UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA – UESB PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, BIODIVERSIDADE E CONSERVAÇÃO

Análise da diversidade citogenética e morfométrica de espécies do complexo “” brasiliensis (Perciformes, Cichlidae) em bacias costeiras da Bahia

Isabel Araújo de Oliveira

PPGGBC

Jequié-BA 2012

Isabel Araújo de Oliveira

Análise da diversidade citogenética e morfométrica de espécies do complexo “Geophagus” brasiliensis (Perciformes, Cichlidae) em bacias costeiras da Bahia

Dissertação de mestrado apresentada ao programa de Pós- Graduação em Genética, Biodiversidade e Conservação da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, para obtenção do título de Mestre em Genética, Biodiversidade e Conservação.

Orientador: Prof. Dr. Paulo Roberto Antunes de Mello Affonso. Co-orientadores: Dr. Paulo Luiz Souza Carneiro e Drª. Débora Diniz.

PPGGBC

Jequié-BA 2012

Isabel Araújo de Oliveira

Análise da diversidade citogenética e morfométrica de espécies do complexo “Geophagus” brasiliensis (Perciformes, Cichlidae) em bacias costeiras da Bahia

Dissertação defendida e aprovada em 14 de março de 2012

Banca Examinadora

Dr. Paulo Roberto Antunes de Mello Affonso (orientador) Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia - UESB

Dr. Juvenal Cordeiro Silva Junior Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia - UESB

PPGGBC

Dra. Soraia Barreto Aguiar Fonteles Universidade Federal do Recôncavo Baiano - UFRB

Programa de Pós-Graduação em Genética, Biodiversidade e Conservação Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia – Jequié, BA

Dedico este trabalho especialmente a uma PPGGBCcriança maravilha, minha filha Maria Eduarda, que será minha eterna companheira; olhar para ela todos os dias só me dava força para continuar a minha jornada. Dedico-o também aos meus pais e irmãos pela confiança em mim depositada e a minha amiga Jamille, pois foi ela quem me apresentou a citogenética de peixes e teve participação expressiva nessa fase da minha vida.

Agradecimentos À UESB e ao PPGGBC pela oportunidade de realização do mestrado, bem como à FAPESB pela concessão da bolsa. A Deus que, mesmo tendo vários nomes, me deu forças para concluir essa jornada, me mostrando o caminho, colocando tudo em seu momento certo, mesmo quando eu achava que não, possibilitando sempre um novo dia com novas oportunidades. Gostaria de agradecer imensamente ao meu orientador Paulo Roberto Antunes de Mello Affonso, por ter aceitado me orientar, pela confiança que depositou em mim, por entender as minhas ausências e limitações por conta da presença constante de minha filha durante o mestrado, pela excelente orientação, pela convivência agradável, pelos momentos extremamente divertidos e pelo exemplo de profissionalismo que ele me deu. Aos meus co-orientadores Dr. Paulo Carneiro e Drª Débora Diniz pela colaboração na execução desse trabalho; suas contribuições foram extremamente valiosas. Ao Professor Dr. Marcelo Ricardo Vicari que respondeu prontamente quando solicitamos sua ajuda com a FISH. À professora Drª. Luisa Maria Sarmento-Soares, da Universidade Federal do Espírito Santo, pela identificação dos animais e por me receber tão cordialmente na minha ida ao Museu de Zoologia Mello Leitão em Santa Teresa – ES, sua disciplina de Biogeografia me auxilio bastante na hora de discutir meus resultados. À professora Drª. Soraia Barreto Aguiar Fonteles e ao professor Dr. Juvenal Cordeiro Silva Junior por aceitarem participar da minha banca de mestrado, e por lerem meu trabalho com tanto carinho. Suas sugestões tornaram minha dissertação mais rica. À minha filha que foi minha companheira nessa jornada e, com seu carisma, conquistou todos no mestrado, laboratório e creche da UESB, me deixando tranqüila para realizar meu trabalho. Por ela ser compreensiva com a ausência dos tios e avós, e nos momentos em que eu tive que me ausentarPPGGBC para ir aos congressos. À minha família pelo carinho, por ser meu suporte, pelas palavras de incentivo. Em especial a minha mãe que é uma mulher de fibra e que também me ensinou a ser assim. Ao meu primo Leonardo e ao Vitor Hugo que foram essenciais nas coletas dos exemplares utilizados nesse trabalho. Ao bolsista de iniciação científica Leandro Argôlo que analisou inúmeras lâminas para que esse trabalho fosse feito e tornou os dias no laboratório ainda mais divertidos com suas piadinhas.

À professora Drª. Caroline Garcia e aos colegas de laboratório e do mestrado que tornaram minha jornada mais agradável, com palavras de apoio quando as coisas não estavam dando certo, e pelos momentos de descontração; meus agradecimentos especiais à Josivanda, Aline, Roque, Lívia, Oziel, Elder, Marcele, Milena, Naiana, Mavione, Emilai, Joany, Isac, Leandro Aragão e Fernando. À minha companheira do lar e grande amiga, Jamille, por sua contribuição enorme no meu trabalho. Sempre que precisei, ela esteve presente para me ajudar. Obrigado por me fazer ver, mais uma vez, que posso contar com você para o que der e vier. E também ao seu noivo Alvrinho, pois além de me ajudar nas coletas se mostrou um super amigo e orou muito para que as coisas acabassem bem. A todos os meus amigos que torceram para que tudo desse certo na minha vida e para que eu pudesse concluir esse trabalho.

PPGGBC

Biografia

Isabel Araújo de Oliveira, filha de Maria José de Araújo e Plínio Salgado Costa de Oliveira, nasceu no Rio de Janeiro, em 16 de setembro de 1984. Concluiu seu ensino médio em 2002 no colégio O Delta em Salvador, Bahia. De 2003 a 2007, foi estudante do curso de Ciências Biológicas da Faculdade de Tecnologia e Ciências de Salvador, Bahia. Em março de 2007, graduou-se em Biologia com ênfase em Genética, com o trabalho de monografia intitulado: “Perspectiva de utilização do Teste do Micronúcleo como indicador de predisposição ao câncer pelo tabagismo”. No dia 30 de outubro do mesmo ano, nasce a sua filha, Maria Eduarda de Oliveira Rodrigues. Em março de 2010, ingressou no curso de mestrado do Programa de Pós-Graduação em Genética, Biodiversidade e Conservação da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (UESB), do qual foi representante de turma do início de 2010 ao fim de 2011, submetendo-se ao exame final de defesa de dissertação em 14 de março de 2012.

PPGGBC

PPGGBC “Aquilo que você desenha fortemente na mente acaba acontecendo.... Um desenho disforme impede a realização do objetivo... Quem luta e serve confiante na vitória constrói a embarcação segura em que navegará amanhã.”

Lourival Lopes

Resumo Grupos biológicos de ampla radiação adaptativa, como os peixes da família Cichlidae (Teleostei: Perciformes), usualmente incluem organismos de taxonomia confusa (espécies crípticas e complexos de espécies) cuja identificação depende de estudos genéticos. Essas análises ainda permitem avaliar a variação intraespecífica a partir da definição dos níveis de variabilidade genética e estrutura populacional. Esse trabalho teve com objetivo caracterizar citogeneticamente e morfometricamente amostras do complexo “Geophagus” brasiliensis de sistemas hidrográficos da Bahia, nordeste do Brasil, compreendendo sete populações de G. brasiliensis das bacias do Rio de Contas, Recôncavo Sul e Una-Almada (Leste) e uma de G. itapicuruensis da bacia do Rio Itapicuru. Todos os exemplares compartilharam número diplóide de 48 cromossomos divididos em 2sm+46st/a (NF=50), cariótipo proposto como simplesiomórfico para a tribo . A heterocromatina das espécies e populações analisadas foi verificada preferencialmente na região pericentromérica da maioria dos cromossomos. G. itapicuruensis e algumas populações de G. brasiliensis da bacia do Rio de Contas e do Rio São Pedro (bacia do Una-Almada) apresentaram RONs simples, enquanto as demais revelaram sítios múltiplos de DNAr, compreendendo até seis cromossomos st/a portadores de RONs. Esse resultado foi confirmado pela coloração com CMA3 e FISH com sondas ribossomais, embora sítios GC-ricos adicionais e não coincidentes com as RONs foram verificados em alguns casos. Por sua vez, os sítios de DNAr 5S mostraram-se invariáveis quanto ao número e localização, ocupando a região intersticial do braço longo de um par st/a não sintênico às RONs. Esses dados mostram características cromossômicas marcadamente divergentes de outras populações e espécies de Geophagus da América do Sul, validando Geophagus brasiliensis como um complexo de espécies. Evidencia-se também que a evolução cromossômica desses ciclídeos ocorre predominantemente por alterações microestruturais. A análise morfométrica baseada em 16 descritores morfológicos separou as populações de G. brasiliensis das amostras de G. itapicuruensis, com as duas primeiras variáveis canônicas capazes de explicar 100% da variação dos dados originais e permitindo construir agrupamentos consistentes (coeficiente de correlação cofenética = 0,9043). Em G. brasiliensis, os dados morfométricos indicam convergência adaptativa entre as populações, corroborada pela discrepância entre os grupos morfológicos e padrões cariotípicos. A diversidade genética e morfológica encontrada nesse complexo de Geophagus reforça a hipótese de que as bacias costeiras do nordeste brasileiro representem um hotspot de biodiversidade, importante para o direcionamento das políticas de conservação da ictiofauna neotropical.

Palavras-chave: Convergência adaptativa, DNAr, double-FISH, evolução cromossômica, Geophagini, ictiofauna. PPGGBC

Abstract Biological groups with wide adaptive radiation such as fish of family Cichlidae (Teleostei: Perciformes), usually harbor taxonomically puzzling organisms (cryptic species and species complexes) whose identification depends on genetic studies. Furthermore, these analyses allow evaluating intraspecific variation by defining the levels of genetic variability and population structure. The goal of this study was to characterize cytogenetically and morphometrically samples of “Geophagus” brasiliensis complex from hydrographic systems in Bahia, northeastern Brazil, comprising seven populations of G. brasiliensis from Contas River, Recôncavo Sul and Una-Almada (Eastern) basins and one of G. itapicuruensis from Itapicuru River basin. All specimens shared a diploid number of 48 chromosomes, divided into 2sm+46st/a (FN=50), a putative symplesiomorphic karyotype for the tribe Geophagini. The heterochromatin in the studied species and populations was detected mainly at pericentromeric region of most chromosomes. G. itapicuruensis and some populations of G. brasiliensis from Contas River basin and from São Pedro River (Una-Almada basin) presented single NORs while the others exhibited multiple rDNA sites, comprising up to six NOR-bearing chromosomes. This result was confirmed by CMA3 staining and by FISH with ribosomal probes although additional GC-rich sites unrelated to NORs were observed in some cases. On the other hand, 5S rDNA sites remained invariable in either number or location, occupying the interstitial region of a st/a pair, not syntenic to NORs. These data show remarkable divergent chromosomal features when compared to other populations and species of Geophagus from South America, validating Geophagus brasiliensis as a species complex. Moreover, it has been demonstrated that the chromosomal evolution in these are mainly driven by microstructural changes. The morphometric analysis based on 16 morphological measurements discriminated the populations of G. brasiliensis from samples of G. itapicuruensis, in which the first two canonic variables were able to explain 100% of the variation in the original data and assuring the formation of reliable groupings (cophenetic correlation coefficient = 0.9043). In G. brasiliensis, the morphometric data indicated adaptive convergence among populations, corroborated by the discrepancy between morphological groups and karyotypic patterns. Both genetic and morphological diversity reported in this Geophagus complex reinforce the hypothesis that coastal basin in northeastern Brazil should be regarded as biodiversity hotspots of relevance to underlie conservation policies of Neotropical ichthyofauna.

Keywords: Adaptive convergence, chromosomal evolution, double-FISH, Geophagini, ichthyofauna, rDNA. PPGGBC

Lista de figuras Figura 1. Mapa destacando a bacia hidrográfica do rio Itapicuru. Fonte: INEMA (2012)...... 17 Figura 2. Mapa destacando a bacia hidrográfica do Recôncavo Sul. Fonte: INEMA (2012)...... 18 Figura 3. Mapa destacando a bacia hidrográfica do rio de Contas. Fonte: INEMA (2012)...... 19 Figura 4. Mapa destacando a bacia hidrográfica do Leste. Fonte: INEMA (2012)...... 21 Figura 5. Filogenia da família Cichlidae a partir de dados morfológicos e de sequências de DNA de nove genes mitocondriais e nucleares (Smith et al., 2008)...... 32 Figura 6. Exemplar de Geophagus brasiliensis (A) e G. itapicuruensis (B). Fotos do autor...... 56 Figura 7. Mapa das regiões de planejamento e gestão de águas do estado da Bahia (acima à esquerda), evidenciando as bacias amostradas (indicadas pelas estrelas), onde XII: Bacia do rio Itapicuru; IX: Bacia do Recôncavo Sul; VIII: Bacia do rio de Contas; VII: Bacia do Una-Almada (parte da região hidrográfica do leste). Acima à direita, mapa do estado da Bahia com os pontos de amostragem de cada população de Geophagus com fotos representativas das localidades à direita: (A) rio Itapicuru-mirim (bacia do rio Itapicuru), (B) rio Mineiro (bacia do Recôncavo Sul), (C) rio de Contas, (D) rio das Pedras, (E) rio Preto do Costa, (F) rio Preto do Crisciúma, (G) rio Oricó (bacia do rio de Contas) e (H) rio São Pedro (bacia do Una-Almada). Fonte: modificada de INEMA (2012)...... 57 Figura 8. Desenho esquemático das 16 medidas morfométricas efetuadas nos exemplares do gênero Geophagus de acordo com numeração no texto...... 62 Figura 9. Cariótipos em coloração convencional das amostras do complexo “Geophagus” brasiliensis da Bahia: (A) Geophagus itapicuruensis do rio Itapicuru- mirim (bacia do rio Itapicuru); (B) G. brasiliensis do rio Mineiro (bacia do Recôncavo Sul); (C) rio de Contas, (D) rio das Pedras, (E) rio Preto do Costa, (F) rio Preto do Crisciúma, (G) rio Oricó (bacia do rio de Contas); (H) rio São Pedro (bacia do Una- Almada)...... 65 Figura 10. Cariótipos após bandamento C das amostras do complexo “Geophagus” brasiliensis da Bahia: (A) Geophagus itapicuruensis do rio Itapicuru-mirim (bacia do rio Itapicuru); (B) G. brasiliensis do rio Mineiro (bacia do Recôncavo Sul); (C) rio de Contas, (D) rio das Pedras, (E) rio Preto do Costa, (F) rio Preto do Crisciúma, (G) rio Oricó (bacia do rioPPGGBC de Contas); (H) rio São Pedro (bacia do Una-Almada)...... 66 Figura 11. Metáfases de Geophagus itapicuruensis (A e B) e G. brasiliensis (C e D) após coloração convencional com Giemsa (A e C) e impregnação com nitrato de prata (B e D). As setas indicam os cromossomos dispostos em buquê ou associados pelas RONs...... 67 Figura 12. Cromossomos de Geophagus itapicuruensis (A) e G. brasiliensis (B-H) + - portadores de Ag-RONs, regiões CMA3 /DAPI e sítios de DNAr 18S e DNAr 5S marcados por double-FISH. As letras A a H correspondem, respectivamente, às amostras do rio Itapicuru-mirim (bacia do rio Itapicuru), rio Mineiro (bacia do Recôncavo Sul), rio de Contas, rio das Pedras, rio Preto do Costa, rio Preto do Crisciúma, rio Oricó (bacia do rio de Contas) e rio São Pedro (bacia do Una-Almada).. 67 Figura 13. Dendrograma por UPGMA a partir da distância D2 de Mahalanobis sobre os dados morfométricos de Geophagus brasiliensis e de G. itapicuruensis por localidade de coleta...... 69

Figura 14. Gráfico de dispersão revelando a diversidade entre e dentro das populações com a projeção dos escores individuais obtidos da análise canônica discriminante independente do tamanho de 16 características morfológicas em espécimes de Geophagus brasiliensis e G. itapicuruensis do estado da Bahia...... 71 Figura 15. Gráfico de dispersão revelando a diversidade entre as amostras de Geophagus brasiliensis e G. itapicuruensis do estado da Bahia através de análise canônica discriminante independente do tamanho de 16 características morfométricas. O círculo vermelho representa a formação do agrupamento das populações de Geophagus brasiliensis...... 71

Lista de tabelas

Tabela 1. Lista de novas espécies de peixes neotropicais descritas de 2006 até 2011 (redescrições não foram incluídas, com exceção de combinações novas). Fonte: Neotropical Ichthyology (Sociedade Brasileira de Ictiologia)...... 23 Tabela 2. Espécies válidas e já descritas no gênero Geophagus, atualizada de Kullander (2003)...... 36 Tabela 3. Dados cromossômicos disponíveis para a Tribo Geophagini, incluindo número diplóide (2n); fórmula cariotípica; número fundamental (NF); número de cromossomos portadores de RONs; distribuição da heterocromatina (banda C); + cromossomos com sítios ricos em GC (CMA3 ) e mapeamento por FISH do DNAr 18S e 5S...... 48 Tabela 4. Espécimes coletados de Geophagus por local de coleta com respectivos números amostrais das análises morfométricas (N1) e citogenéticas (N2)...... 56 Tabela 5. Distâncias interpopulacionais médias (D2 Mahalanobis) baseadas em dados morfométricos de exemplares de Geophagus brasiliensis e G. itapicuruensis por localidade...... 68 Tabela 6. Formação dos grupos pelo método de otimização de Tocher utilizando a distância D2 de Mahalanobis sobre os dados morfométricos de Geophagus brasiliensis e G. itapicuruensis coletados no estado da Bahia. Os acessos representam as localidades...... 68 Tabela 7. Variáveis canônicas (CVi), autovalores (λi) e porcentagem da variação (%σ2) obtidas da análisePPGGBC de 16 caracteres morfométricos em amostras de Geophagus brasiliensis e G. itapicuruensis do estado da Bahia...... 69 Tabela 8. Contribuição relativa dos 16 caracteres morfométricos analisados em Geophagus brasiliensis e G. itapicuruensis do estado da Bahia, onde S.j representa a medida da importância relativa da variável j para o estudo da diversidade genética...... 70

Sumário

1 Introdução...... 14 2 Revisão de literatura...... 16 2.1 Bacias hidrográficas do Atlântico Leste...... 16 2.2 Diversidade da ictiofauna neotropical...... 2 2 2.3 A ordem Perciformes...... 27 2.4 A família Cichlidae...... 2 8 2.5 Aspectos citogenéticos em Cichlidae...... 39 2.6 Análises morfométricas...... 51 3 Objetivos...... 55 3.1 Objetivo geral...... 55 3.2 Objetivos específicos...... 55 4 Material e métodos...... 5 6 4.1 Área de estudo e coleta de material...... 56 4.2 Estudos cromossômicos...... 58 4.2.1 Obtenção de cromossomos mitóticos...... 58 4.2.2 Preparação de lâminas...... 58 4.2.3 Coloração convencional...... 58 4.2.4 Bandamento C...... 59 4.2.5 Ag-RON...... 59 4.2.6 Coloração com fluorocromos base-específicos...... 59 4.2.7 Hibridação fluorescente in situ dupla (double-FISH) com sondas ribossomais...... 60 4.2.8 Análise cromossômica e fotomicroscopia...... 61 4.3 Análises morfométricas...... 61 5 Resultados...... 63 5.1 Análises citogenéticas...... 63 5.2 Análises morfométricas...... 68 6 Discussão...... 72 7 Conclusões...... 87 8 Referências Bibliográficas...... 88 PPGGBC 14

1 Introdução De acordo com o último levantamento realizado pelo Ministério do Meio Ambiente (2008), 5,9 % das espécies de peixes de água doce descritas na fauna brasileira são consideradas ameaçadas. Porém, há evidências que esse número esteja subestimado, principalmente pela ausência de conhecimento taxonômico adequado. A área biogeográfica correspondente aos rios do leste do Brasil, entre a foz do rio São Francisco e os rios litorâneos do norte do Estado de Santa Catarina, constituem a região de endemismo com o maior número de espécies ameaçadas, totalizando 59 espécies (MMA, 2008). Tal situação pode ser explicada pela grande extensão territorial aliada ao alto grau de degradação ambiental da região, com uma combinação de fatores que envolvem desmatamento, assoreamento, poluição, introdução de espécies e construção de hidrelétricas. Relatórios técnicos de biodiversidade que fazem parte do subprojeto “Avaliação e Ações Prioritárias para Conservação dos Biomas Floresta Atlântica e Campos Sulinos” do Ministério do Meio Ambiente (2000) indicam 29 áreas prioritárias para conservação de peixes na Mata Atlântica, sendo que oito delas estão, integral ou parcialmente, localizadas dentro do território baiano. Vale ressaltar que quatro destas são classificadas como insuficientemente conhecidas, mas de provável importância biológica (bacias do rio Itapicuru, rio Paraguaçu; rio de Contas; e rio Pardo), enquanto as demais são de extrema importância biológica (bacias do rio Una; rio João de Tiba; rio Jequitinhonha e rio Mucuri). Muitas dessas áreas citadas são alvo de projetos de construção de reservatórios e usinas hidrelétricas, mineração, atividades agrícolas e outros tipos de degradação ambiental. Tais fatores podem resultar na extinção de espécies antes mesmo de serem conhecidas. Diante deste cenário, projetos de inventário e estudos de taxonomia, sistemática e diversidade genética tornam-se necessários. Embora os peixes da família Cichlidae sejam amplamente estudados, do ponto de vista citogenético, na região neotropical, os dados são pouco representativos frente à ampla diversidade deste PPGGBCsingular grupo de vertebrados. De forma geral, apesar de constituírem uma unidade filogenética, há várias divergências no inter-relacionamento entre os clados, tanto no que diz respeito às análises moleculares como citogenéticas. Apesar dos avanços metodológicos das últimas décadas, restam ainda muitas dúvidas em relação aos mecanismos evolutivos envolvidos na diversificação desse grupo (Feldberg et al., 2003). Entre as espécies de Cichlidae com ocorrência nas drenagens atlânticas do Brasil destaca-se Geophagus brasiliensis, a qual apresenta reconhecida importância na composição 15

da fauna de muitas bacias costeiras brasileiras (Araújo & Santos, 2001; Sarmento-Soares et al., 2008; Sarmento-Soares et al., 2009; Cetra et al., 2010; Moura et al., 2010). Ainda, desde as primeiras revisões no gênero (Kullander, 1986), Geophagus brasiliensis tem sido classificado como incertae sedis (sem atribuição genérica formal), conforme corroborado por análises filogenéticas recentes em ciclídeos, que colocam essa espécie fora do agrupamento do gênero Geophagus (Farias et al., 1999, 2000, 2001; López–Fernandez et al., 2005). Outro fenômeno comum observado na história da taxonomia desse gênero é a descrição de espécies com distribuição ampla. O nome Geophagus brasiliensis tem sido extensamente atribuído a populações que ocorrem em ambientes dulcícolas ou salobros, os quais possuem uma variação extensa de componentes físico-químicos podendo levar a adaptações específicas nos organismos. Consequentemente, as populações dessa espécie apresentam variações consideráveis tanto na morfologia externa como em características citogenéticas, sugerindo a existência de um complexo de espécies. Por exemplo, Mattos (2010) analisou exemplares coletados nas Bacias do Leste brasileiro e reconheceu 11 espécies dentro do complexo “Geophagus” brasiliensis, evidenciando que esforços taxonômicos precisam ser realizados para aprimorar o conhecimento da biodiversidade desse grupo. Levando em consideração a deficiência de estudos sobre a ictiofauna do estado da Bahia, e sabendo que os marcadores citogenéticos e morfométricos são comumente empregados em análises de diversidade genética, estudos com esses marcadores foram realizados em populações e espécies do gênero Geophagus. Essa abordagem visou primariamente identificar o nível de diferenciação entre as amostras desse ciclídeo dominante em sistemas hidrográficos da Bahia. Entre os desdobramentos desse estudo, espera-se auxiliar na resolução de incertezas taxonômicas e reavaliar a composição ictiofaunística das bacias costeiras do estado. A delimitação das espécies e populações de Geophagus é fundamental ainda para estudos biogeográficos, filPPGGBCogenéticos, evolutivos e também para elaboração de medidas de conservação. 16

2 Revisão de literatura 2.1 Bacias hidrográficas do Atlântico Leste No estado da Bahia, as bacias hidrográficas estão agrupadas em 26 Regiões de Planejamento e Gestão das Águas (RPGAs) sob administração do Instituto do Meio Ambiente e Recursos Hídricos, uma autarquia da Secretaria do Meio Ambiente do Estado (SEMA). A gestão dos recursos hídricos estaduais considera que o território baiano se encontra totalmente inserido em duas Regiões Hidrográficas Nacionais: Atlântico Leste e bacia do rio São Francisco (INEMA, 2012). A Região Hidrográfica do Atlântico Leste, localizada entre as coordenadas 9º40’S a 19º00’S e 36º40’O a 44º00’O, compreende os estados de Sergipe, Bahia, Minas Gerais e Espírito Santo (MMA, 2006). Ela possui uma área de 374.677 km², equivalente a 4% do território brasileiro e, mais da metade da área (66,8%) desta região, está localizada no estado da Bahia (ANA, 2012). De forma geral, a ictiofauna das bacias do Atlântico Leste apresenta um elevado grau de endemismo, representando o resultado de processos evolutivos condicionados por fatores climáticos e históricos (Ribeiro, 2006) e pelo regime hidrológico peculiar da região, especialmente em áreas de caatinga (Rosa, 2004; Jacobina et al., 2009). Acredita-se ainda que o número de espécies de peixes que ocorrem nos rios do Atlântico Leste possa ser ampliado com a realização de inventários (Bertaco & Lucena, 2006; Sarmento-Soares et al., 2006). A precisão no conhecimento das espécies de peixes dessa região também esbarra na escassez de levantamentos para as áreas de cabeceiras e ausência de dados precisos da sistemática e da distribuição da maioria dos táxons. Igualmente, o conhecimento do estado de conservação das espécies do Atlântico Leste é considerado incipiente, com algumas espécies já citadas como ameaçadas, a exemplo de Lygnobrycon myersi, conhecida popularmente como piaba-facão (Rosa & Menezes, 1996; Rosa et al., 2003; Castro & JucáPPGGBC-Chagas, 2008). Dessa forma, a maior parte da biodiversidade das bacias hidrográficas do estado da Bahia permanece no anonimato e ameaçada. A seguir, estão destacadas algumas bacias hidrográficas que compõem a região do Atlântico Leste e que apresentam especial interesse para o presente trabalho (Figura 1 a 4). 17

Bacia hidrográfica do rio Itapicuru

Figura 1. Mapa destacando a bacia hidrográfica do rio Itapicuru. Fonte: INEMA (2012).

Localizada na região nordeste do Estado da Bahia, a bacia hidrográfica do rio Itapicuru compreende 37.345 km², abrangendo 54 municípios, onde residem cerca de 990.000 pessoas. A economia da região se caracteriza pela atividade mineradora, na área da Chapada Diamantina e pela predominância de uma agricultura de subsistência e pecuária tradicional no restante da região (IICA, 2012). O clima semi-áPPGGBCrido predomina em 81% da área, ocupando a parte central desta bacia. Em sua porção superior, na Chapada Diamantina, o clima torna-se mais ameno variando de sub- úmido a seco, com os totais pluviométricos atingindo até 900 mm. No seu trecho inferior, o clima torna-se úmido a sub-úmido com precipitações variando de 1000 até 1400 mm (INEMA, 2012). Quanto à vegetação, destacam-se a restinga, floresta ombrófila e manguezais em seu trecho baixo, caatinga, cerrado e floresta estacional semidecidual à medida que avança para o interior, além das zonas de transição e áreas antropizadas, com diversas espécies ameaçadas de extinção (INEMA, 2012). 18

A rede de drenagem dessa região é formada pelo rio Itapicuru e seus afluentes, destacando- se o Itapicuru-Mirim e Itapicuru-Açu. As potencialidades hídricas de superfície dessa bacia são, em geral, baixas. A maioria dos cursos d’água, principalmente no seu trecho médio, apresenta vazões de estiagem praticamente nulas. Devido à escassez hídrica da região, o Departamento Nacional de Obras contra a Seca implantou uma série de açudes no rio Itapicuru e seus afluentes, dentre os quais se destacam os açudes de Jacurici, Araci, Sohen, Andorinha II e Serrote. Mais recentemente, o Governo do Estado construiu os reservatórios de Ponto Novo, Barroca do Faleiro e Pedras Altas (IICA , 2012).

Bacia hidrográfica do Recôncavo Sul

PPGGBC Figura 2. Mapa destacando a bacia hidrográfica do Recôncavo Sul. Fonte: INEMA (2012).

A bacia do Recôncavo Sul drena uma área de 17.788 km2 entre as coordenadas 12º40' a 14º20'S e 38º55' a 40º20'O. Essa região apresenta características climáticas tropicais, influenciadas pelas áreas planálticas a oeste e pela proximidade do mar a leste. Possui uma população de 906.292, abrangendo 56 municípios. Limita-se ao norte e a oeste com a bacia do rio Paraguaçu, ao sul e a sudoeste pela bacia do rio de Contas, e a leste com o Oceano Atlântico (MMA, 2006; INEMA, 2012). 19

O clima em torno desse sistema hidrográfico é caracterizado pela irregular distribuição pluviométrica com a maioria dos cursos d’água intermitente. Em sua vegetação, nota-se a presença da Mata Atlântica, com áreas bem conservadas, bem como extensos manguezais e restingas, os quais formam um amplo estuário. Na parte noroeste, a formação é de caatinga. A porção localizada no clima semi-árido tem uma alta suscetibilidade à desertificação, o que, portanto, demanda atenção redobrada ao manejo das águas (INEMA, 2012). As atividades econômicas predominantes são o turismo, produção de piaçava e dendê, além de uma forte organização das comunidades locais voltada para a agricultura familiar. Os corpos d’água dessa região hidrográfica encontram-se bastante alterados por ações antrópicas, sendo seus principais problemas causados por atividades agropecuárias, extrativistas, industriais, mineração e urbanização (CRA, 2001). Os principais cursos hídricos que cortam a bacia do Recôncavo Sul são os rios Jaguaripe, Jequiriçá, Ribeira do Cupido, Una, Jequié, Almas, Preto e Cachoeira Grande (INEMA, 2012; MMA, 2006).

Bacia hidrográfica do rio de Contas

PPGGBC

Figura 3. Mapa destacando a bacia hidrográfica do rio de Contas. Fonte: INEMA (2012).

20

A bacia do Rio de Contas possui uma área de 55.483 km2, apresentando-se limitada ao norte pelas bacias do rio Paraguaçu e Recôncavo Sul, a oeste com a bacia do rio São Francisco; a leste, com o Oceano Atlântico e ao sul com as bacias do rio Pardo e Una. Abrange 76 municípios com população de 1.242.439 habitantes (SRHSH, 1993; INEMA, 2012). O clima semi-árido predomina no seu trecho superior e médio, abrange 51% da área nessa região, onde as precipitações anuais são inferiores a 700 mm. Em direção ao litoral, o clima fica mais ameno, passando de subúmido a seco para o úmido a subúmido, com precipitação anual aumentando gradativamente até atingir valores próximos a 2.000 mm nas proximidades de sua foz no município de Itacaré (INEMA, 2012). As cabeceiras de seus rios principais (Contas e Brumado) localizam-se na parte sul da Chapada Diamantina, sucedendo-se então, de oeste para leste, áreas de depressões interplanálticas e dos planaltos Sul-Baiano, Pré-Litorâneo e Costeiro. No seu trecho superior e médio ocorrem áreas de vegetação natural de caatinga e áreas antropizadas com exploração agropecuária. No seu trecho inferior, à jusante de Jequié, ocorrem remanescentes das matas de cacau (cabrucas) e de Mata Atlântica. As principais sub-bacias são Alto Contas, rio Brumado, rio Gavião, rio do Antônio, rio Sincorá, rio Gentio, Baixo Contas, rio Gongogi, litorânea e de transição (INEMA, 2012). Destaca-se, nessa região, a construção do reservatório da Barragem da Pedra na década de 60, a 18 km à montante da cidade de Jequié no rio de Contas. Esse reservatório, com superfície aproximada de 70 km e capacidade de estocagem de 1,7 bilhões de metros cúbicos, teve como finalidade promover abastecimento de água, geração de energia e incremento da pesca (Paiva, 1982, SRHSH, 1993, MMA, 2006). Barragens desse tipo e seus respectivos reservatórios alteram o curso natural dos rios, modificando sua feição lótica com conseqüentes perdasPPGGBC e surgimento de novos habitats (Vono et al., 2002) podendo conduzir, sob determinadas circunstâncias, à extinção de espécies incapazes de se adaptar a esse tipo de mudança (Godinho & Godinho, 1994). Além dessa ameaça, foram introduzidas no reservatório da Barragem da Pedra (e, portanto, também na bacia do rio de Contas) espécies fortemente ictiófagas como Serrasalmus brandti, Pygocentrus piraya e Plagioscion squamosissimus, com prováveis conseqüências negativas para toda a ictiofauna dessa localidade (Moura et al., 2010). A introdução de espécies tem gerado consequências desastrosas na ictiofauna nativa, levando à diminuição da sua 21

abundância ou mesmo à sua extinção, já que espécies invasoras podem trazer patógenos, predar ou competir com as espécies nativas (Hilsdorf & Petrere, 2002). Soma-se a tudo isso, o comprometimento das águas pela ejeção de esgoto doméstico em alguns locais, como a calha principal do rio de Contas. O principal foco de tal contaminação localiza-se no município de Jequié, onde foram verificados níveis anormais de cloretos e sólidos totais. Outros pontos também são afetados, como os trechos de mananciais sob a influência dos núcleos urbanos dos municípios de Ipiaú e Ubatã (CRA, 2001).

Bacia Hidrográfica do rio Una-Almada (Leste)

Figura 4. Mapa destacando a bacia hidrográfica do Leste. Fonte: INEMA (2012). PPGGBC Esse sistema hidrográfico, juntamente com as bacias dos rios Almada, Cachoeira e Doce compõem a Região de Planejamento e Gestão das Águas do Leste, com área total de 9.507 km2 (1,68% do estado da Bahia), compreendendo uma população de 682.652 habitantes e 24 municípios baianos. O clima é subúmido ou seco na região oeste, úmido a sub-úmido na porção central e úmido ao leste. Sua cobertura vegetal é composta por Mata Atlântica, floresta estacional decidual e semidecidual (INEMA, 2012). A Reserva Biológica de Una (BA), uma das áreas prioritárias de extrema importância biológica para conservação da flora e fauna de Mata Atlântica situa-se nessa bacia 22

hidrográfica (MMA, 2000). Essa unidade de conservação possui certo grau de ocupação humana, tendo o objetivo básico de proteger a diversidade biológica, disciplinar o processo de ocupação e assegurar a sustentabilidade do uso dos recursos naturais. Os principais problemas ambientais encontrados nessa região são: poluição dos mananciais por esgoto e lixo, ausência de saneamento básico na maioria das comunidades, pesca irregular com malha fina, arpão ou rede de arrasto, desmatamento, loteamentos irregulares na área litorânea, queimadas, caça, comercialização e contrabando de animais silvestres (SEMA, 2012).

