UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

PRESENÇA DE Ureaplasma diversum EM VACAS DE LEITE PERTENCENTES A MUNICÍPIOS DO NORTE DE MATO GROSSO, BRASIL.

JAQUELINE BRUNING AZEVEDO

Cuiabá – MT 2016

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

PRESENÇA DE Ureaplasma diversum EM VACAS DE LEITE DE DIFERENTES MUNICÍPIOS DO NORTE DE MATO GROSSO, BRASIL.

Autor (a): Jaqueline Bruning Azevedo Orientadora: Profª. Drª. Caroline Argenta Pescador Co-Orientadora: Profª. Drª. Valéria Dutra

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- graduação em Ciências Veterinárias, área de concentração: Sanidade Animal, da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias.

Cuiabá – MT 2016

AGRADECIMENTOS

Neste momento de grande emoção, agradeço aos meus pais, Edemundo e Leoni. Agradeço as noites em claro dirigindo um carro e “dirigindo” uma maquina de costura. Sou o que sou, graças a vocês, meus grandes amores. Agradeço as minhas amadas irmãs Juliana e Janaina, que fazem parte, mesmo que de longe, desta conquista. Vocês todos são a minha essência, o motivo de minha caminhada e a razão de todo esforço. Ao meu amado, Adriano, que me ajudou nos momentos de duvidas e questionamentos. A minha orientadora, profa. Dra. Caroline Argenta Pescador, sempre paciente e a disposição. Foi um período de muito aprendizado e de conhecimento, muito obrigada. A minha co-orientadora, profa. Dra. Valéria Dutra, pelo suporte. A Letícia, que, com muita paciência, ajudou durante todas as PCR’s. Aos amigos que fiz no Laboratório de Patologia Veterinária, desejo tudo de melhor na vida pessoal e profissional de vocês. Em especial, Kassia, Samara e Leilane, que se tornaram grandes amigas. Aos colegas da turma de mestrado e professores. Pelos momentos alegres e de conhecimento. Aos produtores, que abriram as portas de suas propriedades e casas, nos ajudando a tornar possível este trabalho. Meus sinceros agradecimentos. Talvez tenha deixado passar alguns momentos e pessoas, mais o carinho e as lembranças estão guardadas. E por fim e mais importante, agradeço a Deus e Nossa Senhora pelas graças que venho recebendo durante toda vida, esta é mais uma delas.

RESUMO

PRESENÇA DE Ureaplasma diversum EM VACAS DE LEITE PERTENCENTES A MUNICÍPIOS DO NORTE DE MATO GROSSO, BRASIL

A infecção por Ureaplasma diversum em fêmeas bovinas pode resultar em vários problemas reprodutivos, que incluem vulvovaginite granular, bezerros fracos, salpingite e aborto espontâneo. A presença de U. diversum na população bovina leiteira do Centro-Oeste do Brasil não foi estabelecida. O objetivo deste estudo foram determinar se U. diversum está presente em bovinos leiteiros do Centro- Oeste, Brasil, utilizando reação em cadeia da polimerase (PCR). A mucosa vulvovaginal de 203 animais localizados em seis municípios da região Norte de Mato Grosso, Brasil foram analisados. Um total de 25% das vacas leiteiras com vulvovaginite foi positivo pela PCR para U. diversum. Os fatores avaliados foram incluídos em um modelo de regressão logística multivariada, e a variável dependente foi à presença de pelo menos um animal positivo no rebanho. Três variáveis foram significativamente associadas com a PCR positiva para o U. diversum. Foi incluído no modelo multivariada final: número de partos, lesões vulvares e problemas reprodutivos. Cada novo parto, as chances de infecção U. diversum diminuíram 0,03 vezes, indicando que vacas com maior número de partos são mais protegidas. A presença de lesões vulvares foi 17,6 vezes maior para fêmeas positivas para U. diversum, sugerindo que esta bactéria pode estar relacionada à lesão granular vermelha na mucosa vulvar, a chance é 7,6 vezes maiores em vacas com problemas reprodutivos. No entanto, novas investigações devem ser realizadas para verificar os efeitos do U. diversum em associação com outras espécies de Mycoplasmas nos rebanhos estudados.

Palavras-chave: fatores associados; leite; PCR vaca; vulvovaginites.

ABSTRACT

PRESENCE OF Ureaplasma diversum IN MILK COWS BELONGING OF MUNICIPALITIES FROM NORTH OF MATO GROSSO STATE, BRAZIL

Ureaplasma diversum infection in bovine females may result in various reproductive problems, including granular vulvovaginitis, abortion, weak calves, salpingitis and spontaneous abortion. The presence of U. diversum in a dairy bovine population from midwestern Brazil has not been established. The aim of this study was to determine whether U. diversum was present in dairy cattle from midwestern Brazil using polymerase chain reaction (PCR). Vulvovaginal mucus was analyzed from 203 animals located in six municipalities in the north region of Mato Grosso State, Brazil. A total of 25% of dairy cows with vulvovaginitis were positive for U. diversum. The factors evaluated were included in a multivariable logistic regression model with the presence of at least one positive animal in the herd serving as the dependent variable. Three variables were significantly associated with a U. diversum positive PCR and were included in the final multivariable model: number of deliveries, vulvar lesions and reproductive problems. For each new delivery, the chance of U. diversum infection decreased 0.03-fold, indicating that cows with the highest number of deliveries were more protected. The presence of vulvar lesions was increased 17.6-fold in females positive for U. diversum, suggesting that this bacteria could be related to the red granulate lesions in the vulvar mucosa, whereas reproductive problems were increased 7.6-fold. However, further investigations should be conducted to ascertain the effects of U. diversum in association with other mycoplasma species in the herds studied.

Keywords: associated factors; cow; milk; PCR; vulvovaginitis.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Cultura microbiológica do Ureaplasma diversum. A cor da colônia é resultado de uma reação bioquímica entre o sulfato de manganês, que em contato com a amônia, produz o pigmento cor de “ouro” (cortesia: Maristela V. Cardoso – Instituto biológico)...... 18 Figura 2 A e B: Rebanhos de bovinos de leite visitados durante o estudo...... 26 Figura 3 Fêmea bovina. Mucosa vaginal. Vulvovaginite granular grau 1...... 26

LISTA DE TABELAS

Quadro 1. Principais eventos relacionados ao estudo de U. diversum em bovinos, a partir do ano 2000...... 15 Tabela 1. Resultado da PCR para U. diversum, associando o número de vacas de leite que apresentaram ou não a lesão de vulvovaginite granular...... 29 Tabela 2. Presença de U. diversum nos rebanhos bovinos localizados no médio norte do estado de Mato Grosso, Brasil...... 30 Tabela 3. Número de PCR positivas para U. diversum agrupadas nos 6 municípios localizados no médio norte do Estado de Mato Grosso, Brasil...... 31 Tabela 4. Resultado da regressão logística das variáveis para os fatores associados ao resultado positivo para U. diversum através da PCR...... 31

ANEXOS

Anexo 1: Inquérito epidemiológico aplicado em cada uma das 22 propriedades rurais visitadas...... 35 Anexo 2: Comprovante de submissão do artigo na revista Tropical Animal Heath And Production...... 37 Anexo 3: Artigo submetido a revista Tropical Animal Health And Production...... 38 Anexo 4: Certificado de aprovação no Comitê de Ética no uso animal...... 51

