Thèse De Doctorat

0 UNIVERSITE D’ANTANANARIVO

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DOMAINE :

SCIENCES ET TECHNOLOGIES

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ECOLE DOCTORALE :

SCIENCES DE LA VIE ET DE L’ENVIRONNEMENT

Thèse de Doctorat

Spécialité : Biodiversité et Santé (Biochimie)

Présentée et soutenue publiquement par :

RATSIMIEBO-ANDRIAMAMPIANINA Maholy Pricille

Titulaire de DEA Biochimie appliquée aux sciences médicales

Le 13 juillet 2017

Devant le jury composé de :

Président : Pr ANDRIANTSIMAHAVANDY Abel

Rapporteur interne : Pr RAKOTO Danielle Aurore Doll Rapporteur externe : Pr ANDRIANASOLO Radonirina Lazasoa Examinateurs : Pr RALISON Charlotte

Pr RANDRIANARIVO Ranjàna Directeur de thèse : Pr JEANNODA Victor

TABLE DES MATIERES Pages DEDICACE………………………………………………………………………………. I REMERCIEMENTS...... II GLOSSAIRE…………………………………………………………………………………..IV LISTE DES ABREVIATIONS…...... VI LISTE DES TABLEAUX………………………………………...... VII LISTE DES FIGURES……………………………………………………………………….. VIII INTRODUCTION GENERALE…………………………………………………………. 1 Chapitre 1: SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

1. Les plantes médicinales ……………………………………………………………... 3 1.1. Utilisation des plantes médicinales……………………………………………… 3 1.2. Les effets secondaires des plantes médicinales………………………………….. 4 1.3. Autres propriétés des plantes médicinales……………………………………….. 5 2. Données sur le genre Pittosporum…………………………………………………. 5 2.1. Données botaniques……………………………………………………………… 5 2.2. Utilisations des espèces de Pittosporum ………………………………………… 6 2.3. Travaux phytochimiques antérieurs sur le genre Pittosporum…………………... 8 2.3.1. Généralités sur les saponosides……………………………………………... 8 2.3.1.1. Saponosides stéroïdiques…………………………………………….. 9 2.3.1.2. Saponosides triterpéniques…………………………………………... 9 2.3.1.3. Les sucres…………………………………………………………….. 10 2.3.1.4. Les acides organiques………………………………………………... 11 2.3.2. Les saponosides du genre Pittosporum……………………………………... 11 2.4. Propriétés pharmacologiques des espèces de Pittosporum………………………. 13 2.4.1. Propriétés antimicrobiennes……………………………………………….. 13 2.4.2. Activité cytotoxique………………………………………………………… 14 2.4.3. Activité toxique sur rongeurs……………………………………………….. 14 2.4.4. Activité antiparasitaire……………………………………………………… 15 2.4.5. Activité antioxydante……………………………………………………….. 15 2.4.6. Activité anti-inflammatoire………………………………………………… 15 2.4.7. Activité hépatoprotective…………………………………………………… 15 3. Les organismes nuisibles…………………………………………………………….. 15 3.1. Les différents organismes nuisibles……………………………………………… 15 3.2. Les dégâts causés par les organismes nuisibles………………………………….. 16 3.3. Les moyens de lutte contre les organismes nuisibles……………………………. 16 3.3.1. Pesticides de synthèse………………………………………………………. 17 3.3.2. Biopesticides………………………………………………………………... 18

Chapitre 2 : ETUDE CHIMIQUE

1. Introduction………………………………………………………………………….. 19 2. Matériels et méthodes……………………………………………………………….. 19

2.1. Le matériel d’étude ……………………………………………………………… 19 2.1.1. Description botanique………………………………………………………. 19 2.1.2. Classification……………………………………………………………….. 21 2.1.3. Répartition géographique…………………………………………………… 21 2.1.4. Lieu de récolte……………………………………………………………… 21 2.2. Les produits chimiques 21 2.3. Procédés d’obtention des extraits et produits purifies…………………………… 23 2.3.1. Préparation du matériel d’étude…………………………………………….. 23 2.3.2. Préparation de l’extrait brut ………………………………………………... 23 2.3.3. Extraction des saponosides totaux………………………………………….. 23 2.3.4. Purification des saponosides……………………………………………….. 23 2.3.4.1. Partition par le n-butanol……………………………………………… 24 2.3.4.2. Fractionnement par chromatographie d’exclusion sur gel de Sephadex LH-20…………………………………………………………………... 24 2.3.4.3. Chromatographie sur flash colonne…………………………………… 24 2.4. Méthodes analytiques…………………………………………………………. 25 2.4.1. Chromatographie sur couche mince (CCM)………………………………... 25 2.4.2. Détermination des familles chimiques……………………………………… 25 2.4.2.1. Préparation des extraits………………………………………………... 25 2.4.2.1.1. Extrait acide……………………………………………………… 26 2.4.2.1.2. Extrait hydroalcoolique…………………………………………... 26 2.4.2.1.3. Extrait aqueux……………………………………………………. 26 2.4.2.1.4. Extrait chloroformique…………………………………………… 26 2.4.2.2. Détection des alcaloïdes……………………………………………….. 26 2.4.2.3. Détection des flavonoïdes (Test de WILLSTÄTTER)……………… 26 2.4.2.4. Détection des leucoanthocyanes (Test de BATE-SMITH)……………. 27 2.4.2.5. Détection des saponosides (Test de mousse)………………………….. 27 2.4.2.6. Détection des tanins et polyphénols…………………………………… 27 2.4.2.7. Détection des désoxyoses (test de KELLER-KILIANI)………………. 27 2.4.2.8. Détection des iridoïdes………………………………………………... 28 2.4.2.9. Détection des anthraquinones (test de BORNTRAGER)……………. 28 2.4.2.10. Détection des quinones libres………………………………………… 28 2.4.2.11. Détection des stéroïdes et triterpènes………………………………… 28 2.4.2.12. Détection des hétérosides cardiotoniques……………………………. 29 2.4.2.13. Détection des hétérosides cyanogénétiques …………………………. 29 2.4.2.14. Détection des coumarines……………………………………………. 29 3. Résultats……………………………………………………………………………… 29 3.1. L’extrait brut méthanolique …….……………………………………………… 29 3.2. Les saponosides totaux…………………………………………………………... 30 3.3. Les extraits purifiés……………………………………………………………… 30 3.3.1. Les extraits obtenus par fractionnement par le butanol…………………….. 31 3.3.2. Les extraits obtenus par chromatographie………………………………….. 31 3.4. Les familles chimiques présentes dans les différents extraits…………………… 32

3.5. Degré d’homogénéité des extraits……………………………………………….. 33

4. Discussion et conclusion……………………………………………………………... 34 Chapitre 3 : ETUDE DES EFFETS SUR LES ANIMAUX

1. Introduction………………………………………………………………………….. 36 2. Matériels et méthodes……………………………………………………………….. 36 2.1. Matériels………………………………………………………………………… 36 2.1.1. Les souris…………………………………………………………………… 36 2.1.2. Les cochons d’Inde…………………………………………………………. 36 2.1.3. Les poussins………………………………………………………………… 36 2.1.4. Les têtards de grenouille et les alevins de poisson………………………… 37 2.1.5. Les larves de moustique…………………………………………………….. 37 2.1.6. Les puces……………………………………………………………………. 37 2.2. Méthodes………………………………………………………………………... 37 2.2.1. Méthodes utilisées dans l’étude de la toxicité aiguë chez la souris………… 37 2.2.1.1. Voies d’administration des extraits à la souris………………………… 37 2.2.1.1.1. Voie intrapéritonéale……………………………………………. 37 2.2.1.1.2 Voie orale…………………………………………………………. 37 2.2.1.1.3 Voie sous-cutanée……………………………………………………….. 37 2.2.1.2. Détermination de la DL chez la souris……………………………… 50 38 2.2.1.3. Etude des effets des saponosides et des non saponosides chez la souris 38 2.2.1.4. Etude des effets des fractions obtenues par chromatographie………… 38 2.2.2. Etude anatomo-pathologique chez la souris………………………………... 38 2.2.3. Méthode d’étude des effets des extraits sur la fonction cardiaque ………… 40 2.2.4. Méthode d’étude des effets des extraits sur les fonctions hépatique et rénale 41 2.2.5. Méthode d’étude des propriétés hémolytiques de l’EMF………………….. 41 2.2.5.1. Préparation de la suspension d’hématies……………………………… 41 2.2.5.2. Test hémolytique……………………………………………………… 41 2.2.5.3. Détermination de la dose hémolytique 50 %...... 42 2.2.6. Méthode d’étude des effets sur les poussins……………………………….. 42 2.2.7. Méthode d’étude des effets sur les animaux à sang froid………………….. 42 2.2.7.1. Test sur les têtards de grenouille (Ptychadena mascareniensis) et les

alevins de poissons (Cyprinus carpio)……………………………….. 42 2.2.7.2. Test sur les larves de moustique (Aedes albopictus et Culex quinquefasciatus)……………………………………………………... 43 2.2.7.3. Test sur les puces (Xenopsylla cheopis)………………………………... 43 2.2.7.4. Détermination de la concentration létale 50 % ou CL50 (24 h)………... 43

3. Résultats……………………………………………………………………………… 44 3.1. Effets des extraits sur la souris…………………………………………………... 44 3.1.1. Influence des voies d’administration ………………………………………. 44 3.1.1.1. Voie intrapéritonéale …………………………………………………. 44

3.1.1.2. Voie orale ……………………………………………………………... 44 3.1.1.3. Voie sous-cutanée …………………………………………………….. 44 3.1.2. Détermination de la DL50 (24 h)…………………………………………… 46 3.1.3. Effets des saponosides (SAP) et des non saponosides……………………… 47 3.1.4. Effets des fractions obtenues par chromatographie sur LH-20…..………… 47 3.1.5. Effets des fractions obtenues par chromatographie « flash »……………… 47 3.1.6. Evolution de l’activité des extraits…………………………………….…… 48 3.2. Etude des lésions anatomo-pathologiques……………………………………….. 48 3.2.1. Lésions macroscopiques……………………………………………………. 48 3.2.2. Lésions microscopiques…………………………………………………….. 48 3.3. Effets des extraits sur la fonction cardiaque……………………………………... 58 3.4. Effets de l’EMF sur les fonctions rénale et hépatique…………………………… 60 3.4.1. Effet sur le poids des souris………………………………………………… 60 3.4.2. Taux sanguins d’ALAT, d’ASAT et de créatinine en présence de l’EMF ….. 60 3.5. Effets de l’EMF sur les hématies de mouton …………………………………… 62 3.5.1. Test hémolytique………………………………………………………….. 62 3.5.2. Dosage de l’activité hémolytique…………………………………………. 62 3.6. Effets de l’EMF sur les poussins………………………………………………… 63 3.7. Effets de l’EMF sur les animaux à sang froid…………………………………… 63 3.7.1. Effets sur les têtards de grenouille…………………………………………. 63 3.7.2. Effets de l’EMF sur les alevins de poisson………………………………... 64 3.7.3. Effets des extraits sur les larves de moustique……………………………. 64 3.7.4. Effets des extraits sur les puces…………………………………………….. 65 3.7.5. CL50 (24 h)………………………………………………………………….. 65

4. Discussion ……………………………………………………………………………. 65 5. Conclusion et perspectives………………………………………………………….. 70

Chapitre 4 : ETUDE DES EFFETS SUR LES VEGETAUX

1. Introduction………………………………………………………………………….. 72 2. Matériels et méthodes……………………………………………………………….. 72 2.1. Matériels…………………………………………………………………………. 72 2.2. Méthodes………………………………………………………………………… 72 2.2.1. Etude des effets de l’EMF sur la germination des graines…………………. 72 2.2.2. Etude des effets de l’EMF sur la croissance des jeunes plantules…………. 73 3. Résultats……………………………………………………………………………… 73 3.1. Effets de l’EMF sur la germination des graines…………………………………. 73 3.2. Effets de l’EMF sur la croissance des jeunes plantules………………………….. 74 4. Discussion…………………………………………………………………………….. 80 5. Conclusion…………………………………………………………………………… 82

Chapitre 5 : ETUDE DES EFFETS SUR LES MICROORGANISMES

1. Introduction………………………………………………………………………… 83

2. Matériels et méthodes………………………………………………………………. 83 2.1. Les microorganismes…………………………………………………………... 83 2.2. Les milieux de culture………………………………………………………….. 84 2.3. Les antibiotiques de référence…………………………………………………. 84 2.4. Etude du spectre d’activité antimicrobienne……………………………………. 84 2.5. Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI), Concentration Minimale Bactéricide (CMB) et/ou Concentration Minimale Fongicide (CMF)…… 85 3. Résultats…………………………………………………………………………….. 86 3.1. Activité antimicrobienne des extraits en milieu solide ………………………… 86 3.2. Activité des extraits et des fractions LH-20 en milieu liquide …………………. 88 3. Discussion et conclusion…………………………………………………………… 90

Chapitre 6 : ETUDE DE L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE

1. Introduction………………………………………………………………………….. 93 2. Matériels et méthodes……………………………………………………………….. 93 3. Résultats……………………………………………………………………………… 94 4. Discussion…………………………………………………………………………….. 96

DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALES ET PERSPECTIVES………….. 98

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES……………………………………………... 101 ANNEXES

I. Composition des réactifs généraux pour les alcaloïdes II. Composition du milieu de Krebs- Henseleit III. Composition du milieu de MUELLER-HINTON IV. Composition du réactif à la vanilline sulfurique V. Composition du PBS (Phosphate Buffered Saline) VI. Publications scientifiques

DEDICACES

Je dédie ce travail

A mon mari Herizo et ma fille Kristen, sources d’amour et de tendresse

A mes parents, sources constantes d’encouragement, de soutien, de confiance et d’affection

A mes beaux-parents pour leur soutien moral

A tous mes proches

REMERCIEMENTS

Cette thèse est le fruit de 4 années de travail. Mes chaleureux remerciements vont à toutes les personnes qui ont apporté son soutien pour sa réalisation.

Je tiens à exprimer mes sincères remerciements à :

- Monsieur le Professeur ANDRIANTSIMAHAVANDY Abel, Président du jury

- Madame le Professeur RAKOTO Danielle Aurore Doll, rapporteur interne

- Monsieur le Professeur ANDRIANASOLO Radonirina Lazasoa, rapporteur externe

- Madame le Professeur RALISON Charlotte, examinateur

- Monsieur le Professeur RANDRIANARIVO Hanitra Ranjàna, examinateur

Je voudrais témoigner toute ma profonde reconnaissance à Monsieur le Professeur JEANNODA Victor, Directeur de l’école doctorale Science de la vie et de l’environnement (SVE), Responsable de l’équipe d’accueil Biodiversité et Santé, et aussi Directeur de ma thèse pour m’avoir accueillie dans son laboratoire et dirigé tous mes travaux. Merci de m’avoir rassurée quand il le fallait et de m’avoir fait profiter de vos grandes connaissances en Toxicologie. Je vous remercie également pour votre rigueur et pour votre exigence, notamment en termes de rédaction et qui ont permis indéniablement d’améliorer la qualité du manuscrit. Si ce travail est présentable aujourd’hui, c’est grâce à vos efforts inlassables, vos nombreux conseils malgré vos lourdes responsabilités.

Je voudrais aussi exprimer ma gratitude au Professeur RAKOTO- RANOROMALALA Danielle Aurore Doll pour ses précieux conseils et ses suggestions tout au long de ce travail, de son apport précieux dans la réalisation du manuscrit, malgré ses nombreuses occupations et d’avoir accepté d’être le rapporteur de cette thèse.

Mes plus vifs remerciements s’adressent au Professeur RANDRIANARIVO Ranjàna, pour m’avoir soutenue et conseillée sur les aspects scientifique et technique de mes travaux, et pour la sollicitude qu’il a toujours manifestée tout au long de ces années de recherche passées au laboratoire.

Je tiens aussi à remercier le Professeur RAJEMIARIMOELISOA Clara et le Docteur Clairette pour leur aide précieuse dans la réalisation de tous les travaux relatifs à l’étude anatomopathologique.

J’exprime aussi ma reconnaissance à l’équipe de l’IMRA dans la réalisation des études sur les organes isolés.

Je tiens à remercier le Docteur RANDRIAMAMPIANINA Lovarintsoa Judicaël pour son aide précieuse, son encouragement et son soutien.

Merci aux doctorants et aux équipes du laboratoire du Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée.

Merci Herizo et Kristen, pour avoir partagé tous ces moments avec moi, pour m’avoir réconfortée mais aussi pour votre soutien de tous les instants.

Je remercie mes parents et mes beaux-parents sans qui tout cela n’aurait pas été possible. Merci de m’avoir soutenue moralement et financièrement tout au long de ces années. Merci à toute la famille pour votre soutien et votre affection.

Je tiens à remercier tous mes amis, en particulier Mihaja, qui m’ont supportée au quotidien, merci pour tous les bons moments passés dans ou en dehors du labo.

Enfin, j’adresse toute ma reconnaissance à tous ceux qui, de près ou de loin, ont contribué à l’élaboration de cette thèse.

iii

GLOSSAIRE

Adénocarcinome : tumeur maligne (cancer) qui s'est développée dans les cellules d'une muqueuse glandulaire (estomac, côlon, bronches, etc.) ou d'une glande (prostate, ovaire, sein, thyroïde, etc.). Apoptotique : se dit d’une auto-destruction des cellules en réponse à un signal Astringente : substances qui ont comme propriétés de resserrer les tissus Brochidodrome : se dit d'une vénation foliaire dans laquelle les nervures se divisent à leur extrémité sur la marge foliaire Chronotrope : qui désigne la variation de la fréquence cardiaque Convulsions cloniques : contractions saccadées, brèves et répétées à courts intervalles Cyanose : coloration bleuâtre ou mauve de la peau Dépurative : qui élimine les toxines Dromotrope : relatif à la vitesse de conduction de l'influx nerveux des fibres musculaires myocardiques Endocardite : inflammation de l'endocarde (structures et enveloppe interne du cœur, incluant les valves cardiaques) Enophtalmie : enfoncement des globes oculaires Exophtalmie : protrusion du globe oculaire hors de l'orbite (en avant) liée à une augmentation du contenu de l'orbite. On parle aussi d’yeux exorbités Extravasation : passage de produits intraveineux d'un vaisseau sanguin vers les tissus environnants Fasciculation : contraction non volontaire et localisée de faisceaux musculaires Fébrifuge : qui sert à baisser la fièvre Hémosidérine : pigment insoluble contenant de l'hydroxyde ferrique Hyperémique : se dit d’une congestion dans un vaisseau provoquée par l'accumulation de sang Hyperplasie : : terme médical désignant une augmentation de volume d'un tissu ou d'un organe due à une augmentation du nombre des cellules Hypokaliémie : diminution de la quantité de potassium contenue dans le sang Hypoxémie : diminution de la quantité d'oxygène transportée dans le sang Inotrope : qui désigne la contractilité myocardique

Leishmaniose : maladie chronique à manifestation cutanée et/ou viscérale due à des protozoaires flagellés appartenant au genre Leishmania de la famille des Trypanosomatidae et transmises par la piqûre de certaines espèces de phlébotomes. La leishmaniose fait partie des zoonoses, maladies affectant les animaux puis transmises à l'Homme Mélanome : tumeur maligne des cellules de la peau qui fabriquent la mélanine, un pigment qui colore la peau et la protège des méfaits des rayons ultraviolets Méningites : une inflammation des méninges Mucus : substance produit par les cellules glandulaires des différentes muqueuses de l'organisme Narcotique : une substance chimique capable d'induire, chez l'humain et chez l'animal, un état proche du sommeil et qui engourdit la sensibilité Ombrophile : se dit des milieux qui dépendent de conditions atmosphériques propices aux pluies ou brumes très fréquentes et abondantes Phenylbutazone : anti-inflammatoire Piloérection : érection des poils Tonique : qui donne de l'énergie physique, qui stimule l'activité de l'organisme Tonotrope : qui concerne le tonus musculaire

LISTE DES ABREVIATIONS

ALAT : alanine aminotransférase

ASAT : aspartate aminotransférase

ATCC : American type culture collection

BAE : n-Butanol/Acide acétique/Eau

CCM : chromatographie sur couche mince

CL50 : concentration létale 50 %

CMB : concentration minimale bactéricide

CMI : concentration minimale inhibitrice

CMF : concentration minimale fongicide

DCM : dicholorométhane

DHI : diamètre de halo d’inhibition

DL50 : dose létale 50 %

DPPH : 1,1-diphényl 1-2 picrylhydrazyle ED : eau distillée EMF : extrait méthanolique de feuilles

IC50 : concentration provoquant 50 % d’inhibition ip : intrapéritonéale

IMRA : Institut Malagasy de Recherches Appliquées

INT : para-iodonitrotétrazolium

IPM : Institut Pasteur de Madagascar

J : jour

LABASM : Laboratoire de Biochimie Appliquée aux Sciences Médicales

MHA : Mueller Hinton agar

MHB : Mueller Hinton bouillon

PBS : Phosphate Buffered Saline

V/V : volume à volume

LISTE DES TABLEAUX

Pages

Tableau 1 : Caractéristiques des différents extraits préparés à partir des feuilles de 30 Pittosporum ochrosiaefolium Tableau 2 : Résultats du criblage phytochimique effectué sur les différents extraits de 33 feuilles de Pittosporum ochrosiaefolium Tableau 3 : Composition du milieu pour le test hémolytique 42 Tableau 4 : Symptômes d’intoxications observés par administration par voie orale 45 Tableau 5 : Influence des voies d’administration sur l’activité toxique de l’EMF 45 Tableau 6 : Résultats expérimentaux de la détermination de la DL50 (24 h) 46 Tableau 7 : Effets des fractions F1, F2, F3, F4 et F5 sur les souris 47 Tableau 8 : Effets des fractions obtenues par chromatographie flash sur souris 47 Tableau 9 : Evolution de l’activité des principes actifs 48 Tableau 10 : Lésions tissulaires observées chez la souris après administration de l’EMF 49 par voie ip et selon la durée d’exposition Tableau 11 : Lésions tissulaires observées chez la souris après administration de l’EMF 51 par voie orale après 10 jours d’exposition Tableau 12 : Effets de l’EMF sur le poids des souris 60 Tableau 13 : Effet de l’EMF sur les deux fonctions physiologiques majeures chez la 60 souris Tableau 14 : Effets des différentes concentrations de l’EMF sur les hématies de mouton 62 Tableau 15 : Détermination de l’activité hémolytique de l’EMF 63 Tableau 16 : Effets des différentes concentrations de l’EMF sur les têtards de grenouille 63 Tableau 17 : Effets des différentes concentrations de l’EMF sur les alevins de poisson 64 Tableau 18 : Effets des différentes concentrations de l’EMF sur les larves d’Aedes 64 albopictus Tableau 19 : Effets de l’EMF sur les larves de Culex quinquefasciatus 65 Tableau 20 : CL50 24 h chez les animaux à sang froid 65 Tableau 21 : Les graines utilisées pour l’expérimentation 72 Tableau 22 : Effets de l’EMF sur la germination de différentes graines 74 Tableau 23 : Pourcentage de stimulation et d’inhibition de croissance des hypocotyles 80 de riz au 15ème jour en présence de différentes concentrations de l’EMF Tableau 24 : Liste des germes pathogènes testés 83 Tableau 25 : Normes utilisées pour l’expression des résultats obtenus par la méthode des 85 disques Tableau 26 : Effets des extraits en milieu solide 87 Tableau 27 : Valeurs de la CMI et CMF de l’EMF, SAP, F2, F3, F4, F5 sur C. albicans 89 Tableau 28 : Activité antioxydante de l’EMF, de la fraction F5 et de l’acide ascorbique 95

vii

LISTE DES FIGURES

Pages

Figure 1 : Principaux squelettes stéroidiques 9 Figure 2 : Principaux squelettes triterpéniques 10 Figure 3 : Acide trihydroxyoleanolic glycoside 12 Figure 4 : R1-barrigenol 12 Figure 5 : Pittangretoside 13 Figure 6 : Phillyrigenin 13 Figure 7 : Pittosporum ochrosiaefolium var madagascariense 20 Figure 8 : Répartition géographique de P. ochrosiaefolium 22 Figure 9 : Extraction et purification des principes actifs des feuilles de P. 32 ochrosiaefolium Figure 10 : Chromatogramme visualisé à la lumière UV (=254 nm) (a) et révélé à la 34 vanilline sulfurique (b) Figure 11 : Détermination graphique de la DL50 (24 h) par la méthode graphique de Reed 46 et Muench (1938) Figure 12 : Coupes histopathologiques de poumon traité par l’EMF à 46,69 mg/kg par voie 52 ip, après un temps d’exposition de 9 h, G x 10 (a) et x 40 (b) Figure 13 : Coupes histopathologiques de foie traité par l’EMF à 46,69 mg/kg par voie ip, 52 après un temps d’exposition de 9 h, G x 10 (a) et x 40 (b) Figure 14 : Coupes histopathologiques de rein traité par l’EMF à 46,69 mg/kg par voie ip, 53 après un temps d’exposition de 9 h, G x 10 (a) et x 40 (b) Figure 15 : Coupes histopathologiques de l’intestin grêle traité par l’EMF à 46,69 mg/kg 53 par voie ip, après un temps d’exposition de 9 h, G x 10 (a) et x 40 (b) Figure 16 : Coupes histopathologiques du gros intestin traité par l’EMF à 46,69 mg/kg par 54 voie ip, après un temps d’exposition de 9 h, G x 10 (a) et x 40 (b, c) Figure 17 : Coupes histopathologiques de poumon traité par l’EMF à 42,48 mg/kg par voie 55 orale, après un temps d’exposition de 10 jours, G x 10 (a) et x 40 (b) Figure 18 : Coupes histopathologiques de foie traité par l’EMF à 42,48 mg/kg par voie 55 orale, après un temps d’exposition de 10 jours, G x 10 (a) et x 40 (b) Figure 19 : Coupes histopathologiques de rein traité par l’EMF à 42,48 mg/kg par voie 56 orale, après un temps d’exposition de 10 jours, G x 10 (a) et x 40 (b) Figure 20 : Coupes histopathologiques de l’intestin grêle traité par l’EMF à 42,48 mg/kg 57 par voie orale, après un temps d’exposition de 10 jours, G x 10 (a) et x 40 (b,c) Figure 21 : Coupes histopathologiques du gros intestin traité par l’EMF à 42,48 mg/kg par 58 voie orale, après un temps d’exposition de 10 jours, G x 10 (a) et x 40 (b, c) Figure 22 : Effet des différentes concentrations de l’EMF et du temps de contact sur le 59 nombre de battements par minute des oreillettes isolées de cobaye (*: p<0,05, **: p<0,02, ***: p<0,01) Figure 23 : Effet des différentes concentrations de l’EMF et du temps de contact sur 59 l’amplitude de contraction des oreillettes isolées de cobaye

viii

(*: p<0,05, **: p<0,02, ***: p<0,01) Figure 24 : Comparaison des taux de créatinine des souris traitées avec EMF et des souris 61 non traitées (n = 3) Figure 25 : Comparaison des taux d’ALAT plasmatique des souris traitées avec EMF et 61 des souris témoins non traitées (n = 3) Figure 26 : Comparaison des taux d’ASAT plasmatique des souris traitées avec EMF et 61 des souris témoins non traitées (n = 3) Figure 27 : Effets des différentes concentrations de l’EMF sur les hématies de mouton 62 Figure 28 : Effets de différentes concentrations de l’EMF sur le développement de 76 l’épicotyle de maïs Figure 29 : Effets de différentes concentrations de l’EMF sur le développement de 76 l’hypocotyle de maïs Figure 30 : Effets de différentes concentrations de l’EMF sur le développement de 77 l’épicotyle de petit pois Figure 31 : Effets de différentes concentrations de l’EMF sur le développement de 77 l’hypocotyle de petit pois Figure 32 : Effets de différentes concentrations de l’EMF sur le développement de 78 l’épicotyle de haricot Figure 33 : Effets de différentes concentrations de l’EMF sur le développement de 78 l’hypocotyle de haricot Figure 34 : Effets de différentes concentrations de l’EMF sur le développement de 79 l’épicotyle de riz Figure 35 : Effets de différentes concentrations de l’EMF sur le développement de 79 l’hypocotyle de riz Figure 36 : Effets des extraits (1 : EMF, 2 : SAP, 3 : nSAP, 4 : Sbut ; 5 : Saq ; 6 : hexane) 88 sur la croissance de Candida albicans en milieu solide (dépôt : 1 mg/disque) Figure 37 : Variation de la turbidité induite par la croissance des microorganismes en 89 fonction de la concentration des fractions F2, F3, F4, F5 Figure 38 : Réduction du radical DPPH 93 Figure 39 : Réduction du DPPH en DPPH-H par les extraits 95 Figure 40 : Inhibition du DPPH en fonction des concentrations de l’EMF, de la fraction 96 F5 et de l’acide ascorbique

Introduction générale

Les plantes ont toujours occupé une place importante dans la vie de l’Homme. Il a de tout temps cherché à exploiter leurs potentialités pour subvenir à ses besoins. Les vertus curatives et thérapeutiques des plantes comptent parmi les propriétés utiles les plus recherchées et les plus utilisées. Actuellement plusieurs milliers (80 000) de plantes médicinales sont connues (Joy et al., 2001). A Madagascar, 6 000 ont été inventoriées.

Les traitements à base de plantes occupent toujours une place importante dans les pays en voie de développement où l’accès aux médicaments n’est pas à la portée d’une frange importante de la population du fait de leur coût trop élevé. Même dans les pays développés, malgré les énormes progrès réalisés par la médecine moderne, la phytothérapie gagne de plus en plus du terrain. Face aux divers inconvénients des médicaments de synthèse comme l’émergence de germes multi-résistants, l’utilisation des plantes médicinales est devenue une alternative. Les plantes médicinales présentent en effet des avantages que les médicaments n’ont pas.

Cependant, l’ingestion de ces plantes est parfois associée à des intoxications graves, voire mortelles. Ces accidents sont généralement dus à leur méconnaissance ou à leur confusion avec d’autres plantes, mais le plus souvent à la non-maîtrise des doses à absorber. Comme toutes subtsances à visée thérapeutique, les plantes médicinales doivent être employées avec précaution.

En plus de leurs utilisations en thérapeutique, plusieurs plantes médicinales sont aussi employées à d’autres fins utiles tels les pesticides. Par exemple, Nicotiana tabacum (plante à nicotine), Chrysanthemum cinerariifolium, Tephrosia vogelii (plante à roténone) sont déjà connues comme agents de lutte contre les insectes (Crosby, 1966).

