LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, em xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Công nghệ Gen và Tế bào, Viện Công Nghệ Sinh Học - Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam đã tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành đề tài tốt nghiệp này. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến Ts. Bùi Thị Mai Hƣơng ngƣời đã quan tâm, dìu dắt và tận tình hƣớng dẫn em trong suốt quá trình làm luận án tốt nghiệp. Đƣợc sự đồng ý của Nhà trƣờng, Viện Công nghệ sinh học - Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp và sự hƣớng dẫn của T.s Bùi Thị Mai Hƣơng, em đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp với đề tài: “Phân lập gen diacylglycerol acyltransferase (DGAT) mã hóa một enzyme đóng vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp triacylglycerol ở loài cây Trẩu (Vernicia montana)” Đồng thời, xin gửi lời cám ơn tới tất cả các bạn sinh viên lớp K59-CNSH đã đóng góp ý kiến, giúp đỡ, động viên và khuyến khích tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận án tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn ! i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i MỤC LỤC ............................................................................................................. ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................... iii DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................... iv DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... iv ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1 PHẦN I. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .............................................. 2 1. 1. Giới thiệu về cây Trẩu ................................................................................... 2 1.2. Diacylglycerol acyltransferase (DGAT) và các nghiên cứu ứng dụng .......... 4 1.2.1. Giới thiệu về diacylglycerol acyltransferase ............................................... 4 1.2.2. Những nghiên cứu ứng dụng về diacylglycerol acyltransferase. ............... 6 PHẦN II. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 8 2.1. Mục tiêu ......................................................................................................... 8 2.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 8 2.3. Đối tƣợng, phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................ 8 2.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................. 8 2.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 8 2.3.3. Cách tiến hành ........................................................................................... 10 PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 14 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số ................................................................... 14 3.2. Kết quả nhân bản gen DGAT1 ở cây Trẩu nhăn nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR……. ............................................................................................................. 14 3.3. Phân tích kết quả trình tự gen DGAT1 của cây Trẩu nhăn (Vernicia Montana) ............................................................................................................. 16 PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................... 41 4.1. Kết luận ........................................................................................................ 41 4.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu chữ viết tắt Viết đầy đủ DGAT Diacylglycerol acyltransferase g Gram l Lít ml Milliliter mm Millimeter N Nitơ nm Nanometer OD Optical density CTAB Hexadecyltrimet bromide hylammonium SDS Sodium dodecyl sulphate PVP Polyvinyl pyrrolidone iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần đệm tách A (100ml) .......................................................... 9 Bảng 2.2. Thành phần đệm tách B (100ml) .......................................................... 9 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1. ADN tổng số của Trẩu ........................................................................ 14 Hình 3.2. Kết quả PCR của gen và một đoạn gen DGAT1 ở cây Trẩu M: Marker ............................................................................................................................. 15 Hình 3.3. Kết quả PCR của các đoạn gen DGAT1 ở cây Trẩu M: Marker ........ 