2.2 Diversidade da ictiofauna neotropical Os peixes constituem o grupo mais antigo, numeroso e diverso dentre os vertebrados. Acredita-se que representem mais da metade das espécies viventes reconhecidas de vertebrados do mundo, com 27.977 espécies válidas dentre os 54.711 vertebrados descritos (Nelson, 2006). Porém, esse número é considerado subestimado em função da constante descrição de novas espécies, especialmente em águas tropicais, como comentado adiante. Embora a água doce represente uma porcentagem ínfima da hidrosfera (apenas 0,01%), ela contém uma extraordinária riqueza biológica, correspondendo a 25% de todas as espécies de vertebrados (Nelson, 2006). Para melhor compreender tal diversidade, Alfred Russel Wallace, em 1876, dividiu o planeta em regiões zoogeográficas: neoártica, neotropical, paleoártica, africana (ou etiópica), oriental e australiana, de acordo com os limites e fauna característica de cada local, que permanecem válidas até os dias atuais (Helfman et al., 2009). Dentre essas, a região neotropical, entre o deserto de Sonora (na fronteira México - Estados Unidos) e o limite sul da América do Sul, é a mais rica em número de espécies (Nirchio & Oliveira, 2006). A ictiofauna neotropical de água doce compreende 4.475 espécies válidas (Reis et al., 2003), com estimativas de que cerca de 30% a 40% de toda a biodiversidade ainda não tenha sido reconhecida. Essa situação é atribuída à extensão geográfica dessa área, à escassez de informaçõesPPGGBC filogenéticas e/ou dados desencontrados (Rosa et al., 2003). No Brasil. os peixes de água doce são representados, em geral, pela subclasse Dipnoi (peixes pulmonados) e as classes Chondrichthyes (peixes cartilaginosos) e, principalmente, (peixes com raios nas nadadeiras). Cinco ordens de Actinopterygii detêm mais de 95% das espécies de peixes de água doce conhecidas no território brasileiro e são listadas a seguir em ordem decrescente do número de espécies: (lambaris, piabas, piranhas, piracanjuba, matrinxãs, traíras, pacus, dourado etc.), Siluriformes (bagres e cascudos), Perciformes (acarás, tucunarés, jacundás, pescadas), Cyprinodontiformes (guarus e peixes-anuais) e Gymnotiformes (tuviras, ituís, poraquê) (MMA, 2008). A presença de vastos 23

sistemas hidrográficos, com considerável distinção de clima e vegetação, faz do Brasil o melhor exemplo da biodiversidade da ictiofauna neotropical, com 3.000 espécies de peixes de água doce, número três vezes maior que qualquer outro país (Reis et al., 2003). Ainda, esse total de espécies descritas vem aumentando consideravelmente nos últimos anos à medida que os esforços de coleta são concentrados em regiões historicamente pouco analisadas e revisões taxonômicas detalhadas são realizadas. Exemplificando, somente as novas descrições publicadas no periódico Neotropical Ichthyology, publicação da Sociedade Brasileira de Ictiologia, desde 2006 (ano da 4ª edição de Fishes of The World de J. S. Nelson) até 2011, somam 174 espécies (Tabela 1). Ainda, em alguns casos, novos gêneros foram reconhecidos entre as espécies descritas, como Lepidocharax (Ferreira et al., 2011), Pseudobunocephalus (Friel, 2008), Gymnotocinclus (Carvalho et al., 2008), Rhinolekos (Martins & Langeani, 2011) e Cruciglanis (Ortega-Lara & Lehmann-A., 2006).

Tabela 1. Lista de novas espécies de peixes neotropicais descritas de 2006 até 2011 (redescrições não foram incluídas, com exceção de combinações novas). Fonte: Neotropical Ichthyology (Sociedade Brasileira de Ictiologia). Espécie Localidade Referência Ordem Characiformes Família Anostomidae Leporinus guttatus Rio Curuá, Serra do Cachimbo, PA Birindelli & Britski (2009) Leporinus venerei Rio Araguaia, MT e GO Britski & Birindelli (2008)

Família Acestrocephalus acutus Bacias dos rios Tocantins e Tapajós, PA, GO e MT Menezes (2006) Acestrocephalus maculosus Bacia do alto Tocantins, GO Menezes (2006) Acestrocephalus nigrifasciatus Rios Arinos e Juruena, bacia do rio Tapajós, MT Menezes (2006) Acestrocephalus pallidus Bacia do rio Madeira, AM e RO Menezes (2006) Acestrocephalus stigmatus Rios das Mortes, Tocantins e Xingu, GO e MT Menezes (2006) Amazonspinther dalmata Rios Purus e Madeira, AM Bührnheim et al. (2008) Astyanax ajuricaba Bacias dos rios Negro, Solimões e Tapajós, AM Marinho & Lima (2009) Astyanax burgerai Rio Almada, BA Zanata & Camelier (2009) Astyanax courensis Bacia do Alto Tocantins, GO Bertaco et al. (2010) Astyanax goyanensis Bacia do Alto Tocantins, GO Bertaco et al. (2010) Astyanax gymnodontus Bacia do rio Iguaçu, PR Pavanelli & Oliveira (2009) Astyanax jordanensis Bacia do rio Iguaçu, PR Alcaraz et al. (2009) Astyanax henseli Rios dos Sinos e Taquari, RS Melo & Buckup (2006) Astyanax microschemos Bacia do rio Itapemirim, ES Bertaco & Lucena (2006) Astyanax pelecus PPGGBCBacia do rio Pardo, BA Bertaco & Lucena (2006) Astyanax utiariti Alto rio Tapajós, MT Bertaco & Garutti (2007) Astyanax vermilion Rios Almada e Cachoeira, BA Zanata & Camelier (2009) Astyanax xavante Médio Rio Araguaia, MT Garutti & Venere (2009) Bryconadenos weitzmani Bacia do Rio Xingu, PA Menezes et al. (2009) Charax goeldii Bacia do rio Madeira, RO Menezes (2007) Hasemania kalunga Bacia do alto rio Tocantins, GO Bertaco & Carvalho (2010) Hasemania piatan Bacia do alto rio de Contas, BA Zanata & Serra (2010) Hemibrycon inambari Bacia do alto rio Madre de Dios, Peru Bertaco & Malabarba (2010) Hemibrycon mikrostiktos Bacia do rio Ucayali, Peru Bertaco & Malabarba (2010) Hemibrycon divisorensis Bacia do rio Ucayali, Peru Bertaco et al. (2007a) Hemigrammus arua Baixo rio Amazonas, PA Lima et al. (2009) Hemigrammus tocantinsi Bacia do alto Tocantins, GO Carvalho et al. (2010a) Hyphessobrycon brumado Bacia do alto rio de Contas, BA Zanata & Camelier (2010) Hyphessobrycon notidanos Bacia do alto Tapajós, MT Carvalho & Bertaco (2006) Hyphessobrycon melanostichos Bacia do alto Tapajós, MT Carvalho & Bertaco (2006) Hyphessobrycon nicolasi Bacia do rio Uruguai, Argentina Miquelarena & López (2010) 24

Hyphessobrycon vinaceus Alto rio Pardo, MG Bertaco et al. (2007b) Jupiaba citrina Bacia do rio Madeira, AM/MT Zanata & Ohara (2009) Jupiaba kurua Alto rio Curuá, PA Birindelli et al. (2009) Knodus shinahota Bacia do rio Mamoré, Bolívia Ferreira & Carvajal (2007) Lepidocharax burnsi Bacias dos rios São Francisco e Doce, MG Ferreira et al. (2011) Lepidocharax diamantina Bacia do rio Paraguaçu, BA Ferreira et al. (2011) Metynnis cuiaba Bacia do alto Paraguai, MS Pavanelli et al. (2009) Odontostilbe ecuadorensis Bacias dos rios Napo, Putumayo e Pastaza, Equador Bührnheim & Malabarba (2006) Odontostilbe nareuda Bacia do rio Madeira, Amazônia Bührnheim & Malabarba (2006) Odontostilbe pao Rio Pao, Venezuela Bührnheim & Malabarba (2007) Odontostilbe parecis Bacia do alto rio Guaporé, MT Bührnheim & Malabarba (2006) Odontostilbe splendida Bacia do rio Orinoco, Colômbia Bührnheim & Malabarba (2007) Oligosarcus jacuiensis Bacias dos rios Uruguai e Jacuí, RS Menezes & Ribeiro (2010) Moenkhausia chlorophthalma Rio Treze de Maio, Serra do Cachimbo, PA Sousa et al. (2010) Moenkhausia dasalmas Bacia do alto Tocantins, GO Bertaco et al. (2011) Moenkhausia diamantina Bacia do rio Paraguaçu, BA Benine et al. (2007) Moenkhausia eurystaenia Bacia do rio Xingu, MT Marinho (2010) Moenkhausia forestii Bacia do rio Paraguai, MT/MS Benine et al. (2009) Moenkhausia plumbea Bacia do rio Tapajós, PA Sousa et al. (2010) Salminus franciscanus Bacia do rio São Francisco, MG/BA Lima & Britski (2007) Tetragonopterus carvalhoi Rio Jari, AM Melo et al. (2011) Tetragonopterus rarus Rio Jari, AM Melo et al. (2011)

Família Crenuchidae Characidium heirmostigmata Bacia do alto Paraná, PR Graça & Pavanelli (2008) Characidium xanthopterum Bacias do alto Paraná e alto Tocantins, GO Silveira et al. (2008)

Família Erythrinidae Hoplias australis Bacia do rio Uruguai, RS/Uruguai Oyakawa & Mattox (2009) Hoplias curupira Bacia Amazônica, Suriname e Guiana Oyakawa & Mattox (2009)

Ordem Cyprinodontiformes Família Poecilidae Phalloceros alessandrae Drenagens costeiras, PR Lucinda (2008) Phalloceros anisophallos Drenagens costeiras, RJ Lucinda (2008) Phalloceros aspilos Rio Parati-Mirim, RJ Lucinda (2008) Phalloceros buckupi Drenagens costeiras, PR Lucinda (2008) Phalloceros elachistos Rio Doce e drenagens costeiras, ES Lucinda (2008) Phalloceros enneaktinos Córrego Toca-do-boi, RJ Lucinda (2008) Phalloceros harpagos Bacia Paraná-Paraguai e rios costeiros do ES a SC Lucinda (2008) Phalloceros heptaktinos Bacia do rio Jacuí, RS Lucinda (2008) Phalloceros leptokeras Bacia do rio Paraíba do Sul, RJ Lucinda (2008) Phalloceros leticiae Alto rio Araguaia, GO Lucinda (2008) Phalloceros lucenorum Rio Juquiá, SP Lucinda (2008) Phalloceros malabarbai Drenagem costeira, SC Lucinda (2008) Phalloceros megapolos Rios São João, Alto Cubatão e adjacências, PR Lucinda (2008) Phalloceros mikrommatos Bacia do rio João de Tiba, BA Lucinda (2008) Phalloceros ocellatus Drenagens costeiras, BA e ES Lucinda (2008) Phalloceros pellos Drenagens costeiras, PR Lucinda (2008) Phallocerosreisi Alto rio Tietê, Paraíba do Sul, Ribeira de Iguape e Lucinda (2008) PPGGBCdrenagens costeiras, SP Phalloceros spiloura Drenagens costeiras, SC e RS Lucinda (2008) Phalloceros titthos Drenagens costeiras, PR Lucinda (2008) Phalloceros tupinambá Rios Itamambuca, Macacu e rios costeiros, SP e RJ Lucinda (2008) Phalloceros uai Bacia do rio São Francisco, MG Lucinda (2008)

Família Rivulidae Austrolebias paucisquama Bacia do rio Jacuí, RS Ferrer et al. (2008) Austrolebias quirogai Bacias do rio Uruguai e Laguna Merín, Uruguai Loureiro et al. (2011) Cynolebias parnaibensis Bacia do Rio Parnaíba, PI Costa et al. (2010)

Ordem Gymnotiformes Família Gymnotidae Gymnotus chaviro Bacia do alto rio Juruá, Peru Maxime & Albert (2009)

Família Hypopomidae Brachyhypopomus draco Bacias costeiras, RS e Uruguai Giora et al. (2008) 25

Ordem Myliobatiformes Família Potamotrygonidae Potamotrygon boesemani Bacia do rio Corantijn, Suriname Rosa et al. (2008)

Ordem Perciformes Família Cichlidae Crenicichla empheres Bacia do alto rio Uruguai, SC Lucena (2007) Crenicichla iguapina Rio Ribeira de Iguape, SP Kullander & Lucena (2006) Crenicichla hadrostigma Bacia do alto rio Uruguai, SC, RS e Argentina Lucena (2007) Crenicichla maculata Rios Maquiné ao Itapocu, RS e SC Kullander & Lucena (2006) Crenicichla tingui Drenagens dos rios Itapocu ao Nhundiaquara, SC, PR Kullander & Lucena (2006) Crenicichla ypo Bacia do médio rio Paraná, Argentina Casciotta et al. (2010) Guianacara dacrya Rios Essequibo e Branco, Guiana Arbour & López-Fernández (2011) Gymnogeophagus tiraparae Bacias dos rios Negro e Tacuarí, Uruguai González-Bergonzoni et al. (2009)

Ordem Siluriformes Família Ariidae Cathorops belizensis Manguezais de Belize Marceniuk & Betancur-R (2008) Cathorops higuchii Rios costeiros de Honduras ao Panamá Marceniuk & Betancur-R (2008) Cathorops kailolae Rios costeiros da Guatemala e México Marceniuk & Betancur-R (2008)

Família Aspredinidae Bunocephalus erondinae Sistema da laguna dos Patos, RS Cardoso (2010) Pseudobunocephalus lundbergi Bacia do rio Orinoco, Colômbia Friel (2008) Trachycorystes menezesi Rio Aripuanã, MT Britski & Akama (2011) Xyliphius anachoretes Sistema Tocantins-Araguaia, GO Figueiredo & Britto (2010)

Família Auchenipteridae Ageneiosus uranophthalmus Bacia Amazônica Central Ribeiro & Py-Daniel (2010) Tatia jaracatia Bacia do baixo rio Iguaçu, PR Pavanelli & Bifi (2009) Tatia caxiuanensis Rio Curuá, PA Sarmento-Soares & Martins- Pinheiro (2008) Tatia meesi Bacia do rio Essequibo, Guiana Sarmento-Soares & Martins- Pinheiro (2008) Tatia nigra Drenagens dos rios Uatumã e Trombetas, PA e AM Sarmento-Soares & Martins- Pinheiro (2008) Tetranematichthys barthemi Bacia do rio Trombetas e baixo Amazonas, PA Peixoto & Wosiacki (2010)

Família Callichthyidae Corydoras ortegai Rio Putumayo, Peru Britto et al. (2007)

Família Cetopsidae Cetopsidium soniae Bacia do rio Takutu, Guiana Vari & Ferraris (2009) Leptodoras oyakawai Bacia do alto rio Tapajós e alto rio Xingu, PA e MT Birindelli et al. (2008) PPGGBC Família Doradidae Platydoras brachylecis Bacias dos rios Pindaré a Parnaíba, MA e PI Piorsk et al. (2008)

Família Heptapteridae Gladioglanis anacanthus Lago do Mamão, rio Aripuanã, AM Rocha et al. (2008)

Família Acestridium triplax Rio Amazonas, PA Rodriguez & Reis (2007) chrysolomus Bacia do rio Xingu, PA Py-Daniel et al. (2011) Baryancistrus xanthellus Bacia do rio Xingu, PA Py-Daniel et al. (2011) Gymnotocinclus anosteos Bacia do alto Tocantins, GO Carvalho et al. (2008) Hemiancistrus cerrado Bacia do rio Tocantins, GO Souza et al. (2008) Hisonotus brunneus Bacia do rio Jacuí, RS Carvalho & Reis (2011) Hisonotus carreiro Cabeceiras do rio Taquari, RS Carvalho & Reis (2011) Hisonotus heterogaster Bacia do rio Jacuí, RS Carvalho & Reis (2011) Hisonotus notopagos Drenagem do rio Camaquã, RS Carvalho & Reis (2011) 26

Hisonotus prata Cabeceiras do rio Taquari, RS Carvalho & Reis (2011) Hisonotus vireo Bacia do rio Jacuí, RS Carvalho & Reis (2011) Hypostomus chrysostiktos Bacia do rio Paraguaçu, BA Birindelli et al. (2007) Hypostomus denticulatus Rio Corumbá, GO Zawadzki et al. (2008a) Hypostomus faveolus Bacias dos rios Tocantins e Xingu, MT, GO, TO, MA Zawadzki et al. (2008b) Hypostomus heraldoi Bacia do alto rio Paraná, GO Zawadzki et al. (2008a) Hypostomus kopeyaka Bacia do rio Tiquié, AM Carvalho et al. (2010) Hypostomus multidens Bacia do alto rio Paraná, PR e SP Jerep et al. (2007) Hypostomus peckoltoides Rio Cuiabá, MT Zawadzki et al. (2010) Hypostomus weberi Bacia do Rio Negro, AM Carvalho et al. (2010b) Lamontichthys avacanoeiro Bacia do alto Tocantins, GO Paixão & Toledo-Piza (2009) Lamontichthys parakana Bacia do baixo Tocantins, PA Paixão & Toledo-Piza (2009) Lithoxus jantjae Rio Ventuari, Venezuela Lujan (2008) Loricaria lundbergi Baixo rio Negro, AM e bacia do rio Baria, Venezuela Thomas & Py-Daniel (2008) Loricaria pumila Baixo Amazonas e baixo Tocantins, AM e PA Thomas & Py-Daniel (2008) Loricaria spinulifera Rio Negro e baixo rio Branco, AM Thomas & Py-Daniel (2008) Microlepidogaster dimorpha Bacia do alto rio Paraná, MG Martins & Langeani (2011) Microlepidogaster longicolla Bacia do alto rio Paraná, DF Calegari & Reis (2010) Neblinichthys brevibracchium Bacia do rio Essequibo, Guiana Taphorn et al. (2010) Neblinichthys echinasus Bacia do rio Essequibo, Guiana Taphorn et al. (2010) Neblinichthys roraima Rio Caroni, Venezuela Taphorn et al. (2010) Otocinclus batmani Bacia do alto rio Amazonas, Colômbia e Peru Lehmann-A. (2006) Otothyropsis piribebuy Rio Piribebuy, Paraguai Calegari et al. (2011) Pareiorhaphis nasuta Rio Matipó, bacia do rio Doce, MG Pereira et al. (2007) Pareiorhaphis scutula Rio Piracicaba, MG Pereira et al. (2010) Parotocinclus arandai Bacias dos rios Jucuruçu e Buranhém, MG e BA Sarmento-Soares et al. (2009) Pterygoplichthys weberi Rios Marañon e Ucayali e alto Amazonas, Colômbia, Armbruster & Page (2006) Equador e Peru Rhinolekos britskii Drenagens do rio Paranaíba, GO Martins & Langeani (2011) Rhinolekos garavelloi Tributário do rio Paranaíba, GO Martins & Langeani (2011) Rhinolekos schaefer Tributário do rio Paranaíba, GO Martins & Langeani (2011) Rineloricaria daraha Rio Daraá, AM Py-Daniel & Fichberg (2008) Rineloricaria langei Bacia do rio Iguaçu, PR Ingenito et al. (2008) Rineloricaria maacki Bacia do rio Iguaçu, PR Ingenito et al. (2008) Rineloricaria osvaldoi Rio Vermelho, bacia do Araguaia, GO Fichberg & Chamon (2008)

Família Pimelodidae Megalonema amaxanthum Bacia Amazônica Lundberg & Dahdul (2008) Megalonema orixanthum Bacia do rio Orinoco, Colômbia Lundberg & Dahdul (2008) Pimelodus britskii Rio Iguaçu, PR e SC Garavello & Shibatta (2007) Pimelodus micróstoma Alto rio Paraná, SP Ribeiro & Lucena (2007) Pimelodus multicratifer Bacia do rio Ribeira do Iguape, SP Ribeiro et al. (2011) Pimelodus pohli Bacia do rio São Francisco, MG e BA Ribeiro & Lucena (2006) Propimelodus araguayae Médio rio Araguaia, MT Rocha et al. (2007)

Família Pseudopimelodidae Cruciglanis pacifici Bacias dos rios Dagua e Anchicayá, Colômbia Ortega-Lara & Lehmann-A. (2006) Microglanis carlae Bacia do rio Paraguai, Paraguai Alcaraz et al. (2008) Microglanis pataxo Bacias do rio Peruípe, rio Jucuruçu e rio Cahy, BA Sarmento-Soares et al. (2006a) PPGGBC Família Scoloplacidae Scoloplax baskini Tributários do rio Aripuanã, AM Rocha et al. (2008)

Família Trichomycteridae Glaphyropoma spinosum Cavernas, Chapada Diamantina, BA Bichuette et al. (2008) Ituglanis cahyensis Bacia do rio Cahy, BA Sarmento-Soares et al. (2006b) Ituglanis mambai Caverna Lapa do Sumidouro, GO Bichuette & Trajano (2008) Trichogenes claviger Bacia do rio Itapemirim, ES Pinna et al. (2010) Trichomycterus caipora Bacia do rio Macabu, RJ Lima et al. (2008) Trichomycterus igobi Bacia do rio Iguaçu, PR Wosiacki & Pinna (2008) Trichomycterus payaya Bacia do alto rio Itapicuru, BA Sarmento-Soares et al. (2011) Trichomycterus uisae Caverna El Misterio, Colômbia Castellanos-Morales (2008)

27

É igualmente importante ressaltar que a biodiversidade não inclui somente o número de espécies de um determinado local, mas também o conjunto de variabilidade ecológica e genética (Solé-Cava, 2001). O seu adequado inventário depende, dentre outras coisas, da resolução de incertezas taxonômicas, pois um organismo classificado como amplamente distribuído pode compor um complexo de várias espécies, levando ao aumento dos níveis de biodiversidade (Frankham et al., 2008). De acordo com a IUCN (Organização Internacional para a Conservação), a necessidade de conservar a diversidade genética é uma das três prioridades globais de conservação, pois a perda dessa variabilidade reduz a habilidade adaptativa das populações às mudanças ambientais. Dessa forma, os dados genéticos contribuem para a resolução de tais incertezas, evitando a mistura de espécies, subespécies ou de populações adaptadas a ambientes distintos e possibilitam o delineamento de unidades de manejo (Frankham et al., 2008).

2.3 A ordem Perciformes Os Perciformes constituem a maior ordem entre os vertebrados, compreendendo 20 subordens, 160 famílias, cerca de 1.540 gêneros e, aproximadamente, 10.033 espécies. Três subordens, Percoidei, Labroidei e Gobioidei, correspondem a 75% das espécies, e as oito maiores famílias são: Gobiidae, Cichlidae, Serranidae, Labridae, Blenniidae, Pomacentridae, Apogonidae e Sciaenidae, que, juntas, correspondem a 5.479 ou 55% dos peixes dessa ordem (Nelson, 2006, Helfman et al., 2009). Considerada como a mais representativa e diversificada dentro da ictiofauna mundial, a ordem Perciformes ocupa quase todos os ambientes aquáticos, sendo mais freqüente (aproximadamente 80%) nos mares e oceanos (Brum & Galetti Jr., 1997). Este grupo é ecologicamente e morfologicamente diverso, apresentando padrões de cores fascinantes que tornam as espécies de pequeno porte muito atraentes para os aquariofilistas e as de grande porte como importantePPGGBC fonte de alimentação e pesca esportiva (Axelrod, 1996). Apesar da enorme diversidade de espécies, pouco se sabe sobre a história evolutiva dos Perciformes. Os registros fósseis mais antigos datam de 85 milhões de anos, com a maioria das famílias atualmente extintas surgindo posteriormente, durante o Eoceno-Mioceno. A escassez dos dados paleontológicos dos Perciformes contrasta com a riqueza de espécies atuais e indica que a ordem sofreu intensa radiação durante os últimos cinco milhões de anos (Arratia et al., 2004). A extensa radiação dos Perciformes quando comparados com outros teleósteos torna a classificação dos membros dessa ordem instável e sujeita a modificações constantes. De fato, a maioria das famílias de Perciformes não apresenta caracteres 28

sinapomórficos que sustentem o seu monofiletismo, sendo a ordem considerada um grupamento artificial (Nelson, 2006). Contrastando com a diversificação morfológica, análises de DNA mitocondrial baseadas em seqüências do gene do citocromo b de Perciformes tipicamente marinhos sugerem que o ancestral comum da ordem estava presente há 150 milhões de anos atrás e que as taxas evolutivas (baseadas em substituição de bases) nesse grupo são bem inferiores àquelas encontradas em mamíferos (Cantatore et al., 1994). Enquanto estudos com microssatélites corroboram a evolução conservada entre alguns grupos de Perciformes, com conservação de locos entre diferentes espécies (Zardoya et al., 1996), outros autores encontraram rápidas taxas de evolução molecular em certas famílias, como os ciclídeos da região neotropical (Farias et al., 1999, 2000 e 2001).

2.4 A família Cichlidae Cichlidae é a segunda maior família dentro de Perciformes e uma das mais ricas entre os vertebrados, com mais de 3.000 espécies válidas (Salzburger & Meyer, 2004). As estimativas precisas sobre tal número são dificultadas pelas diferentes definições taxonômicas, ausência de descrições e sinonímias (Nelson, 2006). Os ciclídeos são nativos das Américas Central e do Sul, Antilhas, África, Madagascar, Israel, Síria, Costa Indiana e Sri Lanka (Chakrabarty, 2004; Nelson, 2006), compreendendo grupos de peixes bem conhecidos como os acarás, apaiaris, tucunarés e tilápias. Nativos de áreas tropicais, eles ocorrem em água doce e, ocasionalmente, em água salobra. Em geral, são extremamente adaptáveis a habitats de condições extremas, apesar de preferirem ambientes lênticos (Feldberg et al., 2003). Os ciclídeos são considerados peixes de água doce secundários, ou seja, constituem um clado que evoluiu a partir de grupos marinhos (Feldberg et al., 2003). Seus fósseis mais antigos datam doPPGGBC Eoceno na América do Sul e do Oligoceno na África, os quais já apresentavam especializações no número de dentes similares às espécies atuais. Assim, acredita-se que o grupo tenha surgido ainda no Cretáceo e se diferenciado anteriormente à fragmentação da Gondwana há mais de 100 milhões de anos (Stiassny, 1987; Nelson, 2006). O centro de biodiversidade dessa família se localiza nos lagos Victoria, Malawi e Tanganika (vale do Rift, África oriental), onde são descritas cerca de 2.000 espécies, frente às 450 descritas no continente Americano (Salzburger & Mayer, 2004). De fato, os ciclídeos desses lagos africanos representam a mais espetacular radiação observada entre os vertebrados 29

(Turner, 2007), onde em cerca de 10 milhões de anos surgiram quase 2.000 espécies a partir de um único ancestral comum (Kocher, 2004). O grande sucesso evolutivo dos ciclídeos, com taxas de especiação extremamente rápidas, é atribuído a diversos fatores (Thompson, 1979). Um deles é a especialização anatômica, sobretudo a organização peculiar da mandíbula faringeal, uma sinapomorfia compartilhada por todos os ciclídeos (Liem, 1980). Acredita-se que ela tenha permitido que a mandíbula oral se tornasse mais especializada para a captura de alimentos (Turner, 2007). Desse modo, as mandíbulas são extremamente versáteis e adaptáveis a ponto de mudarem de forma até mesmo durante o ciclo de vida do mesmo indivíduo (Meyer, 1990). O segundo fator relaciona-se com o comportamento reprodutivo sofisticado e, em particular, com os vários modos de cuidado parental, incluindo a confecção de ninhos e a proteção de ovos e juvenis (Goodwin et al., 1998; Kornfield & Smith, 2000; Kocher, 2004). Os complexos hábitos reprodutivos das espécies dessa família podem ser divididos em duas formas gerais: (1) papel exclusivo das fêmeas em carregar os ovos fecundados ou os ovos recém-eclodidos na boca, hábito geralmente reconhecido em espécies polígamas, e (2) indivíduos monógamos em que ambos os sexos podem cuidar dos ovos e prole. Ainda existem algumas espécies que combinam ambos os métodos, depositando e protegendo os ovos no substrato, mas com desenvolvimento das larvas recém-eclodidas na boca da fêmea. Essa incubação oral é comum e parece ter surgido independentemente em vários grupos de ciclídeos (Nelson, 2006). Outros estudos sugerem que a seleção sexual também desempenhou um papel importante na evolução dos ciclídeos (Seehausen & Van Alphen, 1999; Danley & Kocher, 2001). Esse aspecto é particularmente discutido na especiação de alguns ciclídeos simpátricos dos lagos africanos, como os Haplochromini. Nessa tribo, há evidências de comunicação por meio de sinais olfatórios e acústicos durante a corte que podem determinar o isolamento reprodutivo e a existência de espéciesPPGGBC crípticas na aparência, mas diferenciadas pela produção de sons ou odores distintos (Turner, 2007). Apesar de serem menos expressivos em número de espécies quando comparados aos ciclídeos africanos, os ciclídeos neotropicais são extremamente variados em morfologia, comportamento e adaptações relacionadas a estratégias tróficas ou à vida em condições ambientais especiais (Lowe-McConnell, 1991; Nelson, 2006). Desde 1906, já foram descritas 400 espécies de ciclídeos neotropicais, incluindo seis novas espécies e três novos gêneros (Kullander, 2003), o que corresponde a cerca de 6 a 10% das espécies dessa região (Keenleyside, 1991). 30

As espécies sulamericanas de ciclídeos apresentam, em geral, ampla distribuição geográfica em ambientes lênticos, com exceção de algumas espécies reofílicas dos gêneros Retroculus, Crenicichla e Teleocichla. Alimentam-se de invertebrados, peixes e/ou plantas (Lowe-McConnell, 1991; Kullander, 2003) e não possuem um período especifico para reprodução, com mais de uma geração anual, sendo possível a fixação de novas combinações genéticas (Oliveira et al., 2009). O fato de serem territorialistas permite que populações permaneçam isoladas dentro de uma mesma bacia ou rio, favorecendo assim processos de especiação (Martins-Santos et al., 1995). A capacidade adaptativa dos ciclídeos (Kocher, 2004), combinada à sua rápida especiação e exuberante diversidade, justifica o crescente interesse em estudos de evolução e filogenia nesse grupo (Liem, 1991; Kocher, 2004; Hulsey, 2006). Atualmente, a monofilia dos ciclídeos é aceita por vários autores e corroborada por estudos baseados em dados morfológicos e moleculares (Kullander, 1998; Farias et al., 1999, 2000, 2001; Sparks & Smith, 2004; Smith et al., 2008). Contudo, o consenso em relação aos gêneros e subfamílias reconhecidos na família ainda não foi alcançado (Nelson, 2006), conforme apresentado a seguir. A filogenia da família Cichlidae proposta por Kullander (1998), baseada em caracteres morfológicos, posiciona os Etroplinae (ciclídeos indianos e de Madagascar) e os Pseudocrenilabrinae (ciclídeos africanos e do Oriente Médio) como intimamente relacionados, formando um grupo irmão de todos os ciclídeos. Os ciclídeos sulamericanos estariam subdivididos em cinco subfamílias: Retroculinae, Cichlinae, Astronotinae, Geophaginae e Cichlasomatinae. Por outro lado, análises filogenéticas posteriores baseadas em genes mitocondriais, nucleares e caracteres morfológicos, indicam que os ciclídeos podem ser subdivididos em quatro subfamílias: (1) Etroplinae (ciclídeos de Madagascar e sul da Ásia – Índia e Sri Lanka), (2) PtychochrominaePPGGBC (ciclídeos dos gêneros Oxylapia, Ptychochromis e Ptychochromoides endêmicos de Madagascar), (3) Cichlinae (espécies americanas) e (4) Pseudocrenilabrinae (ciclídeos africanos), esta última dividida em três grandes grupos: (1) Pelmatochromine, (2) Haplochromine e (3) Tilapiine (Sparks & Smith, 2004). Essa subdivisão é também informativa do ponto de vista biogeográfico, sendo congruente com as hipóteses de fragmentação da Gondwana (Sparks & Smith, 2004), a saber: separação do continente Madagascar-Índia da África entre 165-121 milhões de anos atrás, separação da África e América do Sul há 101-86 milhões de anos, e separação de Madagascar e Índia há 88-63 milhões de anos (Pitman et al., 1993). 31

Em concordância com tais dados, os ciclídeos do sul da Ásia e Madagascar são parafiléticos, sendo Etroplinae o grupo irmão de todos os ciclídeos, enquanto Ptychochrominae seria o grupo irmão do clado monofilético formado pelas espécies da África (Pseudocrenilabrinae) e região neotropical (Cichlinae) (Sparks & Smith, 2004). Apesar dos grupos irmãos de Madagascar e Índia serem os mais antigos a divergirem, dados moleculares e morfológicos indicam poucas espécies basais em suas linhagens parafiléticas, ao contrário do que ocorre nas Américas e na África, especialmente dentro dos grandes lagos do vale do Rift (Farias et al., 1999, 2000, 2001; Sparks & Smith, 2004; Azuma et al., 2008). Uma análise filogenética dos Cichlidae neotropicais utilizando sequências do gene mitocondrial do RNAr 16S demonstrou que eles formam um grupo monofilético, tendo Retroculus como gênero basal. Curiosamente, as espécies americanas apresentam níveis significativamente maiores de variação genética que as africanas, apesar do menor número de espécies. Tal evidência sugere que as linhagens do Novo Mundo apresentam origens mais antigas ou passaram por taxas menores de extinção, preservando algumas características plesiomórficas e acumulando maiores níveis de divergência genética em algumas linhagens (Farias et al., 2000). Posteriormente, uma nova filogenia, baseada nos genes mitocondriais e nucleares combinada com análise de caracteres morfológicos foi estabelecida para 90 gêneros terminais, incluindo todos os neotropicais e as principais linhagens de ciclídeos (Smith et al., 2008), resultando numa filogenia bem apoiada e resolvida até o nível de gênero para os grupos neotropicais. Nesse trabalho, os ciclídeos americanos foram incluídos em uma única subfamília, Cichlinae (Figura 5), formando um grupo monofilético. Esta subfamília foi dividida em sete tribos: Astronotini, Chaetobranchini, Cichlasomatini, Cichlini, Geophagini, Heroini e Retroculini, sendo Chaetobranchini e Geophagini (incluindo o gênero Crenicichla) um grupo irmão de Heroini e Cichlasomatini (incluindo Acaronia). Astronotini, uma tribo monogenérica, foiPPGGBC recuperada como o grupo irmão de Chaetobranchini, Geophagini, Heroini e Cichlasomatini. Finalmente, um clado composto por Cichlini e Retroculini surge como o grupo irmão de todos os Cichlinae. 32

PPGGBC Figura 5. Filogenia da família Cichlidae a partir de dados morfológicos e de sequências de DNA de nove genes mitocondriais e nucleares (Smith et al., 2008).