Par ailleurs, les plantes médicinales sont de plus en plus présentes dans la politique de développement de plusieurs pays. Leur utilisation et leur préservation intéressent divers secteurs d’activité englobant, outre les soins de santé, la protection de la nature, la biodiversité, la lutte biologique.

De plus amples informations sur les plantes médicinales seront données dans la partie « Synthèse bibliographique » de cet ouvrage.

Au vu de l’intérêt sans cesse grandissant suscité par les plantes médicinales, démontré par les nombreux travaux menés de par le monde, nous avons choisi de travailler sur Pittosporum ochrosiaefolium, une plante médicinale endémique de Madagascar appartenant à la famille des Pittosporacées. Le choix de cette plante a surtout été dicté par :

Introduction générale

- le nombre élevé de ses congénères utilisé pour soigner diverses maladies dans de nombreux pays - la forte toxicité de l’extrait de ses feuilles sur souris mise en évidence lors de tests préliminaires systématiques effectués dans notre laboratoire d’accueil.

Nos objectifs globaux ont essentiellement consisté à :

- vérifier les propriétés antimicrobiennes qui justifient l’utilisation contre certaines maladies infectieuses des feuilles de P. ochrosiaefolium (voir Synthèse bibliographique) ; - évaluer la toxicité des extraits de feuilles de la plante afin d’estimer les risques encourus par leurs utilisateurs et de formuler les éventuelles recommandations de sécurité qui s’imposent ; - étudier dans quelle mesure des propriétés toxiques de la plante pourraient être exploitées dans la lutte contre les organismes nuisibles ; - prospecter des propriétés thérapeutiques, autres que celles préconisées par leurs utilisations empiriques traditionnelles.

Le présent ouvrage comporte six chapitres :

- Nous apportons dans le premier, « Synthèse bibliographique », des données pertinentes permettant de mieux cadrer notre étude, justifier le choix de nos objectifs et faciliter la compréhension et l’interprétation des résultats obtenus ; - Dans le deuxième, « Etude chimique », nous présentons les différents extraits utilisés pour nos investigations ainsi que les différentes méthodes d’extraction et de purification employées pour les obtenir ; - Le troisième, « Effets sur les animaux », le quatrième, « Effets sur les végétaux » et le cinquième, « Effets sur les microorganismes », sont consacrés aux travaux réalisés et résultats obtenus sur les effets des différents extraits sur différents modèles biologiques ; - Le sixième est consacré à l’étude des « Propriétés antioxydantes de P. ochrosiaefolium ». Une discussion et une conclusion générales sur l’ensemble de l’étude, suivies des perspectives terminent le document. Les résultats que nous avons obtenus ont fait l’objet de 5 publications dont 1 article, 2 communications orales, 1 communication affichée et 1 abstract (Annexe VI).

Chapitre I

Synthèse bibliographique

Nous rassemblons dans ce chapitre des données bibliographiques destinées à justifier davantage le choix de notre sujet de recherche, à bien comprendre les objectifs visés et les travaux entrepris et enfin à mieux interpréter les résultats obtenus. Elles portent notamment sur les plantes médicinales, le genre Pittosporum et les organismes nuisibles.

1. LES PLANTES MEDICINALES 1.1. Utilisation des plantes médicinales

Les plantes médicinales se distinguent par le fait que leurs organes (les feuilles, l’écorce, les fruits …) possèdent des vertus curatives et parfois toxiques. Environ 80 000 espèces de plantes sont employées de par le monde à des fins médicinales (Joy et al, 2001). À titre d’illustration, en voici quelques exemples parmi les plus connus (Iserin, 2001).

- Curcuma longa (Zingibéracées): ses rhizomes sont connus pour leurs propriétés anti-inflammatoires. Par son action antioxydante, elle est supposée avoir un effet protecteur cardio-vasculaire et hépatique. - Azadirachta indica (Méliacées) : toutes les parties de la plante sont utilisées à des fins médicinales. L'écorce, amère et astringente, est employée en décoction pour soigner les hémorroïdes. Macérées, les feuilles sont utilisées pour soigner le paludisme, les ulcères et les vers intestinaux. En jus, en infusion ou en pommade, elles servent à traiter les ulcères, les blessures, les furoncles et l’eczéma. Le jus des feuilles est aussi appliqué sur les yeux pour améliorer la vision nocturne et soigner la conjonctivite. - Allium sativum (Liliacées): ses gousses soignent les maladies de l'appareil digestif et débarrassent les parasites intestinaux de l'organisme. Elles améliorent la capacité de résistance des poumons et apaisent les troubles circulatoires. - Digitalis purpurea (Scrofulariacées): les feuilles servent à traiter les maladies cardiaques en stimulant le cœur à régulariser la circulation sanguine. La plante stimule la diurèse, diminuant le volume sanguin et soulageant ainsi le cœur. - Ricinus communis (Euphorbiacées) : son huile a la réputation d'être puissamment laxative (et à plus fortes doses, purgative), et de déclencher des spasmes intestinaux 3 à 5 h environ après l'ingestion. L'huile de ricin est utilisée dans les cas d'empoisonnement pour purifier l’appareil digestif.

À Madagascar, d’après la banque de données informatisées de l'IMRA, plus de 6 000 plantes font actuellement l'objet d'utilisations médicales. À titre d’exemples :

Synthèse bibliographique

- Cataranthus roseus (Apocynacées) ou pervenche de Madagascar, est utilisée par les Malagasy comme vermifuge, antipaludique et diurétique en infusion, et aussi pour soigner les piqûres de guêpe ou pour désinfecter les plaies (Nicolas, 2012). - Cinnamosma fragrans (Canellacées) ou Mandravasarotra, une plante médicinale endémique de Madagascar, a le pouvoir de servir d’antidote aux poisons, de défendre l’organisme et de purifier le sang. Elle est également utilisée pour soigner la grippe, la toux, la fièvre, les bronchites et les infections du foie (Nicolas, 2012). - Panax ginseng (Araliacées) : la plante est utilisée traditionnellement dans les asthénies fonctionnelles. C'est un stimulant intellectuel principalement utilisé pour améliorer la résistance au stress et les performances cérébrales, et pour réduire la fatigue passagère. Il a une action tonique générale sur l'organisme (Iserin, 2001). - Jatropha curcas (Euphorbiacées) : la décoction des feuilles, parfois additionnée de latex, et en mélange avec d’autres plantes, est utilisée en cas de diarrhée et de dysenterie (Nicolas, 2012). - Adansonia suarezensis (Malvacées) ou Baobab : l’écorce bouillie a la réputation de guérir le cancer (Nicolas, 2012). - Harungana madagascarienesis (Hypericacées): la gomme est appliquée sur les dermatoses et la gale (Nicolas, 2012).

1.2. Les effets secondaires des plantes médicinales

Certaines plantes médicinales ont malheureusement des effets secondaires allant des simples nuisances ou des allergies à des pathologies graves voire mortelles. Quelques exemples sont cités à titre d’illustration :

- Administrée oralement, même à faible quantité, la gomme colorée de Harungana madagascariensis (Hypericacées) provoque une surexcitation psychique, accompagnée d’insomnie et de sensation de froid (Nicolas, 2012). - Panax ginseng (Araliacées) est une plante à effet thérapeutique. Pourtant, des cas d'insomnie, de diarrhées et d'hémorragies gynécologiques ont été déclarés (Kiefer et Pantuso, 2003) (Izzo, 2005). - La réglisse Glycyrrhiza glabra (racines) de la famille des Fabacées est traditionnellement utilisée pour soulager les sensations de brûlures digestives, et pour traiter la toux (expectorant). Une utilisation prolongée et excessive de cette réglisse peut être à l'origine de rétention hydrosodée, de poussée hypertensive, d'hypokaliémie et de troubles du rythme

Synthèse bibliographique

cardiaque (Panduranga et Al-Rawahi, 2013). Les effets indésirables induits par la réglisse sont réversibles mais une consommation régulière peut être à l'origine d'une hypertension prolongée. - Par la présence de nombreux composés dangereux dont les toxalbumines, Jatropha curcas (Euphorbiacées) est toxique. La plante inhibe l’activité ribosomique et empêche les synthèses protéiques par la destruction des ARNm, bloquant l’activité cellulaire et conduisant à une mort rapide (Nicolas, 2012).

1.3. Autres propriétés des plantes médicinales

Les plantes médicinales, en plus de leurs utilisations en thérapeutique, connaissent aussi d’autres emplois : - insecticides Les graines de Neem ou Azadirachta indica sont actives contre plus de 200 insectes. Ses principes actifs (azadirachtine, etc) agissent en produisant des troubles dans l'alimentation de l’insecte et intervenant sur son cycle hormonal, provoquant des malformations dans le processus de mue, empêchant son développement normal et sa croissance (Vallet, 2006) : - engrais : La pulpe d’Azadirachta indica (Vallet, 2006) et les feuilles de Crotalaria (Subramaniam et al., 2013) sont utilisées comme fertilisants des sols ; - produits cosmétiques : Aloe vera utilisée comme lotion pour la peau (Iserin, 2001). - savons : L’huile de la plante Azadirachta indica est utilisée comme savon (Vallet, 2006). - huile de cuisine : Les graines concassées de Linum usitatissimum fournissent des huiles oméga-3 et des minéraux (Iserin, 2001). - colorant alimentaire : La curcumine, une des molécules actives de rhizomes de Curcuma longa est utilisée comme colorant alimentaire (Iserin, 2001).

2. DONNEES SUR LE GENRE Pittosporum 2.1. Données botaniques

Pittosporum est l’un des 9 genres de la famille des Pittosporacées. Pittosporum vient de deux mots grecs : pitta (résine) et sporos (graine) par allusion aux semences enrobées dans une pulpe visqueuse, résinifère qui les réunit étroitement. Le genre Pittosporum regroupe environ 160 espèces d’arbres et d’arbustes (Cufodontis, 1955). Ces plantes sont tropicales ou subtropicales, originaires d’Afrique, d’Asie

Synthèse bibliographique

ou d’Australie. Il est le seul genre de la famille des Pittosporacées retrouvé à Madagascar où il est représenté par 11 espèces dont 9 sont endémiques.

La description botanique détaillée de Pittosporum ochrosiaefolium est présentée dans le chapitre Etude chimique, § 2.1 Matériels et méthodes (p. 19).

2.2. Utilisations des espèces de Pittosporum

Ces plantes ont diverses utilisations empiriques.

À Java et au Tiji, les espèces de Pittosporum servent de poisons de pêche bien qu’elles soient aussi utilisées en médecine traditionnelle.

En Australie, l’infusion de feuilles, fruits, pulpes ou d’écorce de P. phillyraeoides sert à traiter les bleus, les maladies des muscles, l’entorse ainsi que les crampes. Elle sert également à soigner la toux et le rhume. La décoction de fruits, en usage externe ou par ingestion, est utilisée contre l’eczéma et le prurit. Les feuilles sont également utilisées pour traiter les inflammations chroniques et aigues, les infections ainsi que le désordre circulatoire provoquant le cancer (Lassak et al, 2006 ; Latz et al., 1995 ; Barr et al., 1993 ; Goddard et al., 1988 ; Webb et al., 1969).

En Chine, l’écorce de P. glabratum est utilisée contre l’insomnie et l’hypertension. Cette espèce est aussi employée comme analgésique et antidote (Anon, 1993).

En Afrique, P. manii est un remède contre le paludisme et la fièvre, l’inflammation et la morsure des insectes (Clarkson et al., 2004 ; Muthaura et al., 2007).

En Inde, P. tetraspermum est utilisé contre la bronchite chronique et les feuilles servent d’antidote contre les morsures de serpent. Les feuilles sont utilisées pour soigner les infections microbiennes. L’écorce de sa racine présente une propriété narcotique et traite le rhumatisme (Yoganarasimhan, 1996 ; Agarwal, 1997). P. floribundum est utilisé contre les maladies de la peau, l’hémorroïde et la démangeaison. La poudre d’écorce (0,5 à 1 mg) est prise trois fois par jour en cas d’asthme (Savithramma et al., 2007). L’écorce est aromatique, elle est utilisée pour traiter la bronchite chronique et sert d’expectorant. A une dose élevée, elle est utilisée pour traiter la fatigue et employée comme antidote contre les poisons de serpent (Malleswari et al., 2014). L’huile essentielle de P. floribundum est un remède contre le rhumatisme, la lèpre et plusieurs autres maladies. Par leurs actions dépurative et fébrifuge, les feuilles de P. senacia sont utilisées contre les troubles cardiaques et les diabètes, la fièvre, le «tambave » (gastro-entérite des enfants). La décoction de feuilles ou de fruits de P.

Synthèse bibliographique

angustifolium est utilisée pour traiter la maladie des muscles, l’eczéma et le prurit (Lassak et McCarthy, 1983). Les fruits sont aphrodisiaques (McKemey et White, 2011).

Au Japon, les feuilles de P. tobira additionnées de sel sont utilisées pour traiter les maladies de l'espèce bovine. Son bois est employé dans la confection de petits meubles. Les propriétés astringentes de l’écorce de P. undulatum sont exploitées pour le tannage des peaux. L’huile essentielle de ses fleurs fournit un parfum de valeur importante (Grisard, 1890). L’infusion de feuilles de cette plante dans l’alcool ou le vinaigre a une propriété anti- inflammatoire (Botelho, 2007).

Dans les Iles Mascareignes, la décoction de rameaux fleuris de P. senacia est employée comme dépuratif et fébrifuge. Elle est aussi administrée en cas de fièvres et de crises nerveuses. La tisane des fleurs est donnée aux femmes allaitantes et aux jeunes enfants atteints de malnutritions protéiniques. Le fruit frais écrasé passe pour être le remède le plus spécifique contre les piqures d’araignées venimeuses. On l’applique aussi sur la morsure des sangsues arboricoles afin d’éviter qu’elle ne s’infecte (Lavergne, 1990).

A Tahiti, P. undulatum entre, avec l’huile de coco, dans la préparation du Monoï, un cosmétique très estimé des indigènes. Il est utilisé comme arbre d’ornement par la beauté de son feuillage en toutes saisons. Il est le type d’arbre le plus recherché pour greffer des espèces fruitières (porte-greffes) (Grisard, 1890).

A Madagascar, plusieurs espèces sont utilisées en médecine traditionnelle. Nombreuses sont celles connues comme anti-inflammatoires, antimicrobiennes et antispasmodiques. (Boiteau, 1986 ; Rabesa, 1986 ; Pernet, 1957). D’autres espèces sont employées comme antidotes des piqûres, P. ambrense, P. verticillatum et P. ochrosiaefolium.

L’infusion des feuilles de P. ochrosiaefolium sert à soigner la blennorragie, le décocté d’écorces est un vermifuge à dose modérée, l’infusion de tiges et de feuilles sert à calmer les maux de ventre et les feuilles mâchées sont des antidotes des piqûres des araignées venimeuses (Boiteau, 1986 ; Rabesa, 1986 ; Pernet, 1957). Elle est également utilisée contre la toux et les éruptions cutanées. Au Nord-est de Madagascar, la décoction d’écorce est préconisée pour lutter contre la fatigue, les maux de dos et les difficultés à uriner. Les feuilles sèches brûlées ont la propriété de faire taire les enfants la nuit (Nicolas, 2012).

Synthèse bibliographique

2.3. Travaux phytochimiques antérieurs sur le genre Pittosporum

La plupart des espèces Pittosporum sont riches en saponosides. Elles contiennent également des triterpènes, des sesquiterpènes et des caroténoïdes (D’Acquarica et al., 2002 ; Eparvier et al., 2007; Feng et al., 2010; Fujiwara et al., 2002; Maoka et al., 2006; Zhao et al., 2012) et des huiles essentielles.

Plusieurs types de composés ont été isolés et identifiés dans ces plantes mais comme les saponosides sont les composés les plus fréquents et les plus étudiés, nous produisons ci- dessous quelques données sur ces produits.

2.3.1. Généralités sur les saponosides

Les saponosides (ou saponines) sont des hétérosides complexes généralement d’origine végétale, possédant une partie hydrophile constituée d’oses et une partie lipophile appelée génine ou aglycone ou encore sapogénine. Ils sont aussi produits par les organismes marins (Avilov et al., 1997; Yoshiki et al., 1998).

Ils sont caractérisés par leurs propriétés tensioactives. Ils se dissolvent dans l’eau en formant des solutions moussantes (Bruneton, 2009). Ce pouvoir aphrogène est dû au caractère amphiphile des molécules : ces dernières possèdent à la fois un pôle lipophile (la génine) et un pôle hydrophile (la partie osidique). Cette dualité leur confère une activité tensioactive puissante. Ils ont un pouvoir hémolytique. Cette propriété est attribuée à leur interaction avec les stérols de la membrane érythrocytaire. L’interaction induit une augmentation de la perméabilité membranaire et un mouvement des ions : le sodium et l’eau entrent, le potassium fuit, la membrane éclate, permettant ainsi la fuite de l’hémoglobine. Ils sont également toxiques vis-à-vis des animaux à sang froid dont les poissons (icthtyotoxique).

Les saponosides possèdent des propriétés biologiques et pharmacologiques diverses. On peut citer entre autres des activités molluscicide, anti-inflammatoire, antifongique, antibactérienne, antiparasitaire, cytotoxique, antitumorale, immunostimulante et immunomodulatrice (Lacaille-Dubois et Wagner, 1996 et 2000; Lacaille-Dubois, 2005; Hostettmann et Marston, 1995).

Depuis quelques années, des recherches sur des saponosides mentionnent aussi des activités antiapoptotiques sur différents types de cellules telles que Jurkat (lymphocytes T humains leucémiques), teratocarcinome F9, hépatocytes humains, SK-HEP-1, macrophages des tissus périphériques (Lee et al., 1996; Park et al., 1997; Yui et al., 2001; Gaidi et al., 2002).

Synthèse bibliographique

Par leurs propriétés pharmacologiques, plusieurs plantes à saponosides sont utilisées par l’industrie pharmaceutique pour l’obtention de formes galéniques. Les saponosides trouvent de nombreuses applications dans l'industrie alimentaire et dans l’industrie cosmétique en raison de leur propriété moussante et émulsifiante. Ils sont également utilisés pour l'assainissement des sols (Chen et al., 2008) et comme pesticides naturels (Chapagain et al., 2007).

Structuralement, les saponosides peuvent être classés en deux groupes selon la nature de la génine : ceux à génines stéroïdiques, presque exclusivement présents chez les Angiospermes Liliopsida (Monocotylédones) et ceux à génines triterpéniques, de loin les plus nombreux existant chez les Angiospermes Magnoliopsida (Dicotylédones) et chez certains animaux marins (Bruneton, 2009).

2.3.1.1. Saponosides stéroïdique.

Leur génine est constituée d’un squelette à 27 atomes de carbone, appartenant soit au noyau spirostane (hexacyclique), soit au noyau furostane (pentacyclique) (Figure 1).

Figure 1 : Principaux squelettes stéroidiques

Les génines stéroïdiques possèdent un hydroxyle en position 3 (α ou β). D’autres hydroxyles peuvent être présents en position C-1, C-2, C-6, C-14, C-17

2.3.1.2. Saponosides triterpéniques

Leur génine à 30 atomes de carbone est soit tétracyclique (dammarane, cucurbitane, lanostane), soit pentacyclique (oléanane, ursane, lupane, friedelane, hopane, taraxastane) (Figure 2).

Synthèse bibliographique

L’hydroxyle se situe en position C-3 mais généralement de type β. Les positions C-23, C-24, C-28, C-29 et C-30 sont parfois sous forme hydroxyle, aldéhyde ou acide carboxylique. De nombreux carbones peuvent être hydroxylés (C-2, C-7, C-11, C-15, C-16, C-21, C-22). Les C12-13 sont souvent insaturés.

taraxastane

Figure 2 : Principaux squelettes triterpéniques 2.3.1.3. Les sucres

Les génines des saponosides peuvent être reliées à une ou plusieurs chaines osidiques linéaires ou ramifiées.

Synthèse bibliographique

Les oses sont le plus souvent des hexoses, des désoxyoses, des acides uroniques (au moins chez les saponosides triterpéniques) ainsi que des pentoses. Pour les saponosides dont la chaîne osidique est en position C-3, l’activité hémolytique augmente avec le nombre de sucres et est maximale pour quatre unités osidiques (Voutquenne, 2001).

2.3.1.4. Les acides organiques

Des acides organiques peuvent estérifier les hydroxyles libres présents sur les chaines osidiques ou sur la génine.

2.3.2. Les saponosides du genre Pittosporum

Les saponosides rencontrés chez les Pittosporacées sont des saponosides triterpéniques. Ils dérivent de deux squelettes, les oléananes (voir plus bas) et les ursanes (Hegnauer, 1969). Les aglycones sont de type oléan-12-ène, penta- ou tétrahydroxylés (en position 3, 15, 16, 21, 22, et 28). Mais un saponoside de type taraxastane (voir plus bas) a été récemment isolé de P. angustifolium (Bäcker et al, 2015).

Les fonctions hydroxyle en position 21, 22 et 28 sont fréquemment substituées par des acides organiques de type angéloyl, β,β-diméthylacryloyl, 2-méthylbutyroyl et 2-acétoxy-2- méthylbutanoyl.

Les glycones sont généralement des sucres comme l’α-L-arabinose et le β-D-glucose (Higuchi et al., 1983 ; Errington and Jefferies, 1988 ; Seo et al., 2002 ; D’Acquarica et al., 2002).

Plusieurs molécules de saponosides ont déjà été isolées de diverses espèces de Pittosporum :

 Les saponosides de type oléanane  L’investigation chimique de feuilles de P. tetraspermum a abouti à la caractérisation d’un saponoside nommé « acide trihydroxyoléanolique glycoside » (Figure 3), composé à activité antimicrobienne (Rosakutty et al., 2012).

Synthèse bibliographique

Figure 3 : Acide trihydroxyoleanolic glycoside

 Le R1-barrigenol (Figure 4) est une sapogénine triterpénique, extraite de P. tobira. Il a un effet contre les germes responsables de la carie dentaire (Jung-Hyun, 2014).

Figure 4 : R1-barrigenol

 Les saponosides de type taraxastane

Les figures 5 et 6 montrent des exemples de molécules de ce type.

Synthèse bibliographique

Figure 5 : Pittangretoside L, Saponoside triterpénique isolé des feuilles de P. angustifolium (Backer et al., 2015)

Figure 6 : Phillyrigenin, Saponoside triterpénique isolé de P. phillyraeoides (Errington et Jefferies, 1988)

2.4. Propriétés pharmacologiques des espèces de Pittosporum

Des études pharmacologiques ont été effectuées sur des extraits bruts, des extraits purifiés et des produits purs obtenus à partir de différentes espèces de Pittosporum et ont montré les propriétés suivantes :

2.4.1. Propriétés antimicrobiennes

Les plantes du genre Pittosporum sont surtout connues pour leurs propriétés antibactériennes et antifongiques.

Les fractions acétate d’éthyle de feuilles de P. tobira ont montré une activité antibactérienne vis-à-vis de Porphyromona gingivalis, Prevotella intermedia, et Fusobacterium nucleatum (CMI de 200 µg/ml), bactéries responsables de la carie dentaire (Jung-Hyun et al., 2014).

Synthèse bibliographique

L’extrait méthanolique de feuilles de P. phylliraeoides est actif contre Streptococcus pyogenes (CMI 8 µg/ml) et Streptococcus mirabilis et Streptococcus marcenscens (CMI 1000 µg/ml). Cet extrait est aussi actif contre Aspergillus niger avec une CMI de 40 µg/ml. L’extrait hexanique de cette plante montre une activité sur Klebsiella pneumoniae et Streptococcus marcenscens (CMI 1000 µg/ml) (Vesoul et al., 2011).

Les extraits méthanoliques de feuilles, de fruits, d’écorce et de graines de P. floribundum sont significativement actifs contre Bacillus subtilis (MTCC-441), Staphylococcus aureus (MTCC-737), Escherichia coli (MTCC-443), Aspergillus niger (ATCC-16404), Candida albicans (ATCC-10231) (Nagamalleswari et al., 2013).

Les extraits méthanoliques de feuilles de P. tetraspermum inhibent la croissance du champignon Sacrocladium oryzae (Rosakutty et al., 2012). L’extrait chloroformique d’écorce de tige de P. dasycaulon est actif sur Enterobacter aerogenes (CMI 0,325 mg/ml) (Mani et al., 2015).

2.4.2. Activité cytotoxique

L’étude réalisée sur les racines de P. verticillatum a permis d’isoler le composé PV3 (ester-saponine) à activité cytotoxique sur les lignées cellulaires SW480 (cellules cancéreuses des colons humains) et H9c2 (lignée de cellules embryonnaires de cœur) avec des valeurs d’IC50 de 12,19 et 17,30 µM, respectivement. Ce niveau d'activité est supérieur à celui de l’étoposide et celui du méthotrexate, médicaments anticancéreux de référence (Mahenina et al., 2013).

L’extrait éthanolique de fruits de P. tobira montre un effet antiprolifératif et apoptotique sur les plusieurs lignées cellulaires (adénocarcinome du colon, mélanome, …) (D’Acquarica et al., 2002).

La pancherine B extraite des feuilles de P. pancheri inhibe les cellules cancéreuses KB avec une IC50 égale à 5,1.10 M (Eparvier et al., 2007).

L’activité cytotoxique des saponines isolées de ce genre n’est pas limitée aux lignées cancéreuses, en effet les pittosides A et B isolés de P. neelgherrense sont toxiques pour les spermatozoïdes humains (Jain et al., 1980).

2.4.3. Activité toxique sur rongeurs

L’extrait brut (EB) de fruits verts de P. tobira est toxique pour la souris et le rat avec une DL50 de 25 mg/kg par voie ip et 1275 mg/kg par voie orale respectivement (D’Acquarica et al., 2002). Par voie orale, les extraits méthanolique et aqueux d’écorce de P. floribundum

Synthèse bibliographique

présentent une activité toxique sur les rats (DL50 égale à 1843,6 mg/kg et 1337,5 mg/kg respectivement) (Yasodamma et al., 2015).

2.4.4. Activité antiparasitaire

L’extrait méthanolique d’écorce de P. manii inhibe la croissance des souches de Plasmodium falciparum, résistantes à la chloroquine et de Leishmania donovani. Les concentrations inhibitrices sont respectivement de 4,3 µg/ml et 8,6 µg/ml (Kennedy et al., 2013). Ces deux parasites sont responsables du paludisme et de la leishmaniose.

2.4.5. Activité antioxydante

Des composés isolés de racines de P. glabratum ont une activité antioxydante avec des

IC50 comprises entre 35,7 et 75,1 µM (Zhao et al., 2012). P. dasycaulon montre une activité antioxydante (Mani et al., 2014).

2.4.6. Activité anti-inflammatoire

Les extraits méthanoliques d’écorce de racine et de tige de P. tetraspermum possèdent une activité anti-inflammatoire significative. Ils suppriment l’œdème induit chez le rat et son activité est plus importante par rapport à celle du phénylbutazone, l’anti-inflammatoire de référence (Rosakutty et al., 2010).

2.4.7. Activité hépatoprotectrice

Chez la souris, l’extrait méthanolique d’écorce de P. neelgherrense montre une activité hépatoprotectrice similaire à la silymarine qui est un composé connu pour son effet protecteur sur les membranes plasmatiques des cellules hépatiques (Ramellini et Meldolesi, 1976).

3. LES ORGANISMES NUISIBLES 3.1. Les différents organismes nuisibles

Les organismes nuisibles sont des organismes qui portent atteinte à la santé de l’être humain ainsi qu’à la productivité et la qualité de ses ressources et de ses biens. Parmi les auteurs de ces méfaits, on peut citer :

- les insectes ravageurs de culture et de récolte (chenilles, criquets, charançons, pucerons, …), - les insectes vecteurs de maladies (moustiques, mouches tsé-tsé, puces, …) - les parasites (vers intestinaux),

Synthèse bibliographique

- les microorganismes pathogènes (bactéries pathogènes, moisissures d’aliments, champignons phytopathogènes), - les animaux nuisibles (rongeurs, corbeaux …) - les mauvaises herbes.

3.2. Les dégâts causés par les organismes nuisibles

Dans les pays en voie de développement comme Madagascar, les dégâts causés par les organismes nuisibles aggravent la situation socio-économique déjà précaire. Parmi les plus graves figurent :

- les invasions périodiques de criquets qui continuent à entraîner des conséquences désastreuses sur les récoltes et les moyens de subsistance des populations ; - la dévastation des champs de culture, la destruction des récoltes, la détérioration des denrées alimentaires par les rongeurs nuisibles qui se nourrissent des graminées et des légumineuses et attaquent aussi les racines.

À titre d’illustration, les souris peuvent attaquer toutes les denrées alimentaires. De plus, leurs terriers et leurs galeries provoquent la destruction du couvert végétal avec comme conséquence une chute des rendements et une aire d’installation propice aux adventices. Elles attaquent aussi les denrées stockées et peuvent causer beaucoup de dégâts et déchets dans l’enceinte d’une exploitation (Crémer et al., 2006).

- L’émergence et la ré-émergence de maladies contagieuses potentiellement mortelles : les rats véhiculent différentes maladies dangereuses voire mortelles pour l’Homme comme la peste et la rage. Les moustiques par exemple sont responsables de la transmission de maladies parasitaires telles la filariose, la fièvre jaune et le virus West Nile. Les bactéries du genre Salmonella enteridis sont les responsables de la gastroentérite ou de l’intoxication alimentaire, de la bactériémie et de la fièvre entérique (Ryan et al, 2004).

- Destruction des biens et services : les rongeurs sont amenés à user leurs incisives qui ont une croissance permanente. Ils s’attaquent ainsi à toutes sortes de matériaux : papier, cuir, poutres et planches de bois, tuyauteries de plomb, isolants de câbles électriques.

3.3. Les moyens de lutte contre les organismes nuisibles

Pour faire face à ce fléau, de multiples stratégies et moyens ont été mis en œuvre. Depuis la moitié du XXème siècle, le moyen le plus facile, le plus rapide et le plus efficace

Synthèse bibliographique

découvert pour maitriser ces différentes nuisances a été l’emploi des antimicrobiens et des pesticides.

