Diversity and Ecology of Chemosynthetic Symbioses in Deep-Sea Invertebrates Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften - Dr. rer. nat. - dem Fachbereich Biologie/Chemie der Universit¨at Bremen vorgelegt von Jillian M. Petersen Bremen July 2009 Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von April 2006 bis Juli 2009 in der Symbiose-Gruppe am Max-Planck-Institut f¨ur marine Mikrobiologie in Bremen angefertigt. 1. Gutachterin: Dr. Nicole Dubilier 2. Gutachterin: Prof. Dr. Barbara Reinhold Tag des Promotionskolloquiums: 15. September 2009 Auf dem Deckblatt: Rimicaris exoculata Garnelen und Bathymodiolus puteoser- pentis Muscheln auf einem schwarzen Raucher, Logatchev Hydrothermalfeld, Mittel-Atlantischer R¨ucken. Copyright Woods Hole Oceanographic Institu- tion. ‘Finish each day and be done with it. You have done what you could. Some blunders and absurdities no doubt crept in, forget them as soon as you can. Tomorrow is a new day, you shall begin it well and serenely...’ - Ralph Waldo Emerson Summary The energy sources that drive biological processes at deep-sea hydrothermal vents and cold seeps include methane and reduced inorganic compounds such as sulfide and hydrogen. These compounds are unavailable to metazoan life, but can be used by chemoautotrophic or methanotrophic bacteria to fuel chemosynthetic primary production. In these habitats, symbioses between invertebrates and chemoautotrophic or methanotrophic bacteria form the basis of ecosystems that thrive in the absence of sunlight. This thesis is made up of two thematic parts. In the first part, two reviews on methane- oxidizing symbionts are presented. Methanotrophic symbiotic bacteria have so far been found in invertebrate animals at hydrothermal vents and cold seeps in the deep sea, and in a plant host in a terrestrial wetland. No methane-oxidizing symbiont has yet been cultured. Therefore, the evidence for methanotrophy in these bacteria has come from ultrastructural, enzymatic, physiological, stable isotope, and molecular biological studies of the symbiotic host tissues. Despite being found in a wide range of hosts, all marine methanotrophic symbionts for which 16S rRNA sequences are available belong to a single lineage within the Gammaproteobacteria. Methane-oxidizing symbionts in the terrestrial habitat belong to the Alphaproteobacteria. However, many of these symbionts have not yet been characterized with molecular methods, and may be more diverse than currently recognized. These reviews summarize the current knowledge of methane-based symbioses, and identify topics for future research. In the second part of this thesis, I present two studies on the ectosymbiosis of Rimicaris exoculata, an alvinocaridid shrimp from hydrothermal vents on the Mid-Atlantic Ridge (MAR). These shrimp have filamentous ectosymbionts on modified appendages and the inner surfaces of the gill chamber. The symbionts were previously assumed to be ep- silonproteobacterial sulfur oxidizers. Using the full-cycle 16S rRNA approach, I identified a second filamentous ectosymbiont that belongs to a novel symbiotic lineage within the Gammaproteobacteria. To investigate the biogeography of the symbiosis, I compared the 16S rRNA gene sequences of ectosymbionts from four MAR vent fields, Rainbow, TAG, Logatchev, and South MAR, which are separated by up to 8500 km along the MAR. Differ- ences in the 16S rRNA gene for both the gammaproteobacterial and epsilonproteobacterial symbionts were correlated with geographic distance. In contrast, the phylogeny of the free- living relatives of the epsilonproteobacterial symbiont showed no obvious geographic trend. Host-symbiont recognition could explain the observed symbiont distribution. The metabolism of the symbionts from the Rainbow vent field was investigated by ther- modynamic modelling, sequencing of key metabolic genes, and immunohistochemical la- belling of proteins in single epibiont cells. Key genes for carbon fixation by the reductive TCA and CBB cycles indicate that both symbionts can fix CO2. Key genes for hydro- gen, methane, and sulfur oxidation indicate that the epibionts have the potential to use these three energy sources. In addition, immunohistochemistry showed that particulate methane monooxygenase is expressed by the gammaproteobacterial symbiont, although it does not belong to any of the currently known methanotrophic lineages. These studies show that the phylogenetic and functional diversity of the shrimp epibiosis is greater than previously recognized. Zusammenfassung An Hydrothermalquellen und Cold-Seeps erm¨oglichen Methan und reduzierte anorganische Verbindungen wie Sulfid und Schwefelwasserstoff biologische Prozesse. Diese Verbindun- gen sind f¨ur h¨ohere Organismen nicht verf¨ugbar, koennen aber von chemoautotrophen