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...... 12

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...... 14

2.1 Histórico ...... 14

2.2. Biologia do agente ...... 17

2.3. Patogenia e fatores de risco ...... 19

2.4. Importância clínica e econômica ...... 22

2.5. Diagnóstico laboratorial ...... 24

3. MATERIAL E MÉTODOS ...... 25

3.1. População estudada ...... 25

3.2. Delineamento amostral e coleta de amostras ...... 26

3.3. Inquérito epidemiológico ...... 28

3.4. Extração de DNA e PCR ...... 28

4. RESULTADOS ...... 29

5. DISCUSSÃO ...... 32

6. CONCLUSÃO ...... 34

ANEXOS ...... 35

1. Inquérito epidemiológico aplicado em cada uma das 22 propriedades rurais visitadas...... 35

2. Comprovante de submissão do artigo na revista Tropical Animal Heath And Production ...... 37

3. Artigo submetido à revista Tropical Animal Health Na Production...... 38

4. Certificado de aprovação no Comitê de Ética no uso animal ...... 51

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 52

1. INTRODUÇÃO

A atividade leiteira, ou seja, a produção de leite é considerada uma das atividades mais tradicionais do meio rural brasileiro. O valor bruto da produção nacional de leite em 2013 foi de R$ 22,9 bilhões, movimentando e contribuindo para melhorar a economia das pequenas e médias cidades brasileiras (Brasil, 2014) O estado de Minas Gerais é o maior produtor de leite, seguido do Rio Grande do Sul e Paraná. O Mato Grosso é considerado o 8° produtor nacional, produzindo aproximadamente 200 milhões de litros de leite por ano (IBGE, 2015). Embora o Brasil seja um dos maiores produtores mundiais de leite bovino, a produtividade do rebanho (1.381 litros por vaca ordenhada/ano) é pequena. Isso significa que a produção de leite do país é proveniente, em sua maior parte, de sistemas de produção extensivos (IMEA, 2011). O estado de Mato Grosso, além de apresentar um sistema de criação extensivo, possui baixa tecnificação nas propriedades, caracterizada pela não utilização de inseminação artificial e ordenhadeiras mecânicas, comprometendo a eficiência produtiva e reprodutiva pelos baixos índices de concepção gerados (IMEA, 2011). Estudos revelam que dentre os fatores reprodutivos relacionados a baixas taxas de reprodução, a infertilidade, o aborto e as mortes embrionárias estão entre as principais causas de perda de eficiência reprodutiva em bovinos, sendo geralmente, associadas a agentes infecciosos (ANDERSON et al.,1990; KIRKBRIDE et al., 1992; PESCADOR et al., 2007; HIMSWORTH et al., 2009). De acordo com Buzinhani et al. (2007), as infecções por microrganismos da classe Mollicutes em animais de produção possuem importância histórica e persistem interferindo na pecuária. São relatadas na literatura aproximadamente 200 espécies de Mollicutes, mas destas apenas algumas são consideradas patogênicas para os animais de produção, principalmente os Mycoplasmas (FREY, 2002) e Ureaplasma diversum (MARQUES et al., 2009). Grande parte dos problemas reprodutivos em bovinos está relacionada a microrganismos que invadem o trato genital provocando lesões, levando à infertilidade e morte embrionária, entre outras manifestações (PETIT et al., 2008). Nos últimos anos houve um aumento na ocorrência de diagnósticos de agentes da

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família Mycoplasmataceae, em particular dos gêneros Mycoplasma e Ureaplasma, isolados com frequência do sistema reprodutor dos bovinos (KUNZ et al., 2004). Em 1972 um microrganismo do gênero Mycoplasma denominado Ureaplasma diversum foi reconhecido pela primeira vez em rebanhos bovinos de Ontário, no Canadá (DOIG et al., 1979). Até meados de 1978, as investigações sobre a relação entre o U. diversum e os distúrbios reprodutivos foram considerados controversos, pois acreditava-se que este microrganismo era comensal e não estava relacionado com os problemas de infertilidade nos rebanhos (KUNDSIN et al.,1978). O Ureaplasma diversum, é o único microrganismo do gênero que foi isolado em bovinos, é considerado um patógeno oportunista, sendo encontrado nas mucosas e secreções da vulva, vagina e úbere. Sua presença no animal está associada à ocorrência de vulvovaginite granular, salpingite, endometrite, mastite, infertilidade, perda embrionária, abortamento, morte neonatal e no macho leva à vesiculite seminal, balanopostite e epididimite (CARDOSO et al., 2000b; CHELMONSKA-SOYTA et al., 2001; PETIT et al., 2008). Entretanto, problemas reprodutivos caracterizados por aborto, descargas vulvares anormais e também vulvovaginite granular verificadas em algumas propriedades dos Estados Unidos e do Brasil proporcionaram informações adicionais em relação à ação patogênica deste microrganismo (RUHNKE et al.,1978; CHELMOSKA-SOYTA et al.,1994). A transmissão da bactéria de um animal para outro, pode ocorrer durante a estação de monta natural ou artificial, através da inseminação, implantes de progesterona e transferência de embriões (BRITTON et al., 1988; CARDOSO et al., 2000b; STRINGFELLOW & GIVENS, 2000; GAETI et al., 2014). O U. diversum vem sendo relatado em diferentes países, incluindo Nova Zelândia, Canadá, Austrália e nas Américas (SPRECHER et al., 1999). No Brasil, a prevalência de U. diversum em fêmeas bovinas com lesões vulvares varia de 23 a 65% (CARDOSO et al., 2000a; DOS SANTOS et al., 2013; GAETI et al., 2014), sugerindo que o microrganismo pode estar relacionado a vulvovaginite granular. Embora alguns estudos sobre a prevalência de Ureaplasma diversum tenham sido publicados no Brasil e em outros países, há informações limitadas sobre sua presença e distribuição em rebanhos bovinos leiteiros localizados em municípios da mesorregião médio-norte do estado de Mato Grosso. Sendo assim, o objetivo do 13

presente estudo foi verificar a prevalência da Infecção de Ureaplasma diversum através da reação em cadeia da polimerase (PCR) e buscar os fatores associados a esta infecção na população estudada.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Histórico

O primeiro isolamento do gênero Ureaplasma em bovinos ocorreu em 1967, no sistema reprodutivo de animais clinicamente saudáveis (TAYLOR-ROBINSON et al., 1967) sendo considerado um microrganismo não patogênico pela comunidade cientifica.

Em humanos o primeiro diagnóstico ocorreu em 1954, sendo o agente denominado T-mycoplasmas, pelo tamanho pequeno de suas colônias (SHEPARD et al., 1954). O Ureaplasma spp são geralmente considerados como comensais do sistema geniturinário inferior em homens e mulheres (BLANCHARD, 1993; KNOX et al., 2003). Entretanto, infecção por Ureaplasma no sistema reprodutor superior durante a gestação está associada a resultados adversos da gravidez, incluindo nascimentos prematuros e morbidade neonatal (VISCARDI et al., 2010). Os primeiros isolados em animais foram divididos em dois grupos sorológicos, o grupo “P” ou grupo patogênico e o grupo “S” ou grupo saprofítico. Acreditava-se que o grupo “P” estava envolvido com a doença, já o grupo “S” foi considerado um contaminante não patogênico. Os microrganismos classificados como cepa “P” posteriormente foram identificados como Mycoplasma bovigenitalium e os pertencentes à cepa “S” foram chamados de Acholeplasma laidlawii. Estudos subsequentes resultaram na descoberta de um número maior de outras espécies de Mycoplasmas do trato genital de bovinos saudáveis, gerando duvida no papel desses agentes em relação a doenças reprodutivas (DOIG et al., 1981). Em Ontário, no Canadá, DOIG e colaboradores no ano 1980 reproduziram quadros de vulvovaginite, salpingite e outras doenças reprodutivas por meio de estudos experimentais, confirmando a importância do Ureaplasma diversum como causa de doença no sistema reprodutivo de bovinos (DOIG et al., 1979; MILLER et

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al., 1983). O nome U. diversum, foi assim designado, pela primeira vez, devido à utilização de ureia como um substrato metabólico para a geração de adenosina trifosfato (ATP). Após o primeiro relato da bactéria como causa de distúrbios reprodutivos (TAYLOR-ROBINSON et al., 1967), vários artigos foram publicados em âmbito nacional (CARDOSO et al., 2006; BUZINHANI et al., 2011). Em 2000a, Cardoso e colaboradores fizeram o isolamento de U. diversum pela primeira vez no estado de São Paulo – Brasil, em fêmeas bovinas com histórico de desordens reprodutivas. Neste mesmo ano, Cardoso e colaboradores realizaram pela primeira vez, a técnica da Reação em cadeia da polimerase (PCR) em amostras de muco vaginal, obtidas através do esfregaço em mucosa vulvar. A partir de 2000, vários trabalhos utilizando a PCR foram publicados sobre U. diversum. Abaixo segue um quadro abrangendo os principais fatos históricos a partir desta data.

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Quadro 1. Principais eventos relacionados ao estudo de U. diversum em bovinos, a partir do ano 2000.

Ano Trabalho Autor 2000 Primeiro relato de detecção de U. diversum em CARDOSO et al., rebanhos bovinos com problemas reprodutivos no 2000a. estado de São Paulo 2000 Otimização da nested-PCR para detecção de U. CARDOSO et al., diversum 2000b 2005 Isolamento de U. diversum em muco vaginal de vacas OLIVEIRA FILHO et al., leiteiras repetidoras de estro no estado de Alagoas 2005 2012 Detecção de U. diversum a partir de swabs vaginais em CHOUSALKAR et al., bovinos na Austrália 2012. 2013 Detecção de Ureaplasma diversum na população ARGUE et al., 2013 bovina da Austrália 2013 Ureaplasma spp e Mollicutes como causa de DOS SANTOS et al., transtornos reprodutivos em bovinos de leite no Estado 2013 da Paraíba 2013 Desenvolvimento de qPCR na detecção de U. diversum MARQUES et al., 2013 em amostras de fluídos vaginais 2013 Ureaplasma diversum em sêmen bovino da Austrália HOBSON et al., 2013 2014 Ureaplasma diversum como causador de vulvovaginite GAETI et al., 2014 pustular em vacas de corte no Vale do Guapore, Mato Grosso, Brasil. 2014 Efeito apoptótico do Ureaplasma diversum infectando AMORIM et al., 2014 células do tipo HEp-2 2015 Sequenciamento genômico da cepa ATCC 49782 de MARQUES et al., 2015 Ureaplasma diversum.