Les pesticides sont des poisons destinés à tuer les mauvaises herbes (herbicides), les insectes (insecticides), à lutter contre les champignons (fongicides), ou à se débarrasser de divers animaux jugés nuisibles (souricides, raticides, nématicides…). Ce sont des composés minéraux ou organiques de structures très diverses, aux propriétés physico-chimiques et rémanentes multiples. Les pesticides sont classés en deux grands groupes principaux : les pesticides chimiques de synthèse et les biopesticides.

3.3.1. Pesticides de synthèse

Dans les campagnes de lutte contre les organismes nuisibles dans les années 60, les pesticides de synthèse constituaient le seul moyen de lutte car ces composés ont fait preuve d’efficacité.

Les rodenticides et les insecticides (pyréthrinoïdes, des carbamates...) permettent de lutter contre les rongeurs (rats, souris…) et les insectes nuisibles (insectes parasites des plantes et insectes vecteurs de maladies humaines et animales).

Les herbicides (les acides, les chloracétanilides, les nitriles, les urées substituées, les ammoniums quaternaires, les carbamates) sont des pesticides destinés à éliminer les végétaux entrant en concurrence avec les plantes à protéger. Ils peuvent être des perturbateurs de la régulation de l’auxine (principale hormone de croissance), de la photosynthèse ou encore des inhibiteurs de la division cellulaire, de la synthèse des lipides, de la cellulose ou des acides aminés (El Mrabet, 2008).

Les fongicides et les antibiotiques permettent de combattre la prolifération des maladies provoquées par des champignons et des bactéries. Ils peuvent agir sur ces microorganismes soit en inhibant la synthèse de la paroi bactérienne et le fonctionnement des acides nucléiques, soit en perturbant la synthèse protéique et en agissant sur la membrane plasmique.

Du fait de leur usage étendu, de leur caractère persistant et de la présence de leurs résidus dans les milieux et dans l’alimentation, les pesticides de synthèse posent un réel problème de santé publique puisque l’ensemble de la population est susceptible d’être exposé à leurs effets. Pour éviter leurs effets nocifs, les moyens actuels font appel à plusieurs systèmes de lutte biologique.

Synthèse bibliographique

3.3.2. Biopesticides

Pour contribuer à une gestion durable de l’environnement, la mise en place de nouvelles méthodes plus naturelles pour contrôler les organismes nuisibles est davantage encouragée. Les biopesticides peuvent être à base de bactéries, champignons, virus, nématodes et les substances naturelles des plantes qui présentent un large spectre d’action peuvent être utilisées comme pesticides de remplacement (Vincent, 1998).

A titre d’illustration, en voici quelques exemples :

- les toxines de Bacillus thuringiensis ont une propriété « anti-insectes », attaquant les larves des lépidoptères (chenilles) et les larves de moustique (Lambert, 2010). - Le champignon entomopathogène Beauveria bassiana tue une grande variété d’insectes et d’acariens par la production de toxines et la consommation de leurs nutriments (Lambert, 2010). - Les nématodes Steinernema carpocapsae, Heterorhabditis bacteriophera et Heterorhabditis marilatus attaquent les vers blancs (Lambert, 2010). - Les graines de la Méliacée Azadirachta indica, fournissent une huile utilisée depuis des siècles par les paysans pour protéger les stocks de céréales des attaques d’insectes, criquets et scarabées,… (Bézanger-Beauquesne, 1955). - Les bulbes de Rhodocodon madagascariensis (Hyacinthacées) sont employés comme raticides à Madagascar (Rakotobe, 2009). - La graine du vomiquier, Strychnos Nux-vomica (Loganiacées), originaire des régions indomalaise et indochinoise est utilisée depuis longtemps pour la confection d'appâts utilisés pour lutter contre les oiseaux et les mammifères nuisibles (Bézanger-Beauquesne, 1955). Le principe toxique est la strychnine, un alcaloïde de structure complexe.

Chapitre II

Etude chimique

1. INTRODUCTION

Ce chapitre est consacré aux procédés d’extraction et de purification des extraits et produits utilisés pour les investigations biologiques et à la détermination des métabolites secondaires qu’ils contiennent.

2. MATERIELS ET METHODES UTILISES 2.1. LE MATERIEL D’ETUDE 2.1.1. Description botanique (Boiteau, 1986)

Pittosporum ochrosiaefolium est un arbrisseau ou arbre de moyenne taille, atteignant 10 m de hauteur (Figure 7). L’écorce des jeunes rameaux est d’un gris brunâtre, avec des lenticelles plus ou moins nombreuses.

Les feuilles sont souvent groupées à l’extrémité des rameaux, finement coriaces et fermes, à marge étroite cartilagineuse (Figure 7). Bien qu’étant ordinairement mates dessus, elles sont plus claires et vert foncé en dessous, mais toujours entièrement glabres. Elles sont de forme elliptique, largement obovales, plus ou moins longuement rétrécies en un pétiole long de 15 à 20 mm arrondie, pointues, à pointe courte et obtuse.

La nervure médiane est déprimée au-dessus en un étroit sillon, fortement en relief en dessous, assez fortement amincie jusqu’à la pointe.

Les nervures latérales sont au nombre de 6-10. Elles sont rarement plus ascendantes arquées, presque toujours nettement brochidodromes.

L’inflorescence terminale est riche en fleurs, elle est parfois renforcée de rameaux axillaires insérés aux aisselles des feuilles supérieures, de densité et de tailles variables. Les axes sont pubescents jaunâtres, plus rarement glabrescents ou glabres.

Les fleurs sont en fascicules subombelliformes ou corymbiformes, 5-8 fleurs sur les pédicelles longs de 3-10 mm, pubescents ou rarement glabres, à odeur agréable d’orange. Les sépales sont libres non imbriqués, ovales et étroits, en général obtus, pubescents sur la marge, rarement presque glabres. Les pétales sont blancs purs, blanc-jaunâtre ou blanc-verdâtre, oblongs, obtus, le tiers supérieur courbé en arrière.

Etude chimique

Feuilles

Plante entière Rameau feuillu Tige

Fruits Amandes

Figure 7 : Pittosporum ochrosiaefolium var madagascariense

Etude chimique

Les fruits sont ovoïdes atteignant 8-10 mm de diamètre à maturité. Ils sont de couleur jaune. Les valves de la capsule sont coriaces, rigides, ayant une épaisseur de 1,5 mm. Les amandes sont de couleur rouge au nombre de 8-12 dans une graine. Elles sont collées entre elles par une substance visqueuse (Figure 7).

2.1.2. Classification

(Tropicos, 2009)

Règne : PLANTAE Embranchement : TRACHEOPHYTA Classe : MAGNOLIOPSIDA Sous classe : MAGNOLIDAE Ordre : APIALES Famille : PITTOSPORACEAE Genre : Pittosporum Espèce : ochrosiaefolium Variété : madagascariense Nom vernaculaire : Ambovitsika, Maimbovitsika, Ambora-itsaha, Azombary, Fantsikala, Hazomboy

2.1.3. Répartition géographique

La plante se rencontre dans les forêts ombrophiles, dans les zones à climat humide et chaud de la partie Est de l’ile (Figure 8).

2.1.4. Lieu de récolte

La plante a été récoltée au Parc National de Ranomafana au mois de février 2012 à son stade de fructification.

2.2. LES PRODUITS CHIMIQUES

Les produits chimiques utilisés sont de qualité pour analyse et de marque MERCK ou PROLABO. Les supports utilisés pour la chromatographie sur couche mince (CCM) sont des plaques de gel de silice 60 F254 (marque MERCK) prêtes à l’emploi, de dimensions 20 × 20 cm, avec une épaisseur de couche de 0,2 mm. Les plaques peuvent être découpées aux dimensions voulues.

Etude chimique

Figure 8: Répartition géographique de Pittosporum ochrosiaefolium (Source : Carte des limites administratives des Madagascar FTM, 1984)

Etude chimique

2.3. PROCEDES D’OBTENTION DES EXTRAITS ET PRODUITS PURIFIES

2.3.1. Préparation du matériel d’étude

Les feuilles séchées à l’abri de la lumière solaire sont broyées à l’aide d’un mixer et la poudre ainsi obtenue, conservée dans des bocaux bien fermés à la température ambiante, constitue le matériel d’étude.

2.3.2. Préparation de l’extrait brut

La méthode d’extraction par épuisement ou extraction par lixiviation a été utilisée pour extraire les principes toxiques de la plante.

Deux solvants de polarité différente, l’hexane et le méthanol sont utilisés. La poudre est d’abord dépigmentée par épuisement par l’hexane. Pour cela, elle est mise en suspension dans le solvant puis, le mélange est soumis à une agitation magnétique à la température ambiante pendant 3 h. Le surnageant est alors filtré puis l’opération est répétée jusqu’à ce que le surnageant ne soit plus coloré (Randrianarivo et al., 2014).

Le marc dépigmenté est ensuite épuisé avec le méthanol selon la technique ci-dessus. Le traitement est arrêté quand le solvant n’est plus coloré. Après filtration, le surnageant issu de chaque extraction est concentré par évaporation à basse pression et à 50°C à l’aide d’un évaporateur BÜCHI ROTAVAPOR (R110) jusqu’à l’obtention d’un résidu sec.

2.3.3. Extraction des saponosides totaux

Plusieurs molécules de saponosides à propriétés pharmacologiques intéressantes ont déjà été isolées du genre Pittosporum et c’est la raison pour laquelle nous avons eu recours à l’extraction des saponosides totaux. L’extraction des saponosides totaux est effectuée selon la méthode utilisée par Rajemiarimoelisoa (2000). Le résidu sec de l’extrait méthanolique obtenu précédemment est dissous dans du méthanol pur. Placé dans un bain de glace, un mélange d’acétone/éther (V/V) est ajouté goutte à goutte dans la solution ainsi préparée jusqu’à ce qu’aucun précipité ne soit plus observé. Le précipité formé est récupéré par centrifugation (1000 tr/min pendant 5 min à +4°C). Il est ensuite dissous dans l’eau distillée (ED) et le résidu d’évaporation à sec de la solution obtenue constitue les saponosides totaux. Le surnageant est évaporé et le résidu sec obtenu, dissous dans l’ED forme la fraction non saponosidique.

2.3.4. Purification des saponosides

Plusieurs procédés de purification ont été utilisés afin d’obtenir des extraits purifiés.

Etude chimique

La purification a été guidée par un test de toxicité sur souris et d’homogénéité en chromatographie sur couche mince (CCM, voir technique plus bas) et par un criblage des familles chimiques présentes dans les fractions.

2.3.4.1. Partition par le n-butanol

Les saponosides totaux dissous dans l’ED sont fractionnés par le n-butanol (V/V). La phase aqueuse séparée de la phase butanolique est de nouveau soumise à deux autres traitements successifs. Les phases organiques et les phases aqueuses sont rassemblées séparément puis évaporées jusqu’à l’obtention de résidus secs. Chaque résidu repris dans l’ED, est testé sur souris.

2.3.4.2. Fractionnement par chromatographie d’exclusion sur gel de Sephadex LH-20

La chromatographie par perméation de gel ou chromatographie d’exclusion stérique est une technique qui permet la séparation des molécules en fonction de leur taille (masse moléculaire) et de leur forme (structure spatiale) (Hostettmann et al., 1997). La colonne utilisée est remplie d’un gel réticulé de dextrane (Sephadex® LH-20) présentant des caractères lipophiles (groupements isopropyles) et hydrophiles (groupement hydroxyle). Les grosses molécules, dont le diamètre est supérieur à celui des pores du gel sont exclues et sont éluées en premier. Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses dans le gel. L’éluant est constitué par un mélange de Dichlorométhane/Méthanol (DCM/MeOH) 50/50 (V/V).

Le gel est mis à gonfler pendant 3 h à la température ambiante dans le solvant d’élution puis dégazé sous pression réduite. La suspension est ensuite coulée dans une colonne de verre de dimensions connues. Lorsque le gel est complètement sédimenté, sa surface supérieure est stabilisée avec un disque de papier filtre. La colonne est ensuite équilibrée par le solvant d’élution (3 fois volume de la colonne). L’extrait à chromatographier est déposé à raison de 5% du volume total de la colonne. L’élution se fait par gravité.

Cette méthode a été utilisée pour séparer les saponosides (grosses molécules) des flavonoïdes (molécules plus petites).

2.3.4.3. Chromatographie à moyenne pression sur flash colonne

Un verre fritté rempli de silice tassé est fixé sur une fiole à vide. L’échantillon à purifier est déposé sous forme solide mélangé avec de la silice. L’élution s’effectue sous pression par une pompe à vide. Les composés élués sont récupérés à la sortie de la colonne dans la fiole. Le

Etude chimique suivi de la purification est fait par CCM.

La phase stationnaire est formée par le gel de silice de fine granulométrie (6 nm). La phase mobile est constituée par un système de solvants de polarité croissante :

DCM/MeOH/H2O de gradient discontinu 100/0/0 ; 90/10/0 ; 80/20/2 ; 70/30/5 ; 60/32/7 ; 50/50/0 ; 40/50/10 ; 0/100/0 ; 0/0/100.

2.4. METHODES ANALYTIQUES 2.4.1. Chromatographie sur couche mince

La CCM est une méthode analytique basée sur les phénomènes de partage et d’adsorption. Les composés se déplacent sur un support solide, le gel de silice (MERCK), entraînés par un solvant organique. La vitesse de déplacement des substances dépend de leur affinité pour la phase mobile organique d'une part, et des forces d’adsorption dues au support d'autre part. Cette méthode décrite par Audigier et al. (1982) et Mahuzier et Hamon (1986) permet de contrôler la pureté d'un composé organique, de suivre la progression d'une réaction chimique et d’identifier les constituants d'un mélange.

Phase stationnaire : plaque de gel de silice 60 F254 Phase mobile : système de solvants Butanol-Acide acétique-Eau (60/20/20, P/P/P) Révélation : 2 méthodes de révélation ont été adoptées :

 visualisation directe de la plaque sous lumière ultraviolette à 254 nm et à 366nm. Les constituants apparaissent sous forme de taches fluorescentes colorées.  pulvérisation de la plaque avec le réactif à la vanilline sulfurique 0,5 % (Hiai et al., 1976). Les constituants apparaissent sous forme de taches roses qui noircissent après chauffage à 120°C pendant 5 min.

2.4.2. Détermination des familles chimiques

Les réactions de détection des familles chimiques présentes dans un extrait végétal ou criblage phytochimique sont effectuées sur différents extraits selon les méthodes utilisées par Marini-Bettolo et al. (1981), Harborne (1984) et Fong et al. (1997).

2.4.2.1. Préparation des extraits

Les extraits sont préparés : - soit à partir de la poudre de feuilles, - soit à partir du résidu d’évaporation à sec de la solution à analyser.

Etude chimique

2.4.2.1.1. Extrait acide

Dans un tube à essai, 2 ml d’acide chlorhydrique (HCl) 2 N sont ajoutés à 500 mg de poudre de feuilles ou de résidu sec. Le mélange est laissé macérer à +4°C pendant 12 h puis filtré. Le filtrat obtenu constitue l’extrait acide servant à détecter les alcaloïdes.

2.4.2.1.2. Extrait hydroéthanolique

La poudre ou le résidu sec (500 mg) est mis en suspension dans 10 ml de mélange hydroéthanolique 75 %. Après macération pendant une nuit, une filtration conduit à l’obtention d’un extrait hydroéthanolique permettant la détection des flavonoïdes et des leucoanthocyanes.

2.4.2.1.3. Extrait aqueux

Dans un tube à essai, 500 mg de poudre ou de résidu sec sont délayés dans 10 ml d’ED. Le mélange est porté à ébullition pendant 30 min puis mis à macérer à +4°C pendant 12 h. L’extrait aqueux obtenu après filtration est utilisé pour détecter les iridoïdes, les saponosides, les tanins et polyphénols, les désoxyoses ainsi que les quinones.

2.4.2.1.4. Extrait chloroformique

La poudre ou le résidu sec (500 mg) est mélangé(e) avec 3 ml de chloroforme. Le tube est hermétiquement fermé et la suspension est laissée macérer à +4°C pendant au moins 12 h. L’extrait chloroformique est obtenu après filtration de la suspension. Cet extrait est utilisé pour détecter les stéroïdes et les triterpènes.

2.4.2.2. Détection des alcaloïdes

L’extrait acide est réparti dans quatre tubes à essai (1 ml par tube) dont le premier sert de témoin et les trois autres sont additionnés respectivement de quelques gouttes de réactifs de MAYER, de WAGNER et de DRAGENDORFF.

L’apparition dans les trois tubes d’un précipité qui se dissout après ajout d’éthanol absolu indique la présence d’alcaloïdes dans l’extrait.

La composition des réactifs est donnée en Annexe I.

2.4.2.3. Détection des flavonoïdes (Test de WILLSTÄTTER)

Quelques gouttes de HCl 12 N et 2 tournures de magnésium sont ajoutées dans 1 ml d’extrait hydroéthanolique. Le changement de coloration traduit la présence des flavonoïdes :

Etude chimique

- coloration rouge pour les flavonols aglycones - coloration orange indiquant la présence des flavonones aglycones.

2.4.2.4. Détection des leucoanthocyanes (Test de BATE-SMITH)

Dans un tube à essai, un mélange de 0,5 ml d’extrait hydroéthanolique et de 0,5 ml de HCl 12 N est porté à ébullition pendant 30 min.

L’apparition d’une coloration rouge après refroidissement indique la présence de leucoanthocyanes.

2.4.2.5. Détection des saponosides (Test de mousse)

L’extrait aqueux est agité énergiquement pendant au moins 5 min.

L’apparition d’une mousse de 3 cm de hauteur, persistant pendant 30 min indique la présence de saponosides.

2.4.2.6. Détection des tanins et polyphénols

Trois tubes à essai contenant chacun 0,5 ml d’extrait aqueux sont utilisés.

a) Test à la gélatine Quelques gouttes de gélatine 10 % (P/V) sont ajoutées dans le premier tube. L’apparition d’un précipité révèle la présence de tanins hydrolysables de type catéchique.

b) Test à la gélatine salée La formation de précipité après ajout de quelques gouttes de gélatine salée (gélatine aqueuse 1% mélangée avec du NaCl 10 %) dans l’extrait indique la présence de tanins condensés de type pyrogallique.

c) Test au chlorure ferrique Après ajout de chlorure ferrique 10 % en solution méthanolique dans l’extrait aqueux, le virage de la coloration au bleu-vert indique la présence de tanins de type catéchol, tandis qu’une coloration noir-bleuâtre démontre celle de tanins de type pyrogallol.

Une réaction négative à la gélatine salée accompagnée d’une coloration bleu-vert ou bleu-noir avec FeCl3 signifie que d’autres types de composés phénoliques sont présents.

2.4.2.7. Détection des désoxyoses (test de KELLER-KILIANI)

L’extrait aqueux est repris dans 0,5 ml de FeCl3 10 % additionné de 0,5 ml d’acide acétique glacial. Après une légère agitation du mélange, de l’acide sulfurique (H2SO4) 36 N est

Etude chimique versé le long de la paroi du tube incliné.

La présence de désoxyoses est montrée par l’apparition d’un anneau pourpre à l’interface.

2.4.2.8. Détection des iridoïdes

Un mélange de 0,5 ml d’extrait aqueux et de quelques gouttes de HCl 2 N est chauffé au bain-marie bouillant pendant 30 min.

L’apparition d’un précipité vert foncé ou bleu foncé révèle la présence d’iridoïdes.

2.4.2.9. Détection des anthraquinones (test de BORNTRAGER)

Le benzène de volume 1 ml est mélangé avec l’extrait aqueux (V/V). La solution obtenue est agitée énergiquement puis laissée au repos jusqu’à l’obtention de 2 phases bien nettes : une phase aqueuse et une phase benzénique. Le mélange est ajouté de 0,5 ml d’ammoniaque (NH4OH) 25 %. Le virage de la phase alcaline (phase inférieure) au rouge indique la présence d’anthraquinones.

2.4.2.10. Détection des quinones libres

La poudre de matériel végétal ou le résidu sec (1 g) est délayé dans 15 à 30 ml d’éther de pétrole. Après un repos de 24 h, le mélange est filtré. Après ajout de NH4OH N/10, le virage de la phase aqueuse au jaune, rouge ou violet révèle la présence de quinones libres.

2.4.2.11. Détection des stéroïdes et triterpènes

Les méthodes utilisées sont celles de Liebermann-Burchard et de Salkowski.

a) Test de LIEBERMANN-BURCHARD Quelques gouttes d’anhydride acétique sont ajoutées dans 0,5 ml d’extrait chloroformique. Le mélange est ensuite soumis à une légère agitation, puis 2 ml de H2SO4 36N y sont additionnés.

Le résultat est observé au bout de 1 h. La présence de triterpènes est indiquée par l’apparition d’un anneau rouge violacé tandis que la coloration de la phase aqueuse en vert révèle la présence de stéroïdes.

b) Test de SALKOWSKI

Un millilitre de H2SO4 36 N est versé dans le troisième tube en position inclinée.

Etude chimique

L'apparition d'un anneau rouge au niveau de l'interface indique la présence de stérols insaturés.

2.4.2.12. Détection des hétérosides cardiotoniques (réaction de KEDDE)

L'extrait utilisé est obtenu de la façon suivante : dans un tube à essai, 0,5 g de poudre végétale et 2 ml d'anhydride acétique sont mélangés. Après chauffage au bain-marie bouillant sous agitation pendant 2 min, la solution est filtrée. De l'acide sulfurique 36 N (1 ml) est ajouté délicatement au filtrat à l'aide d'une pipette de manière à obtenir deux phases.

Le résultat est positif si une coloration rouge-brun se développe à l'interface.

2.4.2.13. Détection des hétérosides cyanogénétiques

Une bandelette de papier filtre imprégnée de picrate de sodium est insérée dans un tube à essai contenant d’extrait chloroformique. Le tube est ensuite placé au bain-marie à 35°C pendant 3 h tout en observant le changement éventuel de la coloration du papier-filtre.

Les hétérosides cyanogénétiques provoquent un virage de la couleur de ce dernier, du jaune au rouge.

2.4.2.14. Détection des coumarines

La poudre de matériel végétal (1 g) ou de résidu sec est mélangée à 10 ml de dichlorométhane. Le mélange est chauffé pendant quelques minutes puis filtré. Les filtrats sont soumis à une analyse CCM (voir méthode au § 2.4.1, p. 25) en utilisant comme éluant un mélange de toluène et d’acétate d’éthyle (90/10). Après élution, le chromatogramme est visualisé à 366 nm en absence et en présence de NH3 qui sert de révélateur.

L’apparition d’une fluorescence jaune confirme la présence de coumarines.

3. RESULTATS 3.1. L’extrait brut méthanolique

La poudre de feuilles (100 g) a été dépigmentée par l’hexane (5 x 500 ml) puis extraite par le méthanol (5 x 500 ml) selon la technique décrite au § 2.3.2 (p. 23). Les rendements d’extraction, l’aspect et la couleur sont présentés dans le tableau 1.

Etude chimique

Tableau 1: Caractéristiques des différents extraits préparés à partir des feuilles de Pittosporum ochrosiaefolium

Solvants Aspect Couleur Rendement Hexane visqueux vert noir 15,4 % Méthanol limpide vert clair 20,59 %

L’extrait obtenu après évaporation de l’hexane forme l’extrait hexanique qui a été testé seulement sur les microorganismes.

Du point de vue toxicité sur souris, l’extrait méthanolique s’est avéré toxique. Il constitue alors l’extrait brut ou extrait méthanolique de feuilles (EMF) avec lequel tous les tests biologiques sont faits. Ce choix est dicté par les avantages apportés par l’usage des extraits bruts. D’abord, dans la perspective d’appliquer les propriétés mises en évidence, les extraits bruts riches en différentes familles chimiques sont performants à cause des synergies d’action possibles entre les constituants présents. D’autre part, il est difficile pour les organismes cibles de développer une résistance vis-à-vis des nombreux principes actifs d’un extrait brut (Rice, 1984).

3.2. Les saponosides totaux

Comme il a été dit plus haut (voir p. 8), les saponosides sont des constituants majeurs de plusieurs espèces de Pittosporum, nous avons extrait les saponosides de l’EMF.

Le résidu sec de l’EMF (10 g) a été dissous dans du méthanol pur. La solution limpide obtenue a été placée dans un bain de glace puis additionnée de mélange d’acétone/éther (V/V) selon la méthode donnée au § 2.3.3 (p. 23). Le précipité a été récupéré et le surnageant a été de nouveau soumis à une précipitation à l’acétone/éther. L’opération a été répétée plusieurs fois jusqu’à ce qu’aucun précipité n’est plus observé. Au total, 4 L de mélange d’acétone-éther a été utilisé pour extraire les saponosides contenus dans 10 g de feuilles. Les précipités obtenus ont été dissous dans l’ED. Le résidu obtenu après évaporation à sec constitue les saponosides totaux SAP (4,8 g) (toxiques sur souris). Les surnageants ont été évaporés à sec et le résidu obtenu est dissous dans l’ED. Le résidu obtenu après évaporation de l’ED constitue la fraction non saponosidique nSAP (non toxique sur souris).

3.3. Les extraits purifiés

A partir des saponosides totaux, des techniques de purification utilisant notamment les

Etude chimique différences de solubilité et de poids moléculaire ont été effectuées afin d’isoler les principes actifs.

3.3.1. Les extraits obtenus par fractionnement par le n-butanol

Les saponosides totaux (4,8 g) dissous dans l’ED (200 ml) ont été mélangés avec le n- butanol (200 ml) selon la méthode décrite au § 2.3.4.1 (p. 24). L’opération a été répétée 3 fois. Cette étape a permis d’obtenir une phase aqueuse Saq (0,8 g) non toxique sur souris et une phase organique Sbut (3,36 g) toxique.

3.3.2. Les extraits obtenus par chromatographie

La phase organique Sbut a été soumise à une chromatographie d’exclusion sur gel de Sephadex LH-20. Le résidu sec de Sbut (500 mg) est repris dans 1 ml du système de solvants. La solution obtenue est déposée sur une colonne de 30 ml. La colonne a été éluée par gravité par le système isocratique DCM/MeOH : 50/50, V/V avec un débit d’environ 0,5 ml/min/cm2. Les fractions recueillies ont été concentrées puis regroupées sur la base de leur comportement en CCM. En tout, 5 fractions F1 à F5 ont été obtenues. Au total 6 chromatographies ont été nécessaires pour fractionner 3 g de Sbut.

D’après les tests sur souris, les fractions 1 à 3 étaient toxiques (voir § 3.1.4 et 3.1.6, p. 46 et 47). Un criblage phytochimique des fractions a montré que F1 et F2 contiendraient uniquement des saponosides, F3 et F4 renfermeraient un mélange de saponosides et de flavonoïdes et F5 ne contiendrait que des flavonoïdes.

Une deuxième purification par chromatographie flash sur gel de silice en phase normale a été entreprise sur la fraction F2 qui était la plus toxique sur souris et dont le rendement de purification était important (2,15 %). Le résidu sec de F2 (300 mg) a été fractionné sur 10 g de gel de silice 60 Å, 0,06-0,2 mm (ACROS). En suivant le protocole décrit au § 2.3.4.3 (p. 24), la chromatographie flash a fourni 9 fractions S1 à S9 hautement purifiées.

Le diagramme de la figure 9 (p. 32) résume les différentes étapes d’obtention des extraits et produits purifiés.

Etude chimique

Poudre de feuilles Dépigmentation par épuisement par hexane

Poudre dépigmentée

Extraction par le méthanol

EMF Précipitation par l’acétone/éther (V/V)

Saponosides totaux SAP

Partition au n-butanol

Phase aqueuse Phase butanolique Saq Sbut

Chromatographie LH-20 (DCM/MeOH 50/50, V/V)

F1 F2 F3 F4 F5

SiO2 (DCM/MeOH/H2O)

100/0/0 90/10/0 80/20/2 70/30/5 60/32/7 50/50/0 40/50/10 0/100/0 0/0/100

S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9

Figure 9 : Les différentes étapes d’obtention des différents extraits et produits purifiés à partir des feuilles de Pittosporum ochrosiaefolium

3.4. Les familles chimiques présentes dans les différents extraits Un criblage phytochimique a été effectué sur la poudre du matériel végétal et l’EMF puis sur les fractions obtenues à chaque étape de purification afin de détecter les différentes familles chimiques. Les résultats sont récapitulés dans le tableau 2 (p. 33).

Etude chimique

Tableau 2: Résultats du criblage phytochimique effectué sur les différents extraits de feuilles de Pittosporum ochrosiaefolium

Extrait utilisé Famille chimique Test Poudre EMF SAP Sbut Mayer - - - - Extrait acide Alcaloïdes Wagner - - - - Dragendorff - - - - Extrait Leucoanthocyanes Bate-Smith - - - - hydroéthanolique Flavonoïdes Willstätter + + + + Gélatine - - - - Tanins et Gélatine salée + + - - polyphénols Chlorure ferrique + + + - Extrait aqueux Irridoïdes + + - - Saponosides Test de mousse + + + + Désoxyoses Keller-Kiliani + + + + Anthraquinones Borntrager - - - - Stéroïdes Liebermann- - - - - Triterpènes Burchard + + + + Extrait Stérols insaturés Salkowski + + + - chloroformique Coumarines - - - - Hétérosides - - - - cyanogénétiques Hétérosides Kedde - - - - cardiotoniques

D’après ces résultats, la poudre de feuilles, EMF, SAP et Sbut ont réagi positivement aux tests des saponosides, triterpènes, désoxyoses et flavonoïdes. Seuls la poudre, EMF et SAP contiendraient des tanins et polyphénols ainsi que des stérols insaturés.

3.5. Degré d’homogénéité des extraits

Les chromatogrammes de la figure 10 montrent l’évolution de l’homogénéité des différents extraits toxiques obtenus aux différentes étapes de purification. La plaque CCM a été développée dans du B/A/E 60/20/20 (P/P/P). La figure 10 montre les chromatogrammes visualisé sous lumière ultraviolette à =254 nm (10 a) et révélé par la vanilline sulfurique (10 b).

Etude chimique

Figure 10 : Chromatogramme visualisé à la lumière UV (=254 nm) (a) et révélé à la vanilline sulfurique (b) EMF : Extrait méthanolique ; SAP : Saponosides totaux ; SA : Phase aqueuse ; SB : Phase organique ; F1 à F5 : Fractions obtenues après fractionnement sur chromatographie sur gel de Sephadex LH-20 ; S1 à S9 : Fractions obtenues par chromatographie flash

4. DISCUSSION et CONCLUSION

Le criblage phytochimique réalisé sur la poudre de feuilles de P. ochrosiaefolium a révélé la présence de saponosides, de triterpènes, de stérols insaturés, des tanins et polyphénols, des flavonoïdes et des iridoïdes. Cependant, comme dans le cas de nombreuses espèces de Pittosporum (Linnek et al., 2012 ; Mahenina et al., 2013 ; Nyongbela et al., 2013), les saponosides étaient les plus abondants.

