وزارة التعليم العالي جامعة دمشق وزارة التعليم العالي كلية الزراعة الهيئة العامة للتقانة الحيوية قسم علوم األغذية
أمثلة إنتاج إنزيم غلوكوز إيزوميراز Glucose isomerase من عزالت محلية من بكتريا.Streptomyces spp وتحسين إنتاجه باستخدام بعض الطرائق الوراثية Optimization of Glucose isomerase production from local isolates of Streptomyces spp. and improvement of its production using some genetic methods
رسالة أُ ِع دت لنيل درجة الدكتوراه في علوم األغذية
إعــــــــداد
م . سهى عيسى حبيب
إشـــــــــــراف
أ. د. صباح يازجي د. لينه األمير
أستاذ في قسم علوم األغذية أستاذ مساعد في التقانة الحيوية
Ministry of Higher Education Ministry of Higher Education National Commision Damascus University
for Biotechnology College of Agriculture Department of Food Science
Optimization of Glucose isomerase production from local isolates of Streptomyces spp. and improvement its production using some genetic methods
A THESIS
Submitted in partial fulfillment of the requirements for the Ph. D. degree Of Food Science Section
Prepared by
Suha Issa Habeeb (National Commission for Biotechnology)
Supervision
Supervisor Co-Supervisor Dr. Sabah Yazajy Dr. Lina Al-Amir
Prof. Of Food Science Assistant Researcher Faculty of Agriculture National Commission for Damascus University Biotechnology
المحتويات
الموضوع رقم الصفحة
1- المقدمة ...... 1
1-1- أهداف البحث ...... 2
2 - الدراسة المرجعية ...... 4
2 -1- كيمياء اإلنزيمات ...... 4
2-2- لمحة تاريخية عن اإلنزيم ...... 7
2-3- تسمية اإلنزيمات ...... 9
2-4- المماكبة الكيميائية واالنزيمية ...... 11
2-5- طبيعة إنزيم GI وتركيبه ...... 12
2-6- آلية عمل إنزيم GI ...... 14
2-7- مصادر إنزيم GI ...... 16
2-8- إنتاج GI باستخدام الجنس Streptomyces ...... 19 2-8-1- مجموعة األكتينومايسيتات ...... 19
2-8-1-1- جنس Streptomyces...... 20
2-8-1-1-1- موطن Streptomyces...... 21
2-8-1-1-2- دورة حياة Streptomyces...... 22
2-9- العزل ...... 23
2-10- الغربلة ...... 24
2-10-1- الغربلة األولية ...... 25
2- 10-2- الغربلة الثانوية ...... 25
2-11- التشخيص ...... 25
2-12- استخالص اإلنزيم ...... 26
2-13- تقدير الفعالية اإلنزيمية
28......
2-13-1- طريقة (Dische and Borenfreund (1951 ...... 28
2-13-2- طريقة (Kulka (1956 ...... 29
2-13-3- طريقة الفحص المناعي اإلنزيمي )ELISA( ...... 29 2-14- العوامل المؤثرة في إنتاج إنزيم GI ...... 30
2-14-1- تأثير درجة الحرارة ...... 30
2-14-1-1- الحرارة المثلى لنشاط اإلنزيم...... 30
2-14-1-2- درجة حرارة حفظ اإلنزيم...... 30
2-14-1-3- درجة حرارة إنتاج اإلنزيم...... 31
2-14-2- تأثير الرقم الهيدروجيني االبتدائي ...... 31
2-14-3- تأثير زمن التخمير)مدة التحضين( ...... 32
2-14-4- تأثير نسبة الزيلوز ...... ……………….…………..………33
2-14-5- تأثير األمالح والعناصر المعدنية ...... 35
2-15- تحسين إنتاجية اإلنزيمات باستخدام التطفير للكائنات الدقيقة ...... 36
2-16- فصل وتنقية األنزيم ...... 38
2-17- الصفات الحركية لعمل إنزيم GI...... 42
2-17-1- تأثير درجة الحرارة في فعالية اإلنزيم...... 42
2-17-2- تأثير درجة الحرارة في ثباتية اإلنزيم...... 42
2-17-3- تأثير الرقم الهيدروجيني في فعالية اإلنزيم...... 44
2-17-4- تأثير الرقم الهيدروجيني في ثباتية اإلنزيم...... 44 2-18- األهمية التطبيقية إلنزيم GI...... 45
3 - مواد البحث وطرائقه ...... 49
3-1- األجهزة والمواد المستخدمة في الدراسة ...... 49
3-1-1- األجهزة...... 49
3-1-2- المواد الكيميائية المستخدمة ...... 50
3-1- 3- األوساط الزرعية ...... 50
3-1-3-1- وسط العزل (Gauza) ...... 50
3-1-3-2 وسط األساس الصلب )وسط إنتاج اإلنزيم(...... 51
3-1-3-3- وسط اإلنتاج السائل...... 52
3-1-4- أقراص المضادات الحيوية...... 52
3-1-5- البروتينات القياسية...... 53
3-2- طرائق العمل...... 53
3-2-1 جمع العينات...... 53
3-2-2- عزل بكتريا Streptomyces...... 54
3-2-3- تصنيف بكتريا Streptomyces...... 54
3-2-3-1 دراسة بعض الخواص المزرعية والبيوكيميائية للمستعمرات الناتجة...... 54 3-2-3-2 اختبار حساسية البكتريا للمضادات الحيوية...... 55
3-2-4- انتخاب السالالت المنتجة ألنزيم غلوكوز إيزوميراز...... 55
3-2-4-1- الغربلة األولية...... 55
3-2-4-2- الغربلة
الثانوية...... 56
3-2-5- تحديد الطريقة المثلى لتحطيم الخاليا واستخالص إنزيم GI...... 56
3-2-6- تقدير الفعالية اإلنزيمية لـ GI...... 57
3-2-6-1- المنحنى القياسي لمحلول الفركتوز...... 58
3-2-7- التطفير باألشعة فوق البنفسجية...... 59
3-2-8- أمثلة ظروف إنتاج أنزيم GI...... 60
3-2-9- دراسة بعض الصفات الحركية ألنزيم GI الخام المفرز من بكتريا
62...... Streptomyces roseiscleroticus
3-2-9-1- تأثير درجة الحرارة ...... 63
3-2-9-2- االستقرارية الحرارية...... 63
3-2-9-3- تأثير الرقم الهيدروجيني...... 63
3-2-9-4- االستقرارية الحمضية...... 65
3-2-9-5- تأثير تركيز الركيزة على فعالية اإلنزيم...... 65 3-2-9-6- تأثير بعض الشوارد المعدنية...... 66
3-2-10- تنقية إنزيم غلوكوز إيزوميراز...... 66
3-2-10-1- الحصول على المستخلص الخام لألنزيم...... 66
3-2-10-2- مراحل تنقية GI ...... 67
3-2-10-2-1- الترسيب بأمالح كبريتات األمونيوم...... 67
3-2-10-2-2- التنقية باستخدام أعمدة الكروماتوغرافيا...... 68
3-2-10-2-2-1- عمود الـ Sephadex G-100...... 68
3-2-10-2-2-2- عمود الـ Sephacryl S-200 SF...... 69
3-2-11 - تقدير البروتين...... 70
3-2-11-1- المواد والمحاليل المستخدمة...... 70
3-2-11-2- تحضير المنحنى القياسي لتقدير تركيز البروتين...... 71
3-2-11-3- تقدير تركيز البروتين في المستخلص اإلنزيمي...... 71
3-2-12- طريقة الرحالن الكهربائي للبروتين باستخدام طريقة SDS-PAGE
72...... (Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)
3-2-12-1- المواد والمحاليل المستخدمة...... 73
3-2-12-2- طريقة الرحالن الكهربائي إلنزيم GI باستخدام SDS-PAGE...... 74
3-2-13- التطبيقات العملية لـ GI...... 77
3-2-13-1- طريقة كروماتوكرافيا الطبقة الرقيقة TLC ...... 77
3-2-14- التحليل اإلحصائي...... 78
4- النتائج و المناقشة ...... 79
4-1- العزل ...... 79
4-2- تصنيف بكتريا ستربتوميسيس ...... 79
4-2-1- الوصف المورفولوجي لبكتريا ستربتوميسيس ...... 79
4-2-2- مقاومة العزالت للمضادات الحيوية ...... 82
4-2-3- قابلية تمثيل السكريات من قبل عزالت Streptomyces المعزولة
محليا ...... 84
4-3- غربلة عزالت Streptomyces إلنتاج إنزيم GI ...... 89
4-3-1- الغربلة األولية ...... 89
4-3-2- الغربلة الثانوية
90......
4-3-2-1- المنحني القياسي للفركتوز
90......
4-3-2-1- قياس فعالية إنزيم GI...... 91 4-4- تحديد الطريقة المثلى الستخالص اإلنزيم ...... 93
4-5- تطفير بكتريا S. roseiscleroticus باستخدام األشعة فوق البنفسجية ...... 94
4-6- دراسة الظروف المثلى إلنتاج إنزيم GI باستخدام التصميم االحصائي
99...... RSM
4-6-1- تحليل التجربة ...... 101
4-6-2- تعيين الظروف المثلى إلنتاج اإلنزيم ...... 104
4-6-2-1- تأثير سكر الزيلوز في إنتاج GI
104......
4-6-2-2- تأثير درجة الحرارة في إنتاج GI
105......
4-6-2-3- تأثير رقم الحموضة pH في إنتاج GI ...... 106
4-6-2-4- تأثير مدة التحضين في إنتاج GI ...... 107
4-6-2-5- تأثير األيونات المعدنية في إنتاج GI ...... 107
4-7- دراسة بعض صفات إنزيم GI المنتج من بكتريا
108...... S. roseiscleroticus-Mt4
4-7-1- درجة الحرارة المثلى لفعالية اإلنزيم ...... 108
4-7-2- تحديد مجال الثبات الحراري لفعالية اإلنزيم ...... ,,,,,...... 110 4-7-3- الرقم الهيدروجيني األمثل لفعالية اإلنزيم ...... 112
4-7-4- تحديد مجال الثباتية الحمضية لفعالية اإلنزيم ...... 113
4-7-5- تأثير تركيز الركيزة على فعالية اإلنزيم ...... 115
4-7-6- تأثير بعض الشوارد المعدنية على فعالية اإلنزيم ...... 116
4-8- التنقية الجزئية إلنزيم غلوكوز إيزوميراز ...... 117
4-9- تعيين الوزن الجزيئي لبروتين GI باستخدام SDS-PAGE...... 122
4-10- التطبيقات العملية لالنزيم...... 124
5- االستنتاجات ...... 127
6- التوصيات ...... 129
المراجع ...... 130
قائمة الجداول:
رقم رقم الجدول العنـــــــــــــــــــــــــــــــــــــــوان الصفحة األوزان الجزيئية إلنزيم غلوكوز إيزوميراز المنتج من بعض أنواع بكتريا 14 1 Streptomyces 2 بعض البكتريا المنتجة إلنزيم غلوكوز أيزوميراز 17 3 اإلنتاج التجاري إلنزيم غلوكوز إيزوميراز 19 4 األجهزة المستخدمة في البحث 49 5 أقراص المضادات الحيوية المستخدمة 52 6 مصدر وعدد عينات التربة المأخوذة من كل منطقة 54 7 تراكيز محلول الفركتوز القياسي 58 8 المتغيرات المدروسة ومستوياتها باستخدام البرنامج اإلحصائي Minitab 61 9 التصميم اإلحصائي للتجارب 61 تحضير موقي الخالت في درجات الحموضة pH من 3-5 ونسب المحاليل 64 10 المستخدمة تحضير موقي فوسفات الصوديوم في درجات الحموضة pH من 8-6 64 11 ونسب المحاليل المستخدمة تحضير موقي الغاليسين في درجات الحموضة pH من 9-11 ونسب 65 12 المحاليل المستخدمة 13 عدد غرامات ملح كبريتات األمونيوم المضافة إلى ليتر من المحلول 68 14 تراكيز محلول BSA القياسي 71 15 مكونات هالمة الفصل وهالمة الرص واألحجام المستخدمة 75 البروتينات القياسية المستخدمة لتقدير الوزن الجزيئي للـ GI بطريقة -SDS 76 16 PAGE 17 مقاومة عزالت بكتريا Streptomyces للمضادات الحيوية 82 18 قابلية عزالت Streptomyces على استخدام وتمثيل السكريات 85 19 تشخيص عزالت بكتريا Streptomyces على مستوى النوع 87 كثافة نمو عزالت بكتريا Streptomyces المنتجة إلنزيم غلوكوز 89 20 إيزوميراز 21 الفعالية اإلنزيمية لعزالت Streptomyces مقدرة بالوحدة/مل 92 معدل البقاء لبكتريا S.roseiscleroticus بعد تعرضها لألشعة فوق 95 22 البنفسجية الفعالية اإلنزيمية لطفرات العزلة S. roseiscleroticus D3 عند أزمنة 98 23 مختلفة للتشعيع بـ UV فعالية إنزيم غلوكوز إيزوميراز المنتج من بكتريا -S. roseiscleroticus 100 24 Mt4 بعد تعريضه لعدة متغيرات التحليل اإلحصائي لتأثير االمتغيرت المدروسة في فعالية إنزيم غلوكوز 102 25 إيزوميراز
26 التحليل اإلحصائي للتباين للمتغيرات المدروسة التي تؤثر في فعالية إنزيم 103 GI 27 مراحل التنقية المختلفة إلنزيم GI المنتج من S.roseiscleroticus-Mt4 121
قائمة األشكال
رقم رقم الشكل العنوان الصفحة 1 تحويل الغلوكوز إلى الفركتوز في السكريات المفسفرة 8 2 التفاعل اإلنزيمي لتحويل الغلوكوز إلى الفركتوز 8 3 تحول سكر األلدوز إلى الكيتوز 11 11 4 تحّول مجموعة الفوسفات من وضعية إلى وضعية أخرى 5 المركز الفعال في اإلنزيم ومشاركة األيونات المعدنية في عملية التحويل 15 آلية إزاحة الهيدروجين لتحويل المركبات من شكل األلدوز إلى شكل الكيتوز 15 6 وبالعكس بوساطة إنزيم غلوكوز أيزوميريز. 7 مراحل دورة حياة بكتريا Streptomyces 23 8 مستعمرات بكتريا Streptomyces على وسط Gauza agar 80 9 أشكال المشيجة الهوائية وانتاج الصبغات في بكتريا Streptomyces 81 10 شكل السالسل في بكتريا Streptomyces عند الفحص المجهري 81
11 مقاومة بعض عزالت Streptomyces ألنواع مختلفة من المضادات الحيوية 84 91 12 المنحنى القياسي لتركيز الفركتوز باستخدام Cysteine-carbazole GI 13 مقارنة كفاءة المواد المختلفة في استخالص إنزيم المنتج من بكتريا 94 S.roseiscleroticus 14 لوغاريتم عدد المستعمرات نسبة إلى زمن التعرض لألشعة UV 96 الظروف المثلى إلنتاج إنزيم GI من S. roseiscleroticus-Mt4 104 15 بواسطة البرنامج اإلحصائي RSM 16 تأثير درجة الحرارة على فعالية إنزيم غلوكوز إيزوميراز 109 17 تأثير درجة الحرارة على ثبات فعالية إنزيم غلوكوز إيزوميراز 110 18 تأثير الرقم الهيدروجيني على فعالية إنزيم غلوكوز إيزوميراز 112 19 تأثير الرقم الهيدروجيني على ثبات فعالية إنزيم غلوكوز إيزوميراز 114 20 تأثير تركيز الركيزة )الغلوكوز( على فعالية إنزيم غلوكوز إيزوميراز 115 21 تأثير الشوارد المعدنية على فعالية إنزيم غلوكوز إيزوميراز 116 22 المنحني القياسي للبروتين باستخدام ألبومين المصل البقري (BSA) 117 23 نتائج التنقية باستخدام هالمة Sephadex G-100 119 24 نتائج التنقية باستخدام هالمة Sephacryl S-200 120 25 نتائج الرحالن الكهربائي لألجزاء الناتجة عن مراحل التنقية 122 المنحني القياسي الناتج عن الرحالن الكهربائي للبروتينات المعروفة الوزن 123 26 على هالمة SDS-PAGE 27 كروماتوكرافيا الطبقة الرقيقة TLC لتحول الغلوكوز إلى الفركتوز 125
قائمة االختصارات الواردة:
GI Glucose isomerase HFCS High Fructose Corn Syrup CTAB cetyltrimethyl ammonium bromide U Unit S. roseiscleroticus Streptomyces roseiscleroticus nm Nano meter RSM Response Surface Methodology SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis NTG N-methyl-N-nitrose-N-Nitro- guanidine N Molar TCA acid Tricarboxylic TEMED N,N,N,N-tetra mmethyl ethylene diaine DMSO Dimethyl sulfoxide Thin Layer Chromatography TLC Ultra Violet UV APS Ammonium persulphate BP Base pairs Rf Relative mobility BSA Bovine serum albumin الملخص
جمعت 32 عينة تربة من مناطق مختلفة من القطر العربي السوري خالل عامي 2010 و
2011, عزل منها 40 عزلة بكتريا تابعة للجنس Streptomyces, منها 8 عزالت من تربة
مدينة دمشق, 5 من مدينة حماة, 5 من مدينة حمص, 6 من تدمر, 5 من دير الزور, 4 من
الالذقية, 3 من درعا, 4 من السويداء. شخصت العزالت مورفولوجيا وفيزيولوجيا تبعا للط ارئق
المتبعة في المشروع الدولي للستربتوميسيس International Streptomyces ISP)
(Project, وبين التشخيص أن العزالت تنتمي إلى تسعة وعشرين نوعا مختلفا من بكتريا جنس
ستربتومايسيس .
غربلت العزالت لتقييم مقدرتها على إنتاج إنزيم غلوكوز إيزوميراز باستخدام أوساط انتقائية
صلبة باالعتماد على كثافة النمو كمؤشر على استهالك سكر الزيلوز كمصدر للكربون ومن ثم
أوساط سائلة الختبار الفعالية اإلنزيمية. استخلص اإلنزيم بتحطيم الخاليا باستخدام الـ CTAB
بتركيز %0.1 , من ثم قدرت فعاليته باستعمال الغلوكوز كمادة أساس )ركيزة( و قيس الناتج بطريقة لونية باستخدام المطياف الضوئي عند طول موجة 560 نانومتر, وكان أفضل إنتاج
لإلنزيم من قبل العزلة D3 والمصنفة ضمن النوع S. roseiscleroticus حيث بلغت الفعالية
اإلنزيمية لها 5.2 وحدة/مل.
استعملت مجموعة من المواد منها منظفات ومذيبات عضوية لتحطيم الخاليا واستخالص إنزيم
غلوكوز ايزوميريز من بكتريا S.roseiscleroticus اشتملت تلك المواد على الكلوروفورم و
Tween 80 و)SDS( و)DMSO( و )CTAB( بتركيز 0.1% لكل منها وأظهرت النتائج
تفوق CTAB حيث بلغت فعالية اإلنزيم في المستخلص 5.57 وحدة/مل
طبقت عملية التطفير على العزلة S.roseiscleroticus D3 باستخدام األشعة فوق
البنفسجية UV )254 نانو متر( على ارتفاع 10 سم من األطباق, وتم الحصول على 93
طفرة مقاومة لألشعة وتفوقت الطفرة ذات الرقم 4 في زمن تعرض لمدة 60 ثانية على باقي
الطفرات حيث بلغت الفعالية اإلنزيمية إلنزيم غلوكوز إيزوميراز المنتج منها 7.44 وحدة/مل
ورمزت هذه الطفرة بـ S. roseiscleroticus Mt4 وبالتالي تفوقت هذه الطفرة عن العزلة
األصلية بنسبة 43% في إنتاجيتها لإلنزيم.
جرت أمثلة ظروف إنتاج إنزيم غلوكوز إيزوميراز من البكتريا S. roseiscleroticus
Mt4 باستخدام البرنامج اإلحصائي )RSM), أظهرت النتائج بأن أعلى قيمة لفعالية اإلنزيم
والتي بلغت 11.42 وحدة/ مل كانت عند درجة حرارة º25س , والرقم الهيدروجيني 6, ومدة
التحضين 48 ساعة, وتركيز الزيلوز 15 غ/ل, وبوجود كل من أيونات المغنزيوم والكوبالت
بتركيز 0.05% لكل منهما. درس تأثير كل من درجة الحرارة والرقم الهيدروجيني وتركيز الركيزة )glucose( وتركيز بعض
+2 +2 +2 + 2+ +2 2+ الشوارد المعدنية ) Mg , Co , Ca , Ag , Mn , Hg , Cu) في فعالية إنزيم
غلوكوز إيزوميراز المنتج من بكتريا S. roseiscleroticus Mt4, ووجد أن الفعالية
العظمى لإلنزيم كانت عند درجة الحرارة 60 س و الرقم الهيدروجيني 7 و تركيز 8 .0 م ول
من الركيزة )الغلوكوز( وقد بقي األنزيم مستق اَر ضمن مجال درجة الحرارة 30-60س والرقم
+2 +2 +2 +2 الهيدروجيني 9-7 كما تبين أن الشوارد المعدنية ) Mg , Co , Ca , Mn( أثرت
+2 + +2 إيجابيا على نشاط إنزيم غلوكوز إيزوميراز, بينما لعبت شوارد ( Cu , Ag , Hg) دو ا ر
مثبطا له وكان أفضلها في تنشيط اإلنزيم مزيج من شوارد الكوبالت والمغنزيوم.
أجريت مراحل التنقية إلنزيم غلوكوز إيزوميـراز بـدءا مـن الترسـيب بملـح كبريتـات األمونيـوم
ثم باستخدام عم ود الكروماتوغرافيا Sephadex G-100 ثم عمود Sephacryl S-200 .
بينت نتائج التنقية ارتفاع الفعالية اإلنزيمية التي بلغت 15.1 وحدة/مل, كما بلغت
الفعالية النوعية 32.3 وحدة/ مغ وبعدد مرات تنقية بلغت 3 وبحصيلة إنزيمية مقدارها %11.6,
وباستخدام الرحالن الكهربائي هالمة SDS-PAGE أمكن حساب الوزن الجزيئي لإلنزيم
المدروس والذي بلغ 48 كيلو دالتون.
استخدم إنزيم غلوكوز إيزوميراز الخام المنتج من العزلة المحلية -S.roseiscleroticus
Mt4 في تحويل الغلوكوز إلى الفركتوز في كل من الغلوكوز النقي وشراب غلوكوز الذرة وتبين
تحول الغلوكوز إلى الفركتوز خالل 45 ساعة.
ABSTRACT Thirty two samples of soil were collected from different parts of Syria during the years 2010- 2011 and forty isolates of Streptomyces were isolated from these samples, of which 8 were from Damascus , 5 from Hama, 5 from Homs, 6 from Palmyra, 5 from Der El- Zor , 4 from Latakia, 3 from Daraa and 4 from El-Swedaa. These isolates were morphologically and physiologically identified according the methods of ISP (International Streptomyces Project). Results showed that they belonged to twenty-nine different species of Streptomyces. All isolates were screened for their ability to produce glucose isomerase using selective solid media containing xylose as a unique source of carbon and depending on growth level as an index of xylose utilization. Then liquid media were used in order to test enzyme activity, all isolates were able to produce glucose isomerase but they varied in their activity. Enzyme activity was measured using a colorimetric method and glucose as substrate, the colour was measured by spectrophotometer at 560 nm. Isolate D3 (S. roseiscleroticus) showed highest enzyme activity, 5.2 units/ml.
Chloroform, CTAB, DMSO, SDS, Tween 80 with 0.1% concentration were tested to extract the intra-cellular glucose isomerase, CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide) was found to liberate the enzyme with a higher activity of 5.57 U/ml. The wild strain D3 of S. roseiscleroticus was subjected to mutagenesis using UV irradiation at a wave length of 254 nm and a distance of 10 cm above the plates. And 93 mutants were obtained. S. roseiscleroticus mutant was coded Mt4 it showed highest enzymatic activity of 7.44 U/ml after an irradiation period of 60 seconds, a 43% increase of activity compared to the original isolate D3. Some factors affecting glucose isomerase production by S. roseiscleroticus Mt4 were optimized using the statistic program Response Surface Methodology (RSM). Results revealed that the highest enzymatic activity reached 11.42 U/ml when broth medium contained 15 g/l of xylose and an initial pH of 6 during an incubation period of 48 hours at 25°C with the addition of 0.05% of each one of magnesium sulfate and cobalt chloride as metal ion sources. Furthermore, the effects temperature, pH, substrate (glucose) concentration , and of some metal ions ( Mg, Cu, Mn, Co, Ca, Ag, Hg) on glucose isomerase activity produced by S. roseiscleroticus Mt4 were studied. Maximum enzyme activity was found at a temperature value of 60°C, pH 7 and 0.8 mol of glucose as a substrate. The enzyme remained stable at a temperature range of 30-60°C and pH 7-9, and it was activated by (Mg+2, Ca+2, Mn+2, Co+2) while the other ions (Cu+2, Ag+, Hg+2) played an inhibiting role. Best enzyme ionic activator was a mixture of 0.05% of both Mg+2 and Co+2. Purification steps of enzyme started by precipitation with ammonium sulfate, then separation by column chromatography using Sephadex G-100 and Sephacryl S-200 gels. The separated enzymatic protein had an enzyme activity of 15.1 U/ml and specific activity of 32.3 U/ml. protein purification was 3 fold with a yield of 11.6%, it's molecular weight was 48 kDa determined using SDS PAGE. Results of thin layer chromatography (TLC) showed that the optimum time for the conversion of 20% of pure glucose and corn glucose syrup into fructose using glucose isomerase produced by S. roseiscleroticus Mt4 was 45 hrs. 1- المقدمة:
نالت قدرة األحياء الدقيقة على إنتاج مواد ذات أهمية تطبيقية كاألنزيمات والمضادات الحيوية
وغيرها من المركبات اهتمام العديد من الباحثين لعزل واكتشاف سالالت مختلفة من هذه األحياء
ذات الكفاءة العالية في إنتاج األنزيمات واستخدامها في العديد من المجاالت.
شهدت العقود األخيرة من القرن الماضي ا تطور كبي ا ر في إنتاج األنزيمات، وخاصة ذات المصادر
الميكروبية، وبرغم محدودية األحياء الدقيقة المستخدمة في اإلنتاج الصناعي لألنزيمات إال أن
التوجه يزداد يوما بعد آخر في استغالل التطورات الهائلة في مجاالت التقانات الحيوية إلنتاج
أنزيمات بمواصفات وكميات تلبي احتياجات األسواق العالمية منها، واإلنزيمات هي عوامل محفزة
ذات طبيعة بروتينية، ، وهي مسؤولة عن عدد من التحوالت الكيميائية الضرورية الستمرارية
الحياة، حيث تمتلك دو ا ر هاما في كافة مجاالت الحياة فهي تستخدم في صناعة العصائر
والمعجنات واألدوية والمنظفات.
يتبع إنزيم غلوكوز إيزوميراز )GI( إلى إنزيمات التماكب، ويأتي في المرتبة الثالثة من حيث
األهمية الصناعية والتطبيقية والطبية، بعد إنزيمي األميالز والبروتياز، فهو يحفز المماكبة
العكسية من D- غلوكوز إلى D- فركتوز وكذلك من D- زيلوز )سكر الخشب( إلىD-
زيلولوز. يتمتع أنزيم غلوكوز إيزوميراز )GI( ذو المصدر الميكروبي بأهمية قصوى بسبب
المجاالت التطبيقية الواسعة له، و اكتسب اكتشاف هذا اإلنزيم أهمية من الناحية الصناعية
والتجارية لما يتميز به الفركتوز من خصائص فيزيائية، ووظيفية، والتي جعلته يؤدي دو ا ر مهما
في التطبيقات الصناعية حيث استعمل شراب الذرة الغني بالفركتوز(High Fructose (HFCS
1
Corn Syrup كبديل طبيعي للسكروز في العديد من الصناعات الغذائية كصناعة المشروبات
الغازية والمعجنات واألغذية المصنعة واألدوية.
تمتاز األحياء الدقيقة مقارنة بالكائنات األخرى كالحيوانية والنباتية بقدرتها على إنتاج األنزيمات
وبسرعة النمو والتكاثر، ورخص المواد األولية لتنميتها، فضال عن إمكانية تحسين إنتاج هذه
األنزيمات من خالل التحكم بالظروف المزرعية للوصول إلى الظر وف البيئية والتغذوية المثلى
لإلنتاج ، وكذلك تتفوق األحياء الدقيقة بإنتاجها أنواعا كثيرة ومختلفة من األنزيمات مقارنة بتلك
التي يمكن الحصول عليها من المصادر الحيوانية والنباتية و ينتج إنزيم غلوكوز إيزوميراز من
قبل أنواع مختلفة من األحياء الدقيقة كالبكتريا والخمائر والفطريات، وتعد البكتريا المصدر
الرئيسي إلنتاج اإلنزيم والسيما البكتريا الخيطية منها األكتينوميسيتات التي تعد ا مصدر غنيا في
إنتاج المضادات الحيوية واإلنزيمات الصناعية.
إضافة إلى ذلك فإنه يمكن تحسين صفات األنزيمات المنتجة من األحياء الدقيقة كما ونوعا من
خالل استخدام التطفير العشوائي (Random mutagenesis) لزيادة إنتاج هذه األنزيمات
والتغلب على الظروف البيئية الحادة أثناء عملها.
1-1- أهداف البحث:
ونظ ا ر لألهمية التطبيقية والتجارية والصناعية إلنزيم غلوكوز إيزومي ارز فقد اتجهت الدراسة
الحالية نحو تحقيق األهداف التالية:
1. انتخاب عزالت لجنس Streptomyces معزولة من تربة محلية وغربلتها اعتمادا على
قدرتها على إنتاج اإلنزيم.
2
2. التحسين الوراثي لبكتيريا Streptomyces بهدف زيادة إنتاج إنزيم غلوكوز إيزوميراز
بواسطة التطفير الوراثي العشوائي باستخدام األشعة فوق البنفسجية (UV).
3. أمثلة ظروف النمو إلنتاج اإلنزيم )درجة الحرارة – درجة الحموضة- مدة التحضين– ونسبة
الزايلوز على إنتاج اإلنزيم – واأليونات المعدنية( باستخدام التصميم اإلحصائي RSM
.)Response Surface Methodology)
4. إجراء عملية تنقية جزئية إلنزيم غلوكوز إيزوميريز.
5. استعمال اإلنزيم المنتج في بعض التطبيقات الصناعية لتحويل الغلوكوز إلى الفركتوز
للوقوف على كفاءة هذا اإلنزيم.
3
2- الدراسة المرجعية:
1-2- كيمياء اإلنزيمات:
تعد البروتينات مركبات عضوية معقدة تتكون من عدد من األحماض األمينية المرتبطة بروابط
ببتيدية وت تواجد في جميع الكائنات الحية الحيوانية والنباتية واألحياء الدقيقة، ويعود التنوع في
البروتينات إلى االحتماالت الكبيرة التي تنتج عن االختالف في تسلسل األحماض األمينية
وعددها وأنواعها، تعتبر البروتينات ذات أهمية كبيرة لكونها تدخل في تركيب المادة الحية كما
تلعب دو ا ر هاما في الميدان الصناعي و الطبي )Genton et al., 2010(.
أثبتت الطبيعة البروتينية لإلنزيمات في نهاية الربع األول من القرن العشرين، ودخلت حيز
االستخدام التجاري و الصناعي. عرفت أهمية اإلنزيمات منذ آالف السنين، حيث استخدمها
اإلنسان قديما على هيئة أنسجة نباتية أو حيوانية غنية باإلنزيمات، أو على هيئة أحياء دقيقة في
صناعة الخبز، الخل، النبيذ، منتجات الحليب، وغيرها، يعتبر تخمر السكر إلى كحول باستخدام
الخميرة من أقدم األمثلة على الصناعات الحيوية، إال أنه لم يتم فهم آلية عمل اإلنزيمات حتى
القرن التاسع عشر، وذلك لعدم إمكانية تحضير إنزيمات بصورة نقية لدراسة صفاتها وآلية عملها.
ساهم التقدم العلمي في عدة مجاالت في تحديد التركيب الكيميائي لألنزيمات وبنيتها وصفاتها
الحركية واستخداماتها التطبيقية، وأطلق عليها مصطلح أنزيم، الذي يعني باللغة اإلغريقية" داخل
الخميرة "من قبل العالم Kuhne عام 1876، حيث كانت الخميرة هي المادة الرئيسية لألبحاث
آنذاك ألهميتها في صناعات التخمر. تمت أول عملية عزل لألنزيمات عام 1833 من قبل
العالمان الفرنسيان Payen وPersoz حيث تمكنا من عزل مركبا أنزيميا من المالت )الشعير
المنبت( استطاع تفكيك جزيئة النشاء ثم توالت الدارسات التي قادت إلى ظهور مدرستين
4
مختلفتين األولى يقودها عالم األحياء الدقيقة Pasteur ، والثانية يقودها الكيميائي Liebig،
تدعم المدرسة األولى النظرية الحيوية لألنزيمات التي مفادها ضرورة وجود الخميرة الحية في
الوسط لكي يحدث التخمر أما الثانية فتبنت النظرية غير الحياتية التي تفيد بعدم ضرورة وجود
الكائن الحي، ولم يتم حسم النقاش إال عندما أثبت العالم Buchner عام 1897 أن مستخلص
الخميرة بدون خاليا قادر على تحويل الغلوكوز إلى إيتانول وثاني أكسيد الكربون تماما كما تفعل
الخميرة الحية، وهذا يعني أن عملية التخمر تجري بوجود مادة غير حية داخل الخلية، وليست
بسبب الخلية الحية نفسها، سميت هذه المادة باإلنزيم. (Purves et al., 2004)
تمتلك جميع المحفزات الحيوية الكيميائية طبيعة بروتينية إال أنها ليست جميعها أنزيمات (Raymond et al., 2006)
تم التعرف على الطبيعة البروتينية لألنزيمات في بداية عام 1800م، حيث كشفت البنية الببتيدية
للبروتين، والتي يعود الفضل فيها إلى Fischer and Hofmeister. لم تكن التقنيات تسمح في
الحصول على األنزيمات بشكل نقي، كما أنه لم يكن هناك إجماع على أن اإلنزيمات هي
بروتينات حتى عام 1926 م عندما عمل Sumner على بلورة أنزيم اليورياز، وفي عام 1930
م عزل Northrop وآخرون أنزيم الببسين حيث أثبتت الطبيعة البروتينية لألنزيمات . تم التعرف
على أغلب الحموض األمينية في بداية القرن العشرين بعد أن توفرت تقنيات وط رائق حديثة
لتحليل الحموض األمينية، حيث حقق Stein و Moor قفزة كبيرة عندما تمكنا من فصل
األحماض األمينية باستخدام كروماتوغرافيا التبادل الشاردي، كما تم تحديد تسلسل الحموض
األمينية لألنسولين من قبل Sanger و Tuppy في عام 1950 م.
يطلق على المعقد األنزيمي باألنزيم الكلي Holoenzyme عندما يتكون من جزء بروتيني
Apoenzyme وجزئية عضوية منخفضة الوزن الجزيئي هي المساعد األنزيمي Coenzyme أو
5
المجموعة الملحقة Prosthetic group :
(Berg et al., 2007)
تعد اإلنزيمات من أهم العوامل البيولوجية المساعدة في الصناعات الكيميائية، والغذائية بسبب
تخصصها وكفاءتها العالية، وهي عموما من العوامل المحفزة، وذات طبيعة بروتينية وتكون
مسؤولة عن عدد من التحوالت الكيميائية الضرورية إلدامة الحياة، وعادة ما يقوم كل إنزيم
بتحفيز خطوة محددة من خطوات المسارات االستقالبية في الكائنات الحية Bruice and)
.Benkovic, 2000)
لإلنزيمات تطبيقات صناعية عديدة، كاستخدام إنزيمات األميالز في صناعة النبيذ والخبز
والنسيج (Pandey, 2004)، كما استخدمت إنزيمات البروتياز في التخمر وتطرية اللحوم وفي
صناعة المنظفات الصناعية (Godfrey, 1996) واستخدمت إنزيمات الرينين في صناعة
الجبن.(Shieh et al., 2009)
ونظ ا ر إلمكانية إنزيم غلوكوز إيزوميريز من تحويل الزيلوز الذي يعد المكون الرئيسي في أشباه
السليلوزات إلى ال زيلولوز ومن ثم تحويل األخير إلى الكحول اإلثيلي باستعمال بعض الخمائر
مثل Saccharomyces cerevisia أو Candida tropicali أو
Snehalata et al., 2005( Schizosaccharomyces pombe ؛ Walfridsson et al.,1996( ، فقد استعمل إنزيم غلوكوز إيزوميريز في استغالل بعض المخلفات الزراعية
المتمثلة بالكتلة الحيوية النباتية إلنتاج الكحول اإلثيلي الذي يعد وقودا بديال عن الوقود المستخرج
من باطن األرض. (Van Maris et al., 2006 ; Mohammadi et al., 2011)(.