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2.2. Biologia do agente

Para a biologia molecular, os Mycoplasmas são considerados os menores microrganismos replicantes. Dentre os Mycoplasmas, encontra-se a classe dos Mollicutes (do Latim: mollis= macio/mole; cútis= pele) que não apresentam a parede celular. Pertencem a esta classe o Ureaplasma, Entomoplasma, Mesoplasma, Spiroplasma, Acholeplasma, Asteroplasmase Anaeroplasma (RAZIN, 1995). Possuem formatos que variam entre espiral e uma pera, com um aspecto ramificado ou de filamento helicoidal. Na cultura desse agente, é possível observar a formação de cadeias de grânulos (RAZIN, 1995). Os Mollicutes têm comportamento de especificidade em relação ao hospedeiro, órgão e tecido alvo. Esse comportamento explica as suas características nutricionais e adaptativas. Em mamíferos, por exemplo, os Mollicutes, “habitam” superfícies de mucosas do sistema respiratório e urogenital, além de olhos, glândulas mamárias e articulações. Mas, nada impede a colonização em outros hospedeiros e órgãos (RAZIN, 1992). Apesar de sua simplicidade estrutural e funcional, a forma como Mycoplasmas e Ureaplasmas interage com seu hospedeiro não está totalmente elucidada. Estudos recentes demonstraram que a forma de parasitar a célula hospedeira é prioritariamente extracelular (YOU et al., 2006). A bactéria Ureaplasma diversum pertencente ao gênero Ureaplasma e a família Mycoplasmataceae (HOWARD; GOURLAY, 1982). Sendo considerada pleomórfica, ou seja, sua forma varia de acordo com a cepa, a idade da cultura e o método de exame. O U. diversum vive, in vitro, nas condições de microaerofilia, consome a ureia através da enzima uréase, liberando amônia no meio de cultivo e, consequentemente, aumentando o pH (Figura 1) (MARQUES et al., 2013).

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Figura 1: Cultura microbiológica do Ureaplasma diversum. A cor da colônia é resultado de uma reação bioquímica entre o sulfato de manganês, que em contato com a amônia, produz o pigmento cor de “ouro” (cortesia: Maristela V. Cardoso – Instituto biológico).

Embora apresentem fraca coloração pelo método de Gram são considerados microrganismos Gram-negativos, sem parede celular contínua e têm em torno de 330 nm de diâmetro; são imóveis. As condições ótimas para seu crescimento são: temperaturas ao redor de 37º C e pH de 6,0 a 6,5. Suas colônias geralmente são pequenas, entre 15 e 60 μm de diâmetro, de coloração marrom dourado quando em meios de cultura específicos acrescidos de indicadores, podendo muitas vezes não apresentar o aspecto de “ovo frito” característico de outros membros da classe dos Mollicutes (CARDOSO et al., 2000a).

Os Ureaplasmas, anteriormente denominados Mycoplasma T devido à morfologia da sua colônia, foram renomeados para Ureaplasma devido à sua habilidade única de catabolizar a ureia (SANDERSON et al., 2000).

É o mais recente microrganismo da família, sua evolução é decorrente do gênero Acholeplasma e Spiroplasma e sendo diferenciado do U. parvum e U. urealyticum que possuem duas copias do gene 16S, enquanto o U. diversum pode apresentar uma ou duas cópias deste gene. O genoma completo do U diversum é de aproximadamente 750 Kpb e apresenta um teor de G - C encontrado em isolados de bovinos varia em torno de 29,7-30,2 % (MARQUES et al., 2013).

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O U. diversum é a única espécie do gênero descrita em bovinos (HOWARD, 1984) e inclui três sorotipos (A, B e C) aos quais são atribuídos graus distintos de patogenicidade (HOWARD et al., 1973; RUHNKE et al., 1984). Os sorotipos são classificados em U. diversum A417 (sorotipo A), D48 (sorotipo B) e T44 (sorotipo C). sendo o sorotipo A considerado o mais patogênico (BUZINHANI, 2007).

O gênero Ureaplasma têm, reconhecidamente, sete espécies. O Ureaplasma urealyticum e o Ureaplasma parvum, foram isolados apenas em humanos. O Ureaplasma felinum e Ureaplasma cati, foram isolados em gatos; o Ureaplasma canigenitalium, isolado em cão, o Ureaplasma gallorale, isolado em pássaros e o Ureaplasma diversum, foi isolado em bovinos. No entanto, Burgher e colaboradores (2014) já conseguiram isolar o U. diversum em pulmões de suínos com distúrbios respiratórios.

2.3. Patogenia e fatores de risco

Os Mycoplasmas de uma forma geral possuem grande capacidade de fixação na superfície celular, sendo considerado fator de sobrevivência e patogenicidade. Devido a isso, a sua eliminação pelas secreções do sistema urogenital é difícil. Durante essa fixação e crescimento do agente, ocorre a produção e liberação de enzimas e metabólitos como o peróxido de hidrogênio e amônia, considerados danosos à célula (MESEGUER et al., 2003).

A falta de parece celular contribui para a melhor união entre o microrganismo e a célula do hospedeiro, criando um mecanismo para aumentar as concentrações de enzimas e metabólitos dentro destas células (AMARAL, 2003).

Diversas alterações patológicas foram relatadas em estudos experimentais e naturais em relação à infecção por U. diversum. Em fêmeas bovinas, endometrites, salpingites, vulvovaginite granular, infertilidade, morte embrionária e neonatal, e abortos (RUHNKE et al., 1978; CHELMONSKA-SOYTA et al., 1994) são as lesões frequentemente observadas.

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A vulvovaginite granular foi reproduzida através da deposição do agente em mucosa vulvar integra (DOIG, 1980) e na inoculação intrauterina (BALL e MACKIE, 1985). A doença pode ocorrer tanto na forma aguda quanto na forma crônica. Ela é caracterizada pela eliminação de exsudato vaginal mucopurulento, de forma intermitente e com duração de três a dez dias, bem como a presença de hiperemia na vulva e ocorrência de pequenos grânulos, medindo de 1 a 2 mm de diâmetro. Microscopicamente, observa-se agregação linfocitária abaixo do epitélio escamoso e leve infiltrado inflamatório composto por pequeno número de plasmócitos no epitélio escamoso (DOIG et al., 1980).

As vulvovaginites são observadas em novilhas e vacas. Leon e colaboradores (1995) revelaram que a infecção vaginal é observada frequentemente em animais mais jovens. Adicionalmente, por ação estrogênica, o microrganismo pode ser levado até o útero, através da abertura cervical, modificando assim o ambiente uterino e consecutivamente prejudicando o desenvolvimento inicial do embrião (METTIFOGO, 2000). Kreplin e colaboradores (1987) relataram que a fertilidade da fêmea bovina é comprometida pelo U. diversum. Adicionalmente, Sanderson e colaboradores (2000) observaram que vacas negativas para a presença de U. diversum tiveram maior facilidade de fertilização e manutenção da gestação quando comparadas há fêmeas positivas através da cultura. Distúrbios como o abortamento, o nascimento prematuro ou a morte de bezerros fracos recém-nascidos podem ocorrer após a infecção por este agente, devido à placentite caracterizada histologicamente pela fibrose difusa, infiltração acentuada de células mononucleares, focos de necrose, exsudato fibrinoso e mineralização do tecido; ou em consequência da pneumonia que acomete o feto, caracterizada pela alveolite difusa contendo necrose do epitélio alveolar e intensa infiltração de macrófagos, no terço final da gestação (METTIFOGO, 2000; MILLER et al., 1994).

Alguns surtos de infertilidade em rebanhos causados pela infecção por U. diversum podem ou não, estar associados a evidências clínicas de vulvovaginite. No entanto, quando a fase aguda da doença está em predomínio no rebanho, pode-se

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observar marcada redução da fertilidade (até 20%) com possível duração de até seis meses (CARDOSO et al., 2000a, METTIFOGO, 2000, OLIVEIRA FILHO, 2005).

O Ureaplasma diversum é um patógeno oportunista do sistema genital de bovinos que causa vulvovaginite granular, abortamento e infertilidade. Mortes embrionárias precoces contribuem para redução do desempenho reprodutivo em vacas, entretanto, alguns fatores relacionados à patogênese deste processo ainda permanecem obscuros (CARDOSO et al., 2000a; CHELMONSKA-SOYTA et al., 2001). Justamente porque, diagnósticos positivos também são obtidos de animais sem doença reprodutiva aparente. Isto sugere que o isolamento de U. diversum da vulva e vestíbulo pode ser normal. No entanto, se que a localização do agente for na cérvix e útero, pode significar uma condição patológica (SANDERSON et al., 2000; PETIT et al., 2008).

A presença do U. diversum na vulva representa uma fonte constante de infecção por esse microrganismo, que pode ser carreado até o útero durante o estro. Além disso, a presença deste agente por cerca de sete dias é suficiente para criar um ambiente uterino adverso para o desenvolvimento inicial do embrião (METTIFOGO, 2000).

Os abortos, em rebanhos infectados ocorrem de forma esporádica e podem acontecer em qualquer fase da gestação ou o bezerro pode nascer vivo, mas fraco (HOWARD et al., 1975).

Alguns trabalhos epidemiológicos e experimentais comprovam o papel do U. diversum como agente causador de doenças reprodutivas em bovinos (CARDOSO et al., 2000; DOIG et al., 1979). Mas em relação à síndrome reprodutiva associada a este agente Sanderson e colaboradores (2000) acreditam que esta seja multifatorial, pois o mesmo, por si só não é capaz de produzir uma doença, embora os fatores adicionais necessários para o estabelecimento desta síndrome ainda não sejam conhecidos.

