Arshive of SID ژنتيک نوين دوره يازدهم، شماره 1، بهار 1315 صفحه 11-11 بررسی تنوع ژنتیکی ماهی گورخری زاگرس )Aphanius vladykovi( در چشمه مادر و دختر و چشمه چهلگزی در استان چهارمحال و بختیاری با استفاده از نشانگرهای ریزماهواره Genetic diversity of zagros zebrafish (Aphanius vladykovi) in Madar-o-dokhtar spring and Chehelgazi spring in the Chaharmahall-o-Bakhtiari Province by using microsatellite markers * سیدهآمنه حسینی ، علی شعبانی ، حمیدرضا رضایی 1- بهترتیب کارشناس ارشد، دانشیار، استادیار دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی،گرگان، ایران Hosseini SA*1, Shabani A1, Rezaei HR1 1- MSc Student, Associate Professor, Assistant Professor, Gorgan University of Agriculture Science and Natural Resources, Iran * نویسنده مسئول مکاتبات، پست الکترونیکی:[email protected] )تاریخ دریافت: 1/11/29 - تاریخ پذیرش: 29/9/11( چکیده مطالعه حاضر با هدف بررسی تنوع ژنتيکی ماهی گورخری زاگرس )Aphanius vladykovi( که ماهی کوچکی از خانواده کپور دندانداران و بومی استان چهارمحالوبختياری است، با استفاده از نشانگرهای ريزماهواره صورت گرفت. بدينمنظور تعداد 64 قطعه ماهی در پاييز 19 از چشمه چهلگزی و چشمه مادر و دختر جمعآوری شد. در اين بررسی از 4 جايگاه ريزماهواره چندشکل واژههای کلیدی استفاده شد. تعداد آلل مشاهده شده در جمعيتها به طور ميانگين 61/11 و هتروزيگوسيتی مشاهدهشده در چشمه چهلگزی 113/9 و در چشمه مادر و دختر 159/9 محاسبه شد که نشان می- Aphanius vladykovi دهد دوره توليدمثلی طوﻻنی آفانيوس دليلی بر موفقيت توليدمثلی و افزايش هتروزيگوسيتی تنوع ژنتیکی است. نتايج حاصل از Fst )923/9( و Rst )912/9( تمايز ژنتيکی پايينی را ميان مناطق نشان دادند. چهارمحال و بختیاری تجزيه واريانس ملکولی تنها دو درصد تنوع بين جمعيتها نشان داد و فاصله ژنتيکی بين جمعيتها ریزماهواره 322/9 محاسبه شد. جريان ژنی بين دو منطقه 919/11، نسبتاً باﻻ بوده و میتواند متأثر از نحوه محاسبه آماری جريان ژنی باشد. در بررسی تعادل هاردی- واينبرگ پس از اعمال ضريب تصحيح بونفرونی از بين 12 تست جايگاه ژنی، در سه تست پيروی از تعادل مشاهده شد. اين بررسی دﻻيل و نتايج اوليه را برای وجود جمعيتهای متمايز ماهی گورخری زاگرس نشان میدهد، بنابراين توجه و اقدامات جدی برای حفظ ذخاير ژنتيکی آن ضروری است. www.SID.ir Arshive of SID بررسی تنوع ژنتيکی ماهی گورخری زاگرس... سیدآمنه حسینی و همکاران مقدمه آفانیوسها ماهیان با ارزش بیولوژیکی هستند که در مبارزه با بیماری ماﻻریا )با خوردن ﻻرو پشه آنوفل( نقش دارند و از لحاظ ظاهری برای اهداف زینتی بهکار میروند. اغلب یوریترم، یوری- هالین و مقاوم به کمبود اکسیژن بوده اما آبهای خنثی و پر اکسیژن را ترجیح میدهند )Keivany and Soofiani 2004(. این ماهیان دارای دوره تولید مثلی طوﻻنی هستند که نوعی سازگاری Aphanius vladykovi با شرایط محیطی برای ماهیان کوچک با دوره زیستی کوتاه شکل 1- ماهی گورخری زاگرس ) ( محسوب میشود و زمان آن در جنسهای مختلف آفانیوس از DNA اواخر اسفند تا اول مهر با غالبیت در فروردین تا مرداد مشاهده عدم ترمیم میشوند، میتوانند پایداری ژنوم و در نتیجه Jewell 2006 شده است )Hossaini and Golzar 2012(. این ماهیان دارای دو- ریزماهوارهها را تحت تأثیر قرار دهند ) (، لذا تنوع شکلی جنسی بوده و بلوغ جنسی زود هنگام را نشان میدهند و از ریزماهوارهها ابزار بسیار حساسی را برای اندازهگیری تفاوتهای چند ماه پس از تولد، توانایی تولیدمثل دارند. Aphanius ژنتیکی جزئی بین