6
كما جرت محاوالت نقل الجين المشفر إلنتاج إنزيم غلوكوز أيزوميريز من بكتريا Thermus thermophilus إلى الخميرة Sacchromyces cerevisiae لغرض الحصول على ساللة
هجينة من الخميرة والبكتريا لها القدرة على إنتاج إنزيم غلوكوز أيزوميريز لتحويل الزيلوز إلى
زيلولوز مباشرة وتخمير األخير إلنتاج اإليثانول (Van Vleet and Jeffries, 2009(.
2-2- لمحة تاريخية عن األنزيم:
يعود تاريخ إنتاج إنزيم غلوكوز أيزوميراز GI أول مرة إلى عام 1957 من قبل Marshall و
Kooi من بكتريا Pseudomonas hydrophila، كانت هذه نقطة االنطالق الستغالل هذا
اإلنزيم لصناعة شراب الذرة على أنه بديال لقصب السكر )Marshall and Kooi, 1957(.
يقوم إنزيم غلوكوز أيزوميريز بتحويل الغلوكوز إلى الفركتوز بعملية تدعى المماكبة
Isomerization. كما يقوم اإلنزيم بتحويل الزيلوز الذي يعد المكون الرئيسي في أشباه
السليلوزات إلى الزايلولوز ومن ثم تحويل األخير إلى الكحول اإلثيلي.
عرفت تفاعالت التحويل اإلنزيمية للسكريات األلدهيدية إلى السكريات الكيتونية منذ أكثر من
نصف قرن، وتشير الدراسات إلى وجود أربعة أنواع مختلفة من اإلنزيمات التي يطلق عليها
مصطلح غلوكوز أيزوميريز عزلت من الكائنات الحية ولها القابلية على تحفيز تفاعالت تحول
الغلوكوز إلى الفركتوز) Bhosale et al., 1996) .
يعد إنزيم فوسفوغلوكوز أيزوميريزPhosphoglucose isomerase الموجود في جميع الكائنات
الحية الراقية النوع األول منها ) الشكل 1( وقد ذكر ألول مرة من قبل Lohmann في عام
1933 ويعمل هذا اإلنزيم على السكريات المفسفرة فقط بوجود الزرنيخ إذ يحفز التفاعل اآلتي:
Glucose -6- phosphate Fructose-6- phosphate
7
الشكل )1( تحويل الغلوكوز إلى الفركتوز في السكريات المفسفرة
إال أن هذا اإلنزيم ال يستعمل على نطاق تجاري.
أما النوع الثاني فهو ذلك الذي يعمل على السكريات الحرة غير المفسفرة وتكون مصادره
ميكروبية فقط ومنها اإلنزيم الذي يسمى د- غلوكوز أيزوميريز D-glucose isomerase
والذي درس أول مرة في بكتريا Pseudomonas hydrophila من قبل Marshall و Kooi
(1957) ويحول هذا اإلنزيم األلدوزات غير المفسفرة إلى الكيتوزات. حيث له القدرة على تحويل
الغلوكوز والزيلوز إلى الفركتوز والزايلولوز على التوالي دون الحاجة إلى +NAD أو ATP
عامال مساعدا )الشكل 2(.
الشكل )2( التفاعل اإلنزيمي لتحويل الغلوكوز إلى الفركتوز
8
أما النوع الثالث فهو يقوم بتحويل الغلوكوز فقط إلى الفركتوز بوجود +NAD عامال مساعدا وقد
استطاع Takasaki و Tanabe (1962) من عزله من بكترياBacillus megateriumA1.
وتمكن Takasaki وTanabe (1966) أيضا من عزل نوع آخر من هذه اإلنزيمات من
بكتريا Paracolobacterium aerogenoides والذي يتميز بتحويله كل من الغلوكوز
والمانوز إلى الفركتوز بوجود +NAD عامال مساعدا .
تأتي األهمية التطبيقية إلنزيم غلوكوز أيزوميريز كونه ال يحتاج العوامل المساعدة فقد توالت
األبحاث والدراسات على إنتاجه من الكائنات الدقيقة منذ منتصف القرن الماضي حتى يومنا هذا.
3-2- تسمية اإل نزيمات:
ازدادت أعداد األنزيمات المكتشفة بشكل كبير بعد عام1950 م، وأعطيت أسماء مختلفة لكل
إنزيم تمت دراسته من قبل باحثين مختلفين. لم تكن تشير إلى طبيعة التفاعل الذي يقوم اإلنزيم
بتحفيزه، وكان من الضروري إيجاد نظام موحد لتسمية األنزيمات، لهذا عمل اإلتحاد العالمي
لألنزيمات (International Commission on Enzymes) منذ عام 1961 م وتحت رعاية
االتحاد العالمي للكيميائين الحيويين IUB) International Union of Biochemistry)
على تحديد أسس تصنيف وتسمية األنزيمات، وتعريف وحدة الفعالية لكل منها وطرائق تقدير
فعاليتها، تسمى األنزيمات عادة حسب التفاعل الذي تحفزه، وتضاف الالحقة ase إلى نهاية اسم
الركيزة او إلى نوع التفاعل الذي يتم تحفيزه تستثنى بعض األنزيمات التي اكتشفت قديما من هذه
القاعدة مثل إنزيمات الببسين والتربسين والرينين (Dunaway, 2008 (.
سمي إنزيم غلوكوز أيزوميراز في بادئ األمر بإنزيم D-xylose isomerase وذلك لكون
الزايلوز يعد مادة حاثة Inducer إلنتاجه. ) Bhosale et al., 1996) ، وبعد معرفة قابلية
اإلنزيم على تحويل الغلوكوز والزيلوز كركائز لتحويلها إلى الفركتوز والزايلولوز على التوالي فقد 9
أطلق عليه اسم دي-غلوكوز أيزوميريز D-glucose isomerase اتمييز عن إنزيم دي-زايلوز
أيزوميريز D-xylose isomerase الحقيقي الذي يعمل على الزايلوز فقط.
وأطلقت لجنة اإلنزيمات التابعة لالتحاد العالمي للكيميائيين الحيويين تسمية دي-زايلوز كيتول
أيزوميريز لإلنزيم (D-xylose Ketolisomerase (EC 5.3.1.5 غير أن االسم الشائع له
والمتداول في معظم المراجع العلمية هو غلوكوز أيزوميريز (Glucose isomerase (GI
.(Bhosale et al., 1996)
وقد صنفت األنزيمات حسب آلية عملها إلى ست مجموعات رئيسية:
أنزيمات األكسدة واإلرجاع Oxidoreductases : تحفز تفاعالت األكسدة واإلرجاع، حيث
يتم من خاللها انتقال االلكترونات، ومن األمثلة عليها إنزيم Oxidases .
أنزيمات النقل Transferases : تحفز هذه األنزيمات نقل مجموعات وظيفية محددة من مادة
إلى أخرى و االسم الشائع لهذه اإلنزيمات Grouptransferase.
أنزيمات الحلمهة Hydrolases : تحفز هذه األنزيمات حلمهة روابط مختلفة مثل C-N ،C-C
،C-O وبعض الروابط األخرى .يتم من خالل هذه األنزيمات إما إضافة ماء أو نزع الماء.
أنزيمات التفكيك Lyases : تحفز هذه األنزيمات فك روابط مختلفة مثل C C-،C-O ،C-N
وروابط أخرى بطرق أخرى غير الحلمهة واألكسدة .يتم من خالل هذه اإلنزيمات تفكيك أو تشكل
روابط C=C.
إنزيمات التماكب isomerases : تحفز هذه األنزيمات تغيير بنية المادة ضمن الجزيئة الواحدة،
وتسمى هذه األنزيمات حسب نوع التماكب isomerase ، racemase من هذه المجموعة:
األلدوز كيتوز إيزومي ارز : الذي يحفّز تحّول سكر األلدوز إلى سكر الكيتوز
10
الشكل )3( تحول سكر األلدوز إلى الكيتوز
الميوتاز: يحفّز تحّول مجموعة الفوسفات من وضعية إلى وضعية أخرى داخل نفس الجزيء،
ويقع إنزيم غلوكوز إيزوميراز ضمن هذه المجموعة.
الشكل )4( تحّول مجموعة الفوسفات من وضعية إلى وضعية أخرى
أنزيمات الربط ligases: تحفز إنزيمات الربط وصل جزيئتين مع بعضهما بروابط تساهمية
(Moss, 2006) .(Covalent bonds)
4-2- المماكبة الكيميائية واالنزيمية:
عرفت عملية التحويل الكيميائي للغلوكوز إلى الفركتوز منذ أكثر من 100 سنة. لكن هذا التفاعل
غير نوعي و عادة ما يتم في درجات مرتفعة من الحموضة و الحرارة، ويؤدي إلى تشكيل فركتوز
منخفض الحالوة و ذو نكهة غير مرغوبة، ومن الصعب الوصول إلى تركيز أعلى من 40%
للفركتوز بهذه الطريقة، وهذه مشكلة ال يمكن عالجها بسهولة. لذلك، ال يمكن استخدامها تجاريا، 11
وقد تمت دراسة عملية التحول الكيميائي من قبل Barker وآخرون (1973)، وتبعا لذلك،
فالتحويل األنزيمي للغلوكوز إلى الفركتوز يوفر مزايا عديدة ، مثل: خصوصية التفاعل و إمكانية
التحكم بالظروف المحيطة من الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة وغيرها إضافة إلى عدم تشكيل
أي من المنتجات الجانبية غير المرغوبة. وبالتالي يفضل التحويل األنزيمي للغلوكوز إلى
الفركتوز على المماكبة الكيميائية (Antrim et al., 1979) .
5-2- طبيعة إنزيم GI وتركيبه:
يعد إنزيم غلوكوز أيزوميريز أحد إنزيمات التماكب Isomerases ويحفز هذا النوع من
اإلنزيمات التفاعالت العكسية المتضمنة تغير إحدى مشابهات المركب إلى شبيه آخر مثل:
تحويل المركبات من األشباه الهندسية cis إلى األشباه الهندسية tran وبالعكس.
تحويل المركبات األلدهيدية إلى الكيتونية وبالعكس.
تحويل المركبات اإلينولية إلى الكيتونية وبالعكس. )Nelson and Cox, 2000(
كما تصنف اإلنزيمات الميكروبية حسب طبيعة إنتاجها إلى نوعين أساسين فهي أما أن
تكون إنزيمات مستديمة (constitutive) تنتجها الخلية الميكروبية باستمرار وبكميات كبيرة
خالل المراحل المختلفة للنمو بغض النظر عن تركيب الوسط الغذائي أو المادة التي تنمو
عليها الخاليا كإنزيمات السلسلة التنفسية ودورة الحامض الثالثي الكاربوكسيل TCA
وانزيمات Glycolysis وأنزيمات التحلل السكري، أو أن تكون مستحثة (induced) وهذه ال
تفرز إال بوجود ركيزة تعمل عليها في وسط النمو أو بعض المواد القريبة منها كيميائيا ، والتي
تسمى بالمادة الحاثة Inducer إذ تؤدي تلك المادة دو ا ر هاما في تحفيز الخلية الميكروبية
على إنتاج اإلنزيم، واالعتقاد الحديث أن األنزيمات المستحثة موجودة أصال في الخلية ولكن
بكميات قليلة جدا ، وان وجود الركيزة المناسبة لها تعمل على تعجيل تخليقه ومن األمثلة على 12
ذلك أنتاج أنزيم β-Galactosidase عند وجود المادة األساس في الوسط الزرعي وهي سكر
الالكتوز )Whitaker, 1972(، وتشير العديد من المراجع إلى أن إنزيم غلوكوز أيزوميريز
من اإلنزيمات المستحثة إذ يتحفز إنتاجه عند وجود الزيلوز في وسط النمو.
)Joo and Rhee, 1997 ؛ Belfaquih and Penninckx, 2000(.
تختلف مرحلة إنتاج اإلنزيمات في جميع الكائنات الدقيقة فهي أما أن تفرز في المراحل األولى
من مراحل نمو الكائن المجهري أو في المراحل المتأخرة. كما أنها قد تفرز إلى خارج الخلية
وتسمى عندئذ باإلنزيمات الخارجية Extracellular enzyme، وهذه ال تحتاج إلى خطوات
استخالص بل يمكن المباشرة بتنقيتها واستعمالها ، أو أنها تبقى داخل الخلية وتسمى الحالة هذه
باإلنزيمات الداخل خلوية Intracellular enzyme، وهي تحتاج إلى خطوات استخالص معينة
قبل تنقيتها واستخدامها )الخفاجي، 1990(.
يختلف تركيب اإلنزيم ومحتواه من األحماض األمينية تبعا الختالف مصدره ، حيث بينت دراسة
Suekane وآخرون (1978) أن إنزيم غلوكوز أيزوميريز من البكتريا Streptomyces olivochromogens يتألف من 886 وحدة حامض أميني في حين أن اإلنزيم المنتج من
Bacillus stearothermophilus يتألف من 964 وحدة حامض أميني لكل جزيئة من
اإلنزيم، أظهرت نتائج دراسة أخرى أن الوزن الجزيئي إلنزيم غلوكوز أيزوميريز المنقى من بكتريا
Streptomyces olivochromogens يعادل 45 كيلو دالتون مقدرة بطريقة الترحيل الكهربائي
.(Kaneko et al., 2000) SDS - PAGE
تبين الدراسات أن الوزن الجزيئي إلنزيم غلوكوز إيزوميراز المعزول من مصادر ميكروبية مختلفة
يتراوح بين 45-56 كيلو دالتون. (Dhungel et al., 2007)
13
يبين الجدول )1( األوزان الجزيئية ألنزيم غلوكوز إيزوميراز المنتج من أنواع مختلفة من بكتريا
Streptomyces وم راحل تنقية اإلنزيم:
الجدول )1( األوزان الجزيئية ألنزيم غلوكوز إيزوميراز المنتج من بعض أنواع بكتريا
:Streptomyces
مصدر إنزيم GI مراحل تنقية اإلنزيم الوزن الجزيئي )kDa) المرجع Deshmukh and 42 Streptomyces الترحيل الكهربائي بوجود Shankar, (2000). thermonitrificons SDS Streptomyces الترشيح الهالمي و الترحيل Kaneko et al., 45 olivochromogenes (2000). SDS E-86 الكهربائي بوجود Yassien et al., Streptomyces الترسيب بكبريتات األمونيوم 54 (2013) albaduncus وكروماتوغرافيا التبادل األيوني والهالمي الترحيل الكهربائي بوجود SDS Bhasin, (2011) Streptomyces sp. كروماتوغرافيا التبادل األيوني 43 SB - P1 و الترحيل الكهربائي بوجود SDS
6-2- آلية عمل إنزيم GI:
تشير الدراسات المتعلقة بآلية عمل إنزيم غلوكوز أيزوميريز الذي يقوم بتحفيز التفاعالت العكسية
لتحويل الغلوكوز والزايلوز إلى الفركتوز والزايلولوز على التوالي إلى أن األيونات المعدنية ثنائية
التكافؤ تسهم في عملية التحويل وذلك بربط المادة األولية إلى المركز الفعال Active site في
اإلنزيم مكونة معقدا جسريا معدنيا Metal-bridge complex كما أن آلية عمل اإلنزيم
تتضمن تكوين حالة وسطية أين-دايول Ene-diol intermediate compound والموضحة
في الشكل )5(.
14
Aldo pyranoseEne-diol intermediate compound Ketofuranose
الشكل )5( المركز الفعال في اإلنزيم ومشاركة األيونات المعدنية في عملية التحويل. ) ,.Lavie et al
)1994
إال أن بعض الدراسات التي أجريت على تركيب اإلنزيم والية عمله أوضحت أن اإلنزيم يقوم
بتحويل االلدوزات Aldoses إلى الكيتوزات Ketoses وبالعكس وفق آلية إزاحة الهيدروجين
Hydrogen shift mechanism وكما في الشكل )6(
الشكل )6( آلية إزاحة الهيدروجين لتحويل المركبات من شكل األلدوز إلى شكل الكيتوز وبالعكس
بوساطة إنزيم غلوكوز أيزوميريز. )Pastinen et al., 1999(
ويمكن إيجاز آلية إزاحة الهيدروجين بما يأتي:
- ترتبط األيونات المعدنية ثنائية التكافؤ مع المجاميع الكربوكسيلية للسالسل الجانبية
لألحماض األمينية في الموقع الفعال لإلنزيم أو بالقرب منه.
- ترتبط المادة األساس )الركيزة( بهيئتها الحلقية مع اإلنزيم بوساطة ارتباط ذرة االوكسجين
مع ذرة الك ربون الثالثة والخامسة للركيزة مع األيونات المعدنية الثنائية التكافؤ ، إذ تسهم
15
السالسل الجانبية لألحماض األمينية واأليونات ثنائية التكافؤ بآلية غير معروفة لفتح
حلقة الركيزة واستقامتها.
- تقوم المجموعة الكاربوكسيلية للحمض األميني الهستدين في الموقع الفعال لإلنزيم
بالمساعدة على إزاحة الهيدروجين من ذرة الكربون الثانية إلى ذرة الكربون األولى
للركيزة.
- تقوم السالسل الجانبية لألحماض األمينية في موقع الفعال لإلنزيم واأليونات ثنائية
التكافؤ بغلق حلقة التفاعل وتحرير الناتج )Bhosale et al., 1996(.
7-2- مصادر إنزيم GI:
تنتج األنزيمات من مصادر مختلفة كاألنسجة الحيوانية والنباتية و كذلك من األحياء الدقيقة،
وعلى الرغم من وجود أكثر من 2000 أنزيم معروف حتى يومنا هذا إال أن حوالي 50 أنزيما
منها فقط يتم إنتاجها تجاريا (Srivastava et al.,2010).
تشير العديد من المراجع العلمية إلى وجود إنزيم غلوكوز أيزوميريز في أنواع مختلفة من األحياء
الدقيقة كالبكتريا والخمائر والفطريات، وقد حظي اإلنزيم من هذه المصادر بدراسات واسعة من
حيث اإلنتاج والتنقية والتوصيف وامكانية استعماله في مجاالت متعددة في الصناعات الغذائية
والدوائية، وذلك ألسباب عديدة منها سهولة التعامل مع األحياء الدقيقة، ووفرة إنتاجها من اإلنزيم،
وقصر المدة الالزمة لإلنتاج، ورخص أوساط النمو وبساطة عملية الغربلة والعزل وسهولة
استخالص وتركيز وتنقية اإلنزيم ودراسة صفاته وامكانية إنتاجه على نطاق تجاري
)Lobanok et al., 1998(. أشير إلى بعض البكتريا المنتجة إلنزيم غلوكوز أيزوميراز
في الجدول )2(:
16
الجدول )2( بعض البكتريا المنتجة إلنزيم غلوكوز أيزوميراز:
البكترياBacteria المرجع
Antrim et al., (1979). Clostridium sp. Gong et al., (1980). Actinoplances missouriensis Srinivasan et al., (1983). Chainia sp. Carell et al., (1984). Streptomyces rubignous Hafner, (1985). Streptomyces thermoviolaceas Callens et al., (1986). Streptomyces violaceoruber Kwon et al., (1987). Bacillus circulans Kx-6 Dekker et al., (1991). Thermus thermophilus Varsani et al.,(1993). Arthrobacter spp. Chauthaiwale and Rao, (1994). Bacillus sp. Deshmukh et al., (1996). Streptomyces thermonitrificans Azin et al, (1997). Streptomyces olivochromogenes PTCC-1457. Kaneko et al., (2000). Streptomyces olivaceoviridis E-86 Bandlish et al., (2002). Streptomyces murinns Borgi et al., (2004) Streptomyces sp. SK Prashant et al., (2010) Streptomyces sp. Kankiya and Pairoh, (2012) Streptomyces sp. CH7 Yassien et al., (2013) Streptomyces albaduncus Bhasin et al., (2013) Streptomyces sp. SB – AII4 Sathya and Ushadevi, (2014) Streptomyces sp.
أما من الخمائر فقد تم إنتاج إنزيم غلوكوز أيزوميراز من Candida biodinii
(Vongsuvanlert and Tani, 1988( ومن Schizosaccharomyces pombe
من قبل (Linden and Hahn-Hegerdal, 1989)، كذلك أنتج اإلنزيم من خميرة
.)Marko et al., 2003 ;Walfridsson et al., 1996) Saccharomyces cerevisiae 17
ومن الفطريات أنتج Bhosale (1996) إنزيم غلوكوز إيزوميراز من Aspergillus oryzae،
ومن .Riyaz et al., 2010) Aspergillus sp)
ومن حيث اإلنتاج التجاري لإلنزيم فالجدول )3( يبين أهم المصادر الميكروبية المنتجة لـ GI
على النطاق التجاري:
الجدول )3( اإلنتاج التجاري إلنزيم غلوكوز إيزوميراز:
الكائن المجهري االسم التجاري الشركة المنتجة
Gist Brocades and Anheuser- Maxazyme Actinoplanes missousriensis Busch Inc- France
Novo-Nordisk- China Sweetzyme Bacillus coagulans Miles Kali-Chemie Optisweet Streptomyces rubiginosus Finnsugar Spezyme Streptomyces Nagase- Denmark phaeochromogenes Reynolds Tobacco Swetase Streptomyces olivaceus Miles Laboratories Inc-
America (Bhosale et al., 1996)
وكما هو مبين من األبحاث والدراسات فإن أغلب اإلنتاج التجاري لإلنزيم يتم من بكتريا
.Streptomyces
18
8-2- إنتاج GI باستخدام الجنس Streptomyces:
2-8-1- مجموعة Actinomycetes:
األكتينومايسيتات مجموعة من األحياء الدقيقة موجبة غرام، تتميز بتشكيلها للمشيجة
الهوائية كما أن لبعضها القدرة على تشكيل المشيجة األرضية أو تعطي االثنتين معا .
تعود تسمية األكتينومايسيتات إلى االسم اإلغريقي (aktis( أي شعاع و (mykes) وتعني
فطور، أي الفطور الشعاعية وقد أعطي لها هذا االسم بناء على المالحظة األولية لشكلها
المورفولوجي (Wong et al., 2011)، نظر إليها سابقا على أنها مجموعة منفصلة من األحياء
الدقيقة ألنها تشكل حالة وسط بين الفطريات الحقيقية والبكتريا الحقيقية (Hopwood, 1999)،
لكن على ضوء االكتشافات الالحقة حول تركيب الجدار الخلوي فيها صنفت على أنها بكتريا
وليست فطر، فهي كائنات دقيقة بدائية النواة Bentley et al., 2002) Prokaryotic(.
و تتبع لرتبة Actinomycetales ثماني عائالت هي كما يلي:
Actinomycetaceae .1 Nocardiaceae .2 Actinoplanacea .3 Streptomycetaceae .4 Micromonosporaceae .5 Mycobacteriaceae .6 Frankiaceae .7 ) Stackebrandh et al., 1997) Dermatophilaceae .8
تعد مجموعة األكتينومايسيتات المنتج األكبر للمواد االستقالبية البكتيرية الثانوية ، حيث أظهر
المسح الذي أجري على األبحاث التي تمت بين )1992-1988( أنها تنتج أكثر من 1000
منتج استقالبي ثانوي (Sajid et al., 2011(، لذا فمنها ما ينتج مواد استقالبية ذات قدرات
19
عالجية عظيمة، كالمضادات الحيوية، إضافة إلى ذلك األنزيمات و الصبغات
(Champness, 2000) وأهم ما تتميز به هذه الرتبة أنها تحتوي عائلة
Streptomycetaceae التي تتميز بإنتاجها لعدد كبير من اإلنزيمات كالبروتياز، األميالز،
السيلوالز، البكتيناز، الكزيالناز، الليباز إضافة إلى الغلوكوز إيزوميراز. (Agrawal, 2003)
2-8-1-1- جنس Streptomyces:
اكتشف جنس Streptomyces في عام 1943 من قبل Albert Schatz الذي كان يعمل في
مخبر Selman Abraham Waksman في جامعة Rutgers، و أنواعه تصل إلى حوالي
500 نوع (Euzeby, 2008 ; Madigan and Martinko, 2005(
تصنف بكتريا Streptomyces بأنها بكتريا موجبة غرام، هوائية، Kampfer and Peter)
(2006، تتميز بمحتواها المرتفع من الغوانين والسايتوزين (G +C) حيث تصل نسبتها إلى
حوالي Chater et al., 2010) %72). تنتشر هذه البكتريا بشكل كبير في الطبيعة و خاصة
في التربة مكونة المشيجة األرضية و الهوائية كثيرة التفرع، الهوائية منها تتحول إلى سالسل من
األبواغ، و تعتبر هذه الصفة المظهرية ذات أهمية كبيرة في تشخيص و تمييز هذه العائلة عن
بقية األجناس الخيطية األخرى و كذلك األنواع التابعة لنفس الجنس.
( Bibb, 1996 ; Funke, 2005) تظهر المشيجة األرضية لهذه البكتريا على شكل امتدادات خيطية متفرعة، غير مقسمة و غير
مشكلة لألبواغ إال في أنواع قليلة تحمل فيها المشيجة األرضية سالسل قصيرة من األبواغ، و
تختلف ألوان هذه المشيجة من نوع إلى آخر فمنها األبيض، األحمر، البرتقالي، البني، األخضر
و الرمادي، تنتج المشيجة األرضية صبغات ذائبة في الماء أو غير ذائبة و هذا يختلف تبعا
20
لطبيعة الكائن الحي و تركيب الوسط الزرعي و مدة الحضن و غيرها من الظروف األخرى.
)Williams et al., 1990; Korn-Wendisch and Kutzner, 1991(
تنشأ المشيجة الهوائية بشكل تفرعات بسيطة من المشيجة األرضية وتكون أقل تفرعا منها،
وتتباين المشيجة الهوائية من حيث اللون فمنها األخضر، األبيض، األصفر، األزرق، الرمادي،
البنفسجي واألحمر وهذا عائد الختالف النوع البكتيري والوسط الزرعي ودرجة حرارة التحضين
ومدتها، و تعد صفة اللون هذه صفة تشخيصية مهمة على مستوى النوع.
(Kieser et al., 2000 ; Kanellopoulou et al., 2010) يتميز جنس Streptomyces باألبواغ المنتجة في نهاية خيوط المشيجة الهوائية وتتباين
أعدادها)3-50( بوغ، تحاط هذه األبواغ بغالف ليفي يعطي لسطحها مظه ا ر ممي ا ز فمنها السطح
الناعم أو األملس أو الشوكي أو الوشمي... وهذه الصفة تساعد في تمييز األنواع عن بعضها
باستخدام المجهر اإللكتروني الماسح. (Manteca et al., 2007)
2-8-1-1-1- موطن Streptomyces:
تعد التربة الموطن الطبيعي لمعظم أعضاء عائلة Streptomyces حيث تجد في التربة
الظروف المناسبة للنمو و إنتاج المواد الفعالة، ربما ال تكون هذه الظروف هي المثالية لكنها
تسمح لها بالتنافس الناجح مع الكائنات الدقيقة األخرى إذ أن Streptomyces قادرة على إفساد
و تحليل بقايا مكونات النباتات و الحيوانات، كما أنه من السهل إشباع حاجتها بالمصادر
النتروجينية غير العضوية وهي ال تتطلب من أجل نموها فيتامينات أو محفزات نمو.
(Hodgson, 2000(، تجد بكتريا Streptomyces في التربة الكثير من الركائز لدعم نمو
مشيجتها، وهي قادرة على التكيف مع الشروط الفيزيائية لموطنها مثل الرطوبة و التهوية، هذه
الشروط التي تخضع لتغي ارت تدريجية خالل وقت قصير تبعا للوقت و الفصل Kharel et)
21
(al., 2010. تعتبر أبواغها مقاومة للظروف البيئية غير المالئمة، و تساهم في المحافظة على
بقاءها لفترة أطول ضد عوامل الجفاف، التجميد والظروف الالهوائية الناجمة عن اإلشباع بالماء.
)Khan , 2011)
2-8-1-1-2- دورة حياة Streptomyces:
تمر دورة حياة Streptomyces بعدة مراحل : وهي اإلنبات- نمو المشيجة السطحية- نمو
المشيجة الهوائية - إنتاج األبواغ ، حيث تبدأ دورة حياتها بإنبات بويغة واحدة ، تنتج هذه البويغة
العديد من التفرعات (Chater , 1993)، تزداد هذه التفرعات طوال وتمتد على سطح الوسط و في
داخله لتشكيل المشيجة السطحية ، تستمر هذه الشبكة المعقدة باالنتشار في الوسط مستعملة الجزيئات
العضوية المتاحة لها، بعدها تقوم المشيجة السطحية باختراق سطح الوسط مشكلة المشيجة الهوائية،
يتزامن نمو المشيجة الهوائية مع ظهور أول ناتج استقالبي ثانوي في الوســط الصلب
(Schwedock et al ., 1997)
تعتمد استمرارية وبقاء المشيجة الهوائية على استخدام المشيجة السطحية ، من ثم تتشكل األبواغ،
وتحمل األبواغ الناضجة مع بعضها في سالسل )حوالي 50 بوغ(، وتعطي صبغة رمادية اللون
لها أهمية تشخيصية لـ Davis and Chater, 1990) Streptomyces) .
22
الشكل(7) : مراحل دورة حياة بكتريا Kieser et al., 2000) Streptomyces)
9-2- العزل:
لغرض تشجيع أي كائن دقيق له القدرة على إنتاج إنزيم ما ينبغي في البداية عزل هذا الكائن
بصورة نقية، بحيث يصبح في بيئته المخبرية الجديدة معزوال عن غيره من الكائنات الحية بشكل
مفرد ونقي، وتسمى هذه العملية بعملية العزل في مزارع نقية (Isolation in pure cultures)
وهي خطوة لها أهميتها االستثنائية لتجنب أخطاء التشخيص أو الدراسات الفيزيولوجية والحيوية
المصاحبة الستخدام هذا الكائن الدقيق )Maheshwari et al., 2000(، وتسمى المزرعة النقية
هذه بالعزلة (Isolate) لحين تشخيصها على مستوى الجنس والنوع من خالل دراسة خواصها
المظهرية والمزرعية والفيزيولوجية وغيرها، واذا ما أبدت عزلتان نقيتان أو أكثر تنتمي إلى جنس
ونوع واحد تباينا في صفة معينة يتوجب تسمية هذه العزالت بالسالالت (Strains).
)Ruangpan and Tendencia, 2004)
23
يتطلب العزل معرفة صفة مسبقة تتخذ كعامل انتخاب عند عزل األحياء الدقيقة عن بيئتها
الطبيعية كالتربة والماء والهواء )العاني، 1992(، وتوجد هناك العديد من التقنيات لعزل األحياء
الدقيقة الصناعية ، وتعد تقنية المزرعة المدعمة Enrichment culture من أكثر تلك التقنيات
شيوعا لعزل األحياء الدقيقة المنتجة لإلنزيمات وفيها تضاف مواد معينة إلى الوسط أو مصدر
العزل لتحفيز األحياء الدقيقة المنتجة لإلنزيمات المحللة لتلك المواد وتشجيعها على النمو
والتضاعف بمعدالت عالية تشكل أعدادها مع تقدم زمن الحضانة النسبة العظمى من الكائنات
الموجودة في ذلك الوسط )محي الدين ، 1998(، وعندما تصبح للكائنات المدعمة صفة السيادة
يصار إلى عزلها على صورة مزارع نقية بنشر لقاح Inoculum منها على أوساط غذائية صلبة
انتقائية أو تفريقية كما يمكن ممارسة ضغوط انتخابية أخرى عند عزل األحياء الدقيقة وحسب
الغاية من عملية العزل كدرجة الحرارة والرقم الهيدروجيني والضغط األسموزي أو إضافة مضادات
حيوية أو مثبطات أو منشطات معينة إلى الوسط )Joo and Rhee, 1997(.
يمكن عزل األحياء الدقيقة المنتجة إلنزيم غلوكوز أيزوميريز بتدعيم مصدر العزل بسكر الزيلوز
لكونه مادة حاثة إلنتاج اإلنزيم )Belfaquih and Penninckx, 2000( إذ يستدل على قدرة
العزالت على إنتاج اإلنزيم من مالحظة كثافة النمو على هذه األوساط ومن ثم إجراء اخ تبارات
معينة للمستخلصات اإلنزيمية لهذه العزالت لمعرفة كفاءتها في تحويل الغلوكوز إلى الفركتوز.
)Ramachandran et al., 2009)
10-2- الغربلة:
يقصد بعملية الغربلة هو المقارنة بين عدد كبير من العزالت في صفة محددة كصفة إنتاج إنزيم
غلوكوز أيزوميريز لتحديد أي منها أكثر فاعلية أو مقدرة في التعبير عن تلك الصفة من خالل
24
إجراء اختبارات معينة النتقاء العزلة األغزر إنتاجا إلكمال الدراسة عليها أو ربما استخدامها على
نطاق تجاري ) محي الدين، 1998; عمر، 2006(، وغالبا ما تجرى عملية الغربلة للبكتريا
المنتجة إلنزيم غلوكوز أيزوميريز على مرحلتين )Thakur et al., 2007( هما:
2-10-1- الغربلة األولية:
تسمى بالغربلة شبه الكمية Semi-quantitative حيث تعتمد على إجراء اختبار يتسم بالسرعة
والدقة، حيث تزرع العزالت في أوساط صلبة حاوية على مادة حاثة على إنتاج اإلنزيم مثل سكر
الزيلوز ثم تقارن كثافة النمو بين العزالت. إذ تتناسب قابلية العزالت على إنتاج اإلنزيم طرديا مع
كثافة النمو، ويمكن أيضا إجراء اختبار الفعالية اإلنزيمية للعزالت المنتخبة إذا ما تم إجراء الغربلة
األولية على أوساط سائلة )Bok et al., 1984(.
2-10-2- الغربلة الثانوية:
تسمى بالغربلة الكمية Quantitative كونها تعطي تصو ار متكامال عن قابلية العزالت على
إفراز اإلنزيم كما ونوعا . وهنا تجري المقارنة بين العزالت على أساس تقدير الفعالية اإلنزيمية
للمستخلصات الخام لإلنزيم المنتج على أوساط غذائية طبيعية سائلة تماثل تلك التي تستعمل
على نطاق تجاري وبأسلوب المزارع المغمورة Lobanok et al., ( Submerged culture
.)1998
11-2- التشخيص:
يعتمد تشخيص بكتريا .Streptomyces sp المنتجة إلنزيم غلوكوز أيزوميريز على عدد
من الفحوص المورفولوجية والفيزيولوجية (Ventura et al., 2007)، حيث الصفات المزرعية
25
في األوساط الصلبة كرائحة المستعمرات على الوسط ولونها وقوامها وعلى عدد من الخواص
المظهرية الدقيقة كوجود األبواغ من حيث عددها وقوامها ولونها وترتيبها وكذلك نوع المشيجة
)الميسيليا( إن كانت متفرعة أو مستقيمة أو متعرجة ونهايتها فيما إذا كانت مستقيمة أو ملتوية
وكونها مقسمة أو غير مقسمة، إضافة إلى مقدرة العزالت على إنتاج الصبغات في الوسط
(Bergey et al., 2012)، فضال على مدى استجابة البكتريا لصبغة غرام ) Pridham and
.)Trensener, 1974
كما يتضمن التشخيص أيضا بعض الفحوص الفيزيولوجية والكيميائية الحيوية كفحص قدرة
البكتريا على استهالك مصادر الكربون المختلفة عالوة على اختبار مقاومة أو حساسية البكتريا
للمضادات الحيوية واج ارء فحص التضاد Antibiosis لمعرفة تأثير البكتريا في نمو بكتريا
أخرى منافسة في الوسط الزرعي (Joo et al., 2005(.
12-2- استخالص اإلنزيم:
تختلف طريقة االستخالص حسب نوع اإلنزيم، وطريقة استعماله حيث تختلف اإلنزيمات
في أماكن تواجدها فهي إما تفرز خارج الخلية الميكروبية أو داخلها، و تشير معظم المصادر
إلى أن إنزيم غلوكوز أيزوميريز هو من اإلنزيمات الداخلية لذا يتطلب استخالصه استعمال
إحدى الطرائق، وعادة تستخلص اإلنزيمات الميكروبية الداخلية إما بالسحق الميكانيكي لجدران
الخاليا باستعمال التجنيس (homogenization) أو باستعمال الذبذبات فوق الصوتية
(Pawar and Deshmukh , 1994) (ultrasound) ، أو بالطرائق الكيميائية باستعمال
المذيبات العضوية والمنظفات Detergents بنسبة معينة، أو بالطرائق اإلنزيمية مثل استعمال
إنزيم الليزوزيم Lysozyme الذي يحلل جدران الخاليا الميكروبية.)Chen et al., 1979(
26
إن استعمال أي من هذه الطرائق يؤدي إلى تحلل جدرانالخاليا وتحرر اإلنزيمات من
داخل الخلية إلى وسط النمو.
