі поміщали на товують великі об’єми посівного матеріалу: найчастіше відстані 25 см від джерела УФ-променів (лампа бакте- 5 [4] та 10 % [5]. Крім дослідження впливу якості посів- рицидная 15W Electrum G13 A-FG-0495) і знімали кри- ного матеріалу на біосинтез рибофлавіну, досліджувався шки в момент включення секундоміра. Через задані вплив стану посівного матеріалу на утворення компоне- проміжки часу (1, 3, 5 хвилин) чашки закривали криш- нтів ефірної олії, що продукується Е. ashbyi [6]. ками і опромінену культуральну рідину і водну суспен- Мета. Дослідити умови отримання посівного матері- зію міцелію Eremothecium ashbyi засівали в колби на 250 алу Eremothecium ashbyi Guilliermond F-340 в активному см3 з рідким ГПД середовищем у кількості 5% [8, 10]. стані, які б забезпечували найвищу біосинтетичну здат- Результати та їх обговорення. На першому етапі ність штаму-продуценту. підготовки посівного матеріалу здійснюють оновлення 82 Science and Education a New Dimension. Natural and Technical Sciences, V(14), Issue: 132, 2017 www.seanewdim.com вихідної культури на агаризованих середовищах. Оскі- На накопичення біомаси УФ-опромінення впливу льки штам-продуцент є досить нестабільним при збері- майже не здійснює, відмінності між показниками нако- ганні, основною вимогою є розсів культури на щільні пичення біомаси не є статистично значимими. середовища, та відбір колоній, забарвлених у яскраво 3 жовтий колір, які і використовуються для подальшого 40 отримання посівного матеріалу. 35 Незважаючи на постійну підтримуючу селекцію при 30 культивування штаму у лабораторних умовах протягом 25 3 років спостерігалося поступове значне зниження рівня 20 накопичення рибофлавіну та відповідне збільшення рів- 15 ня накопичення біомаси (рис. 1). Зниження кількості 10 рибофлавіну при збільшенні кількості біомаси можна 5 пояснити тісним зв’язком біосинтезу флавінів з обміном 0 пуринів. Концентрація рибофлавіну, мг/дм контроль 1 хв КР 3 хв КР 5 хв КР 1 хв ВС 5 хв ВС 3 50 Рис. 2. Біосинтез рибофлавіну штамом E. ashbyi F-340 після 4 УФ-опромінення 45 3 3,5 (КР – культуральна рідина, ВС – водна суспензія міцелію) (до- 40 стовірність відмінностей р<0,05) 35 3 За результатами проведених досліджень запропоно- 30 2,5 вано додати до технологічної схеми отримання рибо- 25 2 флавіну стадію ультрафіолетового опромінення посівно- 20 1,5 го матеріалу для збільшення виходу рибофлавіну. 15 1 3 4,5 10 4 0,5 5 Концентрація біомаси, г/дм 3,5 Концентрація рибофлавіну, мг/дм 0 0 3 1 2 3 1 2 3 2,5 а б 2 Рис. 1. Біосинтез рибофлавіну (а) та рівень накопичення біома- 1,5 си (б) штамом E. ashbyi F-340 протягом 3 років 1 (достовірність відмінностей р<0,05) 0,5 Концентрація біомаси, г/дм 0 Значна втрата штамом здатності до синтезу рибофла- віну (більше ніж на 90%) призвела до необхідності по- контроль 1 хв КР 3 хв КР 5 хв КР 1 хв ВС 5 хв ВС шуку способів підвищення рівня синтезу рибофлавіну Рис. 3. Накопичення біомаси штамом E. ashbyi F-340 після УФ- штамом-продуцентом. З літературних джерел відомо, опромінення що понадсинтез рибофлавіну грибом E. ashbyi у природ- Результати ферментації, отримані при використанні них умовах здійснюється як захисна реакція на дію со- посівного матеріалу різного віку, наведені в табл. 1. З нячних ультрафіолетових променів. Тому нами було наведених даних видно, що сприятливим для накопи- запропоновано здійснювати УФ-опромінення продуцен- чення рибофлавіну виявилося вирощування посівного ту для підвищення синтезу рибофлавіну. Результати матеріалу протягом 3-4 діб. Мікроскопічний аналіз по- проведених досліджень наведені на рис. 2 та 3. казав, що у цей моменту міцелій гриба представлений Опромінення культуральної рідини продуценту приз- гіфами, що сильно розрослися, з великим числом вакуо- водить до збільшення синтезу рибофлавіну на 72-74%, лей та численними включеннями, що відповідає стаціо- опромінення водної суспензії міцелію штаму- нарній фазі росту культури. проте найбільша кількість продуценту - до збільшення синтезу на 80%. біомаси отримується при засіві середовища інокулятом віком 6 діб. Таблиця 1. Вплив періоду культивування посівного матеріалу на біосинтетичну активність продуценту рибофлавіну Тривалість вирощування Концентрація рибофлавіну на 6 Концентрація біомаси на 6 посівного матеріалу, діб добу культивування, мг/дм3 добу культивування, г/дм3 1 11±0,44 2,02±0,078 2 11,1±0,36 1,46±0,038 3 21,05±0,97 1,92±0,087 4 21,73±0,43 1,93±0,085 5 16,45±0,77 2,55±0,077 6 18,46±0,89 2,68±0,111 (достовірність відмінностей р<0,05) Найбільший рівень накопичення рибофлавіну був досягнутий у тих варіантах,