Entwicklung eines neuartigen, induzierbaren Baculovirus-Insektenzell- Expressionssytems

Der Technischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Zur Erlangung des Doktorgrades Dr.-Ing.

vorgelegt von Ricarda Friebe

aus Dachau

Als Dissertation genehmigt von der Technischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 05.10.2018 Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Reinhard Lerch 1. Gutachter: Prof. Dr. Rainer Buchholz

2. Gutachter: Prof. Dr. Barbara Kappes

Meiner Familie

„Nur wenige wissen, wie viel man wissen muss, um zu wissen, wie wenig man weiß.“

Werner Heisenberg

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Mein besonderer Dank gilt hierbei Herrn Prof. Rainer Buchholz für die Möglichkeit, meine Promotion am Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik durchführen zu können, sowie für seine Unterstützung in jeglicher Hinsicht. Frau Prof. Barbara Kappes möchte ich ganz besonders für die Begutachtung meiner Arbeit bedanken. Ein großes Dankeschön geht auch an Frau Prof. Kathrin Castiglione und Herrn Prof. Wolfgang Kreis für die Übernahme des Prüfungsvorsitzes bzw. der mündlichen Prüfung. Die Promotion am BVT war eine ganz besondere Zeit für mich, geprägt von sehr vielen schönen Momenten, aber auch einigen herben Rückschlägen. Bei allen Mitarbeitern des BVT, vor allem auch bei den mittlerweile Ehemaligen, möchte ich mich für diese schönen Momente bedanken, die wir gemeinsam erlebt haben. Besonderer Dank gilt meinen Mit-DoktorandInnen für die zahlreichen Gelegenheiten, die Herausforderungen des Projektes einmal vergessen zu können und für die vielen „social events“ auch außerhalb des Lehrstuhls. Von ganzem Herzen danke ich Juliane Richter für die unglaublich tolle Atmosphäre im Büro und im Labor, die vielen fachlichen (und vor allem nicht so fachlichen) Gespräche sowie für die Unterstützung in allen Lebenslagen. Herrn Ludwig Körber gilt mein herzlicher Dank für die vielen Anregungen und seine Geduld, sich in ein ihm komplett unbekanntes Thema hineinzudenken. Herrn Andreas Perlick möchte ich für sein jederzeit offenes Ohr und seine stets diplomatische Ehrlichkeit danken, die uns allen das ein oder andere Schmunzeln ins Gesicht gezaubert hat. Frau Christine Schülein möchte ich recht herzlich für Ihre positive Art und die aufmunternden Worte danken, aufgrund derer ich zum Schreiben immer gerne ins Büro gekommen bin. Mein Dank gilt weiterhin Frau Christine Friedl und Frau Elke Heidenreich für die tolle Zusammenarbeit im Labor und die allzeit freund(schaft)liche Atmosphäre. Allen meinen Studenten, HiWis und WiHis danke ich ebenfalls für die tolle Zusammenarbeit und das mir entgegengebrachte Vertrauen.

Zu guter Letzt möchte ich mich von ganzem Herzen bei meiner Familie, meinem Freund und meinen engsten Freunden bedanken. Ihr habt mir stets das Selbstvertrauen, den Rückhalt, die Liebe und die nötige Kraft gegeben, ohne die ich diese Arbeit nicht hätte vollenden können. Danke, dass Ihr an mich glaubt und immer für mich da seid!

DANKE!

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1 2 Stand des Wissens 2 2.1 Das Baculovirus 2 2.1.1 Klassifizierung 2 2.1.2 Aufbau 4 2.1.3 Replikationszyklus in vivo am Beispiel des AcMNPV 6 2.2 Einsatz von Baculoviren als Biopestizid 9 2.2.1 Baculovirus-Präparate 9 2.2.2 Entwicklungsmöglichkeiten Baculovirus-basierter Biopestizide 12 2.2.3 Rekombinante Baculoviren zum Pflanzenschutz 14 2.2.4 Produktion von Baculoviren 17 2.3 Einsatz von Baculoviren zur Proteinproduktion 20 2.3.1 Herstellung gentechnisch veränderter Baculoviren 21 2.3.2 Insektenzelllinien 22 2.3.3 Proteinproduktion 23 2.3.4 Deletionsmutanten 25 2.3.5 Vergleich mit anderen Expressionssystemen 26 2.4 Promotoren 27 2.4.1 Metallothionein-Promotor 28 2.4.2 Tetracyclin-reguliertes System 29 2.5 Markerprotein enhanced green fluorescent proteine 30 3 Zielsetzung 33 4 Methoden 34 4.1 Ablauf der Herstellung rekombinanter Baculoviren 34 4.2 Molekularbiologische Methoden 35 4.2.1 Herstellung chemisch kompetenter Zellen 35 4.2.2 Transformation chemisch kompetenter E. coli Zellen 35 4.2.3 Isolation und Aufreinigung von DNA 37 4.2.4 Bestimmung der DNA-Konzentration 39 4.2.5 DNA-Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion 39 4.2.6 Enzymatische DNA-Restriktion 41 4.2.7 Agarose-Gelelektrophorese 42 4.2.8 Dephosphorylierung 43 4.2.9 Ligation mit T4 DNA-Ligase 43 4.2.10 Sequenzierung von Plasmiden 44 4.3 Allgemeine Zellkultur 44

I Inhaltsverzeichnis

4.3.1 Silikonisieren von Erlenmeyerkolben 44 4.3.2 Bestimmung der Lebendzelldichte und Vitalität einer Insektenzellkultur 44 4.3.3 Kultivierung von Insektenzellen in Suspensionskultur 45 4.3.4 Kryokonservierung von Insektenzellen 45 4.3.5 Toxizitätstests 46 4.4 Arbeiten mit Baculoviren 47 4.4.1 Transfektion von Insektenzellen 47 4.4.2 Herstellung eines Virusstocks 47 4.4.3 Bestimmung des infektiösen Virustiters 47 4.4.4 Bestimmung des Viruspartikeltiters 48 4.4.5 Promotorstudien 50 4.4.6 Interferenz-Test 51 4.5 Expressions-Analytik 52 4.5.1 Reverse Transkription Polymerasekettenreaktion 52 4.5.2 Zelllyse 54 4.5.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 54 4.5.4 Western Blot 55 4.5.5 Fluoreszenzmessung am PlateReader 55 4.5.6 Durchflusszytometrie 57 4.5.7 Enzyme-linked immunosorbent Assay 59 4.6 Kupfer-Analytik 59 5 Ergebnisse 61 5.1 Molekularbiologische Arbeiten 61

5.1.1 Herstellung des Kontroll-Standard Bacmids bPpolhegfp 61

5.1.2 Herstellung des Metallothionein-Promotor Bacmids bPmtnegfp 63

5.1.3 Herstellung der Bacmide bDHPTightegfp und bDHPTightegfp-Ppolhtta mit dem Tet-Off System (PTight) 67 5.2 Zellkultur 70 5.2.1 Adaption der Zellen an Kupfersulfat 70 5.2.2 Kupfer-Toxizitätstest 71 5.2.3 Doxycyclin-Toxizitätstest 73 5.3 Metallothionein-Promotor 74 5.3.1 Herstellung der Virusstocks AcMNPV-Me 74 5.3.2 Regulation des Metallothionein-Promotors durch Kupferionen - I 75 5.3.3 Regulation des Metallothionein-Promotors durch Kupferionen - II 82 5.3.4 Aktivierungskinetik des Metallothionein-Promotors 89

5.4 PTight-Promotor des Tet-Off Systems 94 5.4.1 Herstellung der Virusstocks AcMNPV- DHTe und -DHTePt 94

5.4.2 Regulation des PTight durch Doxycyclin 96

5.4.3 Aktivierungskinetik des PTight 107

II Inhaltsverzeichnis

5.5 Der Standardpromotor Polyhedrin-Promotor 110 5.5.1 Herstellung der Virusstocks AcMNPV-Pe 110 5.5.2 Regulation der Genexpression durch den Polyhedrin-Promotor 110 5.6 Viruscharakterisierung 112 5.6.1 Akkumulation von Deletionsmutanten durch serielle Passage 113 5.6.2 Interferenz-Test 114 6 Fehlerbetrachtung 118 6.1 Toxizitätstest 118 6.2 Virustiterbestimmung 118 6.2.1 Endpunkttitration 119 6.2.2 Real-time Polymerasekettenreaktion 120 6.3 Interferenz-Test 121 6.4 Real-time Reverse Transkription Polymerasekettenreaktion 122 6.5 Fluoreszenzmessung intakter Zellen am PlateReader 123 7 Diskussion 125 7.1 Herstellung der Viren 126 7.1.1 Herstellung der Bacmide 126 7.1.2 Herstellung der Virusstocks 128 7.2 Virustiterbestimmung 129 7.3 Interferenz und Passageneffekt 132 7.3.1 Auswirkungen der Interferenz bei serieller Passage 132 7.3.2 Inhibierung der Proteinproduktion durch Interferenz 134 7.4 Metallothionein-Promotor 138 7.4.1 Unterschiedliches Verhalten der Klone 2 und 4des AcMNPV-Me 138 7.4.2 Regulation des Metallothionein-Promotors durch Kupferionen 140 7.4.3 Kinetik des Metallothionein-Promotors 145

7.5 PTight-Promotor des Tet-Off Systems 148

7.5.1 Regulation des PTight durch Doxycyclin 148

7.5.2 Kinetik des PTight 150 7.6 Vergleich der induzierbaren Promotoren mit dem Polyhedrin-Promotor 153 7.7 Fazit 157 8 Ausblick 159 9 Anhang 199 9.1 Weitere erhobene Daten 199

9.1.1 Induktionskinetik Pmtn 199 9.1.2 Maximalexpression 201 9.1.3 Hemmung der zelleigenen Genexpression 201 9.2 Plasmidkarten 202 9.2.1 pFastBac1 202

III Inhaltsverzeichnis

9.2.2 pMA-T-egfp 202

9.2.3 pPpolhegfp 203

9.2.4 pGEM-Pmtn 203

9.2.5 pGEM-Pmtnegfp 204

9.2.6 pPmtnegfp 204

9.2.7 pDHPTightegfp 205

9.2.8 pDHPTightegfp-Ppolhtta 205 9.3 Gensequenzen 206 9.3.1 Codon-optimierte egfp DNA-Sequenz 206 9.3.2 Drosophila Metallothionein-Promotor DNA-Sequenz 206

9.3.3 PTight-Promotor DNA-Sequenz 206 9.3.4 tta DNA-Sequenz 207 9.4 Klonierungspläne 208

9.4.1 pPpolhegfp 208

9.4.2 pPmtnegfp 209 9.5 Kalibrierfunktionen zur Viruspartikelbestimmung mittels real-time PCR 210 9.6 Chemikalien und Reagenzien 211 9.7 Verbrauchsmaterialien 213 9.8 Laborequipment 214 9.9 Software 215 9.10 Kitsysteme 216 9.11 Enzyme 216 9.12 Antikörper 216 9.13 Medien 217 9.14 Puffer und Lösungen 217 9.15 Organismen 218 9.16 DNA-Fragmente (Restriktionen) 219 9.17 DNA-Fragmente (PCR) 219 9.18 Primerspezifikationen 220

IV

Zusammenfassung

Baculoviren sind hochgradig wirtsspezifische Viren, die zum einen im Rahmen des Baculovirus-Insektenzell-Expressionssystems zur Expression rekombinanter Proteine und zum anderen als Biopestizid bei der Bekämpfung von Fraß-Schädlingen bei einer Vielzahl von Nutzpflanzen eingesetzt werden können. Bisher ist die Anwendung als Expressionssystem auf nicht-toxische Proteine beschränkt, da die Toxizität der Proteine sich negativ auf die Vitalität der Insektenzellen auswirkt, wodurch die Ausbeute an rekombinantem Protein drastisch sinkt. Dies gilt auch für die Vermehrung rekombinanter Baculoviren, die zum Einsatz im Pflanzenschutz ein rekombinantes Protein exprimieren, welches die insektizide Wirkung der Viren verstärken soll, da hier ebenfalls verminderte Virusausbeuten aufgrund der reduzierten Vitalität der Insektenzellen beschrieben wurden. Diese Problematik könnte durch den Einsatz induzierbarer Promotoren zur Steuerung der Expression des rekombinanten Proteins umgangen werden. Aus diesem

Grund wurden im Rahmen dieser Arbeit die beiden induzierbaren Promotoren PTight aus dem Tet-Off System und Metallothionein-Promotor (Pmtn) aus Drosophila im BEVS untersucht.

Hierfür wurden die benötigten Genkonstrukte in E. coli kloniert und die rekombinanten Viren anschließend über eine Transfektion in Sf21-Insektenzellen hergestellt. Beide Promotoren zeigten in infizierten Sf21-Insektenzellen Aktivität und ließen sich über die eingestellten Induktor-Konzentrationen regulieren. Beim Pmtn führte die Verwendung von

CuCl2 zu einer stärkeren Induktion als CuSO4, wobei die höchste Expression des

Reporterproteins eGFP bei einer Konzentration von 800 µM CuCl2 festgestellt werden konnte. Höhere Cu2+-Konzentrationen resultierten in einer rapiden Verschlechterung der

Zellviabilität einhergehend mit einer Reduktion der eGFP-Synthese. Der Pmtn zeigte in Abwesenheit seines Induktors nur schwache Basalaktivität und konnte durch Zugabe von

800 µM CuCl2 50-fach induziert werden. Die Untersuchung der Kinetik ergab, dass eGFP bereits 10 h nach Induktion nachgewiesen und die höchste Produktionsrate in den darauf folgenden 30 h verzeichnet werden konnte. Während eine Induktion 12 hpi zur stärksten eGFP-Produktion geführt hat, konnte der Pmtn auch bis 48 hpi noch induziert werden, allerdings mit stark reduzierten Ausbeuten. Durch die frühe Aktivität des Pmtn wäre dieser auch für die Produktion glykosylierter Proteine geeignet.

Der PTight besitzt in Abwesenheit seines Transaktivators tTA nur eine sehr geringe Basalaktivität, die durch Hemmung der Genexpression mittels Doxycyclin jedoch nicht vollständig erreicht werden kann. Die minimale Doxycyclin-Konzentration, die zur maximalen Hemmung der PTight-gesteuerten Genexpression führt, beträgt je nach Kultivierungssystem 10 - 20 ng∙mL-1 und bewirkt eine Reduktion der eGFP-Produktion um

V Zusammenfassung

87 - 96 %. Eine Induktion des PTight durch Entfernen des Doxycyclins konnte bis 48 hpi nachgewiesen werden, wobei die höchste eGFP-Produktion bei einer Induktion zum

Zeitpunkt 24 hpi beobachtet werden konnte. Da die Aktivierungskinetik des PTight auch von der zeitlichen Expression des Transaktivators tTA abhängig ist, die durch den sehr späten Polyhedrin-Promotor (Ppolh) reguliert wird, konnte die Produktion von eGFP erst ca. 30 hpi detektiert werden. Sie stieg daraufhin allerdings bis 116 hpi stetig an.

Der Vergleich der Maximalexpressionen der beiden induzierbaren Promotoren PTight und

Pmtn mit dem Standardpromotor des BEVS, dem sehr starken Ppolh, hat ergeben, dass der

Pmtn etwa 4 % und der PTight 2 % des Ppolh erreicht, weshalb eine Optimierung der beiden Systeme sinnvoll erscheint. Eine gewisse verminderte Produktivität kann allerdings aufgrund des Vorteils der Regulierbarkeit der Promotoren in Kauf genommen werden.

Neben der Charakterisierung der Promotoren wurde die Bildung von egfp-- Deletionsmutanten durch mehrfaches Passagieren der Virusstocks untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil egfp+-Viren bereits nach fünf Passagen auf ca. 50 % abfällt und nach elf Passagen weniger als 1 % beträgt. Zusätzlich zu den egfp--Deletionsmutanten sind auch noch weitere Mutanten entstanden, denen beispielsweise die zur Replikation benötigten Gene fehlen und die sich daher nur in Anwesenheit eines intakten Helfer-Virus vermehren können. Diese Mutanten werden als defective interfering particles (DIPs) bezeichnet. In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass DIPs sich nicht nur negativ auf die Produktion des rekombinanten Proteins eGFP, sondern auch auf die Virusausbeute auswirken. Deshalb wird empfohlen möglichst immer mit Virusstocks niedriger Passagen zu arbeiten und bei der Vermehrung von Viren sehr kleine MOI im Bereich von 0,001 bis 0,01 einzusetzen.

VI

Abstract

Baculoviruses are highly host-specific viruses which can be used in the context of the baculovirus-insect cell expression system (BEVS) for expressing recombinant proteins as well as a biopesticide to control feeding pests in a variety of agricultural crops. So far, the application as an expression system is limited to non-toxic proteins, since the toxicity of the proteins would have a negative effect on the viability of the insect cells, whereby the yield of recombinant protein decreases dramatically. This also applies to the propagation of recombinant baculoviruses expressing a recombinant protein for the usage in plant protection. Reduced virus yields due to the reduced vitality of the insect cells expressing a protein to enhance the insecticidal activity of the virus have also been reported. This issue could be circumvented by the use of inducible promoters to control the expression of the recombinant protein. For this reason, the two inducible promoters PTight from the Tet-Off system and Drosophila metallothionein promoter (Pmtn) were investigated in the context of the BEVS in this work.

For this purpose, the required gene constructs were cloned in E. coli and subsequently, the recombinant viruses were produced by transfection into Sf21 insect cells. Both promoters showed activity in infected Sf21 insect cells and could be regulated by different inducer concentrations. With Pmtn, the use of CuCl2 led to a stronger induction than CuSO4, whereupon the highest expression of the reporter protein eGFP was found at 2+ a concentration of 800 μM CuCl2. Higher Cu concentrations resulted in a rapid decrease in cell viability linked with a reduction in eGFP synthesis. Pmtn showed only weak basal activity in the absence of its inducer and could be induced 50-fold by addition of 800 μM

CuCl2. Examination of the kinetics revealed that eGFP was already detected 10 h after induction and that the highest production rate was recorded in the subsequent 30 h.