استعمل Danno (1970) التولوين والليزوزيم في عملية استخالص إنزيم غلوكوز
أيزوميريز من بكتريا Bacillus coagulansHN-68 إذ بعد جمع الخاليا بالطرد المركزي
والغسل لثالث مرات بمحلول فوسفات الصوديوم الموقي ذي رقم هيدروجيني 7 الحاوي على
0.005 موالر من إيثلين دي أمين ثالثي حامض الخليك EDTA تعامل الخاليا بمزيج مكون
من التولوين والليزوزيم وبعد الحضن لمدة 20 ساعة على درجة الحرارة 20م، ويزال حطام
الخاليا بالنبذ المركزي بينما يستعمل الرائق كمحلول إنزيمي خام.
في حين تمكن Wang وآخرون (1998) من استخالص إنزيم غلوكوز أيزوميريز المنتج
من بكتريا Streptomyces lividans باستعمال إنزيم الليزوزيم بتركيز 2 مغ/ مل أضيف إلى
50 مغ من المايسليوم لهذه البكتريا.
كما تمكن Yassien وآخرون (2013) من استخالص اإلنزيم من بكتريا
Streptomyces albaduncus بتعليق الخاليا البكتيرية بمحلول cetylpyridinum chloride بتركيز 0.1% ثم حضن الوسط بدرجة حرارة 40°س لمدة 6 ساعات ، أعقب ذلك
عملية النبذ المركزي واعتبر الرائق المستخلص الخام لإلنزيم.
كذلك تمكن Bhasin وآخرون (2013) من الحصول على المستخلص الخام لإلنزيم
بتعليق الكتلة الحيوية لبكتريا Streptomyces sp.SB-AII4 في محلول CTAB بتركيز
0.1% لمدة ساعتين وبعد إجراء عملية نبذ مركزي استبعد الراسب واعتبر الرائق هو المستخلص
اإلنزيمي الخام.
27
قام Kankiya و Pairoh )2012( باستخالص اإلنزيم بتعليق الخاليا البكتيرية في
محلول %0.1 من CTAB بمعدل 1مل من المعلق البكتيري إلى 3 مل من محلول CTAB
وحضن لمدة 24ساعة عند درجة حرارة 40°س أعقب ذلك عملية نبذ مركزي بسرعة
10000دورة/دقيقة لمدة 20 دقيقة.
أجريت دراسة أخرى استخلص اإلنزيم بتعليق الخاليا البكتيرية في الماء المقطر وعومل
بالخالط لمدة 10 – 20 دقيقة ثم نبذ مركزيا بسرعة 20000 دورة /دقيقة لمدة 20 دقيقة وتم
إزالة حطام الخاليا بأكملها وأخذ الرائق )Prashant et al ., 2010(.
13-2- تقدير الفعالية اإلنزيمية:
تعتمد عملية تقدير فعالية إنزيم غلوكوز أيزوميريز على استعمال الغلوكوز كركيزة ويتم
إجراء التفاعل اإلنزيمي تحت ظروف خاصة من الرقم الهيدروجيني للوسط ووجود بعض
األيونات المعدنية بدرجة حرارة معينة ولمدة محدودة، ويتم قياس الناتج بطرائق طيفية لونية
Spectrophotometric methods من هذه الطرائق:
2-13-1- طريقة Dische and Borenfreund (1951):
تعتمد هذه الطريقة على إجراء تفاعل لوني بين السكريات الكيتونية مثل الفركتوز مع
كاشف Cysteine-carbazole تحت ظروف حامضية. إذ يعطي الف ركتوز مع الكاشف لونا
بنفسجيا يمكن قياس شدته عند طول موجة 560 نانومتر، والذي يعبر عن تركيز الفركتوز الناتج
وباالستعانة بالمنحنى القياسي للفركتوز.
28
2-13-2- طريقة Kulka (1956):
يتم في هذه الطريقة إجراء تفاعل لوني بين السكريات الكيتونية مثل الفركتوز مع كاشف
Resorcinol بوجود كبريتات الحديدوز األمونياكي Fe(NH4)2SO4.12H2O وتحت ظروف
حامضية إذ يعطي الفركتوز مع الكاشف تحت هذه الظروف لونا ورديا يمكن قياس شدته بواسطة
السبكتروفوتوميتر عند طول موجة 480 نانومتر والذي يعبر عن تركيز الفركتوز الناتج
وباالستعانة بالمنحنى القياسي للفركتوز.
2-13-3- طريقة الفحص المناعي اإلنزيمي )ELISA(:
تعتبر طريقة معدلة عن طريقة Kulka ألنها تعتمد على استعمال كاشف Resorcinol،
ومن أهم ميزاتها سرعتها مع استعمال أقل كمية من الكواشف ونماذج الفحص، إضافة إلى ذلك
باستخدام هذه الطريقة يمكن إجراء بعض الدراسات الحركية للتفاعل اإلنزيمي أثناء الفحص،
لكنها تتطلب توفر جهاز ELISA tester إذ يتم قياس الفركتوز الناتج من التفاعل اإلنزيمي
بطريقة لونية عند طول موجة 450 نانومتر وباالستعانة بمنحنى قياسي ) Schenck and
.)Bisswanger, 2000
أوصى اإلتحاد العالمي لإلنزيمات بالتعبير عن تركيز اإلنزيم بوحدة قياسية تدعى وحدة
اإلنزيم (Unit (U، وما الوحدة اإلنزيمية إلنزيم غلوكوز أيزوميراز إال كمية اإلنزيم التي تحرر
واحد ميكرومول من الفركتوز تحت شروط محددة من التفاعل خالل دقيقة واحدة .
29
14-2- العوامل المؤثرة في إنتاج إنزيم GI:
يحتاج كل إنزيم إلى ظروفا محددة ليعمل بالصورة األمثل وهذه الظروف تشمل:
2-14-1- تأثير درجة الحرارة:
2-14-1-1- الحرارة المثلى لنشاط اإلنزيم:
تؤثر درجة الحرارة في مختلف الفعاليات الحيوية للخلية، إذ يعتمد تشكل منتجات
االستقالب في األحياء الدقيقة بشكل كبير على درجة الحرارة، وكما هو الحال في معظم
التفاعالت الكيميائية فإن سرعة التفاعالت اإلنزيمية تزداد مع ارتفاع درجة الحرارة ضمن المجال
الحراري الذي يكون فيه اإلنزيم ثابتا ومحتفظا بكامل فعاليته، وقد تبين أن لكل إنزيم درجة حرارة
مثلى يكون عندها نشاط اإلنزيم في أعلى ما يمكن ويقل النشاط تدريجيا كلما ابتعدنا عن درجة
ح اررته المثلى وغالبا ما ترتبط درجة الح اررة المثلى للنمو وانتاج اإلنزيم بنوع األحياء الدقيقة
المستعملة في اإلنتاج )الخياط ومحمد، 2000(.
2-14-1-2- درجة حرارة حفظ اإلنزيم:
يمكن حفظ اإلنزيم مبردا عند درجة حرارة عشرين تحت درجة الصفر المئوي وعندما يراد
استخدامه مرة أخرى يستعيد نشاطه عند رفع درجة حرارته إلى درجة الحرارة المناسبة للتفاعل
األنزيمي، كما أنه ليس من الضروري أن تكون درجة الحرارة المثلى لنمو األحياء الدقيقة هي
ذاتها المثلى لتحوالت االستقالب لتلك األحياء، وتختلف جة درالحرارة المالئمة لثبات اإلنزيم
ونشاطه من إنزيم إلى آخر) السواح، 2002(.
30
2-14-1-3- درجة حرارة إنتاج اإلنزيم:
أشارت العديد من الدراسات إلى أن درجة الحرارة المثلى إلنتاج إنزيم غلوكوز أيزوميريز
لمعظم األحياء الدقيقة وخصوصا تلك التابعة للجنس .Streptomyces sp تتراوح بين -25
35م )Bok et al., 1984 ؛ Al-Tai et al., 1987 ؛ Hong et al., 1991 ؛ Joo and
Rhee, 1997(. كانت درجة الحرارة المثلى إلنتاج إنزيم غلوكوز أيزوميريز من عزلة لبكتريا
ArthrobacterNRRL B-3728 هي 30س (VanKeulen et al., 1981) .
وجد العبيدي )2004( في دراسة الظروف المثلى إلنتاج إنزيم غلوكوز أيزوميريز من
العزلة Actinomycetes sp. ST27 المحبة للحرارة العالية أن درجة الحرارة المثلى لإلنتاج
كانت 50س.
كما بلغت الفعالية اإلنزيمية إلنزيم غلوكوز أيزوميراز9.59 وحدة/ مل المنتج من بكتريا
Streptomyces sp.HM5 عند درجة حرارة 35°س.(Muhyaddin et al., 2008 )
في حين وجد Yassien وآخرون (2013) أن درجة الحرارة المثلى لفعالية اإلنزيم هي
30س عند إنتاجه من العزلة Streptomyces albaduncus، بينما وجد Sathya و
Ushadevi (2014) أن درجة الحرارة المثلى لعمل إنزيم غلوكوز إيزوميراز كانت 37 °س
عند استخالصه من بكتريا .Streptomyces sp .
2-14-2- تأثير الرقم الهيدروجيني االبتدائي (intial pH):
يلعب الرقم الهيدروجيني االبتدائي لألوساط الزرعية دو ا ر بالغ األهمية في نمو الكائن الحي
الدقيق إذ يؤثر تأثي ا ر مباش ا ر في فيزيولوجيا الكائن الحي الدقيق عن طريق تأثيره في ذائبية
المغذيات في الوسط وجاهزيتها، األمر الذي ينعكس على نمو وفعالية األحياء الدقيقة وسير 31
عمليات التمثيل والتخليق وانتاج اإلنزيمات، فضال على تأثيره في فعالية اإلنزيمات وثباتيتها، كما
أن لكل إنزيم رقم هيدروجيني معين يكون عنده أكثر نشاطا يسمى الرقم الهيدروجيني األمثل
حيث ينخفض النشاط األنزيمي ويمكن أن يتوقف عند وصول هذا الرقم إلى الحد األقصى أو
األدنى حيث يتغير التركيب الطبيعي لإلنزيم في هذه الحالة )السواح، 2002(.
تتباين األحياء الدقيقة المنتجة إلنزيم غلوكوز أيزوميريز في قابليتها على النمو وانتاج
اإلنزيم في أوساط ذات أرقام هيدروجينية مختلفة، فقد بينت العديد من الدراسات أن الرقم
الهيدروجيني االبتدائي األمثل إلنتاج اإلنزيم يتراوح بين 10-5 اعتمادا على نوع البكتريا
(Pederson , 1993). في حين أشار Bok وآخرون (1984) إلى أن إنتاج إنزيم غلوكوز
أيزوميريز من بعض عزالت بكتريا .Streptomyces sp المحبة للحم وضة يتطلب تعديل الرقم
الهيدروجيني لوسط اإلنتاج إلى 5.0 باستعمال 0.1 معياري من حمض الهيدروكلوريك إذ بلغت
أعلى فعالية إنزيمية 5 وحدة/ مل. وفي دراسة أخرى وجد أن الرقم الهيدروجيني األمثل إلنتاج
إنزيم غلوكوز أيزوميريز من البكتريا Streptomyces luteogrioseus هو 6.5
(Hong et al., 1991(. ووجد Prashant وآخرون (2010) أن الرقم الهيدروجيني
األمثل لفعالية إنزيم غلوكوز أيزوميريز من بكتريا Streptomyces هو 6.5.
توصل Muhyaddin وآخرون (2008) إلى أن أعلى فعالية إلنزيم غلوكوز أيزوميراز
بلغت 9.59 وحدة/ مل من بكتريا Streptomyces sp.HM5 عند الرقم الهيدروجيني 7.5.
2-14-3- تأثير زمن التخمير )مدة التحضين(:
تعد مدة التحضين من العوامل الهامة التي تؤثر في عملية التخمر، والسيما في النمو
والتخليق الحيوي لإلنزيمات الميكروبية، وتختلف الفترة المثلى الالزمة للوصول إلى الفعالية 32
العظمى لإلنزيمات المستخلصة من األحياء الدقيقة، حيث أن هناك عدد من العوامل التي تتداخل
مع مدة الحضانة المثلى إلنتاج اإلنزيم منها نوع الكائن المنتج وظروف التنمية ومكونات الوسط،
تؤكد معظم الدراسات أن مدة الحضانة المثلى إلنتاج إنزيم غلوكوز أيزوميريز تتراوح بين -24
96 ساعة، حيث كانت مدة الحضانة المثلى إلنتاج إنزيم غلوكوز أيزوميريز من بكتريا
S-41 Streptomyces griseofucusis المحبة للحموضة هي 24 ساعة.
(Kasumi et al., 1981a ; Bok et al.,1984)
ذكر كل من Chen وآخرون (1979) و Joo و Rhee (1997) أن مدة الحضانة
المثلى إلنتاج إنزيم غلوكوز أيزوميريز من أنواع مختلفة من الجنس .Streptomyces sp تتراوح
بين 30-56 ساعة. في حين وجد Lobanok وآخرون (1998) أن أقصى إنتاج من اإلنزيم
لبعض األنواع التابعة لجنس .Streptomyces sp يتحقق بعد 96 ساعة. بينما وجد Prashant
وآخرون (2010) أن الوصول إلى إنتاجية إنزيمية جيدة تم تحقيقه بعد التحضين لفترة 24 ساعة.
2-14-4- تأثير نسبة الزيلوز:
يمثل عنصر الكربون خالل التخم ارت الميكروبية مصد ا ر هاما للطاقة وعنص ا ر رئيسيا في
بناء الخلية. ولمصادر الكربون المختلفة والسيما العضوية منها أثرا مزدوجا في الخلية، إذ
يستعمل في عمليات البناء والتكوين الحيوي، إضافة إلى إنتاج مستقلبات أولية وثانوية، لذلك
يعتبر وجوده في الوسط أم ا ر بالغ األهمية (Stanbury et al., 1997).
تشير أغلب الدراسات إلى أن معظم األحياء الدقيقة المنتجة إلنزيم غلوكوز أيزوميراز
تحتاج إلى الزيلوز كمصدر للكربون وكمادة حاثة إلنتاج اإلنزيم (Muhyaddin et al., 2008)
33
حيث أكد Kasumi وآخرون (1981a) على أهمية وجود الزيلوز في الوسط المعد
إلنتاج إنزيم غلوكوز أيزوميريز من بكتريا Streptomyces griseofuscus إذ أشار إلى
استعمال 0.3% غلوكوز و0.7% زيلوز في وسط اإلنتاج بدال من استعمال 1% غلوكوز في
الوسط المعد للتنمية.
وأشار Dalaly و Abdullah (1986) إلى أن وجود الزيلوز في وسط إنتاج إنزيم
غلوكوز أيزوميريز من البكتريا .Streptomyces sp يعد ضروريا جدا إلنتاج اإلنزيم و أن
استبدال الزيلوز بالغلوكوز يحول دون إنتاج اإلنزيم. كما استطاع Deshmukh وآخرون
(1996) من إنتاج اإلنزيم من بكتريا Streptomyces thermonitrificans بفعالية 12 وحدة
/مل عند إضافة الزيلوز إلى وسط النمو بتركيز %1. ووجد Wang وآخرون (1998) ارتفاع
الحصيلة المنتجة من إنزيم غلوكوز أيزوميريز من البكتريا Streptomyces lividans في وسط
اإلنتاج Tryptic soy broth الخالي من الغلوكوز مقارنة بالوسط نفسه الحاوي على 5% من
الغلوكوز فعلل ذلك أن الغلوكوز يتسبب في تثبيط إنتاج اإلنزيم.
كما ذكر Givry و Duchiron (2007) أن غالبية الكائنات الدقيقة المنتجة إلنزيم
غلوكوز إيزوميراز تتطلب سكر الزيلوز كمحفز ومحرض إلنتاج وتصنيع اإلنزيم .
توصل Muhyaddin وآخرون (2008) إلى أن اإلنزيم المنتج من Streptomyces sp.HM5 أعطى فعالية عالية لدى استخدام الزيلوز في وسط النمو كمصدر كربوني بتركيز
%1.5. كما أشار Bhasin و Modi (2012) إلى أنه البد من وجود الزيلوز بتراكيز تتراوح
بين %1.25 -0.25 في وسط النمو حيث يلعب دو ا ر محف ا ز إلنتاج إنزيم غلوكوز أيزوميراز.
34
كذلك أشار Yassien وآخرون (2013) إلى ضرورة وجود سكر الزيلوز بتركيز %1 في
وسط النمو إلنتاج إنزيم غلوكوز أيزوميراز من بكتريا Streptomyces albaduncus.
2-14-5- تأثير االمالح والعناصر المعدنية:
تحتاج الخاليا الحية إلى األمالح وبعض العناصر المعدنية ألغراض متعددة فهي أما أن
تدخل في التراكيب الخلوية وهذه عادة تحتاجها بكميات كبيرة أو أن تدخل في تركيب بعض
اإلنزيمات بينما تحتاج قسما منها للحصول على حالة التوازن األيوني المهمة في التفاعالت
الكيموحيوية للخلية )الخفاجي ، 1990(.
تشير معظم الدراسات إلى ضرورة وجود بعض األيونات المعدنية الموجبة ثنائية التكافؤ
في األوساط الزرعية المستعملة إلنتاج إنزيم غلوكوز أيزوميريز ويتوقف نوع األمالح وااليونات
المطلوبة على نوع األحياء الدقيقة المنتجة لإلنزيم، وأن أبرز تلك األمالح هي أمالح الم غنزيوم
والكوبالت )Gaikwad et al., 1992(.
فقد أشار Deshmukh وآخرون (1996) إلى أن وجود أيونات المغنزيوم ضروري لنمو
بكتريا Streptomyces thermonitrificans وانتاج اإلنزيم بالرغم من غياب أيونات
الكوبالت. كما أشار Lobanok وآخرون (1998) إلى ضرورة احتواء وسط إنتاج إنزيم غلوكوز
أيزوميريز المنتج من بعض األنواع التابعة لجنس .Streptomyces sp على أمالح كبريتات
المغنزيوم وبتراكيز تراوحت بين 0.05% إلى 0.1%. أكد Joo و Rhee (1997) عند دراسة
الظروف المثلى إلنتاج إنزيم غلوكوز أيزوميريز من عزلة طافرة لبكتريا Streptomyces chibaensisJ-59 ضرورة احتواء وسط إنتاج اإلنزيم على كبريتات المغن زيوم بتركيز %0.1
وكلوريد الكوبلت بتركيز %0.012.
35
بينما ذكر Muhyaddin وآخرون (2008) أن وجود كبريتات المغنزيوم وكلوريد
الكوبالت وبتركيز %0.05 لكل منهما قد أثر أيجابيا في نشاط إنزيم GI حيث بلغت الفعالية
اإلنزيمية له 9.59 وحدة/ مل. كما أكد Yassien وآخرون (2013) أن وجود كل من أيونات
المغنزيوم والكوبالت يساهم في تحسين إنتاجية اإلنزيم.
+ +2 +2 +2 بينما تبين الدراسات أن أيونات Ag Cu , Ba , Hg أدت إلى تثبيط اإلنزيم حيث
فقد فعاليته عند وجود هذه العناصر (Fan et al., 2011).
15-2- تحسين إنتاجية اإل نزيمات باستخدام التطفير للكائنات الدقيقة:
تعتمد الصناعات الغذائية المختلفة والصناعات األخرى على العديد من اإلنزيمات و
المضافات األخرى من أجل زيادة سرعة اإلنتاج وتحسين نوعية المنتج، لذلك فقد امتدت تطبيقات
الهندسة الوراثية (Genetic engineering) والتطفير (Mutation) لتشمل األحياء الدقيقة
المنتجة لتلك اإلنزيمات والمضافات الغذائية )البكري، 1991(، وكما هو معلوم أن اإلنزيمات
والمضافات الغذائية تنتج بالطرائق البيولوجية االعتيادية، ولغرض تلبية الطلب العالمي المتزايد
لإلنزيمات، وتحسين مواصفاتها ونوعيتها وثباتيتها يتطلب ذلك استخدام وتطوير طرق وأساليب
التطفير المختلفة )Ramachandran et al., 2009( .
تمكن Cheng وآخرون (2001) من تحسين إنتاجية Streptomyces hygroscopicus FC904 من المضاد الحيوي Rapamycin باستخدام التطفير باألشعة
فوق البنفسجية وقد زادت إنتاجيته بنسبة 60% عن البكتريا األم.
كما تم تحسين إنتاجية Streptomyces avermitilis 41445 للـ Avermectin
بالتطفير باألشعة فوق البنفسجية (Siddique et al., 2014)
36
كذلك األمر بالنسبة إلى اإلنزيمات حيث يعد التطفير الوراثي من األساليب المستخدمة
لتحسين إنتاجية الكائن الحي الدقيق لإلنزيمات المختلفة وتستخدم لهذا الغرض العديد من العوامل
المطفرة والمقسمة إلى شقين رئيسيين هما العوامل الفيزيائية ومنها استخدام األشعة فوق البنفسجية
وأشعة غاما واألشعة السينية، والعوامل الكيميائية وتستخدم فيها العديد من المركبات الكيميائية
مثل حمض النيتروز (HNO2) وغاز الخردل و bromouracil-5 و Ethyl methyl)
(sulphonate (EMS و (N-methyl- N- nitrose- N- nitro- guanidine (NTG)
)أحمد و النواوي، 1990(.
إن وظائف اإلنزيمات ال تتسم أحيانا بالثبات أثناء عملها بسبب تغير بعض الظروف
المصاحبة للعمل كتغير الرقم الهيدروجيني أو عدم الثبات تجاه تباين درجات الحرارة، إضافة إلى
كون الهندسة الوراثية والتطفير العشوائي (Random mutagenesis) لألحياء الدقيقة المنتجة
لإلنزيمات يعمل على زيادة اإلنتاج فضال عن تحسين صفات اإلنزيم المنتج ,.Kirk et al)
2002)
أمكن من خالل هذا السياق الحصول على إنتاجية أعلى إلنزيم غلوكوز أيزوميراز، أو
الوصول إلى إنزيم أفضل من حيث الخصائص عن طريق تحسين الساللة البكتيرية إما باستخدام
التطفير أو بالتحوير الوراثي (Bhosale et al., 1996( حيث عرضت العديد من السالالت
ذات األهمية التجارية في إنتاج اإلنزيم للتطفير بقصد إنتاج مستويات مرتفعة من اإلنزيم، أو
لتصبح منتجة له، ويتم ذلك إما فيزيائيا أو كيميائيا ، حيث ازداد مستوى إنتاج اإلنزيم بنسبة 60%
بتطفير بكتريا Streptomyces wedmorensis بوساطة (Bengston and ( (NTG
Lamm, 1973(، واستخدمت األشعة فوق البنفسجية بشكل واسع للحصول على سالالت مطفرة
من الكائنات الدقيقة )Adsul et al., 2007(، حيث أعطى التشعيع بوساطة األشعة فوق 37
البنفسجية لبكتريا Streptomyces olivochromogenes ساللة مطفرة بإنتاجية إنزيمية أعلى
بنسبة %70 من الساللة األصلية )Suekane and Iizuka, 1982( وأنتجت العديد من
الطفراتعالية اإلنتاج إلنزيم غلوكوز أيزوميراز بوساطة التطفير باألشعة فوق البنفسجية لبكتريا
.)Bok et al., 1984( Streptomyces acidodurans
16-2- فصل وتنقية األنزيم:
تأتي خطوة تنقية اإلنزيمات الداخل خلوية عموما بعد استخالصها بإحدى الطرائق التي
ذكرت سابقا اعتمادا على طبيعة الخاليا أو النسيج وحجم المستحضر الذي تستخلص منه
اإلنزيمات، ولدراسة اإلنزيمات وخواصها الحركية ال بد من تنقيتها إلى حد التجانس أي التخلص
من المواد الموجودة مع اإلنزيم جميعها تحاشيا للوقوع في استنتاجات خاطئة وال تتحقق التنقية إال
عبر مجموعة من الخطوات المتدرجة يفترض أن تزداد خاللها فعالية اإلنزيم النوعية في كل
خطوة (Kornberg, 1990(.
وتعرف الفعالية النوعية لإلنزيم على أنها قدرة اإلنزيم على تحفيز تفاعل ما، وتحسب الفعالية A A النوعية كما في المعادلة التالية: s mprotein
حيث تمثل As الفعالية النوعية لإلنزيم، m protein تركيز البروتين الناتج، كما تعرف عدد
A مرات التنقية n لكل مرحلة من مراحل التنقية كما يلي: n s As (crude)
حيث تمثل (As(crude الفعالية النوعية لألنزيم الخام (Morton, 1950)
يتم فصل وتنقية األنزيم تبعا للحجم والكتلة إما بالتثفيل فائق السرعة
(g( Ultracentrifugation × 300000()، حيث تكون كتلة األنزيم العامل الرئيسي للفصل، 38
وتستخدم هذه الطريقة لفصل األنزيم عن الشوائب وال تكون ف ّعالة لفصل األنزيمات عن بعضها
البعض، أو بالترشيح الهالمي )Gel filitration) ويستخدم في مرحلة متقدمة من التنقية، ويعتمد
الفصل على مبدأ الوزن، ومن أهم الهالمات المستخدمة ,Sephadex, Sephacryl و
Sepharose، إال أن هذه الطريقة مكلفة وتستغرق الكثير من الوقت، أو ب الديلزة (Dialysis)
وتستخدم عادة إلزالة األمالح والمحاليل العضوية، ويعتمد الفصل على مبدأ الوزن أو الحجم، أو
بالترشيح الفائق )Ultrafiltration( وتستخدم هذه الطريقة لتركيز البروتين
. (Rizvi et al.,2007)
يتم الفصل تبعا للقطبية (Polarity ( واالنحاللية (Solulibility( وللخصائص البنيوية
Structural features لإلنزيم، فتنقى اإلنزيمات بطرائق عديدة فإما أن تفصل تبعا للحجم
والكتلة باستخدام التثفيل فائق السرعة (Ultracentrifugation (، الترشيح الهالمي Gel)
(filitration، الديلزة (Dialysis) ، الترشيح الفائق (Ultrafiltration) ، أو أن تنقى تبعا
للقطبية Polarity باستخدام كروماتوغ رافيا التبادل اإليوني Ion-exchange)
(chromatography، التركيز الكروماتوغرافي (Chromatofocusing)، الرحالن الكهربائي
(Electrophoresis)، كروما توغرافيا التفاعالت المحبة للماء Hydrophobic)
(chromatography ، أو أن تفصل تبعا لالنحالل، أو تبعا للخصائص البنيوية
باستخدام كروماتوغرافيا األلفة (Affinity chromatography) أو االمتزاز المناعي
(Immunoadsorption(
.)Stryer, 2006 ;Morton, 1950)
39
الجدير بالذكر أنه ال يوجد ترتيب ثابت لخطوات تنقية اإلنزيمات، ولكن مع ذلك فإن
المعاملة الحرارية -إذا كان باإلمكان استعمالها– والترسيب بكبريتات األمونيوم أو
المذيبات العضوية أو التركيز بالتجفيد أو الترشيح الفائق تمثل المراحل المبكرة في عمليات التنقية
لغرض تركيز اإلنزيم وتخليصه من أكبر قدر ممكن من الماء الموجود في مستخلصه ومن ثم
تقليص حجمه ورفع كفاءة التنقية )Volesky and Laong, 1985 ؛ داللي ، 1983(.
يمكن فصل وتنقية األنزيمات بخطوات متعددة، تبدأ في معظم األحيان بالترسيب باألمالح،
وتستخدم لهذا الغرض كبريتات األمونيوم بدرجات إشباع متباينة تت را وح بين 20% و %100
(Bajaj et al., 2009; Basha et al., 2009; Kumar et al., 2012(، ولتجميع
ال راسب يتبع ذلك عملية تثفيل بسرعة تت را وح بين 5000 دورة/ دقيقة و 8000 دورة/ دقيقة لمدة
تتراوح بين 15 و 20 دقيقة. تختلف المراجع العلمية في ترتيب خطوات التنقية الالحقة، حيث نجد
أن مجموعة من الباحثين قد أجرت عملية الديلزة Dialysis باستخدام محلول mM Tris 20
HCl طوال الليل، وألحقتها بعملية االكروماتوغرفيا المبادلة لأليونات Ion-exchange)
(Bajaj et al., 2009( chromatography( باستخدام عمود DEAE-Cellulose، وفي
بعض األحيان تجرى بعد ذلك عملية كروماتوغرافيا الفصل تبعا للحجم، ثم تجرى عملية الرحالن
لكل األجزاء التي خضعت لجميع خطوات التنقية السابقة، ويستخدم لهذا الغرض هالم التمايز
(Resolving gel) بتركيز15% وهالم التراص (Stacking gel) بتركيز %5.
(Gaffney, 1996)
تمت تنقية إنزيم غلوكوز أيزوميريز المنتج من بكتريا Streptomyces olivochromogenes بخمس خطوات شملت الترسيب بكبريتات األمونيوم تلتها كروماتوكرافيا
األلفة الكارهة للماء وخطوتين من التبادل األيوني أعقبتها خطوة الترشيح الهالمي فكانت الفعالية 40
النوعية لإلنزيم المنقى 16.5 وحدة/مغ مع حصيلة قدرت بحوالي 33.2% وبعدد مرات تنقية
مقدارها 5.5 مرة (Kaneko et al., 2000).
قام Jabur (2004) بتنقية إنزيم غلوكوز إ ايزوميرز بعدة خطوات شملت تركيز مستخلص
اإلنزيم الخام بكبريتات األمونيوم وبنسبة إشباع 75% ثم الديلزة وام ارر المحلول األنزيمي على
عمود كروماتوكرافيا التبادل األيوني DEAE-Cellulose ثم الترشيح الهالمي على عمود
Sephacryl S–200 وبلغت عدد مرات التنقية 5.34 مرة وبحصيلة %18.89.
تمكن العبيدي )2004( من تنقية إنزيم غلوكوز أيزوميريز المنتج من العزلة المحلية
الطافرة Actinoplanes sp. 89ST27 بإتباع عدة خطوات اشتملت على الترسيب بكبريتات
األمونيوم بنسبة إشباع 70% وكروماتوكرافيا التبادل األيوني بوساطة عمود -DEAE
Sephadex A-50 ثم الترشيح الهالمي بعمود Biogel-A إذ أمكن استرداد 34.14% من
اإلنزيم بعدد مرات تنقية بلغت 20.35 مرة.
أجريت دراسة أخرى قام بها Dhungel وآخرون (2007) أمكن تنقية إنزيم غلوكوز
أيزوميريز المنتج من بكتريا Streptomyces spp بالترسيب بكبريتات األمونيوم أوال بنسبة
إشباع 45% أعقبته استخدام عمود الكروماتوغرافيا Sepharose-4B بعدد مرات تنقية بلغت
7.1 مرة، كماأجريت تنقية إنزيم غلوكوز أيزوميريز المنتج من بكتريا .Streptomyces sp
SB - P1 بعدة خطوات تنقية شملت الترسيب بأمالح كبريتات األمونيوم بنسبة إشباع %85
والتنقية بالترشيح الهالمي باستخدام عمود Sephadex G- 50 ثم استخدم عمود التبادل األيوني
DEAE Cellulose وكانت الحصيلة من اإلنزيم 47.25% وبعدد مرات تنقية بلغت 8.1 مرة
41
(Bhasin , 2011). كما تمكن Yassien وآخرون )2013( من تنقية إنزيم غلوكوز
أيزوميريز المنتج من Streptomyces albaduncus بالترسيب بأمالح كبريتات األمونيوم
بنسب إشباع 70% و 90% على التوالي ثم استخدم عمود التبادل األيوني على مرحلتين
استعمل في األولى عمود من نوع DEAE-cellulose وفي الثانية عمود من نوع -DEAE sephadex A-50 وأمكن استرداد 10.3% من اإلنزيم بعدد مرات تنقية بلغت 13.3 مرة.
17-2- الصفات الحركية لعمل إنزيم غلوكوز أيزوميراز
2-17-1- تأثير درجة الحرارة في فعالية اإلنزيم:
تزداد سرعة معظم التفاعالت الكيميائية مع ارتفاع درجة الحرارة إذ إن الزيادة في درجة
الحرارة تمنح الجزيئات المتفاعلة طاقة حركية اكبر مما ينتج عنها شدة تصادم جزيئات اإلنزيم مع
الركيزة لكل وحدة زمنية. وتنصرف التفاعالت اإلنزيمية بطريقة مماثلة حتى بلوغ درجة حرارية
معينة تتأثر اإلنزيمات بعدها سلبا بسبب حدوث تغيير في تركيب اإلنزيم)Segel, 1976(.
وتعرف درجة الحرارة المثلى الحقيقية لفعالية اإلنزيم بأنها درجة الحرارة القصوى التي يبقى
عندها اإلنزيم محتفظا بفعاليته على مدى من الزمن يزيد في األقل عن المدة الالزمة لقياس
الفعالية في الحالة االعتيادية.
2-17-2- تأثير درجة الحرارة في ثباتية اإلنزيم:
يتأثر الثبات الحراري لإلنزيمات بعدة عوامل وال سيما الرقم الهيدروجيني ، القوة األيونية
وطبيعة المحلول الموقي ووجود أو غياب الركيزة والمنشطات والمثبطات ومدة الحضن وتركيز
اإلنزيم )Whitaker, 1972(. فبارتفاع درجة الحرارة عن الدرجة المثلى للتفاعل تتخرب البنية
الثانوية لإلنزيم وينخفض نشاطه بسرعة ، أما عند بدء التفاعل في درجات الحرارة األقل فإن 42
الحرارة تضيف طاقة تسهل التفاعل اإلنزيمي، لذا فهناك تأثيرين للحرارة وهما زيادة السرعة
االبتدائية للتفاعل إلى حد درجة معينة ثم تخريب )تغيير الطبيعة البروتينية لإلنزيم( في درجات
الحرارة المرتفعة مما يؤدي إلى خفض فعالية اإلنزيم، وتختلف درجات الحرارة المثلى للفعالية
والثبات إلنزيم غلوكوز أيزوميريز باختالف المصادر الميكروبية لإلنزيم، حيث وجد
Deshmukh وShankar (1996) أن درجة الحرارة المثلى لإلنزيم المنتج من بكتريا
Streptomyces thermonitrificans كانت 85°س وأن اإلنزيم يحتفظ بكامل فعاليته عند
حضنه بدرجة حرارة 70س مدة 15 دقيقة.
وكانت درجة الحرارة المثلى لفعالية اإلنزيم المنتج من Streptomyces
80 olivaceoviridis E-86س و أن اإلنزيم يحتفظ بكامل فعاليته 100% عند حضنه
بدرجة حرارة لغاية 70س مدة 3 ساعات ويفقد 20% من هذه الفعالية عند حضنه عند
80س مدة 3 ساعات (Kaneko et al., 2000(.
بينما توصل العبيدي )2004(إلى أن درجة الحرارة المثلى لفعالية اإلنزيم المنتج من
Actinoplanes sp. 89ST27 هي 75س ويحتفظ اإلنزيم بكامل فعاليته عند حضنه بدرجة
حرارة بين 70-35س مدة 30 دقيقة، بينما يفقد 23.6% من فعاليته عند حضنه للمدة نفسها
بدرجة حرارة 80س. واستنتج Bhasin و Modi (2011) أن الفعالية العظمى لإلنزيم المنتج
من Streptomyces sp. SB - P1 كانت عند درجة الحرارة 75 °س. وفي دراسة أخرى كانت
الفعالية العظمى لإلنزيم المنتج من Streptomyces sp. HM5 عند درجة حرارة 60°س،
واستقرارية اإلنزيم كانت عند درجة حرارة أدنى من 60°س (Muhyaddin et al., 2008(.
43
2-17-3- تأثير الرقم الهيدروجيني في فعالية اإلنزيم:
يؤثر الـرقم الهيدروجيني بطريقتين مختلفتين إما أن يغير البنية الثانوية لإلنزيم أو يغير الشحنات
الكهربائية للمجاميع الوظيفية لألحماض األمينية بالموقع الفعال لإلنزيم، وعلى تأين الركيزة وتأين
معقد اإلنزيم ومن ثم تأثر سرعة التفاعل الحفزي اإلنزيمي )Whitaker, 1972(.
2-17-4- تأثير الرقم الهيدروجيني في ثباتية اإلنزيم:
يعد الرقم الهيدروجيني األمثل لثبات اإلنزيم من الصفات المهمة ألي إنزيم والتي يجب أن
تدرس إذ يعتمد الرقم الهيدروجيني األمثل لثبات إنزيم معين على عدة عوامل منها درجة الحرارة
والقوة األيونية وطبيعة المحلول الموقي وتركيز المنشطات والمثبطات والركيزة وتركيز اإلنزيم
والمرافقات اإلنزيمية )Segel, 1976(.