Ao contrário da especiação predominantemente intralacustre desencadeada por seleção sexual e especialização trófica dos ciclídeos africanos, a especiação nos ciclídeos neotropicais ocorreu provavelmente por vicariância e alopatria, resultante de forças geológicas como a captura de cabeceiras e divisão de bacias (Kullander, 1983). Dentre elas, destacam-se o desenvolvimento dos Andes, acompanhado de transgressões e regressões marinhas e a formação do moderno fluxo oeste-leste dos rios Amazonas e Orinoco, proporcionando 33

eventos para a especiação e enriquecimento do grupo (Lundberg et al., 1998). Alguns estudos ainda sugerem que a especiação desse grupo também foi favorecida pela radiação adaptativa, com variações ecomorfológicas, especialmente em algumas tribos da América Central (López-Fernández et al., 2005). Entre as tribos de ciclídeos sulamericanos, destaca-se a Geophagini, amplamente distribuída por toda América do Sul, exceto no Chile (Mattos, 2010). Os membros dessa tribo representam parcela significativa da biodiversidade dos ciclídeos neotropicais, contabilizando 18 gêneros, sendo Geophagus o gênero-tipo, e mais de 180 espécies (Kullander, 2003), com muitas ainda a descrever (Weidner, 2000). López-Fernández et al. (2005) confirmaram que a tribo Geophagini (citada pelos autores como subfamília Geophaginae) é um grupo monofilético. Porém, a acentuada divergência morfológica, ecológica e comportamental da tribo sugere que a divergência seja resultante de radiação adaptativa, ou seja, da diversificação de uma espécie ou tipo ancestral único em várias formas que são adaptativamente especializadas para um nicho específico (López-Fernández et al., 2005). Embora a grande maioria das espécies de Geophagini apresente um lóbulo carnoso epibraquial no primeiro arco branquial (Kullander, 1998), a tribo não é diagnosticada por estados de caracteres morfológicos derivados e exclusivos. Alguns grupos se afastam significativamente do plano geral da tribo, como aqueles que passaram por redução corporal, os denominados ciclídeos anões (gêneros Apistogramma, Biotoecus, ), possivelmente envolvendo uma mudança na estrutura alimentar extremamente adaptada para a peneiração do substrato em busca de invertebrados. Outros possuem corpo alongado com hábito alimentar predatório, como as espécies piscívoras do gênero Crenicichla (López- Fernández & Taphorn 2004). Não por acaso, a composição genérica de Geophagini é controversa devido à inclusão de Crenicichla, defendida por estudos moleculares (Farias et al., 1999, 2000, 2001;PPGGBC López–Fernandez et al., 2005; Smith et al., 2008), contrariando a exclusão do gênero por estudos morfológicos (Kullander, 1998). A maioria dos Geophagini é encontrada em águas rasas, claras ou escuras, com fundos lodosos ou arenosos, em climas tropicais e subtropicais da América do Sul (Lowe-McConnell, 1991; Weidner, 2000). Dentro deste tipo geral de habitat, no entanto, há uma variação extensa de componentes físico-químicos acompanhada por adaptações específicas nos organismos (Mattos, 2010). A biologia reprodutiva e o cuidado parental desse grupo incluem inúmeras combinações de estratégias, com alto investimento reprodutivo (Winemiller & Taphorn 1989; Winemiller & 34

Rose, 1993). Típicos pares monogâmicos com substrato de desova são encontrados em várias espécies (Weidner, 2000). Ambos os progenitores em “Geophagus” brasiliensis, tomam tanto os ovos ou larvas em sua boca para a incubação (Weidner 2000; López-Fernández & Taphorn 2004). Espécies de "Geophagus" steindachneri são polígamos, e os ovos são fertilizados após a fêmea levá-los em sua boca (Weidner, 2000). Os Geophagini anões podem ser monogâmicos (Biotoecus) ou polígamos formando haréns (Apistogramma) (Barlow, 2000). punctulatum é uma espécie em que a estrutura social pode influenciar a mudança de sexo (Carruth, 2000). Um fenômeno comum observado na história da taxonomia de Geophagini é a descrição de gêneros e espécies com distribuição ampla, às vezes abrangendo quase toda a América do Sul, como o ocorrido para o gênero Geophagus. Entretanto, trabalhos taxonômicos recentes revelam que estes gêneros e espécies amplamente distribuídas incluem um grande número de táxons não identificados (Kullander, 1983; 1986; López-Fernández & Taphorn, 2004, Mattos, 2010). Um exemplo desse equívoco é o complexo “Geophagus” surinamensis, tratado inicialmente como amplamente distribuído ao longo do Amazonas e Orinoco e drenagens das Guianas. Revisões recentes em coleções de museus e a exploração de lugares onde os espécimes ainda não haviam sido amostrados revelaram diversidade adicional, com muitas espécies já conhecidas no comércio aquariófilo, mas ainda não descritas (López-Fernández & Taphorn, 2004). De fato, o gênero Geophagus constitui o melhor arquétipo da diversidade taxonômica da tribo, exibindo ampla variabilidade morfológica, ecológica e reprodutiva. A denominação desse gênero advém do hábito de suas espécies abocanharem constantemente o substrato, principalmente durante a alimentação, na procura por presas enterradas, ou como parte do comportamento reprodutivo, através da escavação e modelação de ninhos (Mattos, 2010). Esses peixes geralmentePPGGBC são bentófagos com estrutura facial bem adaptada ao método de alimentação por peneiração do substrato. Seu aparelho branquial lhes permite facilmente separar a areia não comestível dos alimentos, ou seja, areia ou lama são expelidos através das aberturas operculares enquanto as partículas de alimento são ingeridas (Mattos, 2010). Outras características morfológicas, tais como o corpo ventralmente achatado, e a posição relativamente dorsal dos olhos também são indicativos desse tipo de adaptação alimentar (Winemiller et al., 1995). Na região sudeste, as espécies desse gênero são conhecidas pelos nomes de cará, acará- topete, acará-azul, caraúna, papaterra, enquanto no nordeste brasileiro são também 35

denominados como berés. A criação desse gênero ocorreu em 1840 por Heckel, que incluiu nele as espécies: Geophagus megasema, Geophagus deamon, Geophagus jurupari, Geophagus acutticeps, Geophagus pappaterra, Geophagus cupido e Geophagus altifrons (Mattos, 2010). Em 1975, Gosse realizou uma revisão taxonômica no gênero Geophagus, dividindo-o em vários gêneros com base no número de ossos supraneurais e criando os gêneros Biotodoma e Gymnogeophagus. Essa definição foi posteriormente revisada por Kullander (1986), que ressuscitou o gênero Satanoperca como distinto de Geophagus e restringiu esse último às espécies que compartilham costelas epipleurais ao longo das vértebras caudais associadas com expansões da bexiga natatória e maior número de vértebras caudais que abdominais. De acordo com essa nova definição, algumas espécies formalmente descritas como Geophagus que não apresentam tais características foram excluídas, permanecendo até hoje como incertae sedis. Estas espécies parecem fazer parte de dois gêneros distintos, sendo tratadas como “Geophagus” brasiliensis e “Geophagus” steindachneri, as quais distinguem dos representantes de Geophagus stricto sensu (Kullander, 1986). Em geral, as atribuições genéricas de Kullander têm sido corroboradas por análises filogenéticas recentes em Geophagini (Kullander 1998; Farias et al., 1999, 2000, 2001, Lopéz-Fernándes et al., 2005). Esses autores adotaram a proposta de Kullander, colocando o nome do gênero entre aspas. Nesses estudos, o monofiletismo do gênero vem sendo contestado por análises filogenéticas baseadas em dados morfológicos e moleculares. Geralmente esse gênero é recuperado como polifilético quando “Geophagus” brasiliensis e “Geophagus” steindachneri são incluídos nas análises (Kullander, 1998; Farias et al., 2001; López-Fernández et al., 2005). Infelizmente, nenhum destes trabalhos posteriores teve como objetivo solucionar a problemática do gênero, mas visaram à filogenia da subfamília Cichlinae (Farias et al., 1999, 2000, 2001) ou da tribo Geophagini (citada como subfamília Geophaginae) (LópezPPGGBC–Fernandez et al., 2005). Porém, o estudo realizado por Smith et al (2008) na subfamília Cichlinae, baseado em dados moleculares e morfológicos de 90 táxons terminais, Geophagus foi recuperado como um grupo monofilético, através da verificação de um clado onde “Geophagus” brasiliensis é o grupo irmão do clado incluindo Geophagus stricto sensu e “Geophagus” steindachneri. A necessidade de revisão taxonômica em Geophagus é também reforçada à medida que muitos dos ciclídeos anteriormente incluídos nesse gênero foram realocados para outros gêneros da tribo Geophagini, tais como Acarichthys, Apistogramma, Biotodoma, Chaetobranchus, Gymnogeophagus e Satanoperca (Tabela 2). Além disso, entre 2004 e 2010, 36

foram descritas mais 15 espécies de Geophagus além de várias que aguardam descrição científica, como Geophagus sp. “orange head” e outros exemplares bem conhecidos no comércio aquarista (López-Fernández & Taphorn, 2004). Atualmente, o gênero Geophagus é composto por 32 espécies, divididas em três grupos, Geophagus stricto sensu, complexo “Geophagus” brasiliensis e complexo “Geophagus” steindachneri (Tabela 2).

Tabela 2. Espécies válidas e já descritas no gênero Geophagus, atualizada de Kullander (2003). Nomes válidos atualmente Primeira descrição Acarichthys heckelii (Müller & Troschel, 1849) Geophagus thayeri (Steindachner, 1875) Apistogramma agassizii (Steindachner, 1875) Geophagus (Mesops) agassizii (Steindachner, 1875) Biotodoma cupido (Heckel, 1840) Geophagus cupido (Heckel, 1840) Biotodoma wavrini (Gosse, 1963) Geophagus wavrini (Gosse, 1963) Chaetobranchus flavescens (Heckel, 1840) Geophagus badiipinnis (Cope, 1872) Geophagus abalios (López-Fernández & Taphorn, 2004)* Geophagus abalios (López-Fernández & Taphorn, 2004) Geophagus altifrons (Heckel, 1840)* Geophagus altifrons (Heckel, 1840) Geophagus argyrostictus (Kullander, 1991)* Geophagus argyrostictus (Kullander, 1991) Geophagus brachybranchus (Kullander & Nijssen, 1989)* Geophagus brachybranchus (Kullander & Nijssen, 1989) Geophagus brasiliensis (Quoy & Gaimard, 1824)** Chromis brasiliensis (Quoy & Gaimard, 1824) Geophagus brasiliensis (Kner, 1865)

Chromys unimaculata (Castelnau, 1855)

Chromys unipunctata (Castelnau, 1855)

Acara gymnopoma (Günther, 1862)

Acara minuta (Hensel, 1870)

Geophagus iporangensis (Haseman, 1911)

Geophagus brokopondo (Kullander & Nijssen, 1989)* Geophagus brokopondo (Kullander & Nijssen, 1989) Geophagus camopiensis (Pellegrin, 1903)* Geophagus camopiensis (Pellegrin, 1903) Geophagus crassilabris (Steindachner, 1876)*** Geophagus (Satanoperca) crassilabris (Steindachner, 1876) Geophagus dicrozoster (López-Fernández & Taphorn, 2004)* Geophagus dicrozoster (López-Fernández & Taphorn, 2004) Geophagus gottwaldi (Schindler & Staeck, 2006)* Geophagus gottwaldi (Schindler & Staeck, 2006) Geophagus grammepareius (Kullander & Taphorn, 1992)* Geophagus grammepareius (Kullander & Taphorn, 1992) Geophagus harreri (Gosse, 1976)* Geophagus harreri (Gosse, 1976) Geophagus itapicuruensis (Haseman, 1911)** Geophagus brasiliensis itapicuruensis (Haseman, 1911) Geophagus megasema (Heckel,PPGGBC 1840)* Geophagus megasema (Heckel, 1840) Geophagus neambi (Lucinda, Lucena & Assis, 2010)* Geophagus neambi (Lucinda, Lucena & Assis, 2010) Geophagus obscurus (Castelnau, 1855)** Chromys obscura (Castelnau, 1855) Geophagus parnaibae (Staeck & Schindler, 2006)* Geophagus parnaibae (Staeck & Schindler, 2006) Geophagus pellegrini (Regan, 1912)*** Geophagus pellegrini (Regan, 1912) Geophagus proximus (Castelnau, 1855)* Chromys proxima (Castelnau, 1855) Geophagus sp. n. 1** Geophagus sp. n. 1 (Mattos, 2010) Geophagus sp. n. 2** Geophagus sp. n. 2 (Mattos, 2010) Geophagus sp. n. 3** Geophagus sp. n. 3 (Mattos, 2010) Geophagus sp. n. 4** Geophagus sp. n. 4 (Mattos, 2010) Geophagus sp. n. 5** Geophagus sp. n. 5 (Mattos, 2010) Geophagus sp. n. 6** Geophagus sp. n. 6 (Mattos, 2010) 37

Geophagus sp. n. 7** Geophagus sp. n. 7 (Mattos, 2010) Geophagus sp. n. 8** Geophagus sp. n. 8 (Mattos, 2010) Geophagus steindachneri (Eigenmann & Hildebrand, 1910)*** Geophagus steindachneri (Eigenmann & Hildebrand, 1910) Geophagus magdalena (Brind, 1943)

Geophagus hondae (Regan, 1912)

Geophagus surinamensis (Bloch, 1791)* Sparus surinamensis (Bloch, 1791) Sparus trimaculatus (Shaw e Nodder, 1809)

Geophagus sveni (Lucinda, Lucena & Assis, 2010)* Geophagus sveni (Lucinda, Lucena & Assis, 2010) Geophagus taeniopareius (Kullander & Royero, 1992)* Geophagus taeniopareius (Kullander & Royero, 1992) Geophagus winemilleri (López-Fernández & Taphorn, 2004)* Geophagus winemilleri (López-Fernández & Taphorn, 2004) Gymnogeophagus australis (Eigenmann, 1907) Geophagus australe (Eigenmann, 1907) Gymnogeophagus balzanii (Perugia, 1891) Geophagus duodecimspinosus(Boulenger, 1895) Geophagus balzanii (Perugia, 1891)

Gymnogeophagus gymnogenys (Hensel, 1870) Geophagus pygmaeus (Hensel, 1870) Geophagus gymnogenys (Hensel, 1870)

Geophagus camurus (Cope, 1894)

Gymnogeophagus labiatus (Hensel, 1870) Geophagus bucephalus (Hensel, 1870) Geophagus scymnophilus (Hensel, 1870)

Geophagus labiatus (Hensel, 1870)

Gymnogeophagus rhabdotus (Hensel, 1870) Geophagus brachyurus (Cope, 1894) Geophagus rhabdotus (Hensel, 1870)

Satanoperca acuticeps (Heckel, 1840) Geophagus acuticeps (Heckel, 1840) Satanoperca daemon (Heckel, 1840) Geophagus daemon (Heckel, 1840) Satanoperca jurupari (Heckel, 1840) Geophagus jurupari (Heckel, 1840) Satanoperca leucosticta (Müller & Troschel, 1849) Geophagus leucostictus (Müller & Troschel, 1849) Satanoperca mapiritensis (Fernández-Yépez, 1950) Geophagus mapiritensis (Fernández-Yépez, 1950) Satanoperca pappaterra (Heckel, 1840) Geophagus pappaterra (Heckel, 1840) Species inquirenda Geophagus amoenus (Cope, 1872) *espécies de Geophagus sensu stricto, **espécies do complexo “Geophagus brasiliensis”, ***espécies do complexo “Geophagus” steindachneri

O gênero tem uma distribuição trans-andina, com o Lago de Maracaíbo sendo o limite mais oriental de distribuição. Somente duas espécies do grupo "Geophagus" steindachneri (Geophagus pellegrini e Geophagus crassilabris) chegam à porção sul do Panamá. Geophagus sensuPPGGBC stricto (18 espécies descritas) é encontrado em três grandes regiões: na Amazônia, no Orinoco (Venezuela/Colômbia) e na região das Guianas e Suriname. O grupo "Geophagus" brasiliensis (11 espécies, incluindo as descritas por Mattos, 2010) é restrito às drenagens atlânticas do Brasil e do Uruguai. (Kullander, 2003). Apesar das espécies do complexo “Geophagus” brasiliensis ainda se encontrarem dentro do clado Geophagus, são facilmente distinguíveis dos demais Geophagus. Assim como as demais espécies do gênero, elas ocorrem em simpatria com outros grupos de ciclídeos, mas são extremamente territorialistas e descritas como as mais agressivas de todos os representantes de Geophagus. Geralmente se distribuem em grandes grupos e tendem a 38

formar uma hierarquia de dominância perceptível. Quando mantidos em aquários, observa-se que os indivíduos menores podem se tornar alvo de abuso excessivo por indivíduos dominantes ou o grupo pode não se resolver, comportando-se agressivamente (Kadry &

Barreto, 2010). As espécies desse complexo também parecem ser mais adaptáveis a uma variada gama de parâmetros físico-químicos (Mattos, 2010). Dependendo do tipo de ambiente, as espécies do complexo “Geophagus” brasiliensis podem apresentar diferenças significativas de coloração e na forma do corpo (Brum et al., 1998). Em rios com correntes fortes, os indivíduos são mais alongados do que os de águas lentas ou paradas. Suas espécies são distribuídas nos biomas das bacias costeiras desde o Sul da Bahia até o Uruguai, além das bacias do Rio São Francisco e Paraná (Kullander, 2003; Mattos, 2010). Dentro das espécies descritas para esse complexo encontram-se: Geophagus brasiliensis, Geophagus iporangensis, Geophagus itapicuruensis e Geophagus obscurus. A espécie Geophagus brasiliensis foi primeiramente descrita a partir de material coletado no Rio de Janeiro, pela expedição científica liderada pelo explorador Louis Claude de Saulces de Freycinet no Brasil, de 1800 a 1804 (Mattos, 2010). Quoy e Gaimard, em 1824, descreveram essa espécie como do gênero Chromis. Somente na obra de Heckel, em 1840, foram criados os gêneros Geophagus e Acara, ambos sem menção a espécie-tipo, delimitada posteriormente, em 1894, por Eigenmann e Bray, como Acara crassipinnis e Geophagus altifrons (Kullander, 2003; López-Fernández & Taphorn, 2004; Mattos, 2010). Heckel alocou Chromis brasiliensis no gênero Acara, proporcionando uma nova combinação genérica para esta espécie. Mais tarde, foi verificado que Acara crassipinnis pertencia ao gênero Astronotus. Consequentemente, o gênero Acara se tornou sinônimo júnior de Astronotus, filogeneticamente distante da tribo Geophagini (Kullander, 2003; Mattos, 2010). Kner em 1865 PPGGBCdescreveu Geophagus brasiliensis, mas não ficou claro se a descrição feita seria uma nova espécie ou uma nova descrição de uma espécie já conhecida sob uma nova combinação, pois a combinação Geophagus brasiliensis ainda não havia sido proposta (Mattos, 2010). Esse nome, Geophagus brasiliensis, tem sido extensamente atribuído a populações diversas que ocorrem em ambientes dulcícolas ou salobros das bacias costeiras do Brasil. Entretanto, essas populações apresentam variações consideráveis tanto no padrão de morfologia externa como em características citogenéticas, sugerindo a existência de um complexo de espécies ainda mais extenso (Brum et al., 1998). 39

Outros nomes para definir as espécies do complexo “Geophagus” brasiliensis já foram propostos como Geophagus obscurus, da bacia do rio Paraguaçu, Geophagus itapicuruensis da bacia do rio Itapicuru, e Geophagus iporangensis, da bacia do Ribeira do Iguape. Porém, nenhuma redescrição ou diagnose havia sido elaborada até um estudo feito por Mattos (2010), que considerou como válidas as espécies Geophagus obscurus e Geophagus itapicuruensis, além de descrever mais oito espécies através de exemplares coletados na costa leste do Brasil, definindo-os como Geophagus sp. n. 1 até Geophagus sp. n. 8. Mattos (2010) em suas análises verificou ainda que Geophagus iporangensis, Chromis brasiliensis, Chromys unimaculata e Chromys unipunctata (considerado anteriormente sinônimo de Geophagus obscurus) são sinônimos de Geophagus brasiliensis. Outros sinônimos que não foram analisados nesse estudo foram: Acara gymnopoma e Acara minuta. (Kullander, 2003). Observa-se a partir dos dados expostos que o complexo “Geophagus” brasiliensis permanece pouco conhecido em sua ampla área de distribuição. As diferenças populacionais assinaladas para esse complexo necessitam ser sistematicamente analisadas para avaliar o seu significado, sendo essa descontinuidade morfológica uma possível evidência de que esse grupo consista de várias espécies. Como observado na Tabela 2, os esforços taxonômicos estão concentrados em espécies de Geophagus stricto senso, à exceção daquelas descritas por Mattos (2010). Contudo, o conhecimento integrado da diversidade morfológica, ecológica e comportamental de todas as espécies do gênero Geophagus, associado a estudos que envolvam marcadores genéticos são peças essenciais para gerar uma imagem coerente do cenário evolutivo desse grupo.

2.5 Aspectos citogenéticos em Cichlidae A citogenética representa uma das formas de medir a diversidade genética, a partir de estudos da constituiçãoPPGGBC cromossômica da célula. O número de cromossomos geralmente é constante entre indivíduos da mesma espécie, sendo eles os responsáveis pela transmissão de informação genética de uma geração para outra (Allendorf & Luikart, 2006). O aprimoramento das técnicas e das preparações citogenéticas em peixes levou ao aumento no número de espécies estudadas e do detalhamento na descrição das suas características cromossômicas, contribuindo para o melhor entendimento da estrutura genética, evolução e sistemática desse grupo (Martins, 2007). Os marcadores cromossômicos aplicados a peixes permitem: caracterizar populações, espécies e grupos supra-específicos; identificar mecanismos de determinação sexual, cromossomos supranumerários e casos de poliploidia; 40

analisar regiões organizadoras de nucléolos (RON) e heterocromáticas; e mapear fisicamente seqüências específicas do DNA através da hibridação fluorescente in situ (FISH) (Artoni et al., 2000). No caso dos peixes da família Cichlidae, os estudos genéticos têm crescido expressivamente nas últimas décadas. Porém, estes dados podem ser considerados escassos frente ao número de espécies. Além disso, as análises citogenéticas para grande parte das espécies analisadas relatam apenas o número diplóide e fundamental, com poucos trabalhos usando metodologias mais refinadas, como a hibridação com sondas de DNA (Feldberg et al., 2003). Um total de 135 espécies de ciclídeos já foi estudado citogeneticamente, sendo 106 na subfamília Cichlinae, 27 em Pseudocrenilabrinae e dois em Etroplinae. Nenhuma descrição cariotípica para as espécies de Ptychochrominae está disponível. Os dados obtidos sugerem que a distribuição do número diplóide corresponde com a distribuição geográfica da família, com os ciclídeos africanos apresentando número modal de 2n=44, enquanto as espécies da região neotropical apresentam 2n=48, com exceções (Feldberg et al., 2003). Os ciclídeos são considerados um grupo de macroestrutura cromossômica conservada (Thompson, 1979; Feldberg & Bertollo, 1985; Vicari et al., 2006), uma vez que mais da metade das espécies analisadas (60%) apresentam número diplóide igual a 48 e predominância de cromossomos com um braço (acrocêntricos). Esse padrão aponta para uma estase na evolução cariotípica da família, visto que 2n=48 acrocêntricos é considerado o cariótipo ancestral para a ordem Perciformes (Thompson, 1979). Ainda com base no cariótipo plesiomórfico para o grupo, a variação cromossômica em Etroplinae (2n=46 a 48) e Pseudocrenilabrinae (2n=32 a 48) sugere que a evolução cromossômica nos dois clados mais basais da família possivelmente ocorreu em duas direções: (1) manutenção do número diplóide de 2n=48 e (2) decréscimo a partir deste número, provavelmente por fusão cromossômica, resultandoPPGGBC na presença de grandes cromossomos metacêntricos e submetacêntricos em várias espécies (Feldberg et al., 2003). Comparados aos Neotropicais, os ciclídeos do Velho Mundo apresentam menos variação cariotípica, tanto em relação ao número diplóide quanto em estrutura cromossômica. Embora em menor grau, as variações nas espécies do continente americano envolvem tanto número diplóide (2n=38 a 60), como número fundamental (NF=44 a 118). Esta última demonstra a acentuada ocorrência de inversões pericêntricas na evolução cariotípica do grupo, particularmente notável nos clados Neotropicais (Feldberg & Bertollo, 1985; Martins-Santos et al., 1995; Brum et al., 1998; Loureiro et al., 2000; Feldberg et al., 2003; Vicari et al., 2006; 41

Roncati et al., 2007; Benzaquem et al., 2008; Bettin-Pires et al, 2008, 2010; Poletto et al., 2010a, 2012a). Contudo, os estudos genômicos, envolvendo principalmente a aplicação de ferramentas moleculares, estão focados em espécies africanas, sobretudo em Oreochromis niloticus (tilápia-do-Nilo), espécie amplamente empregada na aquicultura. Dados sobre a organização e localização de seqüências de DNA e mapeamento genético e físico, visando à construção de bibliotecas genômicas são abundantes nessa espécie com o objetivo de melhorar traços importantes dos estoques pesqueiros. Por exemplo, mapas físicos do genoma de O. niloticus a partir de FISH com sondas de DNAr 5S, 18S, DNA satélite, DNA telomérico, elementos transponíveis, elementos intercalares altamente repetitivos (LINE), além de cromossomos bacterianos artificiais enriquecidos com seqüências de DNA repetitivos (BACs) vem sendo cada vez mais incrementados (Martins et. al., 2004). A partir dessas abordagens, foi evidenciado que os elementos repetitivos em O. niloticus ocorrem preferencialmente na região pericentromérica, com pequenas marcações dispersas por todos os cromossomos. Mas, muitos blocos têm sido evidenciados no primeiro par cromossômico, identificado como o cromossomo sexual dessa espécie (Ocalewicz et al., 2009). Estas descobertas sugerem que DNAs repetitivos tiveram um papel importante na diferenciação dos cromossomos sexuais em tilápia-do-Nilo. O sistema sexual dessa espécie é do tipo XX/XY, sendo sua região determinadora localizada na porção terminal do primeiro par cromossômico. Como os cromossomos sexuais de tilápia são morfologicamente indiferenciados esse mecanismo foi estabelecido por Ocalewicz et al. (2009) a partir de FISH combinada com coloração DAPI sobre o complexo sinaptonêmico de machos de O. niloticus. Nesse estudo, os autores identificaram uma região não emparelhada localizada na parte distal do braço longo do primeiro par cromossômico no paquíteno, provavelmente relacionada com a supressão de recombinação em torno de um loco de determinação do sexo. Estudos adicionaisPPGGBC sobre a determinação do sexo foram realizados em seis espécies estreitamente relacionadas de peixes Tilapiini por Cnaani et al. (2008), com a detecção de sistemas ZZ/ZW e XX/XY. Comparando mapas genéticos e físicos, esses autores demonstraram uma ampla região de supressão de recombinação no lócus de determinação do sexo em fêmeas com sistema ZZ/ZW e revelaram acúmulo de elementos repetitivos nessa região. Com bases nesses resultados e análises filogenéticas, é sugerido que, pelo menos, duas transições no modo de determinação do sexo podem ter ocorrido nesse clado. Adicionalmente, Chew et al. (2002), utilizando sondas de DNA telomérico, revelaram marcações de ITS (interstitial telomeric sequences ou sequências teloméricas intersticiais) no 42

cromossomo sexual da tilápia-do-Nilo. A presença de sinais intersticiais de telômeros inativos no primeiro par cromossômico, reforça a ocorrência de três fusões cromossômicas para explicar a redução do número diplóide basal de 2n=48 para 2n=44 em tilápias. Alterações em seqüências de DNAr 5S que diferiam por inserções e/ou deleções e por substituições de bases dentro do espaçador não-transcrito também foram encontradas em O. niloticus (Martins et al., 2000). Esses autores ressaltam ainda que a presença de pseudogenes no genoma dessa espécie pode ser uma conseqüência da intensa dinâmica de evolução dos elementos de repetição em tandem como o DNAr. Por sua vez, Valente et al. (2011) analisaram a organização genômica dos elementos transponíveis Rex1, Rex3 e Rex6 em tilápias a partir de FISH, revelando que esses elementos estão principalmente compartimentalizados na heterocromatina pericentromérica, embora sinais dispersos ou agrupados em regiões eucromáticas também tenham sido observados. Para os autores, a presença de elementos transponíveis em áreas heterocromáticas estaria correlacionada com o seu papel na organização de estruturas como os centrômeros. Os elementos Rex também foram concentrados no maior par de cromossomos de Oreochromis niloticus. Como anteriormente dito, supõe-se que esse par cromossômico tenha sido originado por fusões, demonstrando o possível envolvimento desses elementos nos rearranjos cromossômicos (Martins et al., 2000; Chew et al., 2002). Por essas razões, Oreochromis niloticus e outras espécies de tilápia constituem um excelente modelo para estudo de evolução cromossômica em peixes e outros vertebrados, especialmente no tangente aos mecanismos de diferenciação sexual. Visando obter maior compreensão da evolução cromossômica em ciclídeos, Ferreira et al. (2010) mapearam comparativamente regiões de DNA satélite, elementos transponíveis e sequências repetitivas em BACs, em cromossomos de uma gama de espécies africanas. O DNA satélite foi mapeado em quase todos os centrômeros nas espécies de Tilapiini e Haplochromini estudadas,PPGGBC sugerindo que a manutenção da distribuição de DNAs satélites em ciclídeos africanos desempenhe um papel importante na organização e função dos centrômeros. Por outro lado, o mapeamento cromossômico comparativo de elementos transponíveis e BACs mostrou que as sequências repetitivas foram mantidas entre tilapiine, haplochromine e hemichromine e foi evidenciada a homologia dos maiores cromossomos entre estes grupos. O mapeamento de elementos transponíveis sugeriu que diferentes rearranjos cromossômicos poderiam ter ocorrido na origem dos maiores pares cromossômicos em Tilapiini e não-Tilapiini (Ferreira et al., 2010), similarmente ao proposto por Chew et al (2002) e Valente et al (2011). 43

Muitas comparações entre genomas de ciclídeos têm sido realizadas para tentar explicar os mecanismos evolutivos que levaram a diferenciação cariotípica entre os clados, baseadas principalmente em hibridização genômica in situ (GISH). Usando essa metodologia, Valente et al (2009) comparou o genoma da espécie Oreochromis niloticus com o genoma de ciclídeos da África e da América do Sul, demonstrando que alguns dos elementos que compõem a heterocromatina pericentromérica de tilápia são espécie-específicos e que as sequências dos braços longos do maior par cromossômico é conservada dentro de Tilapinni. Nessa análise, a espécie Geophagus brasiliensis apresentou bloqueio menos eficaz em relação ao genoma de Oreochromis niloticus, o que pode ser explicado pela alta taxa evolutiva da tribo Geophagini, proposta por estudos moleculares (Farias et al., 1999, 2000, 2001; López– Fernandez et al., 2005). Os genes Sox2 e Sox14 em ciclídeos também foram mapeados para melhor entender a evolução dessa família gênica em vertebrados. A sintenia ancestral de Sox2 e Sox14 é mantida em distintos grupos de vertebrados e aparecem ligados em Etroplinae (Etroplus maculatus) que representa o grupo irmão de todos os ciclídeos. No entanto, estes genes estão localizados em cromossomos diferentes em várias espécies de Pseudocrenilabrinae, clado intimamente relacionado aos Etroplinae, reforçando que alguns grupos de Cichlidae são caracterizadas por taxas elevadas de rearranjos genômicos (Mazzuchelli et al., 2011). Análises usando FISH com sondas ribossomais foram ainda realizadas em outra espécie africana, Astatotilapia latifasciata (Poletto et al., 2010b, 2012b), caracterizada pela presença de cromossomos supranumerários. Nesse estudo, foram verificados sinais de DNAr 5S na região centromérica de 15 cromossomos acrocêntricos, enquanto os genes de DNAr 18S foram identificados em seis sítios nos braços curtos de pequenos pares subtelo/acrocêntricos e em ambas as regiões teloméricas e pericentroméricas dos cromossomos B. Contudo, as regiões de DNAr 18S nos Bs não estavam ativas, pois nenhum sinal por nitrato de prata foi detectado, reforçandoPPGGBC a hipótese de que sejam pseudogenes. Poletto et al (2010b, 2012b) ainda sugeriram que os cromossomos Bs possam ter surgido a partir da quebra de um isocromossomo contendo DNAr 18S, ou por acumulação de DNAs repetitivos em um pequeno proto cromossomo B derivado do complemento A. Entretanto, a despeito do requinte metodológico das análises cromossômicas nos ciclídeos da região africana e deles representarem o grupo mais especioso dentro da família, os estudos cariotípicos e filogenéticos estão mais concentrados nas espécies do grupo neotropical (Kullander, 1998; Farias et al., 1999, 2000, 2001; Sparks & Smith, 2004; Smith et al., 2008). 44

O número diplóide dos ciclídeos neotropicais varia de 38 (Apistograma borellii) (Thompson, 1979) a 60 (Symphysodon aequifasciatus, Symphysodon discus, Symphysodon haraldi) (Thompson,1979; Takai et al., 2002; Mesquita et al., 2008; Gross et al., 2009b, 2010), observado em linhagens derivadas de Geophagini e Cichlasomatini, respectivamente. Em geral, as variações que mantém o número diplóide 2n=48 são atribuídas a mecanismos de rearranjos estruturais, principalmente, inversões pericêntricas, enquanto que aqueles que modificam o número cromossômico são atribuídos a fissões e fusões cêntricas (Brum & Galetti Jr., 1997; Feldberg et al., 2003; Affonso & Galetti Jr., 2005; Mesquita et al., 2008; Gross et al., 2009b). Tais mudanças na macroestrutura cromossômica em algumas linhagens levaram à extensa diversificação cariotípica observada atualmente entre os ciclídeos neotropicais (Poletto et al., 2010a, 2012a). Com base nesses dados, foram sugeridas três direções evolutivas para o clado neotropical: a primeira é caracterizada pela manutenção do cariótipo plesiomórfico ou com poucos cromossomos meta e submetacêntricos, devido principalmente a inversões pericêntricas. Esse padrão é observado nas tribos Cichlini, Astronotini, Geophagini e Cichlasomatini (Feldberg et al., 2003). A segunda inclui um decréscimo no 2n em paralelo a um aumento de cromossomos de dois braços (m/sm), sugerindo fusões cromossômicas e inversões pericêntricas, visível em alguns representantes das tribos Geophagini e Cichlasomatini (Feldberg et al., 2003). O terceiro caminho carioevolutivo resulta de um aumento no número diplóide, com a manutenção de cromossomos acrocêntricos devido a inversões pericêntricas e subseqüentes fissões cêntricas. Essa característica está presente somente em espécies de Symphysodon (acará-disco) na tribo Cichlasomatini. Contudo, esse gênero ainda requer uma análise mais detalhada, pois apresenta um cariótipo incomum tanto para Cichlidae como para Perciformes, incluindo: 2n=60, prevalência de cromossomos meta/submetacêntricos, presença de microcromossomos, RONs múltiplas e grandes blocos de heterocromatina. Essas características colocamPPGGBC os acarás-discos como o grupo mais derivado dentre os ciclídeos (Takai et al., 2002; Feldberg et al. 2003; Mesquita et al., 2008; Gross et al., 2009b, 2010). Entre os Cichlidae neotropicais, existem também descrições de cromossomos B ou supranumerários. Eles foram encontrados primeiramente em células germinativas de testículo de Gymnogeophagus balzanii, mas ausentes nas células somáticas (Feldberg & Bertollo, 1984). Posteriormente, cromossomos supranumerários foram relatados em Geophagus brasiliensis, Cichlasoma paranaensis e Crenicichla niederleinii na forma de corpúsculos de cromatina (Martins-Santos et al., 1995), em Cichla sp., Cichla monoculus e Crenicichla 45

reticulata, com a presença de três microcromossomos (Feldberg et al., 2004) bem como em Bujurquina vittata, com ocorrência de até 14 microcromossomos (Roncati et al., 2007). Como apenas 30% das espécies descritas para ciclídeos possuem dados citogenéticos, alguns ainda com caracterização incompleta, a construção de árvores filogenéticas baseadas em dados citogenéticos torna-se difícil (Fedberg et al., 2003). Contudo, filogenias previamente propostas para a família, com base em morfologia e genética molecular (Kullander, 1998, Farias et al., 2000, Smith et al., 2008) corroboram o posicionamento basal dos gêneros Cichla e Retroculus, os quais apresentam o cariótipo plesiomórfico de 2n=48 acrocêntricos (Thompson, 1979; Feldberg et al., 2003; Poletto et al., 2010a, 2012a). Adicionalmente, baseado em dados moleculares, o gênero Crenicichla foi recentemente retirado da tribo Cichlini e inserido em Geophagini (Smith et al., 2008). Os dados citogenéticos obtidos para o gênero são consistentes com essa hipótese, visto que este apresenta cromossomos meta e submetacêntricos, característica considerada derivada em ciclídeos (Thompson, 1979; Feldberg & Bertollo et al., 1985; Benzaquem et al., 2008; Poletto et al., 2010a, 2012a). Esses resultados reiteram assim a importância das análises cromossômicas nesse tipo de abordagem e demonstram a necessidade de uma caracterização citogenética mais abrangente, com uma amostragem completa dos gêneros, no intuito de tentar esclarecer tais relações. Em relação à distribuição das regiões organizadoras de nucléolos (RONs), a família Cichlidae é predominantemente caracterizada por sistemas simples de RONs, localizadas no maior cromossomo do complemento. Esta característica parece ser um estado plesiomórfico para ciclídeos (Feldberg et al., 2003). Entretanto, a localização desses sítios em outros cromossomos e a presença de RONs múltiplas também já foram observadas em algumas espécies. Exemplificando, na tribo Geophagini, RONs múltiplas são descritas em Crenicichla lepidota (Martins-Santos et al., 1995), Gymnogeophagus gymnogenys (Bettin-Pires et al., 2010) e SatanopercaPPGGBC jurupari (Mendonça et al, 1999). Enquanto nas duas últimas, essas regiões estão localizadas em cromossomos subtelo/acrocêntricos, Crenicichla lepidota apresentou marcações no primeiro par meta/submetacêntrico e no quinto subtelo/acrocêntrico. Em Satanoperca jurupari, ainda é proposta a ocorrência de um sistema de determinação sexual do tipo XX/XY (Oliveira et al, 2009), mas os dados são inconclusivos e aguardam eventual confirmação. Estudos com técnicas de citogenética molecular em ciclídeos neotropicais também já foram realizados, só que em menor escala se comparado aos representantes africanos. Dados de FISH estão disponíveis para Astronotus ocellatus (Mazzuchelli & Martins, 2009), Cichla 46

kelberi (Teixeira et al., 2009), Geophagus brasiliensis (Vicari et al., 2006; Bettin-Pires et al, 2008; Ferreira Neto et al., 2010), Crenicichla lepidota (Perazzo et al., 2011), Biotodoma cupido, Satanoperca jurupari (Poletto et al., 2010a, 2012a) e espécies de Symphysodon (Gross et al., 2009b, 2010). No caso do gênero Symphysodon, dados de bandamento C e FISH com sondas de DNAr 5S e do retrotransposon Rex3 indicaram correlação entre o acúmulo de elementos repetitivos, heterocromatinização e rearranjos cromossômicos (Gross et al., 2009b). Os resultados encontrados também serviram para explicar a origem da variabilidade fenotípica e genética encontrada em populações selvagens de acará-disco. Paralelamente, análises meióticas conduzidas em exemplares de S. discus, S. aequifasciatus e S. haraldi revelaram que todos os indivíduos de S. discus apresentam 30 bivalentes típicos durante a prófase I. Porém, um intrigante comportamento cromossômico meiótico foi evidenciado em S. aequifasciatus e S. haraldi, onde uma cadeia cromossômica de até 20 elementos foi encontrada durante o diplóteno, diacinese e metáfase I em células de ovócitos e espermatócitos. Esta cadeia cromossômica, a maior já descrita em vertebrados, originou-se provavelmente partir de uma série de translocações cromossômicas múltiplas, decorrentes de movimentação de elementos transponíveis após hibridação de espécies/populações ancestrais (Gross et al., 2009a). Posteriormente, Gross et al. (2010) detectaram variação inter e intraespecífica das RONs nessas mesmas espécies de Symphysodon e utilizaram sondas de DNAr 18S para entender a evolução deste marcador no gênero. Os dados de hibridação confirmaram o polimorfismo no número e no tamanho dos sítios ribossomais nas três espécies, constituindo mais uma evidência de rearranjos cromossômicos estruturais na evolução cariotípica de Symphysodon, possivelmente envolvidos com capacidade adaptativa. Para a tribo Geophagini, dados relativos à detecção de heterocromatina, hibridação in situ e fluorocromos base-específicos são incipientes, o que prejudica análises comparativas (Feldberg et al. 2003).PPGGBC Contudo, diferenças inter-específicas em relação à presença de blocos heterocromáticos já foram relatados para o gênero Crenicichla, representando um possível marcador citogenético para diferenciar espécies (Benzaquem et al., 2008). Em relação ao complexo “Geophagus” brasiliensis, as análises citogenéticas demonstram a conservação do número diplóide plesiomórfico para a família com variações no número fundamental entre 50 a 56 (Tabela 3), Assim como a maioria das espécies de ciclídeos, as populações já analisadas apresentam RON simples no sexto ou décimo par cromossômico subtelo/acrocêntrico, com casos de heteromorfismo de tamanho entre homólogos (Feldberg & Bertollo, 1985, Brum et al., 1998; Martins-Santos et al., 1995; Vicari et al., 2006; Bettin-Pires 47

et al., 2008; Bettin-Pires et al., 2010). Novamente seguindo o padrão basal para o grupo, os blocos heterocromáticos são visualizados preferencialmente em regiões pericentroméricas de todos os cromossomos (Brum et al., 1998, Martins-Santos et al., 1995; Vicari et al., 2006; Bettin-Pires et al, 2008; Bettin-Pires et al, 2010; Ferreira-Neto et al., 2010). Os estudos com fluorocromos e de localização do DNAr 18S e 5S são bem escassos em G. brasiliensis. Os poucos relatos disponíveis mostram que as RONs marcadas com sondas de

DNAr 18S são coincidentes com sinais de CMA3, sendo, portanto, ricas em pares de base GC, conforme comumente encontrado em peixes (Vicari et al., 2006; Bettin-Pires et al, 2008; Ferreira-Neto et al., 2010). Por sua vez, o DNAr 5S foi localizado na porção intersticial do braço longo de um par de cromossomos subtelo/acrocêntricos (Vicari et al., 2006; Ferreira- Neto et al., 2010). O conjunto desses dados mostra que a expansão da citogenética como ferramenta para comparação intra e interespecífica e a aplicação de tecnologias mais refinadas de análise cromossômica podem contribuir para uma melhor compreensão da complexa história evolutiva desse grupo, visto que a maioria das informações está restrita a dados convencionais (Feldberg et al., 2003). Os resultados advindos dessas análises podem, por fim, contribuir na resolução de incertezas taxonômicas e na construção de efetivos planos de manejo e conservação para suas espécies.