جمعیتها فراهم میآورد. vladykovi در چشمهها و رودخانههای استان چهارمحال و عوامل تهدیدآمیزی برای زندگی آفانیوس زاگرس مطرح بوده که بختیاری که اغلب از سرچشمههای رودخانه کارون هستند، از آنجمله خشک شدن برخی زیستگاهها، آلوده شدن منابع آبی، زندگی میکند. نظر به کاهش ساﻻنه جمعیتهای این ماهی در فرار ماهیان قزل آﻻ از استخرها و ورود به تاﻻبها مانند تاﻻب استان چهارمحال و بختیاری و با توجه به ارزش زیستشناختی و چغاخور که از زیستگاههای مناسب آفانیوس است، همچنین زینتی Aphanius vladykovi، بررسی تنوع ژنتیکی این موجود احداث استخرهای قزلآﻻ در مسیر چشمه و رودخانه، که جهت درک میزان ذخایر و حفاظت از آن امری ضروری به شمار شکارچیان قدری برای آفانیوس هستند و سبب کاهش قابل توجه میآید. تنوع ژنتیکی یکی از سه سطح تنوع زیستی پیشنهاد شده جمعیتهای این گونه آبزی شدهاند، اشاره میشود. از جهتی توسط سازمان جهانی حفاظت از منابع طبیعی )IUCN( برای آفانیوس زاگرس در اکثر حوزههای آبی با بیماریهای انگلی برنامههای حفاظت ذخایر است )Lucentini et al. 2009(. بنابراین مخصوصاً بیماری ایک مواجه و بسیار مستعد برای این بیماری حفظ بقای هر جامعه، از اهداف اساسی در زیستشناسی حفاظت است و آنگونه که در بررسیهای پیاپی مشاهده شد و با توجه به است. پژوهشهای پیشین، دچار تلفات قابل توجهی در اثر ابتﻻ به ایک Raissy et al. 2008; Fattollahi 2013 ریزماهوارهها یکی از مهمترین نشانگرهای ژنتیکی به شمار می- میشود ) (. Aphanius آیند، زیرا دارای پتانسیل تخمین مهاجرت و قدرت تفکیک برای پژوهشهای محدودی در زمینه ژنتیکی بر روی جنس تشخیص نسبت باﻻی خویشاوندی میباشند ) .Kimberly et al صورت گرفتهاست. در خط ساحلی اطلس جنوبی تنوع ژنتیکی A.baeticus 2006(. از آنجا که برای یک جایگاه که آغازگر ریزماهواره بر با استفاده از نشانگرهای میتوکندریایی و هستهای اساس آن طراحی می شود، آللهای متعددی یافت میشود، این بررسی شد و تنوع ژنتیکی بسیار پایین و تمایز ژنتیکی ضعیفی نشانگر برای بررسی تنوع ژنتیکی قابلیت باﻻیی دارد. پایداری شناسایی شد. در این خصوص توزیع پراکنده این گونه که از ریزماهوارهها احتماﻻً از طریق پایداری ژنوم در کلیه سطوح کنترل دورههای میان دو یخبندان آغاز شده و همراهی آن با حوادث می شود، بهطوری که برخی جهشها نظیر جهشهایی که موجب خلفی انقراض و مهاجرت ناشی از چرخههای ادواری حاصل از جاری شدن سیل توانسته عدم وجود روابط فیلوژنیک میان جمعیت را به خوبی بیان کند )Gonzales et al. 2014(. بررسی 1 International union for conservation of nature 19 ژنتیک نوین/ دوره یازدهم/ شماره 1/ بهار 1315 www.SID.ir Arshive of SID بررسی تنوع ژنتيکی ماهی گورخری زاگرس... سیدآمنه حسینی و همکاران تنوع ژنتیکی A. Fasciatus نیز تنوع ژنتیکی کم و جمعیت همگن گندمان با موقعیت جغرافیایی N ″46/14ˊ19˚21 و E از نظر ژنتیکی را نشان داد و همچنین نشان داد ریزماهواره نسبت ″91/21ˊ92˚11 و چشمه چهلگزی در نزدیکی روستای باستانی به آلوزایم سطح کم تنوع ژنتیکی را نشان داد ) ;Maltagliati 1998 بیژگرد با موقعیت جغرافیایی N ″99/99ˊ94˚21 و E 29/92″ Cimmaruta et al. 2010(. در بررسی کروموزومی ماهی ˊ19˚ 11 در پاییز سال 1229 صورت گرفت )شکل 9(. باله پشتی گورخری زاگرس مشخص شد که تعداد نمایی کروموزومها )9n( در اتانول مطلق فیکس شده و برای مطالعات ژنتیکی به آزمایشگاه برابر 94 بوده که مشابه دیگر گونههای این جنس از جمله بیوتکنولوژی دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی گرگان منتقل شد. A.persicus ،A. dispar ،A.ginaonis است که تاکنون بررسی استخراج DNA و