يختلف الرقم الهيدروجيني األمثل لفعالية وثبات اإلنزيم غلوكوز أيزوميريز باختالف مصدر
اإلنزيم، حيث كان الرقم الهيدروجيني األمثل لفعالية اإلنزيم المنتج من Streptomyces thermonitrificans هو 7 واحتفظ اإلنزيم بنسبة عالية من هذه الفعالية عند حضنه بمدى
واسع من أرقام الحموضة تتراوح بين )5-9( عند درجة حرارة 30م مدة 15 دقيقة
)Deshmukh and Shankar, 1996(. كما كان الرقم الهيدروجيني األمثل لفعالية اإلنزيم
المنتج من Streptomyces sp. EC10 هو7 وقد أظهر اإلنزيم ثباتا عاليا في حدود من أرقام
الحموضة تتراوح بين Belfaquih and Penninckx, 2000)8-6(، بينما كان الرقم
الهيدروجيني األمثل لفعالية اإلنزيم المنتج من Actinoplanes sp. 89ST27 هو 9 وقد أبدى
اإلنزيم ثباتا عاليا في مدى من أرقام الحموضة تتراوح بين 7-9 عند حضنه بدرجة حرارة -25
30م مدة 30 دقيقة إذ احتفظ اإلنزيم بحوالي 96% من فعاليته وفقد حوالي 58% من فعاليته
44
عند حضنه بأرقام حامضية بين )4-5.5( )العبيدي، 2004(. واستنتج Bhasin (2011) أن
الفعالية العظمى لإلنزيم المنتج من .Streptomyces sp تراوحت عند الرقم الهيدروجيني 7،
كما أن استقرارية اإلنزيم كانت عند الرقم الهيدروجيني 7-9. كما كانت الفعالية العظمى لإلنزيم
عند الرقم الهيدروجيني 8، و استقرارية اإلنزيم كانت عند الرقم الهيدروجيني -8 10
.)Muhyaddin et al., 2008)
18-2- األهمية التطبيقية إلنزيم غلوكوز إيزوميراز:
عرفت أهمية إنزيم غلوكوز أيزوميريز التطبيقية منذ منتصف القرن الماضي عندما
اكتشفت قابليته في تحويل الغلوكوز إلى الفركتوز وانتاج الش ارب الغني بالفركتوز High
(Fructose Syrup (HFS وكذلك إنتاج شراب الذرة الغني بالفركتوز High Fructose
.)Schenck and Bisswanger, 2000( Corn Syrup (HFCS)
تمثل عملية المماكبة األنزيمية (Isomerization( للغلوكوز إلى الفركتوز األساس في
صناعة شراب الذرة الغني بالفركتوز وقد أستعمل هذا المنتج كبديل عن سكر المائدة )السكروز( في
العديد من الصناعات الغذائية كصناعة المشروبات الغازية بنسبة 50% وصناعة المعجنات
بنسبة 22 % واألغذية المصنعة بنسبة 23 % وصناعات أخرى بنسبة 4% وكذلك في مجال
األدوية، وذلك نظ ار الرتفاع أسعار السكر مقارنة بأسعار شراب الذرة الغني بالفركتوز وزيادة الطلب
عليه إذ إن معدل استهالك الفرد األمريكي من السكر بلغ حوالي 50 كغ/ سنة، كما أن ارتفاع
أسعار السكر مقارنة بأسعار شراب الذرة الغني بالفركتوز شجع على التوسع في إنتاج هذا األخير
.)Stephen and Suraez, 2003(
45
الفركتوز أو سكر الفاكهة هو سكر أحادي كيتوني يوجد في العديد من النباتات، اكتشف الفركتوز
من قبل الصيدلي الفرنسي أوجستين في عام Hyvonen and 1982) 1847
,Koivistoinen ) وأطلق عليه اسم فركتوز في العام 1958 من قبل الكيميائي اإلنكليزي
ويليام ميلير (William, 1957)، وسكر الفركتوز النقي والجاف يتميز بلونه األبيض وحالوته
المرتفعة كما أنه عديم الرائحة )Hyvonen and Koivistoinen, 1982(، تجاريا ينتج
الفركتوز من قصب السكر و الشوندر السكري والذرة، والسبب الرئيسي هو أن الفركتوز يستخدم
تجاريا في األطعمة والمشروبات، إضافة إلى انخفاض تكلفته وحالوته العالية نسبيا حيث أنه
السكر الطبيعي األكثر حالوة بين السكريات الطبيعية األخرى، عموما الفركتوز أكثر حالوة من
السكروز بـ 1.73 مرة
)Hanover and White, 1993)
عالوة على ما تقدم فإن الفركتوز يتميز عن الغلوكوز ببعض الخصائص الفيزيائية والوظيفية
كقابليته العالية للذوبان في الماء وميله القليل للتبلور وارتفاع حالوته التي تعادل 2.34 و 1.73
مرة من حالوة الغلوكوز والسكروز على التوالي مما جعلته يلعب دو ار مه ما في التطبيقات الصناعية
)Hanover and White, 1993(، وتتميز المنتجات الحاوية على السكريات الممزوجة مع
الفركتوز كالحلويات بأنها أكثر نعومة من تلك الحاوية على سكريات أخرى وهذا عائد للذوبانية
العالية للفركتوز)McWilliams, 2001(، كما يمنع الفركتوز ظاهرة الترمل لذلك فقد استعمل
في صناعة المثلجات واأللبان كما يعطي القوام اللين للقشطة )Pawan, 1973(، ويستعمل في
صناعة المعجنات لمنح المنتج اللون البني الجذاب والنكهة المميزة واطالة مدة الخزن ، فالفركتوز
هو مرطب ممتاز ويحتفظ بالرطوبة لفترات طويلة من الزمن حتى عندما تكون الرطوبة النسبية
منخفضة )Nabors, 2001( ، لذا فالفركتوز يمكن أن يساهم في إعطاء المنتجات الغذائية التي 46
يدخل فيها ملمسا ناعما أكثر قبوال وكذلك يطيل عمر هذه المنتجات وبالتالي يمنع ظاهرة البيات،
إذ يتحطم الفركتوز بصورة أسرع وأسهل من الغلوكوز عند التسخين منتجا هيدروكسي مثيل
فورفورال HMF بصورة رئيسة والذي يتفاعل بسهولة مع مجموعة األمين في البروتينات
والحوامض األمينية مكونا اللون البني الجذاب والنكهة المميزة للخبز Hanover and White)
(1993، ويسهم الفركتوز في منع ظهور الطعم المر أثناء التذوق في المنتجات التي تستعمل
مواد التحلية الصناعية مثل السكرين لذا استعمل الفركتوز في تحلية غذاء المصابين بمرض
السكر )Pritham, 1998( الرتفاع حالوته والمتصاصه البطيء في القناة الهضمية ويستهلك
دون الحاجة إلى األنسولين )Atiken et al., 1970(.
استخدم الفركتوز في إعداد األغذية ذات السعرات الحرارية المنخفضة وبذلك فهو يساعد على
خفض الوزن ومعالجة السمنة ويستعمل أيضا في تحضير األغذية الخاصة بالرياضيين والمسنين
خالل النقاهة )Pawan, 1973(، كما أنه يزيد من قابلية األمعاء المتصاص الحديد ) Brich
)and Green, 1973
تستعمل فركتوزات الكالسيوم مصدرا للكالسيوم في حاالت نقص الكالسيوم كما يحضر منه
السوربيتول Sorbitol الذي يدخل في صناعة معاجين األسنان )Tyler et al., 1973(، وعند
إحالل الفركتوز بدال من السكروز في األغذية يقل خطر اإلصابة بتسوس األسنان بنسبة %25
ألنه يخفض من إنتاج السكريات المتعددة الغلوكان Glucan الذي
تستهلكه األحياء الدقيقة منتجة حمض الالكتيك الذي يتسبب في تسوس األسنان ) Steven and
.)John, 1981
47
ذكر Schenck و Bisswanger (2000) أن معظم عمليات إنتاج شراب ذرة عالي
الفركتوز تتم بوساطة إنزيم غلوكوز أيزوميريز وبدرجات حرارة 70-55م وبرقم هيدروجيني
يتراوح بين 7.5-8.5، في حين وجد Kaneko وآخرون (2000) أنه بعد إضافة إنزيم غلوكوز
إيزوميراز المنتج من Streptomyces olivochromogenes إلى شراب غلوكوز الذرة الذي
يحتوي على 50% من الفركتوز و1.5% من سكريات متعددة oligosaccharide غير معروفة
وخالل 12 ساعة من التفاعل يتحول الغلوكوز إلى الفركتوز.
تمكن العبيدي )2004( من تحويل الغلوكوز إلى الفركتوز بوساطة إنزيم غلوكوز
أيزوميريز المنتج من Actinomycetes sp. 89ST27 بعد 12 ساعة من أجراء التفاعل في
مفاعل حيوي بدرجة حرارة 70م .
يتراوح الزمن األمثل لتحويل الغلوكوز إلى الفركتوز في بعض الخامات بين 35-40 ساعة
من التفاعل وعلى درجة حرارة 60س. )جبر وزمالؤه، 2010(
48
3- مواد البحث وطرائقه:
1-3- األجهزة والمواد المستخدمة في الدراسة:
تم تنفيذ البحث في مخابر الهيئة العامة للتقانة الحيوية.
3-1-1- األجهزة:
يبين الجدول ) (4 أهم األجهزة المستخدمة عند إجراء البحث ومنشأ كل جهاز من هذه األجهزة:
الجدول ) (4 األجهزة المستخدمة في البحث:
اسم الجهاز الشركة المصنعة مقياس الرقم الهيدروجيني (Hanna – Romania (pH-meter ميزان حساس Mettler Toledo – Taiwan Sensitive balance جهاز تثفيل مبرد Heraeus – Germany Cooling centrifuge حاضنة Lab Tech – Koria Incubator New Brunswick Rotary shaker حاضنة هزازة Scientific – U.S.A حمام مائي Memmert- Germany Water bath جامع األجزاء Fractions collector صناعة محلية Shenan LDZX -50 FB- جهاز المؤصدة )المعقم( Autoclave China مازج أنابيب Stuart- China Vortex فرن كهربائي Grad- Russian Oven جهاز تقطير الماء G F L – Germany حوض رحالن كهربائي Cleaver- UK عمودي
49
مجهر ضوئي Olympus – Philippines Microscope مسخن مع محرك Heater Magnetic Boeco – Germany stirrer مغناطيسي خزان رحالن كهربائي Cleaver- UK Electrophoresis tank مجهز قدرة كهربائية Thermo- California Power Supply مضخة تفريغ Rocker- India Vacuum pump Spectrophotometer مطياف ضوئي Biochrom Libra S12 UV/visible مجهزة قدرة كهربائية Consort Power supply غرفة عزل مزودة باألشعة Bio Air - Italy Laminar hood فوق البنفسجية
3-1-2- المواد الكيميائية المستخدمة:
استخدمت العديد من المواد الكيميائية في البحث ومن أهم هذه المواد: غلوكوز D-Glucose،
كاربازول، سيستين هيدروكلوريد، كبريتات المغنزيوم المائية MgSO4.7H2O، فوسفات
البوتاسيوم األحادية CTAB ،DMSO ،KH2PO4، حمض الكبريت H2SO4، كلور الكوبالت
CoCl2، سكر الزيلوز.
3-1-3- األوساط الزرعية:
حضرت جميع األوساط الزرعية مخبريا أو حسب تعليمات الشركة وعقمت هذه األوساط بالصاد
2 (Autoclave) الم وصد عند درجة حرارة 121ْم وتحت ضغط 15 باوند/انش ، مدة 15 دقيقة
3-1-3-1 وسط العزل: (Gauza)
حضر هذا الوسط بإذابة المكونات االتية في لتر من الماء المقطر.
50
1. Soluble starch 20 g 2. K2HPO4 0.5 g 3. KNO3 1 g 4. NaCl 0.5 g
5. MgSO4.7H2O 0.05 g
6. FeSO4.7H2O 0.01 g 7. Agar 18 g (Bahrim et al., 2010)
عدل الرقم الهيدروجيني للوسط إلى 7.0 ثم عقم بالصاد الموصد حسب الفقرة (3-3) برد
الوسط وأضيف اليه األكتيديون ) Cycloheximide( المعقم من خالل مرشح بكتريولوجي
(Millipor filter ذو قطر ثقوب µm 0.22( بتركيز 100 ميكروغرام/ مل.
.(Hong et al.,1991)
3-1-3-2 وسط األساس الصلب )وسط إنتاج اإلنزيم(:
حضر هذا الوسط بإذابة المكونات اآلتية في لتر من الماء المقطر.
1. Peptone 10 gm 2. Yeast extract 2.5 gm 3. D-xylose 10 gm 4. NaCl 5 gm 5. Beef extract 5 gm
6. MgSO4. 7H2O 0.5 gm 7. Agar 18 gm
عدل الرقم الهيدروجيني للوسط إلى 6.8 وتم تعقيمه بالمؤصدة علما بأن الزيلوز عقم
على انفراد بدون استخدام الحرارة بطريقة الفلترة باستخدام مرشح بكتريولوجي Millipore ذو
51
قطر ثقوب 0.2µm، وأضيف إلى مكونات الوسط بعد التعقيم. استعمل هذا الوسط في مرحلة
الغربلة األولية (Yassien et al., 2013 ; Park and Toma, 1975).
3-1-3-3- وسط اإلنتاج السائل:
حضر من مكونات الوسط األساس الصلب السابق مع استبعاد اآلغار. استعمل هذا
الوسط للغربلة الثانوية وانتاج إنزيم غلوكوز إيزوميريز Yassien et al., 2013 ;Park and)
.Toma 1975)
3-1-4- أقراص المضادات الحيوية:
استخدمت أقراص المضادات الحيوية، حيث زرعت بكتريا Streptomyces على وسط
Gauza Agar ثم وضعت أقراص المضادات الحيوية فوقها ثم حضنت عند حرارة 30°س
لمدة ثالثة أيام وتم الكشف عن مقاومة البكتريا ألقراص المضادات الحيوية. ,.Barbe et al
(2011، يبين الجدول (5) أقراص المضادات الحيوية المستخدمة في الكشف عن مقاومة
العزالت لها.
الجدول (5) أقراص المضادات الحيوية المستخدمة:
Antibiotics الرمز الكمية/ ميكروغرام الشركة المصنعة Sigma- U.S.A 15 cla Clarithromycin Sigma- U.S.A 5 cip Ciprofloxacin Sigma- U.S.A 30 rif Rifampicin Sigma- U.S.A 30 tet Tetracyclin Sigma- U.S.A 30 cfz Ceftazidim Sigma- U.S.A 30 cfx Cefotaxim Sigma- U.S.A 10 amp Ampicillin Sigma- U.S.A 10 pen Penicillin – G
52
3-1-5 - البروتينات القياسية:
استخدمت بروتينات معروفة الوزن الجزيئي وهي: BSA ،β- galactosidase ,
Lysozyme ،β- lactoglobulin ،Carbonic anhydrase ،Ovalbumin
(Biotech-Australia) الستخدامها في الرحالن الكهربائي.
3-2- طرائق العمل:
3-2-1 جمع العينات:
جمعت 32 عينة تربة قلوية من مناطق مختلفة من القطر العربي السوري )دمشق ، حماة،
حمص، تدمر، دير الزور، الالذقية، درعا، السويداء( كما هو مبين في الجدول (6) بين عامي
2010- 2011 في فصل الربيع، وقد تم الحرص على أن تكون العينات مأخوذة من تربة
إلنتاج الذرة الصفراء، أو تربة مزروعة بأشجار الصنوبر والسرو أو غنية بالحشائش، كون هذه
األنواع من الترب تعتبر مصادر غنية باألحياء الدقيقة المنتجة إلنزيم غلوكوز إيزوميريز وخاصة
بكتريا Hong et al, 1991) Streptomyces)، أزيلت الطبقة العشبية بالفأس و كذلك الطبقة
السطحية من التربة على عمق 5-10 سم ، بعد ذلك أخذت التربة حتى عمق 10-15 سم بهذه
الطريقة لتجنب وجود الفطور إلى حد ما من الطبقة السطحية المعرضة للهواء، أخذت عينات
التربة من ثالث مواقع متباعدة من الحفرة ووضعت في أكياس معقمة، وأخذت مكررات من
المكان نفسه من مناطق تبعد عن بعضها 10-20 متر لتمثيل المكان بشكل جيد، ويبين الجدول
(6) مصدر عينات التربة وعددها من كل منطقة.
53
الجدول (6) مصدر وعدد عينات التربة المأخوذة من كل منطقة:
مصدر عينة التربة عدد العينات 6 دمشق 4 حماة 5 حمص 3 تدمر 4 دير الزور 4 الالذقية 3 درعا 3 السويداء 32 مجموع العينات
3-2-2 عزل بكتريا Streptomyces:
تضمنت عملية العزل تعليق 10 غ من كل عينة من التربة بعد غربلتها وا زالة األعشاب والشوائب
منها في 100 مل من الماء المقطر ثم حضرت تخفيفات عشرية متسلسلة للعينات ونقل 0.1 مل
من هذه التخفيفات إلى سطح وسط العزل المضاف له األكتيديون في أطباق بتري معقمة ونشر
على السطح وحضنت األطباق بدرجة حرارة 30س مع متابعة النمو يوميا ولمدة 2-7 أيام،
أخذت مستعمرات البكتريا النامية بصورة منفردة وأعيدت زراعتها على نفس الوسط السابق بطريقة
التخطيط ثم كررت العملية ألكثر من مرة بهدف الحصول على عزالت نقية مع مالحظة كثافة
النمو في كل مره وفحصت الخاليا تحت المجهر للتأكد من نقاوة العزلة.
3-2-3 تصنيف بكتريا Streptomyces:
3-2-3-1 دراسة بعض الخواص المزرعية والبيوكيميائية للمستعمرات الناتجة:
درست بعض الخواص المزرعية ( شكل المشيجة الهوائية واألرضية و لونها، إنتاج الصبغات(
والخواص الدقيقة (شكل الخلية ، شكل سالسل األبواغ وعددها...( باستخدام صبغة غرام
54
(Taddei et al., 2006)، كما تم التحري عن قدرة العزالت على تمثيل و استخدام السكريات
التالية: )غلوكوز، سكروز، إينوسيتول، فركتوز، رافينوز، أرابينوز، زايلوز، مانيتول، رامنوز(
)Bergey et al., 2012)، إضافة إلى ذلك أجري اختبار قابلية العزالت أو عدم قابليتها إلنتاج
المواد المضادة )Bergey and Holt, 2000).
3-2-3-2 اختبار حساسية البكتريا للمضادات الحيوية:
لقحت االطباق الحاوية على وسط العزل بـ 0.1 مل من معلق بكتريا Streptomyces
بعمر 14 يوما و نشر المعلق على سطح الوسط في أطباق بتري ووضعت أقراص المضادات
الحيوية واستدلت على حساسية البكتريا المختبرة من تكون هالة شفافة حول االقراص ) Joo et
,.2005al(، قيست أقطار الهاالت لمناطق التثبيط ورمز للعزالت المقاومة بحرف R والذي
يعني مقدرة البكتريا على النمو في محيط االقراص مباشرة وعدم تثبيط المضادات لها.
3-2-4- انتخاب السالالت المنتجة أل نزيم غلوكوز إيزوميراز:
3-2-4-1- الغربلة األولية:
أجري االختبار بتخطيط العزالت المنتقاة على وسط األساس الصلب )2-3-1-3(
وحضنت األطباق عند درجة حرارة 30 ْم مع متابعة كثافة النمو يوميا ولمدة أسبوع. إذ عدت
كثافة النمو دليال أو مؤش ا ر على استهالك البكتريا لسكر الزيلوز كمصدر وحيد للكربون وكمادة
حاثة )Inducer( على إنتاج اإلنزيم )Joo and Rhee, 1997 ؛ Belfaquih and
.)Penninckx, 2000
55
3-2-4-2- الغربلة الثانوية:
استعملت طريقة المزارع المغمورة (Submerged culture) المذكورة من قبل
(Lobanok et al., 1998). باستعمال حاضنة هزازة إلنتاج اإلنزيم. إذ لقحت دوارق زجاجية
سعة 250 مل حاوية على 50 مل من وسط اإلنتاج السائل المعقم )3-1-3-3( بمليلتر واحد
من معلق األبواغ بحيث يكون حجم اللقاح في وسط اإلنتاج حوالي 105 بوغ/مل. حضنت
الدوارق عند درجة حرارة 30س مدة 48 ساعة بسرعة تحريك 150 دوره/دقيقة.
فصلت الكتلة الحيوية من وسط النمو بال طرد المركزي المبرد وعلى سرعة 15000
دوره/دقيقة مدة 15 دقيقه على درجة حرارة 4س. تم التخلص من الرائق، أما الراسب الذي
يمثل الخاليا الكاملة فقد تم غسلها بالماء المقطر بحجم يعادل حجم وسط اإلنتاج )50 مل(
ونبذت مركزيا تحت نفس الظروف المذكورة سابقا ، تم التخلص من الرائق واستعمل الراسب من
المرحلة األخيرة لعملية الغسل الستخالص اإلنزيم من الخاليا.
3-2-5- تحديد الطريقة المثلى ل متحطي الخاليا واستخالص إنزيم GI:
لتحديد أفضل مادة حالة لجدار الخاليا لغرض استخالص اإلنزيم من بكتريا
Streptomyces roseiscleroticus المصنفة حسب الفقرة (3-2-3( واألفضل من حيث
إنتاج إنزيم GI ، تم التحري عن إنتاج اإلنزيم حيث اختبرت خمسة مواد لتحديد أفضلها
الستخالص اإلنزيم من البكتريا وقد استخدمت هذه المذيبات بنسبة 0.1% وهي الكلورفورم
وصوديوم دودسايل سلفات (SDS) و(DMSO) و(CTAB) وTween 80 ومن ثم تم تقدير
الفعالية اإلنزيمية للمستخلصات.
56
وتتلخص طريقة االستخالص بتعليق خاليا بكتيريا Streptomyces roseiscleroticus
في 50 مل من محلول االستخالص )0.1 % من المذيبات العضوية السابقة في الماء المقطر(
في دوارق بسعة 250 مل وحضنت في حاضنة هزازة وعلى سرعة 150 دورة/ دقيقة وعند درجة
حرارة 30س مدة 24 ساعة ونبذت مركزيا بسرعة 15000 دورة/ دقيقة مدة 15 دقيقة وبدرجة
حرارة 4س. أهمل الراسب وجمع الرائق الذي عد المستخلص الخام لإلنزيم ، ثم قدرت الفعالية
اإلنزيمية (Bhasin et al., 2013).
3-2-6- تقدير الفعالية اإل نزيمية لـ GI:
اتبعت الطريقة المذكورة من قبل Takasaki وآخرون )1969) مع بعض التحويرات التي
ذكرها Kaneko وآخرون (2000) في تقدير فعالية إنزيم غلوكوز إيزوميراز. إذ أضيف 0.1
مل من المستخلص اإلنزيم الخام إلى محلول التفاعل المتكون من 0.5 مل من محلول موقي
فوسفات البوتاسيوم )pH 8 ، N 0.1( و 0.2 مل من محلول كبريتات المغن زيوم )N 0.05( و
0.2 مل من محلول المادة األساس الغلوكوز )N 1( وحضن مزيج التفاعل في حمام مائي على
درجة حرارة 60 ْم واستمر التفاعل اإلنزيمي مدة 30 دقيقة. ثم أوقف التفاعل بإضافة 1مل من
محلول حمض البيركلوريك N 0.5( HClO4(.
تم الكشف عن الفركتوز الناتج بفعل اإلنزيم بإضافة 0.2 مل من محلول سيستائين
هيدروكلوريد Cysteine-Hydrochloride )1.5% في الماء المقطر( و6 مل من محلول
حمض الكبريت )70 %( و 0.2 مل من محلول الكاربازول )Carbazole( )0.12% في
الكحول االثيلي( إلى محلول التفاعل ومزج الخليط جيدا باستعمال مازجة األنابيب Vortex
(Kankiya(Dische and Borenfreund, 1951; and Pairoh, 2012، قيست
57
االمتصاصية عند طول موجة 560 نانومتر في جهاز المطياف الضوئي
(Spectrophotometer) مقابل محلول الشاهد (Blank) الحاوي على جميع المواد ما عدا
محلول اإلنزيم.
تعرف وحدة فعالية اإلنزيم (Unit) بأنها كمية اإلنزيم التي تحرر ميكروموال واحدا من
الفركتوز في الدقيقة الواحدة تحت ظروف التجربة، لكن لتقدير فعالية إنزيم GI الناتج يجب أوال
التوصل إلى معادلة المنحني القياسي للفركتوز، ومنها يستخرج تركيز الفركتوز المتحرر بفعل
اإلنزيم على المادة األساس الغلوكوز باالستعانة بذلك المنحنى القياسي لمحلول الفركتوز.
3-2-6-1- المنحنى القياسي لمحلول الفركتوز: (Rahman, 2008)
حضرت تراكيز متدرجة من سكر الفركتوز تراوحت من 0.1 – 1 ميلي مول بإجراء التخفيفات
الالزمة لمحلول الفركتوز )2.5 ميلي مول( بالماء المقطر وكما موضح في الجدول )7(.
الجدول )7( تراكيز محلول الفركتوز القياسي:
رقم محلول الفركتوز بتركيز 2.5 ملي مول ماء المقطر التركيز النهائي للفركتوز األنبوب )مل( )مل( )ملي مول( 0.1 96 4 1 0.2 92 8 2 0.3 88 12 3 0.4 84 16 4 0.5 80 20 5 0.75 70 30 6 1.00 60 40 7 1.25 50 50 8
58
0 100 0 9
نقل 1مل من المحاليل المحضرة أعاله إلى انبوبة اختبار وأضيف إليها 0.2 مل من
محلول Cysteine- Hydrochloride )1.5%( و6 مل من محلول حمض الكبريت المركز
)70 %( و 0.2 مل من محلول الكاربازول )0.12% في الكحول اإلثيلي( ومزج الخليط بشدة
في مازجة االنابيب Vortex. قيست االمتصاصية عند طول موجة 560 نانومتر في جهاز
المطياف الضوئي الذي تم تصفيره باستعمال الشاهد المؤلف من المحاليل المستعملة لتقدير
الفركتوز واستخدام الماء بدال من محلول الفركتوز نفسه )أنبوب 9 جدول )7(.
3-2-7- التطفير باألشعة فوق البنفسجية:
لغرض إجراء التطفير على بكتريا D3( Streptomyces roseiscleroticus(
المعزولة من تربة دمشق، والتي اختيرت كأفضل عزلة حيث أظهرت أعلى فعالية في إنتاج
غلوكوز إيزوميراز وأجريت عليها عملية تطفير باستخدام األشعة فوق البنفسجية UV، إذ
عرضت أطباق التطفير الحاوية على وسط Gausa لألشعة مع ترك طبق كشاهد لم يعرض
لألشعة. استخدم مصباح كمصدر لألشعة فوق البنفسجية ذو إشعاع بطول موجة 254 نانومتر.
حضر معلق بوغي من أطباق بعمر عشرة أيام للعزلة D3 ضمن محلول ملحي 0.85%)
-6 (NaCl، زرعت تخافيف من المعلق البوغي حتى التمديد 10 وتبين أن هذا األخير هو التمديد
المناسب لالختبار، ، حيث أخذ 0.1 مل من التخفيف السادس و و زعت باستخدام الماسح
الزجاجي على كامل سطح أطباق بتري حاوية على وسط Gausa agar، عرضت األطباق بعد
ذلك إلى األشعة فوق البنفسجية بطول موجة 254 نانومتر ألزمنة متتالية 240-210-180-
(0-30-60-90-120-150 ثانية( ومن ارتفاع 10 سم، من ثم حفظت األطباق في الظالم لمدة 59
30 ساعة، بعدها حضنت األطباق عند حرارة ْم لمدة ثالثة أيام أجريت عملية عد للمستعمرات
المطفرة على كل طبق ثم اختبرت قدرة كل مستعمرة مطفرة على حدة على إنتاج إنزيم GI
.(Abdel-Aziz et al., 2011)
3-2-8- أمثلة ظروف إنتاج أنزيم GI:
درست ظروف إنتاج إنزيم GI لتحديد الطريقة المثلى النتاجه من بكتريا Streptomyces
roseiscleroticus ، تم إنتاج اإلنزيم باستخدام طريقة التخمير المغمورة ووسط التخمر
المذكور سابقا ، ثم درس تأثير خمسة متغي رات ( درجة ح را رة التحضين، رقم الحموضة، ومدة
الحضن، تركيز سكر الزيلوز، تركيز األيونات المعدنية( على نمو الساللة المستخدمة، مع تثبيت
سرعة دوران الحاضنة عند 150 دورة / دقيقة ( درس تأثير كل متغير عند خمسة مستويات
موضحة في الجدول (8) استخدم البرنامج اإلحصائيMinitab والتصميم اإلحصائي
(Muthuvelayudham and Response Surface Methodology (RSM) (Viruthagiri, 2010 ، الذي وضع ليس فقط الختصار عدد التجارب المستخدمة في عملية
األمثلة، بل إلعطاء نتائج أكثر منطقية ووضوح من الب رامج اإلحصائية األخرى، من خالل د راسة
تأثير كل متغير على حدا وتأثير المتغي رات المتداخلة مع بعضها البعض El-Naggar and)
(Abdelwahed, 2014. إن قيم المتغي رات المدروسة ومستوياتها موضحة في الجدول )8(.
وتحليل نتائج األمثلة يعبر عن العالقة بين الفعالية اإلنزيمية (Response (Y والمتغيرات
الخمسة المدروسة (Independent variables(X بمعادلة من الدرجة الثانية كما يلي: Y=a+bX1+cX2+dX3+eX4+fX5+gX12+hX22+iX32+jX42+kX52+lX 1X2+mX1X3+nX1X4+oX1X5+pX2X3+qX2X4+rX2X5+sX3X4+tX3 X5+uX4X5 حيث: 60
Y: العامل المدروس Response
a: الثابت constant b, c, d, e, f: العامل المتغير Linear coefficient g, h, I, g, k: العامل المتغير مربع square coefficient l, m, n, o, p, q, r, s, t, u: العوامل المترابطة مع بعضها Interaction coefficient
الجدول )8( المتغي رات المدروسة ومستوياتها باستخدام البرنامج اإلحصائي Minitab :
مستويات المتغيــــــــــــــــــــــــــــــــــرات المتغيرات تركيز سكر الزيلوز تركيز رقم الحموضة درجة حرارة مدة التخمير بصورة رمز غ/ل األيونات التحضين م يوم المعدنية % 2 25 6 0.01 5 -α = -2 3 30 6.5 0.03 7.5 -1 4 35 7 0.05 10 0 5 40 7.5 0.07 12.5 +1 6 45 8 0.09 15 +α = +2
تم وضع التصميم اإلحصائي المشار إليه في الجدول )9( باستخدام البرنامج اإلحصائي
Minitab، والذي يعبر عن االمتغيرت، ويبين التجارب التي أجريت وعددها 32 تجربة.
61
الجدول)9( التصميم اإلحصائي للتجارب:
المتغيرات تركيز الزيلوز تركيز األيونات رقم الحموضة درجة الحرارة مدة التخمير رقم التجربة 1 غ/ل 10 المعدنية 7 %0.05م 25 يوم 4 4 35 7 0.05 10 2 4 35 7 0.09 10 3 4 35 7 0.05 10 4 3 40 7.5 0.07 7.5 5 4 35 7 0.05 10 6 2 35 7 0.05 10 7 4 35 7 0.05 10 8 5 30 6.5 0.07 12.5 9 4 35 7 0.05 15 10 5 30 6.5 0.03 7.5 11 3 30 7.5 0.07 12.5 12 5 30 7.5 0.03 12.5 13 4 35 8 0.05 10 14 5 40 6.5 0.07 7.5 15 3 30 6.5 0.03 20 16 3 40 6.5 0.03 7.5 17 4 35 6 0.05 10 18 4 35 7 0.01 10 19 4 35 7 0.05 5 20 5 40 7.5 0.07 12.5 21 5 30 7.5 0.07 7.5 22 3 40 7.5 0.03 12.5 23 3 30 7.5 0.03 7.5 24 5 45 7.5 0.03 7.5 25 4 35 7 0.05 10 26 3 40 6.5 0.07 12.5 27 3 30 6.5 0.07 7.5 28 4 35 7 0.05 10 29 6 35 7 0.05 10 30 4 35 7 0.05 10 31 5 45 6.5 0.03 12.5 32
62
3-2-9- دراسة بعض الصفات الحركية ألنزيم غلوكوز أيزوميراز الخام المفرز من بكتريا
: Streptomyces roseiscleroticus
أنتج إنزيم غلوكوز إيزوميراز بطريقة التخمر المغمور وباستخدام وسط األساس السائل )-1-3
3-3( والمضاف له كلوريد الكوبالت بنسبة 0.05% ووزع الوسط في دوارق سعة 250 مل
بحجم 50 مل في كل دورق وعقم بالمؤصدة ثم أضيف سكر الزيلوز بتركيز 15 غ/ليتر
باستخدام المرشح الميكروبيولوجي (µm 0.22) وعدل الرقم الهيدروجيني إلى 6 ، لقحت
5 الدوارق بـ 1% من المعلق البوغي ) 10 خلية /مل( من (S. roseiscleroticus SH(10
وحضنت الدوارق في الحاضنة الهزازة بسرعة 150 دورة/ د عند درجة حرارة º 25م، ومدة
الحضن 48 ساعة وبعد انتهاء مدة التخمر أجريت عملية طرد مركزي للمزرعة الناتجة بسرعة
8000 دورة/ د لمدة 15 دقيقة ومن ثم استخلص اإلنزيم من راسب البكتيريا بتعليق الخاليا
البكتيرية في 50 مل من محلول االستخالص 0.1 % من (CTAB) الذي تم اختياره
كأفضل حال للخاليا في دوارق بسعة 250 مل، ووضعت في حاضنة هزازة بسرعة 150
8000 24 30 دورة/دقيقة وحرارة ْم مدة ساعة، ثم نبذ المعلق الناتج مركزيا بسرعة دورة/ (Chen et al., 1979 4 15 دقيقة مدة دقيقة وحرارة ْم ) أهمل الراسب، وجمع الرائق الذي
اعتبر مستخلصا خاما لإلنزيم )Bhasin and Modi, 2012(.
3-2-9-1- تأثير درجة الحرارة:
قدرت فعالية اإلنزيم الخام عند مدى من درجات الحرارة تراوحت بين 30-90°م ورسمت
العالقة بين درجات الحرارة مقابل الفعالية اإلنزيمية لتعيين درجة الحرارة المثلى لفعالية اإلنزيم
. (Dehkordi et al., 2009 ; Deshmukh and Shankar,1996)
63
3-2-9-2- االستقرارية الحرارية:
حضن 2 مل من المحلول اإلنزيمي الخام بدرجات حرارة مختلفة 30 و40 و50 و60 و70
و80 و 90م مدة 30 دقيقة وفق الطريقة التي ذكرها Deshmukh و Shankar (1996)
و Dehkordi وآخرون (2009)، بردت األنابيب مباشرة في حمام ثلجي ثم قدرت الفعالية
اإلنزيمية المتبقية لتحديد درجة الحرارة المثلى لثباتية اإلنزيم.
3-2-9-3- تأثير الرقم الهيدروجيني:
قدرت الفعالية اإلنزيمية مع استخدام المحاليل الموقية التالية بدالً من محلول فوسفات
البوتاسيوم الموقي )Salehi et al., 2004(:
موقي الخالت برقم هيدروجيني3 و 4 و5 وبتركيزM 0.1.
موقي فوسفات الصوديوم برقم هيدروجيني 6 و7 و8 وبتركيز M 0.1.
موقي الغاليسين هيدروكسيد الصوديوم برقم هيدروجيني 9 و10 و 11.
من أجل الحصول على أرقام الحموضة 4-3 حضر محلول حمض الخل (A) بتركيز M 0.1
ومحلول خالت الصوديوم (M 0.1 (B ثم مزج كما في الجدول )10( للحصول على أرقام
الحموضة المطلوبة:
الجدول (10) تحضير موقي الخالت في درجات الحموضة pH من 3-5 ونسب المحاليل
المستخدمة:
رقم الحموضة المحلول (A) / مل المحلول (B) / مل 1.77 98.23 pH 3.0 15.30 84.70 pH 4.0 64.30 35.70 pH 5.0 )Salehi et al., 2004(
64
ومن أجل الحصول على أرقام الحموضة 6-7-8 استخدم محلول الفوسفات الموقي المحضر
من محلول فوسفات ثنائية الصوديوم (A) بتركيز M 0.4 و محلول فوسفات أحادية
الصوديوم الحامضية بتركيز B) M 0.4) وفق الجدول رقم )11(:
الجدول )11( تحضير موقي فوسفات الصوديوم في درجات الحموضة pH من 6-8 ونسب
المحاليل المستخدمة:
رقم الحموضة المحلول (A) / مل المحلول (B) / مل pH 6.0 87.7 12.3 pH 7.0 39.0 61.0 pH 8.0 5.3 94.7 )Zhang et al., 2009)
أما من أجل الحصول على أرقام حموضة 9-10 استخدم المحلول الموقي الغاليسين
هيدروكسيد الصوديوم بتركيز M 0.1 المحضر من ل محلو الغاليسين (M 0.2 (A
ومحلول هيدروكسيد الصوديوم (M 0.2 (B كما هو مبين في الجدول )12( ويكمل الحجم
بالماء المقطر حتى الوصول إلى حجم 100 مل.