While an induction at 12 hpi led to the highest level of eGFP production, Pmtn could still be induced up to 48 hpi, but with greatly reduced yields. Due to the early activity of Pmtn it would also be suitable for the production of glycosylated proteins.

PTight has only a very low basal activity in the absence of its transactivator tTA, which, however, cannot be fully achieved by inhibiting gene expression by doxycycline. Depending on the cultivation system, the minimal doxycycline concentration, which -1 results in maximum inhibition of PTight-controlled gene expression, is 10 - 20 ng∙mL and causes a reduction in eGFP production by 87 - 96 %. Induction of PTight by removal of the doxycycline could be detected up to 48 hpi, whereby the highest eGFP production could be observed after an induction at 24 hpi. Since the activation kinetics of PTight are also dependent on the temporal expression of the transactivator tTA, which in turn is

VII Abstract

regulated by the very late polyhedrin promoter (Ppolh), the production of eGFP could not be detected until about 30 hpi. Thereafter it increased steadily to 116 hpi.

The comparison of the maximum expressions of the two inducible promoters PTight and

Pmtn with the standard promoter of the BEVS, the very strong Ppolh, has revealed that Pmtn reaches about 4% and PTight about 2% of the Ppolh, so that optimization of the two systems appears reasonable. However, some reduced productivity can be accepted due to the advantage of the inducibility of the promoters.

Besides the characterization of promoters, the formation of egfp- deletion mutants was investigated by multiple passages of virus stocks. It could be shown that the proportion of egfp+ viruses drops to approx. 50 % after only five passages and less than 1 % after eleven passages. In addition to the egfp- deletion mutants, other mutants have emerged which, for example, lack the genes required for replication and therefore can only proliferate in the presence of an intact helper virus. These mutants are referred to as defective interfering particles (DIPs). This work shows that DIPs not only negatively affect the production of the recombinant protein eGFP but also impact virus yield. That’s why it is recommended to always work with virus stocks of the lowest possible passages and very small MOI in the range of 0.001 to 0.01.

VIII

1 Einleitung

Die Expression rekombinanter Proteine für die Forschung oder zur pharmazeutischen Anwendung erfolgt in Expressionssystemen, die entweder pro- oder eukaryotischen Ursprungs sein können. Während mit Prokaryoten sehr hohe Ausbeuten erzielt werden können, sind nur Eukaryoten in der Lage komplexe posttranslationale Modifikationen durchzuführen. Beispiele für eukaryotische Expressionssysteme sind Säugetier-Zelllinien, die wegen ihrer human-ähnlichen Glykosylierung häufig zur Produktion von Pharmazeutika für die Humanmedizin eingesetzt werden. Sie bieten allerdings nur verhältnismäßig schlechte Ausbeuten und sind aufgrund ihrer anspruchsvollen Nährmedien relativ teuer. Insektenzellen, und vor allem das Baculovirus-Insektenzell- Expressionssystem (BEVS), besitzen ebenfalls die Fähigkeit komplexe posttranslationale Modifikationen korrekt auszuführen, erzielen hierbei aber höhere Ausbeuten bei niedrigeren Kosten. Sie stellen daher ein, vor allem für die Forschung (z.B. Strukturaufklärung) interessantes, alternatives Expressionssystem dar. Im BEVS wird ein Baculovirus gentechnisch so verändert, dass es in infizierten Insektenzellkulturen das gewünschte rekombinante Protein, meist gesteuert durch einen starken viralen Promotor, exprimiert. Bei der Expression toxischer Proteine ergibt sich allerdings das Problem, dass die infizierten Zellen durch das produzierte Toxin geschädigt werden, was in einer Abnahme der Proteinproduktion und Virusreplikation resultiert. Dadurch wird die Zellkultur nicht vollständig durchinfiziert, wodurch die Ausbeute sinkt. Der Einsatz induzierbarer Promotoren im BEVS hätte gegenüber herkömmlichen Promotoren den Vorteil, dass die Proteinproduktion zu einem beliebigen Zeitpunkt nach der Infektion (z.B. bei Erreichen einer definierten Infektionsrate) synchron eingeschaltet werden könnte. Baculoviren werden neben dem BEVS aufgrund ihrer Wirtsspezifität auch als Biopestizid gegen Schmetterlingslarven eingesetzt, die jährlich Schäden von mehr als 6,6 Mrd. Euro verursachen (Bradshaw et al., 2016). Baculoviren besitzen nur eine langsame Tötungsgeschwindigkeit von mehreren Tagen bis Wochen, in denen die Fressschäden vorerst weiter zunehmen. Die Entwicklung rekombinanter Baculoviren mit erhöhter Effizienz läuft seit den 1990er Jahren und beruht hauptsächlich auf der Expression insektizider, heterologer Proteine. Hierdurch sterben aber auch die zur Produktion der Viren eingesetzten Larven/Insektenzellen früher, wodurch die Virusausbeute stark sinkt. Auch hier wären induzierbare Promotoren die Lösung, da die Expression des heterologen Proteins während der Phase der Virusproduktion inhibiert werden könnte, wodurch die Virusausbeuten nicht beeinträchtigt werden würden. Erst nach Infektion des Schädlings auf dem Feld würde das rekombinante Protein produziert werden und den Wirt schneller töten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher zwei induzierbare Promotoren für einen möglichen Einsatz im BEVS untersucht. 1

2 Stand des Wissens

2.1 Das Baculovirus

Baculoviren wurden zum ersten Mal im Jahr 1953 von G. Bergold elektronenmikroskopisch untersucht und 20 Jahre später nach dem lateinischen Wort baculum benannt, was Stab, Stange bedeutet und die Morphologie des Virus beschreibt (Bergold, 1953; Vago et al., 1974). Baculoviren sind weltweit verbreitet und extrem, obgleich nicht absolut, wirtsspezifisch, weshalb sie sich sehr gut zum Einsatz als Biopestizid in der Landwirtschaft eignen (Moscardi, 1999). Zu ihren über 600 verschiedenen, ausschließlich wirbellosen Wirten zählen neben den Larven diverser Falterarten auch Zwei- und Hautflügler sowie Köcherfliegen und Shrimps (Rohrmann, 2013). Baculoviren besitzen ein zirkuläres Genom aus doppelsträngiger DNA mit einer Größe von 82 kb bis 179 kb, das auch gegenüber großen Insertionen tolerant ist (Hayakawa et al., 1999; Lauzon et al., 2004). Bisher wurden die Genomsequenzen von mindestens 73 Baculoviren in der GenBank veröffentlicht, darunter das Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), das als das am besten erforschte Baculovirus gilt und die Grundlage für fast alle Baculovirus-Insektenzell- Expressionssysteme bildet (Ayres et al., 1994).

2.1.1 Klassifizierung

Die meisten bisher isolierten Baculoviren stammen aus den Raupen von Schmetterlingen (Lepidoptera), einige aus Sägewespen- (Hymenoptera) und Mosquitolarven (Diptera). Die erste Unterteilung der Familie der Baculoviridae erfolgte anhand der Morphologie der in infizierten Zellen gebildeten occlusion bodies (OBs) zunächst in zwei Gattungen: Nucleopolyhedroviren (NPV) und Granuloviren (GV). Während GVs im Cytoplasma kleine ovale OBs mit jeweils nur einem eingebettetem Nukleokapsid bilden, produzieren NPVs große polyedrische OBs im Zellkern der infizierten Zelle, die Virionen aus entweder nur einem einzelnen (single; SNPV) oder aus mehreren (multiple; MNPV) Nukleokapsiden enthalten können (Rohrmann, 2013). In Abbildung 2.1 ist der Unterschied zwischen SNPVs, MNPVs und GVs noch einmal grafisch veranschaulicht.

2 2.1 Das Baculovirus

Abbildung 2.1: Schematische Darstellung des Aufbaus der occlusion bodies (OBs) von multiple und single Nucleopolyhedroviren (NPV) sowie Granuloviren (GV) (Steineke, 2004) Durch die Sequenzierung der viralen Genome und den Abgleich mit den bereits beschriebenen Morphologien war es möglich ein besseres Verständnis für die evolutionäre Verwandtschaft zu entwickeln und die Baculoviren dadurch genauer zu klassifizieren. So konnte beispielsweise bestätigt werden, dass Viren, die die gleiche Wirtsspezies befallen, genetisch untereinander enger verwandt sind als Viren, die verschiedene Wirtsspezies bevorzugen (Au et al., 2013). Basierend auf diesen Daten werden Baculoviren, wie in Abbildung 2.2 dargestellt, heutzutage zusätzlich anhand ihres Wirts in vier Gattungen eingeteilt.

Abbildung 2.2: Klassifizierung der Baculoviren Unter der Gattung ist die Anzahl der zur jeweiligen Gattung gehörenden Spezies sowie in Klammern die Anzahl der noch nicht offiziell einsortierten Spezies angegeben. Aus Lepidoptera isolierte NPVs gehören zu den Alphabaculoviren, wohingegen aus Lepidoptera isolierte GVs zu den Betabaculoviren zählen. Als Gammabaculoviren werden alle Hymenoptera infizierenden Viren bezeichnet, wohingegen die aus Diptera gewonnenen Viren in der Gruppe der Deltabaculoviren zusammengefasst werden (Jehle et al., 2006). Die Alphabaculoviren unterscheiden sich untereinander in einem zur Infektion benötigten fusogenen Protein und werden deshalb weiter in Gruppe I und

3 2 Stand des Wissens

Gruppe II NPVs unterteilt, wobei Gruppe I NPVs das Glykoprotein 64 (GP64) und Gruppe II NPVs F-Proteine verwenden (Pearson und Rohrmann, 2002). Laut dem International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) umfasst die Gattung der Alphabaculoviren aktuell 40 Spezies, mindestens acht weitere bereits sequenzierte Alphabaculoviren warten noch auf ihre offizielle Einordnung. Als Betabaculoviren sind aktuell 23 Spezies klassifiziert und fünf weitere bereits sequenziert, aber noch nicht offiziell aufgenommen. Die Gattung der Gammabaculoviren beinhaltet drei Spezies, von denen bis dato aber nur zwei offiziell klassifiziert worden sind. Innerhalb der Deltabaculoviren ist bisher nur eine einzige Spezies bekannt (Homepage ICTV, NCBI taxid 10442). Die Viren werden normalerweise nach dem Wirt, aus dem sie das erste Mal isoliert wurden, und der Art ihrer gebildeten OBs benannt (King et al., 2012). Das Virus Autographa californica multicapsid Nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) wurde folglich aus der Mottenart Autographa californica isoliert und bildet polyedrische OBs mit vielen eingeschlossenen Nukleokapsiden. Es wird daher in die Gattung der Alphabaculoviren eingeordnet und stellt auch deren bekanntesten Vertreter dar (Ferrelli et al., 2012; Rohrmann, 2013).

2.1.2 Aufbau

Die kleinste Struktureinheit der Baculoviren bilden die stäbchenförmigen Nukleokapside, die hauptsächlich aus dem viralen dsDNA-Genom und dem formgebenden Protein VP39 bestehen. Das eine Ende besitzt eine spitz zulaufende, hervorstehende Kappe, wohingegen das andere Ende abgeflacht ist (Friesen, 2007; Wang et al., 2016). Hier ist auch das virale Protein VP78/83 lokalisiert, das im Infektionsprozess eine wichtige Rolle beim Transport im Cytoplasma durch Aktinnukleation spielt (Ohkawa et al., 2010). Die 250 bis 300 nm langen Nukleokapside sind entweder einzeln (SNPV, GV) oder zu mehreren (MNPV) in eine Hülle gepackt und bilden die infektiösen viralen Partikel, auch Virionen genannt (Funk et al., 1997). Die meisten Baculoviren besitzen zwei unterschiedliche Formen an Virionen, die budded viruses (BV) und die in den OBs eingebetteten occlusion-derived viruses (ODV). Während alle vier Baculovirus Gattungen OBs und somit auch ODVs bilden können, sind nur die Alpha-, Beta- und Deltabaculoviren in der Lage auch BV zu produzieren (Herniou et al., 2012). Obwohl beide Virionen-Typen auf den gleichen Nukleokapsiden basieren, unterscheiden sie sich in Herkunft und Zusammensetzung ihrer Hüllen. Das ist darauf zurückzuführen, dass sie zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Replikationszyklus und an unterschiedlichen Stellen innerhalb der Zelle gebildet werden und verschiedene Funktionen besitzen (Au et al., 2013). BV entstehen bereits zu Beginn der Replikation der Viren, indem einzelne Nukleokapside aus der Zelle ausgeschleust werden (knospen, englisch: to bud) und dabei einen Teil der Plasmamembran als Hülle erhalten (Rohrmann, 2013). In die Plasmamembran wurden jedoch zuvor die viralen Proteine GP64 und F-Proteine

4 2.1 Das Baculovirus integriert, die das Eindringen der BV in weitere Zellen durch Endocytose ermöglichen (Blissard und Wenz, 1992; Pearson et al., 2000).

Der Aufbau von OBs, ODVs und BVs ist in Abbildung 2.3 skizziert.

Abbildung 2.3: Schematische Darstellung des Aufbaus von MNPV OBs, ODVs und BVs ODVs sind in eine kristalline Proteinmatrix aus Polyhedrin eingebettet und formen OBs. Die Hüllen der ODV und BV sowie die enthaltenen Nukleokapside beinhalten viele verschiedene Proteine, von denen hier nur einige wenige, für das weitere Verständnis notwendige, dargestellt sind (Au et al., 2013). ODVs werden erst in der späten Phase der Infektion gebildet, indem ein oder mehrere Nukleokapside im Kern der infizierten Zelle von einer de novo zusammengesetzten Membran umhüllt werden. Der Ursprung und die Zusammensetzung dieser Hülle sind nicht abschließend geklärt, es wird aber vermutet, dass sie aus Teilen der Kernmembran besteht, die durch viele weitere, zum Teil viruskodierte, Proteine verändert wurde (Rohrmann, 2013; Hong et al., 1997; Slack und Arif, 2006). Die Virionen werden abschließend in eine Proteinmatrix aus Polyhedrin (NPVs) oder Granulin (GVs) eingebettet und formen OBs, wobei die polyedrischen OBs aus Polyhedrin mit einem Durchmesser von 0,6 bis 2 µm deutlich größer sind als die ovalen OBs der GV mit 0,2 bis 0,4 µm (Ackermann und Smirnoff, 1983). Nach dem Tod des infizierten Wirts werden die OBs in die Umwelt freigesetzt, wo die Proteinmatrix die empfindliche virale DNA vor Umwelteinflüssen schützt, insofern sie keiner großen Hitze und UV-Belastung ausgesetzt sind (Rohrmann, 2008). Im Gegensatz zu BVs, die für die Verbreitung des Virus von Zelle zu Zelle innerhalb des Wirtes verantwortlich sind, besteht die Aufgabe der ODVs bzw. OBs darin, das Virus horizontal auf weitere Wirte zu übertragen.

5 2 Stand des Wissens

2.1.3 Replikationszyklus in vivo am Beispiel des AcMNPV

Baculoviren durchlaufen einen zweiphasigen Replikationszyklus, bei dem zwei unterschiedliche virale Phenotypen, die bereits in Kapitel 2.1.2 vorgestellten ODVs und BVs, produziert werden. Während die in OBs gebetteten ODVs für die Primärinfektion verantwortlich sind, ist es Aufgabe der BVs die Infektion im gesamten Wirt durch Sekundärinfektion auszubreiten. Eine Übersicht über den Replikationszyklus ist in Abbildung 2.4 dargestellt.

Abbildung 2.4: Schematische Darstellung des zweiphasigen Replikationszyklus am Beispiel des AcMNPV (Blissard und Rohrmann, 1990) Beim Fressen kontaminierter Blätter nimmt die Insektenlarve OBs auf, die auf diese Weise in ihren Verdauungstrakt gelangen. Aufgrund des im Mitteldarm vorherrschenden alkalischen pH‑Wertes (Dow, 1992) und der, in die OBs eingeschlossenen, im alkalischen Milieu aktiven, Proteasen, lösen sich die kristallinen OBs auf und setzen die enthaltenen

6 2.1 Das Baculovirus

ODVs frei. Um zu den Zellen des Mitteldarmepithels zu gelangen, durchqueren die ODV zuerst die peritrophische Membran, die das Lumen des Mitteldarms vom Mitteldarmepithel abgrenzt und aus Chitin und Proteinen besteht. Mit Hilfe einer Reihe sogenannter per os infectivity factors (PIFs) auf ihrer Hüllmembran heften sich die ODVs danach an die Zellmembran an, wodurch die Fusion beider Membranen hervorgerufen wird und die Nukleokapside in die Zelle eindringen können (Ohkawa et al., 2005; Ishimwe et al., 2015; Horton und Burand, 1993). Der Transport zum Zellkern erfolgt über Aktinnukleation, die durch ein Zusammenspiel der viralen Proteine VP78/83 auf dem Nukleokapsid mit dem Arp2/3 Komplex der Wirtzelle initiiert wird (Ohkawa et al., 2010; Goley et al., 2006). Durch Kernporen in der Kernmembran gelangen die Nukleokapside in den Zellkern, wo die Transkription und Translation viraler Gene beginnt und eine fein regulierte Transkriptionskaskade in Gang gesetzt wird. Diese kann in vier Phasen unterteilt werden (Lu et al., 1997; Au et al., 2016), die hier basierend auf ihrer zeitlichen Abfolge nach Infektion (hpi, engl.: hours post infection) beschrieben werden.

Frühe (immediate early) und verzögerte frühe (delayed early) Phase, ca. 0 – 6 hpi

Nachdem die ODVs im Zellkern von ihrer Hülle befreit worden sind, beginnt die Replikation der viralen Gene durch die zelleigene RNA Polymerase II. Die frühen Gene werden ohne Beteiligung viraler Proteine ausschließlich unter Verwendung zelleigener Transkriptionsfaktoren transkribiert und kodieren beispielsweise für das Anti-Apoptose Protein P35, dessen mRNA bereits zwei Stunden nach Infektion nachgewiesen werden kann, sowie für Genprodukte, die wiederum zur Transkription der Gene der verzögerten frühen Phase benötigt werden (Kelly et al., 2016; Murhammer, 2016). Unter den, während der verzögerten frühen Phase exprimierten, Proteinen befinden sich auch Transkriptionsfaktoren, die die Transkription und Replikation der viralen DNA in der späten Phase induzieren (Hefferon und Miller, 2002).