PPGGBC 48

Tabela 3. Dados cromossômicos disponíveis para a Tribo Geophagini, incluindo número diplóide (2n); fórmula cariotípica; número fundamental (NF); número de cromossomos portadores de RONs; distribuição da heterocromatina (banda C) e de cromossomos com sítios ricos em GC + (CMA3 ); mapeamento por FISH do DNAr 18S e 5S. + Espécie Localidade 2n Cariótipo* NF RONs Banda C* CMA3 DNAr 18S DNAr 5S Referência Acarichthys heckelii Não identificado 48 6m/sm+42st/a 54 Thompson, 1979 Apistogramma agassizii Não identificado 46 24m/sm+22st/a 70 Thompson, 1979 Apistogramma borellii Não identificado 38 22m/sm+16st/a 60 Thompson, 1979 Apistogramma borellii Lagoa Comprida, Aquidauana (MS) 46 16m/sm+30st/a 62 Poletto et al., 2010a, 2012a

Apistogramma ortmanni Não identificado 46 24m/sm+22st/a 70 Thompson, 1979 Rio Paraná (Posadas, Misiones, Apistogramma trifasciata 46 16m/sm+30 st/a 62 P Roncati et al., 2007 Argentina) Rio Araguaia, Barra do Garças e São Biotodoma cupido 48 4m/sm+44st/a 52 2** Poletto et al., 2010a, 2012a Félix do Araguaia (MT) Crenicichla britskii Rio Jupiá (PR) 48 8m/sm+40st/ a 56 2** P Benzaquem et al., 2008 Crenicichla britskii Córrego Olaria, Poloni (SP) 48 6m/sm+42st/a 54 Poletto et al., 2010a, 2012 Crenicichla aff britskii Córrego Olaria, Poloni (SP) 48 6m/sm+42st/a 54 Poletto et al., 2010a, 2012a Crenicichla cincta Catalão (AM) 48 8m/sm+40st/a 56 2** P Benzaquem et al., 2008 Crenicichla aff haroldoi Córrego Olaria, Poloni (SP) 48 6m/sm+42st/a 54 Poletto et al., 2010a, 2012a Crenicichla iguassuensis Rio Iguaçu 48 8m/sm+40st/a 56 2 P 2 Mizoguchi et al., 2007 Crenicichla inpa Br 174, km 14 (AM) 48 6m/sm+42st/a 54 2** P Benzaquem et al., 2008 Crenicichla cf. johanna Catalão (AM) 48 8m/sm+40st/a 56 2** P Benzaquem et al., 2008 Crenicichla lacustris Registro (SP) 48 6m/sm+42st/a 54 2 Feldberg & Bertollo, 1985 Crenicichla lepidota Miranda (MS) 48 6m/sm+42st/a 54 2 Feldberg & Bertollo, 1985 Crenicichla lepidota Rio Paraná (Argentina) 48 6m/sm+42st/a 54 P Roncati et al., 2007 Crenicichla lepidota Não identificado 48 6m/sm+42st/a 54 Thompson, 1979 Crenicichla lepidota Porto Rico, bacia do rio Paraná (PR) 48 6m/sm+42st/a 54 4 P Martins-Santos et al., 1995 Crenicichla lepidota Misiones (Argentina) 48 6m/sm+42st/a 54 2 Fenocchio et al., 2003 Crenicichla lepidota Lagoa Comprida, Aquidauana (MS) 48 6m/sm+42st/a 54 2** Poletto et al., 2010a, 2012a Crenicichla lepidota Canal Mangueira, São Gonçalo (RS) 48 8m/sm+40st/a 56 2 P 2 2 4 Perazzo et al.,, 2011 Crenicichla lucius Não identificado PPGGBC48 6m/sm+42st/a 54 Thompson, 1979 Crenicichla lugubris Catalão (AM) 48 8m/sm+40st/a 56 2** P Benzaquem et al., 2008 Crenicichla niederleinii Porto Rico, bacia do rio Paraná (PR) 48 14m/sm+34st/a 62 2 Martins-Santos et al., 1995 Crenicichla niederleinii Rio Paraná (Argentina) 48 6m/sm+42st/a 54 2 P Roncati et al., 2007 49

+ Espécie Localidade 2n Cariótipo* NF RONs Banda C* CMA3 DNAr 18S DNAr 5S Referência Crenicichla niederleinii Rio Tibagi (PR) 48 10m/sm+38 st/a 58 2** P 2 Loureiro et al., 2000 Crenicichla niederleinii Misiones (Argentina) 48 6m/sm+42st/a 54 2 Fenocchio et al., 2003 Crenicichla niederleinii Rio Paraná (Argentina) 48 6m/sm+42st/a 54 2 P Roncati et al., 2007 Crenicichla notophthalmus Não identificado 48 6m/sm+42st/a 54 Thompson, 1979 Crenicichla reticulate Careiro (AM) 48 6m/sm+42st a 54 2** P Benzaquem et al., 2008 Crenicichla reticulate Rio Uatumã (AM) 48 6m/sm+42st,a 54 2 Feldberg et al., 2004 Crenicichla semifasciata Misiones (Argentina) 48 6m/sm+42st/a 54 2 Fenocchio et al., 2003 Crenicichla semifasciata Miranda (MS) 48 6m/sm+42st/a 54 2 Feldberg & Bertollo, 1985 Crenicichla sexatilis Uruguai 48 4m/sm+44st/a 52 Oyhenart-Perera et al., 1975 Crenicichla cf. saxatilis Rio Peixe-boi (PA) 48 2 Farias et al., 1999 Crenicichla sp. Rio Benedito, Itajaí (SC) 48 8m/sm+40st/a 56 2** P 2 Loureiro et al., 2000 Crenicichla sp. 1 Rio Iguaçu (PR) 48 8m/sm+40st/a 56 2 P 2 Mizoguchi et al., 2007 Crenicichla sp. 2 Rio Iguaçu (PR) 48 8m/sm+40st/a 56 2 P 2 Mizoguchi et al., 2007 Crenicichla sp. Rio São Benedito, Itajaí (SC) 48 8m/sm+40st/a 56 2** 2 Loureiro et al., 2000 Crenicichla strigata Não identificado 48 6m/sm+42st/a 54 Thompson, 1979 Barra do Garças e São Félix do Crenicichla strigata 48 6m/sm+42st/a 54 Poletto et al., 2010a, 2012a Araguaia (MT) Crenicichla vittata Miranda (MS) 48 6m/sm+42st/a 54 2 Feldberg & Bertollo, 1985 Dicrossus filamentosus Não identificado 46 12m/sm+34st/a 58 Thompson, 1979 Geophagus altifrons Amazonas (AM) 48 4m/sm+44st/a 52 2 Salgado et al., 1995 Geophagus brasiliensis Ribeirão Preto (SP) 48 3m/sm+45st/a 51 Michele & Takahashi, 1977 Geophagus brasiliensis Brotas (SP) 48 2m/sm+46st/a 50 2 Feldberg & Bertollo, 1985 Geophagus brasiliensis São Carlos (SP) 48 2m/sm+46st/a 50 2 Feldberg & Bertollo, 1985

Geophagus brasiliensis Pirassununga (SP) 48 2m/sm+46st/a 50 2 Feldberg & Bertollo, 1985

Geophagus brasiliensis Registro (SP) 48 2m/sm+46st/a 50 2 Feldberg & Bertollo, 1985 Geophagus brasiliensis Não identificado 48 4m/sm+44st/a 52 Thompson, 1979 Geophagus brasiliensis Lagoa Rodrigo de Freitas (RJ) 48 8m/sm+40st/a 56 2** P Brum et al., 1998 Geophagus brasiliensis Maricá (RJ) PPGGBC48 6m/sm+42st/a 54 2 P Brum et al. 1998 Córrego Feijão e Pântano, bacia do Geophagus brasiliensis 48 6m/sm+42st/a 54 2 P 2 2 Ferreira Neto et al., 2010 Alto Paraná (PR) Pirapo, bacia do rio Paranapanema Geophagus brasiliensis 48 8m/sm+40st/a 56 2** P Martins-Santos et al., 1995 (PR) 50

+ Espécie Localidade 2n Cariótipo* NF RONs Banda C* CMA3 DNAr 18S DNAr 5S Referência Rio Jaguariaiva, bacia do rio Geophagus brasiliensis 48 6m/sm+42st/a 54 2 P 2 2** 2 Vicari et al., 2006 Paranapanema (PR) Rios Sacovão e Verde, bacia do rio Geophagus brasiliensis 48 6m/sm+42st/a 54 2 P 2 2** 2 Vicari et al., 2006 Tibagi (PR) Rio Cambezinho, bacia do rio Tibagi Geophagus brasiliensis 48 4m/sm+44st/a 52 2 P 2 2 Bettin-Pires et al, 2008 (PR) Córrego Três Bocas, bacia do rio Geophagus brasiliensis 48 4m/sm+44st/a 52 2** P 2** 2** Bettin-Pires et al, 2008 Tibagi (PR) Geophagus brasiliensis Saco da Alemoa e Gasômetro (RS) 48 4m/sm+44st/a 52 2** P 2** Bettin-Pires et al, 2010 Córrego Olaria, Córrego Araquá, rio Geophagus brasiliensis 48 2m/sm+46st/a 50 Poletto et al., 2010a, 2012a Bonito, rio Paraitinguinha (SP) Rio Tietê, Buritama; Engenheiro Geophagus cf proximus 48 4m/sm+44st/a 52 Poletto et al., 2010a, 2012a Taveira, Araçatuba (SP) Geophagus proximus Rio Araguaia, Barra do Garças (MT) 48 4m/sm+44st/a 52 Poletto et al., 2010a, 2012a Geophagus surinamensis Amazonas (AM) 48 4m/sm+44st/a 52 2 Feldberg & Bertollo, 1985 Geophagus surinamensis Não identificado 48 4m/sm+44st/a 52 Thompson, 1979 Geophagus surinamensis Rio Orinoco (Venezuela) 48 4m/sm+44st/a 52 Poletto et al., 2010a, 2012a Gymnogeophagus balzanii Miranda (MS) 48 2m/sm+46st/a 50 2 Feldberg & Bertollo, 1984, 1985 Gymnogeophagus balzanii Rio Paraná (Argentina) 48 2m/sm+46st/a 50 2 P Roncati et al., 2007 Saco da Alemoa e Barra do Ribeiro Gymnogeophagus gymnogenys 48 4m/sm+44st-a 52 4** P 4** Bettin-Pires et al, 2010 (RS) Gymnogeophagus gymnogenys Gasômetro (RS) 48 6m/sm+42st-a 54 2** P 2** Bettin-Pires et al, 2010 Gymnogeophagus labiatus Saco da Alemoa e rio Forqueta (RS) 48 8m/sm+40st/a 56 2 P 2 Bettin-Pires et al, 2010 Gymnogeophagus sp. n. Rio Paraná (Argentina) 48 2m/sm+46st/a 50 Roncati et al., 2007 Satanoperca jurupari Catalão (AM) 48 4m/sm+44st,a 52 4 Mendonça et al., 1999 Satanoperca jurupari Catalão (AM) 48 5m/sm+43st/a 53 Mendonça et al., 1999 Satanoperca jurupari Catalão (AM) 48 6m/sm+42st/a 54 Mendonça et al., 1999 Rio Araguaia, Barra do Garças e São Satanoperca jurupari 48 4m/sm+44st/a 52 2** Poletto et al., 2010a, 2012a Félix do Araguaia (MT) Satanoperca jurupari Não identificado 48 4m/sm+44st/a 52 Thompson, 1979 Satanoperca jurupari Amazônia (AM) 48 Moreira Filho, et al., 1980 Satanoperca pappaterra Porto Rico, bacia do rio Paraná (PR) 48 6m/sm+42st/a 54 2** P Martins-Santos et al., 1995 *m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico;PPGGBC cr=cromossomos; P=pericentromérica; **= heteromorfismo de tamanho de RONs 51

2.6 Análises morfométricas É bem estabelecido que a determinação das diferenças entre populações e/ou espécies é fundamental, pois a falta destes estudos pode levar a índices de biodiversidade errôneos, gerando risco de subestimar ou sobreestimar o número de espécies de um determinado local (Frankham et al., 2008). Para isso, defende-se uma abordagem conjunta para diferenciação dos táxons, com a utilização de diversas técnicas quantas forem necessárias. Entre os diversos métodos disponíveis atualmente para resolução dos limites interespecíficos ou interpopulacionais, a análise morfométrica constitui uma ferramenta importante para identificação dos táxons (Begg et al., 1999). A morfometria costuma ser definida como o estudo da forma e do tamanho para mensuração das diferenças existentes entre populações e espécies a fim de criar referências para a sua comparação. Ao contrário do tamanho, que se pode estimar quantitativamente com certa facilidade, a forma é um conceito mais abstrato em que, muitas vezes, é necessário utilizar comparações no sentido de caracterizar os contornos do que se deseja medir (Peres- Neto, et al., 1995). Tais variações nas estruturas corporais de um ser vivo podem afetar seu comportamento e suas interações ecológicas (Webb, 1984). As pesquisas relacionadas ao formato corporal dos organismos assumem papel particularmente importante na taxonomia, uma vez que as características corporais são o resultado final da evolução (Bookstein, 1991; Zelditch et al., 2004). O fenótipo que um organismo apresenta decorre da interação existente entre um dado genótipo e o meio ambiente em que ele se encontra. Desse modo, a forma do corpo de um indivíduo é afetada tanto pela composição genética como por influências ambientais, tais como a estado nutricional, taxa de crescimento e desenvolvimento (Ricklefs & Miles, 1994). Consequentemente, a evolução de um determinado fenótipo em organismos situados em um mesmo ambiente pode ser evidência de seleção natural e de adaptação (Mcguigan et al., 2005). PPGGBC As primeiras abordagens do estudo da variação da forma comparavam várias medidas, uma a uma. Entretanto, com a disponibilidade de novas tecnologias computacionais, tornou-se possível a análise simultânea de diversas variáveis. Além disso, como os organismos são multidimensionais (Bookstein, 1982), são necessários, no mínimo, três vetores (altura, largura e comprimento) para descrever razoavelmente a sua forma. Para isso, análises estatísticas multivariadas devem ser conduzidas, destacando-se a utilização de análises de componentes principais e variáveis canônicas (Rohlf & Bookstein, 1990; Cavalcanti & Lopes, 1991). 52

Dentre as técnicas multivariadas mais aplicadas na sistemática, a análise de variáveis canônicas permite a simplificação do conjunto de dados, uma vez que as informações originalmente contidas em um grupo de muitas variáveis são resumidas em poucas variáveis com propriedades de reterem o máximo da variação originalmente disponível. Esta técnica baseia-se nas informações entre e dentro de acessos, havendo, portanto, necessidade de dados com repetições (Monteiro & Reis, 1991; Khattree & Naik, 2000). A análise de variáveis canônicas reescreve os dados originais em novas variáveis através de uma transformação de coordenadas. Cada variável canônica é uma combinação linear de todas as variáveis originais. Nestas combinações, cada variável terá uma importância ou peso diferente. Duas são as características das variáveis canônicas que as tornam mais efetivas que as variáveis originais para a análise do conjunto das amostras. A primeira é que as variáveis podem guardar entre si correlações que são suprimidas na análise de variáveis canônicas. Ou seja, as variáveis canônicas são ortogonais entre si. Deste modo, cada uma delas traz uma informação estatística diferente das outras. A segunda característica importante é decorrente do processo matemático-estatístico de geração de cada uma das variáveis que maximiza a informação estatística para cada uma das coordenadas que está sendo criada (Khattree & Naik, 2000). Em análises multivariadas, a separação entre formas nem sempre é completa devido à dependência entre tamanho e a forma. Este fenômeno é devido ao fato de que os componentes de forma na análise padrão apresentam resíduos de tamanho. Para eliminar o tamanho dos componentes de forma, foram criadas algumas análises como a discriminante independente do tamanho (Reis et al., 1990). A idéia básica desse processo é retirar a influência do tamanho na discriminação entre formas. Este procedimento é bastante útil dentro dos grupos de diferentes classes de idade ou sexo. Esses erros, se não controlados, podem originar variações dentro dos grupos que mascaram as diferenças entre os grupos (Peres-Neto, et al., 1995). As medidas dePPGGBC dissimilaridade também são de grande importância em estudos de diversidade que visem distinguir espécies ou populações. Nesses estudos, avaliam-se vários caracteres com graus significativos de correlação, sendo recomendável a utilização da distância generalizada (D2) de Mahalanobis. Ao aplicar esse modelo de distância, considera-se as associações entre características por meio da matriz de variância e covariância residuais entre as variáveis. Essa medida proporciona maior analogia entre técnicas multivariadas e técnicas de agrupamento (Cruz & Regazzi, 2001). As estimativas de dissimilaridade atendem aos objetivos do taxonomista, por quantificarem e informarem sobre o grau de semelhança ou diferenças apresentado entre grupos. Entretanto, 53

o número de estimativas obtidas é relativamente grande, o que torna impraticável o reconhecimento de grupos homogêneos pelo simples exame visual das estimativas. Assim, para realizar essa tarefa faz-se uso dos métodos de agrupamento ou análise de dispersão em gráficos bidimensionais (Cruz & Carneiro, 2006). Os métodos de agrupamento mais utilizados são os de otimização e os hierárquicos. Nos métodos de otimização, os grupos são formados pela adequação de algum critério de agrupamento, ou seja, o objetivo é alcançar uma partição dos indivíduos que otimize alguma medida preferencial. O método de otimizaçäo apresentado por Tocher vem sendo extensivamente usado nos estudos de divergência genética no qual é estabelecido o critério de manter a distância média intragrupo sempre inferior a qualquer distância intergrupo. A entrada de um indivíduo no grupo possui um limite máximo que é estabelecido pelo valor máximo da medida de dissimilaridade no conjunto das menores distâncias envolvendo cada indivíduo (Cruz & Carneiro, 2006). O método de agrupamento de distância média ou UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean) tem sido utilizado com maior freqüência em sistemática (James & McCulloch, 1990) e em taxonomia numérica (Sneath & Sokal, 1973). É um método não ponderado de agrupamento aos pares a partir das médias aritméticas das medidas de dissimilaridade, o que evita caracterizar a dissimilaridade por valores extremos. Dos métodos hierárquicos de agrupamento, o UPGMA é o que apresenta os dendrogramas com coeficientes máximos de correlação cofenética, indicativos de consistência nos agrupamentos (Sokal & Rohlf, 1962; Gonçalves et al., 2008). Contudo, os novos coeficientes de semelhança indicados no eixo do agrupamento podem ser utilizados no estabelecimento de uma nova matriz de dissimilaridade, denominada matriz de coeficiente de semelhança cofenética. Nessa matriz, a informação entre par de indivíduos é, muitas vezes, perdida, dando lugar a novas referências relativas aos grupos ou níveis dentro da árvore de similaPPGGBCridade. Essa simplificação das informações originais pode gerar algumas distorções sobre o padrão de dissimilaridade entre os indivíduos, fazendo-se necessário julgar a adequação dos agrupamentos (Cruz & Carneiro, 2006). A adequação dos agrupamentos é feita pelo coeficiente de correlação cofenética, que nada mais é do que o cálculo do produto entre os elementos da matriz de dissimilaridade e os elementos da matriz cofenética, sendo uma medida de concordância entre valores originais de dissimilaridade e aqueles representados no dendrograma (Sokal & Rohlf, 1962; Bertan et al, 2006). 54

Como dito anteriormente, os métodos de agrupamento podem provocar perda de informações do grau de dissimilaridade, principalmente dos indivíduos pertencentes a um mesmo grupo. Uma maneira alternativa aos métodos de agrupamento para avaliação da diversidade dentro de um conjunto de indivíduos é a análise da dispersão gráfica, normalmente, utilizando o espaço bidimensional. Porém, em análises gráficas, existe a dificuldade do estabelecimento de grupos de similaridade de forma objetiva, sendo realizada a simples inspeção visual da dispersão. Há ainda casos em que a análise gráfica não consegue resumir o complexo de informações das variáveis originais apenas com as informações representadas por dois eixos. Por isso, a utilização conjunta de métodos de dispersão e de agrupamento tem sido a alternativa mais adequada em estudos de diversidade (Cruz & Carneiro, 2006). Tais análises de agrupamento e de variáveis canônicas a partir de dados morfométricos são excelentes instrumentos, principalmente em associação com dados genéticos, para verificar o grau de diferenciação intra e interpopulacional. Em peixes, pela necessidade de uma estrutura bem definida com conformação hidrodinâmica, isso é bem evidente, transformando-os em um adequado material para estudos morfométricos (Cavalcanti & Lopes, 1991). Nas espécies neotropicais, a análise conjunta de dados cromossômicos e morfométricos foi realizada em Astyanax fasciatus (Medrado et al., 2008), Astyanax sp. aff. bimaculatus (Pamponet et al., 2008) e Leporinus elongatus (Molina et al., 2008) entre outros, possibilitando inferir sobre estruturação populacional e eventos de especiação. No caso dos representantes da família Cichlidae, há uma notável diversidade morfológica, especialmente de caracteres como forma do corpo e estruturas relacionadas à alimentação. Essa plasticidade afeta as interações ecológicas e as taxas evolutivas, embora as características morfológicas representem a base de estudos sistemáticos (Meyer, 1987; Wimberger, 1991, 1992). Entre os Haplochromini,PPGGBC a linhagem mais especiosa de ciclídeos africanos, semelhanças morfológicas e de equivalência ecológica são evidentes nos três grandes lagos do vale do Rift. A magnitude da semelhança é notável, tanto entre quanto dentro de cada um dos lagos. Considerando que esse padrão seja o resultado de convergência, a utilização de caracteres morfológicos para a construção de filogenias pode ser enganosa (Kornfield & Smith, 2000). Devido a essa limitação dos dados morfológicos em grupos com elevada capacidade adaptativa, como os ciclídeos, é aconselhável a utilização de várias ferramentas para analisar a diferenciação de populações e/ou espécies, tais como a associação entre dados morfométricos e citogenéticos. 55

3 Objetivos 3.1 Objetivo geral Considerando a potencialidade dos marcadores cromossômicos para a citotaxonomia e, em associação com análises morfológicas, para identificação de populações e espécies, além da carência de estudos citogenéticos na ictiofauna da Bahia, o objetivo do trabalho foi caracterizar citogeneticamente e morfometricamente espécies do complexo “Geophagus” brasiliensis de bacias hidrográficas costeiras do estado. A partir da comparação do perfil morfométrico, características cariotípicas e distribuição geográfica das populações e espécies desse gênero, contribuindo assim para o entendimento dos prováveis mecanismos evolutivos atuantes na sua diversificação.

3.2 Objetivos específicos Caracterizar citogeneticamente populações do complexo “Geophagus” brasiliensis (Perciformes, Cichlidae) ao longo de sistemas hídricos costeiros da Bahia estabelecendo o número diplóide, fórmula cariotípica, localização das Ag-RONs e distribuição da heterocromatina, sítios ricos em bases GC e AT e mapeamento dos genes de RNAr 18S e 5S; Comparar morfometricamente os indivíduos de cada população/espécie amostrada através da análise de varáveis canônicas e métodos de grupamento, estabelecendo o grau de diferenciação interpopulacional e interespecífica; Comparar os dados citogenéticos obtidos com os de outras populações analisadas nas regiões do Brasil, inferindo sobre as tendências evolutivas do gênero Geophagus e da família Cichlidae como um todo; Discutir o papelPPGGBC de barreiras geográficas e história evolutiva das bacias do Leste na diversidade genética da ictiofauna regional, definindo unidades evolutivas únicas e as implicações para a taxonomia e conservação da biodiversidade.

56

4. Material e métodos 4.1 Área de estudo e coleta de material Foram coletados 170 exemplares de Geophagus brasiliensis e 21 de G. itapicuruensis (Figura 6) de oito localidades de quatro regiões de planejamento e gestão de águas do estado da Bahia (Figura 7), perfazendo 191 indivíduos (Tabela 4). Os peixes foram capturados com tarrafas, transportados vivos para o laboratório de Citogenética da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia – Jequié, e mantidos em aquários para a realização das técnicas citogenéticas. As licenças para coleta de material ictiológico foram concedidas pelo Instituto Chico Mendes (ICMBio/SISBIO) em nome de Paulo Roberto Antunes de Mello Affonso (número da licença: 26752-1).

Figura 6. Exemplar de Geophagus brasiliensis (A) e G. itapicuruensis (B). Fotos do autor.

Os indivíduos usados nas análises morfométricas e citogenéticas foram fixados em formol 10% por 48 horas e conservados em álcool 70%. Os Exemplares foram enviados à Dra. Luisa Maria Sarmento-Soares, Universidade Federal do Espírito Santo, para identificação e depósito na coleção do Museu de Biologia Professor Mello Leitão (G. itapicuruensis: MBML 4033 e 4034, 4217, 4582 a 4589; G. brasiliensis: MBML 3998 a 4007, 4012 a 4026, 4028 a 4030, 4032, 4210 a 4214, 4216, 4365, 4545 a 4571, 4573 a 4579, 4581, 4590).

Tabela 4. Espécimes coletados de Geophagus por local de coleta com respectivos números amostrais das análisesPPGGBC morfométricas (N1) e citogenéticas (N2). Espécie Bacia Rio/localidade Coordenadas N1 N2 G. itapicuruensis Rio Itapicuru Rio Itapicuru-mirim/Caldas do Jorro 11º12’15”S/40º29’15”W 21 13 (2♂, 5♀, 6?) G. brasiliensis Recôncavo Sul Rio Mineiro/Itamari 13°60’54”S/39°41’54’’W 24 11 (2♂, 2♀, 7?) G. brasiliensis Rio de Contas Rio de Contas/Jequié 13o51’51”S/40o04’54”W 22 14 (7♂, 3♀, 4?) Rio de Contas Rio das Pedras/distrito Florestal, Jequié 13º43’40"S/39º50'26"W 27 15 (3♂, 5♀, 7?) Rio de Contas Rio Preto do Costa/Jequié 13°45’84”S/39°56’47”W 35 13 (6♂, 2♀, 5?) Rio de Contas Rio Preto do Criciúma/Jequié 13º55’45"S/39º57'57"W 33 15 (6♂, 4♀, 5?) Rio de Contas Rio Oricó/Ubaitaba 14º08’03”S/39º21’30”W 15 13 (2♂, 4♀, 7?) G. brasiliensis Una-Almada Rio São Pedro/Olivença 15º18’04”S/39º04’35”W 14 14 (8♂, 4♀, 2?) 57

Figura 7. Mapa das regiões de planejamento e gestão de águas do estado da Bahia (acima à esquerda), evidenciando as bacias amostradas (indicadas pelas estrelas), onde XII: Bacia do rio Itapicuru; IX: Bacia do Recôncavo Sul; VIII: Bacia do rio de Contas; VII: Bacia do Una-Almada (parte da região hidrográfica do leste). Acima à direita, mapa do estado da Bahia com os pontos de amostragem de cada população de Geophagus com fotos representativas das localidades à direita: (A) rio Itapicuru-mirim (bacia do rio Itapicuru), (B) rio Mineiro (bacia do Recôncavo Sul), (C) rio de Contas, (D) rio das Pedras, (E) rio Preto do Costa, (F) rio Preto do Crisciúma, (G) rioPPGGBC Oricó (bacia do rio de Contas) e (H) rio São Pedro (bacia do Una-Almada). Fonte: modificada de INEMA (2012). 58

4.2 Estudos cromossômicos 4.2.1 Obtenção de cromossomos mitóticos A fim de aumentar o número de metáfases, uma solução composta por Munolan (1 comprimido: 0,5 mL de água) ou Nikkovac puro foi injetada via intramuscular (1 mL/100 g de peso) nos indivíduos 72 horas antes do início da técnica de obtenção de cromossomos mitóticos. Esse procedimento foi repetido em intervalos de 24 horas (Molina et al., 2010). Para a obtenção de cromossomos mitóticos, foi empregada a técnica direta de air-drying (Bertollo et al., 1978). Uma solução aquosa de colchicina (0,025%) foi injetada intra- abdominalmente, atrás das nadadeiras peitorais, na proporção de 1 mL/100 g de peso do , mantendo-se o peixe em aquário aerado por um período de 30 minutos. Decorrido esse tempo, o animal foi sacrificado e fragmentos do rim anterior foram colocados em um Becker de vidro contendo 10 mL de solução hipotônica de KCl (0,075 M), sendo dissociados com seringa de vidro desprovida de agulha. A suspensão celular obtida foi transferida para um tubo de centrífuga, utilizando-se uma pipeta Pasteur. Esse tubo foi levado para a estufa a 37ºC, por 20 minutos. Após a hipotonização, foi feita uma pré-fixação, acrescentando-se cinco a 10 gotas de fixador Carnoy (álcool metílico: ácido acético, na proporção de 3:1) gelado e recém-preparado ao material que foi centrifugado por 10 minutos a 1.000-1.500 rpm. Depois dessa centrifugação, seguiu-se o processo de fixação, que consistiu em três centrifugações utilizando-se 5 mL de fixador Carnoy por 10 minutos a 1.000-1.500 rpm, sempre eliminando o sobrenadante após cada centrifugação. Após a última centrifugação e eliminação do sobrenadante, foi adicionado cerca de 1-2 mL de fixador ao sedimento celular seguido por homogeneização com pipeta Pasteur. O material foi então acondicionado em microtubos de 1,5 ou 2,0 mL e estocado em freezer a -20°C.

4.2.2 Preparação de lâminas Cerca de duas PPGGBC a três gotas da suspensão celular acondicionada nos microtubos foram gotejadas sobre uma lâmina previamente aquecida em água a 60ºC com auxílio de pipeta Pasteur para procedimento das técnicas citogenéticas descritas abaixo.

4.2.3 Coloração convencional A lâmina foi corada com solução de Giemsa a 5% diluída em tampão fosfato pH 6,8 durante 8 minutos. Transcorrido esse tempo, a lâmina era lavada em água corrente. Após a secagem, a lâmina foi analisada em microscópio óptico, sendo selecionadas as melhores metáfases sob objetiva de imersão (1000x) para definição do número diplóide e confecção do 59

cariótipo dos animais. Os cromossomos foram identificados de acordo com a nomenclatura proposta por Levan et al (1964), que consiste em calcular a relação de braços (r), obtido pela razão entre o tamanho do braço longo e o tamanho do braço curto (r=l/s). Dependendo do valor do índice, o cromossomo pode ser classificado como metacêntrico (1,0 a 1,7), submetacêntrico (1,71 a 3,0), subtelocêntrico (3,01 a 7,0) ou acrocêntrico (maior que 7,0). O número fundamental foi calculado levando em conta que cromossomos meta/submetacêntricos possuíam dois braços e os subtelo/acrocêntricos apenas um.

4.2.4 Bandamento C A heterocromatina foi evidenciada pelo bandamento C (Sumner, 1972), com algumas adaptações. As lâminas foram tratadas com uma solução de HCl 0,2 N, à temperatura ambiente, durante 15 minutos e, a seguir, submergidas numa solução de hidróxido de bário

[Ba(OH)2] 5% a 42ºC por aproximadamente um minuto. Logo após, as lâminas foram lavadas em solução de HCl 0,2 N e incubadas em solução salina 2xSSC, aquecida a 60º C, por 20 minutos. As lâminas foram corados com Giemsa 5%, em tampão fosfato pH 6,8 durante 8 minutos. Em seguida, as lâminas foram lavadas com água corrente e secas ao ar.

4.2.5 Ag-RON Para a detecção das RONs ativas utilizou-se o procedimento descrito por Howell e Black (1980), empregando o nitrato de prata (Ag-RONs). As lâminas foram tratadas com uma mistura contendo duas partes de uma solução aquosa de gelatina 2% (acrescida de ácido fórmico 1% na proporção de 1 mL para cada 100 mL de solução) e quatro partes de uma solução de nitrato de prata 50%. O material foi recoberto com uma lamínula e incubado em estufa a 60°C por, aproximadamente, 5 minutos. A lamínula foi então retirada com um jato de água e os cromossomos rapidamente corados com Giemsa 5% em tampão fosfato (pH 6,8), por 30 segundos, seguindoPPGGBC-se lavagem em água corrente.

4.2.6 Coloração com fluorocromos base-específicos Utilizou-se o procedimento descrito por Schmid (1980) com algumas modificações. As lâminas foram colocadas em uma bateria de álcool 70%, 85% e 100%, por 2 minutos em cada banho. Após secagem, adicionou-se 80 µl de Cromomicina A3 (CMA3) em cada lâmina, permanecendo por 1 hora em câmara escura na geladeira. Após este período, as lâminas foram banhadas em tampão McIlvaine e lavadas com água. Imediatamente (antes de secar), adicionou-se 80 µL de solução de distamicina (0,1 mg/mL) sobre cada lâmina por 30 minutos 60

em câmara escura na geladeira. Após este período, as lâminas foram novamente banhadas em tampão McIlvaine e lavadas com água. Logo após (antes de secar), adicionou-se 80 µL de solução de 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) na proporção de 0,2 µg/mL sobre cada lâmina, deixando por 30 minutos em câmara escura na geladeira. Lavou-se a lâmina em tampão McIlvaine, deixando secar ao ar e cobriu-se com lamínula em meio de montagem glicerol/McIlvaine. As lâminas foram colocadas na geladeira e após três dias foram analisadas.