Os fatores de risco relacionados a doenças infecciosas no sistema reprodutivo de bovinos envolve vários momentos, que podem ser considerados pontos críticos, como o manejo pré-parto inadequado, distúrbios endócrinos e nutricionais, condições sanitárias insuficientes, infecção pós-parto (ANDRADE et al.,

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2005), fatores ambientais de estresse, principalmente o estresse calórico (FERREIRA e FERNANDES, 2000). E pode ser incluído ainda, e não menos importante, a exposição de agentes infecciosos durante o período de estação de monta (GAMBARINI et al,. 2009).

Leon e colaboradores (1995) indicaram alguns fatores de risco associados à infecção por Ureaplasma diversum em fêmeas bovinas com aptidão leiteira. Neste trabalho foi possível observar que a idade e o número de partos estão relacionados a menor chance de infecção. Vacas jovens e com poucas parições possuem maior risco de infecção quando comparado a vacas mais velhas e com mais parições. Isso pode ser explicado pelo comportamento imunológico do animal frente a primo- infecção. O animal, ao entrar em contato com a bactéria pela primeira vez, através do coito ou da inseminação artificial, gera uma resposta imunológica que perdura até a quarta parição aproximadamente (DOIG et al., 1981).

Outra informação importante em relação à transmissão e os fatores de risco associado ao U. diversum, é o papel do macho e dos fômites. A transmissão venérea através de touros infectados é importante na disseminação da doença, além de fômites utilizados na inseminação artificial de bovinos (BRITTON et al., 1988; DOIG et al., 1981; KIRKBRIDE, 1987).

A inseminação artificial se mostra mais preocupante, por levar a uma grave diminuição de concepção no primeiro serviço da fêmea, bem como a infecção aguda mais severa e a infecção crônica levando a infertilidade. A infecção através da inseminação artificial pode estar relacionada ao sêmen contaminado inoculado diretamente no útero ou por infecção pré-existente na vagina, que é carreada para o útero pela pipeta de inseminação (DOIG et al., 1979).

O U. diversum é eliminado no ambiente pelas secreções orgânicas do animal, principalmente o sêmen, muco prepucial e vaginal, secreções da conjuntiva e o leite, mantendo a infecção no rebanho (BRITTON et al., 1988; KIRKRIDE, 1987).

2.4. Importância clínica e econômica

De acordo com Huffman et al. (1985) e Miller et al. (1994), os fatores mais importantes que desencadeiam perdas econômicas por Mycoplasma e Ureaplasmas

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em propriedades agropecuárias são a diminuição do número de gestações, ocorrência de perdas fetais ou partos prematuros com consequente diminuição do número de serviços por animal, perdas na qualidade do sêmen e aumento dos custos com veterinários e medicamentos para tratamento das infecções. Os problemas reprodutivos que acometem os animais de produção são responsáveis por grandes prejuízos econômicos, pois interfere diretamente na taxa de fertilidade dos rebanhos bovinos, reduzindo o número de animais nascidos ao ano, retardando a obtenção de nova gestação e impondo manejo diferenciado para as diversas categorias de animais (CARDOSO et al., 2000a).

Dados epidemiológicos indicam que o U. diversum pode ser isolado do sistema urogenital de bovinos em diferentes idades, mas, uma maior incidência foi observado em animais dentro da faixa etária reprodutiva (LÉON et al., 1995).

O U. diversum é frequentemente isolado em animais com histórico de problemas reprodutivos, principalmente o aborto e a vulvovaginite. Adicionalmente, Mulira e colaboradores (1992) observaram à presença de U. diversum em 27,1% das vacas com aptidão para o corte e 43,3% em vacas com aptidão leiteira indicando também que o isolamento deste agente foi duas vezes maior em vacas com lesão vulvar. No Brasil, Cardoso e colaboradores (2000b), observaram que 38,8% das vacas com vulvovaginite eram positivas para U. diversum, e foi possível associar a presença deste microrganismo com distúrbios reprodutivos no rebanho brasileiro.

Em bovinos machos, o U. diversum foi relatado como agente envolvido em casos de vesiculite seminal, balanopostite, epididimite (PILASZEK e TRUSZCYNSKI, 1988) e outras patologias por alterações morfológicas e funcionais nos espermatozóides (EAGLESOME et al., 1992; PANANGALA et al., 1981).

Um dos mecanismos de lesão promovido pelo Ureaplasma diversum é a colonização das membranas celulares (espermatozóides, zona pelúcida embrionária, célula endometrial), a qual interfere na espermatogênese, transporte espermático e capacidade de fecundação (EAGLESOME et al., 1992; KIRKBRIDE, 1987).

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2.5. Diagnóstico laboratorial

2.5.1. Cultivo

O cultivo microbiológico é considerado o “padrão-ouro” para o diagnóstico de U. diversum. No entanto, requer um transporte rápido das amostras ao laboratório, utilização de material especial para transporte e uma pessoa experiente para a identificação (CARDOSO, 2000b). A amostra coletada é semeada em meios de cultivo específicos, Ágar UB e Caldo UB adaptados a partir dos meios de cultura (RUHNKE; ROSENDAL, 1994). A caracterização morfológica do crescimento de Ureaplasma sp. apresenta morfologia colonial típica. A alteração da coloração dos caldos que de laranja passa a ter cor rosa, é devido à alcalinização do meio de cultura. São consideradas negativas as culturas onde não são observadas a alteração do pH do caldo e/ou não são evidenciadas colônias características em ágar (CARDOSO, 2004). São várias as dificuldades encontradas para o cultivo do U. diversum, desde a coleta do material clínico na propriedade, onde frequentemente, ocorre a contaminação por bactérias oportunistas comuns do sistema reprodutivo, o tempo decorrido entre a coleta do material e a sua chegada ao laboratório, que também alteram a viabilidade do microrganismo, podendo alterar o cultivo em meios artificiais tornando os resultados dos exames incertos. Essa soma de fatores acabam corroborando para a implementação de técnicas mais sensíveis e específicas e ao mesmo tempo mais rápidas e econômicas como as técnicas moleculares (CARDOSO et al., 2006).

2.5.2. Reação em cadeia da polimerase (PCR)

CARDOSO et al. (1998), empregaram a técnica de PCR pela primeira vez no Brasil, com primers obtidos na região 16S rRNA, para a pesquisa de U. diversum em muco vaginal bovino. Marques e colaboradores (2013) desenvolveram a técnica de PCR quantitativo (qPCR) para a detecção e quantificação de U. diversum em esfregaços genitais de bovinos. Os iniciadores e sondas específicas para gene U. diversum rRNA 16S foram 100 vezes mais sensíveis do que o PCR convencional obtendo 46,42% de amostras positivas. 24

A principal vantagem da PCR é a possibilidade do diagnóstico ser realizado em pequenas quantidades de ácido desoxirribonucleico (DNA) (CARDOSO, 2000b). Combinando-se o primer MGSO selecionado a partir da região 16Sr RNA com o oligonucleotídeo procariótico GPO-1, amplifica-se um fragmento de 715 pares de bases, o qual está presente em todos os organismos da classe Mollicutes (VAN KUPPEVELD et al., 1992; CARDOSO, 2000b). Com esta técnica não há necessidade de microrganismos viáveis, o que agiliza o diagnóstico e possibilita a implementação rápida de estratégias de controle da doença (CARDOSO et al., 2003).

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. População estudada

O estudo foi de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Ética no Uso de Animais de Pesquisa (CEPA-UFMT: PO 23108.015256 / 14-5). Este estudo foi realizado em 22 propriedades leiteiras localizadas na região norte (13°01 '59,341 "S e 55 ° 56' 38,571" W) de Mato Grosso, Brasil, entre os meses de Dezembro de 2014 e Maio de 2015. A umidade relativa anual e temperatura da região são de 60% e 250C, respectivamente (IBGE, 2013). O volume de produção de leite foi de 1,8 mil litros em 2013, respondendo a 6,84% (1.800 / 684,694 litros) de todo o leite produzido no Estado de Mato Grosso (IBGE, 2013). Os animais (Figura 3) pertenciam aos seguintes municípios: Sorriso, Lucas do Rio Verde, Nova Mutum, Tapuráh, Itanhangá e Vera. Os animais foram selecionados seguindo como critérios: (1) serem fêmeas bovinas com idade acima de 24 meses e (2) pertencerem a proprietários que fornecem leite para o laticínio Lovara (Figura 3). Durante a escolha da propriedade não havia informações sobre histórico sanitário e reprodutivo das propriedades.

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A B Figura 2 A e B: Rebanhos de bovinos de leite visitados durante o estudo.

3.2. Delineamento amostral e coleta de amostras

As mucosas vulvares (n= 203) de fêmeas bovinas pertencentes a 22 rebanhos de fazendas localizadas na região norte de Mato Grosso, Brasil foram analisadas. Em cada rebanho foram avaliadas a presença (Figura 4) ou ausência de grânulos vulvovaginais.

Figura 3: Fêmea bovina. Mucosa vaginal. Vulvovaginite granular grau 1.