Späte (late) Phase, ca. 6 – 24 hpi

Während der späten Phase, bis etwa 20 hpi, findet die Replikation des viralen Genoms statt, wobei sogenannte hrs (homologous regions) als Replikationsursprünge fungieren (Rohrmann, 2011; Rosinski et al., 2002). Die Replikation erfolgt im virogenic stroma, einer Chromatin-ähnlichen Struktur mit Stellen hoher und niedriger Elektronendichte, die sich nahe dem Zellkern bildet und als molekulares Gerüst für die koordinierte Transkription und Replikation der viralen DNA sowie deren Verpackung in Nukleokapside dient (Young et al., 1993). Hierfür werden außerdem die Gene für virale Strukturproteine, die zum Aufbau neuer Nukleokapside aus der synthetisierten viralen DNA benötigt werden, sowie gp64 von einer virus-kodierten RNA Polymerase transkribiert. Das Glykoprotein GP64 wird zur Zellmembran transportiert und in diese integriert. Ab ca. 10 hpi schnüren sich neu gebildete Nukleokapside durch die Zellmembran nach außen ab, wodurch sie ihre 7 2 Stand des Wissens

Hülle erhalten und fortan als BV bezeichnet werden (Rohrmann, 2013). Insgesamt verlassen bis zu 2.000 BVs, was etwa 2,3 % der neu synthetisierten viralen DNA entspricht, eine Zelle und verursachen durch die Infektion von Nachbarzellen eine systemische Infektion (Rosinski et al., 2002). Der Eintritt des BV in die Zelle erfolgt durch Clathrin-vermittelte Endozytose (Long et al., 2006). Das in der Virushülle enthaltene GP64 scheint hierbei eine entscheidende Rolle zu spielen. Zum einen ist es an der Bindung von bisher unbekannten zellulären Rezeptoren beteiligt und zum anderen vermittelt es die durch niedrige pH-Werte ausgelöste Membranfusion, die notwendig ist, um das Nukleokapsid während der Endozytose ins Cytosol freizusetzen (Hefferon et al., 1999; Zhou und Blissard, 2008). Von dort aus bewegt es sich wie die ODVs zum und in den Zellkern und ein neuer Replikationszyklus beginnt (Granados und Lawler, 1981).

Sehr späte (very late) Phase, ca. 18 – 72 hpi

In der letzten Phase des Replikationszyklus sinkt die BV-Produktion und die im Zellkern vorhandenen Nukleokapside erhalten stattdessen eine Hülle, die vermutlich aus Teilen der inneren Kernmembran und vielen weiteren Proteinen, wie beispielsweise den bereits erwähnten PIFs, besteht (Slack und Arif, 2006). Parallel dazu beginnt die Überexpression der Proteine Polyhedrin und p10, die durch die sehr starken Polyhedrin- und p10- Promotoren gesteuert wird. Obwohl p10 nicht direkter Bestandteil der Polyhedrinmatrix ist, wird es für die spätere Freisetzung der OBs benötigt (Raza et al., 2017). Das Polyhedrin kristallisiert um die ODVs aus und bildet dadurch die polyedrischen OBs, die unter dem Mikroskop im Kern der infizierten Zelle beobachtet werden können. Pro Zelle können über 70 OBs entstehen, wobei das Polyhedrin 70 hpi 25 - 50 % der gesamten Proteinmasse der Zelle ausmacht, die zu diesem Zeitpunkt das bis zu 1,45-Fache ihres ursprünglichen Durchmessers angenommen hat (Miller, 1988; Gotoh et al., 2008). Es werden außerdem die beiden Virus-kodierten Enzyme Chitinase und Cathepsin exprimiert, die in den infizierten Zellen akkumulieren. Erst durch die Lyse der Zellen werden sie im Wirt freigesetzt und bewirken eine Verdunkelung der Cuticula, gefolgt von einer Verflüssigung des Kadavers des infizierten Insekts. Die Desintegration führt zur Freisetzung der gebildeten OBs, die daraufhin vom nächsten Wirt aufgenommen werden können (Hawtin et al., 1997; Hodgson et al., 2007). Insgesamt dauert es in Abhängigkeit der Virus-Wirt-Kombination und der Umweltbedingungen ca. fünf Tage bis drei Wochen von der Primärinfektion bis zum Tod des Wirtes (Popham et al., 2016).

8 2.2 Einsatz von Baculoviren als Biopestizid

2.2 Einsatz von Baculoviren als Biopestizid

Biopestizide sind, nach der Definition von Steinke und Giles (1995) biologische Produkte oder Organismen, die von einer biologischen Quelle außerhalb des zu behandelnden Feldes stammen und zu denen Viren, Bakterien, Pilze, Jäger, Parasiten und Pheromone zählen. Sie können entweder einzeln oder in Kombination, im Rahmen einer ganzheitlichen Betrachtung der Schädlingsproblematik, zum Einsatz kommen (Abrol, 2012).

Baculoviren als Biopestizide einzusetzen bringt gegenüber chemischen Pestiziden viele Vorteile. Sie sind nicht toxisch und stellen nicht nur keine Gefahr für die menschliche Gesundheit und Umwelt dar, sondern sind auch für die Anwendung im Rahmen einer ökologischen und nachhaltigen Landwirtschaft geeignet (Moscardi, 1999; Buerger et al., 2007; Joermann, 2017b). Aufgrund ihrer Wirtsspezifität sind sie ebenfalls unschädlich für Nicht-Zielorganismen wie Pflanzen, Tiere und insbesondere nützliche Insekten, wie Bienen, natürliche Jäger und Parasitoide (Gröner, 1990; Ashour et al., 2007; Lapointe et al., 2012).

2.2.1 Baculovirus-Präparate

Die Vorteile von Baculoviren als Biopestizid wurden sich bereits im Jahre 1892 in Deutschland zu Nutze gemacht, wo ein Baculovirus erfolgreich gegen die Larven des Nachtfalters Lymantria monacha in Kiefernwäldern eingesetzt wurde (Huber, 1986). Das weltweit erste registrierte Baculovirus-Präparat Elcar™, zum Schutz von u. a. Sojabohnen, Mais und Tomaten, wurde 1975 von der Firma Sandoz Inc. eingeführt und bestand aus dem HezeNPV, einem Baculovirus mit relativ breitem Wirtspektrum, der mehrere Spezies der Gattungen Helicoverpa und Heliothis infizieren kann (Ignoffo und Couch, 1981; Mettenmeyer, 2002). Das erste in Europa kommerziell erhältliche Pflanzenschutzmittel wurde 1983 von der Firma Kemira Oy unter dem Namen Monisärmiövirus auf den Markt gebracht und enthielt das Baculovirus NeseNPV gegen den Schädling Neodiprion sertifer (Rote Kiefernbuschhornblattwespe) (Orakçi, 2009).

Seither wurden weltweit über 50 Formulierungen aus Baculoviren registriert und in den verschiedensten Bereichen eingesetzt, zu denen nicht nur der Schutz von Nutzpflanzen auf dem Feld, sondern auch der von Obstanbaugebieten, Lagerbeständen und Wäldern zählt (Lacey et al., 2001; Szewczyk et al., 2009). In Tabelle 2.1 ist beispielhaft eine Auswahl der am häufigsten eingesetzten Baculovirus-Präparate sowie der zugehörigen Schädlinge und Pflanzen zusammengestellt. Aktuell (Stand Juli 2017) sind in Deutschland nur zwei Baculoviren (CpGV und AdorGV) als Biopestizide zugelassen, wobei AdorGV im Gegensatz zu CpGV nur eine deutsche und keine europäische Zulassung besitzt. Die Viren

9 2 Stand des Wissens

SpliNPV, SpexNPV und HearNPV hingegen besitzen eine europäische, jedoch keine deutsche Zulassung (Joermann, 2017a; Homepage der Europäischen Kommission).

Aufgrund der Tatsache, dass die meisten bisher bekannten Baculoviren den Gattungen Alpha- und Betabaculovirus angehören, basieren auch fast alle kommerziell hergestellten Baculovirus-Präparate auf Viren dieser beiden Gattungen und richten sich somit gegen Lepidoptera. Die Ausnahme bilden die beiden Gammabaculoviren NeabNPV und NeleNPV, die gegen Blattwespen zum Einsatz kommen (Lucarotti et al., 2007; Erlandson, 2008). Das bisher einzige charakterisierte Deltabaculovirus CuniNPV ist ein vielversprechender Kandidat zur Bekämpfung von Stechmücken der Gattung Culex spp., die Überträger des West-Nil-Virus und anderer Arten der Encephalitis sind. Die Entwicklung eines CuniNPV basierten Präparates scheiterte bisher an einer geeigneten Formulierung, die die vom Virus zur Infektion benötigten hohen Konzentrationen an Magnesium zur Verfügung stellt (Becnel, 2006).

10 2.2 Einsatz von Baculoviren als Biopestizid

Tabelle 2.1: Beispiele von Baculoviren als Biopestizide im Pflanzenschutz Mit 1 gekennzeichnete Viren sind in Deutschland zugelassen, mit 2 gekennzeichnete Viren in Europa. Die Angaben sind beispielhaft und ohne Anspruch auf Vollständigkeit.

Baculovirus Produktbezeichnungen Schädlinge Pflanzen/Früchte Regionen Quellen AngeMNPV Baculo-soja, Anticarsia gemmatalis Sojabohne Brasilien (Moscardi et al., 2011) Coopervirus SpliNPV2 Spodopterin Spodoptera littoralis Baumwolle, Mais Europa, USA (Beas-Catena et al.,

2014)

SpexMNPV2 Spod-X, DOA BIO V1, Spodoptera exigua Weizen, Mais, Reis, Europa (Erlandson, 2008) Vir-ex, Ness-A Weidegrass, Gerste

HezeSNPV Elcar, GemStar, Biotrol Helicoverpa zea, Baumwolle, Mais, USA, Australien, (Buerger et al., 2007; Baculoviren

- Heliothis virescens Kichererbse, Sorghum China, Indien Szewczyk et al., 2012) α HearNPV2 Virin-HS, DOA BIO V2 Helicoverpa armigera Sorghum, Baumwolle, Europa, Australien, (Hauxwell, 2008; Beas- Sojabohne, Tomate China, Indien, Catena et al., 2014) Kenia LydiMNPV Disparvirus, Gypchek Lymantria dispar Forstwirtschaft USA, Kanada (Moscardi et al., 2011) CpGV1,2 Granusal, Madex MAX, Cydia pomonella Äpfel, Birnen, Europa, Südafrika (Lacey und Shapiro-Ilan,

Carpovirusine Walnüsse Argentinien, 2008) - β Neuseeland, AdorGV1 Capex 2 Adoxophyes orana Äpfel, Birnen Deutschland (Erlandson, 2008)

NeabNP Abietiv Neodiprion abietis Tannenwälder Kanada (Lucarotti et al., 2007) - γ NeleNPV Lecontivirus Neodiprion lecontei Kiefernwälder Kanada, USA (Erlandson, 2008)

11 2 Stand des Wissens

2.2.2 Entwicklungsmöglichkeiten Baculovirus-basierter Biopestizide

Obwohl sich der Markt für Baculoviren in den letzten zehn Jahren fast verdreifacht hat, beträgt ihr Anteil bezogen auf den Umsatz aller Biopestizide nur ca. 10 %, deren Anteil an allen Pestiziden 2009 wiederum nur 3,5 % ausmachte (Glare et al., 2012; Lacey et al., 2015). Aufgrund noch bestehender Limitationen wird das Potential der Baculoviren für eine effiziente Schädlingsbekämpfung derzeit nicht vollständig ausgeschöpft (Popham et al., 2016).

Die Herstellung der Viren zur kommerziellen Nutzung erfolgt größtenteils in vivo entweder durch Einsammeln infizierter Larven von Feldern oder durch die Infektion gezüchteter Larven über das Futter. Dieser Prozess ist nicht nur zeit- und personalaufwendig, sondern ermöglicht auch keine gleichbleibende Produktqualität (Grzywacz et al., 2014). Deshalb bestehen Bestrebungen, Baculoviren zukünftig kostengünstiger und in gleichbleibender Qualität in vitro zu produzieren, wofür aber erst entsprechende Zelllinien, Nährmedien und Prozesse entwickelt werden müssen (Reid et al., 2014; Grzywacz, 2017; Grzywacz und Moore, 2017).

Nach der Ernte werden die Baculoviren meist entweder als Suspensionskonzentrat oder als Pulver abgefüllt und müssen vom Anwender zum Teil noch in Wasser verdünnt werden bevor sie versprüht werden können (Grzywacz und Moore, 2017). Das Versprühen wird mit Spritzgeräten durchgeführt, die eigentlich für die Anwendung mit klassischen chemischen Pestiziden konzipiert wurden und für Baculoviren aufgrund der Tröpfchengrößen sowie der Sprühhöhe nicht optimal geeignet sind, da sie die niedrigeren Blätter, auf denen sich die Larven befinden, nicht benetzen. Neue Entwicklungen im Bereich der Applikationstechnik befassen sich nicht nur mit den Spritzgeräten sondern auch mit den Formulierungen an sich und könnten den Einsatz von Biopestiziden noch effizienter machen (Gan-Mor und Matthews, 2003).

Die Effizienz der Baculoviren hängt außerdem davon ab, wann sie auf das Feld ausgebracht werden, da sie frisch geschlüpfte Larven und frühe Entwicklungsstadien am effektivsten infizieren können (Rohrmann, 2013). Der Landwirt muss seine Anbauflächen folglich kontinuierlich auf Schädlinge hin überprüfen, um zum richtigen Zeitpunkt reagieren zu können und aufgrund der geringen Persistenz der Viren unter Umweltbedingungen gegebenenfalls wiederholt sprühen (Cory und Evans, 2007). Der UV- Anteil im Sonnenlicht inaktiviert die Baculoviren, indem es die virale DNA schädigt, wodurch ihre Funktionalität verloren geht und die Viren sich nicht mehr replizieren können (Payne, 1982). Während sie im Blattwerk von Wäldern der gemäßigten Breiten einen Monat und länger unbeschadet überdauern können (Fuxa, 2004), können sie unter hoher UV-Belastung bereits innerhalb eines Tages inaktiviert werden (Cherry et al., 2000).

12 2.2 Einsatz von Baculoviren als Biopestizid

Da die Proteinmatrix der OBs alleine offensichtlich nicht als Schutz vor UV-Strahlung ausreicht, wird versucht durch Zusätze und andere Formulierungen einen Sonnenschutz für Baculoviren zu entwickeln (Burges und Jones, 1998; Orakçi, 2009; Behle und Birthisel, 2014). Weitere Faktoren, die die Persistenz der Baculoviren beeinflussen, sind das Wetter und Pflanzenmetabolite. Nach dem Aufbringen trocknen die OBs auf den Blättern fest und halten auch Regen und Temperaturen bis 50 °C stand. Regnet es allerdings bevor die OBs festgetrocknet sind, haften sie nicht am Blattwerk und werden weggespült, wodurch die Wahrscheinlichkeit, von einer Larve gefressen zu werden, drastisch sinkt. Zudem können Pflanzenmetabolite wie beispielsweise Isoflavonoide, die Persistenz und Infektiosität der Baculoviren sowohl positiv als auch negativ beeinflussen (Cory und Hoover, 2006; Stevenson et al., 2010).

Die hohe Wirtspezifität der Baculoviren macht diese zwar sehr sicher für Nicht- Zielorganismen, schränkt aber auch ihren Wirkungsbereich sehr ein. Daher können Baculoviren nur gezielt eingesetzt werden, während chemische Pestizide häufig gegen eine Vielzahl von Schädlingen wirksam sind. Bei Befall mit mehreren Schädlingen kann aber eine Kombination verschiedener Baculoviren, eventuell auch in Verbindung mit anderen Biopestiziden, zur nachhaltigen Schädlingsbekämpfung eingesetzt werden (Lacey, 2017). Durch dieses Vorgehen und die Verwendung verschiedener Isolate desselben Baculovirus kann auch verhindert werden, dass selbst bei Langezeitbehandlungen Resistenzen ausgebildet werden, wie einst für CpGV berichtet (Eberle und Jehle, 2006; Eberle et al., 2008).

Der wohl wichtigste Grund für die eingeschränkte Verwendung von Baculoviren ist deren, im Vergleich zu chemischen Pestiziden, langsame Tötungsgeschwindigkeit, die von der Baculovirus-Wirt-Kombination und den Umweltbedingungen abhängig ist (Szewczyk et al., 2006). Schnell wachsende, tropische Wirte können innerhalb von 3 - 7 Tagen sterben, wohingegen es bei langsam wachsenden Wirten, wie dem Schwammspinner (Lymantria dispar), 10 - 15 Tage oder länger dauern kann bis der Tod eintritt (Shapiro, 1986). Während dieser Zeit fressen die Larven weiter und können erheblichen Schaden verursachen. Während manche Anbausysteme, wie z.B. Kiefernwälder, diesen Schaden ohne große finanzielle Verluste wegstecken können, sind die Auswirkungen im Obstbau oder bei Feldfrüchten kaum tragbar (Moscardi et al., 2011), weshalb der Einsatz von Baculoviren hier bisher auf jene GV beschränkt ist, die in ca. 4 - 10 Tagen zum Tod des Wirtes führen (Federici, 1997; Lacey et al., 2008). Um ein breiteres Spektrum an Baculoviren für viele Anwendungen anbieten zu können, wird unter anderem versucht die Tötungsgeschwindigkeit durch gentechnische Veränderung der Baculoviren zu erhöhen.