4.2.7 Hibridação fluorescente in situ dupla (double-FISH) com sondas ribossomais Utilizou-se o procedimento descrito por Pinkel et al (1986) com algumas modificações. A sonda de DNAr do fragmento 18S foi obtida a partir do DNA genômico de Prochilodus argenteus (Hatanaka & Galetti, 2004). A sonda de DNAr 5S foi obtida a partir do DNA genômico de Leporinus elongatus (Martins & Galetti, 1999). Para marcação da sonda foi utilizado o procedimento de nick translation com uso dos kits Bionick Labeling System (Invitrogen) e Nick Translation Biotin (Roche), de acordo com as recomendações dos fabricantes. A solução de hibridação consistiu de 200 µL de formamida 50%, 80 µL de sulfato dextrano 50%, 40 µL de 20xSSC, 80 µL de água q.s.p., perfazendo um volume total de 400 µL, aos quais foram adicionados 1 µg de cada sonda. Posteriormente à marcação das sondas, foi realizado o procedimento de hibridação in situ fluorescente. A lâmina, contendo as preparações cromossômicas, foi lavada com tampão PBS 1x (NaCl 0,137 M, KCl 2,8 mM,

Na2HPO4 1,46 mM) por 5 minutos, à temperatura ambiente, sob agitação e posteriormente desidratada em série alcoólica (70%, 85% e 100%). Em seguida, foi tratada com solução de RNAse (100µl/mL) por 1 hora e 30 minutos, em câmara úmida a 37°C e lavada duas vezes em solução de 2xSSC por 10 minutos e com tampão PBS 1x durante 5 minutos, sob agitação. Seguiu-se um tratamentoPPGGBC com solução de pepsina 0,05% em HCl 10 mM a 37°C, por 10 minutos; lavagem em PBS 1x por 5 minutos sob agitação e posterior fixação em formaldeído

1% com MgCl2 50 mM por 10 minutos. O material foi novamente lavado em PBS 1x por 5 minutos sob agitação e, em seguida, desidratado em uma série alcoólica (70%, 85% e 100%), 5 minutos em cada banho, e tratado com formamida 70%/2xSSC a 70°C por 5 minutos para desnaturação dos cromossomos. Seguiu-se uma nova desidratação em série alcoólica (70%, 85% e 100%), 5 minutos em cada banho, a 20°C. Foram aplicados sobre a lâmina, 50µl da solução de hibridação contendo as sondas desnaturadas, permanecendo overnight a 37°C em câmara úmida. Em seguida, a lâmina foi lavada com solução de formamida 50%/2xSSC a 61

42°C por 10 minutos, três vezes com 0,1xSSC a 60°C, 5 minutos em cada lavagem e com solução Tween 20 (0,05%/2xSSC) sob agitação por 5 minutos. Seguiu-se um tratamento com 90µl de NFDM (non fat dry milk) a 5% em 4xSSC por 15 minutos em temperatura ambiente. Para detecção da sonda, foi preparado um mix contendo 994 µl de NFDM, 1 µL de avidina FITC conjugada e 5 µl de anti-digoxigenina rodamina conjugada. As lâminas foram incubadas com 100 µL de cada mix de anticorpos durante 1 hora em câmera úmida e escura, a temperatura ambiente. Posteriormente, as lâminas foram lavadas três vezes com Tween 0,5% em 4xSSC a temperatura ambiente por 5 minutos cada. Finalmente, a lâmina foi desidratada em série alcoólica (70%, 85% e 100%), durante 5 minutos em cada banho. Para montagem das lâminas, foi misturado 500 µl de antifading e 1,25 µl de DAPI (0,2mg/mL), colocando-se 50 µL dessa mistura em cada lâmina, subsequentemente cobrindo- a com lamínula e guardando-a protegida da luz até o momento da análise microscópica.

4.2.8 Análise cromossômica e fotomicroscopia Foram examinadas em microscópio óptico de campo claro pelo menos 30 metáfases por indivíduo para o estabelecimento do número modal. A objetiva de imersão (1.000x) foi utilizada para contagens cromossômicas e análises citogenéticas detalhadas. As melhores metáfases foram fotografadas em microscópio Olympus BX50 de epifluorescência, equipado com sistema digital de captura de imagens (ImagePro Plus – Media Cybernetics) e processadas no programa Adobe Photoshop 7.0.1.

4.3 Análises morfométricas Para obtenção dos dados morfométricos, foram medidos 170 exemplares de Geophagus brasiliensis e 21 de Geophagus itapicuruensis (Tabela 4) utilizado um paquímetro manual com precisão de 0,05PPGGBC mm. Todos os indivíduos amostrados foram medidos duas vezes para cada característica. Em seguida, foi calculada a média das medidas para cada exemplar, a fim de minimizar erros do observador. Dezesseis caracteres morfométricos foram obtidos (Figura 8), oito deles baseados em Lagler et al (1977), a saber: (1) comprimento da cabeça - CC, (2) altura do corpo - AlC, (3) altura do pedúnculo caudal - AlPc, (4) largura interorbital - LiO, (5) diâmetro ocular - DiO, (6) distância pré-anal - DPAn, (7) distância pré-dorsal - DPDs e (8) altura da cabeça - AlCC. Os outros caracteres foram as distâncias entre as nadadeiras (9) dorsal e peitoral - DsPt, (10) peitoral e pélvica - PtPv, (11) pélvica e anal - PvAn, (12) peitoral e anal - PtAn, 62

(13) dorsal e pélvica - DsPv, (14) dorsal e anal – DsAn, (15) fim da dorsal e início da anal – FDA e (16) fim da dorsal e fim da anal - FDFA.

Figura 8. Desenho esquemático das 16 medidas morfométricas efetuadas nos exemplares do gênero Geophagus de acordo com numeração no texto.

Para verificar a diversidade interpopulacional e intrapopulacional foi utilizada a análise discriminante independente do tamanho, que possibilita a identificação de grupos similares em gráficos de dispersão bidimensionais, através do pacote estatístico SAS v. 9.1 (2003) de acordo com o protocolo de Reis et al. (1990). Nessa análise são feitas correções do efeito do tamanho dos indivíduos dentro das amostras, removendo os efeitos de variação dentro de grupos por regressão. Adotou-se a distância generalizada D2 de Mahalanobis e o agrupamento foi realizado empregando-se o método de distância média UPGMA e de otimização de Tocher, utilizando o programa GENESPPGGBC (Cruz, 2008). Para verificar a consistência dos agrupamentos, foi medido o coeficiente de correlação cofenética e avaliou-se também a importância dos caracteres para explicar a diversidade entre as populações e espécies.

63

5 Resultados 5.1 Análises citogenéticas Independentemente do local de origem, as espécies e populações analisadas do complexo “Geophagus” brasiliensis apresentaram a mesma constituição cromossômica com cariótipos formados por dois cromossomos submetacêntricos e 46 subtelo/acrocêntricos (2n=48, NF=50). Observa-se também um decréscimo sutil do tamanho entre os pares acrocêntricos que dificultam o preciso pareamento cromossômico (Figura 9). Em muitas das metáfases analisadas nas duas espécies, foi possível detectar o espalhamento não-casual dos cromossomos com ocorrência de associação pelos centrômeros, sobretudo entre o par portador de RONs, e levando a formação de buquês (Figura 11). A heterocromatina no complemento cariotípico das espécies e populações analisadas por bandamento C está distribuída preferencialmente na região pericentromérica da maioria dos cromossomos de modo sutil (Figura 10). No entanto, algumas populações de G. brasiliensis revelaram bandas C mais conspícuas além de marcações paracentroméricas e terminais, como as provenientes dos rios Mineiro, Pedras, Preto do Costa e São Pedro (Figura 10B, D, E, H). Após a impregnação com nitrato de prata, foi verificado um acentuado polimorfismo no número de cromossomos marcados entre as populações de Geophagus brasiliensis a despeito da manutenção de sítios de Ag-RONs localizados nos braços curtos de cromossomos subtelo/acrocêntricos (Figura 12). Três populações de Geophagus brasiliensis evidenciaram RONs simples, rios de Contas, Oricó e São Pedro (Figura 12C, G, H), seguindo o padrão encontrado em Geophagus itapicuruensis (Figura 12A). Os exemplares de G. brasiliensis das demais localidades evidenciaram RONs múltiplas, compreendendo até três cromossomos portadores de Ag-RONs na população do rio das Pedras (Figura 12D), quatro na população do rio Preto do Crisciúma (Figura 12F) e até cinco cromossomos nas amostras dos rios Mineiro e Preto do Costa (Figura 12B, E). Como esses sítios variavam inter e intra-individualmente análises com coloraçãoPPGGBC por fluorocromos base-específicos e de FISH usando sondas de DNAr 18S foram efetuadas.

O tratamento dos cromossomos metafásicos com Cromomicina A3, um fluorocromo GC- + - específico, e DAPI, um fluorocromo AT-específico, revelou sinais CMA3 /DAPI nos braços curtos de cromossomos subtelo/acrocêntricos nas amostras de ambas as espécies. Contudo, regiões GC-ricas adicionais e não coincidentes com as Ag-RONs foram verificadas nas populações de G. brasiliensis (Figura 12A), dos rios das Pedras e Preto do Crisciúma (três marcações a mais) (Figura 12D, F), rio Mineiro e Preto do Costa (uma marcação a mais) 64

(Figura 12B, E). O mesmo ocorreu com G. itapicuruensis, onde três regiões ricas em GC foram assinaladas, duas delas equivalentes às Ag-RONs (Figura 12A). A técnica da FISH com sondas de DNAr 18S confirmou a variação numérica de locos de genes ribossomais observados pelo nitrato de prata nas populações de G. brasiliensis de bacias costeiras da Bahia, além de revelar sítios adicionais inativos em algumas populações. No caso da população do rio Preto do Crisciúma, um dos cromossomos portadores de Ag- RONs não apresentou marcações coincidentes com a FISH (figura 12F). Dessa forma, dois a seis cromossomos subtelo/acrocêntricos portando sinais de hibridação nos braços curtos foram visualizados de acordo com cada população (Figura 12). No caso de G. itapicuruensis e nos exemplares de G. brasiliensis dos rios de Contas e Oricó, a hibridação in situ confirmou a existência de sistemas simples de RONs (Figura 12A, C, G). Adicionalmente, esse metodologia permitiu verificar heteromorfismo de tamanho entre os sítios de DNAr 18S de cromossomos homólogos, conforme indicado pelas técnicas de Ag-RONs e coloração com fluorocromos em algumas populações (Figura 12). Por outro lado, os sítios de DNAr 5S mostraram-se invariáveis quanto ao seu número e localização nas populações e espécies (Figura 12), ocupando a região intersticial do braço longo de um par subtelo/acrocêntrico mediano em todas as amostras. A aplicação da técnica de FISH com sondas ribossomais simultâneas (double-FISH) também revelou que os genes de RNAr 5S não são sintênicos às RONs.

PPGGBC

65

Figura 9. Cariótipos em coloração convencional das amostras do complexo “Geophagus” brasiliensis da Bahia: (A) Geophagus itapicuruensis do rio Itapicuru-mirim (bacia do rio Itapicuru); (B) G. brasiliensis do rio Mineiro (bacia do Recôncavo Sul); (C) rio de Contas, (D) rio das Pedras, (E) rio Preto do Costa, (F) rio Preto do Crisciúma, (G) rio Oricó (bacia do rio de Contas); (H) rio São Pedro (bacia do Una-Almada).

PPGGBC 66

Figura 10. Cariótipos após bandamento C das amostras do complexo “Geophagus” brasiliensis da Bahia: (A) Geophagus itapicuruensis do rio Itapicuru-mirim (bacia do rio Itapicuru); (B) G. brasiliensis do rio Mineiro (bacia do Recôncavo Sul); (C) rio de Contas, (D) rio das Pedras, (E) rio Preto do Costa, (F) rio Preto do Crisciúma, (G) rio Oricó (bacia do rio de Contas); (H) rio São Pedro (bacia do Una-Almada). PPGGBC

67

Figura 11. Metáfases de Geophagus itapicuruensis (A e B) e G. brasiliensis (C e D) após coloração convencional com Giemsa (A e C) e impregnação com nitrato de prata (B e D). As setas indicam os cromossomos dispostos em buquê ou associados pelas RONs.

Ag-RONs

PPGGBC

Figura 12. Cromossomos de Geophagus itapicuruensis (A) e G. brasiliensis (B-H) + - portadores de Ag-RONs, regiões CMA3 /DAPI e sítios de DNAr 18S e DNAr 5S marcados por double-FISH. As letras A a H correspondem, respectivamente, às amostras do rio Itapicuru-mirim (bacia do rio Itapicuru), rio Mineiro (bacia do Recôncavo Sul), rio de Contas, rio das Pedras, rio Preto do Costa, rio Preto do Crisciúma, rio Oricó (bacia do rio de Contas) e rio São Pedro (bacia do Una-Almada).

68

5.2 Análises morfométricas As análises com base em 16 caracteres morfométricos foram efetuadas em 191 amostras do gênero Geophagus coletadas em quatro sistemas hídricos da Bahia. Desse total, 21 espécimes eram de Geophagus itapicuruensis da bacia do rio Itapicuru (rio Itapicuru-mirim) e 170 exemplares foram de Geophagus brasiliensis das bacias do rio de Contas (rio de Contas, rio das Pedras, rio Preto do Costa, rio Preto do Crisciúma e rio Oricó), Recôncavo Sul (rio Mineiro) e Una-Almada (rio São Pedro). Nas análises morfométricas, essas amostras foram identificadas por números de um a oito, sendo rio de Contas (1), rio das Pedras (2), rio Preto do Costa (3), rio Preto do Crisciúma (4), rio Itapicuru-mirim (5), rio mineiro (6), rio São Pedro (7) e rio Oricó (8). A maior dissimilaridade (21,46) foi observada entre rio das Pedras e rio Itapicuru-mirim enquanto as amostras com menor dissimilaridade (3,12) foram as do rio Preto do Crisciúma e rio das Pedras (Tabela 5).

Tabela 5. Distâncias interpopulacionais médias (D2 Mahalanobis) baseadas em dados morfométricos de exemplares de Geophagus brasiliensis e G. itapicuruensis por localidade. Localidade 1 2 3 4 5 6 7 8 Rio de Contas (1) 0

Rio das Pedras (2) 5,32 0

Rio Preto do Costa (3) 9,56 3,99 0

Rio Preto do Crisciúma (4) 5,71 3,12 5,24 0

Rio Itapicuru-mirim (5) 19,45 21,46 20,89 19,57 0

Rio Mineiro (6) 14,13 8,50 7,23 6,42 11,92 0

Rio São Pedro (7) 8,58 5,83 6,64 3,69 16,04 4,15 0

Rio Oricó (8) 5,29 6,32 6,52 5,63 13,56 5,46 4,30 0

Usando o método de otimização de Tocher, as populações ficaram alocadas em dois grupos, um composto por populações de G. brasiliensis das bacias do rio de Contas, Recôncavo Sul e PPGGBCUna-Almada e outro formado por G. itapicuruensis do rio Itapicuru-mirim (Tabela 6).

Tabela 6. Formação dos grupos pelo método de otimização de Tocher utilizando a distância D2 de Mahalanobis sobre os dados morfométricos de Geophagus brasiliensis e G. itapicuruensis coletados no estado da Bahia. Os acessos representam as localidades. Grupo Acessos Grupo 1 2 4 3 7 8 6 1 Grupo 2 5 69

O agrupamento por UPGMA resultou em padrão semelhante aos resultados obtidos com o método de otimização de Tocher. O dendrograma obtido revelou ainda que a população do Rio de Contas é a mais divergente dentro do maior grupo (Figura 13).

Figura 13. Dendrograma por UPGMA a partir da distância D2 de Mahalanobis sobre os dados morfométricos de Geophagus brasiliensis e de G. itapicuruensis por localidade de coleta.

A representatividade das matrizes de similaridade nos dendrogramas é verificada pela determinação do coeficiente de correlação cofenética, uma medida de concordância entre valores originais de dissimilaridade e aqueles representados no dendrograma. Assume-se que dendrogramas com valores acima de 0,8 são considerados adequados (Rohlf, 2000). O coeficiente de correlação cofenética nesse trabalho foi de 0,9043 indicando consistência no agrupamento. Apoiando a consistência dos dados, as duas primeiras variáveis canônicas foram capazes de explicar 100% da variação total existente nos dados originais, distribuídos em 99,13% para a primeira variável e 0,86% para a segunda (Tabela 7).

Tabela 7. Variáveis canônicas (CVi), autovalores (λi) e porcentagem da variação (%σ2) obtidas da análise de 16 caracteres morfométricos em amostras de Geophagus brasiliensis e G. itapicuruensis doPPGGBC estado da Bahia. Cvi Λi %σ2 Acumulada%σ2 CV1 54387,5947 99,13 99,13 CV2 473,9312 0,86 100,0 CV3 0,7787 0,00 100,0 CV4 0,7075 0,00 100,0 CV5 0,06108 0,00 100,0 CV6 0,0339 0,00 100,0 CV7 0,0174 0,00 100,0 CV8 0,0002 0,00 100,0

70

As contribuições relativas dos caracteres para a divergência utilizando o critério proposto por Singh (1981) são apresentadas na Tabela 8, onde os dados estão organizados de forma decrescente em relação à contribuição. Através dessa tabela, pôde-se observar que as características que mais contribuíram para a diversidade encontrada nas populações estudadas foram: distância pré-anal (DPAn), comprimento da cabeça (CC), distâncias entre o fim da nadadeira dorsal e início da anal (FDA), distâncias entre o fim da nadadeira dorsal e fim da anal (FDFA) e altura do pedúnculo caudal (AlPc). Já os caracteres menos importantes foram as distâncias entre as nadadeiras dorsal e anal (DsAn), distância pré-dorsal (DPDs), altura da cabeça (AlCC) e distâncias entre as nadadeiras peitoral e pélvica (PtPv). Os caracteres menos importantes são os invariantes ou redundantes, ou seja, representadas por outros caracteres altamente correlacionados (Cruz & Carneiro, 2006).

Tabela 8. Contribuição relativa dos 16 caracteres morfométricos analisados em Geophagus brasiliensis e G. itapicuruensis do estado da Bahia, onde S.j representa a medida da importância relativa da variável j para o estudo da diversidade genética. Variável S.j Valor (%) DPAn 36,844928 14,4746 CC 29,314397 11,5162 FDA 22,664435 8,9038 FDFA 22,612216 8,8833 AlPc 20,972512 8,2391 DiO 19,418831 7,6287 AlC 18,618063 7,3141 DsPv 16,321026 6,4117 DsPt 16,2331 6,3772 LiO 12,48034 4,9029 PvAn 10,601266 4,1647 PtAn 9,050988 3,5557 DPDs 8,350074 3,2803 AlCC 5,993303 2,3545 PtPv 3,979204 1,5632 PPGGBC DsAn 1,094125 0,4298

O fato das duas primeiras variáveis canônicas explicarem 100% da variação permitiu a construção do gráfico de dispersão bidimensional que revelaram variações intra e interpopulacionais e interespecíficas, com a formação de dois grupos (Figuras 14 e 15). Corroborando os dados do dendrograma por UPGMA e o método de otimização do agrupamento por Tocher, um grupo inclui os exemplares de Geophagus brasiliensis das bacias do rio de Contas, Recôncavo Sul e Una-Almada enquanto outro é composto pelos exemplares de Geophagus itapicuruensis do rio Itapicuru-mirim, Bacia do rio Itapicuru. Essa distinção está bem ilustrada no gráfico da Figura 15. 71

Figura 14. Gráfico de dispersão revelando a diversidade entre e dentro das populações com a projeção dos escores individuais obtidos da análise canônica discriminante independente do tamanho de 16 características morfológicas em espécimes de Geophagus brasiliensis e G. itapicuruensis do estado da Bahia.

PPGGBC

Figura 15. Gráfico de dispersão revelando a diversidade entre as amostras de Geophagus brasiliensis e G. itapicuruensis do estado da Bahia através de análise canônica discriminante independente do tamanho de 16 características morfométricas. O círculo vermelho representa a formação do agrupamento das populações de Geophagus brasiliensis.

72

6 Discussão As informações citogenéticas em Geophagini estão disponíveis somente para sete dos 18 gêneros que a compõem: Acarichthys, Apistogramma, Crenicichla, Dicrossus, Geophagus, Gymnogeophagus e Satanoperca (Tabela 3). O maior número de dados cromossômicos nessa tribo está concentrado no complexo “Geophagus” brasiliensis, entretanto Geophagus itapicuruensis é caracterizado citogeneticamente pela primeira vez nesse trabalho. A presença de 2n=48 cromossomos é uma característica plesiomórfica e amplamente difundida em Cichlidae (Feldberg et al., 2003), conforme observado para todas as populações e espécies de Geophagus aqui analisadas. Das espécies de Geophagini com dados citogenéticos, apenas as pertencentes ao gênero Apistogramma possuem número diplóide diferente de 48 cromossomos, com Apistogramma borellii apresentando o cariótipo mais derivado (2n=38) (Thompson, 1979). Entretanto, várias fórmulas cariotípicas vêm sendo descritas para espécies dessa tribo (Tabela 3), que possui número fundamental (NF) variando de 50, em Gymnogeophagus balzanii (Feldberg & Bertollo, 1985) e algumas populações de Geophagus brasiliensis (Feldberg & Bertollo, 1985; Poletto et al., 2010a, 2012a), a 70 em Apistogramma ortmanni e Apistogramma agassizii (Thompson, 1979). Essa variação posiciona essa tribo como estruturalmente derivada dentro de Cichlidae, divergindo do NF basal para a ordem Perciformes (NF=48) proposto por Brum e Galetti (1997). Porém, os cariótipos mais apomórficos em ciclídeos são encontrados em Symphysodon (tribo Cichlasomatini). As espécies desse gênero chegam a apresentar NF=118, uma característica incomum tanto para a família quanto para a ordem (Gross et al., 2009a, 2010). Um número fundamental igual a 50 foi constante para as espécies e populações do complexo “Geophagus” brasiliensis das bacias costeiras da Bahia, mas fórmulas cariotípicas diferentes já foram descritas para G. brasiliensis com variações de NF entre 50 a 56 (Tabela 3). Mudanças na PPGGBCmorfologia cromossômica sem alterações do número diplóide ao longo da evolução cromossômica são comumente interpretadas como resultante de inversões pericêntricas. Esse tipo de rearranjo é relativamente comum entre os vertebrados (Sumner, 2003) e em Perciformes é considerado o principal fator responsável por sua divergência (Molina, 2006). Cromossomos portadores desse tipo de rearranjo podem ser mantidos na população principalmente se não resultam na perda ou ganho de material genético relevante a seus portadores. 73

Embora as inversões pericêntricas sejam consideradas a principal fonte de variação cromossômica em Perciformes (Feldberg et al., 2003; Galetti et al., 2000), é possível que outros rearranjos possam estar envolvidos. Por exemplo, em Centropyge aurantonotus, um representante marinho da ordem Perciformes, o elevado valor de NF (92) com manutenção do 2n=48 foi parcialmente atribuído ao acúmulo de heterocromatina nos braços curtos de cromossomos originalmente acrocêntricos (Affonso & Galetti, 2005). O mesmo foi detectado em ciclídeos do gênero Symphysodon concomitantemente com rearranjos numéricos (Gross et al., 2009a). Contudo, no caso dos exemplares do gênero Geophagus analisados nesse trabalho e por outros autores usando técnicas de bandamento C, os blocos heterocromáticos eram restritos a regiões pericentroméricas, conforme discutido adiante. Consequentemente, não há indícios de processos de heterocromatinização ou acúmulo de heterocromatina na modificação da macroestrutura cariotípica nesse grupo, reforçando o papel das inversões. Considerando que o NF=48 seria plesiomórfico para Cichlidae (e demais Perciformes), a fórmula cariotípica encontrada nas amostras de Geophagus analisadas indica uma baixa incidência de alterações macroestruturais na evolução cariotípica das populações e espécies das bacias costeiras da Bahia quando comparadas a outras localidades. As únicas exceções são as populações de G. brasiliensis do interior de São Paulo estudadas por Feldberg & Bertollo (1985) e Poletto et al. (2010a, 2012a) que também apresentaram cariótipos compostos por 2m/sm+46st/a. Cariótipos semelhantes também são encontrados em outros gêneros da tribo Geophagini como Gymnogeophagus balzanii e Gymnogeophagus sp. n. (Feldberg & Bertollo, 1984, 1985; Roncati et al., 2007). O compartilhamento de caracteres macrocariotípicos em populações de bacias historicamente pouco relacionadas e espécies distintas sugere que a presença de um único par m/sm seja uma característica ancestral em Geophagini. Essa proposição é apoiada por dados morfológicos, uma vez que Geophagus representa o gênero-tipo dessa tribo, intimamente relacionado com GymnogeophagusPPGGBC em análises filogenéticas (Weidner, 2000; Smith et al., 2008). Como suporte adicional a essa hipótese, as espécies com morfologia mais diferenciada dentro dessa tribo, como os ciclídeos-anões do gênero Apistogramma e os predadores de corpo fusiforme do gênero Crenicichla, são os que apresentam fórmulas cromossômicas mais divergentes do plesiomórfico para a família (Tabela 3). É importante ressaltar que essa diversidade de fórmulas cariotípicas em Geophagini pode ser, em parte, influenciada por diferenças na condensação da cromatina, levando à discrepância na distinção de cromossomos submetacêntricos e subtelocêntricos entre os autores (Feldberg et al., 2003). Ainda assim, outros dados apóiam que Geophagus brasiliensis 74

realmente represente um complexo de espécies, pois variações consideráveis na morfologia externa, coloração e caracteres citogenéticos, são assinaladas entre as populações (Brum et al., 1998). Tais variações normalmente não são verificadas em outros representantes congêneres. Por exemplo, amostras de Geophagus proximus e Geophagus cf. proximus analisadas por Poletto et al (2010a, 2012a), além de três populações de Geophagus surinamensis estudadas por diferentes autores (Thompson, 1979; Feldberg & Bertollo, 1985; Poletto et al., 2010a, 2012a) não apresentaram diferenças na fórmula cariotípica. Além das características macrocariotípicas, informações sobre regiões cromossômicas são igualmente importantes para a caracterização de espécies e populações. Entre os segmentos passíveis de análise nos cromossomos de peixes, a heterocromatina revelada pelo bandamento C, constitui um marcador capaz de diferenciar populações com cariótipos semelhantes (Jacobina et al., 2009). Nas populações e espécies aqui analisadas, as bandas C foram visualizadas, principalmente, na região pericentromérica da maioria dos cromossomos, característica altamente conservada entre os ciclídeos (Martins-Santos et al., 1995; Brum et al., 1998; Bettin-Pires et al, 2010). Acredita-se que a predominância de heterocromatina ao redor dos centrômeros constitua outra plesiomorfia para a família Cichlidae, pois espécies consideradas basais como Astronotus ocellatus e Cichla kelberi seguem esse modelo de distribuição (Kullander, 1998; Farias et al., 2001; Smith et al., 2008). Essa aparente preferência na localização de blocos heterocromáticos nas regiões pericentroméricas em todos os cromossomos ainda revela que as seqüências repetitivas não estão disseminadas aleatoriamente no genoma. Ao mesmo tempo, essas regiões não estão necessariamente limitadas aos segmentos pericentroméricos (Mazzuchelli & Martins, 2009; Teixeira et al., 2009). Em Symphysodon, um gênero derivado de Cichlidae, grandes quantidades de heterocromatina foram observadas em quase todos os cromossomos, chegando a ocupar as regiões proximais dos braços curtos e longos em algunsPPGGBC pares (Takai et al., 2002; Mesquita et al., 2008; Gross et al., 2009a). No presente trabalho, algumas populações do complexo “Geophagus” brasiliensis do rio de Contas e das bacias do Recôncavo Sul e Una-Almada exibiram, embora sutilmente, marcações paracentroméricas e terminais por bandamento C que enfatizam a diferenciação interpopulacional. Similarmente, exemplares de Geophagus brasiliensis do rio Jaguaiaíva na bacia do rio Paranapanema (Paraná, sul do Brasil) apresentaram uma distribuição divergente de heterocromatina com blocos heterocromáticos intersticiais conspícuos em alguns pares. Esse padrão permitiu diferenciar essa população de outras em bacias próximas, como aquelas do rio Tibagi (Vicari et al., 2006). O conjunto desses dados reforça a evolução dinâmica da 75

heterocromatina, mesmo em espécies com tendências à conservação de caracteres cromossômicos simplesiomórficos. O caráter dinâmico da heterocromatina passa a ter implicações biológicas mais relevantes a partir da década de 90, quando vários relatos mostraram que essa classe de cromatina poderia interferir na estrutura e função de genes e genomas em vários organismos. Por exemplo, já foi demonstrado que o acúmulo de heterocromatina em áreas específicas do genoma favorece a ocorrência de rearranjos cromossômicos (Lim & Simmons, 1994; Dimitri et al., 1997). Assim, a heterocromatina pode operar na especiação cromossômica e ser uma das principais formas de evolução genômica (Biémont & Vieira, 2006). Atualmente, sabe-se que diversas funções também são influenciadas pela heterocromatina, tais como: segregação cromossômica, organização nuclear, regulação da expressão gênica e recombinação gênica (Grewal & Jia, 2007; Skipper, 2007; Bühler, 2009). Outras evidências mostram que as regiões heterocromáticas podem agir ainda na regulação da mitose, progressão do ciclo celular e proliferação das células em associação com respostas a muitas formas de estresses exógenos, como choques térmicos e hipóxia (Burt & Trivers, 2006; Varriale et al., 2008). Desta forma, é possível que as diferenças encontradas no padrão heterocromático e na quantidade e intensidade de bandas C nos cariótipos das espécies de Geophagus nesse e em outros estudos sejam, ainda que parcialmente, relacionadas à adaptação ao ambiente de cada sistema hídrico. Uma hipótese similar foi inferida para explicar o padrão de bandamento C peculiar em espécies do gênero Symphysodon, grupo altamente especializado para ambientes de águas escuras e paradas da bacia Amazônica (Gross et al., 2010). Adicionalmente, populações do peixe neotropical Leporinus elongatus (Characiformes, Anostomidae) foram subdivididas a partir de correlações entre padrões distintos de bandamento C e diferenças morfológicas (Molina et al., 2008). Contudo, a extensão e a eventual validação do papel adaptativo da distribuiçãoPPGGBC da heterocromatina em ciclídeos são dificultadas pela ausência de estudos citogenéticos comparativos entre populações da maioria das espécies já estudadas. Assim como a heterocromatina, a identificação de sequências específicas de DNA repetitivo representa uma ferramenta eficaz para entender organização genômica e evolução cromossômica em vertebrados. Essa abordagem vem sendo amplamente utilizada, em ciclídeos africanos, com ênfase nas espécies de tilápia (Martins et al., 2004) e alguns ciclídeos neotropicais (Vicari et al., 2006; Bettin-Pires et al, 2008; Mazzuchelli & Martins, 2009; Teixeira et al., 2009; Gross et al., 2009ab, 2010; Poletto et al., 2010a, 2012a; Ferreira Neto et al., 2010; Perazzo et al., 2011). 76

Decisivamente, as seqüências repetitivas mais estudadas em citogenética de peixes são aquelas codificadoras de RNAr. Essas sequências estão repetidas em tandem e podem ser divididas em duas famílias multigênicas: DNAr 45S que compreende as regiões que transcrevem os genes de RNAr 28S, 18S e 5,8S bem como os espaçadores intergênicos; e DNAr 5S, uma seqüência altamente conservada de 120 pares de base com espaçadores não transcritos de tamanho variável (Martins, 2007). Múltiplas cópias da primeira classe (DNAr 45S) correspondem às regiões organizadoras de nucléolos (RONs), as quais são positivamente marcadas pela impregnação com nitrato de prata (Ag-RONs) quando previamente ativas na intérfase (Howell & Black, 1980; Boisvert et al., 2007). Ambas as famílias de DNAr foram analisadas nas espécies do presente trabalho, cujos dados são discutidos a seguir. Em relação às RONs, todas as populações de Geophagus previamente estudadas são caracterizadas por sistemas simples, com marcações terminais de Ag-RONs no braço curto de um par de cromossomos st/a (Tabela 3). Todavia, esse padrão foi detectado somente em quatro das amostras aqui analisadas (Geophagus itapicuruensis e G. brasiliensis dos rios São Pedro, Oricó e Contas). RONs múltiplas foram detectadas nas demais populações das bacias costeiras da Bahia, variando entre três (rio das Pedras), quatro (rio Preto do Crisciúma) e cinco (rios Rio Preto do Costa e Mineiro) cromossomos portadores de Ag-RONs (Figura 12). Embora pouco frequente, a presença de mais de um par cromossômico com genes de DNAr também já foi relatada em outros ciclídeos, como Astatotilapia latifasciata (Poletto et al., 2010b, 2012b), espécies do gênero Symphysodon (Gross et al., 2010) além dos representantes da tribo Geophagini Crenicichla lepidota (Martins-Santos et al., 1995); Gymnogeophagus gymnogenys (Bettin-Pires et al, 2010) e Satanoperca jurupari (Mendonça et al., 1999). A coloração com fluorocromos base-específicos e a FISH com sondas de DNAr 18S são normalmente utilizadas para confirmar os sítios de Ag-RONs, uma vez que as RONs em peixes costumam ser equivalentes a sítios GC-ricos detectados pela CMA3 (Verma et al., 2011) e a hibridaçãoPPGGBC permite mapear fisicamente as sequências independentemente de sua atividade gênica (Boisvert et al., 2007). Essas metodologias foram aplicadas nas amostras de Geophagus analisadas e revelaram total correspondência com as Ag-RONs apenas em G. brasiliensis dos rios de Contas e Oricó. Desse modo, essas populações, da bacia do rio de Contas parecem ser mais conservadas do ponto de vista carioevolutivo, devido a compartilharem um sistema de RONs simples, caráter basal para os teleósteos (Galetti, 1998). + A falta de concordância entre o número de Ag-RONs, sítios CMA3 e regiões de DNAr 18S mapeadas por FISH observada nas demais amostras de Geophagus da Bahia pode ser explicada por diversos motivos. Conforme comentado anteriormente, o sucesso da técnica de 77

Ag-RONs depende da atividade gênica do DNAr na intérfase precedente, pois o nitrato de prata associa-se a proteínas nucleolares ácidas envolvidas com a atividade transcricional dos genes ribossomais (Howell & Black, 1980; Phillips & Reed; 1996). Esse fator parece ser responsável pelo maior número de sinais de hibridação com sondas de DNAr 18S que marcações Ag-RONs nas populações do rio São Pedro e, particularmente, do Rio das Pedras (seis sinais para FISH e apenas três cromossomos marcados por Ag-RONs) (Figura 12). Outra limitação da utilização da impregnação com nitrato de prata é que suas marcações podem ser inespecíficas, revelando regiões heterocromáticas ricas em resíduos ácidos (Sumner, 1990; Sánchez et al., 1995). Entretanto, essas duas técnicas se complementam, pois RONs de tamanho reduzido podem ser identificadas pelo nitrato de prata quando em atividade, mas permanecem indetectáveis pela FISH devido ao número limitado de cópias ou por falhas no processo de hibridização atribuídas à utilização de sondas heterólogas, conforme proposto em ciclídeos do gênero Symphysodon (Gross et al., 2010). No caso do presente trabalho, o padrão observado em G. brasiliensis do rio Preto do Crisciúma, com quatro marcações de Ag-RONs e três com a FISH poderia ser explicado tanto pela inespecificidade do nitrato de prata como pelas limitações de resolução da FISH. Contudo, é plausível supor que a incongruência entre os sinais de FISH de DNAr 18S e Ag-RONs nessa população seja resultado da emissão insuficiente de fluorescência para a visualização ao microscópio, pois os sinais eram discretos em alguns pares e a hibridação foi realizada com estringência relativamente alta (50%). Por outro lado, um alto conteúdo de bases GC é relatado nas regiões codificadoras ou nas seqüências espaçadoras ou repetitivas adjacentes aos genes de DNAr 18S em peixes (Pendás et al., 1993; Verma et al., 2011). De fato, todas os sítios de DNAr 18S nas espécies e + populações aqui estudadas apresentaram marcações GC-ricas (CMA3 ) mostrando que essa correspondência é válida na maioria dos casos. Contudo, a presençaPPGGBC de sítios adicionais às RONs encontrados em G. itapicuruensis e nas populações de G. brasiliensis dos rios Preto do Costa, Mineiro e, principalmente, no rio Preto do Crisciúma é justificada pelo fato dessa metodologia revelar regiões de DNA repetitivo ricos em GC (Martins & Galetti, 1998). O padrão observado nessas amostras sugere um provável processo de heterocromatinização, onde os segmentos cromossômicos adicionais de segmentos GC-ricos seriam derivados da heterocromatina associada às RONs por amplificação e posterior dispersão genômica por transposições. Essa hipótese foi inferida para explicar padrões similares a esse em outras espécies de peixes, como Leporinus desmotes (Characiformes, Anostomidae) e Centropyge aurantonotus (Perciformes, Pomacanthidae) por 78