As amostras de muco vaginal foram coletadas por meio da introdução seguida da aplicação de atrito da parede lateral do vestíbulo da vagina por um suabe estéril de algodão (CARDOSO et al., 2000a). As amostras foram colocadas em tubos contendo 2 mL de meio de transporte A3XB (CUNHA et al., 1987) e mantidas refrigeradas a 4°C até a análise em laboratório. Reações em cadeia da polimerase (PCRs) foram utilizados para determinar a presença de U. diversum nas amostras de muco vulvovaginal. As amostras foram selecionadas em dois estágios: propriedades rurais e vacas de leite. Para calcular o número de amostras necessárias, foi considerada a expressão algébrica usada para estimativa da proporção:

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Np(1 p ) n0  2 deff d (N 1)  p (1  p ) z /2 Onde N = é o tamanho da população, p = é a proporção a ser estimada, d = é a margem de erro ou erro máximo da estimativa, Z 1,96 é um valor tabulado da 2 distribuição normal e deff = sendo o efeito do desenho. O número de amostras de muco vaginal foi determinado usando o método descrito por Thrusfield (1995), com intervalo de confiança de 95% e margem de erro de 10%, e prevalência de 50% para Ureaplasma diversum em vacas de leite (DOS SANTOS et al., 2013), com base no valor total de 2.256 animais. O número de vacas de leite amostradas por propriedade (n=10) foi realizada utilizando a seguinte fórmula:

Os valores de prevalência foram calculados separadamente para os animais e fazendas (rebanhos). Como foram avaliadas fazendas contendo diferentes tamanhos de rebanho, a estimativa de prevalência de animais aparente foi ajustada com base no tamanho do rebanho de cada fazenda analisada de acordo com a Fórmula:

Onde, TFP é total de fêmeas ≥24 meses na fazenda, TEFAP é o total de fêmeas ≥24 meses amostradas na fazenda, TFR é o total das fêmeas ≥24 meses na região e TFAR é o total de fêmeas ≥24 meses de amostragem na região. A análise estatística foi realizada através do software R Core Team (2015). Foi realizada tabulação cruzada e estatística descritiva. As variáveis independentes (lesão vulvar, dispositivo de progesterona, raça, idade, número de prenhez e histórico de problemas reprodutivos) foram examinadas para a associação univariada com presença de um animal positivo no rebanho para U. diversum por PCR usando χ2 de teste e t-teste. As variáveis foram primeiramente rastreadas com base na variável resposta (presença de pelo menos um animal positivo no rebanho). As demais variáveis 27

foram inseridas individualmente em um modelo de regressão logística univariável e selecionadas para inclusão no modelo logístico múltiplo, se p <0,25, sendo considerada uma alta correlação. Posteriormente, todas as variáveis selecionadas foram submetidas ao método step wise para o modelo final, em que apenas as variáveis com p <0,05 foram mantidas.

3.3. Inquérito epidemiológico

O inquérito epidemiológico foi elaborado para obter informações referentes ao proprietário, à propriedade, o rebanho e o animal selecionado para colheita de material (anexo 1).

3.4. Extração de DNA e PCR

Para a extração de DNA de U. diversum, 1 ml do meio de transporte do suabe foi centrifugado a 12.000 g por 5 minutos. Em seguida, o produto obtido após esta centrifugação foi ressuspendido em 500 µl de tampão de Lise (0.5 mM EDTA; 1mM Tris-HCL, ph 8.0; 10% SDS, 200 µg/ml Proteinase K). O DNA foi extraído através da técnica de fenol e fenol-clorofórmio, e os ácidos nucléicos precipitaram na fase aquosa pela adição de acetato de sódio (3M) em dois volumes de etanol a 95%. Após a centrifugação a 14.0000 g por 15 minutos, o conteúdo foi lavado uma única vez em etanol 70%, e solubilizado em 50 µl de tampão TE (SAMBROOK e RUSSEL, 2001). U. diversum foi amplificado pela PCR usando os primers previamente publicados UD1 forward 5’-CCG GAT AAT AAC ATT TAC TT-3´ e UD2 reverse 5’- TCG ATA CTG CTA CCG CAA GG-3’(CARDOSO et al., 2000b). O mix da reação de

PCR continha 0.8 µM de cada primer (UD1 e UD2),5 µl MgCl2, 1.5 µl dNTP (10 mM), 0.2 µl de Taq DNA polymerase e 14.5 µl de água livre de nuclease. Sendo 2 µl de DNA adicionado a reação para a obtenção de um volume final de 25 µl por microtubo. Esta reação foi incubada a 940C por 5 minutos e logo em seguida a incubação se repetiu por 35 ciclos de amplificação nas seguintes temperaturas: 940C por 1 minuto, 520C por um minuto e 720C por um minuto, com uma extensão final de 10 minutos a 720C (CARDOSO et al., 2000b).

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Os produtos das amplificações foram analisados em gel de agarose a 1.0%, contendo 10μg/ml de brometo de etídio em tampão TAE (40 mM Tris-acetato, 2mM EDTA, pH 8.0). O produto da PCR foi visualizado em fotodocumentador sob luz ultravioleta.

As amostras consideradas positivas foram purificadas através do Kit de purificação GFX ™ PCR DNA e as sequencias foram obtidas através do sequenciador automático ABI 3500 Genetics analyzers (Applied Biossystems). As sequencias foram comparadas a sequencia depositada no GenBank com o uso do programa BLAST.

4. RESULTADOS

Das 203 vacas de leite testadas, U. diversum, foi detectado em 20 (9,8%) dos animais pela PCR. Desses animais, 5/20 (25%) apresentavam lesões de vulvovaginite, caracterizadas por uma suave hiperemia e grânulos de coloração vermelho-claro na região ventral da mucosa vulvovaginal. Em 31 fêmeas com lesões vulvares, 26 (83.8%) foram consideradas negativas para U. diversum na PCR (Tabela 1). Adicionalmente, o U. diversum foi detectado em 15/172 (8.7%) sem lesões aparente de vulvovaginite.

Tabela 1. Resultado da PCR para U. diversum, contemplando o número de vacas de leite que apresentaram ou não a lesão de vulvovaginite granular. PCR U. diversum Lesão vaginal Total Sim Não Positivo 5 15 20 Negativo 26 157 183 Total 31 172 203

A presença do U. diversum foi confirmada em 13 dos 22 rebanhos visitados (tabela 2). O Rebanho da propriedade 19, localizado no município de Vera, obteve o maior presença do agente, com 30% das amostras das fêmeas bovinas positivas para U. diversum (Tabela 3). A diferença entre a presença de U. diversum em cada município pode ser observada na tabela 4. 29

Tabela 2. Presença de U. diversum nos rebanhos bovinos localizados no médio norte do estado de Mato Grosso, Brasil. Rebanho Número de animais PCR – positive 1 10 0 2 10 1 3 5 0 4 10 1 5 10 1 6 10 1 7 10 1 8 10 1 9 8 0 10 10 0 11 10 2 12 10 2 13 10 1 14 10 0 15 10 1 16 2 0 17 10 2 18 10 2 19 10 3 20 10 0 21 10 0 22 8 0 Total 203 20

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Tabela 3. Número de PCR positivas para U. diversum agrupadas nos 6 municípios localizados no médio norte do estado Mato Grosso, Brasil. Municípios Proporção de rebanhos Proporção de fêmeas positivas positivos por município através PCR nos municípios através da PCR (%) (%) Sorriso 1/2 (50%) 1/20 (5%) Lucas do Rio Verde 2/3 (66.6%) 2/25 (8%) Nova Mutum 3/5 (60%) 4/48 (8.3%) Tapuráh 2/2 (100%) 4/20 (20%) Itanhangá 3/5 (60%) 4/42 (9.5%) Vera 2/5 (40%) 5/48 (10.4%) Total 13/22 20/203

Um total de 13 variáveis foram utilizadas na análise de multivariável. O modelo multivariável final usou dados dos 203 animais provenientes dos 22 rebanhos pertencentes às 22 propriedades. No final, apenas três variáveis foram significativamente associadas com o U. diversum sendo: número de partos (p=0.001), lesões vulvares (p=0.0268), e problemas reprodutivos (p=0.0491) (Tabela 4).

Tabela 4. Resultado da regressão logística das variáveis para os fatores de riscos associados ao resultado positivo para U. diversum através da PCR nos 22 rebanhos de bovinos de leite localizados no médio norte do estado Mato Grosso, Brasil. Variáveis significativas Estimativa O.R. Valor-P O.R., 95% IC Maior número de partos -3,4589 0,0315 0,0001 0,0089-0,1108 Lesão vulvar 2,8717 17,6672 0,0268 1,7119-182,3323 Problema reprodutivo 2,0371 7,6682 0,0491 1,1564-50,8498

Nos animais estudados foi observado que em cada novo parto as chances de infecção por U. diversum diminuíram 0,03 vezes, indicando que vacas com um maior número de partos estão mais protegidas. A presença de lesão vulvar aumentou em 17,6 vezes a chance da fêmea ser positiva para U. diversum em relação aos

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problemas reprodutivos, o risco de infecção aumentou para 7,6 vezes quando o animal é positivo. Em relação à prevalência estimada do U. diversum em rebanhos do município do médio norte de Mato Grosso, o valor obtido foi de 8,13% com intervalo de 95% confiança de [2,81;13,44].