الجدول (12) تحضير موقي الغاليسين في درجات الحموضة pH من 9-11 ونسب المحاليل
المستخدمة:
رقم الحموضة المحلول (A) / مل المحلول (B) / مل pH 9.0 4.4 25 pH 10 15.2 25 32.4 25 pH 11 .)Salehi et al., 2004(
65
3-2-9-4- االستقرارية الحمضية:
حضن محلول األنزيم عند درجة الحرارة 30 °س لمدة 60 دقيقة في المحاليل الموقية المختلفة
ضمن المجال )pH 4-11(. ثم بردت و جرى قياس الفعالية المتبقية Deshmukh and)
. Shankar,1996; Borgi et al., 2007)
3-2-9-5- تأثير تركيز الركيزة على فعالية اإلنزيم:
أضيفت تراكيز مختلفة من سكر الغلوكوز ) 0.2– 0.4- 0.6- 0.8- 1.0- 1.2 مول( ثم
قيست الفعالية اإلنزيمية لتحديد التركيز األمثل من الركيزة إلعطاء أعلى فعالية أنزيمية
)Raykovska وزمالؤه، 2001(.
3-2-9-6- تأثير بعض الشوارد المعدنية:
استبدلت كبريتات المغنزيوم المستخدمة في مزيج التفاعل اإلنزيمي ب شوارد معدنية أخرى وهي
كبريتات المنغنيز و كلوريد الكالسيوم ونترات الفضة وكلوريد الزئبق وكبريتات النحاس ومزيج
من كبريتات المغنزيوم وكلوريد الكوبالت بتركيز Bhasin) . M 0.1 ، 2011(.
3-2-10- تنقية إنزيم غلوكوز إيزوميراز:
3-2-10-1- الحصول على المستخلص الخام لألنزيم:
أنتج إنزيم غلوكوز إيزوميراز بطريقة التخمر المغمور وباستخدام الوسط األساس السائل
)3-1-3-3( وبعد انتهاء مدة التخمر أجريت عملية طرد مركزي للمزرعة الناتجة بسرعة
8000 دورة/د لمدة 15 دقيقة ومن ثم استخلص اإلنزيم من البكتريا المدروسة بتعليق الخاليا
البكتيرية في 50 مل من محلول االستخالص %0.1 من ستيل ثالثي مثيل بروميد 66
األمونيوم (CTAB) في دوارق بسعة 250 مل، ووضعت في حاضنة هزازة بسرعة 150
8000 24 30 دورة/دقيقة وحرارة ْم مدة ساعة، ثم نبذ السائل الناتج مركزيا بسرعة دورة/ Dhungel et al., 2007; Chen et al., 1979 4 15 دقيقة مدة دقيقة وحرارة ْم ) (،
أهمل ال ارسب، وجمع ال ارئق الذي اعتبر مستخلصا خاما لإلنزيم، ُركز محلول األنزيم )500
مل( بتجفيده عند الضغط p = 0.05 bar والحرارة 53- م حتى الحصول على حجم نهائي
لألنزيم الخام قدره 100مل.
3-2-10-2- مراحل تنقية GI :
3-2-10-2-1- الترسيب بأمالح كبريتات األمونيوم:
رسب اإلنزيم بإضافة كبريتات األمونيوم الصلبة إلى المستخلص اإلنزيمي
مع التحريك المستمر لحين اإلذابة بدرجة حرارة 4 ْم وعلى مرحلتين تبعا لما ذكره
(Basha et al., 2009). ففي المرحلة األولى تم ايصال درجة التشبع إلى 25% ثم
اجريت عملية النبذ المركزي بسرعة 8000 دورة/ دقيقة مدة 20 دقيقة بدرجة حرارة 4 ْم.
)Duong and Gabelli ,2014)
أجري التخلص من الراسب. أما الرائق فقد أضيفت إليه كبريتات األمونيوم الصلبة حتى
الوصول إلى نسبة اإلشباع 75%. أجريت عملية النبذ المركزي مرة أخرى تحت نفس الظروف
السابقة. فصل الرائق وأذيب الراسب في 20 مل من محلول فوسفات الصوديوم الموقي بتركيز
M 0.05 وبرقم هيدروجيني 7.5 والحاوي على كبريتات المغنزيوم بتركيز M 0.005. وحفظ
المحلول عند درجة الح را رة 20º - م لحين االستخدام.
67
والجدول (13) يبين الكميات المضافة من ملح كبريتات األمونيوم للوصول إلى درجات
اإلشباع المختلفة:
الجدول (13) عدد غرامات ملح كبريتات األمونيوم المضافة إلى ليتر من المحلول:
قدر حجم المستخلص اإلنزيمي والبروتين والفعالية اإلنزيمية والنوعية للرائق والراسب لجميع
مراحل الترسيب.
3-2-10-2-2- التنقية باستخدام أعمدة الكروماتوغرافيا:
3-2-10-2-2-1- عمود الـ Sephadex G-100 :
تتكون مادة الـ Sephadex من مصفوفة ( متوالية ) من الديكست ران ( ناتج من ارتباط
وحدات الغلوكوز بروابط أثيرية)، يفصل هذا العمود على مبدأ الوزن الجزيئي، يسمح بفصل
البروتينات ذات األو زان الجزيئية من 4-150 كيلو دالتون، وقد جرت هذه المرحلة من التنقية بعد
مرحلة الترسيب بكبريتات األمونيوم حيث أخذ الراسب الناتج بعد مرحلة التشبع بنسبة 75 %
68
وحل في 20 مل من محلول فوسفات الصوديوم الموقي M 0.05 وجفدت للوصول إلى حجم
5مل، تم تحضير هالمة الـ Sigma, U.S.A) Sephadex G-100) ، حيث سكبت
الهالمة في البداية بلطف في عمود زجاجي بأبعاد (1.6×22 سم( مع مالحظة عدم ظهور
فقاعات، غسل العمود بمحلول فوسفات الصوديوم الموقي pH= 8.0( M 0.05) ثالث م رات،
وبلغت سرعة الجريان 36 مل/ ساعة.
أضيف لعمود Sephadex G-100 5 مل من األنزيم، و مرر المحلول الموقي فوسفات
الصوديوم M 0.05 الحاوي على 0.005 موالر من كبريتات المغنزيوم على العمود، جمعت
األجزاء المفصولة من العمود بجامع األجزاء Fraction collecter وكانت سرعة الجريان 36
مل/ساعة وبواقع 1 مل للجزء الواحد. وتمت متابعة امتصاصية كل جزء عند طول موجة = λ nm 280 لالجزاء المفصولة، ورسم المنحني البياني للعالقة بين االمتصاصية وأرقام األجزاء، ثم
جمعت محتويات األنابيب التي تقع ضمن تشكيل القمة، وقيس حجمها وقدرت فعاليتها وتركيز
البروتين منها (Kornberg, 1990( وركزت باستخدام المجفدة ( الضغط = bar p 0.05
والحرارة 53-م( إلى حجم 5 مل.
3-2-10-2-2-2- عمود الـ Sephacryl S-200:
غسل الهالم بالمحلول الموقي فوسفات الصوديوم مرتين pH=8. بعدها علق الهالم بـ
300 مل من نفس المحلول الموقي وأزيلت منه الغازات (Degassing) بمضخة تفريغ الهواء
عبأ الهالم في العمود ليعطي هالما بأبعاد )2.2 × 18 سم( وأجريت موازنة العمود باستخدام
المحلول الموقي نفسه وبما يعادل 3 مرات بقدر حجم الهالم في العمود، ثم مرر 5 مل من
المحلول اإلنزيمي المركز من الخطوة السابقة على عمود الترشيح الهالمي -Sephacryl S
69
Sigma, U.S.A) 200)، وأجريت عمليتا الغسل Washing واالسترداد Elution بمحلول
موقي فوسفات الصوديوم وبسرعة جريان مقدارها 24 مل/ساعة جمعت األجزاء المفصولة من
العمود بجامع األجزاء Fraction collecter بمعدل 1 مل للجزء الواحد تمت متابعة
االمتصاصية لألجزاء المفصولة عند طول موجة 280 نانومتر ورسم المنحني البياني للعالقة بين
االمتصاصية وأرقام األنابيب، ثم جمعت محتويات األنابيب التي تقع ضمن تشكيل القمة، وقيس
حجمها وقدرت فعاليتها وتركيز البروتين منها وركزت باستخدام المجفدة ( الضغط = p 0.05
bar والحرارة 53-م( إلى حجم 5 مل.
3-2-11 - تقدير البروتين
اتبعت طريقة Lowry وآخرون (1951) و Jabur (2004) لتقدير تركيز البروتين وكما يلي:
3-2-11-1- المواد والمحاليل المستخدمة:
محلول (A) كربونات الصوديوم 2%: حضر بإذابة 2 غ من Na2CO3 يكمل إلى 100 مل
من محلول هيدروكسيد الصوديوم N 0.1) NaOH (.
محلول (B) كبريتات النحاس 1%: حضر بإذابة 1 غ من كبريتات النحاس .CuSO4
5H2O يكمل إلى 100 مل من الماء المقطر.
محلول (C) ط رطرات الصوديوم والبوتاسيوم 2%: حضر بإذابة 2 غ من ط رطرات الصوديوم
والبوتاسيوم تكمل إلى 100 مل من الماء المقطر.
محلول (D) مزيج من المحاليل B و C محضرة آنيا بنسبة )1:1(.
محلول الكاشف (E)الذي يتكون من مزيج من المحاليل D و A محضرة آنيا بنسبة )1: 50(
70
كاشف فولن Folin–Ciocalteu phenol: يخفف بنسبة )1 كاشف: 2 ماء مقطر(
محلول البومين المصل البقري الخزين (BSA) بتركيز 2 مغ/مل ماء مقطر.
3-2-11-2- تحضير المنحنى القياسي لتقدير تركيز البروتين
حضرت تراكيز متدرجة من محلول BSA تراوحت من )0 – 0.45 مغ /مل) بإجراء
التخافيف الالزمة لمحلول BSA )2 مغ/مل( بالماء المقطر وكما موضح في الجدول )14(
الجدول )14( تراكيز محلول BSA القياسي:
رقم األنبوب محلول BSA الخزين بتركيز 2 الماء المقطر تركيز محلول BSA 1 مغ/مل0 )مل( 1)مل( 0.0 )مغ/مل( 0.05 0.975 0.025 2 0.1 0.95 0.05 3 0.15 0.925 0.075 4 0.2 0.9 0.1 5 0.25 0.875 0.125 6 0.3 0.85 0.15 7 0.35 0.825 0.175 8 0.4 0.8 0.2 9 0.45 0.775 0.225 10 أضيف لكل 0.5 مل من هذه التراكيز 2 مل من محلول الكاشف (D) المحضر آنيا مع
المزج الجيد. تركت النماذج مدة 10 دقائق بدرجة حرارة الغرفة. أضيف 0.5 مل من محلول
كاشف فولن مع المزج. بعد مرور 30 دقيقة قيست االمتصاصية عند طول موجة 500 نانومتر
ومنها رسم المنحنى القياسي للعالقة بين تركيز BSA )ملغم/مل( واالمتصاصية.
71
3-2-11-3- تقدير تركيز البروتين في المستخلص اإلنزيمي:
أضيف إلى 2 مل من المحلول أو المستخلص اإلنزيمي 3مل من محلول ثالثي كلورو
حمض الخل (TCA) بتركيز 5% وخضع إلى عملية النبذ المركزي بسرعة 3000 دورة/دقيقة
مدة 10 دقائق، وبعد التخلص من الرائق أذيب الراسب في 2 مل من محلول هيدروكسيد
الصوديوم بتركيز )N 0.05) ، ونقل 0.2 مل منه إلى 0.3 مل من الماء المقطر وعومل
حسب الخطوات المذكورة في الفقرة )3-2-11-2 .( قيست االمتصاصية في جهاز المطياف
الضوئي عند طول موجة 500 نانومتر مقابل المحلول الشاهد المؤلف من كمية من محلول
هيدروكسيد الصوديوم بتركيز )N0.05) تعادل كمية المستخلص اإلنزيمي ثم خفف إلى 0.5 مل
بالماء المقطر. (Muhyaddin et al., 2008(
3-2-12- طريقة الرحالن الكهربائي للبروتين باستخدام طريقة Poly Acrylamide Gel)
:SDS-PAGE Electrophoresis)
اتبعت طريقة الترحيل الكهربائي في هالم متعدد اكريالميد تبعا لطريقة Laemmli
(1970) والموصوفة من قبل (Garfin (1990 و Rath وآخرون (2009) في اختبار نقاوة
اإلنزيم، حيث تعتبر هذه الطريقة من أهم طرائق الفصل لالستدالل على نقاوة البروتين ووزنه
الجزيئي وبما أن جزيئات البروتين مختلفة في الشكل والوزن الجزيئي و الشحنة يتم في البداية
تغيير طبيعتها، حيث تقوم مادة الـ SDS بتوحيد شحنة البروتينات فتصبح ذات شحنة سالبة، وعند
تحميل خليط البروتينات على هالم الـ Polyacrylamide تتعرض للتيار الكهربائي فتهاجر
البروتينات باتجاه القطب الموجب ثم تفصل بعدها بواسطة الغربلة الجزيئية molecular )
(sieving تبعا للوزن الجزيئي من ثم يتم تظهير حزم البروتين باستخدام صبغة خاصة، ويمكن
72
معرفة وزن البروتين الناتج بمقارنة المسافة التي يقطعها جزيء البروتين على هالم الفصل مع حزم
من الجزيئات البروتينية معلومة الوزن الجزيئي.
3-2-12-1- المواد والمحاليل المستخدمة: (Garfin,1990)
المحلول الموقي لهالم الفصل (separating gel buffer (pH = 8.8 : حضر بتركيز 1.5
N وذلك باذابة 18.2 غ من ) Tris في 80 مل من الماء المقطر وعدل الرقم الهيدروجيني
إلى 8.8 باستخدام N 1 من حمض كلور الماء )N 0.1( وأكمل الحجم إلى 100مل بالماء
المقطر.
المحلول الموقي لهالم الرص (Stacking gel buffer (pH=6.8: حضر بتركيز N 0.5
وذلك بإذابة 6 غ من Tris في 40 مل من الماء المقطر وعدل الرقم الهيدروجيني إلى 6.8
باستخدام N 1 من حمض الهيدروكلوريك وأكمل الحجم إلى 100 مل بالماء المقطر.
محلول الترحيل(Electrode buffer (pH=8.3 : ويتكون من 3.03 غ من الـ Tris ، 14.4غ
غاليسين، و 1غ SDS تحل جميعها بالماء المقطر ويكمل الحجم إلى لتر.
محلول اكريالميد Acryl amide stock solution : حضر بإذابة 30 غ من أكريالميد مع
0.8 غ من Bis–أكريالميد Bis-acryl amide في 60 مل من الماء المقطر اكمل الحجم
إلى 100مل بالماء المقطر، وحفظ في الثالجة.
محلول SDS 10%: أذيب 10 غ من )SDS( في كمية من الماء المقطر وأكمل الحجم إلى
100 مل بالماء المقطر. 73
محلول بيرسلفات االمونيوم APS) Ammonium Per Sulphate): حضر آنيا بتركيز
1.5% وذلك بإذابة 0.15 غ من (APS) في 10 مل من الماء المقطر.
تيميد N,N,N,N-tetra mmethyl ethylene diamine) TEMED) وهو جاهز
لالستعمال.
محلول التثبيت Fixing solution : حضر بمزج 50 مل كحول الميثيل مع 10مل حمض
الخل و 40 مل ماء مقطر.
محلول التصبيغ Staining Solution : حضر باذابة 0.25 غم من صبغة كوماسي الزرقاء
في 250 مل من خليط مكون من حمض الخل : كحول المثيل : الماء المقطر بنسبة 1 : 4 :
5 على التوالي.
محلول إزالة الصبغة Destaining solution: يتكون من خليط من حامض الخليك : كحول
المثيل : ماء مقطر بنسبة 1 : 4 : 5 على التوالي.
محلول صبغة بروموفينول االزرق Bromo phenol blue %0.25 وحضر بإذابة 0.25 غم
من صبغة بروموفينول االزرق في 100مل من محلول 50% من الغليسرول.
3-2-12-2- طريقة الرحالن الكهربائي إلنزيم GI باستخدام SDS-PAGE:
تجمع األج زاء الخاصة بالرحالن الكهربائي، وتثبت الش رائح داخل إطار الصب باستخدام المالقط
الجانبية، يتم تحضير الهالم بنوعيه :هالم الفصل بتركيز13.5 % بولي أكريالمايد، وهالم الرص
بتركيز4.5 % بولي أكريالمايد حسب الجدول (15) وبدون إضافة المادتين (APS) و
TEMED لحين صب الهالم في القالب بين الشريحتين مباشرة ;Rath et al., 2009) .
Laemmli, 1970) 74
الجدول )15( مكونات هالمة الفصل وهالمة الرص واألحجام المستخدمة:
المادة الحجم المستخدم لتحضير الحجم المستخدم لتحضير
هالمة الفصل هالمة الرص
هالم األ كريالمايد 16.25 مل 3.25 مل
H2O 11.125 مل 8.5 مل
Tris 9.375 مل )pH=8.8 ،N 1.5( 1.5625مل)pH=6.8 ،N 1(
SDS 10% 0.375 مل 0.125 مل
APS 10% 0.375 مل 0.125 مل
TEMED 30 ميكروميتر 25 ميكروميتر
يتم صب محلول هالم الفصل حتى الخط الظاهر على الطبق الزجاجي ( يحدد بوضع المشط قبل
الصب ثم يرسم خط أسفله بمسافة 1 سم.)
يتم التخلص من الفقاعات الهوائية بعد االنتهاء من الصب بإضافة كمية من الماء المقطر على
سطح الهالم، ثم يترك الهالم ليتصلب مدة 30 دقيقة.
حضر هالم الرص وأضيف إلى القالب بعد أن يجفف الماء المقطر باستخدام ورق الترشيح
ويوضع المشط داخل الفراغ بين الشريحتين يترك لمدة 20 دقيقة، من ثم يتم سحب المشط من
الهالم بحرص حتى ال تنكسر اآلبار المتشكلة.
يفصل اإلطار من قالب الصب وتثبت الشريحتان داخل جهاز الرحالن عن طريق حامل يوضع في
خ زان الفصل (Bio-Rad tank- California).
75
يمأل الف راغ داخل الحامل بمحلول الترحيل ويجري تحميل العينات بمقدار 25 ميكروليتر ممزوجة
بالصبغة الدالة على الرحالن في اآلبار أعلى الهالمة، يتم توصيل مزود الطاقة بإغالق ا الخزن
وتوصيل األقطاب الموجبة والسالبة في أماكنها الصحيحة، ويضبط التيار على 220 فولط وتستمر
عملية الرحالن لمدة ساعتين، وبعد وصول الصبغة إلى قمة الهالمة يتم نزع الحامل من خ زان
الفصل واخراج الهالم من بين الش رائح.
يوضع الهالم في حوض التلوين ويضاف محلول التثبيت يغسل الهالم عدة مرات بالماء المقطر
إل زالة آثار محلول التثبيت، يوضع الهالم في محلول التصبيغ لمدة 30 دقيقة حتى ظهور الحزم
بشكل واضح.
يقدر الوزن الجزيئي للبروتينات المفصولة بالمقارنة مع بروتينات قياسية معروفة الوزن الجزيئي
تتراوح أوزانها بين 20-120 كيلو دالتون، والجدول )16) يبين البروتينات القياسية المستخدمة
.(Biotech-Australia)
الجدول )16( البروتينات القياسية المستخدمة لتقدير الوزن الجزيئي للـ GI بطريقة -SDS
:PAGE
البروتين القياسي مصدره وزنه الجزيئي )كيلو دالتون(
120.0 E.coli β- galactosidase 85 bovine plasma BSA 50 chicken egg white Ovalbumin 36 bovine erythrocytes Carbonic anhydrase 28 bovine milk β- lactoglobulin
21 chicken egg white Lysozyme
و لتحديد الوزن الجزيئي للبروتينات يتم رسم المنحني القياسي، حيث تجرى عملية الرحالن
الكهربائي للبروتينات القياسية معروفة الوزن، ويتم فصلها وقياس مسافة الرحالن. 76
يعتمد رسم المنحني القياسي على حركية البروتينات في الهالمة، والتي تكون متناسبة عكسيا مع
ل وغاريتم وزنها الجزيئي، ويمثل المنحني القياسي قيم ل وغاريتم الوزن الجزيئي( المعروف )مقابل
الحركية النسبية لتلك البروتينات( التي تم تحديد أماكنها)
حسبت الحركة النسبية Rf) Relative mobility) لحزم البروتينات القياسية ولإلنزيم من
D R protein المعادلة االتية: f D dye
حيث تمثل DProtein مسافة رحالن البروتين، وتمثل Ddye مسافة رحالن الصبغة
.(Boguth et al., 2000)
3-2-13- التطبيقات العملية لـ GI:
تم استخدام اإلنزيم المنتج في هذه الدراسة و المنقى جزئيا إذ تم تطبيقه على الغلوكوز
النقي و شراب الذرة السكرية حيث أضيف إلى 50 مل من هذه المواد المحضرة بتركيز %20
في موقي فوسفات البوتاسيوم 10 مل من محلول كبريتات المغنسيوم و 5 مل من محلول اإلنزيم
الخام وحضن محلول التفاعل في 60م مدة 45 ساعة مع التحريك المستمر في حاضنة هزازة.
أجري الكشف النوعي عن نواتج التفاعل بطريقة كروماتوكرافيا الطبقة الرقيقة TLC.
3-2-13–1 طريقة كروماتوكرافيا الطبقة الرقيقة Thin layer chromatography
:TLC
للكشف النوعي عن نواتج التحول اإلنزيمية استعملت صفائح زجاجية جاهزة من رقائق
110 0.25 Silica gel بسماكة مم. جففت الصفائح ونشطت في فرن بدرجة حرارة ْم مدة
ساعة ونصف.
77
وضعت نواتج التحول اإلنزيمية وبوجود نماذج قياسية للمقارنة على بعد 2 سم من الحافة
السفلى للصفيحة وبشكل بقع متساوية الحجم وبتركيز 10 ميكروليتر وأجريت عملية التجفيف
المباشر للبقع باستعمال مجفف الشعر الحراري واستعمل خليط من خالت اإليثيل : بروبانول:
ماء مقطر بنسبة 1 : 5 : 1 على التوالي كطور متحرك لفصل السكريات.
شبع إناء الفصل الخاص بخليط المذيبات قبل وضع الصفائح فيه ، ترك المذيب ليصعد
مسافة 15 سم من مكان وضع العينات وجففت الصفائح بحرارة المخبر.
ورشت بعدها بخليط يتألف من Naphtharesorcinol %0.2 الذائبة في الماء وحمض
الف وسفور 85% وبنسبة حجمية 9 : 1 على التوالي ثم سخنت بدرجة حرارة 105م مدة 5
دقائق إلظهار البقع إذ أن بقع الغلوكوز تتميز بلونها األزرق بينما تتميز بقع الفركتوز باللون
البني. واستدل على مدى التحول من مالحظة سيادة اللون البني على اللون األزرق بوساطة
النظر.(Sathya and Ushadevi, 2014 (
3-2-14- التحليل اإلحصائي: - لغرض الغربلة حسبت المتوسطات الحسابية وانحرافاتها المعيارية بواقع ثالثة مكررات لكل عزلة مع حساب فروقها المعنوية وذلك على مستوى ثقة %5 باستخدام البرنامج اإلحصائي SPSS اإلصدار SPSS Statistics for ( 17 )Windows, Version 17.0 - لغرض أمثلة ظروف إنتاج إنزيم GI استخدم البرنامج اإلحصائي Menitab والتصميم االحصائي RSM في أمثلة ظروف إنتاج إنزيم غلوكوز إيزوميراز. (Muthuvelayudham and Viruthagiri, 2010 - ولتحليل نتائج الصفات الحركية لإلنزيم تم استخدام البرنامج اإلحصائي .(Zoia et al., 2008( XLSTAT 2008
78
4 - النتائج والمناقشة :
4-1- العزل:
بينت نتائج العزل وجود بكتريا Streptomyces في جميع أنواع الترب من المناطق المختلفة،
وأمكن الحصول على 70 عزلة من األكتينوميسيتات، منها 40 من البكتريا الخيطية
)Streptomyces (، وهذا يؤكد غنى التربة بأنواع بكتريا Streptomyces كما ذكر حيث تعد
التربة المخزن األساسي للكائنات الدقيقة بشكل عام ولالكتينوميسيتات بشكل خاص ,Dancer)
. 2004)
4-2-تصنيف بكتريا Streptomyces :
4-2-1- الوصف المورفولوجي لبكتريا Streptomyces :
زرعت العزالت المنتقاة في أنابيب اآلغار المائل Slants ، وجرى الكشف عن نتائج النمو
للعزالت المزروعة على اآلغار المائل خالل فترة 14 يوما من الحضانة عند درجة حرارة
30°س. تبين بعد الرجوع إلى تصنيف )Bergey and Holt, 2000( أن أربعين عزلة تنتمي
إلى بكتريا Streptomyces ، حيث بين الفحص المظهري على وسط العزل أن العزالت
أظهرت تباينا من حيث النمو و لون المشيجة الهوائية والتحتية كما هو موضح في الشكل (8)
الذي يوضح نمو بعض عزالت Streptomyces على وسط Gauza agar، و كذلك تباينت
العزالت من حيث إنتاج الصبغات أو عدمه، حيث تميزت هذه العزالت بتكوينها مستعمرات
واضحة ذات سطح مظهره جلدي أو دهني ناعم وقوام مسحوقي تفوح منها ارئحة التربة المّبْت لة
بشكل واضح.
كما لوحظ وجود مشيجة هوائية نسيجية كثيفة تكون بشكل حبيبي أو طباشيري ويختلف لون
المشيجة من نوع إلى آخر فمنها االبيض والرصاصي واالخضر الفاتح واالخضر الزيتوني 79
واالصفر، كذلك تميزت غالبية العزالت بإنتاج الصبغات ذات اللون البني أو العسلي كما فقد
بعضها اآلخر صفة إنتاج هذه الصبغات كما هو مبين في الشكل )9(.
الشكل )8( مستعمرات بكتريا Streptomyces على وسط Gauza agar
حيث: أ- ب- جـ- شكل بكتريا Streptomyces roseiscleroticus
د- شكل بكتريا acrimycini Streptomyces
هـ- شكل بكتريا Streptomyces griseomycini
80
الشكل (9) أشكال المشيجة الهوائية وانتاج الصبغات في بكتريا Streptomyces
ولدى فحص سالسل األبواغ تحت المجهر الضوئي، وجد أنها على شكل سالسل مستقيمة
قصيرة أو سالسل ملتوية كما هو موضح بالشكل )10(
الشكل )10( شكل السالسل في بكتريا Streptomyces عند الفحص المجهري بقوة تكبير 100
81
4-2-2- مقاومة العزالت للمضادات الحيوية
زرعت عزالت بكتريا Streptomyces على وسط غاوزا، ووضعت فوقها أقراص المضادات
الحيوية، ثم تم تحضينها عند درجة حرارة 30م مدة ثالثة أيام وبعد ذلك قيست أقطار تثبيط
النمو حول المستعمرات.
الجدول (17) مقاومة عزالت بكتريا Streptomyces للمضادات الحيوية
المضاد
mp
Rif
Tet
Cla
Cfz
Cip
Pen Cfx
A
العزلة R R R R 33 17 20 23 D1 R R R R 18 19 16 20 D2 R R R R R R R R D3 R R R R R R R R D4 R R R R R R R R D5 R R R R 22 15 23 14 D6 12 R R R 14 19 28 19 D7 R R R R 27 20 R R D8 R R R R 32 18 26 24 H1 R R R R R 26 R R H2 R R R R R R 19 R H3 R R R R 15 25 27 19 H4 R R R R R R R R H5 R R R R 16 16 17 13 M1 R R R R 26 23 32 R M2 R R R R 21 17 R R M3 R R R R 22 10 26 18 M4 R R R R 17 20 R R M5 R R R R 18 28 15 28 T1 R R R R 24 14 R R T2 R R R R 28 21 25 22 T3 R R R R 13 19 22 26 T4 23 R R R 18 24 29 16 T5 R R R R R R R R T6 R R R R R 28 23 27 Z1 R R R R 24 16 14 13 Z2 R R 18 R 19 26 28 18 Z3 R R R R 17 17 20 R Z4 R R R R R R R R Z5 R R R R 25 15 18 22 L1 82
R R R R 27 14 26 31 L2 R R R R 15 23 13 26 L3 R R R R 30 14 19 17 L4 R R R R R R R R R1 R R R R R R R R R2 R R R R R R R R R3 R R R R 32 26 24 21 S1 14 R R R 34 19 20 28 S2 R R R R R 15 R R S3 R R 22 R R 18 17 32 S4 حيث R:مقاومة
بينت النتائج اختالفا في أنماط المقاومة للمضادات الحيوية المستعملة كما هو مالحظ في
الجدول(17).
ويبين الشكل (11) اختالف في أقطار التثبيط ضمن العزالت وبالتالي اختالف المقاومة ألنواع
Streptomyces تجاه المضادات المدروسة ، حيث كانت العزالت متفاوتة في حساسيتها
لمضادات Tetracyclin ، Rifampicin ، Ciprofloxacin ، Clarithromycin، حيث
لم تتمكن البكتريا من النمو بوجودها ، بينما كانت العزالت مقاومة لـكل من Ceftazidim ،
Ampicillin حيث تمكنت من النمو بوجود هذه المضادات. أما بالنسبة للمضادين
Penicillin ، Cefotaxim فقد كانت أغلب األنواع مقاومة له بنسبة مرتفعة، وهذا يتفق مع
ما توصل إليه Ceylan وآخرون )2008( الذي ذكر أن بكتريا Streptomyces ت تفاوت في
مقاومتها للمضادات الحيوية . وهذا قد يعود إلى كون البكتريا منتجة أصال لهذه المضادات
وبنفس الوقت تحمي نفسها من تأثير المضادات التي تنتجها بآلية مقاومة المضادات المختلفة.
كما أوضح الباحثان Freeman و Hopwood (1978) قدرة بكتريا Streptomyces rimosus على إنتاج ومقاومة مضاد أوكسي تت ارسيكلين بنفس الوقت واستنادا إلى ذلك فقد ذكر
83
العديد من الباحثين أن مورثات مقاومة المضادات الحيوية في مختلف أنواع البكتريا الممرضة
أصلها مورثات من جرثومة Streptomyces التي تنتج ذلك المضاد )فيصل، 2010(.
الشكل )11( مقاومة بعض عزالت Streptomyces ألنواع مختلفة من المضادات الحيوية
4-2-3- قابلية تمثيل السكريات من قبل عزالت Streptomyces المعزولة محليا ً
يبين جدول )18( قابلية العزالت المدروسة للنمو على وسط غاوزا الذي أضيف له السكريات
المذكورة كمصدر وحيد للكربون.
84
الجدول )8 (1 قابلية عزالت Streptomyces على استخدام وتمثيل السكريات:
se
se السكر o
Xylose
rabinose
Gluco
Fructose
Mannitol
-
Galact
control
A
Inositol
-
Sucrose
- -
-
Raffinose
D
-
Rhamnose
D
D
D
D
L
العزلة + + + + _ + + _ D1 _ _ _ + + + + + + + + + + _ D2 + _ + _ + + + + + + _ D3 + + + + + + + _ D4 + + + + + + + + + + + + + _ D5 + + + + + + + _ + + _ D6 _ + + + + + + _ + + _ D7 + + + + + + + + + + _ D8 + + + + + + + + + + _ H1 _ + + _ + + + + + + _ H2 _ + + _ + + _ + + + _ H3 _ H4 + + + + + + + + + + _ _ + _ + + + + + + _ H5 + + + + _ + + _ M1 _ _+ _ + + + + + + _ M2 _ _ _ _ + + + + + _ M3 _ _ _ _ _ + + + + + + + _ + + _ M4 + + _ + + + + + _ M5 _ _ + _ _ + + + + + + _ T1 + _ + + _ + + _ + + + _ T2 + + + + + + + _ + + _ T3 _ + + _ _ + + + + + _ T4 + + + + + + + + + + _ T5 + + _ _ + + _ + + + _ T6 + + + + + + + + + _ Z1 _ _ Z2 _ _ + _ _ + + _ + + + + + + + + + _ + + _ Z3 _ + + + + + + + + + _ Z4 + + + _ + + + + + _ Z5 _ _ + + _ + + + + + + _ L1 _ + + _ + + + _ + + _ L2 _ + + + + + + _ + + _ L3 _ _ + _ + + + _ + + _ L4 _ + + _ + + + + + + _ R1 + + + + + + _ + + + _ R2 _ + _ + + + + + + _ R3 + + + + + + + + _ + + _ S1 + + _ + + + + + _ S2 ______+ _ _ + _ S3 _ _ + + _ + + + + + _ S4 _ _ 85
- ال نمو + نمو control: الشاهد
وبناء على االختبارات السابقة وباالعتماد على الجدول )18( أكدت النتائج أن أربعين عزلة من
العزالت المدروسة تنتمي للجنس Streptomyces، وكما هو مالحظ أن جميع أنواع
Streptomyces استطاعت النمو بوجود سكر الغلوكوز والفركتوز كمصر كربوني وهو معيار
مهم في التصنيف، بينما تفاوتت أنواع Streptomyces في النمو على األنواع األخرى من
السكريات، وأمكن تصنيف 33 عزلة منها على مستوى النوع حيث توزعت على 29 نوع مختلف
من الجنس المذكور أما األنواع السبعة المتبقية فصنفت فقط على مستوى الجنس، وبمقارنة
النتائج المذكورة في الجدول (18) مع تصنيف Bergey et al., 2012( Bergey( مع ماسبق
من اختبارات (4-2) يمكن القول بأن العزالت تابعة لجنس Streptomyces وعائدة لألنواع
الموضحة في الجدول)19(.
الجدول ) (19 تشخيص عزالت بكتريا Streptomyces على مستوى النوع:
عزالت تربة دمشق العزلة النوع Streptomyces acrimycini D1 Streptomyes microflavus D2 Streptomyces roseiscleroticus D3 Streptomyces cyanoalbus D4 Streptomyces hirsutus D5 Streptomyces sp. D6 Streptomyces castaneoglobisporus D7 Streptomyces janthinus D8 Streptomyces flaveolus H1 عزالت تربة حماة Streptomyces sp. H2 Streptomyces spheroids H3 Streptomyces caracoi H4 Streptomyces daghestanicus H5 Streptomyces sp. M1 عزالت تربة حمص Streptomyces ogaensis M2
86
M3 pseudovenezuelaeStreptomyces Streptomyces sp. M4 Streptomyces cellulosae M5 Streptomyces piedadensis T1 عزالت تربة تدمر
Streptomyces fluorescens T2 Streptomyces janthinus T3 Streptomyces cellulosae T4 Streptomyces albochromogenes T5 Streptomyces castaneoglobisporus T6 Streptomyces cyanoglomerus Z1 عزالت تربة دير الزور Streptomyces albovirids Z2 Streptomyces coerulatus Z3 Streptomyces sp. Z4 Streptomyces coerulatus Z5 Streptomyces rubrolavendulae L1 عزالت تربة الالذقية Streptomyces lazureus L2 Streptomyces indigocolor L3 Streptomyces microflavus L4 Streptomyces griseomycini R1 عزالت تربة درعا Streptomyces coeliatus R2 Streptomyces mitakaensis R3 Streptomyces coerulatus S1 عزالت تربة السويداء Streptomyces sp. S2 Streptomyces syringae S3 Streptomyces sp. S4 حيث يالحظ غنى التربة باألنواع المختلفة من Streptomyces إذ تم التوصل إلى 27 نوع
مختلف وسبعة عزالت صنفت على مستوى النوع وتوزعت هذه األنواع كما يلي:
3 عزالت S.coerulatus، 2 من S castaneoglobisporus، 2 من S.cellulosae، 2
من S. hirsutus، 2 من S.microflavus ، بينما لم يتكرر وجود األنواع األخرى في الترب
المختلفة وهذه األنواع هي: S. cyanoalbus ،S.roseiscleroticus ،S.acrimycini،
S. daghestanicus ،S. caracoi ،S.spheroids ،S. flaveolus ،S.janthinus، 87
S. fluorescens ،S.piedadensis ،S.pseudovenezuelae ،S.ogaensis،
S. rubrolavendulae ،S.albovirids ،S.cyanoglomerus ،S.albochromogenes،
S. mitakaensis ،S.coeliatus ،S.griseomycini ،S.indigocolor ،S.lazureus،
.S.syringae
هذا يؤكد غنى التربة بأنواع بكتريا Streptomyces ، حيث تمكن Antonieta وآخرون
(2006) من الحصول على 67 ساللة جديدة من Streptomyces من أصل 71 عزلة
ويعود السبب في ذلك إلى أن معظم أعضاء عائلة Streptomyces تجد في التربة الظروف
المناسبة للنمو و إنتاج المواد الفعالة، و ربما ال تكون هذه الظروف هي المثالية لكنها تسمح لها
بالتنافس الناجح مع الكائنات الدقيقة األخرى إذ أن Streptomyces قادرة على إفساد و تحليل
بقايا مكونات النباتات و الحيوانات، كما أنه من السهل إشباع حاجتها بالمصادر النتروجينية غير
العضوية وهي ال تتطلب من أجل نموها فيتامينات أو محفزات نمو وبالتالي فهي توجد بشكل
كبير في التربة. (Hodgson, 2000(.