Etude chimique

Cette prédominance des saponosides nous a conduits à extraire les saponosides de l’EMF. La partition par le n-butanol a permis d’éliminer dans la phase aqueuse les tanins, les polyphénols, les iridoïdes et les stérols insaturés qui contaminaient les saponosides totaux d’après l’analyse phytochimique. Cette dernière a montré que la phase butanolique toxique contiendrait des saponosides, des désoxyoses, des triterpènes et des flavonoïdes. Ainsi, parmi ces composés, les désoxyoses et les triterpènes pourraient être les éléments constitutifs des saponosides. Par conséquent, les flavonoides seraient des contaminants. Il est actuellement reconnu que lors d’une partition par le n-butanol, seuls les saponosides à courte chaine d’oligosaccharides sont éventuellement extraits dans la phase butanolique (Françis et al., 2002). Par contre, ceux qui sont à longue chaine sont plus solubles dans la phase aqueuse. Les saponosides toxiques de P. ochrosiaefolium seraient donc des saponosides à courte chaine osidique avec une génine triterpénique associée à des désoxyoses. A l’étape suivante, la chromatographie sur Sephadex LH-20 a permis de séparer les flavonoïdes des saponosides.

Le test de toxicité sur souris a révélé que les responsables de l’activité toxique de la plante seraient des saponosides, car la fraction F5 constituée uniquement de flavonoïdes n’a montré aucune toxicité. A partir de la fraction saponosodique F2, une purification plus poussée a été entreprise au moyen d’une chromatographie flash à moyenne pression sur gel de silice utilisant un gradient de concentration de DCM/MeOH/H2O. Neuf sous-fractions différentes ont été obtenues. D’après l’analyse par CCM, elles étaient hétérogènes.

Les saponosides se trouvaient probablement sous forme de mélanges complexes très instables. La forte polarité, la relative fragilité et les différences structurales mineures entre ces composés de masse moléculaire élevée (>900 g/mol) rendaient difficile l’obtention de molécules pures et homogènes même si les techniques utilisées étaient performantes.

Des saponosides ont pu être isolés à l’état pur à partir de P. verticillatum (Mahenina et al., 2013) et P. angustifolium (Sadgrove et al., 2016) à l’aide de méthodes similaires mais leur protocole comportait plus d’étapes, parmi lesquelles figuraient des techniques de pointe telles que la chromatographie par HPLC, ou celle sur silice spécifique dont notre laboratoire ne dispose pas.

En conclusion, comme dans le cas de plusieurs espèces de Pittosporum, les saponosides triterpéniques sont les métabolites secondaires prédominants trouvés chez P. ochrosiaefolium. Ils sont responsables de la toxicité sur souris alors que les flavonoïdes, non toxiques sur souris, pourraient être les supports d’autres activités biologiques. Pour ces composés actifs, le nombre et la structure restent encore à déterminer 35

Chapitre III

Etude des effets sur les animaux

Effets sur les animaux

1. INTRODUCTION

Des expériences préliminaires ont démontré la toxicité de l’extrait méthanolique (EMF) de feuilles de P. ochrosiaefolium pour la souris. Aussi, pour bien cerner et caractériser cette toxicité nous avons procédé à :

- l’évaluation de la toxicité aiguë et chronique sur souris (description des différents symptômes, détermination de l’indice de toxicité DL50) ; - la localisation des sites d’action des principes actifs, par l’étude histopathologique d’organes de souris traitées par l’EMF et l’étude des effets de cet extrait sur les fonctions cardiaque, rénale et hépatique par la détermination des paramètres biochimiques (ALAT, ASAT et créatinine) ; - la détermination des effets de l’extrait sur d’autres animaux à sang chaud et à sang froid afin d’identifier les animaux sensibles et les précautions à prendre lors des éventuelles utilisations d’appâts empoisonnés. Ce chapitre comporte également les tests de toxicité réalisés lors du suivi de la purification des composés toxiques.

2. MATERIELS ET METHODES 2.1. MATERIELS 2.1.1. Les souris

Des souris de l’espèce Mus musculus, de race OF-1 pesant 25 ± 2 g, provenant de l’animalerie de l’Institut Pasteur de Madagascar (IPM) ont été employées. Elles étaient placées dans des cages en plastique. Les animaux ont disposé d’eau de robinet et de nourriture ad libitum. La litière était renouvelée toutes les semaines.

2.1.2. Les cochons d’Inde (cobayes)

Des cochons d’Inde (Cavia porcellus) mâles ou femelles pesant 300 ± 50 g ont été utilisés. Ils ont été achetés auprès des éleveurs locaux et gardés dans l’animalerie dans des cages au moins une semaine avant leur utilisation.

2.1.3. Les poussins

Les poussins de race Hubbard (Gallus gallus) âgés de 1 jour testés ont été achetés chez AVITECH, un éleveur avicole.

Effets sur les animaux

2.1.4. Les têtards de grenouille et les alevins de poisson

Les têtards de grenouille sans pattes (Ptychadena mascareniensis) ont été capturés dans les rizières situées aux alentours du Campus de l'Université d'Antananarivo (Ankatso).

Les alevins de poissons âgés de 1 semaine (Cyprinus carpio) ont été fournis par un pisciculteur d’Ambohimangakely. Les tests sont effectués après quelques jours d’adaptation des alevins dans un aquarium aéré.

2.1.5. Les larves de moustique

Les larves utilisées ont été fournies par l’Unité d’entomologie de l’IPM. Il s’agit d’Aedes albopictus et de Culex quinquefasciatus.

2.1.6. Les puces

Les puces Xenopsylla cheopis ont été collectées sur des rats capturés et élevées à l’insectarium de l’Unité d’Entomologie de l’IPM.

2.2. METHODES 2.2.1. Méthodes utilisées dans l’étude de la toxicité aiguë chez la souris 2.2.1.1. Voies d’administration des extraits Trois différentes voies d’administration ont été utilisées.

2.2.1.1.1. Voie intrapéritonéale

Cette voie d’administration consiste à injecter l’extrait dans la cavité abdominale de l’animal (Sandberg et al., 1990). Les composés passent ainsi dans la circulation générale et atteignent rapidement les organes ou tissus où ils vont exercer leurs effets.

Le volume d’extrait à injecter est de 0,3 ml pour 25 g de souris. Les observations durent 24 h.

2.2.1.1.2. Voie orale

Cette technique permet d’administrer les extraits directement dans l’estomac de la souris au moyen d’une canule à bout arrondi. Une souris de 25 g est gavée de 0,25 ml d’extrait à tester. Trois lots de souris sont utilisés et le test dure 24 h.

2.2.1.1.3. Voie sous-cutanée

L’injection sous-cutanée consiste à administrer un volume d’extrait de 0,25 ml à une souris de 25 g. Trois lots de souris sont utilisés et le test dure 24 h.

Effets sur les animaux

2.2.1.2. Détermination de la DL50 chez la souris

La dose létale 50 % (24 h) ou dose qui tue 50 % des animaux testés pendant 24 h, est un indicateur quantitatif de toxicité. Pour sa détermination, l’extrait est administré à des souris réparties en plusieurs groupes, et ce, à des doses croissantes suffisantes pour obtenir un pourcentage de mortalité s’échelonnant entre 0 % à 100 %. La DL50 est estimée par injection par voie intrapéritonéale (ip) et selon la méthode de Reed et Muench (1938) :

 Soit par la formule :

(0,5 − 푁) 퐿표푔 퐷퐿50 = 푙표푔퐵 + 푙표푔푅 (푀 − 푁)

Avec :

B = dose immédiatement inférieure à la DL50 N = mortalité provoquée par la dose B

M = mortalité provoquée par la dose immédiatement supérieure à la DL50 R = raison de la progression géométrique

 Soit par la méthode graphique qui consiste à projeter le point d'intersection de la courbe des totaux cumulatifs des survivants et celle des morts, en fonction des doses injectées. Quarante souris femelles, réparties en 8 groupes de 5 animaux ont été employées. Elles ont eu accès à l’eau et la nourriture ad libitum.

2.2.1.3. Etude des effets des saponosides et des non saponosides chez la souris Pour avoir une idée sur les substances responsables de l’activité sur souris, les saponosides ont été séparés des non saponosides. Les deux fractions ont été testées sur souris. L’activité a été appréciée par injection par voie ip.

2.2.1.4. Etude des effets des fractions obtenues par chromatographie Les fractions obtenues à l’issue des différents procédés de purification ont été injectées par voie ip sur souris.

2.2.2. Etude anatomo-pathologique chez la souris

L’étude histopathologique a été effectuée selon la méthode décrite par Lamb (1981). La préparation des coupes histo-pathologiques comporte en plusieurs étapes. - Le prélèvement des organes Les souris sont sacrifiées puis leurs organes (cerveau, poumons, cœur, foie, reins, intestin) sont prélevés.

Effets sur les animaux

- La fixation des organes

La première étape du traitement du prélèvement est la fixation. Elle a pour but la conservation des structures et le durcissement du prélèvement. Elle consiste à protéger les tissus prélevés de toute hydrolyse due à la libération des enzymes contenus dans les lysosomes cellulaires. Les organes prélevés sont placés dans du formol 10 % afin de tuer les structures cellulaires ou tissulaires et de les conserver dans un état aussi proche que possible de l’état vivant. Les prélèvements sont ensuite coupés en petits fragments de 2 à 4 mm d’épaisseur.

- L’inclusion

L’inclusion des organes dans la paraffine (56-58°) a pour but de faciliter la réalisation des coupes histologiques. Comme la paraffine est hydrophobe, les fragments tissulaires doivent être déshydratés. Ils sont donc inclus dans des cassettes « TISSUE-TEK III® »puis placés dans un automate à inclusion de marque SHANDON® Citadel 1 000 pendant 17 h.

Ce traitement comporte une déshydratation par immersion dans des bains d'alcool de degré croissant (90°, 96°, éthanol absolu) puis une substitution des alcools par le xylène. Ce solvant est un éclaircissant et il permet d’apprécier le degré de pénétration de la paraffine par la transparence acquise par la pièce. Enfin, les fragments sont imprégnés de paraffine.

L'inclusion se fait dans des moules en métal permettant la confection de blocs de paraffine durs, à l'intérieur desquels la pièce prélevée est incluse. Après refroidissement, les blocs de paraffine sont ensuite montés sur le microtome.

- La microtomie et la confection des coupes

Les blocs de paraffine sont coupés en rubans minces de 4 µm d’épaisseur. Les coupes sont ensuite étalées sur une lame préalablement enduite de colle.

- La coloration des coupes et le montage des lames

Les coupes sont déparaffinées par immersion dans des bains de xylène, puis réhydratées par de l'alcool de degré décroissant (éthanol absolu, 96°, 90°), puis par l'eau. Les coupes sont ensuite colorées par immersion dans le colorant Hématoxyline de Mayer qui colore les noyaux en bleu noirâtre puis dans l’éosine qui colore les cytoplasmes en rose.

Après avoir subi une déshydratation par bains d'éthanol de degré croissant (90°, 96°, éthanol absolu), puis bains de xylène, les coupes colorées sont montées entre lame et lamelle à

Effets sur les animaux l’aide d’une colle de montage « Eukitt ». Les tissus sont visualisés au microscope optique de marque BRESSER® aux grossissements 10 et 40 x.

2.2.3. Méthodes d’étude des effets des extraits sur la fonction cardiaque Pour évaluer l’effet direct des principes actifs sur la force de contraction cardiaque ou inotropie et la fréquence de contraction ou chronotropie, différentes concentrations d’extraits ont été testées sur l’oreillette isolée de cobaye.

Préparation des oreillettes isolées de cochon d’Inde :

Le cœur est prélevé après décapitation de l'animal et ouverture rapide du thorax. Les oreillettes sont débarrassées des ventricules avant d'être placées dans un liquide physiologique (milieu de KREBS). Les extrémités des oreillettes prises ensemble sont attachées par des fils qui seront reliés aux capteurs. La préparation est ensuite montée dans une cuve à organe isolé maintenue à 37°C contenant la solution de KREBS. La contraction de l'organe est enregistrée grâce à un myographe isotonique. L'extrait est directement ajouté dans le milieu de KREBS de la cuve à organe et leur effet est évalué pendant 5 min.

2.2.4. Méthodes d’étude des effets des extraits sur les fonctions hépatique et rénale Cette étude a été réalisée sur des souris gavées avec une dose sub-létale d’extrait pendant 30 jours.

Les souris sont placées dans des cages plastiques contenant des copeaux de bois renouvelés tous les 3 jours. Deux lots de 5 souris sont utilisés, les témoins reçoivent de l’ED et les souris tests une dose bien définie d’extrait. Le poids des souris est mesuré chaque jour, du début jusqu’à la fin du traitement pour en noter la variation. A la fin du test, un changement de poids pourrait refléter la toxicité.

Au 31ème jour de test, des prélèvements de sang sont effectués à l’aide des tubes capillaires héparinés à travers le sinus rétro-orbital. Les tubes ainsi obtenus sont centrifugés à 1 500 x g pendant 10 min à +4°C (BIOFUGE, FRESQUE, HERAEUS INSTRUMENTS). Le plasma hépariné est immédiatement pipeté, réparti en aliquotes dans des tubes Eppendorf, puis congelé jusqu’à l’analyse. Après décongélation à température ambiante et homogénéisation, les activités des ALAT, ASAT et créatinine sont mesurées.

Les données obtenues sont analysées statistiquement par le t-test de Student pour la comparaison entre deux groupes. Les valeurs sont présentées sous forme de moyenne ± erreur

Effets sur les animaux standard. Une valeur de p<0,05 est considérée comme différence statistiquement significative (Schwartz, 1961).

2.2.5. Méthodes d’étude des propriétés hémolytiques de l’EMF

Cette étude consiste à mettre en évidence la présence de saponosides dans l’EMF et ensuite de doser leur capacité à provoquer une hémolyse.

2.2.5.1. Préparation de la suspension d’hématies Le sang de mouton défibriné est centrifugé à 5 000 x g pendant 5 min à +4°C et le plasma est éliminé par aspiration. Trois lavages successifs des érythrocytes sont effectués en mélangeant volume à volume la suspension du sang avec du tampon Phosphate Buffered Saline ou PBS (composition en Annexe V). Chaque lavage est suivi d’une centrifugation pendant 5 min dans les mêmes conditions que précédemment. Le culot obtenu après le troisième lavage constitue la suspension d’hématies à 100 %. Les érythrocytes resuspendus dans du PBS sont dilués dans de l’eau bidistillée pour avoir une absorbance de 0,2 à 541 nm qui correspond à 6. 108 cellules/ml et ils constituent la suspension érythrocytaire normalisée (SEN).

2.2.5.2. Test hémolytique La SEN est alors répartie dans les 96 puits d’une microplaque à raison de 50 µl par puits. Différentes concentrations de l’extrait (50 µl) à tester sont ajoutées dans chaque cupule de la microplaque. Deux puits servent de témoins : - Témoin positif (T+) où une hémolyse est observée - Témoin négatif (T-) où aucune hémolyse n’apparait (Tableau 3, p. 42).

La plaque est ensuite incubée à 37°C pendant 45 min, temps nécessaire pour que l’hémolyse ne progresse plus, avant de la mettre à 4°C pendant une nuit. Le test est réalisé en double.

La lecture des résultats se fait à l’œil nu. L’hémolyse se traduit par la formation, au fond de la cupule, d’une plage de lyse résultant de la libération de l’hémoglobine et la sédimentation des hématies sous forme de point rouge au fond de la cupule explique l’absence d’hémolyse.

Effets sur les animaux

Tableau 3: Composition du milieu pour le test hémolytique

Puits n° T+ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 T- Extrait à tester (μl) 0 50 25 12,5 6,25 3,2 1,6 0,8 0,4 0,2 0,1 0 PBS (μl) 0 0 25 37,5 43,7 46,8 48,4 49,2 49,6 49,8 49,9 50 Eau distillée (μl) 50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Concentration finale 0 220 110 55 27,5 13,7 6,87 3,43 1,71 0,85 0,42 0 (µg/ml) SEN (μl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Volume final du 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 mélange (μl)

2.2.5.3. Détermination de la dose hémolytique 50 %

Des concentrations croissantes d’extrait dilué avec du PBS sont préparés puis 1 ml de chaque est versé dans des tubes contenant 0,5 ml de SEN. Après agitation, les tubes sont incubés à 37°C pendant 45 min puis centrifugés à 5 000 x g pendant 5 min. L’hémoglobine libérée sous l’action de la toxine est dosée au spectrophomètre SHIMADZU à 541 nm.

Un témoin de lyse des hématies à 100 % est obtenu en remplaçant le PBS par l’ED. L’eau bidistillée sert de témoin négatif. L’expérience est réalisée en triple.

La dose hémolytique 50 % ou DH50 qui est la quantité en toxine nécessaire pour lyser 50 % de SEN est calculée.

2.2.6. Méthodes d’étude des effets sur les poussins (Gallus gallus)

La sensibilité des poussins aux extraits est comparée avec celle de la souris. La DL100 ip sur souris est testée sur les poussins par voies orale et ip.

L’extrait de volume 0,25 ml est donné par gavage à des poussins de 25 g. Quant à la voie ip, 0,3 ml est injecté à un poussin de 25 g. Les observations durent 24 h.

2.2.7. Méthodes d’étude des effets sur les animaux à sang froid

Pour élargir l’étude du spectre d’activité de l’EMF sur les animaux, des tests de toxicité ont été effectués sur des animaux à sang froid.

2.2.7.1. Test sur les têtards de grenouille (Ptychadena mascareniensis) et les alevins de poisson (Cyprinus carpio)

Les têtards de grenouille et les alevins de poissons sont placés dans des bocaux contenant chacun 250 ml de l’extrait à tester. Plusieurs lots de 5 animaux sont testés avec différentes concentrations de l’extrait, en progression géométrique de raison r déterminée.

Effets sur les animaux

L’expérience est répétée trois fois et dure 24 h au bout desquelles les nombres des morts et des survivants sont comptés.

2.2.7.2. Test sur les larves de moustique (Aedes albopictus et Culex quinquefasciatus)

Les larves de moustique utilisées sont au stade 3 de leur développement. Des lots de 25 larves sont constitués. Les larves sont placées dans des gobelets contenant chacun 50 ml de l’extrait à tester ou d’eau de pluie pour le témoin.

Quatre répétitions sont réalisées pour chaque concentration testée. Au bout de 24 h, les larves mortes sont dénombrées. Les résultats sont exprimés en pourcentage de mortalité.

2.2.7.3. Test sur les puces (Xenopsylla cheopis)

La méthodologie utilisée pour le test de sensibilité des puces est celle de l’OMS (1982) : exposition des puces sur des papiers imprégnés d’insecticides à une concentration définie et pendant un temps donné.

Des carreaux de 1 cm de côté sont tracés sur des bandelettes de papier Whatman n°1. L’extrait à tester est déposé au milieu de chaque carreau à raison de 11,5 µl d’extrait par carreau, puis les bandelettes sont laissées sécher à la température ambiante pendant 24 h.

Les tests sont ensuite réalisés dans des tubes à essai de 18 cm. Des lots de 10 puces sont mis dans les tubes puis les bandelettes pré-imprégnées y sont ensuite placées. Un tube contenant 10 puces et une bandelette non imprégnée sert de témoin. Trois répétitions sont menées par chaque concentration d’extrait.

Le comptage de puces mortes se fait toutes les heures pendant 8 h après introduction de l’extrait.

Au bout 8 h d’exposition, les bandelettes imprégnées sont remplacées par des papiers vierges non imprégnées, puis elles sont laissées en observation pendant 24 h.

Les nombres de puces mortes dans les lots traités par l’extrait à étudier et dans le lot témoin sont comparés et le pourcentage de mortalité est calculé.

2.2.7.4. Détermination de la concentration létale 50 % ou CL50 (24 h)

La valeur de CL50 24 h ou la concentration qui tue 50 % des animaux à sang froid testés en 24 h est déterminée en utilisant le logiciel Graphpad Prism 5.

Effets sur les animaux

3. RESULTATS 3.1. EFFETS DES EXTRAITS SUR LA SOURIS 3.1.1. Influence des voies d’administration

Les symptômes d’intoxication développés par les souris après administration de l’EMF à une dose sub-létale et une dose létale variaient selon les voies d’administration. Tout changement de comportement des souris testées a été noté pendant 24 h après administration de l’extrait, toutes les 15 min, puis toutes les heures. La mort des souris a été également notée (Bürger et al, 2005).

3.1.1.1. Voie intrapéritonéale

A la dose létale 60,24 mg/kg, la toxicité aiguë se manifeste par quelques symptômes :

- Juste après l’injection de l’EMF, les souris sont agitées. - Au bout de 5 min, elles présentent des signes caractérisés par une exophtalmie, un étirement des oreilles vers l’arrière, une perte de support et une fasciculation. - Après 15 min, les oreilles deviennent hyperémiques. L’activité des animaux diminue, leur démarche devient lente. Une augmentation du rythme de la respiration est observée. Les souris trainent leurs pattes postérieures. Une diarrhée glaireuse apparait. - Après 30 min, les oreilles présentent une cyanose. La fréquence respiratoire diminue. - Au bout de 6 h, les souris décèdent après des convulsions cloniques.

3.1.1.2. Voie orale Les symptômes d’intoxication développés chez la souris, après administration de l’EMF à 60,24 mg/kg (DL100 ip) et à 4 000 mg/kg (DL100 orale), sont consignés dans le tableau 4 (p. 45).

3.1.1.3. Voie sous-cutanée

Après injection par voie sous-cutanée de l’EMF, à une dose de 60,24 mg/kg (DL100 ip):

- Une enophtalmie est observée au bout de 5 min. Elle est accompagnée d’une augmentation du rythme cardiaque et d’une piloérection.

- Ces mêmes symptômes persistent pendant quelques heures et au bout de 24 h, les animaux reprennent leur apparence normale.

Effets sur les animaux

Tableau 4: Symptômes d’intoxications observés par administration par voie orale

Dose administrée Symptômes observés - Après 5 min de gavage, une enophtalmie et une pâleur des oreilles sont observées ;

60,24 mg/kg (DL100 ip) - Au bout de 30 min, l’activité motrice diminue. La respiration devient de plus en plus profonde ;

- Les souris ne décèdent pas 24 h après le test.

- Les souris sont agitées juste après l’ingestion des extraits ;

- 2 min après, un hoquet est observé ;

- Au bout de 5 min, une enophtalmie, une diminution du rythme de la respiration accompagnée d’une augmentation 4 000 mg/kg (DL100 orale) de l’amplitude de la respiration prennent place ;

- Après 2 h, une fasciculation apparait et les souris trainent leurs pattes ;

- Au bout de 3 h, elles meurent après des convulsions cloniques.

L’influence des voies d’administration sur l’activité toxique de l’EMF, exprimée en taux de mortalié, est présentée dans le tableau 5.

Tableau 5: Influence des voies d’administration sur l’activité toxique de l’EMF

Pourcentage de mortalité (%) au bout de 24 h DOSE (mg/kg) Intrapéritonéale Sous-cutanée Orale 60,24 (DL100 ip) 100 0 0 463,68 100 0 0 3 000 100 0 0 3 500 100 100 30 4 000 100 100 100

L’injection par voie ip s’avère la plus toxique. A une dose environ 50 fois plus élevée que la DL100 ip, aucune mortalité n’a été observée ni par voie orale, ni par voie sous-cutanée.

Effets sur les animaux

Par voie sous-cutanée, la dose létale 100 % est de 3 500 mg/kg alors que par voie orale, elle est de 4 000 mg/kg.

3.1.2. Détermination de la DL50 (24 h)

Les souris ont été réparties en 8 lots de 5 animaux chacun. Sept lots ont été traités par voie ip avec sept doses croissantes en progression géométrique de raison r = 1,06 de l’EMF, allant de 42,48 à 60,24 mg/kg de poids. Le lot témoin a été traité avec de l’eau physiologique.

Les données utilisées pour la détermination graphique de la DL50 (Figure 11) sont présentées dans le tableau 6.

Tableau 6 : Résultats expérimentaux de la détermination de la DL50 (24 h)

Dose (mg/kg) Nombre de souris Totaux cumulatifs % de Survivantes Mortes Survivantes Mortes mortalité 42,48 5 0 14 0 0 45 3 2 9 2 40 47,76 2 3 6 5 60 50,64 2 3 4 8 60 53,64 1 4 2 12 80 57,36 1 4 1 16 80 60,24 0 5 0 21 100

Survivantes 10 Mortes

Nombre souris de Nombre 5

0 42,48 45 47,76 50,64 53,64 57,36 60,24

Dose (mg/kg)

Figure 11: Détermination graphique de la DL50 (24 h) par la méthode graphique de Reed et Muench (1938)

Effets sur les animaux

La DL50 est de 46,24 mg/kg par la méthode de calcul et de 47,15 mg/kg par la méthode graphique.

3.1.3. Effets des saponosides (SAP) et des non saponosides (nSAP)

Les effets des saponosides SAP et des non saponosides nSAP chez la souris ont été

évalués à des doses correspondant à la DL0 (42,48 mg/kg) et à la DL100 (60,24 mg/kg) ip.

À 42,48 mg/kg, les souris injectées avec les SAP sont toutes mortes. Les SAP se sont avérés plus toxiques que l’EMF car celui-ci n’a provoqué aucune mortalité à cette dose.

Avec les nSAP, même à la dose de 60,24 mg/kg, des symptômes sont apparus mais ont disparu au bout de quelques heures.

3.1.4. Effets des fractions obtenues par chromatographie sur LH-20

Les cinq fractions obtenues par chromatographie sur LH-20 ont été injectées sur souris

à des doses correspondant à la DL0 (42,48 mg/kg) et à la DL100 (60,24 mg/kg) ip de l’EMF. Les résultats sont récapitulés dans le tableau 7.

Tableau 7 : Effets des fractions F1, F2, F3, F4 et F5 sur les souris

Fractions F1 F2 F3 F4 F5 DL0 (42,48 mg/ml) 100 100 100 0 0 DL100 (60,24 mg/ml) 100 100 100 0 0 Les chiffres indiquent le pourcentage de souris mortes

3.1.5. Effets des fractions obtenues par chromatographie « flash »

Parmi les 9 fractions récupérées après chromatographie sur flash, S1, S2, S7 et S8 n’ont pas été testées sur souris à cause de leur faible quantité. Par contre, les fractions S3, S4,

S5, S6, S9 plus disponibles quantitativement ont été testées à des doses correspondant à la DL0

(42,48 mg/kg) et à la DL100 (60,24 mg/kg).

L’activité toxique de ces fractions est récapitulée dans le tableau 8.

Tableau 8 : Effets des fractions obtenues par chromatographie « flash » sur souris

Fractions S3 S4 S5 S6 S9 DL0 (42,48 mg/ml) 0 100 60 0 0 DL100 (60,24 mg/ml) 0 100 100 0 0 Les chiffres indiquent le pourcentage de souris mortes

Effets sur les animaux

3.1.6. Evolution de l’activité des extraits

L’activité des extraits (brut et purifiés) a augmenté au cours de leur purification d’après les tests de toxicité sur souris. Le tableau 9 montre cette augmentation qui s’est traduite par une diminution du temps de survie pour les deux doses testées : DL100 (60,24 mg/ml), DL0 (42,48 mg/ml).

Tableau 9 : Evolution de l’activité des principes actifs

DL DL Extraits 0 100 Observation (42,48 mg/ml) (60,24 mg/ml) EMF 0 100 Mortalité au bout de 6 h SAP 100 100 Mortalité après 6 h F1 100 100 Plus de 4 h F2 100 100 10 min – 4 h F3 100 100 2 h – 6 h S4 100 100 2 h

3.2. ETUDE DES LESIONS ANATOMO-PATHOLOGIQUES

Les effets de l’EMF sur les organes, ont été appréciés par la comparaison des organes prélevés des souris traitées et ceux des souris non traitées. Les doses d’extrait utilisées sont la

DL0 ip (42,48 mg/kg) pour l’administration orale et la DL50 (46,69 mg/kg) pour l’injection intra-péritonéale. Les souris ayant reçu la DL50 ont été sacrifiées au bout de 3 h, 9 h, 24 h et 48 ème h. Les souris qui sont traitées tous les jours avec la DL0 ont été sacrifiées au 10 jour. Des souris non traitées par l’EMF ont servi de témoins. Après la dissection des animaux, les organes sont observés macroscopiquement puis examinés au microscope par l’intermédiaire des coupes histologiques préparées selon la méthode du § 2.2.2 (p. 38).

3.2.1. Lésions macroscopiques

Du point de vue de l’aspect, de la couleur et de la texture, il n’y a pas de différence visible entre les organes traités et ceux non traités.

3.2.2. Lésions microscopiques

Aucune lésion n’a été détectée au niveau du cerveau, du cœur et de l’estomac. Par contre, des lésions microscopiques ont été observées au niveau des intestins, du foie, des poumons et des reins.

Effets sur les animaux

Les lésions anatomo-pathologiques observées sont présentées dans les tableaux 10 pour la voie ip et 11 pour la voie orale et illustrées sur les figures 11 à 20.