5. DISCUSSÃO

Na análise das 203 amostras de muco vulvovaginal para a U. diversum, através da PCR (9,8%), observamos resultados similares ao que foi reportado previamente por Argue e colaboradores (2013). A baixa detecção de U. diversum neste estudo, pode estar associado ao fato, de que apenas 25% das fêmeas avaliadas apresentavam lesões na vulva, sugerindo que a vulvovaginite está intimamente relacionada ao U. diversum (CARDOSO et al., 2000a; GAETI et al., 2014). Estudos experimentais demostraram falhas na tentativa de correlacionar a infecção por U. diversum e a doença genital nos bovinos (DOIG, 1979; SANDERSON et al., 2000). No presente estudo, 8,7 % dos animais sem sinal de vulvovaginite foram positivos para o U. diversum pela técnica da PCR. Embora a vulva seja considerada o local predileção da bactéria para o desenvolvimento de lesões granulares, cuidados devem ser tomados em relação à interpretação de resultados positivos pela PCR de animais sem vulvovaginite (CARDOSO et al., 2000b) devido a possibilidade do U. diversum agir como um organismo patogênico ou como organismo comensal da genitália externa de bovinos (MARQUES et al., 2015). Em nosso estudo, é possível que esses animais estivessem infectados por cepas não patogênicas de U. diversum, indicando uma colonização comensal e não uma infecção da vulva ou do vestíbulo. Adicionalmente, estudos semelhantes, onde ocorreu a inoculação de cepas de U. diversum na glândula mamária de ovelhas e de vacas, foi possível demonstrar que há variação de virulência entre as diferentes cepas, o que justifica a presença do agente em animais sadios (MARQUES et al., 2011). Além disso, no presente estudo, não foi possível identificar a cepa de U. diversum. O obstáculo mais significativo que impossibilitou essa

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caracterização das cepas foi o transporte dos organismos ainda vivos para o laboratório, devido à longa distância das propriedades rurais, que prejudicou a viabilidade do U. diversum para cultura microbiológica, mesmo com as amostras transportadas em meio específico para mycoplasmas. Em contraste, 83.8% (26/31) dos animais com lesões foram negativos para U. diversum pela PCR. Outros agentes como o Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium e o vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR) são agentes causadores de doenças genitais, como a vulvovaginite granular e são indistinguíveis macroscopicamente das lesões promovidas pelo U. diversum (PETIT et al., 2008), devendo ser considerados com diagnóstico diferencial. Estudos futuros precisam ser realizados para determinar se ambos possuem afinidade para ocasionar as lesões vulvares quando comparados ao U. diversum. Em nosso estudo foi possível observar que 59% dos rebanhos estudados apresentaram pelo menos um animal positivo para U. diversum através da PCR, sugerindo que este agente está presente entre a população de gado leiteiro do norte do estado de Mato Grosso, Brasil. As lesões de vulvovaginite encontradas nos animais foram em graus leves, havendo associação com a presença de Ureaplasma diversum de acordo com trabalhos prévios (CARDOSO et al., 1997; GAETI et al., 2014). Além disso, a leve lesão granular observada sugere que alguns sorotipos do U. diversum variam em relação a capacidade de produzir vulvovaginite granular (RUHNKE et al., 1984). Embora o número total de vacas com vulvovaginite tenha sido baixo, estas foram mais propensas a abrigar o U. diversum na vulva quando comparada as fêmeas que não apresentavam vulvovaginite (p=0.0268). O U. diversum foi encontrado com maior frequência em fêmeas com menor número de crias, sugerindo que animais mais jovens levam um tempo maior para eliminar o agente. León e colaboradores (1995) observaram que fêmeas mais jovens e com um número baixo de partos eram mais susceptíveis a presença de U. diversum. Em nosso estudo, a PCR positiva e a idade do animal não tiveram correlação estatística, indicando que a idade não interfere na infecção nas fazendas visitadas. Alguns estudos indicam que o Ureaplasma diversum está associado a doenças reprodutivas, caracterizadas por infertilidade, aborto ou nascimento de bezerros fracos (KREPLIN et al., 1987; BUZINHANI et al., 2007). Em nosso estudo, 33

a presença de U. diversum foi relacionado a desordens reprodutivas (p=0.0491). Além disso, o mecanismo de patogenicidade exercido pelo organismo é praticamente desconhecido (KIM et al., 1994; AMORIN et al., 2014). Marques e colaboradores (2015) descreveram uma nova sequencia do genoma da cepa de U. diversum ATCC49782, que representa um novo recurso para o entendimento de especificidade de hospedeiro e patogenicidade em bovinos. Em suma, estes dados indicam que as vacas leiteiras da região norte do estado do Mato Grosso são suscetíveis à infecção por U. diversum (8,%) sendo associada a vulvovaginite granular. Embora a presença de U. diversum foi confirmada como causa de lesão vulvar os efeitos de outras bactérias da família Mycoplasma ainda está para ser determinada e novos estudos devem ser feitos para saber da ação sinérgica entre as bactérias do gênero Mollicutes neste estado.

6. CONCLUSÃO

Como conclusão, esses dados indicam que vacas de leite oriundas da região médio norte de Mato Grosso estão susceptíveis a infecção por U. diversum. Este agente foi confirmado como causador de lesões caracterizadas como vulvovaginite granular e ainda com problemas reprodutivos relatados pelos proprietários desses animais. A prevalência observada de infecção por U. diversum na população estudada foi de 8,13%.

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ANEXOS

1. Inquérito epidemiológico aplicado em cada uma das 22 propriedades rurais visitadas.

Informações da propriedade 1) Nome da propriedade: 2) Endereço: 3) Município: 4) Características raciais: ( ) pura ( ) cruzada, raça: 5) Tamanho do rebanho: 6) Número de fêmeas em lactação: 7) Tamanho da propriedade: Informações proprietário 8) Quem responde o questionário? ( ) proprietário ( ) outro: 9) Nome do proprietário: Informações zootécnicas 10) Finalidades da exploração: ( ) venda de produto/animais ( ) cria/recria/engorda ( ) subsistência/consumo próprio 11) Produção diária de leite 12) Produção mensal de leite: 13) Numero de vaca em lactação: Produção de leite 14) Tipos de sistema de produção: extensivo com ordenha mecânica ( ) extensivo com ordenha manual 15) Número de ordenhas: 16) Frequência de higiene da área de ordenha: ( ) 1 vez/dia ( ) 2 vezes/dia ( ) 3 vezes/dia ( )nenhuma Informações sobre a propriedade: 17) Quantidade de fêmeas com idade entre: 0-12 meses (____) 12-24 meses (____) 24-36 meses (____) 36-48 meses (____) mais de 48 meses (____) 18) Quantidade de machos com idade entre: 0-12 meses (____) 12-24 meses (____) 24-36 meses (____) 36-48 meses (____) mais de 48 meses (____) 19) Características físicas das fêmeas (escore de condição corporal)-média do rebanho ( )

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1( ) 2 ( ) 3 ( ) 4 ( ) 5. Informações reprodução 20) Orientação médica veterinária: ( )sim ( ) não. Se sim, de que forma: Utilização de I.A.: ( )sim ( )não. Se sim, ( )repasse com touro ( )somente I.A 21) Outras biotécnicas da reprodução: ( )IATF ( )TE ( )outras: 22) Origem do sêmen: ( ) central ( ) da propriedade ( ) outros: 23) Utilização de implante intravaginal de progesterona: ( )sim ( )não. Se sim, qual: Informações sanitárias: 24) Histórico de problemas reprodutivos: ( ) sim ( ) não. Se sim, qual: ( )aborto ( ) retorno ao cio ( ) atraso período gestacional ( ) retenção de placenta ( ) natimortalidade( ) reabsorção fetal( )outros: 25) Histórico de doenças infecciosas: ( ) sim ( ) não. Se sim: ( ) Brucelose ( ) Leptospirose ( ) IBR ( ) BVDV ( ) Neospora( ) outras: 26) Exames sorológicos de rotina: ( ) sim ( ) não. Vacinação: ( ) brucelose ( ) raiva ( ) aftosa ( ) IBR ( ) clostridiose ( ) leptospirose( ) outras: Ficha individual de identificação do animal 27) Faixa etária: ( ) 24-36 meses ( ) 36-48 meses ( ) mais de 48 meses 28) Raça: 29) Numero de prenhes: ( ) 1 ( ) 2 ( ) 3 ( ) 4 ( ) 5 ( )outros: 30) Gestante no momento da visita: ( ) sim ( ) não 31) N° de abortos: ( ) 0 ( ) 1 ( ) 2 ( ) 3 ( ) 4 ( ) 5 ( )outros: 32) Idade ao primeiro parto: 33) Intervalo entre partos: 34) Escore de condição corporal: ( ) 1 ( ) 2 ( ) 3 ( ) 4 ( ) 5. 35) Presença de corrimento vaginal no momento da avaliação: ( ) sim ( ) não 36) Presença de alteração na mucosa vaginal e vulvar no momento da avaliação: ( ) granulação ( ) hiperemia ( ) edema. Em que grau: 37) Histórico de problema reprodutivo: ( ) sim ( ) Não. Se sim, qual: ( ) corrimento vaginal ( ) aborto ( )retenção de placenta ( ) bezerros fracos ( ) aumento intervalo entre partos( ) outros 38) Participou de alguma biotécnica da reprodução: ( ) sim ( ) não. Se sim, qual e repasse com touro: ( ) sim ( ) não 39) Produção diária de leite:

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2. Comprovante de submissão do artigo na revista Tropical Animal Heath And

Production

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3. Artigo submetido à revista Tropical Animal Health Na Production.