4-3- غربلة عزالت Streptomyces إلنتاج إنزيم GI:
4-3-1- الغربلة األولية
أعيدت تنمية العزالت على الوسط األساس الصلب الحاوي على سكر زيلوز كمصدر وحيد
للكربون وعند درجة حرارة 30 °س لمدة ثالثة أيام، مع متابعة يومية لكثافة نموها الظاهري وهي
صفة هامة اتخذت معيا ا ر للتمييز في مرحلة الغربلة األولية وكما هو موضح في الجدول )20(
أظهرت الغربلة األولية أن جميع العزالت تمتلك القدرة على إنتاج إنزيم GI إال أن ثالثة عشرة
منها كانت ضعيفة النمو لذلك استبعدت هذه العزالت في مرحلة الغربلة الثانوية.
88
الجدول )20( كثافة نمو عزالت بكتريا Streptomyces المنتجة إلن زيم غلوكوز إيزوميراز:
العزلة العزلة العزلة العزلة
النمو كثافة النمو كثافة النمو كثافة النمو كثافة النمو
S.lazureu S.janthinus S.spheroids S.acrimycini + s ++++ ++ +++ S.indigoc S. cellulosae S.caracoi S. microflavus +++ olor ++ ++++ ++ S.microfl S.daghestanicus S. roseiscleroticus + avus ++ S.albochromoge + ++++ nes S.griseo S.castaneoglobis Streptomyces sp. S.cyanoalbus + mycini ++++ porus + + S.coeliat S.cyanoglomerus S.ogaensis S.hirsutus ++++ us ++ + ++++ S.mitaka S.albovirids S.pseudovenezuelae Streptomyces sp. + ensis + ++ +++ S.coerul S.coerulatus Streptomyces sp. S.castaneoglobispo ++ atus ++ ++++ + rus Streptom Streptomyces sp. S.cellulosae S.janthinus + yces sp. + ++ +++ S.syringa S.coerulatus S.piedadensis S.flaveolus +++ e ++ +++ +++ Streptom S.rubrolavendul S.fluorescens Streptomyces sp. + yces sp. ++ ae ++++ ++++ )+( نمو ضعيف ، )++( نمو متوسط )+++( نمو جيد ، )++++( نمو كثيف
إن البيئات الطبيعية تعد مصادر أساسية للبكتريا الخيطية المنتجـة إلنـزيم GI والسـيما تربـة
حقــول الـــذرة الصــفراء وتربـــة اشــجار الصـــنوبر. إذ يعتقـــد ان المــادة الخشـــبية المكونــة لســـيقان هـــذه
النباتات غنية بالزيالن الذي يعد المكون الرئيس للهيمي سليلوز كما أن الزيالن يتألف من وحدات
من الزيلوز المرتبطة مع بعضها بآصرة (Gong et al., 1981( (β-1,4( وأن الزيلوز يعـد مـادة
حاثــة إلنتــاج إنــزيم غلوكــوز ايزوميريــز مــن قبــل الكثيــر مــن االجنــاس التابعــة للبكتريــا الخيطيــة
.)Belfaquih and Penninckx, 2000 ; Givry and Duchiron, 2007)
89
4-3-2- الغربلة الثانوية:
قدرت الفعالية اإلنزيمية للعزالت السبعة والعشرين وتم الكشف عن تركيز الفركتوز الناتج عنها
وفق طريقة Disch وBorenfreun (1951) وباالستعانة بالمنحني القياسي لتركيز الفركتوز
.(Rahman, 2008) 4-3-2-1- المنحني القياسي للفركتوز:
حضرت ت راكيز متدرجة من ال فركتوز حسب Rahman (2008) وقيست االمتصاصية
عند طول الموجة 560 نانومتر، رسم المنحنى القياسي لقيم االمتصاصية مقابل تركيز الفركتوز
كما في الشكل )12( ، حيث تبين النقط قيم االمتصاصية المقاسة تبعا لتركيز ال فركتوز، ويبين
الخط المستقيم المالءمة الخطية وفقا للعالقة Y= 0.789X – 0.013، حيثY قيمة
االمتصاصية الضوئية على طول موجة 560 نانو متر، و X تركيز الفركتوز.
الشكل )12( المنحنى القياسي لتركيز الفركتوز باستخدام Cysteine-carbazole
90
4-3-2-1- قياس فعالية إنزيم GI:
يبين الجدول رقم )21( الفعالية اإلنزيمية للعزالت السبعة والعشرين المتفوقة مقدرة
بالوحدة/مل، حيث بينت الدراسة اإلحصائية وجود فروق معنوية في الفعالية اإلنزيمية للعزالت
على مستوى ثقة 5% باستخدام تحليل التباين ANOVA ، وباستخدام أقل فرق معنوي، فبلغت
أعلى قيمة للفعالية 5.2±0.35 وحدة/مل للعزلة S.roseiscleroticus D3 المعزولة من تربة
دمشق ، بينما كانت أدنى قيمة 1.9± 0.2 وحدة/مل للعزلة S.canarius D2.
وبالنتيجة تميز النوع S.roseiscleroticus بقدرته العالية على إنتاج إنزيم GI حيث
بلغت الفعالية اإلنزيمية 5.2وحدة/ مل.
91
الجدول )1 (:2 الفعالية اإلنزيمية لعزالت Streptomyces مقدرة بالوحدة/مل:
العزلة متوسط الفعالية االنزيمية )وحدة/مل(± االنحراف المعيا ري 0.3 ± 3.5f Streptomyces acrimycini 0.2 ± 1.9k Streptomyes microflavus 0.35 ± *5.2a Streptomyces roseiscleroticus 0.3 ± 3.9d Streptomyces cyanoalbus 0.3 ± 3.5f Streptomyces hirsutus g 0.26 ± 3.3 Streptomyces janthinus 0.2 ± 3.7e Streptomyces flaveolus 0.3 ± 4.6b Streptomyces sp. 0.2 ± 3.2g Streptomyces spheroids 0.3 ± 4.1c Streptomyces caracoi 0.4 ± 2.4j Streptomyces pseudovenezuelae 0.3 ± 4.6b Streptomyces sp. 0.3 ± 2.3j Streptomyces cellulosae 0.2 ± 3.6e Streptomyces piedadensis 0.3 ± 4.5b Streptomyces fluorescens 0.3 ± 4.1c Streptomyces janthinus 0.36 ± 2.4j Streptomyces cellulosae 0.3 ± 2.7i Streptomyces albochromogenes 0.3 ± 3.7e Streptomyces castaneoglobisporus j 0.4 ± 2.3 Streptomyces cyanoglomerus g 0.2 ± 3.3 Streptomyces coerulatus i 0.3 ± 2.7 Streptomyces coerulatus g 0.3 ± 3.2 Streptomyces rubrolavendulae e 0.3 ± 3.7 Streptomyces indigocolor b 0.3 ± 4.6 Streptomyces coeliatus h 0.3 ± 2.9 Streptomyces coerulatus e 0.3 ± 3.7 Streptomyces syringae تشير األحرف المختلفة ضمن العمود إلى وجود فروق معنوية على مستوى ثقة ( P < %5(
يبين الجدول (21) أن سبع عزالت من أصل 24 عزلة كانت فعاليتها اإلنزيمية جيدة
حيث تراوحت بين 4.1 -5.2 واتفقت نتائج الدراسة مع العديد من الباحثين، توافقت نتائج هذه
الدراسة مع دراسات أخرى تخص الجنس Streptomyces، إذ بينت دراسة Yassien وآخرون
(2013) أن بكتريا Streptomyce أنتجت اإلنزيم بفعالية 4.7 وحدة/مل.
92
كذلك توافقت النتائج مع ما توصل إليه و Bhasin و Modi (2012) حيث أنتجت
العزلة Streptomyces sp. SB-P1 المدروسة من قبلهما اإلنزيم بفعالية مقدارها 4.88
وحدة/مل.
وفي دراسة أخرى بلغت الفعالية اإلنزيمية للعزلة Streptomyces sp.SB – AII4
المستخدمة في دراسة أخرى لـ Bhasin وزمالئه (2013) 2.8 وحدة/مل.
تم اختيار العزلة D3 المصنفة ضمن النوع S.roseiscleroticus والتي أعطت أعلى
فعالية إنزيمية لمتابعة الدراسة عليها.
4-4- تحديد الطريقة المثلى الستخالص اإلنزيم:
اســتعملت مجموعــة مــن المنظفــات و المــذيبات العضــوية لتحطــيم الخاليــا واســتخالص إنــزيم
غلوكــوز ايزوميريــز مــن بكتريــا S.roseiscleroticus نظــ ا ر لبســاطة هــذه الطريقــة وقلــة تكاليفهــا
مقارنة مع الطرائق الميكانيكية واإلنزيمية ) ;Dhungel et al., 2007; Bhasin et al., 2013
Chen et al., 1979( ، وقــد اشــتملت تلــك المــواد علــى الكلوروفــورم والتــوين 80 و)SDS(
و)DMSO( و )CTAB( بتركيز 0.1% كال على حده.
وأظهــــرت النتــــائج الموضــــحة فــــي الشــــكل )13( أن المركــــب CTAB يعــــد أفضــــل منظــــف
محطــم لجــدار الخاليــا يمكــن اســتعماله الســتخالص اإلنــزيم مــن البكتريــا قيــد الدراســة حيــث بلغــت
فعاليــة اإلنــزيم فــي المســتخلص 5.57 وحــدة/مل فــي حــين تراوحــت الفعاليــة اإلنزيميــة بــين -2.64
4.15 وحــدة/مل فــي مستخلصــات المنظفــات األخــرى. لــذا تــم اختيــار المركــب )CTAB( ســتايل
تـري ميثيـل أمونيــوم برومايـد لتحطــيم جـدار الخاليـا فــي بكتريـا Streptomyces السـتخدامه فــي
استخالص اإلنزيم ألنه أعطى أعلى فعالية إنزيمية وبسبب عدم تأثيره على فعالية اإلنزيم.
93
الشكل )13( مقارنة كفاءة المواد المختلفة في استخالص إنزيم غلوكوز إيزوميريز المنتج من
بكتريا S. roseiscleroticus
وتتفــق هــذه النتــائج مــع Bhasin وآخــرون (2013) حيــث أشــاروا إلــى أن أفضــل الطــرق
الكيميائيــة الســتخالص إنــزيم GI هــي باســتعمال ســتيل ثالثــي بروميــد األمونيــوم )CTAB ( فقــد
ارتفعــــت الفعاليــــة اإلنزيميــــة بمقــــدار 80% عنهــــا لــــدى اســــتخدام المــــواد األخــــرى مثــــل التــــوين 80
والتريتــون X100 و SDS والغليســيرول و NaCl بينمــا كانــت أفضــل الطــرق الميكانيكيــة هــي
طريقة التكسير بالموجات فوق الصوتية مقارنة مع استخدام الطحن الميكانيكي .
يعـــود الســـبب فـــي أفضـــلية اســـتعمال CTAB كمنظـــف لالســـتخالص إلـــى تركيـــب الجـــدار
الخلــوي لبكتريــا Streptomyces الــذي يــتحطم بدرجــة أعلــى فــي المنظفــات ذات الشــحنة الموجبــة
مثـــل CTAB مقارنـــة بالمـــذيبات ذات الشـــحنة الســــالبة مثـــل SDS أو المتعادلـــة مثـــل تــــوين 80
والتلــوين والمــذيب العضــوي الكلوروفــورم. وقــد كانــت النتــائج متوافقــة مــع مــا توصــل إليــه Bhasin
وآخرون (2013) حيث كان CTAB أفضل المذيبات الستخالص إنزيم GI تاله SDS بينما لم
يكن الغليسرول ذو كفاءة جيدة في استخالص اإلنزيم. 94
4-5- تطفير بكتريا Streptomyces roseiscleroticus باستخدام األشعة فوق البنفسجية:
أجريت عملية تعريض األطباق المزروعة ببكتريا Streptomyces roseiscleroticus
لألشعة فوق البنفسجية عند موجة 254 نانومتر ولمدة تراوحت من 0 – 240 ثانية وبفارق 30
ثانية بين المعاملة واألخرى لثمانية معامالت كل منها على حدا، و نالحظ من الجدول )22( أن
عدد المستعمرات ينخفض بازدياد زمن التعرض لألشعة مقارنة بعدد المستعمرات غير المعرضة
للتطفير حيث تناقص عدد مستعمرات البكتريا المطفرة بازدياد مدة تعرضها لألشعة فوق
البنفسجية وذلك من 24 مستعمرة عند زمن التشعيع 30 ثانية لتصل إلى مستعمرتين فقط عند
تعرضها لألشعة لفترة 240 ثانية حيث كان معدل البقاء 33.8% عند الزمن 30 ثانية، بينما
انخفض هذا المعدل بشكل كبير وملحوظ عند فترات التشعيع 60 و 90 و 120 و 150 و
180 و 210 و 240 ثانية ليصبح 28.2 و 23.9 و15.5 و11.3 و 9.9 و5.6 و2.8% على
التوالي. هذه النتائج تتوافق مع نتائج Abdel-Aziz وآخرون (2011)، حيث ينخفض عدد
المستعم ارت تدريجيا مع الزيادة التدريجية لفترة التعرض لإلشعاع بسبب تأثير األشعة ف وق
البنفسجية على DNA البكتيريا. واألشعة تسبب تدريجيا طفرات قاتلة أو تعطي طفرات تؤدي
إلى تخريب DNA وبالتالي تثبيط إنتاج البروتينات الضرورية لحياة الخلية (Kozak, 2005) .
95
الجدول )22( معدل البقاء لبكتريا S.roseiscleroticus بعد تعرضها لألشعة فوق البنفسجية
زمن التعرض ارتفاع مصدر األشعة معدل البقاء (Survival) لألشعة )ثانية( )سم( عددالمستعمرات % 100 71 10 0 33.8 24 10 30 28.2 20 10 60 23.9 17 10 90 15.5 11 10 120 11.3 8 10 150 9.9 7 10 180 5.6 4 10 210 2.8 2 10 240 يبين الشكل )14( زمن قتل خاليا Streptomyces اعتمادا على لوغاريتم عدد المستعم ارت
المتبقية بعد التطفير لألزمنة المدروسة ، والمعادلة الناتجة عن الخط المستقيم هي:
Y= -1.7089X+0.0055
الشكل )14( الخط البياني للوغاريتم عدد المستعمرات نسبة إلى زمن التعرض ألشعة UV
96
يوضح الجدول)23( نتائج تطفير بكتريا S. roseiscleroticus باستخدام أشعة UV،
حيث يبين الجدول تأثير التشعيع في إنتاجية اإلنزيم من كل مستعمرة مطفرة على حدا ومقارنتها
مع البكتريا الشاهد غير المعرضة للتطفير D3 والتي أعطت فعالية إنزيمية مقدارها 5.2 وحدة/
مل.
تمت المقارنة بين الطفرات )93 طفرة( في متوسط الفعالية اإلنزيمية باستخدام اختبار F
ومعنويته وحساب قيمة أقل فرق معنوي LSD وذلك على مستوى الداللة اإلحصائية %0.01
باستخدام البرنامج اإلحصائي SPSS.18.
يتضح من الجدول رقم ) (23 وجود فروق معنوية بين الطفرات عند استخدام األزمنة
المختلفة، وتم الوصول إلى إحدى عشرة طفرة أعطت فعالية إنزيمية أعلى من العزلة األصلية
التي جرى عليها التطفير، لكن تفوقت الطفرة 4 في الزمن 60 ثانية على باقي الطفرات بمتوسط
بلغ 7.44 وحدة/مل، تلتها الطفرة 4 في الزمن 90 دقيقة، ومن ثم الطفرة 6 في الزمن 180
دقيقة، واللتان كان متوسط الفعالية اإلنزيمية لهما 6.08- 6.04 وحدة /مل على التوالي، وبزيادة
بنسبة 43 و17 و 16% على التعاقب عن العزلة األصلية D3. وتفوقت الطفرات عند الزمن
240 ثانية بمتوسطاتها على باقي األزمنة األخرى في الفعالية اإلنزيمية التي بلغت 4.3 وحدة/
مل، بينما تدنت متوسطات الطفرات في الزمن 60 ثانية والتي بلغت 2.81.
بالنتيجة يتبين إمكانية تطفير البكتريا المدروسة S. roseiscleroticus إال أن الطفرة
الرابعة في الزمن 60 ثانية أعطت أعلى فعالية إنزيمية بلغت 7.44 وحدة /مل.
97
الجدول ) (23 الفعالية اإلنزيمية لطفرات العزلة S. roseiscleroticus D3 عند أزمنة مختلفة
للتشعيع بـ UV:
الزمن الفعالية اإلنزيمية الناتجة بعد فترة التعريض لألشعة بالثانية )وحدة /مل( تسلسل الطفرة 30 60 90 120 150 180 210 240 4.01 2.53 1.69 2.49 1.35 4.69 3.42 3.38 1 4.60 5.20 1.99 4.14 5.62 5.62 3.17 4.44 2 1.73 4.22 2.03 4.39 1.3 1.52 2.70 3 2 3.46 4.22 1.39 1.69 6.08 7.44* 5.62 4
1.14 2.20 2.03 1.18 2.45 1.39 5
6.04 5.87 1.14 1.69 1.35 2.11 6
4.35 5.70 3.04 2.62 2.66 3.97 7
2.32 5.79 4.01 2.37 2.32 8
2.37 2.79 5.45 3.63 9
3.59 5.66 3.80 5.20 10
2.41 1.35 2.20 1.77 11
4.73 5.62 4.39 12
2.32 2.32 3.59 13
1.61 3.04 2.49 14
3.55 3.63 3.04 15
2.20 1.35 1.86 16
4.39 4.10 4.77 17
2.37 4.10 18
3.51 2.41 19
1.90 3.21 20
4.35 21
3.55 22
4.14 23
3.68 24
172091.7 F
0.000 Sig.
0.0045 LSD
العدد المتبقي 24 20 17 11 8 7 4 2
98
المتوسط العام 3.27 2.81 3.28 3.04 3.27 3.38 3.23 4.3 تم اختيار الطفرة رقم 4 في الزمن 60ثانية والتي أعطت أعلى فعالية إنزيمية )7.44 وحدة/ مل(
مقارنة بالفعالية اإلنزيمية للعزلة األصلية Streptomyces roseiscleroticus )5.2 وحدة/
مل( أي أن هذه الطفرة حققت زيادة في إنتاج اإلنزيم بنسبة %43 مقارنة مع العزلة األصلية
وأعطيت الرمز S.roseiscleroticus-Mt4 ، وقد ذكر Suekane و Iizuka (1982) أن
ساللة مطفرة لبكتريا Streptomyces livochromogenes بالتشعيع بوساطة األشعة فوق
البنفسجية أعطت إنتاجية إنزيمية أعلى من الساللة األصلية .
تم التأكد من ثباتية الطفرة S.roseiscleroticus-Mt4 بزراعتها عدة مرات على وسط غاوزا
(3-1-3-1) ومن ثم على وسط اإلنتاج السائل (3-1-3-3) وقياس فعالية إنزيم GI فيها.
4-6- دراسة الظروف المثلى إلنتاج إنزيم GI باستخدام التصميم االحصائي RSM:
من أجل أمثلة ظروف إنتاج إنزيم GI باستخدام طريقة التخمير المغمور درس تأثير خمسة متغي رات
( درجة ح را رة التحضين، رقم الحموضة، ومدة الحضن، تركيز سكر الزيلوز، تركيز األيونات
المعدنية( على نمو الساللة المستخدمة، مع تثبيت سرعة دوران الحاضنة عند 150 دورة/ دقيقة، و
باالعتماد على التصميم اإلحصائي المشار إليه في الجدول (9) )من جزء المواد وطرائق العمل(
تم إجراء 32 تجربة، وحسبت فعالية إنزيم غلوكوز إيزوميراز كما هو موضح في الجدول (24)
الذي يبين نتائج الفعالية اإلنزيمية الناتجة من بكتريا S. roseiscleroticus-Mt4 المطفرة.
99
الجدول (24) فعالية إنزيم غلوكوز إيزوميراز المنتج من الطفرة S. roseiscleroticus-Mt4
بعد تعريضه لعدة متغيرات:
رقم التجربة تركيز تركيز األيونات رقم درجة الحرارة مدة التخمير الفعالية الزيلوز المعدنية % الحموضة س يوم اإلنزيمية غ/ل وحدة/ مل 9.13 4 25 7 0.05 10 1 8.91 4 35 7 0.05 10 2 10.48 4 35 7 0.09 10 3 7.98 4 35 7 0.05 10 4 4.52 3 40 7.5 0.07 7.5 5 9.32 4 35 7 0.05 10 6 12.01 2 35 7 0.05 10 7 8.86 4 35 7 0.05 10 8 7.60 5 30 6.5 0.07 12.5 9 8.24 4 35 7 0.05 15 10 9.59 5 30 6.5 0.03 7.5 11 9.21 3 30 7.5 0.07 12.5 12 7.65 5 30 7.5 0.03 12.5 13 5.07 4 35 8 0.05 10 14 7.73 5 40 6.5 0.07 7.5 15 10.39 3 30 6.5 0.03 20 16 11.91 3 40 6.5 0.03 7.5 17 4.18 4 35 6 0.05 10 18 8.24 4 35 7 0.01 10 19 6.80 4 35 7 0.05 5 20 6.04 5 40 7.5 0.07 12.5 21 7.86 5 30 7.5 0.07 7.5 22 5.28 3 40 7.5 0.03 12.5 23 6.84 3 30 7.5 0.03 7.5 24 9.21 5 45 7.5 0.03 7.5 25 9.20 4 35 7 0.05 10 26 11.46 3 40 6.5 0.07 12.5 27 8.87 3 30 6.5 0.07 7.5 28 8.77 4 35 7 0.05 10 29 11.03 6 35 7 0.05 10 30 8.79 4 35 7 0.05 10 31 10.77 5 45 6.5 0.03 12.5 32
100
4-6-1- تحليل التجربة
يبين الجدول )25( تأثير العوامل المدروسة )كـل عامـل علـى حـدة، ومربـع ،العوامـل والعالقـة بـين
العوامل( في الفعالية اإلنزيمية للـ GI كما يلي:
– التأثير الخطي (Linear effect) تأثير كل عامل لوحده في إنتاج اإلنزيم:
نالحــظ مــن الجــدول )25( أن قيمــة P لكــل مــن الــرقم الهيــدروجيني pH ومــدة الحضــن أقــل مــن
P < 0.05( 0.05( وبالتالي هناك تأثير خطي معنـوي لكـل مـن هـذين المتغيـرين فـي إنتـاج إنـزيم
GI ، بينمـا نالحــظ أن قيمــة P لكــل مــن درجــة حــ را رة التحضــين، تركيــز ســكر الزيلــوز و تركيــز
األيونــات األيونــات المعدنيــة كانــت أكبــر مــن P > 0.05( 0.05( وهــذا يعنــي أنــه لــيس لهــذه
المتغيرات أي تأثير معنوي على إنتاج إنزيم GI.
- Squares effect تأثير تربيع العوامل في إنتاج إنزيم GI:
نالحظ من الجدول)25( أن قيمة P لكـل مـن مربـع الـرقم الهيـدروجيني ومربـع مـدة الحضـن كانـت
أقــل مــن P < 0.05( 0.05( وذلــك يعنــي أن هنالــك تــأثير معنــوي لهــذين العــاملين فــي الفعاليــة
اإلنزيمية ولذلك تأخذ العالقة بين مربع هذه المتغي رات وفعالية اإلنزيم شكل قطع مكافئ.
- Interraction effect تأثير العوامل المتداخلة في الفعالية اإلنزيمية لـ GI:
كما هو مبين في الجدول )25( فقد كانت عالقة الرقم الهيدروجيني معنويـة مـع مـدة الحضـن كمـا
كانـت عالقـة الـرقم الهيـدروجيني مـع درجـة الحـرارة معنويـة حيـث كـان )P < 0.05( بينمـا كانـت
العالقات األخرى غير معنوية.
2 ويدل معامل االنحدار R = 86.3% على أن معادلة االنحدار للعوامـل المتغيـرة تـؤثر بنسـبة
%86.3 على مقدار التغير في فعالية األنزيم.
واعتمادا على الجدول )25( يمكن كتابة المعادلة كما يلي : 101
Y= - 206.023 -14.811 X3 +60.815 X4 +788 X3X3 – 4.245 X4X4+ 1.785 X3X4 – 0.302 X4X5
الجدول (25) التحليل اإلحصائي لتأثير االمتغيرت المدروسة في فعالية إنزيم غلوكوز إيزوميراز:
المتغير معامل التغير مربع معامل الخطأ المعياري االحتمالية الثابت 206.023- التغير63.605 للمعامل P) ( T-)3.239(0.008 تركيز الزيلوز 0.729 0.113 0.655 0.526 تركيز األيونات -137.786 278.557 -0.495 0.631 مدة الحضن -14.811 5.564 -2.662 0.022 رقم الحموضة 60.815 14.766 4.119 0.002 درجة الحرا رة 1.978 1.272 1.555 0.148 )تركيز الزيلوز(2 -0.013 0.010 -1.366 0.199 )تركيز األيونات(2 306.320 617.740 0.496 0.630 )مدة الحضن(2 0.788 0.247 3.187 0.009 )رقم الحموضة(2 -4.245 0.988 -4.295 0.001 )درجة الح را رة(2 0.006 0.012 0.476 0.643 تركيز الزيلوز× تركيز 7.012 3.377 2.076 0.062 تركيز الزيلوز× األيوناتمدة الحضن -0.112 0.068 -1.658 0.126 تركيز الزيلوز× رقم الحموضة 0.049 0.135 0.359 0.726 تركيز الزيلوز× درجة الح را رة -0.003 0.013 -0.266 0.795 تركيز األيونات × مدة -22.503 16.887 -1.333 0.210 تركيز الحضناأليونات × رقم 20.130 33.774 0.596 0.563 تركيز األيونات الحموضة× درجة -2.889 3.233 -0.894 0.391 مدة الحضنال ح× را رةرقم الحموضة 1.785 0.675 2.642 0.023 مدة الحضن × درجة الح را رة 0.017 0.065 0.256 0.803 الرقم الهيدروجيني × درجة -0.302 0.129 -2.332 0.040
الح را رة ويبين الجدول (26) التحليل اإلحصائي لتباين المتغيرات المدروسة التي تؤثر في إنتاج اإلنزيم
وجود متغير واحد خطي )Linear( على األقل من المتغيرات المفردة الخمسة معنوي ألن > P
102
(0.05(، كما يوجد متغير مربع واحد)Square( على األقل من المتغيرات المربعة الخمسة
معنوي (P < 0.05 (، ويوجد عالقة ترابط واحدة )Interraction( على األقل من عالقات
الترابط العشرة معنوية حيث (P < 0.05( .
الجدول )26( التحليل اإلحصائي لتباين المتغيرات المدروسة التي تؤثر في فعالية إنزيم GI:
درجة المجموع التسلسلي المجموع المعدل معدل متوسط المصدر P F الحرية للمربعات للمربعات المربعات االنحدار 20 122.673 122.673 6.1337 3.46 0.019 خطي 5 22.009 52.914 10.5827 5.96 0.007 تربيعي 5 60.336 59.662 11.9324 6.72 0.004 التداخل 10 40.328 40.328 4.0328 2.27 0.097 الخطأ المتبقي 11 19.526 19.526 1.7751 الخطأ في المالءمة 5 18.414 18.414 3.6829 19.87 0.001 الخطأ الكلي 6 1.112 1.112 0.1853 المجموع 31 142.2
ويبين الشكل )15( الشروط المثلى لنمو بكتريا S. roseiscleroticus-Mt4 إلعطاء أعلى
إنتاجية وفعالية من إنزيم GI وفق النتائج اإلحصائية : درجة حرارة الحضن 25 °س، والرقم
الهيدروجيني 6، ومدة الحضن 48 ساعة، وسكر الزيلوز 15غ/ل، وأيونات المغنزيوم والكوبالت
بنسبة 0.5% لكل منهما، لذلك تم تطبيق هذه الشروط وقيست الفعالية اإلنزيمية للـ GI فبلغت
11.4 وحدة/مل، وهي قريبة من فعالية اإلنزيم النظرية ) y= 12.59( المبينة في الشكل )15(.
103
الشكل )15( الظروف المثلى إلنتاج إنزيم GI من S. roseiscleroticus-Mt4 بواسطة البرنامج اإلحصائي
RSM
4-6-2- تعيين الظروف المثلى إلنتاج اإلنزيم:
4-6-2-1- تأثير سكر الزيلوز في إنتاج GI:
اســتخدمت تراكيــز مختلفــة مــن ســكر الزيلــوز ) 5-15 غ/ل ( فــي الوســط المســتخدم إلنتــاج
إنــزيم GI مــن بكتريــا S. roseiscleroticus-Mt4 قيســت الفعاليــة اإلنزيميــة مــن أجــل تحديــد
تركيز سكر الزيلوز المثالي، فكان التركيـز المثـالي هـو 15 غ/ل هـي المثلـى كمـا هـو موضـح فـي
الشــكل )15(. وقــد اســتعمل الزيلــوز بوصــفه مصــدرا للكربــون فــي وســط إنتــاج اإلنــزيم فــي المراحــل
الالحقـــة مـــن الدراســـة لكونـــه يحفـــز إنتـــاج اإلنـــزيم بمعـــدالت عاليـــة مقارنـــة مـــع مصـــادر الكربـــون
االخـرى. ;Belfaquih and Penninckx , 2000; Givry and Duchiron, 2007)
Kankiya and Pairoh, 2012)
تتباين الدراسات في تحديد أفضـل تركيـز للزيلـوز فـي إنتـاج إنـزيم غلوكـوز إ ايزوميـرز المنـتج
من بكتريا Streptomyces فقد ذكر Bhasin و Modi (2012) أنـه البـد مـن وجـود الزيلـوز
بتراكيز تتراوح بين %1.25 -0.25 في وسـط النمـو حيـث يلعـب دو ا ر محفـ ا ز إلنتـاج إنـزيم غلوكـوز
أيزوميراز . 104
وجد العبيدي )2004( أن إضـافة الزيلـوز بتركيـز 0.75% فـي الوسـط أعطـى تحفيـزا كبيـرا
إلنتاج إنزيم غلوكوز ايزوميريز من عزلة محلية من بكتريا Actinomycetes sp. ST27 .
تتوافق النتائج مع ما توصل إليه Muhyaddin وآخرون (2008) حيث بلغ إنتاج إنزيم
GI من Streptomyces sp.HM5 7.07 وحدة/مل لدى استخدام الزيلوز في وسط النمو
كمصدر كربوني بتركيز %1.5 .
كذلك كانت النتائج متقاربة مع نتائج Yassien وآخرون (2013) حيث أكدوا ضرورة
وجود سكر الزيلوز بتركيز %1 في وسط النمو إلنتاج إنزيم غلوكوز أيزوميراز من بكتريا
Streptomyces albaduncus، بينما كانت أفضل إنتاجية إلنزيم غلوكوز إيزوميريز من
بكتريا Streptomyces sp. EC10 باستعمال الزيلوز بتركيز Belfaquih and %2)
.Penninckx, 2000)
4-6-2-2- تأثير درجة الحرارة في إنتاج GI :
تشير النتائج المبينة في الشكل )15( إلى أن درجة الحرارة المثلى إلنتاج إنزيم غلوكوز إيزوميراز
كانت 25س، ويعود السبب في ذلك ألن درجة الحرارة تؤثر بشكل مباشر في معدالت كل من
النمو الميكروبي والتخليق الحيوي للمستقلبات إذ أن االنخفاض عن الحد األمثل لدرجة حرارة
اإلنتاج يؤدي إلى تباطؤ النمو وتأخير تخليق المستقلبات المطلوبة وأن ارتفاعها عن حدها قد
يؤثر سلبا في نمو الكائن الحي الدقيق وبالتالي في اإلنتاج )السواح، 2002( .
وتجدر االشارة إلى أن العديد من الباحثين استعملوا درجة حرارة 30 -25س إلنتاج إنـزيم
غلوكوز ايزوميريز من البكتريا الخيطية، توافقـت نتـائج درجـة الحـرارة المثلـى إلنتـاج إنـزيم غلوكـوز
105
ايزوميريز مع ما توصل إليه Lobanok وآخرون (1998) حيث وجـدوا أن درجـة الحـرارة المثلـى
إلنتاج GI هي 25س عند إنتاجه من عدد من العزالت التابعة لجنس Streptomyces.
كما كانت النتائج متقاربة مع ما توصل إليه Yassien (2013) وآخرون أن درجة الحرارة
المثلى لفعالية اإلنزيم هي 30م عند إنتاجه من العزلة Streptomyces albaduncus .
فيما أشار Sathya و Ushadevi (2014) إلى أن درجة الحـرارة المثلـى إلنتـاج إنـزيم غلوكـوز
إيزوميريز من بكتريا .Streptomyces sp تبلغ 37م.
4-6-2-3- تأثير الرقم الهيدروجيني pH في إنتاج GI :
أظهرت النتائج الموضحة في الشـكل )15( أن الـرقم الهيـدروجيني األمثـل إلنتـاج GI هـو 6 كمـا
يتضح من الشكل انخفاض الفعالية اإلنزيمية مع الزيادة التدريجية في أرقام الحموضة .
ويــذكر أن الــرقم الهيــدروجيني أحــد العوامــل البيئيــة التــي ينبغــي الــتحكم بــه لتحقيــق اإلنتــاج
وعلــى مســتويات عاليــة مــن اإلنزيمــات الميكروبيــة ولــيس بالضــرورة أن يتوافــق الــرقم الهيــدروجيني
األمثــل إلنتــاج إنــزيم معــين مــن األحيــاء الدقيقــة مــع الــرقم الهيــدروجيني األمثــل لنمــو تلــك األحيــاء
توافقـــا تامـــا ألســـباب تتعلـــق بالجوانـــب الفيزيولوجيـــة والو ارثيـــة لكـــل مـــن نمـــو الكـــائن وانتـــاج اإلنـــزيم
المطلـــوب وبـــاختالف الظـــروف البيئيـــة واألحيـــاء الدقيقـــة المســـتخدمة فـــي اإلنتـــاج )محـــي الـــدين ،
.)1998
تتوافق النتائج مع نتائج Hong وآخرون )1991( حيث وجد وا أن الرقم الهيدروجيني
األمثل إلنتاج إنزيم غلوكوز أيزوميريز من البكتريا Streptomyces luteogrioseus هو 6.5.
كما تتوافق مع Prashant وآخرون (2010) الذين توصلوا إلى أن الرقم الهيدروجيني األمثل
لفعالية إنزيم غلوكوز أيزوميريز من بكتريا Streptomyces هو 6.5. 106
4-6-2-4- تأثير مدة التحضين في إنتاج GI:
يالحظ من الشكل )15( أن مدة الحضن المثلى إلنتاج إنزيم GI كانت 48 ساعة وبعـدها
تدهورت إنتاجية اإلنزيم مع زيادة زمن التخمير وبالتـالي فـإن إطالـة مـدة الحضـن تعـد غيـر مجديـة
اقتصــاديا . والجــدير بالــذكر أن تــدهور إنتاجيــة اإلنزيمــات مــن األحيــاء الدقيقــة بعــد مــدة الحضــانة
المثاليـــة يعـــزى إلـــى دخـــول البكتريـــا مرحلـــة الثبـــات العـــددي ثـــم مرحلـــة المـــوت أو التحلـــل الـــذاتي
والسيما في المزارع المغلقة بسبب نفاد مكونـات الوسـط وحـدوث مجموعـة مـن التغيـرات فيهـا والتـي
تنعكس سلبا على الكتلة الحيوية وتتسبب في تحلل الخاليا وتحريـر إنزيمـات محللـة للبروتينـات قـد
تؤثر في اإلنزيم المطلوب إنتاجـه ومـن ثـم هبـوط فعاليتـه لـذلك ينصـح بوقـف عمليـات التخمـر قبـل
الوصول إلى طور الثبات عندما يراد تحضير اإلنزيمات وخصوصا الداخليـة منهـا تحـت الظـروف
المثالية إلنتاجها من الخاليا )الخفاجي ، 1990(.