Tableau 10 : Lésions tissulaires observées chez la souris après administration de l’EMF par voie ip et selon la durée d’exposition

Temps Organes Lésions anatomo-pathologiques d’observation - Infiltration inflammatoire inter alvéolaire constituée de nombreux polynucléaires neutrophiles 3 h - Vaisseaux sanguins très dilatés inter-alvéolo- bronchiolaires - Vaisseaux sanguins dilatés contenant des amas de polynucléaires neutrophiles - Présence de lymphocytes péri-bronchiolaires 9 h Poumon - Foyers hémorragiques anciens marqués par des dépôts d’hémosidérine - Infiltrat inflammatoire inter-alvéolaire contenant de nombreux polynucléaires neutrophiles altérés et 24 h lymphocytes - Vaisseaux sanguins dilatés inter-alvéolo-bronchiolaires - Vaisseaux sanguins très dilatés dans le parenchyme 48 h pulmonaire - Veines centrolobulaires légèrement dilatées - Capillaires sinusoïdes dilatés 3 h - Quelques polynucléaires neutrophiles péri vasculaires - Veines centrolobulaires et capillaires sinusoïdes dilatés - Infiltrat inflammatoire fait de lymphocytes, de plasmocytes et de polynucléaires neutrophiles le plus 9 h souvent altérés - Présence de foyers œdémateux et nécrotiques - Veines centrolobulaires dilatées Foie - Polynucléaires neutrophiles disséminés dans le parenchyme hépatique 24 h - Présence de foyers œdémateux et micro-hémorragiques - Nappes hémorragiques renfermant des pigments d’hémosidérine - Veines centrolobulaires dilatés avec extravasation des globules rouges 48 h - Capillaires sinusoïdes dilatés - Nappes hémorragiques et foyers œdémateux - Vaisseaux sanguins très dilatés - Nodule inflammatoire comportant de nombreux Rein 3 h lymphocytes et de rares polynucléaires neutrophiles - Présence de micro-hémorragie

Effets sur les animaux

Tableau 10 (suite):

- Vaisseaux sanguins dilatés - Nodule inflammatoire constitué de nombreux lymphocytes, quelques macrophages, polynucléaires neutrophiles et de rares 9 h plasmocytes - Multiples foyers de micro-hémorragie avec présence de dépôts d’hémosidérine - Vaisseaux sanguins dilatés avec micro-hémorragie interstitielle 24 h - Infiltrat inflammatoire fait de nombreux lymphocytes - Vaisseaux sanguins très dilatés avec extravasation des hématies dans les tissus interstitiels réalisant des foyers de micro- 48 h hémorragies Histologie normale 3 h - Infiltrat inflammatoire des axes villositaires de la muqueuse, comportant des polynucléaires neutrophiles, lymphocytes et 9 h surtout des plasmocytes - Vaisseaux dilatés dans la séreuse Intestin - Infiltrat inflammatoire des axes villositaires et inter glandulaire grêle de la muqueuse, constitué de lymphocytes, de plasmocytes et 24 h surtout de polynucléaires neutrophiles le plus souvent altérés - Vaisseaux sanguins dilatés au niveau de la séreuse - Axes villositaires fibreux infiltrés par quelques polynucléaires neutrophiles avec hyperplasie des capillaires 48 h - Vaisseaux sanguins dilatés au niveau de la sous-muqueuse - Infiltrat inflammatoire constitué de lymphocytes et plasmocytes dans les axes villositaires de la muqueuse avec hyperplasie 3 h capillaire - Quelques vaisseaux sanguins dilatés de la sous-muqueuse - Infiltrat inflammatoire de la muqueuse renfermant des lymphocytes, des plasmocytes et des polynucléaires neutrophiles avec présence de quelques foyers œdémateux 9 h - Vaisseaux sanguins dilatés de la séreuse avec présence de Gros polynucléaires neutrophiles intravasculaires intestin - Infiltrat inflammatoire des axes villositaires de la muqueuse, constitué de nombreux lymphocytes et plasmocytes, quelques polynucléaires neutrophiles avec sécrétion abondante de mucus 24 h par les glandes - Quelques vaisseaux sanguins dilatés de la sous-muqueuse - Infiltrat inflammatoire des axes villositaires de la muqueuse renfermant quelques lymphocytes et macrophages avec foyers 48 h œdémateux et sécrétion abondante de mucus par les glandes - Vaisseaux sanguins dilatés au niveau de la séreuse Cerveau Histologie normale Cœur Histologie normale Estomac Histologie normale

Effets sur les animaux

Tableau 11: Lésions tissulaires observées chez la souris après administration de l’EMF par voie orale après 10 jours d’exposition

Organes Lésions anatomo-pathologiques - Vaisseaux sanguins très dilatés dont la lumière contient quelques Poumon polynucléaires neutrophiles - Infiltrat inflammatoire constitué de polynucléaires neutrophiles - Veines centrolobulaires dilatés avec des polynucléaires neutrophiles intra vasculaires Foie - Capillaires sinusoïdes dilatés - Foyers œdémateux avec quelques polynucléaires neutrophiles et plasmocytes - Vaisseaux sanguins très dilatés - Infiltrat inflammatoire du tissu interstitiel fait d’amas Rein lymphocytaire et d’ilots de polynucléaires neutrophiles parfois altérés - Vaisseaux sanguins dilatés Intestin grêle - Les axes villositaires de la muqueuse comportent de nombreux polynucléaires neutrophiles - Quelques vaisseaux sanguins dilatés - Glandes de la muqueuse à épithélium mucosecrétant Gros intestin - Infiltrat inflammatoire dense constitué de polynucléaires neutrophiles altérés, de lymphocytes et plasmocytes au niveau de la sous-muqueuse Cerveau Histologie normale Cœur Histologie normale Estomac Histologie normale

Les lésions observées après 9 h d’injection et au bout de 10 jours d’administration de l’EMF ont été choisies pour illustrer les effets de l’EMF sur les organes (Figures 12 à 21, p. 52 à 58).

Effets sur les animaux

 Voie ip POUMON

a b

Figure 12 : Coupes histopathologiques de poumon traité par l’EMF à 46,69 mg/kg par voie ip, après un temps d’exposition de 9 h, G x 10 (a) et x 40 (b) 1 : polynucléaire neutrophile, 2 : dépôt d’hémosidérine, 3 : vaisseaux sanguins dilatés

FOIE

1 3

2 a b

Figure 13 : Coupes histopathologiques de foie traité par l’EMF à 46,69 mg/kg par voie ip, après un temps d’exposition de 9 h, G x 10 (a) et x 40 (b)

1 : veine centrolobulaire dilaté, 2 : zone nécrotique, 3 : capillaire sinusoïde dilatée, 4 : œdème

Effets sur les animaux

REIN

3 2

a b

Figure 14 : Coupes histopathologiques de rein traité par l’EMF à 46,69 mg/kg par voie ip, après un temps d’exposition de 9 h, G x 10 (a) et x 40 (b) 1 : vaisseaux sanguinx dilatéx, 2 : micro-hémorragie, 3 : nodule inflammatoire, 4 : pigment d’hémosidérine INTESTIN GRELE

1 2 3

5 6

a b

Figure 15 : Coupes histopathologiques de l’intestin grêle traité par l’EMF à 46,69 mg/kg par voie ip, après un temps d’exposition de 9 h, G x 10 (a) et x 40 (b) 1 : muqueuse, 2 : sous-muqueuse, 3 : musculeuse, 4 : séreuse, 5 : vaisseaux sanguinx dilatés, 6 : infiltrat inflammatoire

Effets sur les animaux

GROS INTESTIN

3 2 1

Figure 16 : Coupes histopathologiques du gros intestin traité par l’EMF à 46,69 mg/kg par voie ip, après un temps d’exposition de 9 h, G x 10 (a) et x 40 (b, c) 1 : muqueuse, 2 : musculeuse, 3 : séreuse, 4 : vaisseaux sanguins dilatés, 5 : œdème, 6 : infiltrat inflammatoire

Effets sur les animaux

 Voie orale POUMON

1 2

a b

Figure 17 : Coupes histopathologiques de poumon traité par l’EMF à 42,48 mg/kg par voie orale, après un temps d’exposition de 10 jours, G x 10 (a) et x 40 (b) 1 : alvéole, 2 : bronchiole, 3 : vaisseaux sanguins très dilatés renfermant des polynucléaires neutrophiles

FOIE

1 2

4 3

a b

Figure 18 : Coupes histopathologiques de foie traité par l’EMF à 42,48 mg/kg par voie orale, après un temps d’exposition de 10 jours, G x 10 (a) et x 40 (b) 1 : veine centrolobulaire dilatée, 2 : veine centrolobulaire dilatée avec de polynucléaires neutrophiles, 3 : capillaires sinusoïdes dilatés, 4 : œdème

Effets sur les animaux

REIN

3 a b

Figure 19 : Coupes histopathologiques de rein traité par l’EMF à 42,48 mg/kg par voie orale, après un temps d’exposition de 10 jours, G x 10 (a) et x 40 (b) 1 : glomérule, 2 : vaisseaux sanguins très dilatés, 3 : amas de polynucléaires neutrophiles

Effets sur les animaux

INTESTIN GRELE

1 2

b c

Figure 20 : Coupes histopathologiques de l’intestin grêle traité par l’EMF à 42,48 mg/kg par voie orale, après un temps d’exposition de 10 jours, G x 10 (a) et x 40 (b, c) 1 : vaisseaux sanguins dilatés, 2 : Polynucléaires neutrophiles dans les axes villositaires de la muqueuse

Effets sur les animaux

GROS INTESTIN

1 2

b c

Figure 21 : Coupes histopathologiques du gros intestin traité par l’EMF à 42,48 mg/kg par voie orale, après un temps d’exposition de 10 jours, G x 10 (a) et x 40 (b, c) 1 : infiltrat inflammatoire dense, 2 : mucus

3.3. EFFETS DE L’EMF SUR LA FONCTION CARDIAQUE

Différentes concentrations de l’EMF (12,5 ; 25 ; 50 µg/ml) ont été testées sur l’oreillette isolée de cobaye à différents temps.

A une concentration inférieure ou égale à 50 µg/ml, l’EMF n’a présenté aucun effet significatif sur la fréquence de contraction auriculaire ou nombre de battements (Figure 22).

Effets sur les animaux

A 25 et à 50 µg/ml, l’EMF a provoqué une augmentation significative de l’amplitude de contraction des oreillettes (Figure 23). A la concentration de 25 µg/ml, cet effet inotrope positif était significatif à partir de 3 min de contact (p<0,05). A 50 µg/ml, l’importance de l’effet augmente proportionnellement avec le temps de contact.

Les effets de l’EMF sur la fonction cardiaque sont montrés sur les figures 22 et 23.

400

300

200

battements/min 100

0 0 12.5 25 50 [EMF] µg/ml 0 min 1 min 3 min 5 min

Figure 22 : Effet des différentes concentrations de l’EMF et du temps de contact sur le nombre de battements par minute des oreillettes isolées de cobaye (*: p<0,05 ; **: p<0,02 ; ***: p<0,01)

40 * ***** 30 * *

20 Amplitude Amplitude de contraction(mm) 10

0 0 12.5 25 50 [EMF] µg/ml 0 min 1 min 3 min 5 min

Figure 23: Effet des différentes concentrations de l’EMF et du temps de contact sur l’amplitude de contraction des oreillettes isolées de cobaye (*: p<0,05 ; **: p<0,02 ; ***: p<0,01)

Effets sur les animaux

3.4. EFFETS DE L’EMF SUR LES FONCTIONS RENALE ET HEPATIQUE 3.4.1. Effets sur le poids des souris

La variation de poids des souris traitées par EMF et non traitées du 1er jour au 30ème jour de traitement est présentée dans le tableau 12.

Tableau 12 : Effets de l’EMF sur le poids des souris

Traitement Poids initial (g) Poids final (g) Taux d’augmentation (%) Témoin (eau distillée) 25,25 ± 2,03 29,94 ± 1,92 18,57 EMF (21,24 mg/kg) 26,06 ± 1,46 34,23 ± 2,02 31,35

Si une diminution de 10 % de poids initial est observée à la fin du test, le poids de souris est considéré comme significativement varié (Raza et al., 2002).

Les résultats ont montré que le poids des souris traitées par l’EMF pendant 30 jours a augmenté de 31,35 %. Cette augmentation est plus importante que celle des souris témoins.

3.4.2. Taux sanguins d’ALAT, d’ASAT et de créatinine en présence de l’EMF

Les taux de ces paramètres biochimiques qui traduisent les fonctions hépatique et rénale chez les animaux témoins et les animaux traités sont montrés dans le tableau 13.

Tableau 13: Taux d’ALAT, d’ASAT et de créatinine chez les souris traitées et non traitées par l’EMF

Fonction hépatique Fonction rénale ALAT (UI/L) ASAT (UI/L) Créatinine (mg/ml) Souris non traitées 34,00 ± 10,19 476,33 ± 66,08 2,95 ± 0,48 Souris traitées 35,33 ± 7,93 350,50 ± 91,86 3,78 ± 0,37

Les courbes montrant l’évolution des paramètres biochimiques des souris traitées par l’EMF et ceux des non traitées sont présentées dans les figures 24, 25 et 26 (p. 61).

Effets sur les animaux

6 ) 4

2 Créatinine (mg/ml Créatinine 0 Témoin Créatinine Test

Figure 24 : Comparaison des taux de créatinine des souris traitées avec EMF et des souris non traitées (n = 3)

10 Taux de ALAT ALAT de Taux

0 plasmatique (UI/L) plasmatique Témoin ALAT Test

Figure 25 : Comparaison des taux d’ALAT plasmatique des souris traitées avec EMF et des souris témoins non traitées (n = 3)

600

400

200

Taux de ASAT ASAT de Taux plasmatique (UI/L) plasmatique

0 Témoin ASAT Test

Figure 26 : Comparaison des taux d’ASAT plasmatique des souris traitées avec EMF et des souris témoins non traitées (n = 3)

Effets sur les animaux

Aucune différence significative n’est observée sur le taux plasmatique d’ALAT, d’ASAT et de créatinine des souris traitées et des souris témoin.

3.5. EFFETS SUR LES HEMATIES DE MOUTON 3.5.1. Test hémolytique

A partir de la DL100 ip sur souris, des dilutions en cascade de l’EMF ont été préparées pour être testées sur les hématies de mouton. Les concentrations vont de 2,4 à 0,004 mg/ml et leurs effets sont montrés dans le tableau 14 et la figure 27.

Tableau 14 : Effets des différentes concentrations de l’EMF sur les hématies de mouton

T+ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 T- EMF 0 2,4 1,2 0,6 0,3 0,15 0,075 0,037 0,018 0,009 0,004 0 (mg/ml) Résultat ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + - - - + + : hémolyse totale + : hémolyse partielle - : absence d’hémolyse avec sédimentation des hématies

Les résultats montrent un effet dose-dépendant de l’EMF sur les hématies de mouton. - A des concentrations inférieures ou égales à 0,018 mg/ml, aucune hémolyse n’est observée. - A des concentrations comprises entre 0,018 à 0,037 mg/ml, une hémolyse partielle avec une sédimentation des hématies est notée - A des concentrations supérieures ou égales à 0,075 mg/ml, une hémolyse totale est observée.

T+ 2,4 1,2 0,6 0,3 0,15 0,075 0,037 0,018 0,009 0,0045 T- (mg/ml)

Figure 27 : Effets des différentes concentrations de l’EMF sur les hématies de mouton

3.5.2. Dosage de l’activité hémolytique L’activité hémolytique de 9 concentrations croissantes de l’EMF allant de 2 à 51,26 µg/ml (r = 1,5) a été testée. Dans les mêmes conditions et les mêmes démarches expérimentales

Effets sur les animaux

que décrit le § 2.2.5.3 de la page 42, l’hémoglobine libérée sous l’action de l’EMF a été dosée par les valeurs de la DO mesurées à 541 nm. Les résultats sont consignés dans le tableau 15.

Tableau 15 : Détermination de l’activité hémolytique de l’EMF (DO à 541 nm)

C°µg/ml Témoin 2 3 4,5 6,75 10,13 15,19 22,78 34,17 51,26 1 0,016 0,101 0,090 0,093 0,092 0,087 0,090 0,011 0,020 0,011 2 0,009 0,092 0,102 0,094 0,084 0,082 0,040 0,019 0,010 0,017 3 0,014 0,091 0,088 0,089 0,084 0,088 0,089 0,014 0,013 0,011 Moyenne 0,013 0,095 0,093 0,092 0,087 0,086 0,073 0,015 0,014 0,013 des DO C° = Concentration La dose hémolytique 50 % a été déterminée par le logiciel Graphpad Prism 5 et elle a été évaluée à 17,80 µg/ml.

3.6. EFFETS SUR LES POUSSINS

Administrée par voie orale et par voie intrapéritonéale, la DL100 ip sur souris qui est de 60,24 mg/kg n’était pas toxique sur les poussins de 1 jour (méthode au § 2.2.6, p. 42). Cette dose n’a provoqué aucun symptôme d’intoxication.

3.7. EFFETS DE L’EMF SUR LES ANIMAUX A SANG FROID 3.7.1. Effets sur les têtards de grenouille

Huit concentrations de l’EMF en progression géométrique de raison r = 1,05, allant de 10,7 µg/ml à 15,06 µg/ml ont été testées sur huit lots de cinq têtards. Trois lots ont servi de témoins. Les résultats sont présentés dans le tableau 16.

Tableau 16 : Effets des différentes concentrations de l’EMF sur les têtards de grenouille*

C° (µg/ml) Témoin 10,70 11,24 11,80 12,39 13,01 13,66 14,34 15,06 1 : 0/5 1 : 0/5 1 : 1/5 1 : 1/5 1 : 1/5 1 : 2/5 1 : 3/5 1 : 5/5 1 : 5/5 Répétitions 2 : 0/5 2 : 0/5 2 : 1/5 2 : 2/5 2 : 2/5 2 : 3/5 2 : 4/5 2 : 3/5 2 : 5/5 3 : 0/5 3 : 0/5 3 : 0/5 3 : 0/5 3 : 2/5 3 : 3/5 3 : 3/5 3 : 5/5 3 : 5/5 Cumul 0/15 0/15 3/15 5/15 5/15 7/15 7/15 9/15 15/15 Mortalité (%) 0 0 20 33,34 33,34 46,67 46,67 60 100 * : Les rapports indiquent le nombre de têtards morts sur le nombre de têtards du lot C° = Concentration Les résultats ci-dessus montrent que l’EMF est toxique sur les têtards de grenouille. Les taux de mortalité variaient de 20 % (11,24 µg/ml) à 100 % (15,06 µg/ml).

Effets sur les animaux

3.7.2. Effets sur les alevins de poisson

Sept concentrations croissantes de l’EMF avec une raison géométrique de 1,13 ont été testées sur sept lots de cinq alevins. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 17.

Tableau 17 : Effets des différentes concentrations de l’EMF sur les alevins de poisson

C° (µg/ml) Témoin 5 5,65 6,38 7,21 8,15 9,21 10,4 1 : 0/5 1 : 0/5 1 : 0/5 1 : 1/5 1 : 2/5 1 : 3/5 1 : 5/5 1 : 5/5 Répétition 2 : 0/5 2 : 0/5 2 : 1/5 2 : 1/5 2 : 1/5 2 : 2/5 2 : 3/5 2 : 5/5 3 : 0/5 3 : 0/5 3 : 0/5 3 : 0/5 3 : 0/5 3 : 2/5 3 : 5/5 3 : 5/5 Cumul 0/15 0/15 1/15 2/15 3/15 7/15 13/15 15/15 Mortalité (%) 0 0 6,67 13,3 20 46,67 86,67 100 * : Les rapports indiquent le nombre d’alevins morts sur le nombre d’alevins du lot C° = Concentration D’après ces résultats, l’EMF a montré une activité toxique sur les alevins de poisson. Le taux de mortalité allait de 6,67 % à la concentration de 5,65 µg/ml à 100 % à 10,4 µg/ml.

3.7.3. Effets des extraits sur les larves de moustique

Sept différentes concentrations de l’EMF en progression géométrique de raison r = 1,5

allant de la CL0 = 0,25 mg/ml à la CL100 = 2,85 mg/ml ont été testées. Les résultats sont présentés dans les tableaux 18 et 19.

Tableau 18 : Effets des différentes concentrations de l’EMF sur les larves d’Aedes albopictus

C° (mg/ml) Témoin 0,25 0,38 0,56 0,84 1,27 1,9 2,85 1 0 0 0 4 4 19 21 25 2 0 0 0 1 11 20 23 24 Répétition 3 0 0 0 2 11 20 23 25 4 0 0 1 0 16 22 21 25 Cumul 0 0 1 7 42 81 88 99 Mortalité (%) 0 0 1 7 42 81 88 99 C° = Concentration Ce tableau montre que l’EMF était toxique sur les larves d’Aedes albopictus. Le taux de mortalité provoqué allait de 1 % à la concentration de 0,38 µg/ml à 99 % à 2,85 µg/ml.

Effets sur les animaux

Tableau 19 : Effets de différentes concentrations de l’EMF sur les larves de Culex quinquefasciatus

C° (mg/ml) Témoin 0,25 0,38 0,56 0,84 1,27 1,9 2,85 1 0 0 1 10 13 22 25 24 2 0 0 2 8 16 23 25 25 Répétition 3 0 0 2 12 15 24 24 25 4 0 0 4 12 16 22 25 25 Cumul 0 0 9 42 60 91 99 99 Mortalité (%) 0 0 9 42 60 91 99 99 C° = Concentration Ces résultats indiquent que l’EMF avait une activité toxique sur les larves de Culex quinquefasciatus. Le taux de mortalité provoqué par variait de 1 % à la concentration de 0,38 µg/ml à 99 % à 2,85 µg/ml.

3.7.4. Effets des extraits sur les puces

A la concentration de 5 mg/ml de l’EMF, testée selon la méthode décrite au § 2.2.7.3 (p. 43), les puces étaient résistantes.

3.7.5. CL50 (24 h)

Les effets toxiques de l’EMF sur les animaux à sang froid sensibles étaient doses- dépendants. Les valeurs des CL50 24 h ont ainsi pu être déterminées selon la méthode citée au § 2.2.7.4 (p. 43). Les résultats sont consignés dans le tableau 20.

Tableau 20: CL50 24 h chez les animaux à sang froid

Classes d’animaux Espèces CL50 Amphibiens Ptychadena mascareniensis 13,51 µg/ml Poissons Cyprinus carpio 8,2 µg/ml Culex quinquefasciatus 0,72 mg/ml (720 ppm) Insectes Aedes albopictus 0,91 mg/ml (910 ppm)

4. DISCUSSION

L’EMF était toxique sur des animaux à sang chaud et à sang froid.

Sur souris, l’injection par voie ip était beaucoup plus efficace que les deux autres voies d’administration testées (orale et sous-cutanée). La DL50 24 h pour l’EMF est comprise entre 46,24 mg/kg et 47,15 mg/kg par voie ip.

Effets sur les animaux

Comparée à la toxicité des espèces de Pittosporum malgaches, évaluée dans les mêmes conditions (animaux, voie d’administration), l’EMF de P. ochrosiaefolium est aussi toxique que l’EMF de P. verticillatum (Arijaona, 2005) dont la DL50 était égale à 46,4 mg/kg mais il est moins toxique que celui de P. senacia (Razafintsalama, 2006) où la DL50 a été estimée à 26,73 mg/kg.

La comparaison de la toxicité de l’EMF de P. ochrosiaefolium avec celle de ses congénères étrangers est difficile car les conditions d’évaluation de cet effet ne sont pas les mêmes : les animaux, les extraits d’organe et la voie d’administration utilisés sont différents. A titre d’illustration, la DL50 des extraits méthanolique et aqueux d’écorce de P. floribundum (Yasodamma et al., 2015) chez le rat par voie orale sont respectivement 1834,6 mg/kg et 1337,5 mg/kg. Les DL50 de l’extrait de graines de P. tobira sont respectivement 25 mg/kg et 1275 mg/kg par voie ip et voie orale, chez la souris et le rat (D'Acquarica et al., 2002). En comparaison avec des plantes déjà étudiées au LABASM, l’EMF est moins toxique sur souris que l’extrait aqueux de graines de Cnestis glabra (DL50 = 36 mg/kg) (Jeannoda,

1984), ou l’EMF de graines d’Albizia viridis (DL50 entre 6,72 et 8,04 mg/kg) et Albizia masikororum (DL50 entre 16,5 et 16,81 mg/kg) (Randrianarivo et al., 2014). Par contre, la toxicité de l’EMF est plus élevée que celle de l’extrait éthanolique de bulbe de Rhodocodon madagascariensis (DL50 = 170 mg/kg) et de l’extrait de feuilles de Discorea antaly (DL50 entre 2,88 g/kg et 2,93 g/kg) (Rakotobe, 2009).

Plusieurs familles chimiques ont été détectées dans l’EMF de feuilles de P. ochrosiaefolium mais les saponosides sembleraient être les responsables de la toxicité de la plante d’après les tests d’activité des différents extraits obtenus.

Ainsi, les saponosides totaux étaient plus toxiques que l’EMF.

Les signes développés par les animaux intoxiqués étaient variés mais les symptômes d’atteinte des systèmes nerveux et respiratoire étaient les plus visibles tels que les convulsions cloniques et l’augmentation du rythme respiratoire. En outre, une diarrhée a été également notée. Cette diversité des symptômes pourrait être due à l’implication de plus d’un principe toxique.

L’étude histo-pathologique a permis de localiser les organes cibles des principes actifs. Le déroulement normal d’une réponse inflammatoire chez les animaux comporte 3 phases successives (Chandrosama et al., 1998). La phase vasculo-exsudative se traduit par la vasodilatation, les foyers œdémateux ou hémorragiques par fuite des globules rouges ou de

Effets sur les animaux liquide plasmatique et la présence des polynucléaires neutrophiles. La phase cellulaire (ou phase de détersion) se manifeste par la présence de plasmocytes, lymphocytes, histiocytes (se transformant en macrophages) pour nettoyer les polynucléaires altérés, les foyers œdémateux ou hémorragiques. La phase de cicatrisation caractérisée par la présence de capillaires hyperplasiques précédant une fibrose tissulaire. En général, les lésions provoquées par l’EMF par voie ip, en fonction du temps et de la dose, évoluaient selon ces 3 phases. La phase vasculo- exsudative se situait dès la 3ème heure après injection sauf pour le gros intestin où une ébauche de la phase cellulaire était déjà observée. A partir de la 9ème heure, la phase cellulaire se poursuivait même jusqu’à la 48ème heure, une ébauche de cicatrisation était amorcée avec la présence des capillaires hyperplasiques. Les lésions observées au bout de 10 jours par voie orale au niveau des organes cibles étaient comparables à celles observées 9 h après administration par voie ip. Ceci pourrait être expliqué par les effets cumulatifs de l’EMF administré quotidiennement. Une autre explication pourrait être avancée. Les saponosides de l’EMF seraient en grande partie dégradés dans le tube digestif (hydrolyse enzymatique ou action de la flore intestinale) réduisant ainsi le nombre de molécules qui sont absorbées et qui atteignent les différents organes d’où le retard de l’apparition des lésions.

Comme il a été dit plus haut, les symptômes nerveux étaient prédominants chez les souris intoxiquées. Les saponosides sont réputés pour leurs effets sur le système nerveux (Bruneton, 1993). Or, l’étude anatomo-pathologique du cerveau a révélé que ce dernier présente une histologie normale. De ce fait, les symptômes nerveux n’étaient pas dus à une action directe de l’EMF sur le cerveau. Ils pourraient être les conséquences des lésions provoquées par les saponosides au niveau des poumons. En effet, les saponosides, bien connus pour leur capacité à perforer la membrane des érythrocytes (Menin et al. 2001) réduiraient le nombre de globules rouges (présence de nappe hémorragique) et partant le transport d’oxygène vers les organes dont le cerveau. L’hypoxie au niveau du cerveau pourrait engendrer une souffrance de l’organe qui s’est traduite entre autres par des crises convulsives.

Par voie ip, l’extrait était directement drainé par la circulation générale. Au niveau de l’intestin, richement vascularisé, il pourrait provoquer une hypersécrétion des glandes muqueuses intestinales expliquant les diarrhées.

L’EMF a provoqué une augmentation de la force de contraction cardiaque ou effet inotrope positif. Cet effet est probablement provoqué par des molécules cardiotoniques qui comprennent trois grandes catégories :

Effets sur les animaux

- Les hétérosides cardiotoniques qui présentent une structure cyclique avec un noyau stéroidique qui leur confère l’activité pharmacologique. Leur effet inotrope positif est très souvent accompagné des effets tonotrope positif, chronotrope négatif, et dromotrope négatif (Brugere et al., 2002).

- les agonistes bêta-1 adrénergiques qui provoquent leurs effets inotrope et chronotrope positifs par augmentation de la concentration intracellulaire en AMPc (Guimarães et al., 2001).

- les inhibiteurs de la phosphodiestérase qui ne présentent que des effets inotropes positifs (Movsesian et al., 2011). Les résultats montrent que les principes actifs de l’extrait n’ont pas agi sur la chronotropie mais seulement sur l’inotropie. Ce qui indique que l’extrait ne renfermait pas de molécules capables de stimuler les récepteurs béta-1 adrénergiques. Or, l’EMF ne contenait pas de stéroïdes. Ceci prouve que les principes actifs seraient des inhibiteurs de la phosphodiesterase (PDE). L’inhibition de la PDE, enzyme catalysant la dégradation de l'AMP cyclique, entraîne une augmentation intracellulaire d’AMPc. Cette augmentation en AMPc active la protéine kinase AMPc-dépendante qui assure la phosphorylation des canaux Ca++ et leur ouverture permettant à l'influx de Ca++. L’augmentation de la concentration intracellulaire en Ca++ est à l’origine de la contraction du myocarde (Chung et al., 2016).

Les résultats de l’étude de la toxicité subchronique ont montré une augmentation significative du poids des animaux traités par rapport aux témoins. Cette hausse du poids pourrait être liée à une stimulation de l’appétit des animaux par l’extrait, et qui aurait pour conséquence une augmentation de leur consommation de nourriture.

L’EMF, à la dose de 21,24 mg/kg/j pendant 30 jours, n’a pas affecté les fonctions rénale et hépatique car aucune différence significative n’a été observée concernant le taux plasmatique d’ALAT, d’ASAT et de créatinine des souris traitées et des souris témoin.

L’activité hémolytique de l’EMF 50 % (DH50 = 17,80 µg/ml) était de de loin supérieure à celle de l’Eupholarine, un saponoside du latex d’Euphorbia laro, isolé à l’état pur

(DH50 = 402,15 µg/ml) (Raheriniaina, 2004). L’activité hémolytique des saponosides est expliquée par leur interaction avec les stérols de la membrane cellulaire des érythrocytes, ce qui induit une augmentation de la perméabilité membranaire et un mouvement des ions : le sodium et l’eau entrent, le potassium fuit, la membrane éclate, permettant ainsi la fuite de l’hémoglobine (Hassan et al., 2010).