Margarido e Galetti (2000) e Affonso e Galetti (2005), respectivamente. Deve-se ressaltar, no entanto, que marcações múltiplas de CMA3 não equivalentes às RONs nunca haviam sido descritas para populações e espécies do gênero Geophagus, constituindo um evento aparentemente raro na tribo Geophagini (Tabela 3). Esses dados indicam um padrão derivado para esses marcadores cromossômicos nas amostras de Geophagus com ocorrência nos sistemas hídricos costeiros da Bahia. A localização dos clusters de DNAr 18S e de sítios ricos em GC em posição terminal nos braços curtos de cromossomos st/a nas amostras analisadas e, portanto, próximos à heterocromatina pericentromérica pode ter favorecido os eventos de transposição, como proposto em Astatotilapia latifasciata (Poletto et al., 2010b, 2012b) e no gênero Symphysodon (Gross et al., 2010). Sabe-se que essa classe de heterocromatina, frequente em Cichlidae (Feldberg et al., 2003), é aparentemente responsável pela forma de buquês observadas em preparações cromossômicas (Fujiwara et al., 1998), conforme demonstrado na Figura 11. Esse comportamento, comumente descrito em Perciformes com grande número de acrocêntricos, facilitaria eventos de translocações (Aguilar et al., 1998, Affonso & Galetti, 2005), levando ao espalhamento de genes de RNAr 18S e/ou de segmentos ricos em GC pelo cariótipo nas populações e espécies de Geophagus aqui analisadas. Além do polimorfismo numérico de sítios ricos em GC e de DNAr 18S, heteromorfismos de tamanho entre cromossomos homólogos nessas regiões foram observadas, muitas vezes acompanhado de variações na atividade transcricional (Ag-RONs). Esse padrão é comumente descritos em ciclídeos, como os Geophagini (Tabela 3) e pode ser associado a erros da DNA polimerase na adição de nucleotídeos durante a replicação e crossing-over desigual, ocasionando acúmulo dessas seqüências (Pendás et al., 1993). Além disso, a tendência da associação na organização nucleolar também poderia facilitar a troca de segmentos e contribuir para o surgimento de heteromorfismos (Wasko & Galetti, 2000). Corroborando essa hipótese, taisPPGGBC associações foram frequentemente visualizadas nas metáfases analisadas nesse trabalho (Figura 11). Diferentemente dos estudos das RONs, dados sobre a localização do gene de RNAr 5S são escassos para Geophagini (Vicari et al., 2006; Ferreira Neto et al.; 2010). Esses autores descrevem a localização do DNAr 5S na região intersticial do braço longo de um par st/a não sintênico aos sítios de DNAr 18S. Esse padrão foi idêntico ao encontrado no complexo “Geophagus” brasiliensis das bacias costeiras da Bahia, revelando que a evolução dessa família de DNAr é altamente conservada nesse grupo de peixes. Essa posição intersticial do DNAr 5S em cromossomos distintos dos portadores de RONs é a situação mais comumente 79

relatada entre os peixes, provavelmente porque a transcrição dos genes do RNAr 18S é efetuada pela RNA polimerase I e do RNAr 5S pela RNA polimerase III (Doudna & Rath, 2002; Hernandez-Verdun et al., 2002; Boivert, 2007), permitindo que esses DNAs possam evoluir separadamente (Galetti Jr. & Martins, 2004). Ainda, a divergência entre as taxas evolutivas do DNAr 45S e DNAr 5S aqui descrita também foi observada em outros grupos da ictiofauna neotropical (Mantovani et al., 2005). Talvez, a não-associação do DNAr 5S com regiões heterocromáticas na maioria das espécies estudadas possa resultar em maior conservadorismo do número e localização desses cístrons. De fato, os padrões divergentes de número e distribuição de sítios de DNAr 5S já descritos em Perciformes estão relacionados à presença equilocal de regiões de DNA repetitivo, como em Astatotilapia latifasciata (Poletto et al., 2010b, 2012b) e Centropyge aurantonotus (Affonso & Galetti, 2005) com, respectivamente, 15 e 18 cromossomos portadores de sinais de FISH com DNAr 5S. Comparando os dados citogenéticos obtidos com os disponíveis na literatura, fica evidente o conservadorismo numérico ao longo da evolução cromossômica do gênero Geophagus (Tabela 3). Contudo, isso não significa que o genoma das espécies desse grupo é estável. Ao contrário, altas taxas evolutivas envolvendo alterações microestruturais parecem caracterizá- lo, especialmente nas bacias costeiras do leste do Brasil. Tais mudanças determinaram a variação no número de sítios de DNAr 18S (ativos ou não) e de regiões coradas com CMA3, confirmando que as famílias multigênicas de DNAr parecem ser um dos componentes de evolução mais rápida no genoma eucariótico (Dover,1986; Eickbush & Eickbush, 2007). Curiosamente, os caracteres cariotípicos descritos em Geophagus itapicuruensis, com Ag- RONs simples e pouco conteúdo de heterocromatina, são mais similares a algumas populações de G. brasiliensis do sudeste do Brasil (Feldberg & Bertollo, 1985; Poletto et al., 2010a, 2012a) do que algumas das demais amostras dessa mesma espécie de bacias costeiras da Bahia. Esse padrão sugere que G. itapicuruensis possa ser mais aparentada com as populações de GeophagusPPGGBC de bacias hidrográficas ao sul da distribuição do complexo do que com as bacias do Leste. A princípio, essa proposição parece ilógica considerando a distância geográfica entre essas regiões, mas análises de endemismo vêm revelando padrões similares. O Rio São Francisco compartilha algumas espécies, quase que exclusivamente, com a área de drenagem do Paraná-Paraguai, evidenciando uma conexão pretérita entre ambas a partir de trocas faunísticas através do Alto Paraguai e cabeceira do rio São Francisco (Hubert & Renno, 2006). Essa relação também já havia sido descrita para algumas espécies de Hypostomus (Montoya-Burgos, 2003). Por sua vez, análises no gênero Cynolebias entre outros colocam parte das espécies endêmicas da região do médio São Francisco em um grupo monofilético 80

com espécies das bacias dos rios Itapicuru e Vazabarris (Costa, 2001; Rosa et al., 2003). Se a bacia do Rio Itapicuru retém similaridades evolutivas com a bacia do São Francisco, é esperado que ela tenha sido igualmente influenciada pela troca faunística com a bacia do Paraná-Paraguai. Para confirmar, tal hipótese, análises envolvendo marcadores moleculares, especialmente de DNA mitocondrial, seriam essenciais. Do ponto de vista, populacional, é interessante destacar que os padrões de distribuição de DNAr 18S e sítios GC-ricos das amostras dos rios das Pedras e Preto do Costa (ambas na bacia do rio de Contas) são mais similares ao padrão da bacia do Recôncavo Sul (rio Mineiro) do que com outras populações do sistema hidrográfico do rio de Contas. A aparente relação entre essas bacias adjacentes constitui um forte indício para uma história evolutiva comum, possivelmente, envolvendo eventos de captura de cabeceira após a dispersão das RONs e + regiões CMA3 , e subsequente isolamento geográfico por vicariância. Essa captura de fluxo hídrico pode acontecer por causa da elevação geofísica (ou subsidência), represamento natural devido ao deslizamento de terra ou por erosão do divisor de águas entre bacias adjacentes (Albert & Crampton, 2010). Como o relevo baiano possui uma topografia plana e de baixa altitude na maior parte das porções médias e baixas das bacias hidrográficas, as fronteiras entre elas podem ter sido semipermeáveis em épocas distintas (Lovejoy et al., 2010). Bacias hidrográficas semipermeáveis no tempo geológico permitem o intercâmbio da ictiofauna, podendo explicar a composição de espécies bastante semelhante entre duas bacias. Assim como no presente estudo, inferências similares foram propostas para explicar a semelhança entre populações das sub-bacias do médio rio de Contas e Recôncavo Sul em outras espécies de peixes, como Astyanax aff. bimaculatus a partir de dados moleculares (Pamponet et al., 2008). Com isso, a bacia do rio de Contas passa a representar a região com maior diversidade cariotípica dentro das amostras estudadas. Obviamente, essa observação é influenciada pelo maior esforço de coletaPPGGBC nessa bacia, com representação de diversos tributários além do rio de Contas. Ainda assim, esse resultado pode ser relacionado às diferentes paisagens e condições climáticas ao longo da bacia do rio de Contas (INEMA, 2012), o que pode levar a adaptações específicas para cada população analisada. Essa possível adaptação local é favorecida pelo comportamento territorialista e cuidado parental de G. brasiliensis (Nelson, 2006; Kadry & Barreto, 2010), características que afetam a vagilidade e o grau de isolamento populacional. Assim, as restrições no fluxo gênico entre as populações de G. brasiliensis poderiam levar ao surgimento e à fixação de rearranjos específicos para cada população, caso essas desempenhem algum papel adaptativo. Efeitos de deriva genética também poderiam resultar 81

na fixação causal de novidades carioevolutivas. Porém, as populações estudadas constituem grupos dominantes na assembléia de peixes de rios costeiros (Sarmento-Soares et al., 2008; Sarmento-Soares et al., 2009; Cetra et al., 2010; Moura et al., 2010), não atendendo assim à premissa básica da deriva, cuja ação é intensificada em populações pequenas e isoladas. Alternativamente, a variabilidade de sítios de DNAr 18S e ricos em GC pode representar recente contato entre os cariomorfos seguido por hibridação e introgressão. Por exemplo, populações de truta-marrom (Salmo trutta) da Península Ibérica apresentam acentuado polimorfismo no número e na localização das RONs. A maior variabilidade desses marcadores foi encontrada em uma região de contato secundário entre duas linhagens divergentes, indicando a ocorrência de hibridação nessa espécie (Martínez et al., 2008). Eventos dessa natureza são particularmente comuns em grupos de grande irradiação adaptativa, como proposto para os ciclídeos neotropicais (Farias, 1999, 2000, 2001; López- Fernández et al., 2005). De fato, muitos ciclídeos, incluindo táxons com sistemas distintos de cromossomos sexuais, podem ser prontamente hibridados em laboratório e produzirem híbridos viáveis e férteis (Zhu et al., 2010). Considerando essa plasticidade genômica de Cichlidae e que as populações de G. brasiliensis com maior variação estão dentro da mesma bacia (rio de Contas), a hipótese de hibridação não pode ser descartada. Assumindo essa hipótese como verdadeira, essas raças cromossômicas estariam isoladas preferencialmente por mecanismos pré-zigóticos, mas não tiveram tempo para evoluir incompatibilidade pós-zigótica nas zonas de contato (Kornfield & Smith, 2000). Independentemente das causas dessa variação (adaptação local, introgressão ou uma combinação de ambas), a peculiar diferenciação interpopulacional de G. brasiliensis nas bacias costeiras da Bahia pode representar um conjunto de raças cromossômicas em especiação incipiente (Feldberg et al., 2003). A ampla distribuição do complexo “Geophagus” brasiliensisPPGGBC aliada às diferenças cariotípicas é mais um indício para a presença de várias espécies nesse complexo (Martins-Santos et al., 1995; Brum et al., 1998). Essa hipótese foi testada e corroborada por Mattos (2010), usando dados morfológicos nas populações do leste do Brasil. Esse autor descreveu e validou 11 espécies do complexo “Geophagus” brasiliensis, incluindo aquela que o nomeia. Entre as espécies do complexo confirmadas nesse trabalho para as bacias costeiras da Bahia estão: Geophagus sp. n. 1 nas cabeceiras da bacia do rio Paraguaçu, Geophagus sp. n. 2 na sub-bacia do alto rio de Contas, Geophagus obscurus na bacia do rio Paraguaçu, Geophagus itapicuruensis na bacia do rio Itapicuru e Geophagus brasiliensis com maior área de distribuição. Esses dados somados às 82

informações citogenéticas aqui obtidas reforçam a distinção de G. brasiliensis em relação às demais populações do sudeste e sul do Brasil, indicando mecanismos distintos de evolução cromossômica, com possíveis desdobramentos em novas espécies. O estabelecimento dessas diferenças entre população e espécies é fundamental, pois a incapacidade de distinção entre elas podem determinar ruídos em estudos evolutivos (Magurran, 1998) e levar à estimativa errônea da diversidade e riqueza de determinado local. Sendo assim, a utilização em conjunto de marcadores morfológicos, citogenéticos e moleculares, deve ser cada vez mais frequente em sistemática. Marcadores neutros podem ser explorados em uma estrutura genética populacional, para contrastar com diferenças associadas com fenótipos adaptativos (Loh et al. 2008). Sob essa perspectiva, análises morfométricas também foram realizadas nas amostras do complexo “Geophagus” brasiliensis, usando dois métodos de agrupamento baseados na distância D2 de Mahalanobis (Tabela 5): otimização de Tocher e UPGMA. Esses métodos são aplicados para dividir um conjunto original de observações em grupos, revelando o grau de similaridade entre eles (Cruz & Regazzi, 2001), e geraram resultados equivalentes nesse trabalho (Tabela 6; Figura 13). Essa congruência estaria relacionada à robustez dos dados analisados, uma vez que é estabelecido que os estudos de caracteres morfométricos usando variáveis canônicas devem incluir o menor número de variáveis para explicar, pelo menos, 80% da variação observada nos dados originais (Cruz & Carneiro, 2006). As duas primeiras variáveis canônicas explicaram 100% da variação original identificada nas populações e espécies de Geophagus de bacias costeiras da Bahia, distribuídas em 99,13% para a primeira variável e 0,86% para a segunda (Tabela 7). Consequentemente, os gráficos de dispersão obtidos a partir da análise discriminante independente do tamanho também geraram resultados equivalentes aos identificados pelos métodos de agrupamento (Figuras 14 e 15). Conjuntamente, esses resultados permitiram separar claramente as amostras de G. brasiliensis de G. PPGGBCitapicuruensis, apoiando os dados de Mattos (2010) que validaram as duas espécies. (Figuras 13 a 15). A consistência desses agrupamentos foi medida pelo coeficiente de correlação cofenética, que revelou um valor extremamente alto (0,9043), considerando que dendrogramas adequados são aqueles que apresentam valores acima de 0,8 (Rohlf, 2000). Por outro lado, dentre as amostras de G. brasiliensis, foi demonstrado que, algumas vezes, populações dentro da bacia do rio de Contas exibiram maior similaridade com indivíduos coletados em bacias próximas do que entre rios da própria bacia. Por exemplo, as amostras dos rios Oricó (Bacia do rio de Contas), Mineiro (Bacia do Recôncavo Sul) e São Pedro (Bacia do Una-Almada) mostraram-se mais similares, enquanto as demais populações da 83

Bacia do rio de Contas (rios das Pedras, Preto do Costa, Preto do Crisciúma) foram agrupadas á parte daquela do rio de Contas (Figura 13). Esses dados morfométricos revelam padrões de similaridade interpopulacional mais relacionados às características ambientais que ao modelo clássico de isolamento por distância e diferem do descrito pelas análises citogenéticas. De fato, as populações dos rios Oricó, Mineiro e São Pedro estão localizadas em uma típica região de Mata Atlântica, enquanto os rios das Pedras, Preto do Costa, Preto do Crisciúma estão situados em áreas de transição entre clima tropical úmido e semi-árido. Por outro lado, a porção estudada do rio de Contas está em uma região com predominância de clima semi- árido. Possivelmente, essas diferenças ambientais podem caracterizar distintas pressões seletivas que agem em cada população e desempenham um papel importante nas características fenotípicas. Apesar da eficiência da morfometria para a discriminação de unidades taxonômicas, como a validação da espécie Geophagus itapicuruensis, os dados apontam para a convergência adaptativa do plano corporal dos ciclídeos do gênero Geophagus. Desse modo, inferências filogenéticas baseadas em dados morfométricos nesse grupo de vertebrados devem ser interpretadas com cautela (Kornfield & Smith, 2000), sendo mais indicadas para discutir processos adaptativos e interação genótipo: fenótipo. Evidências similares são relatadas em outras espécies de Cichlidae, colocando essa família como um dos grupos de vertebrados com maior número de casos de convergência morfológica (Wimberger, 1991, 1992; Kornfield & Smith, 2000; Kocher, 2004). Nesse grupo, fenótipos semelhantes relacionados a circunstâncias ecológicas particulares têm evoluído, resultando em indistinguíveis adaptações tróficas e de forrageamento a despeito de diferenças na coloração em espécies geograficamente isoladas (Sturmbauer & Meyer, 1992). Visando analisar a dinâmica do tecido ósseo em resposta a estímulos mecânicos, Wimberger (1991) investigou o efeito de diferentes dietas sobre a forma corporal de jovens de Geophagus brasiliensisPPGGBC e Geophagus steindachneri, espécies que diferem no período em que os alevinos começam a alimentar-se de fontes exógenas. Nesse experimento, o padrão de mudanças foi similar para ambas as espécies: os peixes que se alimentaram de náuplios de Artemia salina desenvolveram cabeças mais alongadas e rasas, corpo relativamente menor e nadadeiras mais estreitas que aqueles que consumiram larvas de quironomídeos. Outros exemplos do papel da dieta sobre características fenotípicas em ciclídeos são descritos em Cichlasoma managuense (Meyer, 1987) e Cichlasoma minckleyi (Trapani, 2003), uma vez que peixes criados com dietas distintas em laboratório desenvolveram diferenças na mandíbula. 84

Adicionalmente, a ocorrência de dieta flexível é uma característica marcante da ictiofauna fluvial tropical. A maioria das espécies de peixes tropicais pode adaptar-se a diferentes fontes alimentícias tão logo ocorram oscilações na abundância relativa do recurso alimentar por alterações ambientais espaço-temporais, especialmente aquelas envolvendo o regime hidrológico (Wootton, 1999; Abelha et al., 2001). Além disso, Junk (1980) enfatizou que as mudanças hidrológicas afetam também a qualidade dos alimentos. Nesse processo de exploração de recursos alimentares, tal variabilidade individual freqüentemente leva ao polimorfismo trófico e, conseqüentemente, ao surgimento de morfotipos, que são formas de uma mesma espécie que diferem em hábitat, dieta e morfologia (Wimberger, 1994). Esses relatos fornecem um possível embasamento teórico para a maior divergência morfológica da população do rio de Contas dentro do grupo formado por Geophagus brasiliensis. Essa população está situada na calha principal da bacia sob influência de diversos tributários e de intensa ocupação humana (INEMA, 2012). Assim, a disponibilidade de diferentes recursos alimentares e tolerância a condições ambientais subótimas em Geophagus brasiliensis (Mattos, 2010) pode ter levado a uma adaptação trófica, originando diferentes morfotipos. Exemplos dessa diferenciação morfológica possivelmente relacionada a fatores ambientais ocorrem entre os exemplares do rio de Contas e rio Oricó (Figura 13), populações com acentuada similaridade citogenética. O mesmo é válido para a separação fenotípica entre as populações da Bacia do rio de Contas (rios das Pedras e Preto do Costa) e do Recôncavo Sul (rio Mineiro), amostras geneticamente similares, com maior número de cópias de DNAr 18S. A combinação de dados citogenéticos e morfométricos nas populações e espécies do complexo “Geophagus” brasiliensis aqui estudadas apóiam as considerações de diversos autores (Lundberg, 1993; Pamponet et al., 2008). Segundo eles, enquanto as características ambientais podem explicar as diferenças observadas entre as populações, especialmente dentro de uma mesmaPPGGBC bacia hidrográfica, fatos históricos podem fornecer informações sobre a estreita relação entre as populações das bacias distintas. Essa discrepância entre ambientes atuais e distribuição das espécies sugere que o impacto das barreiras de dispersão passadas ou outros fatores históricos ainda perdurem. No entanto, sem dados ecológicos suficientes, a discrepância pode não ser aparente, ou pode ser incorretamente interpretada (Tuomisto, 2007). Infelizmente, pouco se sabe sobre a evolução paleogeográfica da região Nordeste. Os dados disponíveis, contudo, demonstram que o conjunto de espécies de peixes de água doce nessa região representa o resultado de diversos processos históricos e ecológicos (Lundberg et 85

al., 1998; Vilas-Bôas et al., 2001; Bizzi et al., 2003; Hubert & Renno, 2006; Carnaval et al., 2009). Efeitos antrópicos, como as alterações ambientais e os programas de introdução de espécies, também parecem ter afetado a ictiofauna regional pela exclusão de elementos autóctones da fauna original (Moura et al., 2010). Os dados disponíveis na literatura, tais como intervalo de distribuição de alguns grupos de peixes e a identificação de espécies endêmicas, sugerem a existência de unidades biogeográficas ou sub-províncias ao longo das bacias costeiras do leste do Brasil, que podem ter servido como refúgios (Bizerril, 1999; Ribeiro, 2006). Entender essas histórias evolutivas complexas é um problema de grande importância em estudos biogeográficos, uma vez que a superposição de eventos pode produzir várias mudanças nas distribuições das espécies e, por isso, complexos padrões de distribuição são esperados (McLennan & Brooks, 2002; Brooks & Van Veller, 2003). Os resultados aqui encontrados parecem confirmar a “hipótese de museu” (Fjeldsa 1994; Nores, 1999) segundo a qual as planícies tropicais atuam como museus onde uma grande variedade de espécies se acumula e as incursões marinhas constituem grandes eventos vicariantes, favorecendo a divergência de linhagens. Com base nessa hipótese, duas previsões podem ser esperadas para peixes de água doce: (1) alto nível de endemismo nas áreas localizadas nas terras emersas durante o Mioceno, e (2) um maior número de espécies nas planícies, contrastando com baixos níveis de endemismo (Hubert & Renno, 2006). Considerando que as áreas amostradas estão situadas em regiões relativamente altas das bacias hidrográficas da Bahia com muitos pontos próximos às cabeceiras (rios Preto do Crisciúma, Preto do Costa, Mineiro e Pedras), o primeiro padrão seria, de fato, esperado. Muitos estudos também mostram que uma importante parcela da biodiversidade neotropical foi perdida no Pleistoceno com as glaciações. Nesse processo, as áreas de Mata Atlântica mais ao sul do continente sulamericano possuíam climas relativamente instáveis em comparação com aquelas atualmente mais secas na porção norte-central do Brasil (Andrade- Lima, 1982; CarnavalPPGGBC et al., 2009). Evidências recentes baseadas em dados moleculares em vertebrados terrestres e modelos paleoclimáticos assumem que essas últimas serviram como um refúgio glacial para a biodiversidade durante os extremos climáticos do Pleistoceno e Plioceno superior (Carnaval & Moritz, 2008; Carnaval et al., 2009; Martins, 2011). Essas áreas, ainda pouco estudadas, compreendem habitats altamente fragmentados e parecem constituir um hotspot de biodiversidade, prioritárias para a conservação biológica (Paese et al., 2010; Cruz-Neto et al., 2011). A diversidade citogenética das populações de Geophagus brasiliensis com a presença de particularidades microestruturais distintas das populações de outras regiões do Brasil 86

constituem mais um forte indício para o modelo de refúgio inicialmente proposto por Carnaval e Moritz (2008). O surgimento de diferentes morfotipos e a provável dispersão de sítios ribossomais e/ou ricos em GC pelo cariótipo na maior parte das amostras estudadas também reforçam essa teoria, pois a ausência de processos de extinção local favoreceria o aumento da diversidade genética e fenotípica. Desse modo, a extensão para espécies aquáticas do padrão descrito em vertebrados terrestres impõe a necessidade de esforços conservacionistas, historicamente focados nas regiões sul e sudeste do Brasil, para as bacias da região nordeste. Sem essas medidas, a destruição de habitat, poluição ambiental e a introdução de espécies alóctones ou exóticas, comuns na região (Cetra et al., 2010), poderiam apagar rapidamente as marcas dos processos históricos, impedindo a compreensão dos mecanismos responsáveis pelo endemismo dessas áreas (Carnaval et al., 2009). Finalmente, os resultados desse trabalho situam o complexo “Geophagus” brasiliensis como um excelente modelo biogeográfico devido à ampla distribuição geográfica e à plasticidade genotípica e fenotípica de seus representantes, além de reterem caracteres plesiomórficos que permitem a polarização dos dados. Entretanto, como muitos grupos que ocorrem nas bacias do Atlântico Leste (Rosa et al., 2003), esse gênero ainda merece maiores revisões taxonômicas que evitem conclusões errôneas ou conflitantes no estabelecimento de padrões de distribuição e caracterização da diversidade do grupo. O avanço no conhecimento das relações históricas entre as bacias geográficas da Bahia depende ainda de estudos adicionais sobre a composição faunística, uma vez que extensas áreas são praticamente inexploradas, bem como de estudos adicionais que estabeleçam as relações filogenéticas para um maior número de grupos monofiléticos (Sarmento-Soares et al., 2008; Sarmento-Soares et al., 2009; Cetra et al., 2010; Moura et al., 2010). Quando grupos monofiléticos distintos exibem padrões congruentes de distribuição e possibilitam o reconhecimento de áreas de endemismo, pode-se produzir hipóteses mais confiáveis para explicar como esses padrões se desenvolveram aoPPGGBC longo do tempo (Rosa et al., 2003). Recomenda-se assim que grupos monofiléticos distintos da ictiofauna típica do nordeste do Brasil de distribuição ampla dentro e fora das bacias estudadas sejam incluídos em estudos futuros. Somente a reunião desses dados pode fornecer as peças adicionais ao intrincado cenário evolutivo e biogeográfico dessa importante e desprotegida região da América do Sul.

87

6 Conclusões O emprego de múltiplas ferramentas, tais como marcadores citogenéticos e morfométricos, no complexo “Geophagus” brasiliensis mostrou-se eficaz para identificação taxonômica e de unidades evolutivas nesse complexo; Os dados citogenéticos disponíveis para o complexo “Geophagus” brasiliensis foram ampliados, sendo realizada a primeira descrição cariotípica de G. itapicuruensis; As espécies e populações estudadas apresentaram conservadorismo do número diplóide plesiomórfico dos Cichlidae (2n=48), enquanto os sítios de DNAr 18S mostraram-se variáveis, com a primeira descrição de RONs múltiplas nesse grupo; A fórmula cariotípica de 2sm+46st/a (NF=50) parece constituir um caráter simplesiomórfico de Geophagini a partir de análises comparativas; A associação entre sítios de DNAr 18S e regiões ricas em GC e a disposição não- aleatória de cromossomos st/a nas células metafásicas podem explicar a dispersão desses cístrons associadas a translocações e transposições de seqüências de DNA repetitivo; O genoma de espécies do gênero Geophagus parece evoluir predominantemente por alterações cromossômicas estruturais (inversões pericêntricas, polimorfismos de regiões ricas em GC e de sítios de DNAr); Diferentemente do DNAr 18S, os sítios de DNAr 5S foram conservados em posição intersticial de um par st/a, não sintênico às RONs, possivelmente devido à ausência de blocos heterocromáticos ricos em GC; A similaridade entre o padrão citogenético entre a Bacia do Recôncavo Sul e Bacia do Rio de Contas parece indicar um evento de captura de cabeceiras entre elas após a dispersão do DNAr 18S pelo genoma; A discriminação de G. itapicuruensis em relação às demais amostras confirmou a ocorrência dePPGGBC espécie endêmica no estado da Bahia, informação relevante para a conservação da ictiofauna regional; A diferenciação morfológica nas populações de G. brasiliensis foi mais sutil e congruente com o tipo de ambiente, revelando uma possível convergência adaptativa; A Bacia do rio de Contas parece ser um hotspot importante para a conservação do complexo “Geophagus” brasiliensis; Os dados apresentados nesse trabalho e aqueles disponíveis na literatura demonstram a necessidade de revisões taxonômicas no gênero Geophagus a fim de proporcionar um cenário real sobre a diversidade desse grupo e do inter-relacionamento de suas espécies. 88

8 Referências bibliográficas ABELHA, MCF.; AGOSTINHO, AA. & GOULART, E. 2001. Plasticidade trófica em peixes de água doce. Acta Scientiarum, vol. 23, no. 2, p. 425-434. AFFONSO, PRAM & GALETTI Jr, PM. 2005. Chromosomal diversification of reef fishes from genus Centropyge (Perciformes, Pomacanthidae). Genetica, vol. 123, p 227–233. AGUILAR, CT.; CORRÊA, MMO. & GALETTI Jr, PM. 1998. Chromosome associations by centromeric heterochromatin in marine fishes. Chromosome Science, vol. 2, p. 73-76. ALBERT, JS. & CRAMPTON, WG. 2010. The geography and ecology of diversification in Neotropical freshwaters. Nature Education Knowledge, vol. 1, no. 10, p. 13. ALCARAZ, HSV.; GRAÇA, WJ. & SHIBATTA, OA. 2008. Microglanis carlae, a new species of bumblebee (Siluriformes: Pseudopimelodidae) from the río Paraguay basin in Paraguay. Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 3, p. 425-432. ALCARAZ, HSV.; PAVANELLI, CS. & BERTACO, VA. 2009. Astyanax jordanensis (Ostariophysi: Characidae), a new species from the rio Iguaçu basin, Paraná, Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 7, no. 2, p. 185-190. ALLENDORF, FW. & LUIKART, G. 2006. Conservation and the Genetics of Populations. Blackwell Publishing, New York, NY. ANA (Agência Nacional de Águas. Região Hidrográfica Atlântico Leste. Disponível em . Acesso em 23 de fevereiro de 2012. ANDRADE-LIMA, D. 1982. Present-day forest refuges in Northeastern Brazil. In PRANCE, GT. Biological diversification in the tropics. Columbia University Press, New York. p. 245- 251 ARAÚJO, FG & SANTOS, LN. 2001. Distribution of fish assemblages in Lajes reservoir, Rio de Janeiro, Brazil. Brazilian Journal of Biology, vol. 61, no. 4, p. 563-576. ARBOUR, JH. &PPGGBC LÓPEZ-FERNÁNDEZ, H. 2011. Guianacara dacrya, a new species from the rio Branco and Essequibo River drainages of the Guiana Shield (Perciformes: Cichlidae). Neotropical Ichthyology, vol. 9, no. 1, p. 87-96. ARRATIA, G.; LÓPEZ-ARBARELLO, A.; PRASAD, GVR.; PARMAR, V. & KRIWET, J. 2004. Late Cretaceous-Paleocene percomorphs (Teleostei) from India – Early radiation of Perciformes. In: ARRATIA, G.; WILSON, MVH. & CLOUTIER, R. Recent advances in the origin and early radiation of vertebrates. Verlag. München, Alemanha. p. 635-663. 89

ARTONI RF.; VICARI, MR. & BERTOLLO, LAC. 2000. Citogenética de peixes neotropicais: métodos, resultados e perspectivas. Biological and Health Sciences, vol. 6, p. 43-60. AXELROD, HR. 1996. The most complete colored lexicon of cichlids. 2a ed. TFH Publications. NJ, USA. 864 p. AZUMA, Y.; KUMAZAWA, Y.; MIYA, M.; MABUCHI, K. & NISHIDA, M. 2008. Mitogenomic evaluation of the historical biogeography of cichlids toward reliable dating of teleostean divergences. BMC Evolutionary Biology, vol. 8, p. 215. BARLOW, GW. 2000. The fishes: nature's grand experiment in evolution. Perseus publishing, Cambridge. BEGG, G.A.; FRIEDLAND, K. & PEARCE, JB. 1999. Stock identification and its role in stock assessment and fisheries management: an overview. Fisheries Reasearch, vol. 43, p.1-8. BENINE, RC.; CASTRO, RMC. & SANTOS, ACA.2007. A new Moenkhausia Eigenmann, 1903 (Ostariophysi: Characiformes) from Chapada Diamantina, rio Paraguaçu Basin, Bahia, Northeastern Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 5, no. 3, p.259-262. BENINE, RC.; MARIGUELA, TC.& OLIVEIRA, C. 2009. New species of Moenkhausia Eigenmann, 1903 (Characiformes: Characidae) with comments on the Moenkhausia oligolepis species complex. Neotropical Ichthyology, vol. 7, no. 2, p. 161-168. BENZAQUEM, DC.; FELDBERG, E.; PORTO, JIR.; GROSS, MC & ZUANON , JAS. 2008. Cytotaxonomy and karyoevolution of the genus Crenicichla (perciformes, cichlidae). Genetics and Molecular Biology, vol. 31, p. 250-255. BERTACO, VA. & CARVALHO, FR. 2010. New species of Hasemania (Characiformes: Characidae) from Central Brazil, with comments on the endemism of upper rio Tocantins basin, Goiás State. Neotropical Ichthyology, vol. 8, no. 1, p. 27-32. BERTACO, VA. & GARUTTI, V. 2007. New Astyanax from the upper rio Tapajós drainage, Central Brazil (Characiformes:PPGGBC Characidae). Neotropical Ichthyology, vol. 5, no. 1, p. 25-30. BERTACO, VA. & LUCENA, CAS. 2006. Two new species of Astyanax (Ostariophysi: Characiformes: Characidae) from eastern Brazil, with a synopsis of the Astyanax scabripinnis species complex. Neotropical Ichthyology, vol. 4, no. 1, p. 53-60. BERTACO, VA. & MALABARBA, LR. 2010. A review of the Cis-Andean species of Hemibrycon Günther (Teleostei: Characiformes: Characidae: Stevardiinae), with description of two new species. Neotropical Ichthyology, vol. 8, no. 4, p. 737-770. BERTACO, VA.; CARVALHO, FR. & JEREP, FC. 2010. Astyanax goyanensis (Miranda- Ribeiro, 1944), new combination and Astyanax courensis, new species (Ostariophysi: 90

Characiformes): two Characidae from the upper rio Tocantins basin, Central Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 8, no. 2, p. 265-275. BERTACO, VA.; JEREP, FC. & CARVALHO, FR. 2011. New species of Moenkhausia Eigenmann (Ostariophysi: Characidae) from the upper rio Tocantins basin in Central Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 9, no. 1, p. 57-63, BERTACO, VA.; MALABARBA, LR.; HIDALGO, M. & ORTEGA, H. 2007a. A new species of Hemibrycon (Teleostei: Characiformes: Characidae) from the río Ucayali drainage, Sierra del Divisor, Peru. Neotropical Ichthyology, vol. 5, no. 3, p. 251-257. BERTACO, VA.; MALABARBA, LR. & DERGAM, JA. 2007b. New Hyphessobrycon from the upper rio Pardo drainage in eastern Brazil (Teleostei: Characiformes: Characidae). Neotropical Ichthyology, vol. 5, no. 3, p. 245-249. BERTAN, I.; CARVALHO, FIF.; OLIVEIRA, AC.; VIEIRA, EA; HARTWIG, I.; SILVA, JAG; SHIMIDT, DAM.; VALÉRIO, IP.; BUSATO, CC. & RIBEIRO, G. 2006. Comparação de métodos de agrupamento na representação da distância morfológica entre genótipos de trigo. Revista Brasileira de Agrociência, vol. 12, no. 3, p. 279-286. BERTOLLO, LAC.; TAKAHASHI, CS. & MOREIRA-FILHO, O. 1978. Cytotaxonomic considerations on Hoplias lacerdae (Pisces, Erythrinidae). Brazilian Journal of Genetics, vol 1, p. 103-120. BETTIN-PIRES, L.; GIULIANO-CAETANO, L. & DIAS, AL. 2010. Cytogenetic characterization of Geophagus brasiliensis and two species of Gymnogeophagus (Cichlidae: Geophaginae) from Guaiba Lake, RS, Brazil. Folia Biologica, vol. 58, no. 1-2, p. 29-34. BETTIN-PIRES, LB.; GIULIANO-CAETANO, L. & DIAS, AL. 2008. Karyotype similarities among two populations of Geophagus brasiliensis (Perciformes, Cichlidae) from the Tibagi river basin/PR/Brazil. Caryologia, v.61, p.135-138. BICHUETTE, ME. & TRAJANO, E. 2008. Ituglanis mambai, a new subterranean catfish from a karst areaPPGGBC of Central Brazil, rio Tocantins basin (Siluriformes: Trichomycteridae). Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 1, p. 9-15. BICHUETTE, ME.; PINNA, MCC. & TRAJANO, E. 2008. A new species of Glaphyropoma: the first subterranean copionodontine catfish and the first occurrence of opercular odontodes in the subfamily (Siluriformes: Trichomycteridae). Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 3, p. 301-306. BIÉMONT, C & VIEIRA, C. 2006. Genetics - Junk DNA as an evolutionary force. Nature, vol. 443, p. 521-524. 91