13 2 Stand des Wissens

2.2.3 Rekombinante Baculoviren zum Pflanzenschutz

Die gentechnische Modifikation von Baculoviren zur Generierung eines besseren Biopestizids verfolgt das Ziel, spezielle Eigenschaften der Viren so zu verändern, dass die Dauer bis zum Tod des Wirts verkürzt, das Wirtspektrum erweitert und die UV-Stabilität erhöht wird. Hierzu stehen prinzipiell zwei Ansätze zur Verfügung. Entweder werden Fremdgene in das Baculovirusgenom eingebracht, deren Genprodukte die genannten Eigenschaften beeinflussen, oder es wird versucht durch Deletion endogener Gene Einfluss auf das Wirtspektrum und den Infektionsverlauf zu nehmen. Die inserierten exogenen Gene lassen sich in drei Kategorien einteilen: Hormone, Enzyme und Toxine.

2.2.3.1 Hormone Das erste Baculovirus, das ein rekombinantes Hormon exprimierte, wurde 1989 von Maeda hergestellt. Das diuretische Hormon führte zu starkem Wasserverlust der infizierten Bombyx mori Larven, wodurch die Tötungsgeschwindigkeit im Vergleich zum Wildtyp-Virus um 20 % erhöht werden konnte (Maeda, 1989). In den folgenden Jahren wurden mindestens vier weitere Insektenhormone getestet, die aber keine signifikante Steigerung der insektiziden Aktivität zeigten (Eldridge et al., 1991; O'Reilly et al., 1995; Vakharia et al., 1995; Ma et al., 1998; Girardie et al., 2001).

2.2.3.2 Enzyme Die Idee der Manipulation des Hormonhaushaltes wurde aber nicht verworfen, sondern in anderer Form weiterverfolgt. Die Juvenilhormonesterase (JHE) ist ein Enzym, das natürlicherweise in Insekten vorkommt und die Konzentration des Juvenilhormons durch Inaktivierung des Hormons reguliert. Eine durch ein rekombinantes Baculovirus gesteuerte, verfrühte Expression des JHE-Gens führt zu einem vorzeitigen Abfall des Juvenilhormonspiegels und leitet die Verpuppung ein (Kamita et al., 2005). Erste vielversprechende Versuche hierzu wurden 1990 von Hammock et al. durchgeführt, deren Ansatz von weiteren Arbeitsgruppen aufgegriffen und weiterentwickelt wurde (Hammock et al., 1990b; El-Sheikh et al., 2011). Tatsächlich fraßen die infizierten Larven im Vergleich zur Wildtyp-Kontrolle weniger, waren kleiner und starben etwas früher (Hammock et al., 1990a; Hammock et al., 1990b; Eldridge et al., 1992). Weitere Beispiele für den Einsatz von Enzymen sind Enhancine, die zu den Metalloproteasen gehören und die Virulenz der

Viren erhöhen, was in einer bis zu 21-fach niedrigeren LD50 (letale Dosis, um 50 % der infizierten Larven zu töten) resultierte (Hayakawa et al., 2000; Adoga, 2012). Harrison und Bonning untersuchten den Einfluss der Expression der Proteasen Stromelysin-1, Gelatinase A und Cathepsin L, von denen bekannt ist, dass sie Proteine der peritrophischen Membran abbauen können, auf infizierte H. virescens Larven. Dabei konnten sie zeigen, dass die Überexpression des Enzyms Cathepsin L die Dauer bis zum

14 2.2 Einsatz von Baculoviren als Biopestizid

Tod um 51 % von 98 auf 48 Stunden verringert (Harrison und Bonning, 2001). Es wurden weitere Versuche mit Cathepsin L und B exprimierenden Baculoviren durchgeführt und diese sogar in Feldversuchen erfolgreich getestet (Shao et al., 2008; Li et al., 2008; Sun et al., 2009).

Eine Reihe weiterer Enzyme wurde untersucht, darunter die algal virus pyrimidine dimer specific glycosylase (cv-PDG), die in die ersten Schritte der Reparatur von durch UV-Licht geschädigter DNA involviert ist und die UV-Stabilität der OBs verbessern sollte (Furuta et al., 1997; Kamita et al., 2005). Zwar waren die rekombinanten BVs drei Mal resistenter gegen UV-Licht als die Wildtyp-Kontrolle, auf die OBs konnte jedoch kein positiver Einfluss festgestellt werden. Überraschenderweise hatte die Expression des Enzyms aber eine

Reduktion der LC50 (letale Konzentration, um 50 % der infizierten Laven zu töten) um 94 % und der LT50 (letale Zeit, Dauer bis 50 % der infizierten Laven gestorben sind) um 41 % in Spodoptera frugiperda Larven zur Folge (Petrik et al., 2003).

2.2.3.3 Toxine Eine weitere, ausgiebig untersuchte Möglichkeit Baculoviren als Biopestizid effizienter zu machen und die Tötungsgeschwindigkeit zu erhöhen, besteht in der Expression eines insektenspezifischen Toxins. Das Hauptaugenmerk lag hierbei auf Neurotoxinen, die aus Milben, Spinnen oder Skorpionen isoliert wurden und in der Lage sind Insekten zu paralysieren, sodass sie aufhören zu fressen und gegebenenfalls früher sterben. Das erste erfolgreiche und bis dato am häufigsten eingesetzte Toxin ist das Androctonus australis insect toxin 1 (AaIT), aus dem Gift des Skorpions A. australis. Das AaIT-Gen wurde in verschiedenen Baculoviren unter verschiedenen Promotoren und mit unterschiedlichen Ausschleussequenzen getestet, wobei eine Reduktion der durchschnittlichen Überlebensdauer der Larven um 46 % und der Fressschäden um bis zu 72 % erreicht werden konnte (Kamita et al., 2005). Baculoviren, die aus den gelben Mittelmeerskorpionen Leiurus quinquestriatus hebraeus und Leiurus quinquestriatus quinquestriatus, sowie aus dem roten Skorpion Mesobuthus tamulus, gewonnene Neurotoxine exprimieren, führten um bis zu 41 % bzw. 42 % schneller zum Tod als die entsprechenden Wildtyp-Viren (Harrison und Bonning, 2000; Regev et al., 2003; Rajendra et al., 2006). Beispiele für aus Milben und Spinnen gewonnene Toxine sind das Neurotoxin TxP-I aus Pyemotes tritici (Burden et al., 2000), DTX9.2 aus Diguetia canities und TalTX-1 aus Tegenaria agrestis (Hughes et al., 1997), Ba3 aus Brachypelma albiceps (Ardisson-Araújo et al., 2013), ar1b aus Atrax robustus (Yu et al., 2015) und Cit1a aus Lachesana tarabaevi (Ali et al., 2015). Eine weitere Strategie, um die Tötungsgeschwindigkeit zu erhöhen, ist die Integration eines Bacillus thuringiensis Toxins (Bt-Toxin) in die Polyhedrinmatrix, sodass dieses bereits bei der Primärinfektion direkt im Mitteldarm freigesetzt wird und seine Wirkung entfalten

15 2 Stand des Wissens kann. Chang et al. haben ein Baculovirus konstruiert, das ein Fusionsprotein aus Polyhedrin und dem Bt-Toxin Cry1 exprimiert und intakte OBs ausbildet. Dadurch konnte die LC50 um den Faktor 100 reduziert und die Tötungsgeschwindigkeit um 63 % verbessert werden (Chang et al., 2003). Darauf aufbauend haben Shim et al. zusätzlich zum Cry1- Polyhedrin-Fusionsprotein noch das AaIT-Gen in das Baculovirusgenom integriert und dadurch die Wirkmechanismen des im Mitteldarm aktiven Cry1 Bt-Toxins mit dem neurologisch wirksamen AaIT vereint (Shim et al., 2009). Insgesamt wurden schon über 70 verschiedene rekombinante Baculoviren, die für Neurotoxine kodieren, untersucht und die Anzahl nimmt stetig zu (Kroemer et al., 2015).

2.2.3.4 Gen Deletionen Das Baculovirus AcMNPV exprimiert ein Enzym namens Ecdysteroid UDP- Glukosyltransferase (EGT), das Zuckermoleküle auf das Hormon Ecdyson überträgt und es dadurch inaktiviert. Diese Inaktivierung verhindert die nächste Häutung, was zu einer Verlängerung des Larvenstadiums und damit einhergehend zu einer gesteigerten Nahrungsaufnahme führt. Homologe des egt sind in über 90 % der bekannten Baculoviren zu finden (Kamita et al., 2005). Durch Entfernen des, für die Virusreplikation nicht essentiellen, EGT-Gens aus dem Virusgenom kann die Häutung infizierter Larven normal stattfinden, wodurch Fressschäden um 40 % reduziert werden konnten (O'Reilly und Miller, 1991; Pinedo et al., 2003). Chen et al. und Sun et al. sind noch einen Schritt weiter gegangen und haben egt nicht nur entfernt, sondern stattdessen das Gen für das Toxin AaIT inseriert, wodurch die Effizienz der Viren sowohl im Hinblick auf die Tötungsgeschwindigkeit, als auch auf die Reduktion des Fressschadens weiter verbessert werden konnte (Chen et al., 2000; Sun et al., 2004). Yu et al. haben anstelle von aait das Gen für das Neurotoxin RjAa17f aus dem Skorpion Rhopalurus junceus in den EGT-Gen- Lokus integriert und dadurch ebenfalls eine Verringerung der Futteraufnahme in

Kombination mit einer Reduktion der LD50 um 57 % sowie der mittleren Überlebensdauer um 13 % erreicht (Yu et al., 2017).

Die Wirtspezifität der Baculoviren wird durch spezielle Gene, wie beispielsweise p143 (Helikase) (Nagamine und Sako, 2016), per os infectivity factors (PIFs) (Song et al., 2016), hrf-1 (host range factor 1), hcf-1 (host cell factor 1) und die immediate early Gene ie-1 und ie-2 sowie durch die Fähigkeit zur Inhibierung der Apoptose der infizierten Zelle reguliert (Thiem und Cheng, 2009). Durch einen Austausch dieser Gene durch Homologe aus anderen Spezies sowie die Überexpression Apoptose-inhibierender Faktoren, wie p35 und IAPs (inhibitor of apoptosis proteins) konnte das Wirtsspektrum einiger Baculoviren erweitert werden (Thiem und Cheng, 2009; Wu et al., 2016).

16 2.2 Einsatz von Baculoviren als Biopestizid

2.2.3.5 Weitere Entwicklungen Der Grad der Verbesserung insektizider Eigenschaften durch die Expression heterologer Proteine hängt nicht nur vom parentalen Virus, der Wirtsspezies, dem Larvenstadium des Wirts und der Virusdosis, sondern auch stark vom gewählten Promotor ab. Durch die Wahl des richtigen Promotors können Zeitpunkt und Menge des exprimierten Proteins reguliert und dadurch die Effizienz des Baculovirus erhöht werden. Einen Überblick über mögliche Promotoren bietet Kapitel 2.4. Neben der Erforschung geeigneter Promotoren befassen sich neueste Studien auch mit wachstumshemmenden Peptiden aus Spodoptera exigua (Wan et al., 2015), immunsuppressiven Proteinen (CrV1) aus dem Cotesia rubecula Bracovirus (Wei et al., 2016) und der Integration von Enhancinen in die Polyhedrinmatrix (Yang et al., 2017).

2.2.4 Produktion von Baculoviren

Wie bereits erwähnt, erfolgt die kommerzielle Herstellung von Baculoviren bis heute hauptsächlich in vivo. Nur einige kleine Unternehmen und Forschungsinstitute arbeiten in vitro mit Zellkulturen. Beide Produktionssysteme besitzen Vorteile, aber auch Limitationen, die im Folgenden beschrieben werden.

2.2.4.1 In vivo Produktion Teilweise kommt es immer noch vor, dass Baculoviren direkt auf dem Feld durch natürlich oder gezielt infizierte Larven gewonnen werden. Der mit Abstand größte Teil der Produktion findet aber in laborähnlichen Produktionsanlagen statt (van Beek und Davis, 2016). Von der Aufzucht der Larven über deren Infektion und Ernte bis zur Formulierung und Verpackung des fertigen Produktes wird alles in einer Anlage durchgeführt, wobei auf eine strikte räumliche Trennung der verschiedenen Bereiche geachtet werden muss, um eine Kontamination der Aufzucht mit den Baculoviren zu vermeiden. Obwohl diese Art der Produktion kein aufwändiges Equipment erfordert und recht simpel erscheint, müssen doch eine Reihe von Einflussfaktoren, die sich auf die Ausbeute und Qualität des Produktes auswirken, berücksichtigt werden. Zuerst muss überprüft werden, ob die verwendeten Larven Träger einer latenten Infektion eines anderen Virus sind und wie stark die Kontamination mit anderen Mikroorganismen ist, um eine Verunreinigung des Produktes zu reduzieren (Grzywacz und Moore, 2017). Da gewisse Bakterien und Pilze in Symbiose mit den Larven leben, lassen diese sich bei der in vivo Produktion nie ganz vermeiden und gelten bis zu einer Konzentration von 1∙108 cfu∙mL-1 in flüssigen Formulierungen und 5∙108 cfu∙mL-1 in Pulvern als unbedenklich (Jenkins und Grzywacz, 2000; Grzywacz und Moore, 2017). Es muss jedoch nachgewiesen werden, dass sich unter den Keimen keine Pathogene wie Shigella spp., Salmonella spp., Vibrio spp., oder Escherichia coli befinden (Jenkins und Grzywacz, 2003; Organisation for Economic Co-

17 2 Stand des Wissens operation and Development, 2011). Durch die Ernte der infizierten Larven vor ihrem Tod lässt sich zwar die mikrobielle Belastung verringern, dafür sinkt aber die Aktivität der produzierten Viren und somit die Produktqualität (Grzywacz und Moore, 2017). Die biologische Aktivität der Baculoviren ist dabei nicht nur vom Ernte-, sondern auch vom Infektionszeitpunkt und von weiteren Kultivierungsbedingungen wie Temperatur und Luftfeuchte abhängig (Subramanian et al., 2006). Die Produktivität der in vivo Produktion unterscheidet sich je nach Wirt-Baculovirus-Kombination und beträgt zwischen 3∙106 - 6∙106 OBs pro Milligramm Larve bei NPVs (Cherry et al., 1997) und 3,5∙106 – 2,3∙109 OBs pro Milligramm Larve bei GVs (Moore, 2002; Grzywacz et al., 2004; Cuartas et al., 2014), wobei ca. 1012 OBs pro Hektar bei NPVs (Ignoffo, 1999; Cherry et al., 2000; Lasa et al., 2007; Grzywacz et al., 2008; Arrizubieta et al., 2016) und 1∙1013 - 3∙1013 OBs pro Hektar bei GVs (Grzywacz et al., 2004; Lacey und Shapiro-Ilan, 2008; Lacey et al., 2008; Nakai, 2009; Moore et al., 2015) für eine effiziente Schädlingskontrolle eingesetzt werden müssen.

2.2.4.2 In vitro Produktion Die Gründe dafür, dass die in vitro Produktion von Baculoviren trotz des technischen Fortschrittes noch nicht der Goldstandard ist, sind vielfältig. Obwohl seit über 30 Jahren auf diesem Gebiet geforscht wird und die Produktion rekombinanter Proteine mithilfe von Baculovirus-infizierten Insektenzellen bereits im großen Maßstab durchgeführt wird (siehe Kapitel 2.3.3), fehlen solche Entwicklungen im Bereich der Baculovirus-Produktion. Als Ursache hierfür wird häufig der Mangel an geeigneten Bioreaktoren für die large-scale Produktion genannt, die nach Black et al. mindestens 10 - 20.000 Liter fassen sollten (Black et al., 1997). Der erhöhte Sauerstoffbedarf infizierter Insektenzellen kann zwar durch die Verwendung von Rührkesselreaktoren oder Blasensäulen gedeckt werden, jedoch verursachen diese Reaktortypen sehr hohe Scherkräfte, sodass die aufgrund ihrer Größe und den Folgen der Infektion empfindlichen Insektenzellen geschädigt würden (Claus et al., 2012). Ein von Buchholz und Huebner patentiertes Verfahren zur Produktion von Baculoviren in verkapselten Insektenzellkulturen löst dieses Problem, da die Zellen in den für Nährstoffe und Stoffwechselprodukte durchlässigen Mikro-Hohlkapseln vor Scherkräften geschützt sind. Die Kapseln können in Rührkesselreaktoren kultiviert werden und ermöglichen so ein einfaches scale-up sowie die Anpassung an die aktuelle Nachfrage auf dem Markt (Buchholz und Huebner, 2000). Dennoch wurde dieses Verfahren bisher nur von einem Unternehmen zur kommerziellen CpGV-Produktion eingesetzt, was sich aber aufgrund des wachsenden Interesses großer internationaler Konzerne an Biopestiziden rasch ändern könnte (Glare et al., 2012). Diese Entwicklung könnte auch den nötigen Schub geben, um die Entwicklung neuer Zelllinien und kostengünstiger Medien voranzutreiben. Wie auch in der Natur vermehren sich Baculoviren in einigen Wirten besser als in anderen, weshalb für jedes Virus eine geeignete Zelllinie etabliert

18 2.2 Einsatz von Baculoviren als Biopestizid werden muss, an die gewisse Anforderungen gestellt werden. Um eine ausreichende Wirtschaftlichkeit zu erreichen, sollten die Verdopplungszeiten unter 24 Stunden liegen; die Zellen sollten außerdem als Suspensionskultur und in serumfreiem Medium kultivierbar sein. Obwohl bereits viele Zelllinien entwickelt worden sind, existieren nur wenige zuverlässige, gut charakterisierte Zelllinien für die Replikation von beispielsweise AcMNPV, SpfrMNPV, sowie HearSNPV (siehe Tabelle 2.2). Außerdem fehlen entsprechende Zelllinien für weitere kommerziell interessante Baculoviren (Elanchezhyan, 2009; Reid et al., 2014).

Tabelle 2.2: Etablierte Insektenzelllinien zur in vitro Baculovirus-Produktion

Zelllinie Ursprung Baculovirus Quelle HzAM1 Helicoverpa zea HearNPV (Pedrini et al., 2011) Sf9 Spodoptera frugiperda SpfrMNPV (Almeida et al., 2010) Sf21 Spodoptera frugiperda AcMNPV (Mena und Kamen, 2011) High Five™ Trichoplusia ni AcMNPV (Mena und Kamen, 2011) Bei der Entwicklung neuer Nährmedien kommt es vor allem darauf an, dass sie günstig (1,00 - 2,50 US$∙L-1), chemisch definiert und frei von tierischen Produkten wie fötalem Kälberserum sind, da diese in ihrer Zusammensetzung zwischen verschiedenen Chargen schwanken und aufgrund ihres hohen Preises bis zu 90 % der Gesamtkosten herkömmlicher Medien ausmachen (Black et al., 1997).