واکنش زنجیرهای پلیمراز شدهاند ) Esmaeili et al. 2007; Amini and Hemmatzadeh استخراج DNA با استفاده از روش فنل-کلروفرم ) .Hillis et al 2012(. همچنین بررسی نواربندیهای گوناگون بر روی 1996( صورت گرفت. DNA استخراج شده در 199 میکرولیتر کروموزومهای Aphanius vladykovi که برای نخستین بار در آب مقطر دو بار تقطیر حل شده و تا زمان انجام آزمایشات در ایران بر روی یک گونه آبزی انجام شد، نشان داد ژنوم این گونه فریزر 99- درجه سانتیگراد نگهداری شد. کمیت و کیفیت DNA دارای نواحی غنی از بازهای C و G بوده در حالی که بخشهای استخراجی با الکتروفورز ژل آگارز یک درصد و روش غنی از بازهای A و T در آن کم است ) Hemmatzade and اسپکتروفتومتری تعیین شد. شش جفت آغازگر ریزماهواره شامل BL2-114 ،)Strecker 2006( GATA2 ،CmD1 ،AC4 ،BA9 .)Amini 2012 از آنجا که تاکنون اطﻻعاتی در مورد تنوع ژنتیکی Dubut et al. 2009( Aphanius( و Matura et al. 2012( GGM024( مورد vladykovi منتشر نشده و از طرفی دانستن تنوع ژنتیکی برای تجزیه و تحلیل قرار گرفت. واکنش زنجیرهای پلیمراز )PCR( حفظ ذخایر با ارزش این گونه ضروری است، در این مطالعه به برای هر یک از آغازگرها انجام شد و دمای بهینه برای هر یک به بررسی تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیتهای آن در دو منطقه با دست آمد )جدول 1(. محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز روی 6 جفت آغازگر ریزماهواره پرداخته شد. ژل پلیاکریلآمید 4 درصد جداسازی شده و در نهایت ژلها به Sambrok et al. 1989 روش نیترات نقره رنگآمیزی شدند ) (. Gel Doc مواد و روشها عکسبرداری از ژلها توسط دستگاه مستندساز ژل ) Gel-Pro Analyzer 6.0 XR, BIO-RAD بررسی مناطق و نمونهبرداری ( انجام شد و از نرمافزار نمونهبرداری در استان چهار محال و بختیاری از 92 عدد ماهی برای محاسبه طول قطعات استفاده شد. آفانیوس زاگرس در هر منطقه، چشمه مادر و دختر در شهرستان جدول 1- خصوصیات جایگاههای ژنی مورد استفاده در جمعیتهای کپوردندان زاگرس bp ˚C ´ ´ جایگاه توالی آغازگر) 2- 1( دمای اتصال) ( وزن ) ( F:CACGCTCCTTTGGGGAAGCCTA BA9(F) 919-262 69 R:GCCGTCTGCCTGTTTGCCTTTATC F:AATGGATGGTGTGAATGGC CmD1(F) 164-991 11 R:GGATGGATACAGAGCAGCAC F:TCGGATGCTCAGTCAGTACG GATA2(F) 129-921 19 R:ATGAACAACGAGTCACACGC F:CTGCTGCAGTCTGCAC AC4(T) 129-169 99 R:TCACCTCCAAGGTTAGTCAT F:ATCACTGCCATTTTATTA BL2-114 944-249 19 R:CTGCTCCGCTCTGTTCCA F:TCCCTCTTTTTGGTCTCAGG GGM024 199-149 11 R:TAGGTGAACAAATGGCATGG ژنتیک نوین/ دوره یازدهم/ شماره 1/ بهار 1315 13 www.SID.ir Arshive of SID سیدآمنه حسینی و همکاران بررسی تنوع ژنتيکی ماهی گورخری زاگرس... جدول 9- تنوع ژنتیکی 6 جایگاه ژنی مورد مطالعه در جمعیتهای آفانیوس زاگرس GGM024 BL2-114 AC4(T) GATA2(F) CmD1(F) BA9(F) Na 4 11 4 19 4 14 Ne چشمه چهلگزی 12/229 2/221 6/261 6/116 19/299 1/292 Ho 1 1 9/214 1 1 1 He 9/412 9/212 9/426 9/416 9/491 9/291 Fis -9/929 -9/944 -9/199 -9/164 -9/914 -9/941 Na 19 11 4 4 12 14 Ne چشمه مادر و دختر 19/299 2/444 1/299 1/444 11/124 6/619 Ho 1 1 1 9/422 1 1 He 9/419 9/219 9/429 9/429 9/422 9/299 Fis -9/144 -9/922 -9/991 9/111 -9/112 -9/949 تجزیه آماری بین جایگاه دارای اندازه آللی 149 تا BL2 ،999 دارای اندازه آللی تجزیههای مربوط به ساختار ذخایر ژنتیکی شامل تعداد آلل 294 تا GATA2 ،249 دارای اندازه آللی 129 تا 929 و مشاهده شده )Na(، تعداد آلل موثر )Ne(، هتروزیگوسیتی مشاهده GGM024 دارای اندازه آللی 199 تا 149 جفت باز بودند.