Presence of Ureaplasma diversum in the genital tracts of female dairy cattle in Mato Grosso State, Brazil.

Jaqueline B. Azevedo1, Gustavo S. Silva2, Priscylla S. Rocha1, Letícia C. Pitchenin3, Valéria Dutra3, Luciano Nakazato4, Anderson Castro Soares de Oliveira5, Caroline A. Pescador1*

1Laboratory of Veterinary Pathology, Federal University of Mato Grosso (UFMT), Av. Fernando Corrêa da Costa 2367, CEP 78069-900, Cuiabá, Mato Grosso, Brazil. 2Epidemiology Laboratory, Federal University of Rio Grande do Sul (UFRGS), Av. Bento Gonçalves 9090. Bairro Agronomia, CEP 51900-000, Porto Alegre, Brazil. 3Microbiology Laboratory, Federal University of Mato Grosso (UFMT), Av. Fernando Corrêa da Costa, 2367. Boa Esperança, CEP 78069-900, Cuiabá, Mato Grosso, Brazil. 4Laboratory of Veterinary Molecular Biology, Federal University of Mato Grosso (UFMT), Av. Fernando Corrêa da Costa, 2367.Boa Esperança, CEP 78069-900, Cuiabá, Mato Grosso, Brazil. 5Department of Statistic, Federal University of Mato Grosso (UFMT), Av. Fernando Corrêa da Costa, 2367. Boa Esperança, CEP 78069-900, Cuiabá, Mato Grosso, Brazil.

*Corresponding author: Caroline Argenta Pescador. Tel.556536158624. E-mail address: [email protected]

Abstract Ureaplasma diversum infection in bovine females may result in various reproductive problems, including granular vulvovaginitis, abortion, weak calves, salpingitis and spontaneous abortion. The presence of U. diversum in a dairy bovine population from midwestern Brazil has not been established. The aims of this study were to determine whether U. diversum was present in dairy cattle from midwestern Brazil using polymerase chain reaction (PCR). Vulvovaginal mucus was analyzed from 203 animals located in six municipalities in the north region of Mato Grosso State, Brazil. A total of 25% of dairy cows with vulvovaginitis were positive for U. diversum. The factors evaluated were included in a multivariable logistic regression model with the presence of at least one positive animal in the herd serving as the dependent variable. Three variables were significantly associated with a U. diversum positive PCR and were included in the final multivariable model: number of deliveries, vulvar lesions and reproductive problems. For each new delivery, the chance of U.

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diversum infection decreased 0.03-fold, indicating that cows with the highest number of deliveries were more protected. The presence of vulvar lesions was increased 17.6-fold in females positive for U. diversum, suggesting that this bacteria could be related to the red granulate lesions in the vulvar mucosa, whereas reproductive problems were increased 7.6-fold. However, further investigations should be conducted to ascertain the effects of U. diversum in association with other mycoplasma species in the herds studied.

Keywords: cow; milk; PCR; associated factors; vulvovaginitis.

Introduction The species Ureaplasma diversum is a well-known bovine pathogen that is considered a normal microfloral inhabitant but has also been associated with different clinical manifestations in the female reproductive tract (Sanderson et al. 2000, pp. 401--408), including granular vulvitis, endometritis, salpingitis, abortion, infertility and embryo loss. This organism is a bovine origin mollicute in the Mycoplasmataceae family that can be transferred between animals during the breeding season via natural mating, artificial insemination and embryo transfer (Cardoso et al. 2000, pp. 137--143; Stringfellow et al. 2000, pp. 629--642). A progesterone device (P4) could also be a potential means of dissemination of the organism (Gaeti et al. 2014, pp. 59--63). The infection occurs in both acute and chronic forms, resulting in lesions characterized by granulates in the vulvar and vaginal epithelia, hyperemia and purulent vaginal discharge 1-5 days after contact with the bacteria (Miller et al. 1983, pp. 367--374). Epidemiological data have indicated that U. diversum can be isolated from urogenital tracts of bovines at different ages, but the highest prevalence is found during the active reproductive stage (León et al. 1995, pp. 21--25). U. diversum has been reported in various countries, including New Zealand, Canada and the United States of America (Sprecher et al. 1999, pp. 1197--1206). In Brazil, the frequency of U. diversum in tested animals with lesions ranges from 23 to 65% (Cardoso et al. 2000, pp. 137--143; Gaeti et al. 2014, pp. 59--63; Dos Santos et al. 2013, pp. 315-- 318), suggesting that this microorganism may be related to granular vulvovaginitis. Studies have used polymerase chain reaction (PCR) and quantitative TaqMan PCR 39

for the detection of U. diversum (Hobson et al. 2013, pp. 469--473; Marques et al. 2013, pp. 670--674). Moreover, U. diversum genome sequences were recently reported (Marques et al. 2015, pp. 314--315) and might contribute to the understanding of host specificity and pathogenicity in cattle. Infection occasioned by U. diversum in Brazil is usually more frequent in dairy cows. In Mato Grosso state, dairy cattle production has thrived due to support by research and technology. However, there is room for improvement in milk production through good sanitary management. Nevertheless, little is known about the prevalence of U. diversum in the dairy cattle population in the midwestern region of Brazil. The aims of this study were to verify the presence of U. diversum in a dairy population located in the middle north region of Mato Grosso state and to search for plausible factors associated with U. diversum-positive herds. Materials and methods Study area The study design was in accordance with a protocol approved by the Institutional Committee for Ethics in the Use of Research Animals (CEPA-UFMT: PO 23108.015256/14-5). This study was conducted in 22 dairy farms located in the northern region (13° 01' 59.341" S and 55° 56' 38.571" W) of Mato Grosso State, Brazil, between December 2014 and May 2015. The annual relative humidity and mean temperature of the region are 60% and 25°C, respectively (IBGE, 2013). The volume of milk production was approximately 1.8 thousand liters in 2013, which accounted for 6.84% (1.800/684.694) of all milk produced in the State of Mato Grosso (IBGE, 2013). The animals belonged to the following municipalities: Sorriso, Lucas do Rio Verde, Nova Mutum, Tapuráh, Itanhangá and Vera. Sample size and sample collection Vulvovaginal mucus (n=203) was analyzed from 22 herds from farms located in the north region of Mato Grosso State, Brazil. In each herd, the presence or absence of vulvovaginal pustules were evaluated. The vaginal mucus samples were collected via the introduction of a sterile cottons swab into the vestibule of the vagina followed by the application of friction to the lateral wall (Cardoso et al. 2000, pp. 241-- 250). Then, the samples were placed in tubes containing 2 ml of A3XB transport 40

medium (Cunha et al. 1987, pp. 170--177) and kept refrigerated at 4°C prior to laboratory analysis. Polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the presence of U. diversum in the vulvovaginal mucus samples. The samples were analyzed in two stages: farms and animals (dairy cows). To calculate the sample size, we considered an algebraic expression used in the estimation of proportions: Np(1 p ) n0  2 deff d (N 1)  p (1  p ) z /2 where N is the size of the population, p is the proportion being estimated, d is the margin of error or maximum error of the estimate, Z 1,96 , which is a tabulated 2 value of the normal distribution, and deff is the design effect. The vulvovaginal sample size was determined using the method described by Thrusfield (2013) with a 95% confidence level, 10% margin of error, an average referential prevalence of U. diversum in dairy cattle of 50% (Dos Santos et al. 2013, pp. 315--318) and a total of 2.256 dairy cows. Next, we determined that 10 dairy cows should be sampled on each farm using the following formula:

Statistical analysis Prevalence values were calculated separately for animals and farms (herds). Because farms with different herd sizes were evaluated, the apparent animal prevalence estimate was adjusted based on the herd size of each analyzed farm according to the formula

where TFP is the total number of females ≥24 months of age on the farm, TTFAP is the total number of females ≥24 months of age sampled on the farm, TFR is the total number of females ≥24 months of age in the region and TFAR is the total number of females ≥24 months of age sampled in the region. 41

The statistical analysis was performed using the R software (R Core Team, 2014). Cross tabulation and descriptive statistics were calculated. Independent variables (vulvar lesion, progesterone device, breed, age, number of pregnancies and history of reproductive problems) were examined for univariate association with the presence of a PCR-positive animal in the herd using the χ2 test and t-test. Variables were screened based on the response variable (presence of at least one positive animal in the herd). The remaining variables were entered individually into a univariable logistic regression model and selected for inclusion in the multiple logistic model if p<0.25 was considered a high correlation. Subsequently, all screened variables were submitted to the stepwise method for the final model in which only variables with p<0.05 were retained. DNA extraction and PCR For U. diversum DNA extraction, 1 ml of swab transport medium was centrifuged at 12.000 x g for five minutes. Then, the pellets were resuspended in 500 µl of lysis buffer (0.5 mM EDTA, 1 mM Tris-HCL, pH 8.0, 10% SDS, and 200 µg/ml Proteinase K). DNA was extracted using phenol and phenol-chloroform, and the nucleic acids were precipitated from the aqueous phase via the addition of sodium acetate (3 M) and two volumes of 95% ethanol. After centrifugation at 14.0000 x g, the pellets were washed once with 70% ethanol and solubilized in 50 µl of TE buffer (Hobson et al. 2013, pp. 469--473). U. diversum was amplified by PCR using the following previously published primers: UD1 forward 5’-CCG GAT AAT AAC ATT TAC TT-3´ and UD2 reverse 5’-TCG ATA CTG CTA CCG CAA GG-3’ (Gambarini et al. 2009, pp. 1421--1426). The assay was performed with a reaction mixture containing 0.8 µM of each primer (UD1 and UD2), 5 µl of MgCl2, 1.5 µl of dNTPs (10 mM), 0.2 µl of Taq DNA polymerase, and 14.5 µl of nuclease-free water. Two microliters of DNA was added to the reaction mixture for a final volume of 25 µl per tube. The reaction mixtures were incubated at 94°C for five minutes prior to 35 amplification cycles of 94°C for one min, 52°C for one min, and 72°C for one min and a final extension step at 72°C for ten min (Gambarini et al. 2009, pp. 1421--1426). The amplified products were analyzed on a 1.0% agarose gel containing 10 μg/ml ethidium bromide in TAE buffer (40 mM Tris-acetate and 2 mM EDTA, pH 8.0). The products were visualized and photo documented under ultraviolet light.