Erst wenn sowohl geeignete Zelllinien als auch Medien zur Verfügung stehen, werden die Potentiale der in vitro Produktion von Baculoviren voll ausgeschöpft werden können. Durch die Verwendung axenischer Zelllinien kann auf die aufwendige Zucht von mit Mikroorganismen kontaminierten Larven verzichtet und ein in seiner Zusammensetzung gleichbleibendes Produkt erzeugt werden. Durch die Möglichkeit der Kryokonservierung verschiedener Zelllinien und Virus-Stocks können im batch-Verfahren flexibel verschiedene Baculoviren produziert und die Mengen an die Bedürfnisse des Marktes angepasst werden (Reid et al., 2014). Es ist bekannt, dass bei der kontinuierlichen Produktion von Baculoviren sowohl eine Verringerung der Ausbeuten an OBs als auch Mutanten mit reduzierter Virulenz auftreten, was als Passageneffekt bezeichnet wird (Krell, 1996). Der Passageneffekt ist darauf zurückzuführen, dass die Viren zur Vermehrung in der Zellkultur keine intakten ODVs und OBs benötigen und sich somit Mutationen im 25k fp locus häufen können, der für ein Protein kodiert, das für die Ausbildung der ODVs und OBs essentiell ist (Lua et al., 2002; Eberle et al., 2012). Dies wird bei der Verwendung von batch-Verfahren umgangen, indem für jede Charge frischer Virus-Stock eingesetzt wird und die OBs zum richtigen Zeitpunkt geerntet werden. Auf diese Weise konnten im kleinen Maßstab bereits zuverlässig funktionsfähige HearSNPV- OBs mit einer Konzentration von 1,2∙108 OBs∙mL-1 produziert werden (Lua und Reid,

19 2 Stand des Wissens

2003). Für andere Viren konnten Ausbeuten von 1∙106 - 3∙108 OBs∙mL-1 in Suspensionskulturen erreicht werden (Claus et al., 2012). Mit dem bereits erwähnten Verfahren nach Buchholz und Hübner konnten im Vergleich dazu AcMNPV-Ausbeuten von 1,76∙1010 OBs∙mL-1 in den Kapseln erzielt werden, was zeigt, dass die Produktivität der in vitro Produktion von Baculoviren der Produktion in vivo deutlich überlegen sein kann (Son et al., 2006).

Ein weiterer Grund für die Etablierung von in vitro Verfahren ist, dass dies die einzige Möglichkeit zur Herstellung rekombinanter Baculoviren ist (Inceoglu et al., 2006). Vor allem Baculoviren die genetisch so verändert wurden, dass sie zu einem schnelleren Tod des Wirtes führen, erreichen bei der Produktion in vivo weniger als 10 % der Ausbeute ihrer Wildtyp-Viren (Grzywacz und Moore, 2017). Rekombinante Viren, deren Polyhedrin- Gen (polh) ersetzt wurde, sind alleine nicht mehr in der Lage OBs zu bilden, weshalb in diesen Fällen immer eine Co-Infektion mit einem polh-enthaltenden Wildtyp-Virus durchgeführt werden muss, was in einer Zellkultur unter kontrollierten Bedingungen einfacher zu bewerkstelligen ist.

2.3 Einsatz von Baculoviren zur Proteinproduktion

Der erste Aufsatz über die Verwendung eines rekombinanten Baculovirus (AcMNPV) zur Proteinproduktion wurde im Jahre 1983 von der Arbeitsgruppe um Max Summers der Texas A&M University veröffentlicht und beschreibt die Expression des humanen

β‑Interferons unter Nutzung des Polyhedrin-Promotors (Ppolh) (Smith et al., 1983b). Dies war nur möglich, da sie zuvor zeigen konnten, dass polh für die Replikation der Viren in Zellkultur nicht essentiell ist und daher durch ein heterologes Gen ersetzt werden kann (Smith et al., 1983a). Wie bereits in Kapitel 2.1.3 beschrieben, wird Polyhedrin in der sehr späten Phase der Infektion überexprimiert und ist Hauptbestandteil der Proteinmatrix der OBs, die für die horizontale Übertragung des Virus auf neue Wirte verantwortlich sind. Die Verbreitung des Virus von Zelle zu Zelle erfolgt jedoch ausschließlich durch BVs, weshalb zur Vermehrung der Viren in Zellkultur keine OBs benötigt werden. Nur wenige Monate nach der Veröffentlichung von Smith et al. publizierte eine Arbeitsgruppe um Lois Miller aus Idaho eine weitere Arbeit, in der sie erfolgreich die E. coli β-Galaktosidase mit Hilfe eines rekombinanten Baculovirus in einer Insektenzellkultur exprimierten (Pennock et al., 1984). Diese beiden Arbeiten legten den Grundstein für das Baculovirus- Expressionsvektor-System (BEVS), das auch Baculovirus-Insektenzell-Expressionssystem genannt wird. Die Herstellung rekombinanter Viren wurde Anfang der 1990er Jahre durch die Entwicklung von bacterial artificial chromosomes (BAC) stark vereinfacht. BACs tragen das gesamte AcMNPV Genom, können in E. coli vermehrt und mit Hilfe der bereits für bakterielle Systeme entwickelten molekularbiologischen Methoden gentechnisch

20 2.3 Einsatz von Baculoviren zur Proteinproduktion verändert werden (Luckow et al., 1993). Seither wurde das BEVS immer weiter entwickelt und wird heutzutage standardmäßig sowohl zur Produktion rekombinanter Proteine für wissenschaftliche Zwecke als auch zur industriellen Herstellung von Impfstoffen und viralen Vektoren für die Gentherapie eingesetzt (van Oers et al., 2015).

2.3.1 Herstellung gentechnisch veränderter Baculoviren

Die Herstellung rekombinanter Baculoviren erfolgt heutzutage fast ausschließlich über Bacmide, die zusammen mit den passenden Transfervektoren von verschiedenen Herstellern angeboten werden und für unterschiedliche Zwecke konzipiert sind. So gibt es Systeme für die Expression von ein oder zwei heterologen Proteinen, wie z.B. das Bac-to- Bac® Baculovirus Expressionssystem (Anderson et al., 1995), und Systeme, die mehrere Expressionskassetten erlauben und somit die Co-Expression mehrerer Proteine ermöglichen, wie z.B. MultiBac™ (Trowitzsch et al., 2010; Sari et al., 2016). Der Ablauf der Virusherstellung ist dabei prinzipiell immer ähnlich und erfolgt in drei Schritten, hier am Beispiel des Bac-to-Bac® Systems dargestellt. Zuerst wird das zu exprimierende Gen in einen Transfervektor zwischen einen Baculovirus-Promotor und einen Transkriptionsterminator kloniert. Flankiert wird dieser Bereich von Erkennungssequenzen, die eine gerichtete Transposition des DNA-Fragmentes in das Bacmid ermöglichen. Der Transfervektor enthält außerdem einen E. coli origin of replication (ori), wodurch er in E. coli vermehrt werden kann, sowie das Gen eines Selektionsmarkers und gegebenenfalls Protein-Tags, die eine spätere Aufreinigung des Proteins vereinfachen (Invitrogen by Life Technologies, 2002). Bei den Baculovirus- Promotoren handelt es sich meist um die beiden sehr späten Promotoren der Gene polh und p10, die stark überexprimiert werden (Possee und King, 2016). Der zweite Schritt, die Transposition des DNA-Fragments aus dem Transfervektor in das Bacmid, erfolgt in E. coli mit Hilfe eines Helferplasmides, das für die hierfür benötigten Enzyme kodiert. In den E. coli-Zellen befindet sich außerdem das Bacmid, das sich in drei Merkmalen von der viralen genomischen DNA unterscheidet. Es besitzt zur selektiven Replikation in E. coli neben einem einzelnen E. coli ori auch ein Selektionsmarker-Gen sowie die für die Transposition benötigten Erkennungssequenzen, eingebettet in das LacZα-Gen. Durch die Integration des DNA-Fragments aus dem Transfervektor wird das Gen zerstört, wodurch positive Klone einfach mittels Blau/Weiß-Screening identifiziert werden können. Die rekombinanten Bacmide werden isoliert und zur Transfektion von Insektenzellkulturen verwendet, in denen sich das rekombinante Virus repliziert und anschließend aus dem Überstand gewonnen werden kann (Invitrogen by Life Technologies, 2002). Der Vorteil dieses Systems besteht in den genetisch gut definierten hergestellten Viren, die keine aufwendige Trennung über plaque assays zur Trennung von Wildtyp-Viren benötigen und der dadurch verhältnismäßig leichten Handhabbarkeit. Die Nutzung dieses Systems für

21 2 Stand des Wissens die Herstellung von Proteinen zur Anwendung im Menschen könnte aber aufgrund der auf dem rekombinanten Virus vorhandenen bakteriellen DNA-Sequenzen und Antibiotika- Selektionsmarker auf vorklinische Untersuchungen beschränkt sein (van Oers et al., 2015). Deshalb wurden auch Systeme wie flashBAC™ entwickelt, bei denen eine homologe Rekombination des gewünschten DNA-Fragmentes aus dem Transfervektor in das Bacmid in Insektenzellen durchgeführt wird, wodurch im fertigen Virus keine bakteriellen Sequenzen enthalten sind (Hitchman et al., 2009). Es existieren auch Systeme, in denen der das gene of interest (goi) tragende Transfervektor zusammen mit einem linearisierten Baculovirus-Genom in Insektenzellen transfiziert wird. Dem linearisierten Baculovirus-Genom fehlt ein Teil eines essentielles Gens, das nur durch homologe Rekombination mit dem Transfervektor komplementiert wird. Dadurch können sich selbstligierte Viren, denen das Insert fehlt, nicht replizieren, wodurch die Ausbeute an rekombinantem Virus fast 100 % beträgt (Drugmand et al., 2012).

2.3.2 Insektenzelllinien

Bisher wurden alleine aus Lepidoptera mehr als 320 Zelllinien aus über 65 verschiedenen Spezies entwickelt, von denen bei 60 % bekannt ist, dass sie in der Lage sind ein oder mehrere Baculoviren zu replizieren (Lynn und Harrison, 2016). Für die Produktion rekombinanter Proteine haben sich drei, aus den Ovarien von Schmetterlingslarven isolierte, Zelllinien durchgesetzt, die heutzutage am häufigsten im BEVS zum Einsatz kommen. Zwei davon wurden aus Spodoptera frugiperda isoliert und als IPLB-Sf21-AE, kurz Sf21, und Sf9 bezeichnet, wobei Sf9 ein Subklon der Sf21-Zelllinie ist. Die dritte Zelllinie BTI-Tn-5B1-4 wurde aus Trichoplusia ni-Zellen entwickelt und ist unter dem Handelsnamen High Five™ bekannt (Contreras-Gómez et al., 2014). Insektenzellen besitzen typischerweise einen Durchmesser von 10 µm - 20 µm und weisen eine runde oder Fibroblasten-ähnliche Morphologie auf. Ihre Wachstumsrate besitzt bei 27 °C ein Maximum mit Verdopplungszeiten zwischen 24 und 30 Stunden. Der Vorteil der genannten Zelllinien besteht hauptsächlich darin, dass sie sowohl adhärent, als auch in Suspension kultiviert und an serumfreie Medien adaptiert werden können (van Oers und Lynn, 2010). Die kommerziell erhältlichen serumfreien Medien, wie Ex-Cell® 420, Insect- XPRESS™ und Sf-900™, beinhalten meist Glucose als Kohlenstoffquelle, Aminosäuren, organische Säuren, Vitamine, Fette und anorganische Salze bei einer Osmolalität um 350 mOsm∙kg-1 (Chan und Reid, 2016). Insektenzellen wachsen am besten im leicht sauren Milieu bei pH-Werten um 6,3. Durch den Einsatz von Phosphatpuffer zur pH- Kontrolle kann auf eine kontrollierte Kohlenstoffdioxid-Umgebung verzichtet werden (Vlak et al., 2002). Während High Five™-Zellen höhere Proteinausbeuten pro Zelle liefern, erreichen die Sf21- und Sf9-Zelllinien höhere Zelldichten von bis zu 8∙106 Zellen∙mL-1 und somit eine höhere volumetrische Produktivität (Beas-Catena et al., 2014). Obwohl

22 2.3 Einsatz von Baculoviren zur Proteinproduktion

Insektenzellen in der Lage sind eukaryotische posttranslationale Modifikationen (N- und O-Glykosylierung, Phosphorylierung, Fettsäureacylierung, Sialylierung, α-Amidierung, N- terminale Acetylierung, Carboxymethylierung, Isoprenylierung) durchzuführen, können diese zwischen verschiedenen Spezies variieren und sind zudem nicht immer identisch mit denen höherer Eukaryoten (Jarvis, 2009; Drugmand et al., 2012). Ein Beispiel hierfür ist die Fähigkeit der genannten Zelllinien zur N-Glykosylierung neu synthetisierter Proteine, die aber weniger komplexe Seitenketten ausbilden als Säugetierzellen, wie in Abbildung 2.5 dargestellt ist.

Abbildung 2.5: Unterschiede zwischen den N-Glykanstrukturen in Insekten- und Säugetierzellen (a,b) Die beiden Hauptprodukte der N-Glykan-Prozessierung in Insektenzellen, klassifiziert als Paucimannose Strukturen, (c) Die komplexeste mittels MS in Insekten nachgewiesene Glykanstruktur eines Bienengift-Glykoproteins, (d-f) Verschiedene Beispiele komplexer Säugetier- N-Glykanstrukturen modifiziert nach van Oers et al. (2015). Da die Glykosylierung gerade bei therapeutischen Proteinen einen großen Einfluss auf die biologische Aktivität haben kann, wurden Zelllinien entwickelt, die eine Kombination humaner Enzyme zur N-Glykan-Prozessierung exprimieren, wodurch eine Humanisierung der Glykanstrukturen erreicht werden konnte (Harrison und Jarvis, 2006). Eine die Glycosyltransferasen, Galactosyltransferase und Sialyltransferase exprimierende Zelllinie ist unter dem Namen Mimic™ Sf9 Cells kommerziell erhältlich (Granados et al., 2007).

2.3.3 Proteinproduktion

Die Scopus-Suche nach „baculovirus expression“ liefert mehr als 9500 Treffer, was bekräftigt, dass bereits mehrere Tausend heterologe Proteine mit Hilfe des BEVS hergestellt worden sind. Das System wird aufgrund seiner Fähigkeit zur korrekten Faltung von Proteinen in der Forschung u. a. zur Produktion von Proteinen und Proteinkomplexen zur Strukturanalyse eingesetzt. So konnte beispielsweise die Struktur des β1-adrenergen G Protein-gekoppelten Rezeptors aufgeklärt werden (Warne et al., 2008). Da für

23 2 Stand des Wissens

Forschungszwecke meist nur kleine Mengen des zu untersuchenden Proteins benötigt werden, wird hier häufig im small-scale in Erlenmeyerkolben mit Ausbeuten von bis zu 1 g∙L-1 gearbeitet, wobei die Ausbeute je nach Protein um das 100-Fache schwanken kann (Yang, 2016). Sollen größere Mengen Protein produziert werden, muss ein up-scaling des Prozesses auf Bioreaktoren erfolgen.

Obwohl auch von der Verwendung von wave Bioreaktoren und Blasensäulen berichtet wird (Kadwell und Overton, 2016), werden klassische und single-use Rührkesselreaktoren mit einem Volumen von bis zu 2.500 L bevorzugt (Ikonomou et al., 2003; Buckland et al., 2014). Dies wurde erst durch den Einsatz von Medienzusätzen wie Pluronic® F-68 möglich, das den hydrodynamischen Stress auf die empfindlichen Zellen verringert und gleichzeitig als Anti-Schaum-Mittel fungiert (Thompson et al., 2016; Homepage ThermoFisher Scientific). Beim up-scaling müssen alle kritischen Faktoren, die die Produktivität und Produktqualität beeinflussen, berücksichtigt und gegebenenfalls optimiert werden. Zu diesen Faktoren zählen die Temperatur, die Konzentrationen an gelöstem Sauerstoff und Kohlenstoffdioxid im Medium, die Rührerdrehzahl, die Zelldichte (time of infection, TOI) und das Verhältnis von infektiösen Viruspartikeln zu Zellen zum Zeitpunkt der Infektion (multiplicity of infection, MOI), der Erntezeitpunkt (time of harvest, TOH) sowie die Prozessführung als batch, fed-batch oder kontinuierlicher Prozess (Contreras-Gómez et al., 2014). Die Temperatur beeinflusst das Wachstum und den Stoffwechsel der Zellen und somit auch die Proteinausbeute und -qualität (Reuveny et al., 1993).

Zu den Qualitätsmerkmalen gehören nicht nur die Vollständigkeit und korrekte Faltung des Proteins sondern auch dessen Glykosylierung, die neben der Temperatur auch von der Konzentration an gelöstem Sauerstoff, der Rührerdrehzahl und der Reaktorgeometrie abhängig ist (Donaldson et al., 1999; Joshi et al., 2001; Zhang et al., 2002; Saarinen und Murhammer, 2003; Joosten und Shuler, 2003). Die Parameter MOI, TOI und TOH sind intrinsisch miteinander verbunden und müssen für jede Anwendung neu optimiert werden (Carinhas et al., 2009).