Effets sur les animaux

L’activité de l’EMF n’était pas sélective. En plus de sa toxicité sur les animaux à sang chaud, il a également agi sur les animaux à sang froid. Les alevins de poisson étaient plus sensibles que les têtards de grenouille. Comparé aux extraits de graines d’Albizia de Madagascar dont la toxicité a été évaluée dans les mêmes conditions, l’EMF était plus toxique sur les têtards de grenouille (CL50 = 13,51 µg/ml) que l’extrait méthanolique d’A. aurisparsa

(CL50 = 60 µg/ml), mais moins toxique que celui d’A. androyensis (CL50 = 3,56 µg/ml). Sur les alevins de poisson, l’EMF était moins toxique (CL50 = 8,2 µg/ml) que l’extrait d’A. tulearensis

(CL50 = 2,28 µg/ml).

La forte toxicité de l’EMF sur les poissons s’explique par l’action des saponosides sur l’épithélium respiratoire (Roy et al., 1990). Ces auteurs ont également montré que les poissons présentent des réactions de stress en présence de saponosides dans l'eau (Françis et al., 2002). Plusieurs espèces de Pittosporum sont également utilisées comme poison de pêche (Yoganarasimhan et al., 1996 ; Nagamalleswari et al., 2013).

Concernant la toxicité sur les larves de moustique, l’EMF a montré une activité toxique sur Culex quinquefasciatus plus faible que celle de l’extrait méthanolique de Vitex trifolia

(Verbenacées) dont la CL50 est de 41,41 ppm (Ghosh et al., 2011). Par contre, il a présenté une activité larvicide plus élevée que celle des extraits méthanoliques de Pavonia zeylanica

(Malvacées) et d’Acacia ferruginea (Fabacées) pour lesquels les CL50 sont respectivement 2214,7 ppm et 5362,6 ppm (Ghosh et al., 2011). L’EMF était moins actif que l’EB de latex d’Euphorbia primulifolia var. primulifolia (Euphorbiacées), une plante déjà étudiée au

LABASM dont la CL50 est de 0,48 ppm (Rasamoelina, 2012).

Vis-à-vis d’Aedes albopictus, l’EMF (910 ppm) a été beaucoup moins toxique que l’extrait méthanolique de feuilles Annona squamosa (Annonacées) (20,26 ppm) (Ghosh et al., 2011).

Les doses létales de l’EMF pour la souris n’étaient pas toxiques pour les poussins aussi bien par voie orale que par voie ip.

L’EMF n’a pas d’effets sur les puces.

A propos des éventuels effets que pourrait avoir l’utilisation d’extrait de P. ochrosiaefolium chez l’Homme, rappelons que l’EMF, chez la souris, n’était létale par voie orale qu’à une dose élevée (4 g/kg). Les 4 g d’extrait correspondent à 20 g de feuilles. En supposant que l’Homme ait une sensibilité similaire à celle de la souris, il faudrait qu’un Homme de 70 kg consomme 1,4 kg de feuilles en une seule prise pour en décéder, chose qui

Effets sur les animaux n’est pas envisageable, pour en décéder. Par contre, il faut être vigilant quant aux effets secondaires potentiels engendrés par la plante car même si des symptômes externes n’ont pas été observés après ingestion de la plante pendant quelques jours, les organes épurateurs pourraient être affectés par les principes actifs.

En ce qui concerne l’utilisation potentielle des extraits de P. ochrosiaefolium dans le contrôle des animaux nuisibles :

- au vu des résultats obtenus des tests d’intoxication par voie orale sur les souris de laboratoire, il n’est pas réaliste d’envisager l’utilisation de P. ochrosiaefolium comme appât empoisonnés contre les rongeurs. En effet, d’après l’échelle de toxicité de Hodge et Sterner (WHO, 1996), la plante est classée parmi les substances légèrement toxiques par voie orale

(DL50 orale entre 500 - 5 000 mg/kg). Cependant, il ne faut pas oublier que les souris sauvages, une souche différente de celle des souris de laboratoire, vivent dans des conditions très différentes. Si elles sont plus sensibles à l’EMF, l’utilisation de P. ochrosiaefolium en tant que souricide pourrait être considérée. Aussi, des expériences préalables sur des souris sauvages s’avèrent nécessaires.

- l’emploi de l’EMF est envisageable pour combattre les larves de moustique. Cependant, sa forte toxicité envers les poissons et les têtards et peut-être à d’autres animaux à sang froid doit être prise en compte.

5. CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Nos résultats ont montré que les feuilles de P. ochrosiaefolium contiennent des saponosides qui sont toxiques pour les souris, les poissons, les têtards de grenouilles ainsi que les larves de moustique.

Les symptômes que l’EMF a développé, les lésions qu’il a occasionnées au niveau des organes et les valeurs de ses indices de toxicité permettent de le classer parmi les extraits très toxiques par voie ip, mais faiblement toxiques par voie orale.

Dans le futur, nous envisageons :

- d’approfondir l’étude toxicologique avec les molécules de saponosides purs afin de déterminer le nombre de molécules impliquées dans les effets toxiques et comprendre leurs mécanismes d’action ;

Effets sur les animaux

- d’étudier dans quelle mesure les activités de l’EMF sur la fonction cardiaque pourraient être exploitées à des fins utiles ;

- d’entreprendre des enquêtes auprès des consommateurs d’extraits de P. ochrosiaefolium sur leurs éventuels effets secondaires ;

- de discuter avec les autorités compétentes des possibilités d’utilisation des extraits dans la lutte contre les organismes nuisibles ;

- d’étudier les autres métabolites secondaires présents dans les extraits sur les plans chimique et pharmacologique.

Chapitre IV

Etude des effets sur les végétaux

Effets sur les végétaux

1. INTRODUCTION

Des plantes toxiques pour des animaux sont connues pour être également toxiques pour des plantes. Plusieurs espèces malgaches étudiées au niveau de notre laboratoire d’accueil en sont des exemples : Albizia bernieri (Randrianarivo et al., 2014), Cnestis polyphylla (Jeannoda, 1986). Etant donné les impacts néfastes de l’utilisation des herbicides de synthèse sur l’environnement et sur la santé humaine et vétérinaire (Cf. Synthèse bibliographique), nous avons exploré les propriétés phytotoxiques de P. ochrosiaefolium dont la toxicité pour les animaux est maintenant bien établie.

Nos recherches ont consisté à : - évaluer l’influence des extraits sur la germination de graines - apprécier leurs effets sur la croissance de jeunes plantules.

Les expériences ont été réalisées avec l’EMF disponible en quantité suffisante.

2. MATERIELS ET METHODES 2.1. MATERIEL

Les graines utilisées sont des plantes potagères Liliopsida et Magnoliopsida provenant d’AGRIVET, un fournisseur agrée de semences.

Les informations concernant ces plantes sont données dans le tableau 21.

Tableau 21 : Les graines utilisées pour les expérimentations

Nom CLASSE FAMILLE Nom scientifique vernaculaire Phaseolus vulgaris Haricot blanc FABACEES Pisum sativum Petit pois MAGNOLIOPSIDA CUCURBITACEES Cucumis sp Concombre BRASSICACEES Brassica sp Tissam white Zea maÿs Maïs LILIOPSIDA POACEES Oryza sativa Riz

2.2. METHODES 2.2.1. Etude des effets de l’EMF sur la germination des graines

Pour chaque espèce étudiée, les graines sont désinfectées par trempage dans de l’eau de javel 10 % pendant 1 min. Après rinçage à l’eau de robinet, les graines réparties en 3 lots de

Effets sur les végétaux

10 sont trempées dans l’EMF à des concentrations déterminées pendant 48 h à l'obscurité et à 30°C. Après le trempage, toutes les graines de chaque espèce sont mises à germer sur du coton imbibé d’eau de robinet. Un lot de 10 graines trempées dans de l’eau de robinet pendant 48 h et est mis à germer sur du coton imbibé d'eau sert de témoin. Les graines sont arrosées tous les 2 jours avec l’eau de robinet et leur germination est suivie pendant 15 jours.

Les graines, qui ont germé, qui n’ont pas germé et qui sont pourries, sont comptées tous les 2 jours jusqu’à la fin du test. Les résultats sont exprimés en pourcentage de germination.

Selon Scott et al., (1984) :

% Germination = (nombre de graines germées / nombre total de graines) × 100

2.2.2. Etude des effets de l’EMF sur la croissance des jeunes plantules

Cette expérience a été réalisée selon les méthodes de Randrianarivo et al. (2014) sur 4 plantes potagères (haricot, maïs, riz, petit pois). Ces plantes ont été choisies parmi les espèces dont les graines sont faciles à faire germer et celles dont les organes des plantules (épicotyles et hypocotyles) sont faciles à mesurer. Les effets de l’EMF sur la croissance des jeunes plantules sont comparés à ceux du glyphosate, un herbicide de référence.

Les graines sont trempées dans l’eau de robinet pendant 48 h pour la levée de dormance. Elles sont ensuite réparties en 4 lots de 10 graines. Le premier lot servant de témoin est transféré sur du coton imbibé d’eau de robinet. Les 3 autres lots sont mis à croître sur du coton imprégné d’extrait de concentration bien définie. Les jeunes plantules sont arrosées avec de l’eau de robinet tous les 2 jours pendant 15 jours. Les effets de différentes concentrations d’EMF sur la croissance des jeunes plantules sont appréciés par la mesure des longueurs des hypocotyles et des épicotyles tous les 2 jours.

Les résultats ont été soumis à des analyses statistiques ANOVA à l’aide du logiciel STATITCF (MS-DOS version 6.21), suivi du test de Newman-Keuls à 5 % d’intervalle de confiance. Le nombre de jours d’expérimentation et la concentration des extraits ont été choisis comme facteurs.

3. RESULTATS 3.1. EFFETS DE L’EMF SUR LA GERMINATION DES GRAINES

La levée de la germination constitue un premier diagnostic d’effet inhibiteur d’un extrait.

Effets sur les végétaux

Les graines ont été mises à germer en présence de l’EMF à différentes concentrations (0,5, 1, 2,5 et 5 mg/ml). La suite des opérations est décrite au § 2.2.1 (p. 72).

Les pourcentages d’inhibition enregistrés au 15ème jour sont présentés dans le tableau 22.

Tableau 22 : Effets de l’EMF sur la germination de différentes graines

EMF Pourcentage d’inhibition (%) (mg/ml) Petit pois Maïs Haricot Riz Concombre Tissam 0 0 0 0 0 0 0 0,5 26,67 13,33 13,33 0 50 10 1 33,33 16,63 16,63 10 46,67 33,33 2,5 40 13,33 30 3,33 26,67 43,33 5 73,33 23,33 100 3,33 26,67 43,33

Les graines témoins ont toutes germé à 100 %.

L’EMF a inhibé la germination de toutes les graines mais à des taux très différents. Par exemple à 5 mg/ml, la germination du haricot était inhibée à 100 % alors que celle du riz ne l’était qu’à moins de 4 %. Par ailleurs, l’inhibition était dose dépendante.

Les deux Fabacées, le haricot (100 %) et le petit pois (73,3 %), étaient les plus sensibles à l’action de l’EMF. Pour les autres graines, l’inhibition allait de 3,3 % (riz) à 43,3 % (tissam).

Le suivi régulier de la germination durant les 15 jours a permis de noter que la germination était retardée de 5 jours (haricot et maïs) ou interrompue au bout de 7 jours (haricot). Dans le deuxième cas, les graines pourrissaient.

3.2. EFFETS DE L’EMF SUR LA CROISSANCE DES JEUNES PLANTULES

L’EMF a été utilisé à diverses concentrations. En partant de 7,2 mg/ml, concentration recommandée pour l’utilisation optimale du glyphosate, 7 concentrations décroissantes de l’EMF ont été utilisées : 7,2 mg/ml ; 3,6 mg/ml ; 1,8 mg/ml ; 0,9 mg/ml ; 0,45 mg/ml ; 0,225 mg/ml ; 0,1125 mg/ml.

Les courbes de croissance des jeunes plantules de maïs, petit pois, haricot, riz, en présence de l’EMF sont présentées sur les figures 28 à 35. La justification du choix de ces 4 plantes a été déjà présentée dans § 2.2.2 (p.73).

Effets sur les végétaux

Des effets sur le développement des plantules, inhibition ou stimulation, ont été observés. L’inhibition se manifestait, selon les concentrations étudiées, par un ralentissement ou un arrêt de la croissance chez les jeunes plantules mais ces effets n’était pas significatifs (p>0,05) selon les analyses statistiques. C’est au niveau de l’hypocotyle de riz qu’elle était la plus marquée (p<0.05) (Figure 35). L’effet inhibiteur du glyphosate sur les jeunes plantules testées était plus important que celui de l’EMF.

En général, l’effet inhibiteur de l’EMF sur la croissance des jeunes plantules était faible.

Effets sur les végétaux

120 Epicotyle de maïs ) 80 p=0,53

40 Longueur (mm

0 3 5 7 9 11 13 15 Nombres de jours

0 mg/ml 0,1125 mg/ml 0,225 mg/ml 0,45 mg/ml 0,9 mg/ml 1,8 mg/ml 3,6 mg/ml 7,2 mg/ml Glyphosate 7,2 mg/ml

Figure 28 : Effets de différentes concentrations de l’EMF sur le développement de l’épicotyle de maïs

50 Hypocotyle de maïs

40 ) 30 p= 0,11

20 Longueur Longueur (mm

0 3 5 7 9 11 13 15 Nombre de jours

0 mg/ml 0,1125 mg/ml 0,225 mg/ml 0,45 mg/ml 0,9 mg/ml 1,8 mg/ml 3,6 mg/ml 7,2 mg/ml Glyphosate 7,2 mg/ml

Figure 29 : Effets de différentes concentrations de l’EMF sur le développement de l’hypocotyle de maïs

Effets sur les végétaux

160 Epicotyle de petit pois

120

p= 0,84 80

Longueur (mm) 40

0 3 5 7 9 11 13 15 Nombre de jours

0 mg/ml 0,1125 mg/ml 0,225 mg/ml 0,45 mg/ml 0,9 mg/ml 1,8 mg/ml 3,6 mg/ml 7,2 mg/ml Glyphosate 7,2 mg/ml

Figure 30 : Effets de différentes concentrations de l’EMF sur le développement de l’épicotyle de petit pois

Hypocotyle de petit pois 40

20 p=0,55 Longueur Longueur (mm) 10

0 3 5 7 9 11 13 15 Nombre de jours

0 mg/ml 0,1125 mg/ml 0,225 mg/ml 0,45 mg/ml 0,9 mg/ml 1,8 mg/ml 3,6 mg/ml 7,2 mg/ml Glyphosate 7,2 mg/ml

Figure 31 : Effets de différentes concentrations de l’EMF sur le développement de l’hypocotyle de petit pois

Effets sur les végétaux

30 Epicotyle de haricot

20 p=0,94

10 Longueur (mm)

0 3 5 7 9 11 13 15 Nombre de jours

0 mg/ml 0,1125 mg/ml 0,225 mg/ml 0,45 mg/ml 0,9 mg/ml 1,8 mg/ml 3,6 mg/ml 7,2 mg/ml Glyphosate 7,2 mg/ml

Figure 32 : Effets de différentes concentrations de l’EMF sur le développement de l’épicotyle de haricot

100 Hypocotyle de haricot

60 p=0,06

40 Longueur (mm)

0 1 2 3 4 5 6 7 Nombre de jours

0 mg/ml 0,1125 mg/ml 0,225 mg/ml 0,45 mg/ml 0,9 mg/ml 1,8 mg/ml 3,6 mg/ml 7,2 mg/ml Glyphosate 7,2 mg/ml

Figure 33 : Effets de différentes concentrations de l’EMF sur le développement de l’hypocotyle de haricot

Effets sur les végétaux

80 Epicotyle de riz 60

p=0,64 Longueur Longueur (mm) 20

0 3 5 7 9 11 13 15 Nombre de jours

0 mg/ml 0,1125 mg/ml 0,225 mg/ml 0,45 mg/ml 0,9 mg/ml 1,8 mg/ml 3,6 mg/ml 7,2 mg/ml Glyphosate 7,2 mg/ml

Figure 34 : Effets de différentes concentrations de l’EMF sur le développement de l’épicotyle de riz

Hypocotyle de riz 16

8 p=0

Longueur (mm) 4

0 3 5 7 9 11 13 15 Nombre de jours 0 mg/ml 0,1125 mg/ml 0,225 mg/ml 0,45 mg/ml 0,9 mg/ml 1,8 mg/ml 3,6 mg/ml 7,2 mg/ml Glyphosate 7,2 mg/ml

Figure 35 : Effets de différentes concentrations de l’EMF sur le développement de l’hypocotyle de riz

Effets sur les végétaux

Par contre, l’EMF possède un pouvoir phytoinhibiteur très élevé (p=0) sur l’hypocotyle de riz (Tableau 23).

Tableau 23 : Pourcentage de stimulation et d’inhibition de croissance des hypocotyles de riz au 15ème jour en présence de différentes concentrations de l’EMF

Concentration Stimulation Inhibition (mg/ml) (%) (%) 0 100 0 0,1125 130,39 -30,39 0,225 145,7 -45,7 0,45 83,44 16,56 0,9 77,21 22,79 1,8 80,07 19,93 3,6 11,46 88,54 7,2 7,95 92,05 Glyphosate 0 100

A de faibles concentrations (0,1125 et 0,225 mg/ml), l’EMF stimule la croissance de l’hypocotyle de riz. Le pourcentage de stimulation varie de 130,39 à 145,7 %. A partir de 0,45 mg/ml, l’EMF inhibe la croissance de l’hypocotyle. Cette inhibition s’accroit avec l’augmentation de la concentration. Ainsi, le pourcentage d’inhibition est de 16,56 % à 0,45 mg/ml et atteint 92,05 % à 7,2 mg/ml. Utilisé à la même concentration, l’effet inhibiteur de l’EMF (92,05 %) sur le riz est légèrement inférieur à celui du glyphosate (100 %).

4. DISCUSSION

Les effets de l’EMF ont été observés sur la germination des graines et le développement des plantules. En ce qui concerne certaines graines, la germination s’arrête au stade de gonflement de la graine. Pour d’autres, la germination s’arrête au début de l’apparition de la radicule. La différence de germination des graines pourrait être due à la différence de perméabilité sélective aux principes actifs. Kruse et al. (2000) ont montré que lorsque des plantes sensibles sont exposées aux molécules actives, la germination des graines est retardée.

Effets sur les végétaux

L’EMF a inhibé la germination des graines à des taux différents. Il se pourrait que les graines qui étaient insensibles aux doses testées (0,5 à 5 mg/ml), soient sensibles à des doses plus élevées.

Il existe plusieurs modes et sites d’action probables des molécules phytochimiques : inhibition de la division et de l’élongation cellulaire, réduction de l’activité mitotique, inhibition de la synthèse des protéines, inhibition de la respiration, diminution de la perméabilité membranaire (Rice, 1984). Un retard ou un arrêt de transmission des composés de stockage pourrait réduire la quantité des substrats utilisés pour la respiration et l’énergie métabolique, ce qui pourrait ensuite engendrer une diminution de la germination et de la croissance des graines (Yarnia et al., 2009).

L’EMF n’était pas actif sur l’épicotyle des plantules. C’est au niveau de l’hypocotyle qu’il a exercé son effet phytochimique. D’aprè Nishida et al., (2005), les tissus racinaires étaient plus sensibles aux produits phytochimiques que les tissus des pousses. L’hypocotyle de riz était plus perméable aux principes actifs de l’EMF que l’épicotyle car la racine entrait en contact direct avec ces produits. A de faibles concentrations, l’EMF stimulait la croissance de l’hypocotyle de riz mais à partir d’une concentration plus élevée, il l’inhibait. Ce résultat est en accord avec les points de vue de Rice (1984), qui a déclaré que les substances allélochimiques sont stimulatrices à de faibles concentrations et inhibitrices à des concentrations plus élevées.

Comparé aux plantes déjà étudiées au LABASM, l’EMF est aussi actif sur l’hypocotyle de riz que l’extrait méthanolique d’Albizia bernieri (pourcentage d’inhibition de croissance égale à 91,5 %). Par contre, son effet inhibiteur est plus élevé que celui de l’extrait méthanolique d’Albizia viridis dont le pourcentage d’inhibition de croissance de l’hypocotyle de riz est de 76,7 % (Randrianarivo et al., 2014).

Les molécules phytotoxiques comprennent les phénols, les terpènes, les glycosides, les alcaloïdes, les aminoacides et les sucres (Harborne, 1989). L’effet phytotoxique des plantes médicinales pourrait être attribué à la présence de composés phénoliques comme les flavonoïdes, les tanins et les phénols (Sharma et al., 2014). Ces composés interfèrent avec les enzymes responsables de l’activité respiratoire des graines provoquant ainsi l’inhibition de la germination et l’altération de l’activité de l’hormone de croissance (Sharma et al., 2014).

Les saponosides des plantes sont également phytotoxiques. Les effets de plusieurs d’entre eux sont dus à leur activité détergente sur les membranes (Macias et al., 2004).

Effets sur les végétaux

Comme l’EMF contient des flavonoïdes, des tanins et polyphénols, des désoxyoses, des stérols insaturés, des saponosides et des triterpènes, la phytotoxicité de l’EMF pourrait être dû à un effet synergique de ces composés.

L’effet de l’EMF sur l’hypocotyle de riz se rapproche de celui du glyphosate (inhibition égale à 100 %). Le glyphosate est un herbicide systémique à large spectre qui pénètre toute la plante. Son principal effet est de bloquer un enzyme, le 5-énolpyruvylshikimate-3- phosphate synthase (EPSPS) dont la plante a besoin pour fabriquer des acides aminés et des protéines (Gomes et al., 2014). Lorsque l’enzyme est bloqué, la plante meurt en quelques jours. Bien que l’EMF soit encore un mélange de différentes molécules, il est cependant aussi actif que le glyphosate qui est déjà un produit pur. Par conséquent, les principes à activité herbicide de l’EMF pourraient constituer de nouvelles molécules potentiellement plus performantes que le glyphosate.

5. CONCLUSION

L’EMF de P. ochrosiaefolium a une propriété phytotoxique. Il agit avec une efficacité variable aussi bien sur la germination des graines que la croissance des jeunes plantules

Chapitre V

Etude des effets sur les microorganismes

Effets sur les microorganismes

1. INTRODUCTION

Rappelons que P. ochrosiaefolium est une plante médicinale employée pour soigner des maladies infectieuses d’origine bactérienne (plaies, blennorragie). Dans notre étude, nous avons cherché à vérifier le bien-fondé de cette utilisation empirique et caractériser l’activité antimicrobienne (nature de l’activité, spectre d’activité) en testant nos extraits (EMF, les saponosides totaux et les différentes fractions obtenues lors de la chromatographie sur LH-20 (Fractions LH-20) sur des germes pathogènes. A cet effet, des tests d’antibiogramme en milieu solide et une évaluation de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) en milieu liquide, de la Concentration Minimale Bactéricide (CMB) et/ou de la Concentration Minimale Fongicide (CMF) ont été réalisés.

2. MATERIELS ET METHODES 2.1. Les microorganismes Le matériel microbiologique est constitué de 10 germes provenant de la collection du LABASM (Tableau 24). Nous avons étudié les effets des extraits de P. ochrosiaefolium sur la croissance in vitro des germes impliqués dans les pathologies humaines et ceux impliqués dans des pathologies traitées par la plante telles que les plaies. Ce sont des souches bactériennes Gram positif, des souches bactériennes Gram négatif et une souche fongique.

Tableau 24 : Liste des germes pathogènes testés

Souches Références

Enterobacter aerogenes ATCC 13048

Enterobacter cloacae ATCC 13047 Gram- Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145

Yersinia enterocolitica ATCC 23715

Bacillus cereus ATCC 14579

Clostridium perfringens ATCC 13124

Gram+ Staphylococcus aureus ATCC25923

Streptococcus pneumoniae ATCC 6305

Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Levure Candida albicans ATCC 10231

Effets sur les microorganismes

2.2. Les milieux de culture

Les milieux utilisés sont de qualité pour analyse et de marque BIORAD. Il s’agit :

. du milieu de MUELLER-HINTON Agar (MHA) pour étudier la sensibilité des microorganismes aux extraits en milieu solide ; . du bouillon MUELLER-HINTON (MHB) pour étudier l’activité des extraits en milieu liquide (composition en Annexe III).

2.3. Les antibiotiques de référence

Des disques pré-imprégnés de Néomycine (30 µg/disque) pour les bactéries et de Miconazole (500 µg/disque) pour C. albicans ont été utilisés comme référence.

2.4. Etude du spectre d’activité antimicrobienne

La sensibilité des microorganismes vis-à-vis des extraits a été déterminée par la méthode de diffusion en milieu gélosé ou encore appelée méthode des disques (Rios et al., 1988).

Chaque souche de bactérie est repiquée en milieu gélosé MHA dans des boites de Petri suivant la méthode par épuisement, puis incubée à l’étuve selon les conditions de température et de durée optimales de culture de chaque germe, afin d’obtenir une culture jeune et des colonies isolées.

A partir des cultures ci-dessus, quelques colonies isolées sont mises en suspension dans de l’eau physiologique. La turbidité de cette suspension est ajustée à celle de l’étalon 0,5 Mac Farland puis diluée au 1/100 pour obtenir un inoculum estimé à 106 cellules/ml. Cet inoculum est ensemencé par inondation sur des boites de Petri contenant la gélose MH.

Les disques d’antibiogramme stérilisés (6 mm de diamètre), pré-imprégnés de 10 µl d’extrait à tester à raison de 1 mg/disque sont délicatement déposés à la surface de la gélose ensemencée selon les méthodes utilisées par Andriamampianina et al., (2016). L’extrait diffuse à partir du disque créant ainsi un gradient de concentration. Les caractères de sensibilité ou de résistance de la souche bactérienne en seront déduits. Plus le halo d’inhibition est grand, plus le microorganisme est sensible. Des disques témoins (ED ou solvant d’extraction) et des disques de référence (antibiotique) sont inclus dans les essais. Les expériences ont été réalisées en double.

Effets sur les microorganismes

Les boites de Petri sont incubées à 37°C pour toutes les bactéries et à 25°C pour C. albicans. Les diamètres des halos d’inhibition (DHI) sont mesurés (mm) au bout de 24 h.

L’activité antimicrobienne de l’extrait est exprimée en DHI de la croissance microbienne qui traduit la sensibilité des souches testées. Cette grandeur est interprétée selon les normes utilisées par Ponce et al. (2003) et Moreira (2005) présentées dans le tableau 25.

Tableau 25: Normes utilisées pour l’expression des résultats obtenus par la méthode des disques

Diamètre du halo d’inhibition (x) Sensibilité des germes Résultats < 8 mm Résistant - 9 mm 20 mm Extrêmement sensible +++

2.5. Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI), Concentration Minimale Bactéricide (CMB) et/ou Concentration Minimale Fongicide (CMF)

La CMI ou Concentration minimale inhibitrice est la plus faible concentration d’un antibiotique donnant une inhibition de croissance. Elle a été déterminée pour les extraits actifs sur les microorganismes testés (halo d’inhibition ≥ à 9 mm) selon la méthode de dilution en milieu liquide sur microplaque utilisée par Andriamampianina (2016). C’est une méthode de double dilution.

Une ansée de germes prélevée à partir d’une pré-culture est ajustée à 0,5 Mac Farland et ramenée à 106 cellules/ml dans du bouillon Mueller-Hinton (MHB). L’inoculum est ainsi obtenu.

Une dilution en cascade d’extraits stérilisés par filtration (Sartorius stedim biotech 0,2 µm) est effectuée de manière à obtenir une gamme de concentrations précises.

Deux témoins sont utilisés : un témoin négatif (T-) contenant 100 µl de MHB et un positif (T+) (5 µl d’inoculum et 95 µl de MHB).

Chaque dilution d’extrait de volume 100 µl sont transférés dans les puits de la microplaque, qui contiennent chacun 95 µl de MHB et 5 µl d’inoculum. La gamme de concentrations de chaque extrait subit ainsi une dilution de moitié et les concentrations finales générées s’étalent de 25 mg/ml à 0,05 mg/ml.

Effets sur les microorganismes

Les plaques sont ensuite recouvertes de papier aluminium stérile, puis incubées à la température optimale de la souche (37°C pour les bactéries et 25°C pour la levure) pendant 24 h.

Après incubation, 40 µl de solution de chlorure de para-iodonitrotétrazolium (INT), de concentration 0,2 mg/ml sont ajoutés dans chaque puits. L’INT est un indicateur coloré de couleur jaune qui vire au violet lorsqu’il y a croissance microbienne. La plaque est de nouveau incubée de la même façon que précédemment. La croissance bactérienne est détectée par la coloration violette de l’INT. La CMI correspond à la plus faible concentration de l’extrait testé ne présentant pas de changement de coloration (Andriamampianina et al., 2016).

Pour la détermination de la CMB et de la CMF, 5 µl de chaque puits qui ne présente pas de trouble sont repiqués sur du milieu de MHA. La CMB ou la CMF correspond à la plus faible concentration avec laquelle aucune colonie bactérienne ne pousse après incubation.

Selon Michelle da Silva (2013), il n’y a pas de consensus concernant l’activité antimicrobienne des produits naturels. Un extrait dont la CMI ou la CMB ou la CMF est inférieure à 200 mg/ml s’avère significativement actif. Cette référence est adoptée pour l’interprétation des résultats de cette étude.

Le rapport CMB/CMI ou CMF/CMI donne une indication sur la nature de l’effet de l’extrait sur les microorganismes. Quand le rapport est > 4, l’effet est bactériostatique ou fongistatique et s’il est ≤ 4, l’effet est bactéricide ou fongicide (Chamandi et al., 2015).

3. RESULTATS 3.1. Activité antimicrobienne des extraits en milieu solide

L’activité des extraits a été étudiée sur 10 souches microbiennes à raison de 1 mg/disque, une concentration souvent utilisée pour les extraits de plantes (Razafintsalama et al., 2013 ; Marimuthu et al., 2014 ; Andriamampianina et al., 2016).

Les résultats sont récapitulés dans le tableau 26 et montrés sur la figure 36 (p. 88).

- Toutes les souches bactériennes testées ont été résistantes à tous les extraits. - Par contre, tous les extraits ont été actifs sur C. albicans mais leur efficacité a été différente. En effet, les DHI variaient de 14 mm pour l’EMF à 18,5 mm pour Sbut.

Effets sur les microorganismes

- Plus les extraits étaient purifiés, plus actifs ils étaient sur C. albicans : les DHI devenaient de plus en plus grands. - L’activité des extraits sur C. albicans était cependant nettement inférieure à celle du Miconazole (DHI = 25 mm à 500 µg/disque).