BIRINDELLI, JLO. & BRITSKI, HA. 2009. New species of the genus Leporinus Agassiz (Characiformes: Anostomidae) from the rio Curuá, rio Xingu basin, Serra do Cachimbo, Brazil, with comments on Leporinus reticulatus. Neotropical Ichthyology, vol. 7, no. 1, p. 1- 10. BIRINDELLI, JLO.; SOUSA, LM. & PÉREZ, MH. 2008. New species of thorny catfish, genus Leptodoras Boulenger (Siluriformes: Doradidae), from Tapajós and Xingu basins, Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 3, p. 465-480. BIRINDELLI, JLO.; ZANATA, AM. & LIMA, FCT. 2007. Hypostomus chrysostiktos, a new species of armored catfish (Siluriformes: Loricariidae) from rio Paraguaçu, Bahia State, Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 5, no. 3, p. 271-278. BIRINDELLI, JLO.; ZANATA, AM.; SOUSA, LM. & NETTO-FERREIRA, AL. 2009. New species of Jupiaba Zanata (Characiformes: Characidae) from Serra do Cachimbo, with comments on the endemism of upper rio Curuá, rio Xingu basin, Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 7, no. 1, p. 11-18. BIZERRIL, CRSF. 1999. A ictiofauna da bacia do Rio Paraíba do Sul. Biodiversidade e padrões biogeográficos. Brazilian Archives of Biology and Technology, vol. 42, no. 2. BIZZI, LA.; SCHOBBENHAUS, C.; VIDOTTI, RM. & GONÇALVES, JH. 2003. Geologia, Tectônica e Recursos Minerais do Brasil. Serviço Geológico do Brasil (CPRM), Brasília. BOISVERT, FM.; KONINGSBRUGGEN, SV.; NAVASCUÉS, J. & LAMOND, AI. 2007. The multifunctional nucleolus. Molecular Cell Biology, vol. 8, p. 574-585. BOOKSTEIN, FL. 1982. Foundation of morphometrics. Annual Review in Ecology and Systematics, vol, 13, p. 441-480. BOOKSTEIN, FL. 1991. Morphometric tools for landmark data. Cambridge University Press, Cambridge, New York. 435 p. BRITSKI, HA. & BIRINDELLI, JLO. 2008. Description of a new species of the genus Leporinus Spix (Characiformes:PPGGBC Anostomidae) from the rio Araguaia, Brazil, with comments on the and distribution of L. parae and L. lacustris. Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 1, p. 45-51. BRITSKI, HA. & AKAMA, A. 2011. New species of Trachycorystes Bleeker, with comments on other species of the genus (Ostariophysi: Siluriformes: Auchenipteridae). Neotropical Ichthyology, vol. 9, p. 273–279. BRITTO, MR.; LIMA, FCT. & HIDALGO, MH. 2007. Corydoras ortegai, a new species of corydoradine catfish from the lower río Putumayo in Peru (Ostariophysi: Siluriformes: Callichthyidae). Neotropical Ichthyology, vol. 5, no. 3, p. 293-300. 92

BROOKS, DR. & VAN VELLER, MGP. 2003. Critique of parsimony analysis of endemicity as a method of historical biogeography. Journal of Biogeography, vol. 30, p. 819–825. BRUM, MJI. & GALETTI Jr, PM. 1997. Teleostei ground plan karyotype. Journal Comparative Biology, vol. 2, no. 2, p. 91–102. BRUM, MJI.; OLIVEIRA, CC.; VOIGT, N. & CÔRREA MMO. 1998. Karyotypic discrepancy between populations of Geophagus brasiliensis (Perciformes: Cichlidae), including the topotypical population, with possible taxonomic implications. Journal Comparative Biology, vol. 3, p. 177-184. BÜHLER, M. 2009. RNA turnover and chromatin-dependent gene silencing. Chromosoma, vol. 118, p. 141–151. BÜHRNHEIM, CM. & MALABARBA, LR. 2007. Redescription of Odontostilbe pulchra (Gill, 1858) (Teleostei: Characidae: Cheirodontinae), and description of two new species from the río Orinoco basin. Neotropical Ichthyology, vol. 5, no. 1, p. 1-20. BÜHRNHEIM, CM.; CARVALHO, TP.; MALABARBA, LR. & WEITZMAN, SH. 2008. A new genus and species of characid fish from the Amazon basin - the recognition of a relictual lineage of characid fishes (Ostariophysi: Cheirodontinae: Cheirodontini). Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 4, p. 663-678. BURT, A. & TRIVERS, R. 2006. Genes in conflict: the biology of selfish genetic elements. Harvard University Press, Cambridge. p. 228-300. CALEGARI, BB. & REIS, R.E. 2010. A new species of Microlepidogaster (Siluriformes: Loricariidae: Hypoptopomatinae) from the upper rio Paraná basin, Brazil.Neotropical Ichthyology, vol. 8, no. 3, p. 625-630. CANTATORE, P.; ROBERTI, M.; PESOLE, G.; LUDOVICO, A.; MILELLA, F.; GADALETAL, MN. & SACCONE, C. 1994. Evolutionary analysis of cytochrome b sequences in some perciformes: Evidence for a slower rate of evolution than in mammals. Journal of MolecularPPGGBC Evolution, vol. 39, no. 6, p. 589-597. CARDOSO, AR. 2010. Bunocephalus erondinae, a new species of banjo catfish from southern Brazil (Siluriformes: Aspredinidae). Neotropical Ichthyology, vol. 8, no. 3, p. 607- 613. CARNAVAL, AC. & MORITZ, C. 2008. Historical climate modeling predicts patterns of current biodiversity in the Brazilian Atlantic Forest. Journal of Biogeography, vol. 35, p. 1187–1201. 93

CARNAVAL, AC.; HICKERSON, MJ.; HADDAD, CFB.; RODRIGUES, MT. & MORITZ, C. 2009. Stability predicts genetic diversity in the Brazilian Atlantic Forest Hotspot. Science, vol. 323, p. 785–789. CARRUTH, L. 2000. Freshwater cichlid Crenicara punctulata is a protogynous sequential hermaphrodite. Copeia. p. 71-82. CARVALHO, FR.; BERTACO, VA. & JEREP, FC. 2010a. Hemigrammus tocantinsi: a new species from the upper rio Tocantins basin, Central Brazil (Characiformes: Characidae). Neotropical Ichthyology, vol. 8, no. 2, p. 247-254. CARVALHO, PH.; LIMA, FCT. & ZAWADZKI, CH. 2010b. Two new species of the Hypostomus cochliodon group (Siluriformes: Loricariidae) from the rio Negro basin in Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 8, no. 1, p. 39-48. CARVALHO, TP. & BERTACO, VA. 2006. Two new species of Hyphessobrycon (Teleostei: Characidae) from upper rio Tapajós basin on Chapada dos Parecis, Central Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 4, no. 3, p. 301-308. CARVALHO, TP. & REIS, RE. 2011. Taxonomic review of Hisonotus Eigenmann & Eigenmann (Siluriformes: Loricariidae: Hypoptopomatinae) from the laguna dos Patos system, southern Brazil. Neotropical Ichthyology, vol.9, no.1, p. 1-48. CARVALHO, TP.; LEHMANN-A., P. & REIS, RE. 2008. Gymnotocinclus anosteos, a new uniquely-plated genus and species of loricariid catfish (Teleostei: Siluriformes) from the upper rio Tocantins basin, central Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 3, p. 329-338. CASCIOTTA, J.; ALMIRÓN, A.; PIÁLEK, L.; GÓMEZ, S. & RÍCAN, O. 2010. Crenicichla ypo (Teleostei: Cichlidae), a new species from the middle Paraná basin in Misiones, Argentina. Neotropical Ichthyology, vol. 8, no. 3, p. 643-648. CASTELLANOS-MORALES, C. A. 2008. Trichomycterus uisae: a new species of hypogean catfish (Siluriformes: Trichomycteridae) from the northeastern Andean Cordillera of Colombia. NeotropicalPPGGBC Ichthyology, vol. 6, p. 307-314. CASTRO, RMC. & JUCÁ-CHAGAS, R. 2008. Lygnobrycon myersi (Miranda-Ribero, 1956). In: Livro Vermelho da Fauna Brasileira Ameaçada de Extinção, vol. II, Ministério do Meio Ambiente. Ed. Brasília, DF, p. 75-77. CAVALCANTI, MJ. & LOPES, PRD. 1991. Morfometria comparada de Ctenosciaena gracilicirrhus, Paralonchurus brasiensis e Micropogonias furnieri (Teleostei, Scianidae) pela análise multivariada de redes de treliças. Revista Brasileira de Zoologia, vol. 77, p. 627- 635. 94

CETRA M.; SARMENTO-SOARES, LM & MARTINS-PINHEIRO, RF. 2010. Peixes de riachos e novas Unidades de Conservação no sul da Bahia. Pan-American Journal of Aquatic Sciences, vol. 5, no. 1, p. 11-21. CHAKRABARTY, P. 2004. Cichlids biogeography: comment and review. Fish and Fisheries, vol. 5, p. 97-119. CHEW, JS.; OLIVEIRA, C.; WRIGHT, JM. & DOBSON, MJ. 2002. Molecular and cytogenetic analysis of the telomeric (TTAGGG)n repetitive sequences in the Nile tilapia, Oreochromis niloticus (Teleostei: Cichlidae). Chromosoma, vol. 111, no. 1, p. 45-52. CNAANI , A.; LEE, BY.; ZILBERMAN, N.; OZOUF-COSTAZ, C.; HULATA, G.; RON, M.; D'HONT, A.; BAROILLER, JF.; D'COTTA, H.; PENMAN, DJ.; TOMASINO, E.; COUTANCEAU, JP.; PEPEY, E.; SHIRAK, A. & KOCHER, TD. 2008. Genetics of sex determination in tilapiine species. Sexual Development, vol. 2, no. 1, p. 43-54. COSTA, WJEM. 2001. The neotropical annual fish genus Cynolebias: phylogenetic relationships, taxonomic revision and biogeography. Ichthyological Exploration of Freshwaters, vol. 12, p. 333-383. COSTA, WJEM.; RAMOS, TPA.; ALEXANDRE, LC. & RAMOS, RTC. 2010. Cynolebias parnaibensis, a new seasonal killifish from the caatinga, Parnaíba River basin, northeastern Brazil, with notes on sound producing courtship behavior (Cyprinodontiformes: Rivulidae). Neotropical Ichthyology, vol. 8, no. 2, p. 283-288. CRA (CENTRO DE RECURSOS AMBIENTAIS). 2001. Recursos Hídricos. In: Avaliação da Qualidade das Águas. Relatório Técnico/Avaliação Ambiental. Centro de Recursos Ambientais. ed. Salvador, Brasil. p. 15-389. CRUZ, C.D. 2008. Programa Genes - Diversidade Genética. 1° ed. Viçosa, MG: Editora UFV. vol. 1, 278 p. CRUZ, CD. & CARNEIRO, PCS. 2006. Modelos biométricos aplicados ao melhoramento genético. 2ª. ed. revisada,PPGGBC Editora UFV, Viçosa. vol.2, 585 p. CRUZ, CD. & REGAZZI, AJ. 2001. Modelos Biométricos Aplicados ao Melhoramento Genético. Editora UFV, Viçosa. 390p. CRUZ-NETO, O.; MACHADO, IC.; DUARTE Jr., JA. & LOPES, AV. 2011. Synchronous phenology of hawkmoths (Sphingidae) and Inga species (Fabaceae–Mimosoideae): implications for the restoration of the Atlantic forest of northeastern Brazil. Biodiversity Conservation, vol. 20, p. 751–765. DANLEY, PD. & KOCHER, TD. 2001. Speciation in rapidly diverging systems: lessons from Lake Malawi. Molecular Ecology, vol. 10, p. 1075-1086. 95

DIMITRI, P.; ARCA, B.; BERGHELLA, L. & MEI, E. 1997. High genetic instability of heterochromatin after tranposition of the LINE-like I factor in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 94, p. 8052-8057. DOUDNA, JA. & RATH, VL. 2002. Structure and function of the eukaryotic ribosome: the next frontier. Cell, vol. 109, p. 153–156. DOVER, GA. 1986. Linkage disequilibrium and molecular drive in the rDNA gene family. Genetics, vol. 122, p. 249-252. EICKBUSH, TH. & EICKBUSH, DG. 2007. Finely orchestrated movements: Evolution of the ribosomal RNA genes. Genetics, vol. 175, p. 477-485. FARIAS, IP.; ORTI, G & MEYER, A. 2000. Total evidence: molecules, morphology, and the phylogenetics of cichlid fishes. Journal of Experimental Zoology, vol. 288, p. 76–92. FARIAS, IP.; ORTI, G.; SAMPAIO, I.; SCHNEIDER, H & MEYER, A. 1999. Mitochondrial DNA phylogeny of the family Cichlidae: Monophyly and fast molecular evolution of the Neotropical assemblage. Journal of Molecular Evolution, vol. 48, p. 703-711. FARIAS, IP.; ORTÍ, G.; SAMPAIO, I.; SCHNEIDER, H. & MEYER, A. 2001. The Cytochrome b gene as a phylogenetic marker: the limits of resolution for analyzing relationships among cichlid fishes. Journal of Molecular Evolution, vol. 53, p. 89–103. FARIAS, LN.; PIECZARKA, JC.; NAGAMACHI, CY.; SOUTO, PSS.; COELHO, PN. & BARROS, RM. 1999. Estudos cariotípicos de duas espécies da família Cichlidae (Pisces, Perciformes) do rio Peixe-boi (Amazônia, PA). Genetics and Molecular Biology (Suppl.), vol. 22, no. 3, p. 73. FELDBERG, E. & BERTOLLO, LAC. 1984. Discordance in chromosome number among somatic and gonadal tissue cells of Gymnogeophagus balzanii (Pisces, Cichlidae). Brazilian Journal of Genetics, vol. 7, p. 639-645. FELDBERG, E. & BERTOLLO, LAC. 1985. Karyotypes of 10 species of Neotropical cichlids (Pisces, Perciformes)PPGGBC. Caryologia, vol. 38, p. 257-268. FELDBERG, E. & BERTOLLO, LAC. 1985. Nucleolar organising regions in some species of Neotropical cichlid fish (Pisces, Perciformes). Caryologia, vol. 38, p. 319-324. FELDBERG, E.; PORTO, JIR. & BERTOLLO, LAC. 2003. Chromosomal changes and adaptation of cichlid fishes during evolution. In: VAL, AL. & KAPOOR, BG. Fish adaptations. New Dehli & New York: Science Publishers. p. 285-308. FELDBERG, E.; PORTO, JIR.; ALVES-BRINN, MN.; MENDONCA, MNC. & BENZAQUEM DC. 2004. B chromosomes in Amazonian cichlid species. Cytogenetic and Genome Research, vol. 106, p. 195-198. 96

FENOCCHIO, AS.; PASTORI, MC.; RONCATI, H.; MOREIRA-FILHO, O. & BERTOLLO, LAC. 2003. A cytogenetic survey of the fish fauna from Argentina. Caryologia, vol. 56, p. 197-204. FERREIRA NETO, M.; OLIVEIRA, C.; FORESTI, F.; NOGAROTO, V.; ALMEIDA, MC.; ARTONI, RF.; VICARI, MR & MOREIRA-FILHO, O. 2010. Comparative cytogenetic study among three fish species: an analysis from a water divide region. Publicatio UEPG: Ciências Biológicas e da Saúde, vol.16, no.1, p. 19-28. FERREIRA, IA.; POLETTO, AB.; KOCHER, TD.; MOTA-VELASCO, JC.; PENMA, DJ. & MARTINS, C. 2010. Chromosome evolution in African cichlid fish: contributions from the physical mapping of repeated DNAs. Cytogenetic and Genome Research, vol. 129, no. 4, p. 314-322. FERREIRA, KM. & CARVAJAL, FM. 2007. Knodus shinahota (Characiformes: Characidae) a new species from the río Shinahota, río Chapare basin (Mamoré system), Bolivia. Neotropical Ichthyology, vol. 5, no. 1, p. 31-36. FERREIRA, KM.; MENEZES, NA. & QUAGIO-GRASSIOTO, I. 2011. A new genus and two new species of Stevardiinae (Characiformes: Characidae) with a hypothesis on their relationships based on morphological and histological data. Neotropical Ichthyology, vol. 9, no. 2, p. 281-298. FERRER, J.; MALABARBA, LR. & COSTA, WJEM. 2008. Austrolebias paucisquama (Cyprinodontiformes: Rivulidae), a new species of annual killifish from southern Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 2, p.175-180. FIGUEIREDO, CA. & BRITTO, MR. 2010.A new species of Xyliphius, a rarely sampled banjo catfish (Siluriformes: Aspredinidae) from the rio Tocantins-Araguaia system.Neotropical Ichthyology, vol.8, no.1, p. 105-112. FJELDSA, J. 1994. Geographical patterns for relict and young species of birds in Africa and South America andPPGGBC implications for conservation priorities. Biodiversity and Conservation, vol. 3, p. 207–226. FRANKHAM, R.; BALLOU, JD. & BRISCOE, DA. 2008. Fundamentos de genética da conservação. Ribeirão Preto, SP: Sociedade Brasileira de Genética. 280p. FRIEL, JP. 2008. Pseudobunocephalus, a new genus of banjo catfish with the description of a new species from the Orinoco River system of Colombia and Venezuela (Siluriformes: Aspredinidae). Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 3, p. 293-300. FUJIWARA, A.; ABE, S.; YAMAHA, E.; YAMAZAKI, F. & YOSHIDA, MC. 1998. Chromosomal localization and heterochromatin association of ribosomal RNA gene loci and 97

silver–stained nucleolar organizer regions in salmonid fishes. Chromosoma Research, vol. 6, p. 463–471. GALETTI Jr, PM. 1998. Chromosome diversity in Neotropical fishes: NOR studies. Italian Journal of Zoology (Suppl.) vol. 65, p. 53-56. GALETTI Jr. PM.; AGUILAR CT. & MOLINA, WF. 2000. An overview of marine fish cytogenetics. Hydrobiologia, vol. 420, no.1, p. 55-62. GALETTI Jr., PM. & MARTINS, C. 2004. Contribuição da hibridização in situ para conhecimento dos cromossomos de peixes. In: Guerra, M. FISH: Conceitos e aplicações na citogenética. Sociedade Brasileira de Genética, Ribeirão Preto, Brasil. p. 61-88. GARAVELLO, JC. & SHIBATTA, OA.2007. A new species of the genus Pimelodus Lacépède, 1803 from the rio Iguaçu basin and a reappraisal of Pimelodus ortmanni Haseman, 1911 from the rio Paraná system, Brazil (Ostariophysi: Siluriformes: Pimelodidae). Neotropical Ichthyology, vol. 5, no. 3, p. 285-292. GARUTTI, V. & VENERE, PC. 2009. Astyanax xavante, a new species of characid from middle rio Araguaia in the Cerrado region, Central Brazil (Characiformes: Characidae). Neotropical Ichthyology, vol. 7, no. 3, p. 377-383. GIORA, J.; MALABARBA, LR. & CRAMPTON, W. 2008. Brachyhypopomus draco, a new sexually dimorphic species of Neotropical electric fish from southern South America (Gymnotiformes: Hypopomidae). Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 2, p. 159-168. GODINHO, HP. & GODINHO, AL. 1994. Ecology and conservation of fish in southeastern Brazilian river basins submitted to hydroelectric impoundments. Acta Limnologica Brasiliensia, vol.5, p. 187-197. GONÇALVES, LSA.; RODRIGUES, R.; AMARAL JÚNIOR, AT.; KARASAWA, M. & SUDRÉ, CP. 2008. Comparison of multivariate statistical algorithms to cluster tomato heirloom accessions. Genetics and Molecular Research, vol. 7, p. 1289-1297. GONZÁLEZ-BERGONZONI,PPGGBC I.; LOUREIRO, M. & OVIEDO, S. 2009. A new species of Gymnogeophagus from the río Negro and río Tacuarí basins, Uruguay (Teleostei: Perciformes). Neotropical Ichthyology, vol. 7, no. 1, p. 19-24. GOODWIN, NB.; BALSHINE-EARN, S. & REYNOLDS JD. 1998. Evolutionary transitions in parental care in cichlid fish. Proceedings of the Royal Society of London B, vol. 265, p. 2265-2272. GRAÇA, WJ. & PAVANELLI, CS. 2008. Characidium heirmostigmata, a new characidiin fish (Characiformes: Crenuchidae) from the upper rio Paraná basin, Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 1, p. 53-56. 98

GREWAL, SIS. & JIA, S. 2007. Heterochromatin revised. Nature reviews, vol. 8, p. 35-46. GROSS, MC.; FELDBERG ,E.; CELLA, DM.; SCHNEIDER, MC.; SCHNEIDER, CH.; PORTO, JI. & MARTINS, C. 2009a. Intriguing evidence of translocations in Discus fish (Symphysodon, Cichlidae) and a report of the largest meiotic chromosomal chain observed in vertebrates. Heredity, vol. 102, no.5, p. 435-441. GROSS, MC.; SCHNEIDER, CH.; VALENTE, GT.; MARTINS, C. & FELDBERG, E. 2010. Variability of 18s rdna locus among Symphysodon fishes: chromosomal rearrangements. Journal of Fish Biology, vol. 76, no.5, p. 1117-1127. GROSS, MC.; SCHNEIDER, CH.; VALENTE, GT.; PORTO, JI.; MARTINS, C. & FELDBERG, E. 2009b. Comparative cytogenetic analysis of the genus Symphysodon (discus fishes, cichlidae): chromosomal characteristics of retrotransposons and minor ribosomal DNA. Cytogenetic and Genome Research, vol. 127, no. 1, p. 43-53. HATANAKA, T. & GALETTI Jr, PM. 2004. Mapping of the 18S and 5S ribosomal RNA genes in the fish Prochilodus argenteus Agassiz, 1829 (Characiformes, Prochilodontidae). Genetica, vol. 122, p. 239-244. HELFMAN, GS.; COLLETTE, BB.; FACEY, DE. & BOWEN, BW. 2009. The diversity of fishes: biology, evolution and ecology. 2a. ed. Hong Kong, Wiley-Blackwell. HERNANDEZ-VERDUN, D.; ROUSSEL, P. & GÉBRANE-YOUNÈS, J. 2002. Emerging concepts of nucleolar assembly. Journal of Cell Science. 115. p. 2265-2270. HILSDORF, AW. & PETRERE JR, M. 2002. Conservação de peixes na Bacia do rio Paraíba do Sul. Ciência Hoje, vol. 30, no. 180, p. 62-65. HOWELL, WM. & BLACK, DA. 1980. Controlled silver staining of nucleolus organizer region with protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia. vol. 36, p. 1014- 1015. HUBERT, N. & RENNO, J. 2006. Historical biogeography of South American freshwater fishes. Journal of Biogeography.PPGGBC vol. 33, p. 1414–1436. HULSEY, CD. 2006. Function of a key morphological innovation: fusion of the cichlid pharyngeal jaw. Proceedings of the Royal Society B, vol. 273, no. 1587, p. 669-675. 99

IICA (Instituto Interamericano de Cooperação para a Agricultura). Análise dos regimentos internos dos comitês das bacias hidrográficas dos rios Itapicurú e Salitre. Disponível em:. Acesso em 23 de fevereiro de 2012. INEMA (Instituto do Meio Ambiente e Recursos Hídricos). Comitês de Bacias. Disponível em: . Acesso em 23 de fevereiro de 2012. INGENITO, LFS.; GHAZZI, MS.; DUBOC, LF. & ABILHOA, V. 2008. Two new species of Rineloricaria (Siluriformes: Loricariidae) from the rio Iguaçu basin, southern Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 3, p. 355-366. JACOBINA, UP.; AFFONSO, PRAM.; CARNEIRO, PLS. & DERGAM, JA. 2009. Biogeography and comparative cytogenetics between two populations of Hoplias malabaricus (Bloch, 1794) (Ostariophysi: Erythrinidae) from coastal basins in the State of Bahia, Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 7, no.4, p. 617-622. JAMES, FC & MCCULLOCH, CE. 1990. Multivariate analysis in ecology and systematics: Panacea or Pandora’s box? Annual Review Ecology Systematic, vol. 21, p.129-166. JEREP, FC.; SHIBATTA, OA. & ZAWADZKI, CH. 2007. A new species of Hypostomus Lacépède, 1803 (Siluriformes: Loricariidae) from the upper rio Paraná basin, Southern Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 5, no. 4, p. 435-442. JUNK, W.J. 1980. Áreas inundáveis: um desafio para a limnologia. Acta Amazonica, vol. 10, no. 4, p. 775-796. KADRY, VO & BARRETO, RE. 2010. Environmental enrichment reduces aggression of pearl cichlid, Geophagus brasiliensis, during resident-intruder interactions. Neotropical Ichthyology, vol. 8, no. 2, p. 329-332. KEENLEYSIDE, MHA. 1991. Parental Care. In: KEENLEYSIDE, MHA. Cichlid Fishes: Behaviour, EcologyPPGGBC and Evolution. New Delhi, Chapman and Hall. p.191-208. KHATTREE, R. & NAIK, DN. 2000. Multivariate data reduction and discrimination with SAS software. Cary, NC: SAS Institute. p. 588. KOCHER TD. 2004. Adaptive evolution and explosive speciation: the cichlid fish model. Nature Reviews Genetics, vol. 5, p. 288-298. KORNFIELD, I. & SMITH, PF. 2000. African cichlid fishes: Model system for evolutionary biology. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics, vol. 31, p.163-196. KULLANDER, SO. 1983. Revision of the South American cichlid genus Cichlasoma. Swedish Museum of Natural History, Stockholm. 100

KULLANDER, SO. 1986. Cichlid Fishes of the Amazon River Drainage of Peru. Monograph: Department of Vertebrate Zoology, Swedish Museum of Natural History. Stockholm. 431p. KULLANDER, SO. 1998. A Phylogeny and Classification of the South American Cichlidae (Teleostei: Perciformes). In: MALABARBA, LR.; VARI, R.P., LUCENA, ZMS. & LUCENA, CAS. Phylogeny and Classification of Neotropical Fishes. Porto Alegre, Edipucs. p. 461-498. KULLANDER, SO. 2003. Family Cichlidae. In: REIS, RE.; KULLANDER, SO. & FERRARIS Jr, CJ. Check List of Freshwater Fishes of South and Central America. Porto Alegre, Edipucs. p. 605-655. KULLANDER, SO. & LUCENA, CAS. 2006. A review of the species of Crenicichla (Teleostei: Cichlidae) from the Atlantic coastal rivers of southeastern Brazil from Bahia to Rio Grande do Sul State, with description of three new species. Neotropical Ichthyology, vol. 4, p. 127-146. LAGLER, KF.; BARDACH, JE.; MILLER, RR. & PASSINO, DRN. 1977. Ichthyology. John Wiley & Sons Ltd, New York. p. 506. LEHMANN-A., P. 2006. Otocinclus batmani, a new species of Hypoptopomatine catfish (Siluriformes: Loricariidae) from Colombia and Peru. Neotropical Ichthyology, vol. 4, no. 4, p. 379-383. LEVAN, A.; FREDGA, K. & SANDBERG, AA. 1964. Nomenclature for centromeric position on chromosomes. Hereditas, vol. 52, p. 201-220. LIEM, KF. 1980. Adaptive significance of intra and interspecific differences in the feeding repertoires of cichlid fishes. American Zoologist, vol. 20, p. 295–314. LIEM, KF. 1991. Functional morphology. In: KEENLEYSIDE, MHA. Cichlid Fishes: Behaviour, Ecology and Evolution. New Delhi, Chapman and Hall. p. 129-150. LIM, J.K & SIMMONS,PPGGBC M.J. 1994. Gross chromosome rearrangements mediated by transposable elements in Drosophila melanogaster. Bioessays, vol. 16, p. 269-275. LIMA, FCT. & BRITSKI, HA. 2007. Salminus franciscanus, a new species from the rio São Francisco basin, Brazil (Ostariophysi: Characiformes: Characidae). Neotropical Ichthyology, vol. 5, no.3, p. 237-244. LIMA, FCT.; WOSIACKI, WB. & RAMOS, CS. 2009. Hemigrammus arua, a new species of characid (Characiformes: Characidae) from the lower Amazon, Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 7, no. 2, p. 153-160. 101

LIMA, SMQ.; LAZZAROTTO, H. & COSTA, WJEM. 2008. A newspecies of Trichomycterus (Siluriformes: Trichomycteridae) fromLagoaFeia drainage, southeastern Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 6, p. 315-322. LOH, YH.; KATZ, LS.; MIMS, MC.; KOCHER, TD.; YI, SV. & STREELMAN, JT. 2008. Comparative analysis reveals signatures of differentiation amid genomic polymorphism in Lake Malawi cichlids. Genome Biology, vol. 9, no. 7, p. R113. LÓPEZ-FERNÁNDEZ, H. & TAPHORN, DC. 2004. Geophagus abalios, G. dicrozoster and G. winemilleri (Perciformes: Cichlidae), three new species from Venezuela. Zootaxa, vol. 439, p. 1-27. LÓPEZ-FERNÁNDEZ, H.; HONEYCUTT, RL.; STIASSNY, MLJ. & WINEMILLER, K. O. 2005. Morphology, molecules, and character congruence in the phylogeny of South American geophagine cichlids (Perciformes, Labroidei). Zoologica Scripta, vol. 34, p.627-651. LOUREIRO, M.; DUARTE, A. & ZARUCKI, M. 2011. A new species of Austrolebias Costa (Cyprinodontiformes: Rivulidae) from northeastern Uruguay, with comments on distribution patterns. Neotropical Ichthyology, vol. 9, no. 2, p. 335-342. LOUREIRO, MA.; GIULIANO-CAETANO, L. & DIAS, AL. 2000. Cytogenetic characterization of two species of the genus Crenicichla (Pisces, Cichlidae). Cytologia, vol. 65, p. 57-63. LOVEJOY, NR.; WILLIS, SC. & ALBERT, JS. 2010. Molecular signatures of Neogene biogeographic events in the Amazon fish fauna. In: HOORN, CM. & WESSELINGH, FP. Amazonia, Landscape and Species Evolution. Blackwell Publishing, London. p. 405-417 LOWE-MCCONNELL, RH. 1991. Ecology of Cichlids in South American and African Waters, excluding the African Great Lakes. In: KEENLEYSIDE, MHA. Cichlid Fishes: Behaviour, Ecology and Evolution. New Delhi, Chapman and Hall. p.60-85. LUCENA, CAS. 2007. Two new species of the genus Crenicichla Heckel, 1840 from the upper rio UruguayPPGGBC drainage (Perciformes: Cichlidae). Neotropical Ichthyology, vol. 5; no. 4, p. 449-456. LUCINDA, PHF. 2008. Systematics and biogeography of the genus Phalloceros Eigenmann, 1907 (Cyprinodontiformes: Poeciliidae: Poeciliinae), with the description of twenty-one new species. Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 2, p. 113-158. LUCINDA, PHF.; LUCENA CAS. & ASSIS, NC. 2010. Two new species of cichlid fish genus Geophagus Heckel from the Rio Tocantins drainage (Perciformes: Cichlidae). Zootaxa, vol. 2429, p 29–42. 102

LUJAN, NK. 2008. Description of a new Lithoxus (Siluriformes: Loricariidae) from the Guayana Highlands with a discussion of Guiana Shield biogeography. Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 3, p. 413-418. LUNDBERG, JG. & DAHDUL, WM. 2008. Two new cis-Andean species of the South American catfish genus Megalonema allied to trans-Andean Megalonema xanthum, with description of a new subgenus (Siluriformes: Pimelodidae). Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 3, p. 439-454. LUNDBERG, JG. 1993. African-South American freshwater fish clades and continental drift: problems with a paradigm. In: GOLDBLATT, P. Biological Relationships between Africa and South America. Yale University Press. p. 156-199. LUNDBERG, JG.; MARSHALL, LG.; GUERRERO, J.; HORTON, B.; MALABARBA, MCSL. & WESSELING, F. 1998. The stage for neotropical fish diversification: A history of tropical South American Rivers. In: MALABARBA, LR.; REIS, RE.; VARI, RP.; LUCENA, ZM. & LUCENA, CAS. Phylogeny and classification of Neotropical fishes. Edipucrs, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil. 603 p. MAGURRAN A. 1998. Population differentiation without speciation. Philosophical Transactions of the Royal Society B, vol. 353, no. 1366, p. 275–286. MANTOVANI M.; ABEL, LD. & MOREIRA-FILHO, O. 2005. Conserved 5S and variable 45S rDNA chromosomal localisation revealed by FISH in Astyanax scabripinnis (Pisces,

Characidae). Genetica, vol. 123, no. 3, p. 211-216. MARCENIUK, AP. & BETANCUR-R., R. (2008). Revision of the species of the genus Cathorops (Siluriformes: Ariidae) from Mesoamerica and the Central American Caribbean, with description of three new species.Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 1, p. 25–44. MARGARIDO, VP. & GALETTI Jr., PM. 2000. Amplification of a GC-rich heterochromatin in the freshwater fish Leporinus desmotes (Characiformes, Anostomidae). Genetics and Molecular Biology,PPGGBC vol 23, no. 3, p. 569-573. MARINHO, MMF. & LIMA, FCT. 2009. Astyanax ajuricaba: a new species from the Amazon basin in Brazil (Characiformes: Characidae). Neotropical Ichthyology, vol. 7, no. 2, p. 169-174. MARTÍNEZ. P.; CASTRO, J.; PARDO, BG.; BOUZA, C.; HERMIDA, M. & VILAS, R. 2008. High Ag-NOR-site variation associated to a secondary contact in brown trout from the Iberian Peninsula. Genetica, vol. 136, no. 3, p. 419-27. 103

MARTINS, C. 2007. Chromosomes and repetitive DNAs: a contribution to the knowledge of fish genome. In: PISANO, E.; OZOUF-COSTAZ, C.; FORESTI, F. & KAPOOR, BG. Fish Cytogenetics. Science Publisher, New Hampshire, EUA. p. 421-453. MARTINS, C. & GALETTI Jr., PM. 1998. Karyotype similarity between two sympatric Schizodon fish species (Anostomidae, Characiformes) from the Paraguay River basin. Genetics and Molecular Biology, vol. 21, no. 3, p. 355-360. MARTINS, C. & GALETTI JR, PM. 1999. Chromosomal localization of 5S rRNA genes in Leporinus fish (Anostomidae, Characiformes). Chromosome Research, vol. 7, p. 363-367. MARTINS, C.; OLIVEIRA, C.; WASKO, AP & WRIGTH, JM. 2004. Physical mapping of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) genome by fluorescent in situ hybridization of repetitive DNAs to metaphase chromosomes - a review. Aquaculture, vol. 231, p. 37-49. MARTINS, C.; WASKO, AP.; OLIVEIRA, C. & WRIGHT, J. 2000. Nucleotide sequence of 5S rDNA and localization of the ribosomal RNA genes to metaphase chromosomes of the Tilapiini cichlid fish, Oreochromis niloticus. Hereditas, vol. 133, p. 39-46. MARTINS, FM. 2011. Historical biogeography of the Brazilian Atlantic forest and the Carnaval-Moritz model of Pleistocene refugia: what do phylogeographical studies tell us? Biological Journal of the Linnean Society, vol. 103, p. 1-11. MARTINS, FO. & LANGEANI, F. 2011. Rhinolekos, a new genus with three new species of Hypoptopomatinae (Siluriformes: Loricariidae) from upper rio Paraná. Neotropical Ichthyology, vol. 9, no. 1, p. 65-78. MARTINS-SANTOS, IC.; PORTELA-CASTRO, ALB. & JULIO Jr, HF. 1995. Chromosome analysis of 5 species of the Cichlidae family (Pisces, Perciformes) from the Paraná River. Cytologia, vol. 60, p. 223-231. MATTOS, JLO. 2010. Revisão taxonômica do grupo de espécies Geophagus brasiliensis (Quoy e Gaimard, 1824) do leste do Brasil (Perciformes: Cichlidae). Rio de Janeiro: Universidade FederalPPGGBC do Rio de Janeiro. Dissertação de Mestrado em Zoologia. p. 84. MAXIME, EL. & ALBERT, JS. 2009. A new species of Gymnotus (Gymnotiformes: Gymnotidae) from the Fitzcarrald Arch of southeastern Peru. Neotropical Ichthyology, vol. 7, no. 4, p. 579-585. MAZZUCHELLI, J. & MARTINS, C. 2009. Genomic organization of repetitive DNAs in the cichlid fish Astronotus ocellatus. Genetica, vol. 136, no. 3, p. 461-469. MAZZUCHELLI, J.; YANG, F.; KOCHER, TD. & MARTINS, C. 2011. Comparative cytogenetic mapping of Sox2 and Sox14 in cichlid fishes and inferences on the genomic organization of both genes in vertebrates. Chromosome Research, vol. 19, no. 5, p. 657-667. 104