Im Produktionsmaßstab werden oft niedrige MOI bevorzugt, da kleine Inokulum- Volumina zum einen die Produktionskosten senken und zum anderen so weniger verbrauchtes Medium in den Produktionsreaktor übertragen wird (Contreras-Gómez et al., 2014). Wird eine niedrige MOI << 1 verwendet, wird initial nur ein Bruchteil der Zellen infiziert, die daraufhin aufhören sich zu teilen und stattdessen neue Viren produzieren. Die nicht infizierten Zellen wachsen weiter bis sie von den neu gebildeten Viren infiziert werden (Sekundärinfektion), was zu einer asynchronen Infektion und uneinheitlichen Proteinproduktion der Kultur führt. Bei hohen MOI > 5 erfolgt die Infektion der Zellen simultan und es ergibt sich eine synchrone Infektion ohne weiteres Wachstum der Kultur

24 2.3 Einsatz von Baculoviren zur Proteinproduktion

(Aucoin et al., 2010; Palomares et al., 2012). Dafür wird aber ein Virusstock mit sehr hohem Titer als Inokulum benötigt, der nur durch mehrfaches Passagieren des Virus hergestellt werden kann und dadurch die Produktionskosten steigert (Contreras-Gómez et al., 2014). Die serielle Passage des Virus erhöht zudem die Wahrscheinlichkeit der Akkumulation von Deletionsmutanten, was die Proteinproduktion und damit den Gesamtprozess negativ beeinflussen kann (Pijlman et al., 2003a). Die höchsten bekannten Proteinkonzentrationen industrieller Prozesse betragen 300 mg∙L-1 und 80 mg∙L-1 für die Herstellung von humaner Collagenase IV in High Five® Zellen bzw. humanem Proapolipoprotein A-I in Sf21-Insektenzellen (Schmidt, 2004).

2.3.4 Deletionsmutanten

Das Auftreten von Virusmutanten, die sowohl den Infektionsprozess, die Ausbeute an infektiösen Viruspartikeln als auch die Produktion rekombinanter Proteine beeinträchtigen können, ist ein wohl-bekanntes Phänomen, das bereits 1986 von Tramper und Vlak beschrieben wurde (Tramper und Vlak, 1986). Ein Typ dieser Mutanten wird als defective interfering particles (DIPs) bezeichnet. DIPs sind Deletionsmutanten, deren genetische Variationen durch homologe und heterologe Rekombinationen, Transpositionen, sowie durch Mutationen, beispielsweise durch Fehler bei der DNA- Replikation, entstehen (Bangham und Kirkwood, 1993; Krell, 1996; Hajós et al., 2000). Sie sind zwar infektiös, können sich in der Zelle aber nicht selbständig replizieren, da ihnen die hierfür nötigen Gene für beispielsweise Expressionssfaktoren oder Polymerasen fehlen (Pijlman et al., 2001). DIPs benötigen deshalb ein intaktes Virus als Helfer, dessen Genprodukte sie für ihre eigene Replikation ausnutzen (Roux et al., 1991). Dieser Vorgang wird auch als Interferenz bezeichnet.

Durch die Deletionen sind DIPs kleiner als intakte Viruspartikel und weisen häufig eine höhere Dichte an oris auf (Pijlman et al., 2003a; Pijlman et al., 2003b). Dadurch vermehren sie sich schneller als die parentalen Viren, wodurch es bei serieller Passage oder in einem kontinuierlichen Prozess zu einer Anhäufung von DIPs kommen kann (Kool et al., 1991). Dies tritt besonders bei hohen MOI auf, da hier die Wahrscheinlichkeit größer ist, dass eine Zelle sowohl von einem intakten Virus als auch von einem DIP infiziert wird. Der Anteil infizierter Zellen folgt der Poisson-Verteilung und die Wahrscheinlichkeit, dass eine Zelle bei einer MOI von 1 von mehr als einem Virus infiziert wird, beträgt bereits ca. 60 % (Palomares et al., 2005). Aus diesem Grund können Virusstocks höherer Passagen niedrigere infektiöse Titer und anteilig mehr DIPs enthalten, was auch als Passageneffekt bezeichnet wird (Krell, 1996). Dadurch entsteht eine heterogene Population an Virus-Phänotypen mit unvorhersehbaren Fluktuationen in der relativen Häufigkeit von DIPs und replikationsfähigen Viren (Zwart et al., 2013).

25 2 Stand des Wissens

Ein weiterer Mutationstyp sind rekombinante Viren, die das heterologe Gen verloren haben, sonst aber alle zur Replikation benötigten Gene besitzen. Sie verursachen ebenfalls einen starken Abfall der Produktion des rekombinanten Proteins nach mehreren Passagen und sind zusammen mit den DIPs der Hauptgrund dafür, dass BEVS Prozesse derzeit nur im batch und nicht kontinuierlich betrieben werden. Um dies zu ändern, wird versucht die Stabilität der rekombinanten Viren durch weitere gentechnische Veränderungen des Genoms zu erhöhen (Pijlman et al., 2002; Pijlman et al., 2004; Giri et al., 2012).

2.3.5 Vergleich mit anderen Expressionssystemen

Der Erfolg des BEVS wird darin deutlich, dass es in knapp 50 % der wissenschaftlichen Veröffentlichungen, welche sich mit der Expression höherer eukaryotischer Proteine beschäftigen, verwendet wird (Drugmand et al., 2012). Expressionssysteme lassen sich nach dem Produktionsorganismus prinzipiell in pro- und eukaryotische Systeme unterteilen. Die bekanntesten Vertreter prokaryotischer Expressionssysteme sind die Bakterienstämme E. coli und Bacillus subtilis, die durch schnelles Wachstum, kostengünstige Medien und hohe Proteinexpression überzeugen. Ihr Nachteil besteht in den fehlenden posttranslationalen Modifikationen, der zum Teil inkorrekten Faltung der Proteine und Bildung von unlöslichen inclusion bodies.

Wenn es darauf ankommt rekombinante Glykoproteine herzustellen, die möglichst identisch zum natürlich vorkommenden Protein sein sollen, wird deshalb bevorzugt auf eukaryotische Expressionssysteme zurückgegriffen, die in der Lage sind posttranslationale Modifikationen durchzuführen. Zu den Bekanntesten zählen Hefen (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris), filamentöse Pilze (Aspergillus niger, Trichoderma reesei), Insektenzellen (siehe Kapitel 2.3.2), Säugetierzelllinien (human embryotic kidney (HEK 293), chinese hamster ovary (CHO)) sowie transgene Pflanzen und Tiere (Gomes et al., 2016). Bei der Expression in Insekten- und Säugetierzellen muss unterschieden werden, ob die Zellen (transient oder stabil) transfiziert oder mit einem viralen Vektor infiziert wurden, da durch den Einsatz von Viren meist höhere Produktausbeuten erreicht werden (van Oers et al., 2015). Ein Vergleich weiterer Eigenschaften verschiedener Zellkultur-basierter Expressionssysteme ist in Tabelle 2.3 zusammengefasst.

26 2.4 Promotoren

Tabelle 2.3: Vergleich verschiedener eukaryotischer Expressionssysteme Skala: niedrig (+) bis hoch (+++) 1) wie stark gleichen die posttranslationalen Modifikationen denen aus Säugetierzellen. 2) Lentiviren sind Humanpathogene, weshalb bei ihrer Anwendung ein dauerhaftes Risiko einer Infektion besteht. Modifiziert nach van Oers et al. (2015) und Gomes et al. (2016).

Hefen Insektenzellen Säugetierzellen Säugetierzellen Eigenschaft (P. pastoris) (BEVS) (transfiziert) (Lentivirus) Posttranslationale + + + + + + + + + Modifikationen1) Biologische Aktivität + + + + + + + + + + Immunogenität + + + + + + + + + + + Produktivität + + + + + + + + Sicherheit + + + + + + -2) Kosten + + + + + + + + + Ein weiteres potentielles Expressionssystem stellen Mikroalgen, wie Chlamydomonas reinhardtii, dar, die aktuell aber aufgrund der sehr geringen erzielten Produktivität noch nicht zum industriellen Einsatz kommen (Richter, 2017).

2.4 Promotoren

Promotoren sind DNA-Sequenzen, die durch Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren und DNA-Polymerasen die Expression der downstream liegenden Gene regulieren. Es gibt Promotoren die immer aktiv sind und solche, die durch äußere Einflüsse aktiviert bzw. gehemmt werden können. Die erste Gruppe nennt man konstitutive Promotoren, zu denen die bereits genannten viralen Promotoren der Gene polh und p10 gehören. Diese beiden Promotoren sind sehr stark, ihr Expressionsmaximum liegt aber in der sehr späten Phase der Infektion, was sich negativ auf die Produktqualität auswirken kann. In der sehr späten Phase werden posttranslationale Modifikationen, wie die Glykosylierung, nicht mehr korrekt durchgeführt und die Sekretion rekombinanter Proteine nimmt ab (Harrison und Jarvis, 2006; van Oers, 2011; Li et al., 2012).

Deshalb wurden auch einige Promotoren der frühen und späten Phasen auf ihre Fähigkeit, rekombinante Proteine in ausreichender Menge zu exprimieren, hin untersucht. Hierzu zählen die Promotoren der Gene ie-1, ie-2, vcath, vp39, p6.9 und gp64, der basic-Promotor sowie synthetische frühe Promotoren und Tandempromotoren (George et al., 2015; Bleckmann et al., 2015; Zitzmann et al., 2017). Da diese Promotoren schwächer sind als der Ppolh und Pp10 wurde außerdem versucht ihre Aktivität durch das Anhängen von homologous regions (hrs) Sequenzen zu steigern, wodurch größere Mengen an korrekt gefaltetem und biologisch aktivem Protein hergestellt werden konnten (Ishiyama und Ikeda, 2010). Neben Baculovirus-eigenen Promotoren wurden 27 2 Stand des Wissens auch frühe Promotoren anderer Insektenviren, wie beispielsweise aus dem Cotesia plutellae Bracovirus, untersucht, die Promotoraktivitäten von bis zu 35 % des Ppolh erreichten (Choi et al., 2008).

Alle konstitutiven Promotoren haben gemein, dass die Zellen das von ihnen regulierte goi, aufgrund der bei niedrigen MOI asynchron verlaufenden Virusinfektion, zu unterschiedlichen Zeitpunkten exprimieren (siehe Kapitel 2.3.3). Das führt dazu, dass ein Teil der produzierten Proteine deutlich länger der Degradation durch Proteasen ausgesetzt ist, wodurch eine heterogene Mischung entsteht (Martensen und Justesen, 2001; Brondyk, 2009). Eine Alternative zu den konstitutiven Promotoren stellen induzierbare Promotoren dar, die durch Zugabe oder Entfernen regulatorischer Substanzen gezielt gesteuert werden können, wodurch die Proteinproduktion synchronisiert und dadurch die Produktqualität gesteigert werden könnte.

Bisher wurden noch keine induzierbaren Promotoren aus Baculoviren veröffentlicht, sondern nur Systeme aus anderen Arten, wie z.B. die Hitzeschock-Promotoren aus Drosophila und der schwarzen Tigergarnele (Penaeus monodon) (Crouch und Passarelli, 2005; Chuang et al., 2007). Die Temperatur ist aber ein Parameter, der beim Einsatz rekombinanter Baculoviren auf dem Feld nicht gesteuert werden kann, weshalb im Folgenden zwei weitere potentielle induzierbare Systeme vorgestellt werden.

2.4.1 Metallothionein-Promotor

Metallothioneine sind Proteine, die durch ihren hohen Cystein-Gehalt Schwermetalle und freie Radikale binden können und somit zur Regulierung der intrazellulären Metallionen- Konzentration beitragen. Die Transkription der Metallothionein-Gene wird als Reaktion auf verschiedene Stimuli, wie oxidativer Stress oder hohe Metallionen-Konzentrationen, hochreguliert (Bonneton et al., 1996). Ein Kennzeichen der eukaryotischen Metallothionein-Promotoren sind kurze DNA-Motive, die metal response elements (MREs) genannt werden und die Consensus-Sequenz TGCRCNC (R = A, G; N = G, A, T, C) enthalten. Zinkfinger-Proteine, die in Abhängigkeit der Metallionen-Konzentration an die MREs binden und dadurch den Promotor aktivieren, werden als metal-responsive transcription factor-1 (MTF-1) bezeichnet (Günther et al., 2012). MTF-1 ist evolutionär von den Insekten bis zu den Säugetieren konserviert und wurde bisher in Menschen, Mäusen, Capybaras, Fischen und Drosophila charakterisiert (Séguin und Prévost, 1988; Maur et al., 1999; Dalton et al., 2000; Zhang et al., 2001; Lindert et al., 2008). Orthologe des Gens mtf-1 wurden auch in anderen Wirbeltieren und Insekten gefunden (Günther et al., 2012).

Der induzierbare Metallothionein-Promotor (Pmtn) aus der Taufliege Drosophila melanogaster der Ordnung Diptera wird standardmäßig zur Expression rekombinanter

28 2.4 Promotoren

Proteine in stabil transfizierten D. melanogaster Schneider line 2 Zellen verwendet (Angelichio et al., 1991; Yamaji, 2014). Seine Aktivität konnte aber auch schon in Säugetier- und Pflanzenzellen sowie in Mosquito- und Sf9-Insektenzellen gezeigt werden

(Otto et al., 1987; Kovach et al., 1992; McKenzie et al., 1998; Bryson et al., 2010). Der Pmtn zeichnet sich durch seine geringe Basalaktivität aus und wird meist durch 400 ‑ 500 µM

CuSO4 oder 5 ‑ 10 µM CdCl2 aktiviert (Bunch et al., 1988; Johansen et al., 1989; Johanson et al., 1995; Bernard et al., 1995; Hegedus et al., 1998; Matsushima et al., 2004; Lee et al., 2011; Yang et al., 2012; Backovic und Krey, 2016).

2.4.2 Tetracyclin-reguliertes System

Das 1992 von Gossen und Bujardt erstmals beschriebene, und seither stetig weiterentwickelte, Tetracyclin-regulierte System ist mittlerweile in zwei verschiedenen Varianten erhältlich. Beim Tet-On System wird die Expression des Zielgens durch Zugabe von Tetracyclin aktiviert, wohingegen beim Tet-Off System die Transkription des Zielgens in Anwesenheit von Tetracyclin bzw. Doxycyclin, einem für Zellkulturen weniger giftigen Tetracyclinanalogon, gehemmt wird (Rossi und Blau, 1998).

Das System besteht aus dem Doxycyclin-bindenden Transaktivator und dem induzierbaren Promotor PTight, der die Transkription des Zielgens reguliert. Der Promotor ist aus einem modifizierten tetracycline-responsive element (TRE), das sieben direkte repeats der tet-Operatorsequenz (tetO) enthält, und mit einem minimal CMV-Promotor

(PminCMV) verbunden ist, aufgebaut. Der Tetracyclin-Transaktivator (tTA) bindet in

Abwesenheit von Doxycyclin an das TRE und aktiviert dadurch den Promotor PTight. tTA ist ein chimäres Protein, bestehend aus dem bakteriellen Tetracyclin-Repressor-Protein (tetR), das durch das Anhängen der Transkriptionsaktivator-Domäne des viralen Proteins VP16 aus dem Herpes Simplex Virus an die Verwendung in eukaryotischen Zellen adaptiert wurde.

Die Expression des Tetracyclin-Transaktivator-Gens (tta) wird von einem konstitutiven Promotor reguliert, sodass immer ausreichend viel tTA in der Zelle vorliegt, um eine maximale Aktivierung des PTight zu erreichen (Gossen und Bujardt, 1992; Sprengel und Hasan, 2007). In Anwesenheit von Doxycyclin bindet dieses an ein allosterisches Zentrum am Transaktivator und führt dadurch zu einer Transformationsänderung, die die 9 Bindungsaffinität des Transaktivators für die TREmod um den Faktor 10 herabsetzt. tTA kann deshalb nicht mehr an die DNA binden, löst sich von ihr und die Transkription des Zielgens wird gestoppt (Orth et al., 2000).

Da in der Sequenz von PTight Bindestellen für eukaryotische Transkriptionsfaktoren fehlen, besitzt der Promotor in Abwesenheit seines inducers laut Hersteller Clontech kaum

29 2 Stand des Wissens

Basalaktivität (Clontech Laboratories, 2012b). Der genaue Ablauf der Regulation bei Verwendung des Tet-Off Systems ist in Abbildung 2.6 dargestellt.

Abbildung 2.6: Mechanismus der Genregulation mittels Tet-Off System nach Clontech Laboratories (2012a) Das Tet-Off System hat bisher in vielen eukaryotischen Expressionssystemen Anwendung gefunden, wie z.B. in verschiedenen humanen Zelllinien, Neuronen, Candida, Aspergillus, transgenen Mäusen und Malariamücken sowie Sf9-Zellen, wobei sich gezeigt hat, dass die benötigte Konzentration an Doxycyclin stark System-abhängig ist (Wu et al., 2000; Mizuguchi und Hayakawa, 2002; Lycett et al., 2004; Anders et al., 2012; Wanka et al., 2016; Sohn et al., 2017; Bijlani et al., 2017).

2.5 Markerprotein enhanced green fluorescent proteine

In dieser Arbeit wurde mit dem enhanced green fluorescent proteine (eGFP) als Markerprotein gearbeitet. Dieses Protein ist eine Variante des GFP aus der Quallenart Aequorea victoria. Die grüne Fluoreszenz der Qualle wurde 1955 von Davenport und Nicol zum ersten Mal beschrieben, woraufhin Shimomura et al. 1962 GFP als Nebenprodukt des sogenannten Aequorins aus der Qualle isoliert und benannt haben (Davenport und Nicol, 1955; Shimomura und Johnson, 1962; Shimomura, 2005).

Das 27 kDa große GFP besteht aus 238 Aminosäuren, von denen die drei Aminosäuren Serin, Tyrosin und Glycin an den Positionen 65 - 67 die chromophore Gruppen bilden

30 2.5 Markerprotein enhanced green fluorescent proteine

(Cubitt et al., 1995), die sich im Inneren des fassförmigen Moleküls befindet (Ormö et al., 1996), wie in Abbildung 2.7 zu sehen ist. Aufgrund seiner kompakten Struktur ist das Protein sehr beständig gegenüber chemischer Denaturierung (Ward und Bokman, 1982), pH- und Temperaturschwankungen (Ishii et al., 2007) sowie Proteasen (Li et al., 1998) und besitzt in den getesteten Zelllinien eine sehr hohe Stabilität mit Halbwertszeiten um 26 Stunden (Corish und Tyler-Smith, 1999).