16 iv ĐẶT VẤN ĐỀ Cải tạo giống cây trồng bằng công nghệ gen đƣợc coi là phƣơng pháp tiên tiến nhất hiện nay và đã thành công ở rất nhiều loài cây trồng nông – lâm nghiệp (Jame, 2006). Tỷ lệ cây lâm nghiệp biến đổi gen đƣợc trồng trên thế giới ngày càng gia tăng. Bằng kỹ thuật chuyển gen các nhà nghiên cứu thuộc Biotechnology Foundation Laboratories, ĐH Thomas Jefferson, Hoa Kỳ đã xác định đƣợc phƣơng pháp làm gia tăng hàm lƣợng dầu trong lá cây thuốc lá biến đổi gen, bằng cách cho thể hiện gen của cây Arabidopsis thaliana, đó là diacylglycerol acyltransferase (DGAT). DGAT mã hóa một enzyme đóng vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp triacylglycerol. Chính sự cải biên này đã làm gia tăng gấp 20 lần hàm lƣợng triacylglyceride tích lũy trong lá cây thuốc lá. Đặc biệt, sự cải biên gen DGAT làm cho hàm lƣợng dầu tăng 5,8% xét về trọng lƣợng khô của lá, khoảng 2 lần hàm lƣợng dầu bình thƣờng. Một trong những nguồn sản xuất NLSH có giá trị kinh tế là cây Trẩu nhăn (Vernicia montana) chiếm một tỷ lệ rất lớn lƣợng dầu. Dầu Trẩu chứa acid béo chủ yếu là α-eleostearic (70 – 80%). Đây là dạng acid béo chƣa no với 3 nối đôi có khả năng oxy hoá mạnh, nên dầu mau khô. Khi khô kết thành màng có tính chất chống ẩm chịu đƣợc thời tiết biến đổi cao, sức co giãn tốt, có tác dụng chống gỉ. Cho nên dầu Trẩu có vai trò rất quan trọng trong chế biến Sơn, keo. Ngoài ra dầu Trẩu đƣợc dùng để pha chế nhiên liệu sinh học, đó là dầu diesel sinh học. Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành xây dựng đề tài ở giai đoạn đầu đó là: “Phân lập gen diacylglycerol acyltransferase (DGAT1) mã hóa một enzyme đóng vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp triacylglycerol ở loài cây Trẩu (Vernicia montana)” 1 PHẦN I. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. 1. Giới thiệu về cây Trẩu Nguồn gốc Cây Trẩu có tên khoa học là: Vernicia montana Giới : Plantae Bộ : Malpighiales Họ : Euphorbiaceae Chi : Vernicia Loài :Vernicia montana Đặc điểm sinh học Trẩu hay còn gọi là Trẩu nhăn (danh pháp khoa học: Vernicia montana) là một loài cây mộc bản địa ở Đông Nam Á và Hoa Nam. Cây trẩu thƣờng mọc ở vùng đất khô, ráo nƣớc ở trong rừng thƣa hoặc ven rừng rậm, thƣờng đƣợc trồng nhiều ở các tỉnh phía Bắc tới Nghệ An, Hà Tĩnh để làm cây cho bóng mát và cũng để lấy hạt. Thu hái vỏ cây vào mùa xuân, hạt lấy ở quả già. Cây trung bình cao 10– 15 m. Lá trẩu to bản dài khoảng 15 cm, rộng 10 cm, có khi xòe thành ba dẻ, mặt trên có lông tơ rậm; mặt dƣới ít hơn. Hoa trẩu đơn tính, sắc trắng, ở giữa ngả màu hung đỏ tía. Hoa mọc thành chùm, khá thơm. Trái trẩu hình trứng, hơi nhọn đằng chỏm, tròn đằng cuống, lớn khoảng 5 cm. Vỏ nhăn nheo, có lông tơ; mặt vỏ có những rãnh dọc ngang. Trái trẩu chia thành 3 2 múi; khi trẩu chín thì trái ngả sang màu vàng. Mỗi trái thƣờng có ba hạt. Hạt trẩu hình bầu dục, sần sùi, dài khoảng 25 mm, rộng khoảng 20 mm. Trẩu sinh trƣởng nhanh, ở điều kiện thích hợp cây 3 tuổi có cao 4-5m. Cây bắt đầu ra hoa, kết quả ở giai đoạn sau 6-7 năm tuổi. Mùa hoa tháng 3-5, mùa quả chín tháng 9-10. Hoa thụ phấn nhờ côn trùng. Tuổi thọ của cây khoảng 35-50 năm hoặc lâu hơn, tuỳ thuộc điều kiện môi trƣờng sống và chế độ canh tác. Thành phần hóa học Nhân chiếm 50-70% trọng lƣợng hạt. Hàm lƣợng dầu trong nhân khá cao (46 – 65%). Các chỉ số lý hoá chính của dầu: Tỷ trọng (ở 150C): 0,9208-0,9450; chỉ số chiết quang (ở 350C): 1,504-1,517; chỉ số iod: 149,5-170,58; chỉ số xà phòng: 193,38-196,73; chỉ số acid: 1,4. Dầu chứa acid béo chủ yếu là axit stearic (70 – 80%). Đây là dạng acid béo chƣa no với 3 nối đôi có khả năng oxy hoá mạnh, nên dầu mau khô. Sau khi ép dầu, khô bã còn lại chứa tới 50% protein thô, 7,5% tro, 3% cellulose và một số hợp chất khác (trong đó có saponin). Giá trị sử dụng Dầu trẩu có những đặc tính quan trọng mà một số dầu khác không có đó là tính chịu nhiệt độ cao, chịu nƣớc và chịu mặn. Chính vì vậy, đây là nguyên liệu quý trong việc chế biến sơn cách nhiệt, sơn trang trí, sơn chống axit, sơn trong môi trƣờng có sức phá hủy mạnh và kể cả sơn dùng trong Quốc phòng. Do những tính chất đặc biệt và công dụng lớn nhƣ đã nêu trên, dầu trẩu là một sản phẩm rất có giá trị. Trong công nghiệp, dầu trẩu đƣợc dùng làm sơn cao cấp, (sơn ô tô, máy bay, tầu thuyền…), sơn cách điện, cách nhiệt, chất dẻo, cao su nhân tạo, xà phòng, da 3 nhân tạo, vải sơn, vải dầu, sơn mỹ thuật, mực in… Khô dầu dùng làm phân bón hoặc làm thức ăn gia súc sau khi đã khử các độc tố. Vỏ quả có thể dùng làm than hoạt tính. Gỗ màu trắng, mềm dễ bị mối mọt, nên có thể dùng làm bột giấy hoặc làm củi đun. Những nghiên cứu gần đây của Đại học Lâm nghiệp cho biết, gỗ trẩu có thể xử lý để sản xuất đồ mộc dạng ván ghép thanh. 1.2. Diacylglycerol acyltransferase (DGAT) và các nghiên cứu ứng dụng 1.2.1. Giới thiệu về diacylglycerol acyltransferase Theo số liệu của Bộ Nông nghiệp Mỹ, sản lƣợng nhiên liệu sinh học toàn cầu đã tăng gấp ba lần từ 4,8 tỷ ga lông (18,16 tỷ lít) năm 2000 lên khoảng 16 tỷ ga lông (60,56 tỷ lít) năm 2007, nhƣng vẫn chỉ chiếm chƣa đến 3% lƣợng cung ứng nhiên liệu cho các phƣơng tiện giao thông toàn cầu.