تتفــق النتــائج مــع نتــائج Joo و Rhee (1997) حيــث اأشــار إلــى أن المــدة المثاليــة
للحضن للحصول إلى أقصى إنتاجية مـن بكتريـا Streptomyces chibaensis J-59 هـي 42
ساعة عند درجة حرارة 30س.
4-6-2-5- تأثير األيونات المعدنية في إنتاج GI:
يبين الشكل )15( زيادة الفعالية اإلنزيميـة إلنـزيم GI بإضـافة أيونـات المغنزيـوم والكوبالـت
كانت أفضل نسبة هي 0.05% لكل منهما و أي زيادة بعد ذلك لم تكن مجدية في هذه الفعالية.
تتفق النتائج مع ماتوصل إليه كل من Muhyaddin وآخرون (2008)، و Yassien
وآخرون (2013) بأن وجود كبريتات المغنزيوم وكلوريد الكوبالت وبتركيز %0.05 لكل منهما قد
أثر أيجابيا في نشاط إنزيم GI. كما أكد Yassien وآخرون (2013) أن وجود كل من أيونات 107
المغنزيوم والكوبالت يساهم في تحسين إنتاجية اإلنزيم. بينما كانت النسب من أيونات المغنزيوم
والكوبالت للوصول إلى أفضل فعالية إنزيمية إلنزيم GI المنتج من Streptomyces sp. CH7
هي 0.1 % و 0.01 % لكل منهما على التوالي (Kankiya and Pairoh, 2012(، كذلك
تتطابق النتائج مع نتائج Dhungel وآخرون (2007) حيث وجدوا أن التراكيز األفضل من
أيونات المغنزيوم والكوبالت للحصول على أعلى فعالية إنزيمية إلنزيم GI المنتج من بكتريا
Streptomyces كانت %0.05.
وبصــورة عامــة فـــإن وجــود األيونــات المعدنيـــة الموجبــة ثنائيــة التكــافؤ يعــد ضــروريا إلنتـــاج
إنــزيم غلوكــوز إيزوميــراز ويعتمــد نــوع تلــك األيونــات المطلوبــة علــى نــوع الكــائن المجهــري المنــتج
لإلنزيم )Lama et al., 2001( وعلى هـذا األسـاس فقـد تباينـت الدراسـات فـي تحديـد نـوع االيـون
الذي يجب أن يضاف للوسط المستعمل في إنتاج اإلنزيم.
4-7- دراسة بعض صفات إنزيم GI المنتج من بكتريا S. roseiscleroticus-Mt4:
تم تحليل كافة نتائج هذا الجزء من التجارب باستخدام البرنامج اإلحصائي XLSTAT
)Zoia et al., 2008) وبواقع ثالثة مكررات لكل تجربة
4-7-1- درجة الحرارة المثلى لفعالية ا إل نزيم:
أجــري التفاعــل اإلنزيمــي بــدرجات حــرارة تراوحــت بــين 30-90 °س، فــأظهرت النتــائج كمــا هــو
موضح في الشـكل )16( تزايـد فعاليـة اإلنـزيم مـع زيـادة درجـة الحـرارة حتـى بلغـت أقصـاها عنـد
درجــة الحــرارة 60 °س إذ بلغــت الفعاليــة االنزيميــة 9.2 وحــدة/مل ثــم انخفضــت بزيــادة درجــة
الحرارة لتصل إلى 1.8 وحدة/مل عند درجة الحرارة 90 °س.
108
الشكل )16) : تأثير درجة الحرارة على فعالية إنزيم غلوكوز إيزوميراز.
أكدت نتائج التحليل اإلحصائي أن قيمة الفعالية عند درجة الحرارة 50°س تختلف اختالفا
ظاهريا )غير معنوي( عن قيمة الفعالية عند درجة الحرارة 70 °س، كذلك تختلف قيمة
الفعالية عند درجة الحرارة 30°س تختلف اختالفا ظاهريا عن قيمة الفعالية عند درجة
الحرارة 80°س. بينما تختلف قيمة الفعالية عند درجة الحرارة 60°س اختالفاَ معنوياَ عن جميع
القيم التي تم الحصول عليها عند مستوى ثقة 0.05. ويعزى ذلك إلى زيادة سرعة التفاعالت
اإلنزيمية مع ارتفاع درجة الحرارة بسبب زيادة الطاقة الحركية للجزيئات ومن ثم زيادة
التصادمات بين جزيئات اإلنزيم وجزيئات المادة األساس أما انخفاض الفعالية اإلنزيمية الشديد
عند درجات الحرارة العالية فإنه يعود إلى امتصاص الجزيئات المتفاعلة لطاقة عالية مما
يؤدي إلى تغيير تركيب اإلنزيم ومن ثم مسخه وفقدانه للفعالية تدريجيا . )Segel، 1976(.
وقد توافقت نتائج هذه الدراسة مع ما وجده Anderson وآخرون )2000( من أن إنزيم
غلوكوز ايزوميريز المنتج من بكتريا Streptomyces murinus أظهر أقصى فعالية
109
إنزيمية عند درجة الحرارة 60م أثناء حضن اإلنزيم بدرجات حرارة مختلفة مدة ساعة، كذلك
كانت درجة الحرارة المثلى لفعالية اإلنزيم هي 60م (Muhyaddin وآخرون، 2008(.
4-7-2- تحديد مجال الثبات الحراري لفعالية األنزيم:
أظهرت نتائج حضن إنزيم غلوكوز إيزوميريز المنتج من العزلة الطافرة
S.roseiscleroticus-Mt4 بدرجات حرارة تراوحت بين 90-30 °س مدة 30 دقيقة أن
اإلنزيم احتفظ بكامل فعاليته بدرجة حرارة تراوحت بين 30-60 °س )الشكل 17( ، بعدها
انخفضت الفعالية اإلنزيمية تدريجيا وفقد 35% من فعاليته تقريبا عند حرارة 70س وفقد
67% منها عند حرارة 80 °س، بينما فقد 92% من هذه الفعالية عند حرارة 90°س. ويعزى
سبب انخفاض فعالية اإلنزيم قيد الدراسة بارتفاع درجة الحرارة إلى تأثير الحرارة في تركيب
جزيئة اإلنزيم ومن ثم مسخه )Meng وزمالؤه، 1993).
الشكل )17) تأثير درجة الحرارة على ثبات فعالية إنزيم غلوكوز إيزوميراز.
110
أكدت نتائج التحليل اإلحصائي أن قيمة الفعالية اإلنزيمية عند درجة الحرارة 30°س تختلف
اختالفا ظاهريا )غير معنوي( عن مثيالتها عند درجات الحرارة 40-50-60س، وهنا
نستنتج أن الفعالية قد بقيت شبه ثابتة في هذا المجال. وقد أكد التحليل اإلحصائي أن قيم
الفعالية األخرى ذات داللة معنوية، أي أن هناك اختالف حقيقي في القيم المحددة.
تباينت الدراسات في تحديد الثبات الحراري إلنزيم غلوكوز إيزوميريز وذلك حسب مصدر
اإلنزيم، حيث وجد Suekane وآخرون (1978) أن انزيم غلوكوز إيزوميريز المنتج من
بكتريا Streptomyces olivochromogenes احتفظ بكامل فعاليته عند معاملته بدرجات
حرارة 50 -30 °س مدة 30 دقيقة ثم انخفضت الفعالية بارتفاع درجة الحرارة المعاملة إذ فقد
اكثر من 95% من فعاليته عند معاملته في80°س لنفس المدة الزمنية السابقة.
بينما وجد Belfaquih و Penninckx (2000) أن اإلنزيم المنتج من بكتريا
Streptomyces sp. EC10 أظهر ثباتا عاليا تجاه درجات الح اررة الواقعة بين 30-50°س
إذ احتفظ اإلنزيم بكامل فعاليته ولكنه فقد 70% منها عند حضنه بدرجة 70°س لمدة 60
دقيقة.
كانت النتائج قريبة مع ما ذكره العبيدي )2004( حيث توصل إلى أن درجة الحرارة المثلى
لفعالية اإلنزيم المنتج من Actinoplanes sp. 89ST27 هي 75س ويحتفظ اإلنزيم بكامل
فعاليته عند حضنه بدرجة حرارة بين 70-35س مدة 30 دقيقة، بينما بقيت 23.6% من
فعاليته عند حضنه للمدة نفسها بدرجة حرارة 80س.
111
4-7-3- الرقم الهيدروجيني األمثل لفعالية ا إل نزيم:
قدر الرقم الهيدروجيني األمثل لفعالية اإلنزيم بمدى من األرقام الهيدروجينيـة تـراوح بـين )4-11(
باستعمال محاليل موقيـة مختلفـة. وبينـت النتـائج الموضـحة فـي الشـكل )18( أن اإلنـزيم أظهـر
أعلـى فعاليـة عنـد الـرقم الهيـدروجيني 7. إذ أعطـى اإلنـزيم اقصـى فعاليـة انزيميـة مقـدارها 8.8
وحدة/مل في حين انخفضت الفعالية عند األرقام الهيدروجينية الحامضية حيث كانـت 2 وحـدة
/مل عند الرقم الهيدروجيني 4، كذلك عند االرقام الهيدروجينية القاعدية انخفضت الفعالية إلى
1.5 وحدة /مل عند الرقم الهيدروجيني11.
الشكل )18) : تأثير الرقم الهيدروجيني على فعالية إنزيم غلوكوز إيزوميراز
وأكدت نتائج التحليل اإلحصائي أن قيمة الفعالية اإلنزيمية عند الرقم الهيدروجيني 7 تختلف
اختالفا معنويا عن قيم الفعالية عند أ رقام الحموضة األخرى المستخدمة حيث تفوقت عن باقي
القيم.
112
إن سبب االنخفاض في الفعاليـة يعـود إلـى تـأثر واحـدة أو اكثـر مـن المجـاميع االيونيـة الموجـودة
في الموقع الفعال لإلنزيم بسبب تغير الحالـة االيونيـة لهـذه المجـاميع وانعكـس ذلـك علـى قابليـة
اإلنـزيم لالرتبـاط بـالركيزة (Segel, 1976) وجـاءت النتـائج متفقـة مـع مـا تـم اإلشـارة إليـه فـي
دراسات سابقة أن الرقم الهيدروجيني األمثل لفعالية إنزيم غلوكوز إيزوميريز المنـتج مـن معظـم
األنـواع التابعـة لجـنس .Streptomyces sp يتـراوح بـين Mishra and Debnath, 9-7)
(Dhungel et al., 2007; Liu et al., 1996 ;2002 أي يقــع ضــمن االرقــام
الهيدروجينيــــة المتعادلــــة القاعديــــة )Pawan وDeshpande، 2000(، كمــــا أن هــــذه النتيجــــة
تتوافق مع ما توصل إليه Yassien وآخرون )2013( في أن أفضل رقـم هيـدروجيني لفعاليـة
اإلنزيم المنتج من Streptomyces albaduncus هو 7.
كذلك كان الرقم الهيـدروجيني األمثـل لفعاليـة إنـزيم GI المنـتج مـن Thermoanaerobacter ethanolicus هي Fan et al., 2011) 7(.
4-7-4- تحديد مجال الثباتية الحمضية لفعالية اإل نزيم:
تم تعيين الرقم الهيدروجيني األمثل لثبات إنزيم غلوكوز إيزوميريز المنتج من العزلة الطافرة
S.roseiscleroticus-Mt4 بحضنه لمدة 60 دقيقة في محاليل موقية تراوحت أرقامها
الهيدروجينية بين 4 -11. أظهرت النتائج الموضحة في الشكل )19( أن الرقم الهيدروجيني
األمثل لثبات اإلنزيم يتراوح بين 7-9 إذ احتفظ اإلنزيم تقريبا بكامل فعاليته عند حضنه في
هذا المدى من األرقام الهيدروجينية في حين فقد اإلنزيم نسبة مرتفعة من فعاليته عند األرقام
الهيدروجينية الحامضية والقاعدية، حيث فقد 64% من فعاليته عند الرقم الهيدروجيني 4،
كذلك فقد 48% من هذه الفعالية عند الرقم الهيدروجيني 11.
113
الشكل )19( تأثير الرقم الهيدروجيني على ثبات فعالية إنزيم غلوكوز إيزوميراز
أظهرت نتائج التحليل اإلحصائي أن قيمة الفعالية اإلنزيمية المتبقية عند الرقم الهيدروجيني 7
تختلف اختالفا ظاهريا عن باقي القيم عند األرقام الهيدروجينية 8-9، وهنا نستنتج أن النسبة
المئوية للفعالية المتبقية بقيت شبه ثابتة في هذا المجال. وقد أكد التحليل اإلحصائي أن قيم
الفعالية األخرى ذات داللة معنوية، أي أن هناك اختالف حقيقي في القيم المحددة.
وقد يعود سبب االنخفاض في الفعالية عند القيم الهيدروجينية الحامضية أو القاعدية إلى حدوث
تغيرات في شحنة جزيئة اإلنزيم عالوة على تغير الحالة األيونية للموقع الفعال لإلنزيم عند
الحدود القصوى من الحموضة والقاعدية، حيث يعتبر مصدر اإلنزيم والطبيعة الكيميائية
للمحلول الموقي من العوامل المهمة التي تؤثر في تحديد الرقم الهيدروجيني األمثل لثبات
اإلنزيم (Anderson وآخرون 2000)، وقد تباينت نتائج الدراسات في تحديد الرقم
الهيدروجيني األمثل لثبات اإلنزيم، حيث وجد Belfaquih و Penninckx (2000) أن
اإلنزيم المنتج من العزلة Streptomyces sp. EC10 احتفظ بكامل فعاليته عند حضنه بقيم
114
من األرقام الهيدروجينية تراوحت بين 6-8، كذلك وجد Yassien وآخرون )2013( أن
اإلنزيم بقي مستق ا ر ضمن مجال من أرقام هيدروجينية تت اروح بين 7-6.5 .
4-7-5- تأثير تركيز الركيزة على فعالية األنزيم:
يبين الشكل )20( فعاليـة إنـزيم غلوكـوز إيزوميـ ارز تبعـا لتركيـز الركيـ زة )الغلوكـوز(، ويتضـح مـن
هذا الشكل زيادة النشاط اإلنزيمي بشكل تدريجي مع زيادة تركيز الركيزة، وأعلى فعالية لألنـزيم
كانت عند استخدام 0.8 م ول من الغلوكوز وبعد هذا التركيز لـم تالحـظ أي زيـادة ملموسـة فـي
الفعاليــة، وقــد توصــل Gong وآخــرون (1981) إلــى أن أفضــل تركيــز للغلوكــوز هــو 1.33
مــ ول، بينمــا وفــي دراســة أخــرى كــان أفضــل تركيــز للركيــزة هــو 0.92 مــ ول ) Ogbo and
(Odibo, 2007 ، تشــير نتــائج التحليــل اإلحصــائي إلــى أن هنــاك فــروق معنويــة فــي قــيم
الفعالية لدى استخدام الغلوكوز بتراكيز 0.2-0.4-0.6 مول، بينما كانت الفروق ظاهرية بين
قـيم الفعاليـة عنـد التراكيـز 1.2 -1.0 -0.8 عنـد مسـتوى ثقـة 0.05 والسـبب هـو تشـبع اإلنـزيم
بالركيزة ولم يتبق جزيئات إنزيمية حرة لالرتباط مع الركيزة.
الشكل )20) : تأثير تركيز الركيزة )الغلوكوز( على فعالية أنزيم غلوكوز إيزوميراز 115
4-7-6- تأثير بعض الشوارد المعدنية على فعالية األ نزيم
+2 +2 2+ 2+ يالحــظ مــن الشــكل )21( أن أيونــات الـــ ) Mg , Co , Mn ,Ca) نشــطت عمــل أنــزيم
غلوكـــوز إيزوميـــراز لكـــن كانـــت الفعاليـــة اإلنزيميـــة فـــي أقصـــى قيمـــة لهـــا عنـــد اســـتخدام مـــزيج مـــن
أيونـــات الكوبالـــت والمغنزيـــوم حيـــث كانـــت الفعاليـــة 8.8 وحـــدة/مل، أمـــا أيونـــات الفضـــة والزئبــــق
والنحــاس فقــد لعبــت ا دور مثبطــا حيــث فقــد اإلنــزيم فعاليتــه بوجــود هــذه األيونــات، وهــذا يتوافــق مــع
Fan وآخــــرون (2011) بـــــأن أفضــــل فعاليـــــة لإلنـــــزيم عنــــد إضـــــافة مـــــزيج مــــن شـــــوارد الكوبالـــــت
والمغنزيــوم، كمــا وجــد Ogbo و Odibo (2007) أن أيونــات المغنزيــوم والكوبالــت والمنغنيــز
لعبــت ا دور منشــطا إلنــزيم GI بينمــا كانــت أيونــات النحــاس مثبطــة لهــذه الفعاليــة، و أكــد التحليــل
اإلحصائي أيضاَ أن جميع قيم الفعالية هذه ذات داللة معنوية.
الشكل )21) : تأثير الشوارد المعدنية على فعالية أنزيم غلوكوز إيزوميراز
116
4-8- التنقية الجزئية إلنزيم غلوكوز إيزوميراز:
من أجل تقدير كمية البروتين بعد كل مرحلة من امرحل التنقية، تم رسم المنحني القياسي
للبروتين، حيث جرى استخدام اتركيز متدرجة من محلول ألبومين المصل البقري )BSA(
تراوحت من )0 – 0.45 مغ/مل) وقيست االمتصاصية عند طول الموجة 500 نانومتر ومنها
رسم المنحنى القياسي للعالقة بين تركيز BSA )ملغم/مل( واالمتصاصية. ;Jabur, 2004 )
Lowry, 1951)
حيث يوضح الشكل )22( العالقة الخطية بين تراكيز المحلول القياسي واالمتصاصية.
وبتعويض قيمة االمتصاصية المقاسة بعد كل مرحلة من مراحل التنقية في معادلة المنحني
القياسي يمكننا حساب تركيز البروتين الناتج.
الشكل )22( المنحني القياسي للبروتين باستخدام ألبومين المصل البقري (BSA)
117
أجريت مراحل التنقية الجزئية إلنـزيم غلوكـوز إيزوميـراز بـدءا مـن الترسـيب بملـح كبريتـات
األمونيــوم ثــم باســتخدام عمــ ود الكروماتوغرافيــا Sephadex G-100 وعمــود -Sephacryl S
200 . حيـــث أخضـــع المســـتخلص اإلنزيمـــي الخـــام لسلســـلة مـــن خطـــوات التنقيـــة تمثلـــت الخطـــوة
األولى منهـا بفصـل بـروتين اإلنـزيم عـن طريـق ترسـيبه بكبريتـات االمونيـوم علـى مـرحلتين وبنسـب
إشــباع 25% ثــم 75%، والفكــرة األساســية مــن ترســيب بروتينــات اإلنزيمــات بكبريتــات األمونيــوم
تتلخص بمعادلة الشحنات الموجودة على سطح البروتين واحداث اإلخالل )disruption( بطبقـة
المــاء المحيطــة بــالبروتين وخفــض درجــة تميئهــا (degree of hydration( ومــن ثــم انخفــاض
ذائبيــة البــروتين وترســيبه )Lide و David ، 2006(. وشــيوع اســتعمال كبريتــات األمونيــوم فــي
ترســيب البروتينــات يعــود بالدرجــة الرئيســة إلــى ذائبيتهــا العاليــة وانعــدام أو قلــة تأثيرهــا فــي تركيــب
اإلنزيم عالوة على توفرها ورخص ثمنها )Zapp, 2012 (.
وجــــد Deshmukh وShankar (2000) أن إضــــافة كبريتــــات االمونيــــوم بنســــبة إشــــباع
70% إلى المستخلص اإلنزيمي الخام لبكتريا Streptomyces thermonitrificans أدى إلى
زيادة الفعالية النوعية من 1.11 إلى 4.31 وحدة/ مغ ورفع عدد مرات التنقية إلى 3.88 مرة.
فيمـا أشــارKaneko وآخــرون (2000) إلـى أن إضــافة كبريتـات األمونيــوم بتركيــز %15
موالر إلى مستخلص اإلنـزيم الخـام المنـتج مـن Streptomyces olivaceoviridis E-86 أدى
إلى زيادة الفعالية النوعية من 2.9 إلى 8.3 وحدة/مغ ورفع عدد مرات التنقية إلى 2.8 مرة.
أخذ 5 مل من محلول األنزيم بعد الترسيب بالملح و وجرت التنقية باستخدام عمود
Sephadex G-100 مع استخدام محلول فوسفات الصوديوم الموقي بتركيز M 0.05 وبرقم
هيدروجيني 7.5 والحاوي على كبريتات المغنزيوم بتركيز M 0.005 وبسرعة جريان 36
118
مل/ساعة، وجرى قياس االمتصاصية ألج زاء بروتين األنزيم التي جمعت في أنابيب بمعدل 1
مل للجزء الواحد في كل أنبوب عند طول الموجة 280 نانومتر وحسبت فعالية األنزيم لمجموع
األجزاء التي شكلت كل قمة في طيف االمتصاص والشكل )23( يبين نتائج عملية التنقية
باستخدام عمود Sephadex G-100.
الشكل (23) نتائج تنقية GI باستخدام هالمة Sephadex G-100 ، قيست االمتصاصية
ألجزاء البروتين التي فصلت بمعدل جريان 36مل/ساعة باستخدام محلول فوسفات الصوديوم الموقي
بتركيز M 0.05 وبرقم هيدروجيني 7.5 والحاوي على كبريتات المغنزيوم بتركيز M 0.005، وتم
قياس االمتصاصية عند طول موجة λ = 280 nm ألجزاء البروتين. ثم قيست فعالية األنزيم عند كل
قمة.
يتضح من هذا الشكل أن األجزاء التي تم جمعها في األنابيب ذات األرقام بين 53-44
)10 مل( أظهرت أعلى فعالية لألنزيم . لذلك جمعت هذه األجزاء وركزت بالتجفيد حتى الحصول
على حجم 5 مل، من ثم تم إمرارها على هالمة Sephacryl S-200. 119
الشكل (24) نتائج تنقية GI باستخدام هالمة Sephacryl S-200، قيست االمتصاصية ألجزاء
البروتين التي فصلت بمعدل جريان 36 مل/ساعة باستخدام محلول فوسفات الصوديوم الموقي بتركيز
M 0.05 وبرقم هيدروجيني 7.5 والحاوي على كبريتات المغنزيوم بتركيز M 0.005، وتم قياس
االمتصاصية عند طول موجة λ = 280 nm. قيست فعالية األنزيم عند مجموع األجزاء لكل قمة.
قيست االمتصاصية ألجزاء البروتين التي فصلت عند طول الموجة nm 280 . قيست
فعالية األنزيم عند القمم المتشكلة، ويبين الشكل )24( أن األجزاء التي جمعت في األنابيب بين
27-34 أظهرت أعلى فعالية لألنزيم، وكانت القمة عند األنبوب رقم 30 ووجود قمة واحدة ذات
فعالية عالية.
ويبين الجدول )27( ملخصا لخطوات تنقية إنزيم غلوكوز إيزوميريز المنتج من
البكتريا S.roseiscleroticus-Mt4، وقد أظهرت النتائج كما هو مبين في الجدول )27(
ارتفاع الفعالية اإلنزيمية التي بلغت 15.5 وحدة/مل، كما بلغت الفعالية النوعية 32.3 وحدة/ مغ
وبعدد مرات تنقية بلغت 3 وبحصيلة إنزيمية مقدارها %11.6. 120
الجدول )27( مراحل التنقية إلن زيم GI المنتج من S.roseiscleroticus-Mt4:
الفعالية الحجم الفعالية الفعالية تركيز عدد مرات الحصيلة النوعية خطوات التنقية الناتج االنزيمية الكلية البروتين U/mg] التنقية االنزيمية % [mg/ml] [U] [U/ml] [ml] ]
المستخلص الخام 100 10.6 1060 0.97 10.93 1 100
الترسيب بكبريتات االمونيوم )-25 20 12.3 246 0.75 16.4 1.5 23.2 )%75 هالمة Sephadex 13.3 2.12 23.1 0.61 141 14.1 10 G-100 هالمة 11.6 3 32.3 0.48 124 15.5 8 -Sephacryl S 200
وقد تمكن Yassien وآخرون (2013) من تنقية إنزيم غلوكوز إيزوميراز المنتج من
بكتريا Streptomyces albaduncus بعدة خطوات تنقية تمثلت بالترسيب بملح كبريتات
األمونيوم ثم عمود التبادل األيوني DEAE- Cellulose وبعده عمود الكروماتوغرافيا 50
-Sephadex A وكانت الحصيلة اإلنزيمية 10.5% وبعدد مرات تنقية بلغت 13.3 مرة.
بينما توصل Jabur (2004) إلى إمكانية تنقية إنزيم GI المنتج من بكتريا Streptomyces sp HM5 بالترسيب بالملح وك\لك باستخدام المبادل األيوني السالب DEAE- Cellulose و
الترشيح الهالمي باستعمال هالم Sephacryl S200 وكانت الحصيلة اإلنزيمية 18.89% و
عدد مرات تنقية 5.34.
121
4-9- تعيين الوزن الجزيئي لبروتين GI باستخدام SDS-PAGE:
بعد إجراء عملية التنقية الجزئية إلنزيم غلوكوز إيزوميراز، تم االحتفاظ بحجم 25
ميكروليتر من األجزاء الناتجة عن كل مرحلة من م راحل التنقية في المجمدة عند درجة الحرا رة
-20 س، بعدها أجريت عملية الرحالن الكهربائي لهذه األجزاء )الشكل 25( حيث يبين
المسار (A) نتائج الرحالن الكهربائي لبروتينات معروفة الوزن الجزيئي، بينما يبين المسار (B)
نتيجة الرحالن الكهربائي لعينة البروتين بعد التنقية باستخدام هالمة Sephadex G-100 حيث
ظهرت مجموعة من الحزم عددها ثالثة، أما المسار (C) فيبين نتيجة الرحالن الكهربائي لعينة
البروتين بعد تنقيتها باستخدام هالم Sephacryl S-200 وقد ظهرت حزمة واحدة،
الشكل )25( نتائج الرحالن الكهربائي لألج زاء الناتجة عن مراحل التنقية (هالمة Sephadex
G-100، هالمة Sephacryl S-200( يمثل المسار A نتائج الرحالن الكهربائي لبروتينات مؤشرات
الوزن الجزيئي، ويمثل المسار B الحزم الناتجة بعد التنقية بهالم Sephadex
G-100، ويمثل المسار C نتيجة الرحالن بعد تنقية األنزيم بهالمة Sephacryl S-200. 122
و تظهر في هذا الشكل في المسار A األوزان الجزيئية للبروتينات الناتجة التي حسبت كما يلي:
في البداية رسم المنحني القياسي لبروتينات معروفة الوزن الجزيئي ) مؤشرات الوزن الجزيئي
للبروتينات ذات الوزن الجزيئي الواطئ Low molecular weight protein markers( الذي
يربط بين قيمة الحركة النسبية RF وقيمة (Log(MW ، حيث RF يمثل نسبة المسافة التي
قطعها البروتين إلى المسافة التي قطعتها الصبغة، بينما (Log(MW هو لوغاريتم الوزن الجزيئي
للبروتينات معروفة الوزن الجزيئي 20-120 كيلو دالتون.
يبين الشكل )26( المنحني القياسي الناتج . أجريت المواءمة الخطية وفقا للمعادلة المبينة في هذا
الشكل.
الشكل )26( المنحني القياسي الناتج عن الرحالن الكهربائي للبروتينات المعروفة الوزن على
هالمة SDS-PAGE 123
ثم تم حساب الوزن الجزيئي لكل حزمة في الشكل )الهالم( من خالل قياس نسبة المسافة
التي قطعتها الحزمة إلى المسافة التي قطعتها الصبغة وتعويضها في معادلة المستقيم المبين في
الشكل )26( وبالنتيجة أمكن حساب الوزن الجزيئي لإلنزيم المدروس والتي بلغت 48 كيلو
دالتون.
تباينت الدراسات في تقدير الوزن الجزيئي إلنزيم غلوكوز إيزومي ارز وذلك تبعا الختالف
مصدر اإلنزيم وطريقة القياس المتبعة، فقد بلغ الوزن الجزيئي إلنزيم غلوكوز إيزوميراز المنتج من
Streptomyces olivochromogenes E-86 45 كيلو دالتون (Kaneko et al., 2000)
وكان كذلك متوافقا مع ما توصل إليه Bhasin (2011) حيث بلغ الوزن الجزيئي إلنزيم GI
المنتج من sp. SB – P1 Streptomyces 43 كيلو دالتون ، بينما وجد Yassien وآخرون
(2013) أن الوزن الجزيئي له بلغ 54 كيلو دالتون عند إنتاجه من بكتيريا Streptomyces
.albaduncus
4-10- التطبيقات العملية لالنزيم
درست كفاءة انزيم غلوكوز إ ايزوميرز المنتج من البكتريا S.roseiscleroticus-Mt4 في
تحويــل الغلوكــوز إلــى الفركتــوز فــي خامــات صــناعية مختلفــة هــي شــراب غلوكــوز الــذرة Corn glucose syrup والغلوكوز النقي. Schenck and Bisswanger, 2000; Stephen and)
)Suraez, 2003
تــم تحضــين مــزيج التفاعــل لمــدة 45 ســاعة مــن التفاعــل )بتركيــز 20% لكــل مــن الغلوكــوز
والفركتـوز القياسـيين وكـذلك لشـراب غلوكـوز الـذرة(، اسـتعملت الطريقـة اللونيـة للكشـف عـن النتـائج
باســـتعمال صـــفائح كروماتوغرافيـــا الطبقـــة الرقيقـــة TLC، وأظهـــر التحليـــل بطريقـــة كروماتوكرافيـــا
124
الطبقة الرقيقة لكل من الغلوكوز النقي وشـراب غلوكـوز الـذرة تحـول الغلوكـوز إلـى الفركتـوز خـالل
زمــن التفاعــل حيــث تحــول لــون البقــع مــن اللــون األزرق المميــز لوجــود ســكر الغلوكــوز إلــى اللــون
البنــي التــي تــدل علــى وجــود ســكر الفركتــوز ، أي أنــه باإلمكــان اســتخدام إنــزيم غلوكــوز إيزوميــراز
المنــتج مــن العزلــة المحليــة S.roseiscleroticus-Mt4 فــي تحويــل الغلوكــوز إلــى الفركتــوز فــي
العديد من الصناعات الغذائية مما يؤدي إلـى رفـع حـالوة المنتجـات وبالتـالي إمكانيـة تقليـل الكميـة
المستخدمة من السكريات الداخلة في صناعة تلك المنتجات، األمـر الـذي يحقـق جـدوى اقتصـادية
لهذه المنتجات.
والشكل (27) يبين نتائج الفصل بكروموتوكرافيا الطبقة الرقيقة حيث أنه هناك تحوال للغلوكوز إلى الفركتوز في المعامالت التي استعمل فيها الغلوكوز النقي وشراب غلوكوز الذرة كركائز .
الشكل (27) كروماتوكرافيا الطبقة الرقيقة TLC لتحول الغلوكوز إلى الفركتوز في كل من الغلوكوز
النقي وشراب الذرة الغني بالغلوكوز. حيث: 1: الغلوكوز القياسي ، 2: الفركتوز القياسي،3-4
: الغلوكوز النقي %20 قبل وبعد إضافة اإلنزيم، 6-5: شراب الذرة %20 قبل وبعد إضافة اإلنزيم. 125
وبالنتيجة أمكن تحويل المنتجات السابقة الحاوية على الغلوكوز إلى الفركتوز خالل زمن 45
ساعة، وهذا يتوافق مع ما توصل إليه جبر وآخرون (2010) حيث كان الزمن األمثل لتحويل
الغلوكوز إلى الفركتوز في كل من شراب غلوكوز الذره وعصير التمر) الدبس( والغلوكوز النقي
يتراوح بين 35 -40 ساعة.
126
- االستنتاجات :
1- غنى التربة بأنواع مختلفة من بكتريا الفطور الشعاعية Actinomycetales وعلى وجه الخصوص بكتريا الجنس Streptomyces المنتجة إلنزيم غلوكوز ايزوميريز بشكل جيد.
2- تفوق النوع )Streptomyces roseiscleroticus( في إنتاج إنزيم GI حيث بلغت الفعالية اإلنزيمية 5.2 وحدة/مل.
3- كان للمركب CTAB دور فعال في استخالص االنزيم بالمقارنة مع كل من الكلوروفورم و Tween 80 و)SDS( و)DMSO( من خالل تحطيم جدار الخلية.
4- أمكن باستخدام األشعة فوق البنفسجية الحصول على طفرات ذات إنتاجية أعلى من إنزيم GI كما في الطفرة S.roseiscleroticus-Mt4 ، وبزيادة بنسبة 43% مقارنة مع العزلة األصلية D3.
5- أمكن التوصل الى الظروف المثلى للحصول على أعلى إنتاجية إنزيمية للعزلة الطافرة S.roseiscleroticus-Mt4 بلغت 12.596 وحدة / مل عند استخدام البرنامج اإلحصائي Minitab والتصميم اإلحصائي (Response Surface (RSM .Methodology
6- كانت درجة الحرارة المثلى لنشاط إنزيم GI الخام هي 60س ، وبقي اإلنزيم
مستق اَر في مجال من درجات الح اررة 30-60م لمدة 30 دقيقة ، و كان الرقم الهيدروجيني األمثل لنشاط اإلنزيم 7 وبقي اإلنزيم مستق اَر في مجال من األ رقام الهيدروجينية 7-9. 7- ا زدادت الفعالية األنزيمية عند استخدام الركيزة )الغلوكوز( بتركيز 0.8 مول . 2+ +2 +2 2+ 8- نشطت شوارد الـ ) Mn ,Co , Ca , Mg) عمل إنزيم غلوكوز إيزوميراز، أما +2 + +2 شوارد ( Cu , Ag , Hg) فقد لعبت دور مثبط لإلنزيم، وكان أفضلها لتنشيط االنزيم مزيج من شوارد الكوبالت والمغنزيوم بتركيز 0.1M.
127
9- أمكن تنقية اإلنزيم باستخدام الترسيب بكبريتات األمونيوم والفصل على أعمدة الكروماتوغرافيا باستخدام هالمتي Sephadex G-100 و -Sepharose S .200 10- أمكن تعيين الوزن الجزيئي لبروتين GI باستخدام SDS-PAGE وبلغ 48 كيلو دالتون. 11- أمكن تحويل الغلوكوز في حال الغلوكوز النقي وشراب الذرة الغني بالغلوكوز إلى الفركتوز خالل 45 ساعة باستخدام إنزيم غلوكوز إيزوميراز.
128
التوصيات: 1. االستمرار بالعمل على بكتريا Streptomyces للحصول على سالالت ذات إنتاجية أعلى من اإلنزيم. 2. تطبيق اإلنزيم المنقى على المنتجات الحاوية على الغلوكوز للتأكد من فعالية اإلنزيم. 3. استخدام تقنيات وراثية كعملية التنسيل (Cloning)على بكتيريا Streptomyces للحصول على طفرات موجهة ومحددة وبالتالي تطوير اإلنتاج. 4. استخدام كائنات أخرى منتجة إلنزيم غلوكوز إيزوميراز ومقارنة إنتاجها بإنتاجية بكتريا Streptomyces.