und methanotrophen Mikroorganismen f¨ur chemosynthetische Prim¨arproduktion genutzt wer- den. In diesen Habitaten sind Symbiosen zwischen Invertebraten und chemoautotrophen und methanotrophen Bakterien die Grundlage f¨ur Licht-unabh¨angiges Leben. Diese Dissertation besteht aus zwei Teilen. Im ersten Teil werden zwei Review-Artikel ueber Methanotrophe Symbionten vorgestellt. Methanotrophe Symbionten wurden bis- lang in Invertebraten an Hydrothermalquellen und Cold-Seeps in der Tiefsee und in einer Moospflanze eines terrestrischen Habitats gefunden. Bislang wurde kein Methan- oxidierender Symbiont im Labor kultiviert. Beweise fuer die Methanotophie diesen Bak- terien stammen daher von Untersuchungen zu Ultrastruktur, Enzymatik, Physiologie, Iso- topie, und Molekular-Biologie. Trotz ihrer weiten Verbreitung in vielen Wirtsorganismen geh¨oren alle marinen methanotrophen Symbionten mit bekannter 16S rRNA Gensequenz zu einer einzigen Gruppe innerhalb der Gammaproteobakterien. Terrestrische, Methan- oxidierende Symbionten geh¨oren dagegen zu den Alphaproteobakterien. Viele dieser Sym- bionten sind jedoch noch nicht molekularbiologisch charakterisiert und sind m¨oglicherweise diverser als bislang bekannt. Diese Review-Artikel fassen den aktuellen Wissensstand Methan-basierter Symbiosen zusammen und geben Ausblick auf zuk¨unftige Forschungss- chwerpunkte. Im zweiten Teil dieser Dissertation stelle ich zwei Untersuchungen zur Ektosymbiose von Rimicaris exoculata, einer alvinocarididen Garnele von Hydrothermalquellen des Mittel- Atlantischen R¨uckens (MAR), vor. Modifizerte Gliedmaße und innere Oberfl¨achen der Kiemenh¨ohlen der Wirte sind von filament¨osen Ektosymbionten besiedelt, welche fr¨uher als schwefeloxidierende und ausschliesslich epsilonproteobakterielle Organismen beschrieben wurden. Anhand des 16S rRNA Ansatzes habe ich einen zweiten filament¨osen Ektosym- bionten identifiziert, welcher zu einer neuen Gruppe von symbiontischen Gammapro- teobakterien geh¨ort. Die Biogeographie der Ektosymbionten von den vier Hydrothermal- Feldern Rainbow, TAG, Logatchev und South MAR habe ich basierend auf 16S rRNA Gensequenzen vergleichend untersucht. Diese Untersuchungsgebiete sind bis zu 8500 km von einander entfernt. Unterschiede zwischen den 16S rRNA Gensequenzen korre- lierten mit der geographischen Verteilung sowohl der gammaproteobakteriellen als auch der epsilonproteobakteriellen Symbionten. Im Gegensatz dazu zeigten die freileben- den Verwandten der epsilonproteobakteriellen Symbionten keine eindeutige Korrelation mit der Geographie. Die spezifische Erkennung von Wirt und Symbiont k¨onnte das Verteilungsmuster erkl¨aren. Abschliessend wurden die Stoffwechsel-Kapazit¨aten der Symbionten des Rainbow Hydrothermal-Feld anhand thermodynamischer Modellierung, Sequenzierung von Genen zentraler Stoffwechselfunktionen und immunohistochemischer Markierung von Proteinen direkt in Symbionten-Zellen untersucht. Der Nachweis von Schl¨usselgenen des reduktiven TCA-Zyklus und des CBB-Zyklus deuten darauf hin, dass beide Symbionten CO2 fixieren k¨onnen. Detektierte Gene zur Oxidation von Wasserstoff, Methan und Schwefel zeigen die m¨ogliche F¨ahigkeit diese Verbindungen als Energiequelle zu nutzen. Dar¨uber hinaus wurde immunohistochemisch die Expression der partikul¨aren Methan Monooxygenase im gammaproteobakteriellen Symbionten gezeigt, wobei dieser Organismus phylogenetisch nicht zu den bislang bekannten Methanotrophen geh¨ort. Diese Untersuchungen legen nahe, dass die phylogenetische und physiologische Diversit¨at dieser Symbiosen gr¨oßer ist als bislang angenommen. TABLE OF CONTENTS Contents I Introduction 13 1 Chemosynthesis 14 1.1 Energy sources for chemosynthetic microorganisms ...... 14 1.2 Carbon sources for chemosynthetic microorganisms ...... 15 1.2.1 CO2 fixation pathways .................. 17 1.2.2 CH4 incorporation .................... 19 1.3 Chemosynthetic animals? ..................... 21 2 Diversity of habitats 22 2.1 Hydrothermal vents ........................ 23 2.1.1 The geological setting of hydrothermal vents ...... 23 2.1.2 Hydrothermal circulation and the chemical and physi- cal properties of vent fluids ............... 28 2.1.3 Heterogeneity of vent fluid composition on the Mid- Atlantic Ridge ....................... 32 2.2 Cold Seeps ............................. 33 2.2.1 The geological setting of cold seeps ........... 33 2.3 Analogous habitats ........................ 34 2.3.1 Shallow-water marine sediments ............. 34 2.3.2 Whale falls ........................ 35 2.3.3 Sunken wood and shipwrecks .............. 35 3 Diversity of hosts 36 3.1 Marine invertebrate hosts with endosymbionts ......... 42 3.2 Marine invertebrate hosts with ectosymbionts ......... 46 4 Diversity of microbes 49 4.1 Sulfur-oxidizing