42

U. diversum positive samples were purified with the GFX™ PCR DNA purification kit and sequenced in the ABI 3500 Genetics analyzer automatic sequencer (Applied Biosystems, Life Technologies Corporation, Foster City. California, USA). The sequences were compared with the sequence found in GenBank by the BLAST program. Results Of the 203 dairy cows investigated, U. diversum was detected in 20 (9.8%) animals by PCR. Of these, 5/20 (25%) had vulvovaginal lesions characterized by mild hyperemia and lightly red granular vulvitis in the ventral area of the vulvar mucosa. Of the 31 dairy cows that had vulvar lesions, 26 (83.8%) were PCR negative for U. diversum (Table 1). Additionally, U. diversum was detected in 15/172 (8.7%) animals with no apparent lesions. The presence of U. diversum was confirmed in 13 of the 22 sampled herds (Table 2). Herd 19 from Vera municipality had the highest isolation rate, with 30% of the dairy cows sampled positive for U. diversum (Table 2). The different incidence of positive animals from each municipality is shown in Table 3. The Tapuráh municipality had the highest number of positive farms (Table 3). A total of 13 variables were included in the multivariable analysis. The final multivariable model used data from 203 cattle from 22 herds with no missing observations. In the final multivariable model, three variables were significantly associated with U. diversum: number of deliveries (p=0.001), vulvar lesions (p=0.0268), and reproductive problems (p=0.0491) (Table 4). Every new delivery decreased the chances of U. diversum infection 0.03-fold in the animals studied, indicating that the cows with the highest number of deliveries were more protected. The presence of vulvar lesions was 17.6-fold higher in females positive for U. diversum and 7.6-fold higher in cows with reproductive problem. Discussion The detection of U. diversum in the 203 vulvovaginal mucus samples analyzed by PCR (9.8%) was similar to the results previously reported by Argue and contributors (2013, pp. 99--101). The low detection of U. diversum by PCR in this study could have occurred because only 25% of the females had vulvar lesions, suggesting that vulvovaginitis was closely related to U. diversum (Cardoso et al. 2000, pp. 59--63; Gaeti et al. 2014, pp. 137--143). 43

A number of previous field studies have failed to show a correlation between Ureaplasma infection and bovine genital disease (Doig, 1979, pp. 89--94; Sanderson et al. 2000, pp. 401-408). In the present study, 8.7% of animals without any symptoms of vulvovaginitis were positive by PCR. Although the vulva is the preferred site for the development of granular lesions, care should be taken in interpreting positive PCR results from vulvar swabs of animals without vulvovaginitis (Cardoso et al. 2000, pp. 241--250) because U. diversum can act as either a pathogenic or commensal organism (Marques et al. 2015, pp. 314--315). In our study, these animals may have been infected with a non-pathogenic strain of U. diversum, indicating a commensalistic colonization and not an infection of the vulva and vestibulum. Moreover, similar studies with U. diversum strains inoculated in the mammary glands of sheep and cattle have indicated variable virulence in different strains, justifying the presence of ureaplasmas in healthy animals (Marques et al. 2011, pp. 205--211). Furthermore, it was not possible to identify the U. diversum strains in our study. The most significant hurdle to overcome is the transport of live organisms to the laboratory due to the long distances from farms, which hinders the viability of U. diversum for microbiological culture in specialized media in the laboratory. In contrast, 83.8% (26/31) of animals with vulvar lesions were negative by PCR. Other agents such as Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium and bovine rhinotracheitis virus (IBR) are causative agents of genital disease that may be visually indistinguishable from Ureaplasma lesions (Petit et al. 2008, pp. 325--333) and should be considered in the differential diagnosis. Further studies need to be performed to determine whether both mycoplasma and rhinotracheitis virus have a greater affinity for vulvar lesions than U. diversum. Our observation that 59% of the herds studied had at least one animal that was PCR positive for U. diversum suggested that Ureaplasma diversum was present among dairy cattle populations in the north region of Mato Grosso State, Brazil. The macroscopic lesions characterized by pustular vaginitis were mild but an association with U. diversum had to assumed in the animals tested in this area, which was in agreement with previous reports (Cardoso et al. 1997, pp. 172--173; Gaeti et al. 2014, pp. 59--63). The low amount of granularity observed suggested that some serotypes of ureaplasma might vary in their ability to produce granular vulvitis 44

(Ruhnke et al. 1984, pp.295--301). Although the total number of dairy cows with vulvovaginitis was low, these cows were more likely to harbor U. diversum in the vulva than animals without vulvitis or vaginitis (p=0.0268). As expected, U. diversum was found more often in females with a lower number of deliveries, suggesting that infected animals take more time to eliminate the agent. León et al. (1995, pp. 21--25) observed that younger animals with a lower number of deliveries were more likely to be colonized by U. diversum. In our study, positive PCR reactions for U. diversum did not differ significantly according to the age of the animal, indicating that age was of only minor importance as a cause of infection on the farms visited. Some studies have also demonstrated that Ureaplasma diversum is associated with female illness characterized by infertility, abortion or birth of weak calves (Kreplin et al. 1987, pp. 440; Buzinhani et al. 2007, pp. 1368--1375). In the present study, the presence of U. diversum was correlated with reproductive disorders (p=0.0491). However, the mechanisms by which this organism exerts it pathogenicity in cattle are mostly unknown (kim et al. 1994, pp. 1528--1533; Amorin et al. 2014, pp. 1--9). Marques et al. (2015, pp. 314-315) reported a new genome sequence of U. diversum strain ATCC49782, which represented a valuable new resource to elucidate host specificity and pathogenesis in bovines. In conclusion, these data indicated that dairy cows from the north region of Mato Grosso state were susceptible to contamination by U. diversum and that these bacteria were associated with pustular vulvovaginitis. Although the presence of U. diversum was confirmed as a cause of vulvar lesions, the effects of other bacteria from the Mycoplasma family have not been determined. Future studies should ascertain the effects of bacterial synergistic action in this state.

Acknowledgements We are grateful for the co-operation of Laticínio Lovara®, which allowed us to visit the dairy farms. The authors thank Dr. Luis Gustavo Corbellini (Epidemiology Laboratory from Federal University of Rio Grande do Sul) for the generous help with data analysis and statistical advice. The study was supported by FAPEMAT.

Conflicts of interest statement 45

The authors declare that they have no competing interests. References

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Tables

Table 1. U. diversum PCR results with the number of dairy cows with or without vulvovaginal lesions. U. diversum Vaginal lesions Total PCR Yes No Positive 5 15 20 Negative 26 157 183 31 172 203

48

Table 2. Presence of U. diversum in dairy herds from Mato Grosso, Brazil. Herd Number of animals PCR-positive 1 10 0 2 10 1 3 5 0 4 10 1 5 10 1 6 10 1 7 10 1 8 10 1 9 8 0 10 10 0 11 10 2 12 10 2 13 10 1 14 10 0 15 10 1 16 2 0 17 10 2 18 10 2 19 10 3 20 10 0 21 10 0 22 8 0 Total 203 20

Table 3. PCR positivity for U. diversum from bovine vulvovaginal mucus samples in six municipalities in Mato Grosso, Brazil. Municipality Proportion of the herd Proportion of PCR- PCR-positive (%) positive females (%) Sorriso 1/2 (50%) 1/20 (5%) Lucas do Rio 2/3 (66.6%) 2/25 (8%) Verde Nova Mutum 3/5 (60%) 4/48 (8.3%) Tapuráh 2/2 (100%) 4/20 (20%) Itanhangá 3/5 (60%) 4/42 (9.5%) Vera 2/5 (40%) 5/48 (10.4%) Total 13/22 20/203

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Table 4. Results of multivariable logistic regression analysis for risk factors associated with PCR-positive results for U. diversum in 22 dairy herds in the north region of Mato Grosso, Brazil. Significant variables Estimate OR P-value OR, 95% CI N0 of deliveries -3.4589 0.0315 0.0001 0.0089-0.1108 Vulvar lesions 2.8717 17.6672 0.0268 1.7119-182.3323 Reproductive problems 2.0371 7.6682 0.0491 1.1564-50.8498

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4. Certificado de aprovação no Comitê de Ética no uso animal

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