Abbildung 2.7: β-Fass-Struktur und ungefähre Dimensionen des GFP aus A. victoria (Day und Davidson, 2009) Schnell wurde GFP zu einem beliebten Reporterprotein zur Untersuchung der Genexpression oder Proteinlokalisation, gelangte aber durch die immer höheren Anforderungen bald an seine Grenzen, bis 1995 von Cormack, Valdivia und Falkow zwei Punktmutationen in das GFP-Gen eingeführt und dadurch die Eigenschaften insbesondere für die Anwendung in Zellen höherer eukaryotischer Systeme verbessert wurden (Cormack et al., 1996). Durch den Austausch von Serin durch Threonin an Position 65 konnte die Formation der chromophoren Gruppe beschleunigt und die Fluoreszenz bei Anregung mit blauem Licht versechsfacht werden (Heim et al., 1995).

Eine zweite Mutation von Phenylalanin zu Leucin an Position 64 nahe der chromophoren Gruppe brachte eine 35-fach stärkere Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm hervor, sowie eine verbesserte Löslichkeit und effizientere Proteinfaltung bei 37 °C. Die stärkere Fluoreszenz ist auf eine Verschiebung des Anregungsmaximums von 395 nm bei GFP zu 490 nm bei eGFP zurückzuführen, wobei das Maximum der Emissionswellenlängen bei ca. 508 nm unverändert blieb (Yang et al., 1996; Cormack et al., 1996).

31 2 Stand des Wissens

Hierdurch ist es möglich eGFP mit der üblicherweise in der Durchflusszytometrie verwendeten Laser/Filter-Kombination für Fluorescein Isothiocyanat (FITC) zu messen. Die Anregungs- und Emissionspektren von GFP und eGFP sind in Abbildung 2.8 gezeigt.

GFP Ex

1,0 GFP Em

) - eGFP Ex 0,8 eGFP Em

0,6

0,4

0,2 Rel. Fluoreszenzintensität ( Fluoreszenzintensität Rel.

0,0 300 350 400 450 500 550 600 Wellenlänge (nm)

Abbildung 2.8: Anregungs- und Emissionspektren von GFP und eGFP nach Tsien (1998) und Patterson et al. (2001)

32

3 Zielsetzung

In dieser Arbeit soll ein neuartiges, induzierbares Baculovirus-Insektenzell- Expressionssystem (BEVS) entwickelt und getestet werden, das sowohl zur Expression rekombinanter (toxischer) Proteine in Zellkultur, als auch zur Schädlingsbekämpfung eingesetzt werden kann. Hierzu sollen die beiden induzierbaren Promotoren

Metallothionein-Promotor (Pmtn) aus Drosophila und PTight, als Teil des Tet-Off Systems, jeweils in das Genom des Baculovirus AcMNPV integriert und anschließend in infizierten Sf21-Insektenzellen charakterisiert werden. Als Reporterprotein für die Genexpression soll, aufgrund der unkomplizierten Nachweisbarkeit, das grün fluoreszierende Protein eGFP dienen. Die Promotoren sollen hinsichtlich ihrer generellen Funktionalität sowie der Regulierbarkeit ihrer Aktivität in Abhängigkeit der Konzentration ihrer jeweiligen 2+ Induktoren Doxycyclin bzw. Kupferionen untersucht werden. Da der Pmtn durch Cu induziert wird, sollen zuerst die beiden Salze CuSO4 und CuCl2 bezüglich ihrer Fähigkeit, den Promotor zu aktivieren, verglichen und anschließend die zur maximalen Promotorinduktion benötigte Kupferionen-Konzentration ermittelt werden. Hierbei sollen außerdem das maximale Induktionsverhältnis sowie die Basalaktivität des Pmtn in Abwesenheit des Induktors Cu2+ bestimmt werden. Es soll ferner untersucht werden, in welcher Phase der Infektion der Pmtn am aktivsten ist, in welcher Zeitspanne er nach Infektion noch induziert werden kann und wie die Aktivierungskinetik verläuft.

Der PTight wird durch Zugabe von Doxycyclin nicht induziert, sondern gehemmt. Folglich sollen die minimale Doxycyclin-Konzentration, die zur maximalen Hemmung der PTight- gesteuerten Genexpression führt, sowie das Verhältnis der resultierenden eGFP- Produktion in inhibiertem und nicht-inhibiertem Zustand ermittelt werden. Die

Basalaktivität des PTight soll durch ein Kontrollvirus bestimmt werden, dem das Gen des zur Aktivierung des PTight benötigten Tetracyclin Transaktivators (tTA) fehlt. Wie auch für den Pmtn sollen außerdem die Zeitspanne, in der der Promotor nach Infektion durch Entfernen des Doxycyclins noch aktiviert werden kann, und die Aktivierungskinetik untersucht werden. Abschließend sollen der eGFP-Produktionsverlauf sowie die Maximalexpression der beiden induzierbaren Promotoren mit dem Standardpromotor des BEVS, dem Polyhedrin-

Promotor (Ppolh), verglichen werden.

Zusätzlich zur Charakterisierung der Promotoren soll eine genaue Analyse der hergestellten Viren, vor allem in Bezug auf die Bildung von Deletionsmutanten, erfolgen und der Einfluss dieser Mutanten sowohl auf die eGFP-Produktion als auch auf die Virusproduktion untersucht werden.

33

4 Methoden

4.1 Ablauf der Herstellung rekombinanter Baculoviren

Zur Herstellung der Baculoviren wird das Bac-to-Bac® System von Invitrogen verwendet. Dieses System wird primär zur Herstellung von Viren für die Überexpression von Proteinen in Insektenzellen genutzt, weshalb sich die Auswahl der angebotenen

Promotoren auf die starken Standardpromotoren Polyhedrin-Promotor (Ppolh) und p10-

Promotor (Pp10) beschränkt. Die Promotoren befinden sich auf verschiedenen Transfervektoren, in die das Zielgen (gene of interest, goi) kloniert werden muss. Der

Transfervektor pFastBac1 (p) enthält nur den Ppolh, der Transfervektor pFastBacDual (pD) enthält zusätzlich den Pp10. Sollen andere Promotoren, wie der Metallothionein-Promotor

(Pmtn) und der PTight aus dem Tet-Off System getestet werden, müssen die Transfervektoren entsprechend modifiziert werden. Die in dieser Arbeit hergestellten Transfervektoren, sowie die jeweils enthaltenden Promotoren, sind in Tabelle 4.1 aufgeführt. Die Plasmidkarten und Klonierungspläne befinden sich im Anhang in den Kapiteln 0 und 9.2.

Tabelle 4.1: Benennung der hergestellten Transfervektoren, Bacmide und Viren

Ppolh: Polyhedrin-Promotor, egfp: enhanced green fluorescent protein-Gen, Pmtn: Drosophila Metallothionein-Promotor, PTight: Promotor des Tet-Off Systems, tta: Tetracycline-Transaktivator- Gen.

Transfervektor Bacmid Virus Promotor + goi Kapitel pPpolhegfp bPpolhegfp AcMNPV-Pe Ppolh - egfp 5.1.1 pPmtnegfp bPmtnegfp AcMNPV-Me Pmtn - egfp 5.1.2 pDHPTightegfp bDHPTightegfp AcMNPV-DHTe PTight - egfp 5.1.3 Ppolh - – pDHPTightegfp- bDHPTightegfp- AcMNPV-DHTePt PTight - egfp 5.1.3 Ppolhtta Ppolhtta Ppolh - tta In den Transfervektoren werden die Promotoren, gois sowie der Gentamicin- Resistenzmarker von mini-Tn7 Elementen flankiert, deren Gegenstücke, die mini-attTn7 Zielsequenzen, sich auf den Bacmiden (bMON14272; Kanamycin-Resistenz) in den Escherichia coli DH10Bac™ Zellen befinden. Die E. coli DH10Bac™ Zellen enthalten zusätzlich ein Helferplasmid (pMON7124; Tetracyclin-Resistenz), das für eine Transposase kodiert und somit die Transposition der DNA vom Transfervektor in das Bacmid über die mini-Tn7 Sequenzen ermöglicht. Nach der Transformation des Transfervektors in die E. coli DH10Bac™-Zellen werden Klone, bei denen die Transposition funktioniert hat und die folglich das rekombinante Bacmid enthalten, über Antibiotikaselektion und ein

34 4.2 Molekularbiologische Methoden

Blau/Weiß-Screening identifiziert. Bei erfolgreicher Integration der DNA zwischen die mini-attTn7 Sequenzen auf dem Bacmid wird die Expression des LacZα Peptids gestört, wodurch keine α-Komplementation erfolgen und daher keine funktionsfähige β‑Galactosidase gebildet werden kann. Diese Klone erscheinen auf Bluo-Gal-haltigem Medium weiß, wohingegen Klone, die das Bacmid ohne Insert enthalten, blau gefärbt sind. Die rekombinanten Bacmide aus den weißen Klonen werden vermehrt und anschließend zur Transfektion von Spodoptera frugiperda (Sf21)-Insektenzellen verwendet. Sobald sich die Bacmide in den Insektenzellen befinden, verhalten sie sich wie Baculoviren, wodurch rekombinante Viren gebildet und als budded Viren in den Überstand abgegeben werden. Diese 1. Passage (P1-Stock) wird zur weiteren Vermehrung der Viren verwendet.

4.2 Molekularbiologische Methoden

In diesem Kapitel werden die zur Herstellung der verschiedenen Transfervektoren und Bacmide benötigten Methoden beschrieben.

4.2.1 Herstellung chemisch kompetenter Zellen

Zur Replikation und Klonierung von Plasmiden werden in dieser Arbeit chemisch kompetente E. coli DH5α und SURE (stop unwanted rearrangement events) Zellen verwendet. Bei der Erzeugung und Replikation rekombinanter Bacmide kommen E. coli DH10Bac™ Zellen zum Einsatz. Die Herstellung der Kompetenz erfolgt für alle Zellen mit der nach Mülhardt (2009) modifizierten CaCl2-Methode. 2 mL einer E. coli DH5α, DH10Bac™ oder SURE über-Nacht-Kultur werden in 400 mL LB-Medium überführt und bei

37 °C und 190 rpm im Inkubator inkubiert, bis eine Optische Dichte OD600 von 0,6 erreicht wird. Um das Wachstum der Zellen an diesem Punkt zu stoppen, werden die Zellen sofort auf Eis gestellt und anschließend bei 4 °C für 15 min bei 3000 g zentrifugiert. Das Pellet wird nun zwei Mal in 100 mL eiskalter, steriler CaCl2-Lösung resuspendiert und danach jeweils bei 4 °C für 15 min bei 3000 g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das

Pellet in 10 mL eiskalter, steriler CaCl2-Lösung aufgenommen. Die daraus erstellten Aliquote á 100 µL werden bis zu ihrer Verwendung bei -80 °C gelagert.

4.2.2 Transformation chemisch kompetenter E. coli Zellen

Mittels Transformation werden Plasmide in die E. coli Zellen eingebracht und können somit amplifiziert werden. In einigen Fällen führt die Replikation der Plasmide in E. coli DH5α Zellen zu Gen-Deletionen, weshalb in diesen Fällen stattdessen E. coli SURE Zellen verwendet werden. Zur Transformation werden 10 µL Ligationsansatz oder 1 ng Plasmid 35 4 Methoden in 100 µL angetaute Zellsuspension pipettiert und für 30 min auf Eis inkubiert. Danach erfolgt der Hitzeschock bei 42 °C für 30 s (E. coli DH5α) oder 45 s (E. coli SURE und DH10Bac™) im Wasserbad. Die Zellen werden im Anschluss sofort für 2 min auf Eis gestellt und 250 µL LB-Medium (E. coli DH5α) oder 900 µL S.O.C. Medium (E. coli SURE und DH10Bac™) zugegeben. Es folgt eine einstündige (E. coli DH5α und SURE) bzw. vierstündige (E. coli DH10Bac™) Inkubation im Thermomixer bei 37 °C und 800 rpm. Bei einer Plasmid-Transformation werden 30 µL und bei Ligationsansätzen 50 µL der Zellsuspension auf LB-Agarplatten ausplattiert und über Nacht (E. coli DH5α und SURE) oder für 48 h (E. coli DH10Bac™) bei 37 °C inkubiert. Die Selektion auf Zellen, die das Plasmid bzw. das rekombinante Bacmid enthalten, erfolgt, wie in Tabelle 4.2 aufgeführt, durch Zugabe von Antibiotika.

Tabelle 4.2: Selektionsdruck durch Antibiotika-Zugabe

Plasmid/Bacmid Antibiotikum Konzentration pFastBac1, pFastBacDual pMA-T-egfp pPpolhegfp pPmtnegfp Ampicillin 100 µg∙mL-1 pDHPTightegfp pDHPTightegfp-Ppolhtta Negativkontrolle – kein Plasmid Dephosphorylierter Vektor

Postivkontrolle – kein Plasmid kein Antibiotikum - bPpolhegfp Kanamycin 50 µg∙mL-1 bP egfp mtn Gentamicin 7 µg∙mL-1 bDHPTightegfp Tetracyclin 10 µg∙mL-1 bDHPTightegfp-Ppolhtta Den Agarplatten für die Transformation von E. coli DH10Bac™ Zellen werden zusätzlich 100 µg∙mL-1 Bluo-Gal und 40 µg∙mL-1 IPTG zugesetzt, um die Integration der gewünschten DNA-Sequenz in das Bacmid durch ein Blau-Weiß-Screening überprüfen zu können. Durch Transpositionen des DNA-Fragmentes zwischen den mini-Tn7 Sequenzen auf dem Transfervektor in die mini-attTn7 Bindestellen im Bacmid wird die Expression des LacZα Peptids unterbunden, sodass Kolonien, die das rekombinante Bacmid enthalten, weiß erscheinen, wohingegen Kolonien, die das unveränderte Bacmid enthalten, blau gefärbt sind. Bei jeder Transformation wird eine Kontrolle mitgeführt, der keine Plasmid-DNA zugesetzt wird. Diese wird sowohl als Negativkontrolle auf eine Antibiotikum-haltige Agarplatte, als auch als Positivkontrolle auf eine Antibiotikum-freie Agarplatte ausplattiert. Hierdurch kann die Wirksamkeit des Antibiotikums und die Viabilität der verwendeten Zellen überprüft werden. Ferner wird bei jedem Ligationsansatz eine Kontrolle in Form des

36 4.2 Molekularbiologische Methoden dephosphorylierten Vektorrückgrats mitgeführt, um den Anteil an Kolonien mit selbstligiertem Plasmid abschätzen zu können.

Nach der entsprechenden Inkubationszeit werden die am besten isolierten und größten Kolonien von den Platten gepickt und in ca. 2 mL Antibiotikum-haltigem LB-Medium über Nacht bei 37 °C und 180 rpm inkubiert.

Bei der Transformation der Plasmide pDHPTightegfp und pDHPTightegfp-Ppolhtta werden die Zellen nach dem Hitzeschock, auf den Platten und in der über-Nacht-Kultur bei nur 30 °C kultiviert, da sich gezeigt hat, dass ein verlangsamtes Wachstum der Zellen zu weniger Deletionen in den Plasmiden führt.

4.2.3 Isolation und Aufreinigung von DNA

4.2.3.1 Plasmid Isolation mittels alkalischer Lyse Die Isolation auf Aufreinigung von Plasmiden nach deren Vermehrung in E. coli erfolgt durch alkalische Lyse nach der Methode von Green und Sambrook, 2012. Am Vortag werden ca. 2 mL einer Antibiotika-haltigen über-Nacht-Kultur angesetzt, von denen am Tag der Isolation 1,5 mL bei 18.000 g abzentrifugiert werden. Das Pellet wird in 100 µL eiskalter Lösung I und 100 µg∙mL-1 RNase A resuspendiert bevor 200 µL Lösung II zugegeben und die Proben ca. fünfmal vorsichtig invertiert werden. Die Ansätze werden auf Eis gestellt und 150 µL eiskalte Lösung III zugegeben. Nach mehrmaligem Invertieren werden die Proben für 5 min auf Eis inkubiert, bevor sie bei 20.800 g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert werden. Der Überstand wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt und 10 min bei 4 °C inkubiert. Es folgt die Fällung der DNA mit dem doppelten Volumen an 99 % Ethanol. Die Proben werden kurz gevortext, 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend bei 20.800 g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wird mit 1 mL 70 % Ethanol gewaschen und noch einmal bei 20.800 g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das für ca. 30 min bei Raumtemperatur getrocknete

Pellet in 50 µL H2Obidest aufgenommen. Wird die DNA nicht sofort verwendet, wird sie bei -20 °C gelagert.

4.2.3.2 Bacmid Isolation mittels alkalischer Lyse Die in E. coli DH10Bac™ Zellen hergestellten rekombinanten Bacmide werden mittels einer, auf sehr große Plasmide angepassten, alkalischen Lyse (Invitrogen by Life Technologies, 2002) extrahiert, bevor sie zur Virusproduktion in Insektenzellen eingesetzt werden können. Hierzu werden am Vortag ca. 2 mL einer Antibiotika-haltigen (50 μg∙mL-1 Kanamycin, 7 μg∙mL-1 Gentamicin, 10 μg∙mL-1 Tetracyclin) über-Nacht-Kultur angesetzt, von denen am Tag der Isolation 1,5 mL bei 14.000 g für 1 min abzentrifugiert werden. Das Pellet wird vorsichtig in 300 µL eiskalter Lösung I und 100 µg∙mL-1 RNase A resuspendiert,

37 4 Methoden bevor 300 µL Lösung II zugegeben und die Proben ca. fünfmal vorsichtig invertiert werden. Die Ansätze werden für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert, woraufhin 300 µL eiskalte Lösung III zugegeben werden. Nach mehrmaligem Invertieren werden die Proben für 10 min auf Eis inkubiert, bevor sie bei 14.000 g für 10 min zentrifugiert werden. In der Zwischenzeit werden zur Fällung der DNA 800 µL Isopropanol in ein neues Reaktionsgefäß vorgelegt, zu denen nach Beendigung der Zentrifugation der Überstand pipettiert wird. Der Ansatz wird vorsichtig invertiert, für 10 min auf Eis inkubiert und für 15 min bei 14.000 g und Raumtemperatur zentrifugiert. Das Pellet wird mit 0,5 mL 70 % Ethanol gewaschen und noch einmal bei 14.000 g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das für ca. 10 min bei Raumtemperatur getrocknete Pellet in 40 µL H2Obidest aufgenommen. Die isolierten Bacmide werden bei baldiger Nutzung für 1 ‑ 2 Tage im Kühlschrank und bei längerer Lagerung bei -20 °C aufbewahrt.