MCGUIGAN, K.; CHENOWETH, SF. & BLOWS, MW. 2005. Phenotypic divergence along lines of genetic variance. The American Naturalist, vol. 165, no. 1, p. 32-43. MCLENNAN, DA. & BROOKS, DR. 2002. Complex histories of speciation and dispersal in communities: a re-analysis of some Australian bird data using BPA. Journal of Biogeography, vol. 29, p. 1055–1066. MEDRADO, AS.; FIGUEIREDO, AVA.; WALDSCHIMIDT, AM.; AFFONSO, PRAM. & CARNEIRO, PLS. 2008. Cytogenetic and morphological diversity in populations of Astyanax fasciatus (Teleostei, Characidae) from Brazilian northeastern river basins. Genetics and Moleculat Biology (suppl.), vol. 31, p. 208-214. MELO, BF.; BENINE, RC.; MARIGUELA, TC.& OLIVEIRA, C. 2011. A new species of Tetragonopterus (Characiformes: Characidae: Tetragonopterinae) from the rio Jari, Amapá, northern Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 9, no. 1, p. 49-56. MELO, FAG. & BUCKUP, PA. 2006. Astyanax henseli, a new name for Tetragonopterus aeneus Hensel, 1870 from southern Brazil (Teleostei: Characiformes). Neotropical Ichthyology, vol. 4, no. 1, p. 45-52. MENDONÇA, MNC.; PORTO, JIR. & FELDBERG, E. 1999. Ocorrência de três citótipos em Satanoperca aff. jurupari (Perciformes, Cichlidae) no Catalão, Manaus, AM. Genetics and Molecular Biology (Suppl.), vol. 22, no. 3, p. 69. MENEZES, NA. & RIBEIRO, AC. 2010. Oligosarcus jacuiensis (Characiformes: Characidae), a new species from the Uruguay and Jacuí river basins, southern Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 8, no. 3, p. 649-653. MENEZES, NA. 2006. Description of five new species of Acestrocephalus Eigenmann and redescription of A. sardina and A. boehlkei (Characiformes: Characidae). Neotropical Ichthyology, vol. 4, no. 4, p. 385-400. MENEZES, NA. 2007. Charax goeldii Fowler, 1913 a valid species of Galeocharax Fowler (Characiformes: Characidae).PPGGBC Neotropical Ichthyology, vol. 5, no. 1, p. 21-24. MENEZES, NA.; NETTO-FERREIRA, AL. & FERREIRA, KM. 2009. A new species of Bryconadenos (Characiformes: Characidae) from the rio Curuá, rio Xingu drainage, Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 7, no. 2, p. 147-152. MESQUITA, DR.; PORTO, JIR. & FELDBERG, E. 2008. Chromosomal variability in the wild ornamental species of Symphysodon (Perciformes, Cichlidae) from Amazon. Neotropical Ichthyology, vol. 6, p.181–190. 105

MEYER A. 1987. Phenotypic plasticity and heterochrony in Cichlasoma manguense (Pisces: Cichlidae) and their implications for speciation in cichlid fish. Evolution, vol. 41, p. 1357– 1369. MEYER, A. 1990. Ecological and evolutionary aspects of the trophic polymorphism in Cichlasoma citrinellum (Pisces: Cichlidae). Biological Journal of the Linnean Society, vol. 39, p. 279-299. MICHELE, JL. & TAKAHASHI, CS. 1977. Comparative cytology of Tilapia rendalli and Geophagus brasiliensis (Cichlidae, Pisces). Cytologia, vol. 42, p. 535-537. MIQUELARENA, AM. & LÓPEZ, HL. 2010. Hyphessobrycon nicolasi (Teleostei: Characidae) a new species from the Uruguay River basin in the Mesopotamian Region, Argentina. Neotropical Ichthyology, vol. 8, no. 1, p. 1-6. MIZOGUCHI, SMHK.; PORTELA-CASTRO, ALB. & MARTINS-SANTOS, IC. 2007. Cytogenetic characterization of Crenicichla (Pisces, Perciformes, Cichlidae) of the Iguaçu River. Genetics and Molecular Research, vol. 6, no. 3, p. 650-656. MMA (Ministério do Meio Ambiente). 2000. Avaliação e ações prioritárias para a conservação da biodiversidade da Mata Atlântica e Campos Sulinos por: Conservation International do Brasil, Fundação SOS Mata Atlântica, Fundação Biodiversitas, Instituto de Pesquisas Ecológicas, Secretaria do Meio Ambiente do Estado de São Paulo, SEMAD/Instituto Estadual de Florestas-MG. Brasília: MMA/ SBF. 40p. MMA (Ministério do Meio Ambiente). 2006. Caderno da Região Hidrográfica Atlântico Leste. Ministério do Meio Ambiente, Secretaria de Recursos Hídricos. Brasília, DF. 156 p. MMA (Ministério do Meio Ambiente). 2008. Livro vermelho da fauna brasileira ameaçada de extinção / editores Angelo Barbosa Monteiro Machado, Gláucia Moreira Drummond, Adriano Pereira. 1ª. ed., vol. 2, Brasília, DF/Belo Horizonte, MG: Fundação Biodiversitas. MOLINA, WF. 2006. Chromosomal changes and stasis in marine fish groups. In: PISANO, E.; OZOUF-COSTAZ,PPGGBC C.; FOREST, F. & KAPOOR, BG. Fish cytogenetics. Science Publishers, Enfield, p. 69-110. MOLINA, WF.; ALVES, DEO.; ARAÚJO, WC.; MARTINEZ, PA.; SILVA, MFM. & COSTA, G.W.W.F. 2010. Performance of human immunostimulating agents in the improvement of fish cytogenetic preparations. Genetics and Molecular Research, vol. 9, no. 3, p. 1807-1814. MOLINA, WF.; SHIBATTA, O.A & GALETTI Jr, PM. 2008. Chromosomal evidence of population subdivision in the freshwater fish Leporinus elongatus in the Upper Paraná River basin. Genetics and Molecular Biology, vol. 31, p. 270-274. 106

MONTEIRO, LR. & REIS, SF. 1999. Princípios de Morfometria Geométrica. Ribeirão Preto, Holos Editora Ltda. p.188. MONTOYA-BURGOS, J.I. 2003. Historical biogeography of the catfish genus Hypostomus (Siluriformes: Loricariidae), with implications on the diversification of Neotropical ichthyofauna. Molecular Ecology, vol. 12, p. 1855–1867. MOREIRA-FILHO, O.; BERTOLLO, LAC.; FERRARI, I.; TAKAHASHI, CS. & FORESTI, F. 1980. Estudos citogenéticos em peixes da região amazônica. III. Ordem Perciformes. Ciência e Cultura (Supl.), vol. 32, p. 734. MOURA, NA.; ARAUJO, EL.; BITTENCOURT-OLIVEIRA., MC; PIMENTEL, RMM. & ALBUQUERQUE, UP. 2010. Reservatórios do Nordeste do Brasil: biodiversidade, ecologia e manejo. Bauru, SP: Canal 6. 576 p. NELSON, J. S. 2006. Fishes of the World. John Willey & Sons, Inc., New York, 601p. NIRCHIO, M. & OLIVEIRA, C. 2006. Citogenética de Peces. Porlamar, Gráficas Internacional. NORES, M. 1999. An alternative hypothesis to the origin of Amazonian bird diversity. Journal of Biogeography, vol. 26, p. 475-485. OCALEWICZ, K.; MOTA-VELASCO, JC.; CAMPOS-RAMOS, R. & PENMAN, DJ. 2009. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research, vol. 17, p. 773–782. OLIVEIRA, C.; FORESTI, F. & HILSDORF AWS. 2009. Genetics of Neotropical fish: from chromosomes to populations. Fish Physiology and Biochemistry, vol. 35, p. 81-100. ORTEGA-LARA, A. & LEHMANN-A., P. 2006. Cruciglanis, a new genus of Pseudopimelodid catfish (Ostariophysi: Siluriformes) with description of a new species from the Colombian Pacific coast. Neotropical Ichthyology, vol. 4, no. 2, p. 147-156, 2006. OYAKAWA, OT.PPGGBC & MATTOX, GMT. 2009. Revision of the Neotropical trahiras of the Hoplias lacerdae species-group (Ostariophysi: Characiformes: Erythrinidae) with descriptions of two new species. Neotropical Ichthyology, vol. 7, no. 2, p. 117-140. OYHENART-PERERA, MF.; LUENGO, JA. & BRUM-ZORRILLA, N. 1975. Estudio citogenetico de Cichlasoma facetum (JENYNS) y Crenicichla sexatilis (LINN.) (Teleostei, Cichlidae). Rev Biol del Uruguay, vol. 3, p. 29–36. PAESE, A.; PAGLIA, A.; PINTO, LP.; FOSTER, MN.; FONSECA, M. & SPOSITO, R. 2010. Fine-scale sites of global conservation importance in the Atlantic forest of Brazil. Biodiversity Conservation, vol. 19, p. 3445–3458. 107

PAIVA, MP. 1982. Grandes represas do Brasil. Editora Terra, Brasília, DF. PAIXÃO, AC. & TOLEDO-PIZA, M. 2009. Systematics of Lamontichthys Miranda-Ribeiro (Siluriformes: Loricariidae), with the description of two new species. Neotropical Ichthyology, vol. 7, no. 4, p. 519-568. PAMPONET, VCC.; CARNEIRO, PLS.; AFFONSO, PRAM.; MIRANDA, VS.; SILVA JUNIOR, JC.; OLIVEIRA, CG. & GAIOTTO, FA. 2008. A multi-approach analysis of the genetic diversity in populations of Astyanax aff. bimaculatus Linnaeus, 1758 (Teleostei, Characidae) from Northeastern Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 4, p. 621-630. PAVANELLI, CS. & BIFI, AG.2009. A new Tatia (Ostariophysi: Siluriformes: Auchenipteridae) from the rio Iguacu basin, Parana State, Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 7, p. 199-204. PAVANELLI, CS. & OLIVEIRA, CAM. 2009. A redescription of Astyanax gymnodontus (Eigenmann, 1911), new combination, a polymorphic characid fish from the rio Iguaçu basin, Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 7, no. 4, p. 569-578. PAVANELLI, CS.; OTA, RP. & PETRY, P. 2009. New species of Metynnis Cope, 1878 (Characiformes: Characidae) from the rio Paraguay basin, Mato Grosso State, Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 7, no. 2, p. 141-146. PEIXOTO, LAW. &WOSIACKI, WB. 2010. Description of a new species of Tetranematichthys (Siluriformes: Auchenipteridae) from the lower Amazon basin, Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 8, no. 1, p.69-75. PENDÁS AM.; MORÁN, P. & GARCIA-VÁSQUEZ, E. 1993. Ribosomal RNA genes are interspersed throughout a heterochromatin chromosome arm in Atlantic salmon. Cytogenetic Cell Genetics, vol. 63, p. 128-130. PERAZZO, G.; NOLETO, R.; VICARI, M.; MACHADO, P.; GAVA, A. & CESTARI, M. 2011. Chromosomal studies in Crenicichla lepidota and Australoheros facetus (cichlidae, perciformes) fromPPGGBC extreme southern Brazil. Reviews in Fish Biology and Fisheries, vol. 21, no. 3, p. 509-515. PERES-NETO, PR. 1995. Introdução a análises morfométricas. Oecologia Brasiliensis. Rio de Janeiro. vol. 2, p. 57-89. PHILLIPS, RB. & REED, KM. 1996. Application of fluorescence in situ hybridization (FISH) techniques to fish genetics: a review. Aquaculture, vol. 40, p. 197-216. 108

PINKEL, D.; STRAUME, T. & GRAY, JW. 1986. Cytogenetic analysis using quantitative, high-sensitivity, fluorescence hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 83, p. 2934-2938. PINNA, MCC.; HELMER, JL.; BRITSKI, HA. & NUNES, LR. 2010. A new species of Trichogenes from the rio Itapemirim drainage, southeastern Brazil, with comments on the monophyly of the genus (Siluriformes: Trichomycteridae).Neotropical Ichthyology, vol. 8, no. 4, p. 707-717. PIORSKI, NM.; GARAVELLO, JCH.; MARIANGELES, A. & SABAJ, MH. 2008. Platydoras brachylecis, a new species of thorny catfish (Siluriformes: Doradidae) from northeastern Brazil.Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 3, p. 481-494. PITMAN, WC.; CANDE, S.; LABRECQUE, J. & PINDELL J. 1993 . Fragmentation of Gondwana: the separation of Africa from South America. In: GOLDBLATT, P. Biology relationships between Africa and South America. Yale University Press, New Haven. p. 15- 34. POLETTO, AB.; FERREIRA, IA.; CABRAL-DE-MELLO, DC.; NAKAJIMA, RT.; MAZZUCHELLI, J.; RIBEIRO, HB.; VENERE, PC.; NIRCHIO, M.; KOCHER, TD. & MARTINS C. 2010a. Chromosome differentiation patterns during cichlid fish evolution. BMC Genetics. vol. 11, p. 50. doi:10.1186/1471-2156-11-50

POLETTO, AB.; FERREIRA, IA.; CABRAL-DE-MELLO, DC.; NAKAJIMA, RT.; MAZZUCHELLI, J.; RIBEIRO, HB.; VENERE, PC.; NIRCHIO, M.; KOCHER, TD. & MARTINS C. 2012a. Correction: Chromosome differentiation patterns during cichlid fish evolution. BMC Genetics, doi:10.1186/1471-2156-13-2 POLETTO, AB.; FERREIRA, IA. & MARTINS C. 2010b. The B chromosomes of the African cichlid fish Haplochromis obliquidens harbour 18S rRNA gene copies. BMC Genetics, vol. 11, PPGGBCp. 1. doi:10.1186/1471-2156-11-1 POLETTO, AB.; FERREIRA, IA. & MARTINS C. 2012b. Correction: The B chromosome of the cichlid fish Haplochromis obliquidens harbors 18S rRNA genes. BMC Genetics, doi:10.1186/1471-2156-13-3 PY-DANIEL, LHR. & FICHBERG, IA. 2008. A new species of Rineloricaria (Siluriformes: Loricariidae: Loricariinae) from rio Daraá, rio Negro basin, Amazon, Brazil.Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 3, p. 339-346. 109

PY-DANIEL, LR.; ZUANON, J. & OLIVEIRA, RR. 2011. Two new ornamental loricariid of Baryancistrus from rio Xingu drainage (Siluriformes: ). Neotropical Ichthyology, vol. 9, no. 2, p. 241-252. REIS, RE.; KULLANDER, SO. & FERRARI Jr, CJ. 2003. Checklist of the freshwater fishes of South and Central America. Edicpucrs, Porto Alegre, RS. p.742. REIS, SF.; PESSÔA, LM. & STRAUSS, RE. 1990. Application of size-free canonical discriminant analysis to studies of geographic differentiation. Brazilian Journal of Genetics, vol. 13, no. 3, p. 509-520. RIBEIRO, AC. 2006 .Tectonic history and the biogeography of the freshwater fishes from the coastal drainages of eastern Brazil: an example of faunal evolution associated with a divergent continental margin. Neotropical Ichthyology, vol. 4, p. 225-246. RIBEIRO, FRV. & PY-DANIEL, LHR. 2010. Ageneiosus uranophthalmus, a new species of auchenipterid catfish (Osteichthyes: Siluriformes) from river channels of the central Amazon basin, Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 8, no. 1, p. 97-104. RIBEIRO, FRV. & LUCENA, CAS. 2007. Pimelodus microstoma Steindachner, 1877, a validspeciesofpimelodidcatfish (Siluriformes: Pimelodidae) fromtheupper rio Paraná drainage. Neotropical Ichthyology, vol. 5, no.1, p. 75-78. RIBEIRO, FRV. & LUCENA, CAS. 2006. A new species of Pimelodus La Cépède, 1803 (Siluriformes, Pimelodidae) from the rio São Francisco drainage, Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 4, no. 4, p. 411-418. RIBEIRO, FRV.; LUCENA, CAS. & OYAKAWA, OT. 2011. A new species of Pimelodus La Cépède, 1803 (Siluriformes: Pimelodidae) from rio Ribeira de Iguape basin, Brazil. Neotropical Ichthyology, vol.9, no.1, p. 127-134. RICKLEFS, RE. & MILES, DB. 1994. Ecological and evolutionary inferences from morphology: An ecological perspective. In: Wainwright, P.C. & Reilly, S.M. Ecological morphology. UniversityPPGGBC of Chicago Press, Chicago. p.13-41 ROCHA, MS.; OLIVEIRA, RR. & PY-DANIEL, LHR. 2008. A new species of Gladioglanis Ferraris & Mago-Leccia from rio Aripuanã, Amazonas, Brazil (Siluriformes: Heptapteridae). Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 3, p. 433-438. ROCHA, MS.; OLIVEIRA, RR. & PY-DANIEL, LHR. 2007. A new species of Propimelodus Lundberg & Parisi, 2002 (Siluriformes: Pimelodidae) from rio Araguaia, Mato Grosso, Brazil. Neotropical Ichthyology, vol.5, no.3, p. 279-284. 110

ROCHA, MS.;OLIVEIRA, RR. & PY-DANIEL, LHR. 2008. Scoloplax baskini: a new spiny dwarf catfish from rio Aripuanã, Amazonas, Brazil (Loricarioidei: Scoloplacidae). Neotropical Ichthyology, vol. 6, no.3, p. 323-328. RODRIGUEZ, MS. & REIS, RE. 2007. A new species of Acestridium Haseman, 1911 (Loricariidae: Hypoptopomatinae) from the Eastern Amazon basin, Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 5, no. 4, p. 429-434. ROHLF, FJ. & BOOKSTEIN, FL. 1990. Proceedings of the Michigan Morphometrics Workshop. Special Publication no. 2. The University of Michigan Museum of Zoology, Ann Arbor. ROHLF, FJ. 2000. NTSYS-PC Numerical taxonomy and multivariate analysis system. New York: Exeter Software (Version 2.1). p. 38. RONCATI, HA.; PASTORI, MC. & FENOCCHIO, AS. 2007. Cytogenetic studies and evolutive considerations on fishes of the family Cichlidae (Perciformes) from Parana River (Argentina). Cytologia, vol. 72, no. 4, p. 379-384. ROSA, RS. & MENEZES NA. 1996. Relação preliminar das espécies de peixes (Pisces: Elasmobranchii e Actinopterygii) ameaçadas no Brasil. Revista Brasileira de Zoologia,vol. 13, no. 3. p. 647-667. ROSA, RS. 2004. Diversidade e conservação dos peixes da caatinga. In: SILVA, JMC.; TABARELLI, M.; FONSECA, MT. & LINS, LV. Biodiversidade da caatinga: Áreas e Ações Prioritárias para a Conservação. Ministério do Meio Ambiente, Brasília, DF, p. 149-161. ROSA, RS.; CARVALHO, MR. & WANDERLEY, CA. 2008. Potamotrygon boesemani (Chondrichthyes: Myliobatiformes: Potamotrygonidae), a new species of Neotropical freshwater stingray from Surinam. Neotropical Ichthyology, vol. 6, no.1, p. 1-8. ROSA, RS.; MENEZES, NA.; BRITSKI, HA.; COSTA, WJEM. & GROTH, F. 2003. Diversidade, padrões de distribuição e conservação dos peixes da caatinga. In: LEAL.; IR; TABARELLI, M.PPGGBC & SILVA JMC. Ecologia e Conservação da caatinga. Editora Universitária da Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PB, p. 135-180. SALGADO, SM.; FELDBERG, E. & PORTO, JIR. 1995. Estudos citogenéticos em cinco espécies da família Cichlidae (Perciformes-Labroidei), da Bacia Amazônica Central. Revista Brasileira de Genética (Suppl.), vol. 18, no. 3, p. 463. SALZBURGER, W. & MEYER, A. 2004. The species flocks of East African cichlid fishes: recent advances in molecular phylogenetics and population genetics. Naturwissenschaften, vol. 91, p. 277-290. 111

SÁNCHEZ, A.; JIMÉNEZ, R.; BURGOS, M.; STITOU, S.; ZURITA, F. & DÍAZ DE LA GUARDIA, R. 1995. Cytogenetic peculiarities in the Algerian hedgehog: silver stains not only NORs but also heterochromatic blocks. Heredity, vol. 75, p. 10-6. SARMENTO-SOARES, LM. &MARTINS-PINHEIRO, RF. 2008. A systematic revision of Tatia (Siluriformes: Auchenipteridae: Centromochlinae). Neotropical Ichthyology, vol.6, no. 3, p. 495-542. SARMENTO-SOARES, LM.; MARTINS-PINHEIRO, RF.; ARANDA, AT. & CHAMON, CC. 2006a. Microglanis pataxo, a new catfish from southern Bahia coastal rivers, northeastern Brazil (Siluriformes: Pseudopimelodidae). Neotropical Ichthyology, vol. 4, no. 2, p. 157-166. SARMENTO-SOARES, LM.; MARTINS-PINHEIRO, RF.; ARANDA, AT. & CHAMON, CC. 2006b. Ituglanis cahyensis, a new catfish from Bahia, Brazil (Siluriformes: Trichomycteridae). Neotropical Ichthyology, vol. 4, no. 3, p. 309-318. SARMENTO-SOARES, LM.; MAZZONI, R & MARTINS- PINHEIRO, RF. 2008. A fauna de peixes dos Rios dos Portos Seguros, extremo Sul da Bahia, Brasil. Boletim do Museu de Biologia Mello Leitão, vol. 24, p 119-142. SARMENTO-SOARES, LM.; MAZZONI, R. & MARTINS-PINHEIRO, RF. 2009. A fauna de peixes na bacia do Rio Jucuruçu, leste de Minas Gerais e extremo Sul da Bahia. Pan- American Journal of Aquatic Sciences. vol. 4, no. 2, p. 193-207. SARMENTO-SOARES, LM.;ZANATA, AM.& MARTINS-PINHEIRO, RF. 2011. Trichomycterus payaya, new catfish (Siluriformes: Trichomycteridae) from headwaters of rioItapicuru, Bahia, Brazil. Neotropical Ichthyology, vol.9, no. 2, p. 261-271. SAS Institute Inc. 2003. Statistical Analysis System user’s guide. v. 9.1: SAS Institute, USA. SCHINDLER, I & STAECK, W. 2006. Geophagus gottwaldi sp. n. - a new species of cichlid fish (Teleostei: Perciformes: Cichlidae) from the drainage of the upper río Orinoco in Venezuela. ZoologischePPGGBC Abhandlungen, vol. 56, p. 91-97. SCHMID M. 1980. Chromosome banding in Amphibia. IV. Differentiation of GC- and AT- rich chromosome regions in Anura. Chromosoma, vol. 77, p. 83-103. SEEHAUSEN, O. & VAN ALPHEN, JJM. 1999. Can sympatric speciation by disruptive sexual selection explain rapid evolution of cichlids diversity in Lake Victoria? Ecology Letters, vol. 2, p. 262-271. 112

SEMA (Secretaria do Meio Ambiente). Unidade de Conservação. Disponível em: . Acesso em 23 de fevereiro de 2012. SILVEIRA, LGG.; LANGEANI, F.; GRAÇA, WJ.; PAVANELLI, CS. & BUCKUP, PA. 2008. Characidium xanthopterum (Ostariophysi: Characiformes: Crenuchidae): a new species from the Central Brazilian Plateau. Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 2, p. 169-174. SINGH, D. 1981. The relative importance of characters affecting genetic divergence. The Indian Journal of Genetic and Plant Breeding, vol. 41, p. 237-245. SKIPPER, M. 2007. Mysteries of heterochromatic sequences unravelled. Nature Reviews, vol.8, p. 567. SMITH, WL.; CHAKRABARTY, P & SPARKS, JS. 2008. Phylogeny, taxonomy, and evolution of Neotropical cichlids (Teleostei: Cichlidae: Cichlinae). Cladistics, vol. 24, p. 625- 641. SNEATH, PHA & SOKAL, RR. 1973. Numerical Taxonomy. San Francisco: Freeman, 573 p. SOKAL, RA. & ROHLF, FJ. 1962. The comparison of dendograms by objective methods. Taxonomy, vol. 11, p. 33-40. SOLÉ-CAVA, AM. 2001. Biodiversidade molecular e genética da conservação. In: MATIOLI, SR. Biologia Molecular e Evolução. 2ª Ed, Ribeirão Preto: Holos editora, p. 172- 192. SOUSA, LM.; NETTO-FERREIRA, AL. & BIRINDELLI, JLO. 2010. Two new species of Moenkhausia Eigenmann (Characiformes: Characidae) from Serra do Cachimbo, Pará, Northern Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 8, no. 2, p. 255-264. SOUZA, LS.; MELO, MRS.; CHAMON, CC. & ARMBRUSTER, JW. 2008. A new species of Hemiancistrus from the rio Araguaia basin, Goiás state, Brazil (Siluriformes: Loricariidae). Neotropical Ichthyology,PPGGBC vol. 6, no. 3, p. 419-424. SPARKS, JS. & SMITH, WL. 2004. Phylogeny and biogeography of cichlid fishes (Teleostei: Perciformes: Cichlidae). Cladistics, vol. 20, p. 501-517. SRHSH (SECRETARIA DOS RECURSOS HÍDRICOS SANEAMENTO E HABITAÇÃO). 1993. Plano diretor de recursos hídricos. Bacia do rio das Contas: Diagnóstico do sistema físico. Relatório técnico, Salvador, BA. p.160. STAECK, W. & SCHINDLER, I. 2006. Geophagus parnaibae sp. n. - a new species of cichlid fish (Teleostei; Perciformes; Cichlidae) from the rio Parnaíba basin, Brazil. Zoologische Abhandlungen, vol. 55, p. 69-75. 113

STIASSNY, MLJ. 1987. Cichlid familial intrarelationships and the placement of the neotropical genus Cichla (Perciformes, Labroidei). Journal of Natural History, vol. 21, p. 1311-1131. STURMBAUER, C. & MEYER, A. 1992. Genetic divergence, speciation and morphological stasis in a lineage of African cichlid fishes. Nature, vol. 358, p. 578-581. SUMNER, AT. 1972. A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin. Experimental Cell Research. vol. 75, p. 304-306. SUMNER, AT. 1990. Chromosome banding. Uniwin Hyman, London, UK. p. 434. SUMNER, AT. 2003. Chromosomes - Organization and Function. Blackwell Publishing: United Kingdon, UK. p. 287. TAKAI, A.; YOSHIKAWA, T. & OJIMA, Y. 2002. C-banded karyotype and nucleolus organizer regions in a discus fish, Symphysodon aequifasciata axelrodi (Cichlidae, Perciformes). Journal of Chromosome Science. 6. p. 53-55. TAPHORN, DC.; ARMBRUSTER, JW.; LÓPEZ-FERNÁNDEZ, H. & BERNARD, CR. 2010. Description of Neblinichthysbrevibracchium and N. echinasus from theupper Mazaruni River, Guyana (Siluriformes: Loricariidae), andrecognition of N. roraima and N. yaravi as distinct species. Neotropical Ichthyology, vol. 8, no. 3, p. 615-624. TEIXEIRA, WG.; FERREIRA, IA.; CABRAL-DE-MELLO, DC.; MAZZUCHELLI, J.; VALENTE, GT.; PINHAL, D.; POLETTO, AB.; VENERE, PC. & MARTINS, C. 2009. Organization of repeated DNA elements in the genome of the cichlid fish Cichla kelberi and its contributions to the knowledge of fish genomes. Cytogenetic and Genome Research, vol. 125, no. 3, p. 224-234. THOMAS, MR. & PY-DANIEL, LHR. 2008. Three new species of the armored catfish genus Loricaria (Siluriformes: Loricariidae) from river channels of the Amazon basin. Neotropical Ichthyology, vol.6, no. 3, p. 379–394. THOMPSON, KW.PPGGBC 1979. Cytotaxonomy of 41 species of Neotropical Cichlidae. Copeia, vol.4, p. 679-691. TRAPANI, J. 2003. Morphological variability in the Cuatro Cienegas cichlid, Cichlasoma minckleyi. Journal of Fish Biology, vol. 62, p. 276-298. TUOMISTO H. 2007. Interpreting the biogeography of South America. Journal of Biogeography, vol. 34, p. 1294-1295. TURNER, GF. 2007. Adaptive radiation of cichlid fish. Current Biology, vol. 17, no. 19, p. 827-831. 114

VALENTE, GT.; MAZZUCHELLI, J.; FERREIRA, IA.; POLETTO, AB; FANTINATTI, BE. & MARTINS, C. 2011. Cytogenetic mapping of the retroelements Rex1, Rex3 and Rex6 among cichlid fish: new insights on the chromosomal distribution of transposable elements. Cytogenetic and Genome Research, vol. 133, no. 1, p.34-42. VALENTE, GT.; SCHNEIDER, CH.; GROSS, MC.; FELDBERG, E. & MARTINS, C. 2009. Comparative cytogenetics of cichlid fishes through genomic in-situ hybridization (GISH) with emphasis on Oreochromis niloticus. Chromosome Research, vol. 17, no. 6, p.791-799. VARI, RP. & FERRARIS Jr., CJ. 2009. New species of Cetopsidium (Siluriformes: Cetopsidae: Cetopsinae) from the upper rio Branco system in Guyana. Neotropical Ichthyology, vol. 7, no. 3, p. 289-293. VARRIALE, A.; TORELLI, G. & BERNARDI, G. 2008. Compositional properties and thermal adaptation of 18S rRNA in vertebrates. RNA, vol. 14, p. 1492-1500. VERMA, J.; LAKRAI, WS.; KUSHWAHA, B.; SIRAJUDDIN, M.; NAGPURE, N. S. & KUMAR, R. 2011. Characterization of two freshwater silurid catfish using conventional and molecular cytogenetic techniques. Journal of Genetics, vol. 90, p. 319-322. VICARI, MR; ARTONI, RF.; MOREIRA-FILHO, O. & BERTOLLO, LAC. 2006. Basic and molecular cytogenetics in freshwater Cichlidae (Osteichthyes, Perciformes). Karyotypic conservadorism and divergence. Caryologia, vol. 59, p. 260-266. VILAS-BÔAS, GS.; SAMPAIO, FJ. & PEREIRA, AMS. 2001. The Barreiras Group in the Northeastern coast of the state of Bahia, Brazil: depositional mechanisms and processes. Anais da Academia Brasileira de Ciências, vol. 73, no. 3, p. 417-427. VONO, V.; SILVA, LGM.; MAIA, BP. & GODINHO, HP. 2002. Biologia reprodutiva de três espécies simpátricas de peixes neotropicais: Pimelodus maculatus Lacépede (Siluriformes, Pimelodidae), Leporinus amblyrhynchus Garavello & Britski e Schizodon nasutus Kner (Characiformes, Anostomidae) do recém-formado Reservatório de Miranda, Alto Paraná. RevistaPPGGBC Brasileira de Zoologia, vol.19, no. 3, p. 819-826. WASKO, AP. & GALETTI Jr., PM. 2000. Mapping 18S ribosomal genes in fish of the genus Brycon (Characidae) by fluorescence in situ hybridization (FISH). Genetics and Molecular Biology, vol. 23, no. 1, p. 135-138. WEBB, PW. 1984. Body form, locomotion and foraging in aquatic vertebrates. American Zoologist, vol. 24, p.107-120. WEIDNER, T. 2000. South American Eartheaters. Cichlid Press, El Paso, TX. p. 336 WIMBERGER, PH. 1991. Plasticity of jaw and skull morphology in the neotropical cichlids Geophagus brasiliensis and G. steindachneri. Evolution, vol. 45, no. 7, p. 1545-1563. 115

WIMBERGER, PH. 1992. Plasticity of fish body shape. The effects of diet, development, family and age in two species of Geophagus (Pisces: Cichlidae). Biological Journal of the Linnean Society, vol. 45, p. 197-218. WIMBERGER, PH. 1994. Trophic plasticity, polymorphisms, and speciation in vertebrates. In: STOUDER, DJ. & FRESH, K. Advances in Foraging Theory and Ecology. Belle Baruch Press, South Carolina. p. 19-43. WINEMILLER, K. O. & TAPHORN, DC. 1989. La evolución de las estrategias de vida en los peces de los llanos occidentales de Venezuela. Biollania, vol.6, p. 77-122. WINEMILLER, KO. & ROSE. KA. 1993. Why do most fish produce so many tiny offspring? The American Naturalist, vol. 142, no. 4, p.585-603. WINEMILLER, KO.; KELSO-WINEMILLER, LC. & BRENKERT, AL. 1995. Ecomorphological diversification and convergence in fluvial cichlid fishes. Environmental Biology of Fishes, vol. 44, p.235-261. WOOTTON, R.J. 1999. Ecology of teleost fish. The Netherlands: Kluwer Academic Publishers. p. 386. WOSIACKI, WB. & PINNA, MCC. 2008. Trichomycterusigobi, a new catfish species from the rio Iguaçu drainage: the largesthead in Trichomycteridae (Siluriformes: Trichomycteridae).Neotropical Ichthyology, vol. 6, p. 17-23. ZANATA, AM. & CAMELIER, P. 2009. Astyanax vermilion and Astyanax burgerai: new characid fishes (Ostariophysi: Characiformes) from Northeastern Bahia, Brazil Neotropical Ichthyology, vol. 7, no. 2, p. 175-184. ZANATA, AM. & CAMELIER, P. 2010. Hyphessobrycon brumado: a new characid fish (Ostariophysi: Characiformes) from the upper rio de Contas drainage, Chapada Diamantina, Bahia, Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 8, no. 4, p. 771-777. ZANATA, AM. & OHARA, WM. 2009. Jupiaba citrina, a new species from rio Aripuanã, rio Madeira basin,PPGGBC Amazonas and Mato Grosso States, Brazil (Characiformes: Characidae). Neotropical Ichthyology, vol. 7, no. 4, p. 513-518. ZANATA, AM. & SERRA, JP. 2010. Hasemania piatan, a new characid species (Characiformes: Characidae) from headwaters of rio de Contas, Bahia, Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 8, no. 1, p. 21-26. ZARDOYA, R.; VOLLMER, DM.; CRADDOCK, C.; STREELMAN, JT.; KARL, S. & MEYER, A. 1996. Evolutionary conservation of microsatellite flanking regions and their use in resolving the phylogeny of cichlid fishes (Pisces: Perciformes). Proceedings Royal Society of London B, vol. 263, p. 1589-1596. 116

ZAWADZKI, CH.; WEBER, C. & PAVANELLI, CS. 2008a. Two new species of Hypostomus Lacépède (Teleostei: Loricariidae) from the upper rio Paraná basin, Central Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 3, p. 403-412. ZAWADZKI, CH.; BIRINDELLI, JLO. & LIMA, FCT. 2008b. A new pale-spotted species of Hypostomus Lacépède (Siluriformes: Loricariidae) from the rio Tocantins and rio Xingu basins in central Brazil. Neotropical Ichthyology, vol. 6, no. 3, p. 395-402. ZAWADZKI, CH.; WEBER, C. & PAVANELLI, CS. 2010. A new dark-saddled species of Hypostomus (Siluriformes: Loricariidae) from the upper rio Paraguay basin. Neotropical Ichthyology, vol. 8, no. 4, p. 719-725. ZELDITCH, ML.; SWIDERSKI, DL.; SHEETS, HD. & FINK, WL. 2004. Geometric morphometrics for biologists. Part II: Analysis shape variables, Livro. Elsevier Academy Press, p. 153-290. ZHU, HP.; LU, MX.; GAO, FY.; HUANG, ZH.; YANG LP. & GUI JF. 2010. Chromosomal localization of rDNA genes and genomic organization of 5S rDNA in Oreochromis mossambicus, O. urolepis hornorum and their hybrid. Journal of Genetics, vol. 89, no. 2, p. 163-171.

PPGGBC