Tableau 26 : Effets des extraits en milieu solide

Diamètre du halo d'inhibition (mm) Antibiotiques de Souche Extraits (1 mg/disque) référence EMF SAP SB Néo Mico Enterobacter cloacae - - - 27,2 - Enterobacter aerogenes - - - 19,4 - Pseudomonas aeruginosa - - - 18 - Yersinia enterocolitica - - - 20,5 - Clostridium perfringens - - - 22,5 - Bacillus cereus - - - 21 - Staphylococcus aureus 7 18 - Streptococcus pneumoniae - - - 23,5 - Candida albicans 14,5 17,5 18,5 - 25 - : pas d’halo d’inhibition

Hex : extrait hexanique ; EMF : extrait méthanolique ; SAP : saponosides totaux ; nSAP : fraction non saponosidique ; SB : phase butanolique obtenue après la partition des saponosides totaux au n-butanol ; SA : phase aqueuse obtenue après la partition des saponosides totaux au n-butanol ; Néo : Néomycine à 30 µg/ml ; Mico : Miconazole à 500 µg/ml

Effets sur les microorganismes

Figure 36 : Effets des extraits (1 : EMF, 2 : SAP, 3 : SAPn, 4 : Sbut ; 5 : Saq ; 6 : Hexane) sur la croissance de Candida albicans en milieu solide (dépôt : 1 mg/disque)

3.2. Activité des extraits et des fractions LH-20 en milieu liquide L’évaluation des effets sur C. albicans de l’EMF, des SAP et des fractions LH-20 disponibles en quantité suffisante (F2, F3, F4 et F5) a été complétée par la détermination de la CMI et de la CMB.

La figure 37 montre un exemple de la variation de la croissance de C. albicans en fonction de la concentration des extraits.

Effets sur les microorganismes

25 12,5 6,25 3,12 1,56 0,78 0,39 0,19 0,1 0,05 T+ T- (mg/ml)

Zone A Zone B

Figure 37 : Variation de la turbidité induite par la croissance de Candida albicans en fonction de la concentration des fractions LH-20.

- ZONE A : aucune croissance bactérienne se traduisant par la coloration jaune très claire - ZONE B : croissance bactérienne visible se traduisant par la coloration violette - T- : témoin négatif (100 µl de MHB + 40 µl de solution de INT) - T+ : témoin positif (95 µl de MHB + 5 µl d’inoculum + 40 µl de solution de INT)

Les CMI et CMF des extraits actifs sont récapitulés dans le tableau 27. Les CMI variaient de 0,39 (F5) à 3,12 mg/ml (SAP et F2) et les CMF de 1,56 (EMF, F4 et F5) à 3,12 mg/ml (SAP, F2 et F3). Dans tous les cas, les rapports CMF/CMI étaient inférieurs à 4 indiquant que les effets de tous les extraits avaient une action fongicide sur C. albicans.

Tableau 27 : Valeurs de la CMI et CMF de l’EMF, SAP, F2, F3, F4, F5 sur C. albicans

Fractions CMI (mg/ml) CMF (mg/ml) CMF/CMI Activité EMF 1,56 1,56 1 Fongicide SAP 3,12 3,12 1 Fongicide F2 3,12 3,12 1 Fongicide F3 1,56 3,12 2 Fongicide F4 1,56 1,56 1 Fongicide F5 0,39 1,56 4 Fongicide

Effets sur les microorganismes

3. DISCUSSION

Nos résultats sur les propriétés antibactériennes ne permettent pas encore de conclure sur le pouvoir antibactérien de nos extraits. En effet, toutes les bactéries Gram positif et Gram négatif que nous avons testées étaient insensibles à l’EMF et SAP. Les souches pathogènes impliquées dans les maladies indiquées dans la littérature et lors des enquêtes ethnobotaniques concernant les utilisations de P. ochrosiaefolium sont des souches sensibles que nous n’avons pas testées.

Cependant, comme nous avons signalé dans la synthèse bibliographique, plusieurs activités antimicrobiennes ont été observées chez le genre Pittosporum : - P. viridulum a été démontrée active sur S. aureus et Salmonella typhi (John et al., 2014). - P. phylliraeoides est active contre Streptococcus pyogenes et Streptococcus mirabilis et Streptococcus marcenscens, Klebsiella pneumoniae et Streptococcus marcenscens (Vesoul et al., 2011). - P. floribundum est efficace sur Bacillus subtilis (MTCC-441), Staphylococcus aureus (MTCC-737), Escherichia coli (MTCC- 443), (Nagamalleswari et al., 2013). - P. dasycaulon est active sur Enterobacter aerogenes (Mani et al., 2015). - P. tobira a une activité antibactérienne vis-à-vis de Porphyromona gingivalis, Prevotella intermedia, et Fusobacterium nucleatum (Jung-Hyun et al., 2014).

Aussi, des investigations sur d’autres souches de bactéries s’avèrent donc nécessaires.

Par contre, nos extraits étaient actifs sur la levure C. albicans. L’effet sur ce microorganisme est une propriété bien connue chez plusieurs espèces de Pittosporum telles que P. tetraspermum (Al-Dhabi et al, 2015), P. floribundum (Nagamalleswari et al., 2013) et P. dasycaulon (Mani et al., 2015). Cependant, les candidoses ne figurent pas parmi les pathologies infectieuses traitées empiriquement avec P. ochrosiaefolium.

Les valeurs de la CMI de l’EMF et du SAP contre C. albicans étaient respectivement de 1,56 et 12,5 mg/ml. Par rapport aux études antérieures réalisées au LABASM, l’activité des extraits sur ce microorganisme était moins importante que celle des extraits méthanoliques de feuilles de Crotalaria bernieri (CMI = 0,097 mg/ml) et des graines d’Albizia bernieri (0,5 mg/ml).

Nos extraits étaient moins actifs que ceux de P. tetraspermum. A titre d’exemple, l’isosteviol, un produit pur isolé de cette plante montrait une bonne activité avec une CMI vis

Effets sur les microorganismes

à vis C. albicans de 62,5 µg/ml (Al-Dhabi et al, 2015). Par contre, l’EMF et SAP étaient plus efficaces que l’extrait méthanolique de P. dasycaulon (CMI = 20,80 mg/ml) (Mani et al., 2015).

Les candidoses sont souvent des infections bénignes, mais elles peuvent être à l’origine d’infections plus graves comme les candidoses digestives, gastriques ou encore se compliquer en septicémie, méningites, endocardites en particulier si elles apparaissent chez des patients immunodéprimés, pouvant mener au décès (Delaloye et al., 2014).

Diverses études ont montré que de nombreuses espèces de Candida ont développé une résistance aux médicaments antifongiques. Aujourd'hui, l'utilisation de médicaments à base de plantes pour traiter les infections fongiques s’avère importante parce qu’ils ont moins d'effets secondaires et sont moins susceptibles de développer la résistance aux médicaments par rapport à leurs homologues des chimiques.

Par ailleurs, des espèces de Pittosporum possèdent également des activités vis-à-vis d’autres souches de champignons : - P. floribundum est actif sur Aspergillus niger, (Nagamalleswari et al., 2013) ; - P. tetraspermum inhibe la croissance du Sacrocladium oryzae (Rosakutty et al., 2012).

Les activités des extraits pourraient être dues aux divers composés qu’ils contiennent tels que les saponosides, les tanins, les flavonoïdes dont les propriétés antimicrobiennes sont connues. L’activité antifongique de la fraction F2 qui ne contient que des saponosides est la même que celle des saponosides totaux (SAP). Par contre, l’activité de la fraction F5 qui ne contient que des flavonoïdes est presque 8 fois supérieure à celle de SAP (CMIF5 = 0,39 mg/ml contre CMISAP = 3,12 mg/ml). Ceci démontre que l’activité des flavonoïdes a été masquée par celle des saponosides ou en d’autres termes, il existe des interactions négatives (antagonismes) entre les deux groupes chimiques. Il est alors permis de penser que les flavonoïdes pourraient avoir une activité antibactérienne et justifier aussi l’utilisation empirique de la plante, mais malheureusement, la quantité disponible en F5 n’était pas suffisante pour le vérifier.

Les saponosides pourraient agir en modifiant la perméabilité de la paroi cellulaire et donc exercer une action toxique sur tous les tissus organisés. Ils exercent une certaine activité antimicrobienne par combinaison avec les membranes cellulaires pour provoquer des changements dans la morphologie des cellules conduisant à la lyse de celles-ci (Omojate et al., 2014). L'action lytique des saponosides a été attribuée à l'interaction de l'aglycone avec le cholestérol membranaire conduisant à la formation des pores au niveau de la membrane.

Effets sur les microorganismes

Comme la majorité des polyphénols, les flavonoïdes ont aussi une activité antifongique très puissante. Ils sont capables de se fixer sur certaines protéines et enzymes modifiant ainsi les équilibres enzymatiques (Vulgare et al., 2012).

En conclusion, les feuilles de P. ochrosiaefolium possèdent une activité fongicide qui est attribuée aux flavonoïdes et aux saponosides dont le nombre et la spécificité restent à vérifier.

Chapitre VI

Etude de l’activité antioxydante

Activité antioxydante

1. INTRODUCTION

La recherche de propriétés pharmacologiques et thérapeutiques potentielles de P. ochrosiaefolium constituait un des principaux objectifs de nos travaux sur cette plante.

Des flavonoïdes ont été trouvés dans les feuilles de P. ochrosiaefolium (Cf. Etude chimique, § 3.4., p. 32). Or, ces métabolites secondaires sont connus pour être de bons composés antioxydants. Aussi, avions-nous évalué le potentiel antioxydant de l’EMF. Pour ce faire, le test au DPPH a été utilisé.

2. MATERIELS ET METHODES

La réduction du radical libre DPPH (2.2 Diphenyl 1 picryl hydrazyl) par un antioxydant peut être suivie par spectrophotométrie UV-visible, en mesurant la diminution de l’absorbance à 517 nm provoquée par la présence des extraits (Wu, 2007). En présence de piégeurs de radicaux libres, le DPPH, de couleur violette, se réduit en 2.2 Diphenyl 1 picryl hydrazine de couleur jaune (Figures 38 et 39) (Maataoui et al., 2006). Cette décoloration est représentative de la capacité des extraits à piéger ces radicaux libres indépendamment de toutes activités enzymatiques.

DPPH (violet) DPPH-H (jaune)

Figure 38. : Réduction du radical DPPH

L’activité antioxydante des extraits a été déterminée par la méthode utilisée par Sofidiya et al (2011).

Différentes concentrations des extraits, en progression géométrique de raison r ont été préparées dans du méthanol. Les mêmes concentrations d’acide ascorbique (antioxydant de référence) ont été préparées. Un volume de 1 ml de chaque concentration est mélangé à 1 ml de solution méthanolique de DPPH à 0,004 % (P/V). La densité optique (DO) à 517 nm est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre SHIMADZU, après 30 min d’incubation à la température ambiante et à l’obscurité. Pour chaque concentration, le test est répété 3 fois. Une

Activité antioxydante augmentation de l’activité antioxydante est exprimée par une diminution de la valeur de l’absorbance.

La décroissance de l’absorbance est convertie en pourcentage d’activité Scavenger selon l’équation suivante :

% IP = [(Abs contrôle – Abs test)/ Abs contrôle] × 100) Où :

- IP : Pourcentage d’inhibition - Abs contrôle : Absorbance de la solution de DPPH (contrôle négatif) - Abs test : Absorbance de l’extrait

La SC50 (scavenging concentration 50 %) ou IC50 permettant de calculer la concentration d’extrait nécessaire pour piéger 50 % des radicaux DPPH a été déterminée graphiquement à partir des courbes de la variation du pourcentage d’inhibition I % en fonction de la concentration de chaque extrait. Plus la valeur de l’IC50 est petite, plus l’activité antioxydante des extraits est grande (Hebi et al., 2015).

L’analyse statistique des résultats a été réalisée en utilisant l’analyse des variances ANOVA à l’aide du logiciel Graphpad Prism 5.

3. RESULTATS

L’activité antioxydante de l’EMF, de la fraction F5 et de l’acide ascorbique est présentée dans le tableau 29. Les capacités antioxydantes étaient très significatives chez l’EMF et F5 (p<0,0001). L’activité exercée sur le radical libre DPPH par l’EMF et F5 était dose- dépendante. L’IC50 de l’acide ascorbique était égale à 1,17 µg/ml. Celles de l’EMF et F5 étaient de 7,1 et de 1,21 µg/ml respectivement.

A 177,67 µg/ml, l’EMF exerçait un fort piégeage du DPPH (98,08 %). Pour la fraction F5, l’inhibition était presque totale à seulement 29,8 µg/ml.

Activité antioxydante

Tableau 28 : Activité antioxydante de l’EMF, de la fraction F5 et de l’acide ascorbique

Concentrations % d’inhibition (µg/ml) EMF F5 Acide ascorbique 1,31 - 53,00 ± 2,12 54,06 ± 0,67 2,05 - 58,85 ± 0,54 58,25 ± 2,68 3,20 - 63,07 ± 0,70 67,17 ± 0,71 5 48,57 ± 0.92 68,06 ± 1,39 72,30 ± 1,99 7,81 53,05 ± 1,63 74,54 ± 1,03 84,29 ± 0,51 12,2 56,88 ± 0,36 88,10 ± 3,37 99,05 ± 0,19 19,07 61,29 ± 1,29 89,73 ± 6,77 99,25 ± 0,09 29,8 67,13 ± 0,44 97,49 ± 0,19 99,40 ± 0,15 46,57 75,79 ± 2,56 97,88 ±0,53 99,52 ± 0,11 72,76 93,39 ± 1,07 97,81 ± 0,26 99,55 ± 0,00 113,09 96,90 ± 0,83 98,26 ± 0,24 99,37 ± 0,15 177,67 98,08 ± 0,14 98,84 ± 0,15 99,00 ± 0,25

Les pourcentages d’inhibition obtenus pour l’EMF, F5 et l’acide ascorbique ont permis de tracer des courbes ayant une allure exponentielle avec présence d’un palier qui traduisait la réduction presque totale du DPPH en sa forme non radicalaire (Figure 40).

Figure 39 : Réduction du DPPH en DPPH-H par les extraits

Activité antioxydante

125

85 Pourcentage d'inhibition (%)

45 1,31 5 19,07 72,76 Concentration (µg/ml)

EMF F5 Acide ascorbique

Figure 40 : Inhibition du DPPH en fonction des concentrations de l’EMF, de la fraction F5 et de l’acide ascorbique

4. DISCUSSION

Les profils cinétiques obtenus révèlent une activité anti-radicalaire fortement dépendante des rapports antioxydant/DPPH. Plus le composé antioxydant était concentré, plus l’inhibition était importante.

Avec une IC50 de 7,1 µg/ml, de loin inférieure à 50 µg/ml, l’EMF peut être classé parmi les antioxydants très puissants (Jeyapragash et al., 2016).

Le pouvoir antioxydant de l’EMF était nettement supérieur à celui de l’Isosteviol, un produit pur isolé de P. tetraspermum. En effet, à 72,76 µg/ml, il inhibait les radicaux libres DPPH à 93,39 % alors qu’à 100 µg/ml, une concentration plus élevée, l’inhibition par l’Isosteviol n’était que de 70 % (Al-Dhabi et al., 2015).

L’activité antioxydante de l’EMF était comparable à celle de l’extrait méthanolique de feuilles de Dilobeia thouarsii dont l’IC50 est de 7,5 µg/ml (Razafitsalama, 2012).

L’EMF était largement plus efficace que l’extrait acétate d’éthyle de feuilles de

Pittosporum manii (IC50 = 177,39 µg/ml) (Momeni et al., 2010), les extraits méthanoliques de feuilles de Coriandrum sativum (IC50 = 751 µg/ml) (Mallick et al., 2016) et de graines de

Nigella sativa (IC50 = 640 µg/ml) (Talbil et al., 2015).

Activité antioxydante

Les capacités antioxydantes révélées in vitro sont en relation directe avec le contenu en métabolites secondaires de l’extrait. L’activité antioxydante de l’EMF pourrait être due aux polyphénols et/ou flavonoïdes présents dans l’extrait. Les flavonoïdes sont bien connus pour leur action antioxydante (Bruneton, 1999).

L’activité antiradicalaire de la fraction F5 (IC50 = 1,21 µg/ml) était similaire à celle de l’acide ascorbique (IC50 = 1,17 µg/ml) qui est un produit pur considéré comme le piégeur le plus efficace dirigé contre les radicaux libres dans les systèmes biologiques hydrosolubles. Donc, la fraction F5 a montré une puissante activité antioxydante.

En conlusion, les extraits de feuilles P. ochrosiaefolium ont une activité antioxydante élevée due à des flavonoïdes dont le nombre et la structure restent à vérifier.

Discussion et conclusion générales- Perspectives

Les investigations réalisées sur P. ochrosiaefolium, une plante endémique utilisée en médecine traditionnelle nous ont montré non seulement des propriétés pharmacologiques mais aussi des activités toxiques sur les animaux, les végétaux et les microorganismes.

Les métabolites secondaires contenus dans la plante étaient variés mais des saponosides terpéniques comme ceux trouvés dans d’autres espèces de Pittosporum telles P. verticillatum (Mahenina et al., 2013), P. floribundum (Yasodamma et al., 2015) et P. tobira (I D’Acquarica et al., 2002) étaient les principaux principes actifs impliqués. Nos travaux n’ont pas encore abouti à l’isolement et partant à la détermination structurale des différentes molécules de saponosides. Aussi, il n’est pas encore possible de se prononcer 1) sur le nombre de saponosides différents que contient l’EMF, 2) sur le nombre de saponosides actifs, 3) si les effets sur les différents organismes sensibles sont dus à une même molécule ou à des molécules différentes et 4) si les saponosides de Pittosporum ochrosiaefolium sont des nouvelles molécules ou des molécules déjà trouvées chez d’autres espèces de Pittosporum et/ou d’espèces de plantes appartenant à d’autres familles.

Des exemples illustrent en effet cette dernière hypothèse. La cnestine ou méthionine sulfoximine, un inhibiteur puissant de la glutamine synthétase initialement isolé de Cnestis glabra (Connaracées), est très toxique à la fois sur les animaux, les végétaux et les microorganismes (Jeannoda, 1986). Elle constitue aussi le principe toxique d’autres espèces de Connaracées malgaches à savoir Cnestis polyphylla et Rourea orientalis (Jeannoda, 1986). Quatre sur les cinq diterpénoïdes de type clérodane isolés du tubercule de Dioscorea antaly, sont de nouvelles molécules (Rakotobe, 2009). Les 3 bufadiénolides isolés de bulbes de Rhodocodon madagascariensis sont des molécules déjà trouvées dans d’autres espèces d’Hyacinthacées et d’une espèce animale, le crapaud (Rakotobe, 2009).

Dans le genre Pittosporum, des nouvelles molécules de saponosides triterpéniques ont été isolées de P. tobira (4) (D’Acquarica et al., 2002), de P. verticillatum (3) (Mahenina et al., 2013). Une molécule est commune à P. senacia (Linnek et al., 2012).

D’après nos résultats sur les microorganismes, l’EMF n’avait pas d’effet sur les bactéries pathogènes testées mais était très actif sur Candida albicans, une levure pathogène responsable de plusieurs maladies chez l’Homme et les animaux. L’EMF devrait être testé sur d’autres souches bactériennes pour vérifier le bien-fondé de l’utilisation de la plante pour traiter les maladies infectieuses d’origine bactérienne telles que la blennoragie.

Discussion et conclusion générales- Perspectives

A propos de l’utilisation traditionnelle de P. ochrosiaefolium, la faible toxicité des principes toxiques par voie orale semble expliquer la non-mention d’effets indésirables. Cependant, les lésions observées au niveau de plusieurs organes, surtout les organes épurateurs (foie, poumons et reins), nécessitent encore une étude toxicologique plus approfondie avec les produits purs et des enquêtes auprès des consommateurs.

En ce qui concerne l’utilisation de la toxicité de P. ochrosiaefolium dans le contrôle des organismes nuisibles, des possibilités sont envisageables. Contre les rongeurs, il faudrait encore attendre les résultats des tests sur des animaux sauvages (en liberté) qui vivent dans des conditions très différentes de celles des souris de laboratoire qui se sont montrées insensibles. L’activité intéressante contre les larves de moustique pourrait être exploitée moyennant des précautions pour éviter les effets sur des animaux à sang froid comme les poissons et les batraciens. Seule l’utilisation dans les milieux où ces animaux sont absents (flaque d’eau, étang) est pour le moment préconisée. Des tests sur des moustiques adultes devraient aussi être entrepris.

Les résultats relatifs aux effets de l’EMF sur les végétaux sont intéressants car l’EMF est à la fois actif sur les semences et les jeunes plantules, mais il est nécessaire d’effectuer des tests sur les mauvaises herbes et les plantes envahissantes avant d’envisager son utilisation comme herbicide. Les résultats sur les effets de l’EMF sur les plantes nous indiquent que les saponosides de P. ochrosiaefolium, dans son écosystème pourraient intervenir dans les relations de la plante avec les organismes environnants.

Nos résultats ont mis en évidence une autre propriété intéressante de la plante, le pouvoir antioxydant.

Nos travaux ont apportés des réponses aux objectifs que nous nous sommes fixés.

Les travaux effectués ont permis d’enrichir les connaissances sur P. ochrosiaefolium, sur la biodiversité de la flore malgache notamment les plantes médicinales et d’ouvrir de nouvelles pistes de recherche sur les autres espèces de ce genre.

PERSPECTIVES

Au vu de nos résultats qui semblent prometteurs, il est intéressant de :

- étendre les enquêtes à d’autres régions où pousse la plante pour explorer davantage ses utilisations et les effets secondaires ou inconvénients éventuels liés à ses emplois ;

Discussion et conclusion générales- Perspectives

- améliorer les procédés d’extraction et de purification afin d’obtenir les saponosides à l’état pur ; - purifier la fraction F5 ; - déterminer la structure chimique des produits purs ; - obtenir les composés isolés en quantité suffisante pour approfondir les tests sur les animaux et les microorganismes ; - étudier les effets toxiques in vivo sur d’autres espèces animales ; - étudier les effets des extraits sur les plantes nuisibles ; - étendre les tests antimicrobiens à d’autres germes pathogènes ; - exploiter les propriétés antioxydantes ; - approfondir les propriétés biologiques déjà mises en évidence ; - étudier le mécanisme d’action des principes actifs ; - prospecter d’autres propriétés biologiques mises en évidence chez d’autres espèces de Pittosporum ; - entreprendre les collaborations avec les populations locales et les agents de proximité pour les expériences sur terrain (tests sur les appâts empoisonnés, les larves de moustiques, les plantes invasives etc.).

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Annexes

ANNEXES

ANNEXE I

Composition des réactifs généraux pour les alcaloïdes

 Réactif de MAYER - Chlorure de mercure……………………………………………………………1,36 g

- Iodure de potassium……………………………………………………………….5 g

- Eau distillée……………………………………………………………….qsp 100 ml

 Réactif de WAGNER - Iodure de potassium………………………………………………………………2 g

- Iode……………………………………………………………………………..1,27 g

- Eau distillée……………………………………………………………….qsp 100 ml

 Réactif de DRAGENDORFF Il s’agit d’un mélange (v/v) de deux solutions, A et B.

Solution A :

- Nitrate de bismuth………………………………………………………………1,7 g

- Acide tartrique concentré………………………………………………………...20 g

- Eau distillée……………………………………………………………….qsp 100 ml

Solution B :

- Iodure de potassium………………………………………………………………10 g

- Eau distillée qsp………………………………………………………………...40 ml

Le mélange est ensuite additionné de 10 g d’acide tartrique et son volume est ramené à

100 ml par de l’eau distillée.

Annexes

ANNEXE II

Composition du milieu de Krebs- Henseleit (en mM)

- NaCl…………………………………………………………………………………20

- NaHCO3……………………………………………………………………………..25

- KCl………………………………………………………………………………...4,72

- CaCl2…………………………………………………………………………..……2,5

- MgSO4……………………………………………………………………………...0,5

- KH2PO4……………………………………………………………………………..1,2

- D-glucose……………………………………………………………………………11

ANNEXE III

Composition du milieu de MUELLER-HINTON

Formule-type (g/l)

- Extrait de viande...... 3

- Peptone...... 5

- Peptone trypsique de caséine...... 10

- Chlorune de sodium...... 5

- Glucose...... 2

- Agar...... 10

- Eau distillée...... q.s.q.1000 ml

pH 7,3 ± 0,1 à 25°C

Annexes

ANNEXE IV

Composition du réactif à la vanilline sulfurique

- Vanilline……………………………………. 0, 5 g

- Acide sulfurique (H2SO4) 36 N……………. 100 ml

ANNEXE V

Composition du PBS (Phosphate Buffered Saline)

• Phosphate disodique……………...0,39 g

• Phosphate monosodique………….1,34 g

• Chlorure de sodium……………….8,5 g

• Eau distillée………………………q.s.p 1000 ml

ANNEXE VI

Publications scientifiques

 Communication orale

Ratsimiebo M. P. Etudes chimique et biologique de l’extrait méthanolique de feuilles de Pittosporum ochrosiaefolium (Pittosporaceae). Journées jeunes chercheurs, Décembre 2015.

Ratsimiebo M. P. Chemical and biological investigation of Pittosporum ochrosiaefolium, a medicinal plant of Madagascar. Recherche et Développement. Doctoriales 2016.

 Communication affichée

Ratsimiebo M. P., Rakoto D. A. D., Randrianarivo H. R., Jeannoda V. L. Evaluation of antioxidant and antimicrobial properties of Pittosporum ochrosiaefolium extract, 2016.

Annexes

 Articles dans les revues internationales

Ratsimiebo M. P., Ramanitrahasimbola D., Rajemiarimoelisoa C. F., Razafindrakoto Z. R., Randrianarivo H. R., Rakoto D. A. D., Jeannoda V. L. Toxicity Study of Pittosporum ochrosiaefolium Bojer (Pittosporaceae) a Medicinal Plant of Madagascar. Journal of Plant Sciences, 2015; 3(6): 349-357.

Ratsimiebo M. P. Acute toxicity study of leaf methanolic extract from Pittosporum ochrosiaefolium. The 16th Symposium of the Natural Products Reseach Network for Eastern and Central Africa (NAPRECA). Theme: Improved Health and Agriculture through Sustainable Exploration of Biodiversity for Drug Discovery and Bioenergy, Septembre 2015.