129
المراجع العربية
]1[ أحمد، محمد علي والنواوي، محمد عبد الرزاق (1990). الفطريات الصناعية- الـدار العربيـة للنشـر- مصر. ]2[ البكري، غالب حمزة )1991(. مبادئ الهندسة الوراثية. الطبعة األولى- مطبعة دار الحكمـة- جامعـة البصرة. ]3[ الخفــاجي ، زهــرة محمــود. )1990(. التقنيــة الحيويــة – مطــابع دار الحكمــة للطباعــة والنشــر. جامعــة بغداد. ]4[ الخياط، غسان حمادة ومحمد، محمد )2000(. كيمياء مكونات األغذية. كلية الزراعة، جامعة دمشق. ]5[ السواح، محمود محمد عوض اهلل )2002(. األنزيمات الميكروبية. دار النيل للطباعة – الطبعة األولى – مصر. ]6[ العاني ، فاروق ياس . ( 1992) وراثة األحياء المجهرية . وزارة التعليم العالي والبحث العلمي . جامعة بغداد . دار الحكمة للطباعة والنشر . ]7[ العبيدي ، سعد حسين خضير. )2004(. استخالص وتوصـيف إنـزيم غلوكـوز إيزوميريـز المنـتج مـن البكتريا الخيطية المحلية ودراسة تحسين إنتاجه باستخدام أشعة غاما. أطروحة دكتوراه. كلية العلوم – جامعة بغداد.ص 117. ]8[ داللي ، باسل كامل. )1983(. فهم األنزيمات. مطابع جامعة الموصل. جامعة الموصل.349 . ]9[ جبــر، حميــدعبود و محــي الــدين، محمــد عمــر و داللــي، باســل كامــل. 2010. دراســة كفــاءة إنــزيم غلوكــوز أيزوميريــز المنــتج مــن عزلــة محليــة مــن البكتريــا Streptomyces sp. HM5 فــي تحويــل الغلوكوز إلى الفركتوز، مجلة ديالى، العدد 6)4(:271-250. ]10[ عمر، عادل. )2006(. إنتاج أنزيمات األميالز من الفطريات وتنقيتها واستعمالها في بعض المجاالت التطبيقية. أطروحة دكتوراه في قسم علوم األغذية، كلية الزراعة، جامعة دمشق، سوريا. ص 28. ]11[ فيصل، ريان مازن. )2010(. األس الهيدروجيني المنخفض محيدا لمحتوى الـ DNA البالزميدي لجرثومة Streptomyces مقارنة بمحيدات أخرى. مجلة علوم الرافدين، (1)21: 53- .40 ]12[ محي الدين ، محمد عمر. )1998(. تنقية وتوصيف إنزيم البروتييز الحامضي – بديل المنفحة - المنتج من العفن RhizomucormieheiMO-46 بطريقة تخمرات الحالة الصلبة. أطروحة دكتوراه. كلية الزراعة – جامعة بغداد. ص37 . 130
References: Abdel-Aziz, M.S., Talkhan, F.N., Fadel, M, AbouZied,A.A., Abdel-Razik,, A.S. (2011). Improvement of Xylanase production from Streptomyces Pseudo griseolus via UV Mutagenesis. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 5(5): 1045-1050. Adsul, M.G., Bastawde, K.B.,Varma, A.J., and Gokhale, D.V. (2007). Strain improvement of Penicillium janthinellum NCIM 1171 for increased cellulase production. Bioresource Technology., 98: 1467-1473. Agrawal, V.P. (2003). Biodiversity of Khumbu region: population study of actinomycetes. Royal Nepal Acdemy for Science and Technology.6-8: 357-360. Al-Tai, A. M., Ali, Y, and Abdul–Razzak, S. H. (1987). Isomerization of glucose to fructose: Production and some properties of glucose isomerase from Sterptomyce ssp. strain C7. Enzyme and Microbial Technology. 9: 632-634. Anderson, A. K., S. B. Petersen and Frisner. H. (2000). Effect of pH on activity, thermostability and aggregation of glucose isomerase from Sterptomyces murinus. Journal of Biotechnology. (10): 150-161. Antonieta,T., María. J. R., Ernesto . M.V., Cristina. C. (2006). Isolation and identification of Streptomyces spp. from Venezuelan soils: Morphological and biochemical studies. Microbiological Research. 161: 222–231. Antrim, R. L., W. Colilla, and Schnyder. B. J. (1979). Glucose isomerase production of high fructose syrups. Applied Biochemistry and Bioengineering. 2:97–155. Atiken, J. M.,Dunnigan, M. G. and Ford, J. A. (1970). International symposium on clinical and metabolic aspects of levulose, Clamic Limited Crew, 97- 103. Azin, M.,Moazami, N. and Nemat-Gorgani, M. (1997). Production, Purification and Immobilization of glucose isomerase from Streptomyces olivochromogenes PTCC 1457. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 13: 597-598. Bajaj, B.K., Pangotra, H., Wani, M.A., Sharma, P. and Sharma, A. (2009). Partial purification and characterization of a highly thermostable and pH stable endoglucanase from a newly isolated Bacillus strain M-9. Indian Journal of Chemical Technology. 16, 382-387. Bengston, B. L., and W. R. Lamm. (1973). Procede du isomerisation du glucose et du fructose. French patent. 2,172,882. Bandlish, R. K., Hess, J. M.,Epting, K. L.,Vielle, C. and Kelly, R. M. (2002). Glucose to fructose conversion at high temperatures with xylose (glucose)
131
isomerase from Sterptomyces murinusand two hyper thermophilic Thermotoge Species. Biotechnology and Bioengineering. 80: 185-194. Barbe, V., Bouzon. M., Mangenot. S., Badet. B. (2011). Complete genome sequence of Streptomyces cattleya NRRL 8057, a producer of antibiotics and fluorometabolites. Journal of Bacteriology. 193 : 5055–5056. Barker, S.A., Somers. P. J. and Hatt.B. W.(1973). (Boehringer Mannheim GmbH). Fructose. U.S. patent 3,875,140. Basha, N.S., Rekha, R., Komala, M. and Ruby, S. (2009). Production of extracellular anti-leukaemicenzyme lasparaginase from marine actinomycetes by solidstate and submerged fermentation: Purification and Characterisation. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 8:353- 360. Bahrim, G., Iancu. C., Butu. N., Negota. T.G. (2010) . Production of a novel microbial transglutaminase using Streptomyces sp. polar strains. Romanian Biotechnological Letters. 15(2): 5197-5203. Belfaquih, N. and Penninckx, M. J. (2000). A bifunctional -xylosidase- xylose isomerase from Sterptomyces sp. Ec10. Enzyme and Microbial Technology. 27: 114-121. Bentley, S. D.,Chater, K. F., Cerdeno, A. M., Challis, G. L., Thomson, N. R., James, K. D., Harris, D. E., and Hopwood, D. A. (2002). Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3 (2). Nature, 417: 141-147. Berg, M.J., John L .T., and Lubert .S. (2007). "Biochemistry". 6th ed. W.H. Freeman and Company, NY, 1026. Bergey, N.R. and Holt, J.G. (2000). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 9thed. P: 408 . Bergey, W., Aidan P., Michael. G., Peter. K., Hans.J. B., Martha E. T., Wolfgang. L, and Ken.S. (2012). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology ,the edition 5: The Actinobacteria. p: 437-464. Bhasin, S., Sharma P., Rajpal P. and H.A. Modi. (2013). Comparative study of extraction methods for intracellularly produced glucose isomerase by Streptomyces sp.SB–AII4.International Research Journal of Biological Sciences. 2(10): 43-50. Bhasin, S. and Modi, H. A. (2012). Optimization of fermentation medium for the production of Glucose Isomerase using Streptomyces sp. SB-P1. Biotechnology Research International. Article ID 874152, p:1-10. Bhasin, S.(2011). Studies on glucose isomerase from Streptomyces sp. [Ph.D. thesis], Gujarat University, Ahmedabad, Gujarat, India.p: 98. Bhosale, S. H.,Rao, M. B. and Deshpande ,V. V. (1996). Molecular and industrial aspects of glucose isomerase. Microbiology Reviews. 60 (2): 280-300. Bibb, M. J. (1996) . The regulation of antibiotic production in Streptomyces coelicolor. Microbiology. 142:1335-1344. 132
Boguth, G.N., Harder, A., Scheibe, B., Wildgruber, R. and Weiss, W., (2000). The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 21: 1037-1053. Bok, S. K., W. Seidman, and Wopat. P. W. (1984). Selective isolation of acidophilic Streptomyces strains for glucose isomerase. Applied and Environmental Microbiology.47:1213–1215. Borgi, M.A., Rhimi. M., Bejar. S. (2007). Involvement of alanine 103 residue in kinetic and physicochemical properties of glucose isomerases from Streptomyces species. Biotechnology Journal. 2(2):254-259. Borgi, M.A, Srih-Belguith K, Ben Ali M, Mezghani M, Tranier ,S, Haser ,R, Bejar, S .(2004). Glucose isomerase of the Streptomyces sp. SK strain: purification, sequence analysis and implication of alanine 103 residue in the enzyme thermostability and acidotolerance. Biochimie. 86 (8): 561- 568. Brich, G. C. and Green, L. F. (1973). Molecular structure and function of food carbohydrates. Applied Science Publisher, London. P: 9-20. Bruice, T.C. and Benkovic, S.J. (2000). Chemical basis for enzyme catalysis. Biochemistry. 39: 6267-6274. Callens, M.,Kersters-Hilderson, H., Van-Opsta, O. and Debruyne, C. K. (1986). Catalytic properties of D-xylose isomerase from Streptomyces violaceoruber. Enzyme and Microbial Technology. 8: 696-700. Carell, H. L., Rubin, B. H., Hurley, T. J. and Glusker, J. P. (1984). Xylose- ray crystal structure of D-xylose isomerase at 4 A resolution. Journal of Biological Chemistry. 259: 3230-3236. Ceylan, O., Okmen. G., and Ugur. A. (2008). Isolation of soil Streptomyces as source antibiotics active against antibiotic-resistant bacteria. EurAsian Journal of BioSciences. 2: 73-82. Champness, W. (2000). Actinomycete development, antibiotic production and phylogeny: questions and challenges. American society for microbiology, Washington. DC, 11-31. Chater, K. F. (1993) . Genetic differentiation in Streptomyces. Annual Review of Microbiology. 47: 685-689. Chater, K. F., Biró, S., Lee, K. J., Palmer, T. and Schrempf, H. (2010). The complex extracellular biology of Streptomyces. FEMS Microbiology Reviews. 34 (2): 171–98. Chauthaiwale, J. V. and Rao, M. B. (1994). Production and purification of extracellular D-xylose isomerase from an alkaliphilic, thermophilic Bacillus sp. Applied and Environmental Microbiology. 60: 4495-4499. Chen, WP., Anderson, AW., Han, Y.W. (1979). Production of glucose isomerase by Streptomyces flavogriseus. Applied and Environmental Microbiology. 37: 324–331.
133
Cheng, Y.R., Huang, J., Qiang, H., Lin, W.L., Demain , A.L. (2001). Mutagenesis of the rapamycin producer Streptomyces hygroscopicus FC904. Journal of Antibiotics. 54(11):967-72. Dalaly, B. K. and Abdullah, M. S. (1986). Isolation and partial characterization of glucose isomerase from Streptomyces. Zanco (Iraqi).4: 131-139. Dancer, S.J. (2004). How antibiotics can make us sick: the less obvious adverse effects of antimicrobial chemotherapy. The Lancet Infectious Diseases. 4: 611-619. Danno, G. (1970). Studies on D-glucose isomerase enzyme from Bacillus coagulans, strain HN-68. Part IV. Purification, crystalization and physieochemical properties. Agricultural and biological chemistry. 34: 1795-1804 Davis, N.K.; and Chater, K.F. (1990). Spore colour in Streptomyces coelicolor A3(2) involves the developmentally regulated synthesis of a compound biosynthetically related to polyketide antibiotics. Molecular Microbiology; 4 : 1679-1691. Dehkordi, A. M.,Tehrany, M. S., Safari.I. (2009). Kinetics of Glucose Isomerization to Fructose by Immobilized Glucose Isomerase (Sweetzyme IT). Industrial and Engineering Chemistry Research. 48(7): 3271-3278. Dekker, K., Sugiura, A., Yamagata, H.,Sakaguchi, k. and Udaka, S. (1991). Efficient Production of thermostableThermusthermophilusXylose (glucose) Isomerase in Escherichia coli and Bacillus brevis. pplied Microbiology and Biotechnology. 36: 727-732. Deshmukh, S.S., Deshpande, M.V., Shankar, V. (1996). Medium optimization for the production of glucose isomerase from thermophilic Streptomyces thermonitrificans. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 10 (3): 264-267. Deshmukh, S. S. and Shankar, V. (2000). Glucose isomerase from thermophilic Streptomyces thermonitrificans: purification and characterization. Biotechnology and Applied Biochemistry. 24: 65-72. Dhungel, B., Subedi. M., Tiwari, K.B., Shrestha, U.T., Pokhrel. S. and Agrawal. V.P. (2007). Thermostable glucose isomerase from psychrotolerant Streptomyces species. nternational Journal of Life Sciences. 1 : 6-10 Dische,Z. Borenfreund, A. (1951). A new spectrophotometric method for the detection and determination of keto sugar and trioses. Journal of Biological Chemistry. 192(2): 583-587. Dunaway, M. D. (2008). "Enzyme function discovery". Structure (London, England : 1993). 16 (11): 1599–600. Duong, L. K., Gabelli S.B.(2014). Salting out of proteins using ammonium sulfate precipitation. Methods in Enzymology. 41:85-94. El-Naggar, N.E. and Abdelwahed, N.A.M. 2014. Application of statistical experimental design for optimization of silver nanoparticles biosynthesis 134
by a nano factory Streptomyces viridochromogenes. Journal of Microbiology 52(1): 53–63. Euzeby, J. P. (2008). "Genus Streptomyces". List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature. Retrieved: 09-28. Fan, X.L., Wu. F.Q., and Daniel. A.B. (2011). A database of thermodynamic properties of the reactions of glycolysis, the tricarboxylic acid cycle, and the pentose phosphate pathway. Database, Article ID bar005, doi:10.1093. Freeman, R. F., Hopwood, D. A. (1978). Unstable naturally occurring resistance to antibiotics in Streptomyces. Journal of general microbiology.106: 377- 381. Funke, G. (2005). Actinomyces and related genera. In S. P. Borriello, P. R. Murray and G. Funke (Eds.), Topleyand Wilson's Microbiology and Microbial Infections (10th ed., pp. 1005-1022). Edward Arnold Publishers Ltd. Gaffney, B. J. (1996). Lipoxygenase : Structural principles and spectroscopy. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 25 : 431 - 459. Gaikwad, S. M., Rao, M. and Deshpande,V. V. (1992). D- glucose / xylose isomerase Streptomoyces: Differential roles of magnesium and cobalt ions. Enzyme and Microbial Technology. 14: 317-320. Garfin, D. E. (1990). Purification Procedures. electrophoretic methods. “In Methods in Enzymology” Vol. 185 (Edited. by Murray E. D. and Deutscher, P.) Academic Press, New York. Genton, Laurence; Melzer, Katarina; Pichard, Claude. (2010). Energy and macronutrient requirements for physical fitness in exercising subjects. Clinical Nutrition. 29 (4): 413–423. Givry, S., Duchiron, F. (2007). Optimization of culture medium and growth conditions for production of L-arabinose isomerase and D-xylose isomerase by Lactobacillus bifermentans. Microbiology. 77(3):281–287. Godfrey, T., West.S.I. (1996). Introduction to industrial enzymology, in Industrial enzymology. edn 2 Edited by Godfrey, T., West.S.I. London: Macmillan Press, 1-8. Gong, C., Chen, L.F. and George, T. (1980). Purfication and properties of glucose isomerase of Actinoplanesmissouriensis. Biotechnology and Bioengineering. 12: 833-845. Gong, C. S., Chen, L. F.,Flickinger, M. C., Chiang, L. C and Tsao, G. T. (1981). Production of ethanol from D-xylose by using D-xylose isomerase and yeast. Applied and Environmental Microbiology. 41: 430-436. Hafner, E. W. (1985). Constitutive mutant of a thermostable glucose isomerase U. S. Patent 4, 551, 430. Journal of Biological Chemistry (Cited in Bandlishet al. , 2002).
135
Hanover, L. M. and White, J. S. (1993). Manufacturing, compostion and application of fructose. The American journal of Clinical Nutrition. 58: 1245-1325. Hodgson, D. A. (2000) . Primary metabolism and its control in Streptomycetes: A most unusual group of bacteria. Advances in Microbial Ecology. 238: 42-47. Hong, S. S, Baek, J. K. , Lee, H. S., Kuk, S. U. and Park, K. H. (1991). Isolation of glucose isomerase- producing microorganisms, Streptomyces luteogriseus and determination of fermentation conditions. Korean Journal of Applied Microbiology and Biotechnology .19 (3): 296-302. Hopwood, D. A. (1999). Forty years of genetics with Streptomyces: from in vivo through in vitro to in silico. Microbiological. 154: 2183-2188. Hyvonen, L., and Koivistoinen, P. (1982). "Fructose in Food Systems". In Birch, G.G. and Parker, K.J. Nutritive Sweeteners. London and New Jersey: Applied Science Publishers. pp. 133–144. ISBN 0-85334-997-5. Jabur, H.A.(2004). Production and purification of glucose isomerase from local isolate of Streptomyces sp. HM5 with studying some of its characteristics and applications. [Ph.D. thesis], Diyala, Iraq University.p: 104. Joo, G.J., Shin, S., Heo, G.Y., Kim, Y.M., and Rhee, I.K. (2005). Molecular cloning and expression of a thermostable xylose (Glucose) isomerase gene, xylA, from Streptomyces chibaensis J-59. Journal of Microbiology., 43(1): 34-37. Joo, G. J. and Rhee, I. K. (1997). Production of glucose isomerase from xy/b mutant Streptomyces chibensis J- 59. Korean Journal of Applied Microbiology and Biotechnology. 25 (1): 75-81. Kampfer and Peter (2006). "The Family Streptomycetaceae, Part I: Taxonomy". In Dworkin, Martin; Falkow, Stanley; Rosenberg, Eugene; Schleifer, Karl-Heinz; Stackebrandt, Erko. The Prokaryotes. pp. 538–604. Kaneko, T., Takahashi, S. and Saito, K. (2000). Characteerization of acid-stable glucose isomerase from Streptomyces sp. and development of single-step processes for high-fructose corn sweetener production. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (5): 940-947. Kanellopoulou, T., Alexopoulou, A., Tanoulu, M. I., Tiniakos, D., Giannopoulos, D., Koskinas, J., and Archimandritis, A. J. (2010). Primary Hepatic Actinomyces. The American Journal of the Medical Sciences. 339(4), 362-365. Kankiya,C., Pairoh .P. (2012).Glucose(xylose) isomerase production by Streptomyces sp. CH7 grown on agricultural residues, Brazilian Journal of Microbiology. 43(3): 1084–1093. Kasumi, T, Hayashi, K., Tsumura, N. and Takagi, T. (1981a). Physiochemical characterization of glucose isomerase from Streptomyces griseofuscus S- 41. Agricultural and Biological Chemistry. 45 (5): 1087-1095.
136
Khan, S.T. ( 2011). Streptomyces associated with a marine sponge Haliclona sp.; biosynthetic genes for secondary metabolites and products. Environ Microbiol Black. 13 : 391–403 Kharel, M.K., Shepherd, M.D., Nybo, S.E., Smith, M.L., Bosserman, M.A. and Rohr, J. (2010). Isolation of Streptomyces species from soil. Curr Protoc Microbiol. Chapter 10:Unit 10E.4. doi: 10.1002/9780471729259. Kieser, T., Bibb, M.J.,Buttner, M.J.,Chater, K.F., and Hopwood, D.A. (2000). Practical Streptomyces genetics. Microbiology., 148: 1777–1783. Kirk, O., Borchert, T.V. and Fuglsang, C.C.(2002). Industrial enzyme applications. Current Opinion in Biotechnology. 13(4):345-51. Kornberg, A. (1990). Why purify enzymes. “In Methods in Enzymology” Vol. (edited by Deutscher, M. P. ). Academic press, New York. Vol. 182 : 1-5. Kozak, M.J. (2005). Glucose isomerase from Streptomyces rubiginosus; potential molecular weight standard for small angle X-ray scattering. Journal of Applied Crystallography.(38): 555–558. Kumar, D.M., Poovai, P., Kumar, C.P., Saroja, Y.S., Manimaran, A. andKalaichelvan, P. (2012). Optimization of Bacillus cereus MRK1 cellulase production and its biostoning activity. Der Pharmacia Lettre. 4: 881-888. Korn-Wendisch, F., Kutzner, H.J., 1991. The Family Streptomycetaceae. The Prokaryotes. A Handbook on the Biology of Bacteria: Ecophysiology, Isolation, Identification, Applications. Chapter 41. Springer-Verlag. Berlin, New York, pp 965–968. Kulka, R. G. (1956). Colorimetric estimation of ketopentoses and ketohexoses. Biochemical Journal . 63: 542-548. Kwon, H., Kitada, M. and Horikoshi, K. (1987) Purification and properties of D- glucose / xylose isomerase from alkalophilic Bacillus No. Kx-6. Agricultural and biological chemistry. 51(7): 1983-1989. Lama, L., Nicolaus B., Calandrelli V., Romano I., Basile R., Gambacorta A. (2001). Purification and characterization of thermostable xylose(glucose) isomerase from Bacillus thermoantarcticus. The Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 27:234–240 Laemmli, U.K.(1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685. Lavie, A., Allen, K. N.,Petsko, G. A. and Ringe, D. (1994). X-ray crystallographic structures of D-xylose isomerase – substrate complexes position the substrate and provide evidence for metal movement during catalysis. Biochemistry. 33: 5469-5480. Lide David, R. (2006). CRC Handbook of Chemistry and Physics (87th ed.). Boca Raton, FL: CRC Press. ISBN 0-8493-0487-3. Linden, T. and Hahn-Hagerdal, B. (1989). Fermentation of lignocellulose hydrolystates with yeasts and xylose isomerase. Enzyme and Microbial Technology. 11: 583-589. 137
Liu, S.Y., Wiegel. J., Gherardini. F.C. (1996). Purification and cloning of a thermostable xylose(glucose) isomerase with an acidic pH optimum from Thermoanaerobacterium strain JW/ SL-YS489. Journal of Bacteriology. 178: 5938-5945. Lobanok, A. G., Sapunova, L. I., Dikhtievski, Y. O. and Kazakevich, I. O. (1998). Screening of glucose isomerase-producing microor-ganisms. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 14: 259-262. Lohmann, K. (1933). Glucose-G-phosphate isomerase, occurance and function, In The Enzyme (edited by P. P. Royer), 3rd Edition,. 6: 272-276. Academic Press New York and London (Cited in Chou et al. , 1976). Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L. and Randall, R.J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 193, 265-275. Madigan, M.. Martinko, J. (2005) . Brock Biology of Microorganisms. Prentice Hall. ISBN 0-13-144329-1. Maheshwari, R., Bhardawaj, G., Bhat, M.(2000). Thermophilic Fungi: Physiology and Enzymes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64(3): 461-488. Manteca, A., Claessen, D., Lopez-Iglesias, C. and Sanchez, J. (2007). Aerial hyphae in surface cultures of Streptomyces lividans and Streptomyces coelicolor originate from viable segments surviving an early programmed cell death event. FEMS Microbiology Letters . 274:118-125 Marko, K., Harry, R. H., Ann Kristin, S., Aaron, A.W.,Mike, S.M. J., Wim, T.A.M., Jan, J.J.,Huub, J.M., Johannes, P., Jack, T. P. (2003). High-level functional expression of a fungal xylose isomerase: the key to efficient ethanolic fermentation of xylose by Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 4 : 69-78 Marshall, R. O., and E. R. Kooi. (1957). Enzymatic conversion of D-glucoseto D-fructose. Science. 125:648–649. McWilliams, M. (2001). Foods: Experimental Perspectives, 4th Edition. Upper Saddle River, NJ : Prentice Hall. ISBN 0-13-021282-2. Meng, M., M. Bagdasarian and J.G. Zeikus. (1993). Proc. Natl Acad. Sci. USA, (90): 8459–8463. Mishra, A., Debnath. D.M. (2002). Effect of pH on simultaneous saccharification and isomerization by glucoamylase and glucose isomerase. Applied Biochemistry and Biotechnology.102-103(1-6):193- 199. Mohammadi, A.,Razavi, S.H., Mousavi, S.M., Rezaei, K. (2011). A comparative between sugar consumption and ethanol production in wort by immobilized Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ludwigii and Saccharomycesrouxii on brewer's spent grain. Brazilian Journal of Microbiology . 42(2):605-615.
138
Morton, R.(1950). Separation and purification of enzymes associated with insoluble particles. Nature.166: 1092-1095. ."Moss ،G.P. (2006). "Recommendations of the Nomenclature Committee International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the Nomenclature and Classification of Enzymes by the Reactions they Catalyse. Muhyaddin, M.O., Jabur, H.A. and Dalaly, B.K. (2008). Production of Glucose isomerase from local isolate of Streptomyces sp. HM5 2- Optimization of enzyme production conditions by submerged cultures. Journal of Research Diyala Humanity. 31(2): 11-32. Muthuvelayudham, R. and Viruthagiri, T. (2010). Application of central composite design based response surface methodology inparameter optimization and on cellulase production using agricultural waste. International Journal of Chemical and Biological Engineering. 3: 97- 104. Nabors, L.O. (2001). "American Sweeteners". pp. 374–375. Nelson, d. L. and Cox, M. M. (2000). Principles of Biochemistry. Worth Publishers, Madison and Avenue Inc. New York, USA. Ogbo, F.G., and F.J.C. Odibo .(2007). Some Properties of the thermostablexylose isomerase of Saccharococcus caldoxylosilyticus No.31. Biotechnology. (6):414-419. Pandey A. (2004). Alpha amylase from a fungal culture grown on oil cakes and its properties. Brazilian Archives of Biology and Technology. 47: 309– 317. Park, Y. K. and Toma, M. (1975). Isomerization of glucose semipurified, cell bound and immobilized glucose isomerase of Streptomyces sp. Journal of Food Science. 40: 1112-1114. Pastinen, O.,Visuri, K.,Schoemaker, H. E. and Leisola, M. (1999). Novel reaction of xylose/glucose isomerase from Streptomyces rubiginosis. Enzyme and Microbial Technology. 25: 695-700. Pawan, G. L.S. (1973). Fructose (Cited in Brich. G. G. and Green L. F.) Page 65. Applied Science Publishers, London. Pawan, S.A., and Deshpande. V.V. (2000). Charaterization of acid induced unfolding intermediates of glucose/xylose isomerase. European Journal of Biochemistry. (267): 6331-6338. Pawar, H.S., and Deshmukh, D.R. (1994). Immobilization of D-Xylose (D- Glucose) Isomerase from a Chainia Species. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 24(2): 143 –150. Pederson, S. (1993). Industrial aspects of immobilized glucose isomerase. Bioprocess Technology. 16: 185-208. Prashant,S., Saurabh,S., Sanjay,K. C., and Gomase,V.S. (2010). Isolation, purification and characterization of Glucose Isomerase enzyme from 139
Streptomyces species isolated from Parbhani Region. Journal of Enzyme Research. 1(2): 1-10. Pridham, T. G. and Tresner, H. D. (1974). Family VII Streptomycetaceae. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. 8th ed. , 747-829. (edited by Buchanan, R. E. & Gibbons, N. E. ). William and Wilkins Company/Baltimore. Pritham, G. H. (1998). Andersons Essentials in Biochemistry. Mosby, New York, N. Y. 74. Purves,W. K., Sadava.D. O., Gordon. H. 7th Edition . (2004). Macmillan Publishers. ISBN 978-0-7167-9856-9. pp. 139–140. Rahman, N A. (2008). Determination of Glucose and Fructose from Glucose Isomerization Process by High-performance Liquid Chromatography with UV Detection. Modern Applied Science. 2 (4): 151-154. Ramachandran, S., Patel, A.K., Nampoothiri, K.M., Chandran, S., Szakacs, G., Soccol, C.R.,Raykovska, V., Angelova, P.D., Paskaleva, D., Stoeva, S., Abashev, J., Kirkov, L. and Voelter, W. (2009). Isolation and characterization of a xylose–glucose isomerase froma Nadu. African Journal of Biotechnology. 8(17): 4159-4162. Rath, A., Glibowicka. M., Nadeau. V. G., Chen. G., Deber. C. M. (2009). Detergent binding explains anomalous SDS-PAGE migration of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences.106 (6): 1760–1765. Raykovska,V., Angelova,P.D., Paskaleva,D., Stoeva,S.,Abashev,J., Kirkov,L., and Voelter. W. (2001). Isolation and characterization of a xylose– glucose isomerase from a new strain Streptomyces thermovulgaris 127, var. 7-86. Biochemistry and Cell Biology. 79(2): 195–205. Raymond, F. G., Thomas, C., John, F. A.(2006). The RNA World: The Nature of Modern RNA Suggests a Prebiotic RNA World Volume 43 of Cold Spring Harbor monograph series, ISSN 0270-1847. Riyaz, Z. S., Shimpi, G. B., and Chincholkar, S. B. (2010). Constitutive production of extracellular glucose isomerase by an osmophillic Aspergillus sp. under submerged conditions. The Journal of Food Science and Technology. 47(5): 496–500. Rizvi, edited by Anil Kumar Pabby, Ana Maria Sastre, Syed S.H.; Pabby, Anil Kumar; Rizvi,, Syed S.H.; Sastre, Ana Maria. (2007). Handbook of membrane separations : chemical, pharmaceutical, and biotechnological applications. Boca Raton, Fla.: CRC Press. ISBN 978-0-8493-9549-9. Ruangpan, L., and Tendencia, E. A. (2004). Chapter 1. Bacterial isolation, identification and storage. In Laboratory manual of standardized methods for antimicrobial sensitivity tests for bacteria isolated from aquatic animals and environment (pp. 3–11). Sajid, I., Shaaban, K.A., Hasnain, S. (2011). Identification, isolation and optimization of antifungal metabolites from the Streptomyces 140
malachitofuscus ctf9. Brazilian Journal of Microbiology . 2011;2:592– 604. Salehi, Z., Sohrabi, M., Kaghazchi, T., & Bonakdarpour, B. (2004). Application of down flow jet loop bioreactors in implementation and kinetic determination of solid-liquid enzyme rections. Process Biochemistry. 40 (7): 2455-2460. Sathya, R. and Ushadevi, T. (2014). Isolation and screening of glucose isomerase producing marine Streptomyces species for fructose production. Der Pharma Chemica, 6 (5):215-219. Schenck, M. and Bisswanger, H. (2000). Amicroplate assay for D-xylose/D- glucose isomerase. Enzyme and Microbial Technology. Vol. 22: 721-723. Schwedock, J., McCormick, J.R., Angert, E.R., Nodwell, J.R., and Losick, R.(1997). Assembly of the cell division protein FtsZ into ladder-like structures in the aerial hyphae of Streptomyces coelicolor. Molecular Microbiology. 25: 847-58. Segel, I. H. (1976). Biochemical Calculations. 2nd Edition, John Wiley and Sons, Inc. New York. Shieh, C.J., Phan,T. L.A. and Shih, I. L.(2009). Milk-clotting enzymes produced by culture of Bacillus subtilis natto. Biochemical Engineering Journal. 43: 85-91. Siddique, S.,Syed. Q., Adnan. A., and Qureshi.F.A.( 2014). Production and screening of high yield avermectin B1b mutant of Streptomyces avermitilis 41445 through mutagenesis. Jundishapur Journal of Microbiology. 7(2): 8626. Snehalata, H. B., Mala, B. R., and Vasanti,V. D. (2005). Molecular and Industrial Aspects of Glucose Isomerase Division of Biochemical Sciences the Journal of Applied Crystallography. 38: 555-558. Srinivasan, M. C.,Vartak, H. G., powar, V.V. and Kire, J. m. (1983). High activity extracellular xylose (glucose) isomerase from a Chainia species. Biotechnology Letters.. 5(9): 611-614. Srivastava, P., Shukla, S., Choubey, S.K., Gomase, V.S. (2010). Isolation, purification, characterization of glucose isomerase enzyme form Streptomyces species isolated from Parbhani Region. Journal of Enzymes Research. 1(1):1-10. Stackebrandh, E., Rainey, F.A., and Ward Rainey, N.L. (1997). Proposal for a new hierarchic classification system, Actinobacteria classis nov. International journal of systematic bacteriology. 47:479-491. Stanbury, P., Whitaker, A .and Hall, S. (1997). Principles of Fermentation Technology (Second edition), Aditya books Private Limited, New Delhi, India , pp. 93–105. Stephen, H. and Suraez, N. (2003). Sugar and sweetener: Situation and outlook. U. S. department of agriculture. 1-74. 141
Steven, L. Y. and John, E. L. (1981). Manufacture, use and nutritional aspects of 90% high fructose corn sweettners. American Chemical Society . 2-4. Stryer, L. (2006). Biochemistry 6th edition, W.H. Freeman.p.303. Suekane, M., Tamura, M. and Tomimura, C. (1978). Physico-chemical and enzymatic properties of purified glucose isomerase from Streptomyces olivochromogenes and Bacillus stearothermophilus. Agricultural and biological chemistry . 42(5): 909-917. Suekane, M., and H. Iizuka. (1982). Production of glucose isomerase by genus Streptomyces. Z. Allg. Mikrobiol. 22:577. Taddei, A., Rodriguez. M. J., Marquez-Vilchez. E., Castelli. C. (2006). Isolation and identification of Streptomyces spp. from Venezuelan soils: Morphological and biochemical studies. Microbiological Research. 161(3): 222-231. Takasaki, Y. and Tanab, O. (1962). Studies on the isomerization of sugar by bacteria. Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan . 36: 1010-1014. Takasaki, Y.; Kosugi, and Kanbayashi, A. (1969). Studies on sugar isomerization enzyme. Production, crystallization and some properties of glucose isomerase from Streptomyces sp. Agricultural and biological chemistry. 33: 1527-1534. Takasaki, Y. and Tanab, O. (1966). Studies on the isomerization of sugar by bacteria. IX- NAD- linked D-glucose isomerizing and D-mannose isomerizing from Paracolobacteriumaerogenoides. Agricultural and biological chemistry . 30: 220-225. Thakur, D.,Yadav, A., Gogoi, B.K., Bora,T.C. (2007). Isolation and screening of Streptomyces in soil of protected forest areas from the states of Assam and Tripura, India, for antimicrobial metabolites. Journal of Medical Mycology. 17: 242-249. Tyler, E. V., Brady, L. R. and Robbers, J. E. (1973). Pharmacognoses, 7th Ed., Lea and Febger. Philadelphia, USA. 23: 381-393. Van Vleet, J.H. and Jeffries, T.W. (2009). Yeast metabolic engineering for hemicellulosic ethanol production. Current Opinion in Biotechnology. 20(3):300-306. VanKeulen, M. A.,Vellenga, K. and Joosten, G. E. (1981). Kinetics of isomerization of D-glucose into D-fructose catalyzed by glucose isomerase containing Arthrobacter cells in immobilized and Non- immobilized form. Biotechnology and Bioengineering. XXIII: 1437- 1448. Van Maris, A.J.A., Abbott, D.A., Bellissimi, E., van den Brink, J.P., Kuyper, M., Luttik, M.A.H., Wisselink, H.W., Scheffers, W.A., van Dijken, J.P. and Pronk, J.T. (2006). Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydro-lysates by Saccharomyces cerevisiae: current status. Antonie van Leeuwenhoek . 90(4): 391-418. 142
Varsani, L., Cui, T.,Rangarajan, M., Hartley, B. S., Goldberg, J.,Collyer, C. and Blow, D. M. (1993). Arthrobacter D-xyloeisomerases: Protein engineered subunit interfaces. Biochemical Journal. 291: 575-583. Ventura, M., Canchaya, C., Tauch, A., Chandra, G., Fitzgerald, G.F., Chater, K.F.(2007). Genomics of Actinobacteria: Tracing the evolutionary history of an ancient phylum. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 3:495. Volesky, B. and Laong, I. (1985). Microbial enzymes production, purification and isolation. Critical reviews in Biotechnology. 2: 119-146. Vongsuvanlert, V. and Tani, Y. (1988). Purification and characterization of xylose isomerase of a methanol yeast, Candida boidinii which is involved in sorbitol production from glucose. Agricultural and biological chemistry. 52: 1817-1824. Walfridsson, M.,Bao, X., Anderlund, M.,Lilius, G., Bulow, L. and Hahn. Hagerdal, B. (1996). Ethanolic fermentation of xylose with Saccharomyces cerevisiae harboring the Termusthermophilus xyla gene, which expresses an active xylose (glucose) isomerase. Applied and Environmental Microbiology. 62(12): 4648-4651. Wang, F., Whitaker, R. D. and Bath, C. A. (1998). Production of glucose isomerase in a recombinant strain of Streptomyces lividans. Applied Microbiology and Biotechnology. 50: 65-70. Whitaker, J. R. (1972). Principle of Enzymology for Food Science. Mareel Dekker, Inc. New York. 25:387. William Allen Miller. (1957). Elements of Chemistry: Theoretical and Practical, Part III. Organic Chemistry (London, England: John W. Parker and son), pages 52 and 57. Williams, J. G. K.,Kubelik, A. R.,Livak, K. J.,Rafalski, J. A., and Tingey, S. V. (1990) . DNA polymorphisms amplified by arbitrary primes are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research. 18: 6531-6542. Wong, V., Turmezei, T., Weston, V.(2011). Actinomycosis. BMJ.343:d6099. Yassien, M. A. M., Fatani, J.A.A.M., and Asfour, H.Z. (2013). Purification, characterization and immobilization of glucose isomerase from Streptomyces albaduncus. African Journal of Microbiology Research. 7(21):2682-2688. Zapp, K. H. (2012). "Ammonium Compounds" in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry,, Wiley-VCH, Weinheim. Zhang, Y.P., Hong, J. and Ye, X.(2009). Cellulase assays. Biofuels. Springer. 213-231. Zoia, L., Orlandi, M., Argyropoulos, D.S. (2008). Microwave-assisted lignin isolation using the enzymatic mild acidolysis (EMAL) protocol. Journal of agricultural and food chemistry. 56: 10115-10122.
143