УДК 575.17: 582.579.2 РІВЕНЬ ПОЛІМОРФІЗМУ ТА ДИФЕРЕНЦІАЦІЯ ПОПУЛЯЦІЙ IRIS PUMILA L. ЗАДАНИМИ ТРЬОХ ТИПІВ ПЛР-МАРКЕРІВ О.М. БУБЛИК \ І.Ю. ПАРНІКОЗАВ.А. КУНАХ1 1 Інститут молекулярної біології'і генетики НАН України, вул. Акад. Заболотного, 150, Київ, 03143, Україна 2 ДУ Національний антарктичний науковий центр МОН України, бульвар Тараса Шевченка, 16, Київ, 01601, Україна E-mail: [email protected], [email protected], [email protected] Генетичний поліморфізм рідкісного селекційно і деко­ Здебільшого для рідкісних та зникаючих ви­ ративно цінного виду Iris pumila досліджено за до­ дів обмежені відомості про геномні послідов­ помогою ПЛР-аналізу з праймерами трьох типів: на ності, тому актуальним завданням є розробка основі мікросателітних послідовностей (ISSR), послі­ ефективних підходів та вибір адекватних марке­ довностей МГЕ (IRAP та iPBS) та генів відповіді на абіотичний стрес (LP-PCR). Виявлено високий рівень рів для дослідження генетичного поліморфізму внутрішньовидового та внутрішньопопуляційного гене­ кожного нового виду. За літературними дани­ тичного поліморфізму, який не поступався значенням ми при вивченні генетичної мінливості рослин інших видів роду Iris. Основні показники генетичного широко використовують як ПЛР-маркери на поліморфізму п ’яти популяцій І. pumila з території основі послідовностей некодувальних ділянок України склали: частка поліморфних локусів (Р) — ДНК (Garrido-Cardenas et al., 2018), так і різних 26,5—68,5 %, індекс Шеннона (S) — 0,105—0,285, генне генів (Gupta, Rustgi, 2004; Soumaya et al., 2020) різноманіття (Н ) — 0,069—0,190. Залежність рівня та ретротранспозонів (Kalendaret al., 2018). При мінливості від розміру популяції була прямою у ISSR- розробці програм збереження останнім часом аналізі і оберненою за даними інших двох маркерів. Пряму залежність генетичних та географічних дис­ зростає інтерес до використання поряд із до­ танцій між популяціями виявили лише ISSR-маркери. бре вивченими і найбільш поширеними ней­ Найвищий рівень поліморфізму виявляли LP-PCR- тральними анонімними маркерами і тих, що маркери, але встановити популяційну приналежність відображають адаптивну генетичну мінливість усіх особин дозволили лише ISSR-маркери. Апробована (Rodriguez-Quilon et al., 2016; Flanagan et al., система ПЛР-маркерів може бути застосована для 2018). Саме вони дозволяють відібрати матері­ моніторингу стану генофонду, вивчення генетичної ал для збереження, який буде мати вищу стій­ структури популяцій та міграційних процесів. кість до кліматичних змін, різноманітних стре­ Ключові слова: Iris pumila і., рідкісний вид, ПЛР- сів, хвороб і в кінцевому рахунку забезпечить аналіз, генетичний поліморфізм, генетична структу­ адаптацію і виживання популяцій, а також у ра популяцій. подальшому може бути застосований у селек­ Вступ. Одним із ключових сучасних напрям­ ції для збагачення господарсько-цінних видів ків природоохоронної біології є збереження корисними ознаками (Gupta et al., 2004; Allen- генетичного різноманіття. Головним завдан­ dorf, 2017). Розуміння особливостей мінливості ням при охороні видів є збереження макси­ різних типів ДНК-маркерів і їх адекватне за­ мального еволюційного потенціалу, що може стосування може бути корисне не лише для забезпечити підтриманням найвищої можливої різнобічної характеристики генетичного полі­ генетичної мінливості. Цей підхід грунтується морфізму, а і для уточнення класифікації так­ на попередньому визначенні рівня і розподілу сономічних груп і підвищення ефективності генетичної мінливості рідкісних видів, вивчен­ застосування маркерних систем у селекцій­ ні генетичних процесів у їхніх популяціях та них програмах (Biswas et al., 2010; Mahmud et адаптації до умов довкілля. Кінцевим ета­ al., 2018). пом є розробка на основі цих даних науково У цьому дослідженні ми порівняли пошире­ обгрунтованих рекомендацій щодо збережен­ ні методи ISSR, IRAP і порівняно нові — iPBS ня та експлуатації видів (Allendorf, 2017; Frank- та LP-PCR за здатністю визначати генетичний ham et al., 2017; Holderegger et al., 2019). поліморфізм. ISSR-ПЛР (Inter-Simple Sequence Repeat) призначений для аналізу ділянок ге­ © O.M. БУБЛИК, І.Ю. ПАРНІКОЗА, В.А. КУНАХ, 2021 ному, фланкованих інвертованими повторами 42 ISSN 0564—3783. Цитологія і генетика. 