Journal of Plant Sciences 2015; 3(6): 349-357 Published online December 9, 2015 (http://www.sciencepublishinggroup.com/j/jps) doi: 10.11648/j.jps.20150306.19 ISSN: 2331-0723 (Print); ISSN: 2331-0731 (Online)

Toxicity Study of Pittosporum ochrosiaefolium Bojer (Pittosporaceae) a Medicinal Plant of Madagascar

Maholy Pricille Ratsimiebo 1, David Ramanitrahasimbola 2, Clara Fredeline Rajemiarimoelisoa 2 Zoarilala Rinah Razafindrakoto 3, Hanitra Ranjana Randrianarivo 1, Danielle Aurore Doll Rakoto 1, Victor Louis Jeannoda 1

1Laboratory of Applied Biochemistry to Medical Sciences, Fundamental and Applied Biochemistry Department, Faculty of Sciences, University of Antananarivo, Antananarivo, Madagascar 2Department of Pharmacy, Faculty of Medicine, University of Antananarivo, Antananarivo, Madagascar 3Malagasy Institute for Applied Research (IMRA), Antananarivo, Madagascar Email address: [email protected] (M. P. Ratsimiebo), [email protected] (D. Ramanitrahasimbola), [email protected] (Z. R. Razafindrakoto), [email protected] (C. F. Rajemiarimoelisoa), [email protected] (D. A. D. Rakoto), [email protected] (H. R. Randrianarivo), [email protected] (V. L. Jeannoda) To cite this article: Maholy Pricille Ratsimiebo, David Ramanitrahasimbola, Clara Fredeline Rajemiarimoelisoa, Zoarilala Rinah Razafindrakoto, Hanitra Ranjana Randrianarivo, Danielle Aurore Doll Rakoto, Victor Louis Jeannoda. Toxicity Study of Pittosporum ochrosiaefolium Bojer (Pittosporaceae) a Medicinal Plant of Madagascar. Journal of Plant Sciences. Vol. 3, No. 6, 2015, pp. 349-357. doi: 10.11648/j.jps.20150306.19

Abstract: The present work aimed to assess the leaf toxicity of Pittosporum ochrosiaefolium Bojer , a well-known medicinal plant endemic to Madagascar. Leaf methanolic extract (LME), obtained after successive extractions by hexan and methanol, was tested in vivo on warm and cold-blooded animals and in vitro on isolated atria of guinea-pig. LME was toxic to mice with a LD 50 of about 46.69 mg/kg of body weight by intraperitoneal route. It induced mainly nervous disorders (body fasciculation, clonic convulsions), respiratory troubles (reduction of respiration frequency and cyanosis) and diarrheas. By intraperitoneal route, LME (46.69 mg/kg) caused histopathological lesions in lungs, liver, kidneys, small and large intestines but had no effects on brain, heart and stomach. Vascular congestion, inflammatory infiltrates, edema and necrosis were frequently observed. LME had a positive inotropic effect but no significant chronotropic one on isolated atria. It did not alter renal and hepatic functions at 21.24 mg/kg. It was highly toxic to the frog Ptychadena mascareniensis (LC 50 of 13.51 µg/mL) and the fish Cyprinus carpio (LC 50 of 8.2 µg/mL). It was also toxic to mosquito larvae Culex quinquefasciatus and Aedes albopictus with LC 50 of 720 ppm and 910 ppm respectively. Different chemical compound groups were found in LME but only saponins proved to be toxic. Under certain conditions, P. ochrosiaefolium might be exploited as source of pesticides or therapeutic molecules. Keywords: Pittosporum ochrosiaefolium , Leaf Methanolic Extract, Saponins, Toxicity, Histopathological Lesions, Pharmacological Activity

subtropical regions [3]. It is often cultivated as ornamental 1. Introduction plants in the Mediterranean region [4]. This study was undertaken to investigate the toxic effect of Pittosporum has other uses. Its timber is used in leaf methanolic extract (LME) of Pittosporum marquetry. Some species are employed as a fish poison [5-7]. ochrosiaefolium (Pittosporaceae), an endemic species to Different species are widely used as medicinal plants for Madagascar used in traditional medicine. It was the the treatment of various diseases. P. floribundum parts are continuation of our preliminary investigations on the toxicity used against skin diseases and itches [7]. In high doses, its of Malagasy Pittosporum species [1, 2]. bark acts as narcotic used as an antidote to snake poison, The Pittosporum genus, originating from East Asia, is one general weakness and also as a stimulant [8]. Australian of the 9 genera belonging to the Pittosporaceae family. It Aborigines use P. phylliraeoides to treat a variety of comprises about 160 species growing wild in tropical and conditions. An infusion of the leaves, seeds, fruit pulp or 350 Maholy Pricille Ratsimiebo et al .: Toxicity Study of Pittosporum ochrosiaefolium Bojer (Pittosporaceae) a Medicinal Plant of Madagascar wood is utilized to treat bruises, muscle aches, sprains and chemical nature of the compound(s) responsible of its cramps. P. phylliraeoides infusions are drunk to treat cough toxicity. Its effects on disease vector insects were also and cold and to induce lactation [9]. A decoction of fruit is investigated. used both externally and by ingestion to treat eczema and pruritus [10]. In south of India, P. tetraspermum is an 2. Experimental expectorant and possesses febrifuge and narcotic properties. It is used to cure chronic bronchitis, leprosy and skin 2.1. Plant Materials diseases. The paste of the root bark is applied to inflammatory and rheumatoid swelling [11]. In Azores Leaves were harvested in Ranomafana (Region of archipelago, infusion of P. undulatum fruits in alcohol or Vatovavy-Fitovinany, 400 km South East of Antananarivo), vinegar is employed for its anti-inflammatory activity [12]. in February 2013. Voucher specimens of P. ochrosiaefolium In South Africa and Kenya, P. manii is used for the treatment were deposited in the herbarium of Plant Biology and of fever, malaria, inflammation, stomachache and as an Ecology Department of the Faculty of Sciences of the antidote for insect bites [13, 14]. Some Pittosporum species University of Antananarivo. displayed an antidote activity for snake poisoning [7]. 2.2. Animals Several active compounds were isolated from Pittosporum . Triterpene saponins were found in P. senacia OF-1 strain Albino mice (Mus musculus ), weighing 25±2 (senaciapittosides A and B) [15], P. viridiflorum g, came from the Pasteur Institute of Madagascar breeding (Pittoviridoside) [16], P. verticillatum [17], P. manii [18]. farm. Sesquiterpene glycosides were isolated from P. undulatum Male or female Guinea pigs weighing 300±50 g were used. (undulatumosides A and B) [19] and P. viridiflorum [20]. They were purchased from local farmers and kept at least a Iridoid glycosides (6α-hydroxygeniposide) were obtained week in the IMRA animal house before use. Those rodents from P. glabratum [21], carotenoids (tobiraxanthins) from P. were housed under standard environmental conditions and tobira [22]. Essential oil was extracted from P. undulatum fed with standard rodent diet and water ad libitum . [23], P. neelgherrense and P. viridilum [24]. Fishes (Cyprinus carpio ), Royal strain, 2-4 cm size, were In addition, a number of Pittosporum species were the provided by a fish farmer. subject of pharmacological studies. Methanolic extract from Apode frog tadpoles (Ptychadena mascareniensis ) were the bark of P. manii showed activity against Plasmodium harvested from the ponds in the vicinity of the Antananarivo falciparum strains [18]. Antimicrobial and antifungal University site. activities of several species such as P. tobira [25], P. Fishes and tadpoles were allowed to acclimatize to the floribundum [7]. P. neelgherrense [26], P. undulatum [23], P. aquarium conditions for three days after their arrival in viridulum [24], P. tetraspermum [27] were demonstrated. laboratory. Larvicidal activity of P. tobira was reported [28]. Anti- The mosquito larvae (Culex quinquefasciatus, Aedes inflammatory activity of P. tetraspermum [11] and P. albopictus ) were furnished by Entomology department of undulatum [19] was revealed. The methanol and aqueous Pasteur Institute of Madagascar (IPM). extracts of stem bark from P. dasycaulon showed antioxidant One day old chicks (Gallus gallus domesticus ), Hubbard activities [29]. Cytotoxicity properties of P. verticillatum classic strain, were provided by poultry farmer. [17], P. venulosum [30] and P. tobira [22] were reported. In Madagascar, Pittosporum is represented by 11 species, 2.3. Leaf Methanolic Extract Preparation 9 of which are endemic. Different species are widely used as The dried leaves of P. ochrosiaefolium were ground into medicinal plants. They have anti-inflammatory, antimicrobial powder. Leaf powder (100 g) was extracted with hexan until and antispasmodic activities [31, 32]. complete discoloration. The colorless powder was extracted P. ochrosiaefolium Bojer var madagascariense Danguy with 3x1000 mL of methanol for 24 h under stirring. The Cufod is a shrub or tree up to 10 m high growing in filtrate was evaporated under reduced pressure to yield dry rainforest, in hot and humid areas of the eastern part of extract powders. The water solution of this leaf powder was Madagascar. named LME. The leaf infusion is employed for the treatment of gonnorhea. The bark decoction is a vermifuge in moderate 2.4. Extraction of the Crude Saponins doses. The stem and leaf infusion serve to calm bellyache and chewed leaf is an antidote for poisonous spider bites [31, The extraction of the crude saponins was performed as 32]. It is also used against cough and rash. In North East of following. LME residue was dissolved in methanol. A Madagascar, bark decoction is recommended to fight against mixture of acetone-ether (v/v) was added dropwise to the tiredness, back pain and urinating difficulty [33]. In resulting solution placed in ice-bath until no more crude Ranomafana, according to traditional healers, P. saponins precipitated. Precipitate was dissolved in distilled ochrosiaefolium is used to heal wounds. water and constituted the crude saponin fraction. The The present work mainly focused on the assessment and supernatant was evaporated to dryness. Dry residue characterization of the LME toxic effects on animals and the dissolved in distilled water constituted the non saponosidic Journal of Plant Sciences 2015; 3(6): 349-357 351

fraction. The toxicity activity of both fractions was assessed small intestines were harvested afterwards and preserved in on mice. formol 10%. The preparation of the organ sections for histopathological 2.5. Phytochemical Screening examinations was carried out using a classical method The detection reactions of chemical groups on LME were including the following steps: body fixation, inclusion, organ carried out according to the methods of Fong et al , 1997 [34] sections, preparation by microtomy, glass slide mounting, and Marini-Bettolo et al , 1981 [35]. staining and microscope examination [40]. 2.6. Acute Toxicity Tests 2.8. Study of LME Cardiac Effect

Toxic effects on mice and chicks were evaluated by The effect of LME on the chronotropy and inotropy of the intraperitoneal route and oral route. By intraperitoneal route, guinea pig isolated atria was assessed utilizing the method LME was injected at a volume of 0.25 mL per 25 g of body described in previous paper [41]. weight while by oral route, it was given by gavage by means Increasing concentrations of LME from 12.5 to 50 µg/mL of a curved distal end needle at the rate of 0.25 mL per 25 g were tested on the same animals. The responses of atria were of body weight. recorded at 1, 3 and 5 min after each injection. The number Subcutaneous route was employed to assess LME toxicity of beats per min and the amplitude of contraction were on mice (0.25 mL per 25±2g of body weight). measured and percentage of stimulation or inhibition was calculated according to the parameter controls. 2.6.1. Behavioral Observations of Intoxicated Mice All changes in intoxicated mice behavior were observed 2.9. Study of LME Effect on the Renal and Hepatic during 24 h after LME administration, continuously for the Functions first 4 h and then every hour. Changes in general behavior and This study consisted in the daily administration of a sub- other physiological activities or death were noted [36, 37]. lethal dose of the extract during 30 days and the assessment of the biochemical parameters to evaluate hepatic and renal 2.6.2. LD 50 Assessment on Mice The toxicity study was carried out using 40 female mice. function after treatment in mice. After exposure to a few The animals were randomly distributed into 8 groups of 5 possible toxic substances, there will be changes in body animals: one control group and seven treated groups. weight gain which would reflect toxicity [42]. Animals were provided with food and water ad libitum . The animals were weighed and divided into two groups of Seven different doses (from 42.48 to 60.24 mg/kg body five animals each. They were treated daily at a fixed time in weight) of LME were intraperitoneally injected. The control the morning by gavage of 10 mL/kg of distilled water for the group received physiological serum. control animals and 10 mL/kg of the extract prepared in distilled water for the treated animals. The tested LME dose The LD 50 (24 h) of the extract was determined by calculation and graphical methods of Reed and Muench, was 21.24 mg/kg body-weight. This dose corresponded to the 1938 [38] and Boyd et al , 1968 [39]. 1/2 of LD 0 by intraperitoneal route. The animals were then weighed every day, from the start until the end of the st 2.6.3. LC 50 Assessment on Cold Blooded Animals treatment, to note any weight variation. On the 31 day, the The LC 50 (24 h) of LME was determined on fishes, frog animals were anesthetized by chloroform inhalation. Their tadpoles and mosquito larvae. Eleven groups of five animals blood was collected on the retro-orbital. (fishes or frog tadpoles) were placed each in 500 mL Mean plasma levels of ALAT, ASAT and creatinine from crystallizer containing 250 mL of spring water. Ten groups control animals were statistically compared with those of the were treated with 10 different concentrations of LME and the extract treated animals. last one served as control. For the mosquitoes, 25 larvae were placed in 25 mL of 2.10. Statistical Analysis distilled water. Different concentrations of LME were added The results of LC 50 assessment were treated using the in the medium. One group without extract is used as control. method of statistical analysis ANOVA (Graphpad prism 5 The tests were performed in triplicate. software). Those of the pharmacological study were 2.7. Anatomopathological Study expressed as mean ± standard error mean (SEM). Significant differences were determined using a Student’s t test and the Three groups of 10 mice were used. Animals of group 1 differences were considered significant if p<0.05 [43]. were injected with 46.49 mg/kg, a dose corresponding to LD 50 , then sacrificed 3, 9, 24, 48 h after treatment. Animals 3. Results and Analysis of group 2 were treated orally with a single daily dose of 42.48 mg/kg (LD 0 dose) for 10 days. At the end of 3.1. LME Extraction Yields experiences, the animals were sacrificed. Animals of group 3 served as control. Extraction of the dried leaves of P. ochrosiaefolium gave a Brain, lungs, heart, stomach, liver, kidneys, large and green colored extract with a yield of 20.59%. 352 Maholy Pricille Ratsimiebo et al .: Toxicity Study of Pittosporum ochrosiaefolium Bojer (Pittosporaceae) a Medicinal Plant of Madagascar

3.2. Major Chemical Groups in LME 3.4. Anatomopathological Studies

The results of phytochemical screening of LME revealed The macroscopic analysis of the organs did not show any the presence of saponins, triterpenes, unsaturated sterols, significant changes in aspect, size, color or texture when alkaloids, flavonoids, iridoïds, tannins and polyphenols compared with the control group. (Table 1). Brain, heart and stomach appeared normal. Three hours after LME injection, vascular exudative inflammation 3.3. Acute Toxicity of LME on Mice appeared as vascular congestion in lungs, liver, kidneys and 3.3.1. Behavior Studies large intestine. Inflammatory infiltrates of variable density The signs developed by intoxicated animals were various. consisting of neutrophil polymorphonuclears were visible. The signs of the nervous system disorders were developed by No histologic lesion was observed in small intestine. hypoactivity, exophthalmos, fasciculation, paralysis of the Hemorrhagic foci with the presence or not of hemosiderin hind legs and clonic convulsions. The respiratory systems pigments appeared in purifier organs (lungs, liver and attacks were manifested by reduction of respiration kidneys) after 9 h of intoxication. Edematous and necrotic frequency, cyanosis etc. Other disorders as diarrhea were foci were also noted in liver. Hemorrhagic areas or noted. edematous foci and residual inflammatory cells were found at 24 h after injection. A starting tissue repair in inflammation 3.3.2. Influence of Administration Route target organs with capillary hyperplasia (small and large The influence of the administration route on LME effect intestines) appeared after 48 h. was shown in Table 2. The intraperitoneal route was by far As examples of organ injuries, lesions in lungs, liver, the most efficient. At doses about 52 times higher than the kidney, small and large intestines, which were more visible intraperitoneal LD 100 (60.24 mg/kg), no mortality was after at 9 h of poisoning were shown in Fig. 1. observed by subcutaneous and oral routes. Lesions by oral intoxication were generally the same as by intraperitoneal route after 3 h of intoxication. However, some 3.3.3. LD 50 Values lesions were not observed. The LD 50 of P. ochrosiaefolium value was assessed between 46.24 mg/kg and 47.15 mg/kg. 3.5. Effects of LME on Three Major Physiological Functions Table 1. Phytochemical screening of leaf preparations of P. ochrosiaefolium. 3.5.1. Effects of LME on the Cardiac Contraction in Results Chemical groups Tests Guinea-Pig powder LME On the one hand, compared to the magnitude of the Mayer + + contraction control, the perfusion of LME at a concentration Alkaloids Wagner + + of 25 µg/mL significantly increased auricular force of Dragendorff + + rd th Flavonoids Willstätter + + contraction at 3 and 5 minute (p<0.05) of recording (Fig. Iridoïds Hot HCl - - 2). At 50 µg/mL, it produced a positive inotropic effect time- Leucoanthocyanins Bate-Smith - - dependent. On the other hand, up to 50 µg/mL, no significant Saponins Froth test + + effect was recorded on the auricular frequency of contraction Steroids - - (p>0.05). Liebermann-Burchard Triterpenes + + Unsaturated sterols + + 3.5.2. Effects of LME on the Renal and Hepatic Functions Cardenolides - - in Mice Cyanogenic glycoside Grignard - - (i). Effects of LME on the Body Weight Insaturated lactones Kedde - - The mean weekly body weight gain of control and daily Coumarin - - treated mice with LME during 30 days was presented in Gelatin 1% - - Table 3. Tannins and polyphenols Gelatin-salt 10% + + The body weight of all treated animals increased. The FeCl 3 + + weight gain was even higher in treated animals. Quinones Borntrager - - (ii). Effects of LME on the Biochemical Parameters The impact of a sub-chronic intoxication by LME (21.24 Table 2. Effect of LME on mice according to administration route. mg/kg) on hepatic and renal function was assessed by any Mortality rate (%) rate change of respectively transaminases (ASAT and ALAT) DOSE (mg/kg) Intraperitoneal Subcutaneous Oral and creatinine. No significant change of the rate of the 3 60.24 100 0 0 biochemical parameters (p>0.05) was observed under the 463.68 100 0 0 experiment conditions (Table 4). 3000 100 0 0 3500 100 100 30 3.6. Effects of LME on Chicks and Cold Blooded Animals 4000 100 100 100 At 60.24 mg/kg, a dose corresponding to LD 100 on mice, Journal of Plant Sciences 2015; 3(6): 349-357 353

LME had no effect on chicks by intraperitoneal and oral tadpoles, Cyprinus carpio alvins and Culex quinquefasciatus routes. and Aedes albopictus larvae (Table 5). LME had toxic effects on Ptychadena mascareniensis

Figure 1. Main lesions induced by LME on lungs, kidney, small intestine (G x10), liver and large intestine by intraperitoneal route after 9 h of exposure (magnification factor x 40).

ED: edema; HA: hemorrhagic area; VD: vasodilatation; NP: neutrophil polymorphonuclears; NZ: necrotic zone; HS: hemosiderin pigments; II: inflammatory infiltrate; M: mucus

Figure 2. Effect of different concentrations of LME and contact time on the number of beats per minute (a) and the amplitude of contraction (b) and of the isolated guinea pig atria (n=3); *: p<0.05; **: p<0.02; ***: p<0.01. 354 Maholy Pricille Ratsimiebo et al .: Toxicity Study of Pittosporum ochrosiaefolium Bojer (Pittosporaceae) a Medicinal Plant of Madagascar

Compared to LD 50 of leaf extract of other Malagasy Table 3. Evolution of body weight of mice treated orally with LME (21.24 species, assessed under almost the same conditions (animal, mg/kg) during 30 days. administration route), LME was as toxic as P. verticillatum Evolution of body weight (g) Increase (LD of 46.4 mg/kg) [1] but less toxic than P. senacia (LD Treatments 50 50 Initial Final (% ) of 26.73 mg/kg) [2]. The comparison to the foreign Distilled water (Control) 25.25±2.03 29.94±1.92 18.57 Pittosporum species toxicity was not easy because their LME (21.24 mg/kg) 26.06±1.46 34.23±2.02 31.35 LD 50 , were sometimes assessed on other animals and by other administration route and concerned other parts extract Table 4. Effects of LME on two major physiological functions on mice. of the plant. For information, the LD 50 on rats by oral route Physiological function of the methanol and aqueous extracts of Pittosporum Hepatic Renal floribundum bark were 1834.6 mg/kg and 1337.5 mg/kg

ALAT (UI/L) ASAT (UI/L) Creatinine (mg/L) respectively [44]. The LD 50 24 h values of P. tobira green Control 34.00 ± 10.19 476.33 ± 66.08 2.95± 0.48 seeds extract were respectively of 25 mg/kg and 1275 mg/kg LME 35.33 ± 7.93 350.50 ± 91.86 3.78 ± 0.37 by intraperitoneal and oral routes in mice and rats [22]. In comparison to the toxicity of other plants we studied, Table 5. Effects of LME on different cold blooded animals. LME was more toxic than Rhodocodon madagascariensis bulb extract (LD 50 of 170 mg/kg) and Albizia bernieri seed Animal class Species LC 50 Amphibians Ptychadena mascareniensis 13.51 µg/mL extract (LD 50 of 55 mg/kg) [41]. Fishes Cyprinus carpio 8.2 µg/mL The signs developed by intoxicated animals were various Culex quinquefasciatus 0.72 mg/mL (720 ppm) but the symptoms of nervous and respiratory systems attacks Insects Aedes albopictus 0.91 mg/mL (910 ppm) were the most visible. This diversity was probably due to the presence of more than one toxic secondary metabolite in 3.7. Effects on Mice of Crude Saponins and Non LME. Saponosidic Compounds Crude saponins proved to be more toxic than LME. The symptoms with non-saponin group might be due to small The effects on mice of crude saponins and non saponosidic amounts of non-extracted saponins or other compounds. compounds were evaluated at two doses corresponding respectively to LME LD 50 (46.69 mg/kg) and LD 100 (60.24 4.3. Anatomopathogical Study mg/kg). At 46.69 mg/kg, crude saponins were found to be more The evolution over time of lesions caused by LME by toxic than LME. As to non-saponosidic compounds, even at intraperitoneal route was comparable to the normal progress 60.24 mg/kg, they were not lethal to mice but caused slight of the inflammatory response in animals. The vasculo- symptoms which disappeared within few hours. exsudative phase resulted in vasodilatation, edematous or hemorrhagic foci by loss of red blood cells or intravascular 4. Discussion fluid and neutrophil polymorphonuclears. The cleaning phase occurred through the presence of plasma cells, histiocytes to 4.1. Phytochemistry clean altered polymorphonuclear leukocytes, edematous or hemorrhagic foci. The scarring process (fibrosis, capillary Several chemical groups were found in leaf extract of P. hyperplasia) began after 24 h. ochrosiaefolium such as saponins, triterpenes, unsaturated The hemorrhagic area observed in liver and lungs were sterols, alkaloids, flavonoids, iridoïds, tannins and certainly due to the tensioactive and hemolytic activities of polyphenols, but saponins appeared to be the main chemical saponins present in large amount in LME. group if not the only involved in the toxicity of this plant. As mentioned above, saponins were found to be responsible of 4.4. Effects on Major Physiological Functions the toxic activity of a number of Pittosporum species. Given The result showed that LME possessed a concentration and the endemicity of P. ochrosiaefolium and the diversity of time-dependent positive inotropic effect. Three main saponins already isolated from Pittosporum , P. categories of substances are known to have a positive ochrosiaefolium might contain new saponins. inotropic effect, the digitalis, the phosphodiesterase inhibitors Investigations on other chemical groups, whose and the β1-adrenergic agonists. The positive inotropic effect pharmacological interests were demonstrated in foreign of digitalis is often accompanied by a negative chronotropic Pittosporum species, are ongoing. effect [45]. They contain in their chemical structure some 4.2. Acute Toxicity steroid nucleus which is responsible of their pharmacological activity. According to the phytochemical screening, this plant LME was toxic to warm and cold blooded animals. In did not contain any steroid compounds. On the other hand, mice, by intraperitoneal route it was highly toxic but by oral the positive inotropic effect of the β1-adrenergic agonists was route it was much less toxic, explaining why there were no accompanied by a positive chronotropic effect. reported side-effects. Journal of Plant Sciences 2015; 3(6): 349-357 355

LME did not act on the chronotropy but only on inotropy, These scientific data are necessary before exploiting any indicating that it could not contain any molecules capable to pharmacological property of this plant. They also stimulate the beta-1 adrenergic receptors. The demonstrated the weak toxicity of LME by oral route which pharmacological profile of the cardiac effect of this tested justifies the use of P. ochrosiaefolium in traditional medicine. extract was closer than that of the phosphodiesterase However, any use by injection is strongly not recommended. inhibitors. Effectively, the PDE inhibitors have only a Keeping in mind the various pharmacological properties positive inotropic effect [46]. So, its positive inotropic effect concerning the saponosides isolated from foreign could be due to a PDE type III inhibition mechanistic. Pittosporum species and saponosides in general, The body weight of the animals did not show any investigations are ongoing for isolating P. ochrosiaefolium significant change when compared to control group. saponins and exploring their properties . The serum biochemical parameters were studied to The toxicity of LME to cold blooded animals was evaluate the possible alterations in hepatic and renal interesting but its rational use in pest control must take functions influenced by the extracts. account its non-selective effects. The function of renal filtration was not significantly Our results contributed to a better knowledge of medicinal affected. The creatinine plasma level was statistically not and poisonous plants from Madagascar. different for the group of treated animals and those of the control group. Acknowledgment There were no changes in the ALAT and ASAT levels, which revealed that LME did not affect the liver function/ or The authors are grateful to the Pasteur Institute of metabolism. Madagascar (IPM) for providing mice for toxicity assessment, Therefore, it can be inferred that LME at 21.24 mg/kg did and the mosquito larvae and the Malagasy Institute for Applied not affect the normal hepatic and renal functions on 30 days Research (IMRA) for its technical support. treatment. 4.5. Effects of LME on Other Animals References LME toxicity was not selective since cold-blooded animals [1] M. Arijaona. Purification et caractérisation partielles des were also found to be susceptible to its action. The fish principes toxiques de feuilles de Pittosporum verticillatum Cyprinus carpio was more sensitive to LME than the frog (Pittosporaceae). Mémoire de DEA en Sciences de la vie” tadpole Ptychadena mascareniensis . Compared to the spécialité Biochimie, Université d’Antananarivo, (2005) p 79. toxicity of the seed extracts of Malagasy Albizia assessed in [2] V. E. Razafintsalama. Etude chimique et toxicologique des the same conditions [41], LME (LC 50 of 13 µg/mL) was extraits toxiques de feuilles de Pittosporum senacia more toxic to Ptychadena mascareniensis than the seed (Pittosporaceae). Mémoire de DEA en Sciences de la vie” methanolic extract of Albizia aurisparsa (LC 50 of 60 µg/mL) spécialité Biochimie, Université d’Antananarivo, (2006) p68. but less toxic than Albizia androyensis (LC 50 of 3.56 µg/mL). [3] G. Cufodontis. 92e Famille Pittosporacées. In: Humbert H, LME was more toxic to Cyprinus carpio than Albizia Gouvernement général de Madagascar, editors. Flore de aurisparsa (LC of 15 µg/mL) but less toxic than Albizia Madagascar et des Comores (plantes vasculaires), Typographie 50 Firmin-Didot et Cie, Paris; 1 (6) (1955) 33–39. tulearensis (LC 50 of 2.28 µg/mL). The high toxic effects of LME on cold-blooded animals [4] A. Loukis and C. Hatziioannou. Volatile Constituents of were probably due to saponins. The toxicity of these Pittosporum tobira (Thunb.) Aiton fil Cultivated in Greece. J. Essent. Oil Res., 17 (2005) 186-187. compounds to cold blooded animals is well-known. It accounts for the use of many plants containing saponins as poison [5] S. N. Yoganarasimhan. Medicinal plants of India, Karnataka fishing in several countries. Many species of Pittosporum were Interline Publishing Pv. 1st ed. Ltd., Bangalore, India, (1996). also reported to be used as fish-poisoning [5, 7]. [6] C. Thomas, Fuller and E. McClintock. Poisonous plants of Concerning the toxicity to mosquito larvae, LME was California. California Natural History Guides, (1988). compared to leaf methanolic extracts of other plants [47]. LME (LC of 720 ppm) was much more efficient against Culex [7] K. Nagamalleswari, N. Yasodamma and A. J. R. Binny. 50 Phytochemical screening, antibacterial and antifungal studies quinquefasciatus than Pavonia zeylanica (Malvaceae) and of Pittosporum floribundum Wight & Arn. Leaf, bark, fruit and Acacia ferruginea (Leguminosae) whose LC 50 were 2214.7 seed extracts. International Journal of Pharma and Bio ppm and 5362.6 ppm respectively. On the contrary, it was less Sciences, 4 (2) (2013) 464–474. efficient than Vitex trifolia (Verbenaceae) (LC of 41.41 ppm). 50 [8] K. M. Malleswari, N. Yasodamma and D. Chaithra. Acute To Aedes albopictus, LME (LC 50 of 910 ppm) was less toxic toxicity studies of Pittosporum floribundum Wt & Arn. A than Annona squamosa (Annonaceae) LC 50 of 20.26 ppm). herbal drug from Tirumala hills. Golden Research Thoughts, 4 (1) (2014) 2231-5063. 5. Conclusion [9] J. Vesoul and I. E. Cock. An Examination of the Medicinal Potential of Pittosporum phylliraeoides : Toxicity, Our results showed that P. ochrosiaefolium contained Antibacterial and Antifungal Activities. 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ABSTRACT

Research of possible toxicity and other biological properties of interest were conducted on P. ochrosiaefolium leaves, a medicinal plant from Madagascar. The leaf methanolic extract (LME), obtained by lixiviation with hexan and methanol, was used on animals, plants and microorganisms investigations. LME contained various secondary metabolites (saponosides, polyphenols, flavonoïds, iridoïds, unsatured sterols and triterpenes) but saponosides constituted the major chemical group. LME was weakly toxic on mice by oral route but highly toxic by intraperitoneal one.

Its LD50 was 46.69 mg/kg of mice by ip route. It induced mainly nervous disorders and respiratory troubles and caused histopathological lesions in lungs, liver, kidneys, small and large intestines. Lesions are characterized by vascular congestion, inflammatory infiltrates constituted by neutrophiles polynuclears, necrosis and edema. LME had a positive inotropic effect on isolated atria at 25 µg/ml. It did not alter renal and hepatic functions at 21.24 mg/kg.

LME was also toxic to cold blooded animals. Its LC50 values were 13.51 µg/ml to the frog Ptychadena mascareniensis, 8.2 µg/ml LC50 to the fish Cyprinus carpio, 0.72 mg/ml and 0.91 mg/ml to the mosquito larvae Culex quinquefasciatus and Aedes albopictus respectively. However, it had no effect to fleas (Xenopsylla cheopis) at 5 mg/ml. LME inhibited the seed germination of various plants affected the growth of rice seedlings. LME exhibited a fungicidal action on Candida albicans (Minimum inhibitory concentration = 1.56 mg/ml).

LME showed a very high antioxidant power (IC50 = 7.1 µg/ml). Tests with partially purified products demonstrated that saponosides were the responsible of the toxicity on animals and plants and flavonoids of the antifungal and antioxidant properties. In conclusion, this study revealed the toxic property of Pittosporum ochrosiaefolium leaves wich might be exploited in the control of pests and in the new pharmacological properties.

Keywords: Pittosporum ochrosiaefolium, leaf methanolic extract, saponosides, flavonoïds, zootoxic, phytotoxic, antimicrobial, antioxidant.

RESUME

Des recherches sur une éventuelle toxicité et d’autres propriétés biologiques d’intérêt ont été menées sur les feuilles de P. ochrosiaefolium, une plante médicinale endémique de Madagascar. L’extrait méthanolique (EMF), obtenu par lixiviation par l’hexane puis le méthanol, a été utilisé pour les investigations sur les animaux, les végétaux et les microorganismes L’EMF contient divers métabolites secondaires (saponosides, polyphénols, flavonoïdes, iridoïdes, stérols insaturés et triterpènes), mais les saponosides constituent la famille chimique majoritaire. L’EMF est faiblement toxique pour la souris par voie orale mais très toxique par voie intrapéritonéale (ip). Sa DL50 est estimée à 46,69 mg/kg de souris par voie ip. Il provoque des symptômes qui suggèrent une atteinte du système nerveux et respiratoire et des lésions au niveau des organes épurateurs (poumons, reins, foie, intestin), caractérisées par une congestion vasculaire, un infiltrat inflammatoire constitué de polynucléaires neutrophiles, des foyers de microhémorragies et des foyers œdémateux et nécrotiques. Il exerce un effet inotrope positif sur les oreillettes isolées de cobaye à partir de 25 µg/ml. Par contre, il n’affecte pas les fonctions rénale et hépatique à la dose de 21,24 mg/kg.

L’EMF est aussi toxique pour les animaux à sang froid : sa CL50 est estimée à 13,51 µg/ml et 8,2 µg/ml sur les têtards de grenouille et les alevins de poisson. Sur les larves de moustique, la CL50 est de l’ordre de 0,72 mg/ml sur Culex quinquefasciatus et 0,91 mg/ml sur Aedes albopictus. Par contre, à la concentration de 5 mg/ml, il est sans effets sur les puces. L’EMF inhibe la germination des certaines graines de Liliopsida et Magnoliopsida et la croissance de jeunes plantules. L’EMF est actif contre Candida albicans avec une CMI de 1,56 mg/ml.

L’EMF a un bon pouvoir antioxydant avec une IC50 de 7,1 µg/ml. Des tests avec des produits partiellement purifiés ont permis de démontrer que les saponosides sont responsables de la toxicité sur les animaux et les végétaux et les flavonoïdes de la propriété antifongique et antioxydante. En conclusion, l’étude a révélé des propriétés toxiques des feuilles de Pittosporum ochrosiaefolium qui pourraient être exploitées dans le contrôle d’organismes nuisibles et de nouvelles propriétés pharmacologiques.

Mots clés : Pittosporum ochrosiaefolium, extrait méthanolique, saponosides, flavonoïdes, zootoxique, phytotoxique, antimicrobien, antioxydant.