2021. Т. 55. № 1 Рівень поліморфізму та диференціація популяцій Iris pumila L. мікросателітних локусів (Zietkiewicz et al., пуляційної структури та виявлення адаптивних 1994). Другий тип застосованих нами марке­ генетичних змін. рів пов’язаний із мобільними генетичними Матеріали і методи. Матеріалом для дослід­ елементами (МГЕ): [RAP (Inter-Retrotransposon ження були 49 рослин І. pumila з п’яти при­ Amplified Polymorphism) використовує прай- родних популяцій, географічне розміщення мери на основі послідовностей LTR — довгих яких охоплює широти від південного Криму кінцевих фрагментів ретротранспозонів, а до північної межі поширення виду в Україні: iPBS — на основі послідовностей праймер- 11 рослин з популяції поблизу с. Мигія (Пер- зв’язувального сайту (primer binding site) зво­ вомайський р-н Миколаївської обл.), 9 рос­ ротної транскриптази (Kalendar et al., 2010). лин з півострова Аляуди (м. Миколаїв), 10 — з Ефективність цих маркерів зумовлена присут­ околиць с. Каравеллово (до 2016 р. Коларово, ністю великої кількості ретроелементів у ге­ Жовтневий р-н Миколаївської обл.), 10 — з номах більшості рослин і їх здатністю до ут­ околиць с. Андріївка (Полтавський район, Пол­ ворення нових копій. Також ми використали тавська обл.), 9 рослин з околиць Балаклави LP-PCR (Long Primer PCR) — праймери, го­ (м. Севастополь, АР Крим). Розміри популяцій мологічні до консервативних послідовностей складали: Мигія — більше тисячі особин, Аляу­ генів відповіді на абіотичний стрес: гену теп­ ди — близько сорока, Каравеллово та Андріїв­ лового шоку Hvhspl7 та гену стресу посухи ка — близько пятидесяти, Балаклава — близько АБАЗ (Liviero et al., 2002). Функція зазначених двохсот. генів безпосередньо пов’язана із забезпечен­ ДНК виділяли за (Doyle, Doyle, 1987) із су­ ням життєздатності організму в умовах стре­ хого матеріалу за допомогою СТАБ із подаль­ су, тому мінливість, яку вони виявляють, по­ шою очисткою хлороформом. тенційно має адаптивний характер. Для генетичного аналізу були використані ві­ Об’єкт дослідження — Iris pumila L. (Irida- дібрані в попередньому дослідженні (17) прай­ ceae) — вид, який використовується у селекції мери різних типів, ефективність яких визначали та декоративному садівництві, типовий ксеро­ за показником розпізнавальна здатність DL. фіт європейської степової зони. Це багаторіч­ Показник Dl розраховували за формулою: ник, шо розмножується клонально та насін­ ням, запилюється комахами, є строго пере­ DL=1-Ip„ хреснозапильним, з низькою здатністю до роз­ де р. — частота і-го набору фрагментів (патер- повсюдження насіння. Цей вид — алополіплоїд ну) з числа утворюваних праймером (Tessier et (2п = 32), що імовірно утворився внаслідок al., 1999). Загалом було застосовано сім ISSR- природної гібридизації між /. attica (2п = 16) праймерів (tri6 = 53 °С), два IRAP-праймери and I. pseudopumila (2п =16). Внаслідок згубно­ (tri6p = 58 °С), чотири iPBS-праймери (t = го антропогенного впливу та природних фак­ 50 °С) та два LP-PCR-праймери (tri6p=55 °С). торів чисельність іриса низького скорочується, Послідовності та характеристики використаних відбувається руйнування його середовища іс­ праймерів наведено у табл. 1. нування і фрагментація ареалу. На сьогодніш­ Реакційна суміш для проведення ПЛР ній день вид охороняється на території низки об’ємом 20 мкл містила: 20 нг ДНК, 0,2 мМ областей України (Parnikoza et al., 2017), шо дНТФ, 1,25 U Taq-полімерази, 1 х (NH4)2S04 обумовлює актуальність визначення загрози буфер («Fermentas», Литва), 2 мМ MgCl2, 1 мкМ збіднення його генетичного різноманіття. праймера. На реакційну суміш нашаровували У цьому дослідженні ми ставили перед со­ 15 мкл мінеральної олії для запобігання випа­ бою подвійну мету — поглиблене дослідження ровуванню. Як негативний контроль викорис­ генетичного поліморфізму І. pumila за допомо­ товували стандартну реакційну суміш без ДНК. гою ПЛР-маркерів трьох типів — ISSR, МГЕ та ПЛР проводили в термоциклері Терцик МС2 LP-PCR — і порівняння їх ефективності для ви­ («Біотехнологія», Росія) за наступного темпе­ значення рівня мінливості, диференціації по­ ратурного режиму: 94 °С — 2 хв., 35 х (94 °С — пуляцій та окремих особин, встановлення по­ 20 с, tri6p- 30 с, 72 °С - 90 с), 72 °С - 5 хв. ISSN 0564—3783. Цитологія і генетика. 2021. І 55. № 1 43 О.М. Бублик, І.Ю. Парнікоза, В. А. Кучах Продукти ПЛР фракціонували електрофо­ нітність Нея (очікувана гетерозиготність Не) — резом у 1,5%-ному агарозному гелі в буфері розраховували за допомогою програми GenAl- 0,5*ТВЕ і візуалізували забарвленням бромис­ Ех (Peakall, Smouse, 2006). За допомогою цієї ж тим етидієм. програми у тесті Мантеля (Mantel, 1967) з 999 Кожну реакцію проводили у двох повтор- пермутаціями визначали кореляції між матри­ ностях, враховували лише чіткі і відтворювані цями генетичних та географічних дистанцій. А амплікони. На основі матриць бінарних ознак також застосовували аналіз молекулярної дис­ (наявність-відсутність амплікона) за допомо­ персії (AM OVA) для оцінки розподілу загаль­ гою програми FAMD (Schlüter, Harris, 2006) ної генетичної мінливості між трьома регіона­ розраховували генетичні відстані Жакарда між ми (Миколаївська обл., Полтавська обл., АР рослинами, на їх основі методом UPGMA бу­ Крим), п’ятьма популяціями та в їх межах. дували дендрограми генетичної подібності. Генетичну структуру популяцій