4.2.3.3 Plasmid/Bacmid Isolation durch Kits Wenn für die isolierte Bacmid/Plasmid-DNA besonders hohe Reinheitsgrade, für beispielsweise Sequenzierungen, benötigt werden, können zur Isolation statt der alkalischen Lyse verschiedene Kits herangezogen werden. Eine Liste der in dieser Arbeit verwendeten Kits ist im Anhang Kapitel 9.10 zu finden. Die Plasmid-Isolationen werden nach Herstellerangaben durchgeführt, jedoch wird im letzten Schritt zur Elution der

Plasmid-DNA auf 65 °C erwärmtes H2Obidest verwendet und dieses vor der finalen Zentrifugation 5 min auf der Säule belassen, um die Ausbeuten zu erhöhen. Bei der Isolation von Bacmiden mit dem PureLink™ HiPure Plasmid DNA Miniprep Kit wird das

DNA-Pellet am Ende in H2Obidest anstelle von TE Puffer aufgenommen.

4.2.3.4 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen und PCR-Ansätzen Um DNA-Fragmente zur weiteren Verwendung aus einem Agarosegel zu isolieren, werden die gewünschten Banden unter UV-Licht ausgeschnitten und mit Hilfe des Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kits laut Herstellerangaben aufgereinigt. Im Gegensatz zum

Protokoll wird zur Elution der DNA-Fragmente jedoch H2Obidest (65 °C; 2 x 25 µL) statt Elutionspuffer verwendet und die Absorbtionszeit von 2 min auf 5 min erhöht. Die Aufreinigung von PCR-Fragmenten erfolgt mit demselben Kit und derselben Variation des Protokolls.

38 4.2 Molekularbiologische Methoden

4.2.4 Bestimmung der DNA-Konzentration

Die photometrische Bestimmung der Konzentration von DNA-Lösungen erfolgt am Nanophotometer der Firma Implen bei einer Wellenlänge von 260 nm. Nachdem mit dem verwendeten Lösungsmittel eine Referenzmessung durchgeführt worden ist, wird die Probe auf die Messstelle pipettiert und der passende Deckel aufgesetzt. Die verwendeten Probenvolumina hängen dabei von der erwarteten Konzentration der DNA-Lösung ab und sind in Tabelle 4.3 zusammengefasst.

Tabelle 4.3: Parameter zur Bestimmung der DNA-Konzentration in Lösungen

Konzentrationsbereich Probenvolumen Deckel Beispiel 5 ‑ 150 ng∙µL-1 4 µL Lid10 Aufgereinigte DNA-Fragmente 150 ‑ 3500 ng∙µL-1 2 µL Lid50 Plasmid-Lösung nach Alkalischer Lyse Neben der Konzentration der DNA-Lösung wird auch deren Reinheitsgrad über das Verhältnis der Absorptionen bei 260 nm und 280 nm bestimmt. Werte zwischen 1,8 und 2,0 lassen auf einen hohen Reinheitsgrad schließen, wohingegen Werte kleiner als 1,8 Verunreinigung durch Proteine oder andere organische Substanzen indizieren. Für alle Arbeiten mit DNA werden möglichst reine DNA-Proben verwendet.

4.2.5 DNA-Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion

Die einfache Polymerasekettenreaktion (PCR, engl.: polymerase chain reaction) ist eine Methode zur Amplifikation von definierten DNA-Fragmenten, die in dieser Arbeit sowohl zu Kontrollzwecken als auch zur Herstellung von DNA-Fragmenten zur Klonierung eingesetzt wird.

4.2.5.1 Kontroll-PCR für Bacmide Die circa 137 kb langen rekombinanten Bacmide können aufgrund ihrer Größe nicht mittels enzymatischer Restriktion auf die erfolgreiche Transposition des Inserts hin überprüft werden, weshalb stattdessen eine Kontroll-PCR durchgeführt wird. Hierzu befinden sich auf dem Bacmid vor und nach den mini-Tn7 Sequenzen die Erkennungssequenzen der pUC/M13 Standardprimer (siehe Tabelle 9.14), deren Abstand beim unveränderten Bacmid ungefähr 300 bp beträgt. Durch die Insertion der DNA aus den Transfervektoren verlängert sich der Abstand und somit das in der Kontroll-PCR generierte DNA-Fragment. Da mit den PCR-Produkten nur zu Kontrollzwecken weitergearbeitet wird, wird eine Taq DNA-Polymerase ohne 3' → 5'-Exonukleaseaktivität und damit ohne proof reading-Funktion eingesetzt. Die Zusammensetzung eines PCR- Ansatzes bei Verwendung der Taq DNA-Polymerase ist in Tabelle 4.4 aufgeführt.

39 4 Methoden

Tabelle 4.4: Zusammensetzung der PCR-Ansätze – Taq DNA-Polymerase

Komponente Volumen Endkonzentration Taq Puffer B (10 x) 2,5 µL 1 x

MgCl2 (25 mM) 2,5 µL 2,5 mM dNTPs (10 mM) 0,75 µL 0,3 mM Forward Primer (10 µM) 0,75 µL 0,3 µM Reverse Primer (10 µM) 0,75 µL 0,3 µM Template (25 ng∙µL-1) 2 µL 2 ng∙µL-1 Taq DNA-Polymerase (5 U∙µL-1) 0,5 µL 0,1 U∙µL-1

H2Obidest ad 25 µL Der Ansatz wird in einem 0,2 mL Reaktionsgefäß auf Eis pipettiert und anschließend kurz zentrifugiert bevor er zur DNA-Amplifikation in den ThermoCycler gestellt wird. Das zur Taq DNA-Polymerase und den pUC/M13 Primern gehörige PCR-Programm ist in Tabelle 4.5 dargestellt. Die Temperatur der Deckelheizung des ThermoCyclers ist zum Schutz vor Kondensation auf 105 °C eingestellt. Zu jedem Ansatz wird eine Negativkontrolle ohne DNA-Template (NTC, no template control) mitgeführt.

Tabelle 4.5: PCR-Temperaturprogramm – Taq DNA-Polymerase

Schritt Temperatur Dauer Zyklen Initiale Denaturierung 98 °C 3 min 1 Denaturierung 94 °C 45 s Primerhybridisierung 55 °C 45 s 32 Elongation 72 °C 2 min Finale Elongation 72 °C 7 min 1 Lagerung 4 °C ∞ 1 Bei einigen Bacmiden ist es mit der Taq DNA-Polymerase nicht möglich gewesen DNA- Fragmente zu amplifizieren, weshalb in diesen Fällen mit der, in Kapitel 4.2.5.2 beschriebenen, Kapa HiFi DNA-Polymerase und den entsprechenden Reaktionsbedingungen gearbeitet worden ist. Nur die Menge an eingesetztem Bacmid ist bei 2 ng∙µL-1 konstant gehalten worden.

4.2.5.2 Amplifikation von DNA zur Klonierung Die Amplifikation von DNA-Abschnitten durch PCR ermöglicht es, über die gewählten Primer, Restriktionsschnittstellen an die Enden des DNA-Fragments anzuhängen, mittels derer das amplifizierte DNA-Fragment später mit Restriktionsenzymen geschnitten und ligiert werden kann. Hierdurch kann ein und dasselbe Template durch die Verwendung unterschiedlicher Primer für verschiedene Klonierungen genutzt werden. Eine Übersicht über die in dieser Arbeit verwendeten Primer liefert Tabelle 9.14 im Anhang. In Tabelle

40 4.2 Molekularbiologische Methoden

4.6 ist die Zusammensetzung eines PCR-Ansatzes bei Verwendung der Kapa HiFi DNA- Polymerase dargestellt. Die Kapa HiFi DNA-Polymerase besitzt eine proof reading- Funktion und arbeitet mit einer hohen Genauigkeit, weshalb sie für alle Insert- Amplifikationen und bei schwierigen Templates, die beispielsweise repetitive Sequenzen enthalten, verwendet wird.

Tabelle 4.6: Zusammensetzung der PCR-Ansätze – Kapa HiFi DNA-Polymerase

Komponente Volumen Endkonzentration Fidelity Buffer (5 x) 5 µL 1 x dNTPs (10 mM) 0,75 µL 0,3 mM Forward Primer (10 µM) 0,75 µL 0,3 µM Reverse Primer (10 µM) 0,75 µL 0,3 µM Template (5 ng∙µL-1) 1 µL 0,2 ng∙µL-1 Kapa HiFi DNA-Polymerase (1 U∙µL-1) 0,5 µL 0,02 U∙µL-1

H2Obidest ad 25 µL Der Ansatz wird in einem 0,2 mL Reaktionsgefäß auf Eis pipettiert und anschließend kurz zentrifugiert, bevor er in den ThermoCycler gestellt wird, dessen Deckelheizung zum Schutz vor Kondensation auf 105 °C eingestellt wird. Die verwendeten PCR-Programme unterscheiden sich abhängig von den gewählten Primern und der Länge der DNA- Fragmente in den Primerhybridisierungs-Temperaturen und Elongationszeiten, basieren aber alle auf dem in Tabelle 4.7 dargestellten Ablauf.

Tabelle 4.7: PCR-Temperaturprogramm – Kapa HiFi DNA-Polymerase

Schritt Temperatur Dauer Zyklen Initiale Denaturierung 95 °C 3 min 1 Denaturierung 98 °C 20 s Primerhybridisierung 55 - 70 °C 15 s 32 Elongation 72 °C 15 s∙kb-1 Finale Elongation 72 °C 60 s∙kb-1 1 Lagerung 4 °C ∞ 1 Zu jedem Ansatz bzw. für jedes Primerpaar wird eine NTC mitgeführt.

4.2.6 Enzymatische DNA-Restriktion

Um nach einer Ligation zu überprüfen, ob das Insert korrekt im Plasmid integriert worden ist, werden die Plasmide mit verschiedenen Restriktionsenzymen behandelt. Ein Vergleich der entstandenen DNA-Banden im Agarosegel mit den erwarteten Größen der DNA- Fragmente gibt Aufschluss über Anwesenheit und, bei geeigneter Wahl der Schnittstellen, auch Orientierung des Inserts. Eine Übersicht über die verwendeten Restriktionsenzyme,

41 4 Methoden die jeweils damit behandelten Plasmide sowie die Größe der erwarteten DNA-Fragmente ist im Anhang in Tabelle 9.12 zusammengestellt. Das allgemeine Pipettierschema für ein Ansatzvolumen von 10 µL ist in Tabelle 4.8 dargestellt, wobei jeweils der laut Herstellerangaben zum Enzym passende Puffer verwendet wird. Wenn die Restriktion nicht zur Kontrolle sondern zur Vorbereitung einer Ligation angesetzt wird, vergrößern sich die Ansätze entsprechend der eingesetzten Menge an DNA, wobei das Verhältnis von 1 U Restriktionsenzym pro 1 µg DNA konstant gehalten wird. Die Ansätze werden bei 37 °C und 300 rpm für eine Stunde im Thermomixer inkubiert. Falls notwendig, erfolgt abschließend eine Hitzeinaktivierung der Restriktionsenzyme nach Herstellerangaben.

Tabelle 4.8: Zusammensetzung der Ansätze für eine Kontrollrestriktion

Komponente Volumen Endkonzentration Puffer (10 x) 1 µL 1 x Restriktionsenzym (10 U∙µL‑1) 0,1 µL (≙ 1 U) 1 U∙(µg DNA)-1 Plasmid DNA X µL (≙ 1 µg DNA) 0,1 µg∙µL-1

H2Obidest ad 10 µL

4.2.7 Agarose-Gelelektrophorese

Zur Trennung der, durch die Behandlung mit Restriktionsenzymen oder durch PCR entstandenen, DNA-Fragmente entsprechend ihrer Größe wird eine Agarose- Gelelektrophorese durchgeführt. Die Herstellung des Agarosegels erfolgt durch Aufkochen von 1 g Agarose in 100 mL Tris-Acetat-EDTA (TAE)-Puffer, dem anschließend zur Sichtbarmachung der DNA unter UV-Licht Ethidiumbromid in einer Konzentration von 0,2 µg∙mL-1 zugesetzt wird. Nachdem die Proben mit 6-fach konzentriertem Ladepuffer versetzt worden sind, werden sie, ebenso wie 6 µL eines geeigneten DNA- Größenstandards, auf das Gel aufgetragen. Die eingesetzten Probenvolumina betragen je nach Anwendung 12 µL bei einer Kontrollrestriktion, 6 µL bei der Überprüfung der Größe von PCR-Fragmenten und bis maximal 50 µL pro Geltasche für DNA, die im Anschluss zur Weiterverwendung aus dem Gel isoliert werden soll. Die Trennung erfolgt bei 110 V für eine Stunde in einfach konzentriertem TAE-Puffer. Zur Detektion und Aufnahme der DNA- Banden unter UV-Licht werden ein Geldokumentationssystem und die Software VisionCapt verwendet.

42 4.2 Molekularbiologische Methoden

4.2.8 Dephosphorylierung

Plasmide, die mit Restriktionsenzymen linearisiert worden sind, können während der Ligationsreaktion statt mit dem gewünschten Insert auch mit sich selbst ligieren. Werden die 5‘-Phosphatgruppen des Vektorrückgrats vor der Ligation enzymatisch entfernt, kann die Ligase die Enden des Vektorrückgrats nicht mehr selbstligieren und die Ausbeute an korrekten Ligationen wird erhöht. Hierzu wird zu 2 µg linearisiertem Plasmid so viel 10- fach konzentrierter Reaktionspuffer gegeben, dass er final 1-fach konzentriert ist. Danach werden 5 U des Enzyms Antarktische Phosphatase zum Ansatz pipettiert und dieser vorgetext. Die Inkubation erfolgt bei 37 °C für 15 min im Thermomixer. Im Anschluss wird das Enzym für 5 min bei 70 °C hitzeinaktiviert.

4.2.9 Ligation mit T4 DNA-Ligase

Die Ligation von Vektorrückgrat und Insert erfolgt in verschiedenen molaren Verhältnissen, die über Formel 4.1 berechnet wurden und im jeweiligen Abschnitt mit angegeben sind.

퐹 ∙ 푚푉푒푘푡표푟(ng) ∙ 퐿ä푛푔푒퐼푛푠푒푟푡(bp) Formel 4.1 푚퐼푛푠푒푟푡(ng) = 퐿ä푛푔푒푉푒푘푡표푟(bp) mit F: Faktor bzw. angegebenes Verhältnis

In Tabelle 4.9 ist die Zusammensetzung für eine Ligation mit einem Ansatzvolumen von 20 µL aufgelistet.

Tabelle 4.9: Zusammensetzung der Ligationsansätze

Komponente Volumen Endkonzentration T4 DNA-Ligase Puffer (10 x) 2 µL 1 x Vektor DNA X µL (≙ 50 ng DNA) 2,5 ng∙µL-1 Insert DNA X µL variabel

H2Obidest ad 20 µL T4 DNA-Ligase (400 U∙µL-1) 1 µL (≙ 400 U) 20 U∙µL-1 Der Ligationsansatz wird über Nacht bei 16 °C inkubiert und im Anschluss entweder sofort für die Transformation kompetenter E. coli verwendet oder bei -20 °C gelagert.

43 4 Methoden

4.2.10 Sequenzierung von Plasmiden

Zur Überprüfung der korrekten Nukleotid-Sequenz werden die aufgereinigten Plasmide an die Firma GATC zur Sanger-Sequenzierung geschickt. Die zur Sequenzierung verwendeten Primer sind in Tabelle 9.14 im Anhang zusammengestellt. Die Auswertung der erhaltenen Sequenzdaten erfolgt mit Hilfe der Software SnapGene.

4.3 Allgemeine Zellkultur

4.3.1 Silikonisieren von Erlenmeyerkolben

Um während der Kultivierung ein Anhaften der Insektenzellen an die Erlenmeyerkolben zu vermeiden, werden diese vorab mit Silikon beschichtet. Hierzu wird die Silikon-Lösung im Kolben durch Schwenken gleichmäßig verteilt und eventuelle Reste in den nächsten Kolben transferiert. Um überschüssige Silikon-Lösung zu entfernen werden die Kolben im Anschluss für ca. 10 min auf den Kopf gestellt, bevor sie bei 100 °C für 15 min getrocknet werden. Nachdem die Kolben etwas abgekühlt sind, wird eine weitere Schicht Silikon- Lösung aufgetragen, Reste durch Abtropfen entfernt und die Kolben mit Alufolie verschlossen. Das Einbrennen und Hitzesterilisieren erfolgt bei 180 °C für 4 h.

4.3.2 Bestimmung der Lebendzelldichte und Vitalität einer Insektenzellkultur

Die Parameter Lebendzelldichte (LZD) und Vitalität geben Aufschluss über den Zustand der Insektenzellkultur. Zu ihrer Bestimmung werden 100 µL der Zellsuspension mit 100 µL 0,2 % Trypanblau-Lösung vermischt und gegebenenfalls mit 0,9 % NaCl-Lösung verdünnt. 10 µL der homogenisierten Probe werden in eine Neubauer-Zählkammer pipettiert und anschließend vier Großquadrate ausgezählt, wobei anhand der Blaufärbung toter Zellen durch Trypanblau zwischen toten und lebenden Zellen unterschieden wird. Die Berechnungen der Lebendzelldichte und der Vitalität erfolgen nach Formel 4.2 und Formel 4.3.

∑ 푁푙푒푏푒푛푑푒 푍푒푙푙푒푛 ∙ 푉퐹 ∙ 10.000 퐿푍퐷 (Zellen∙mL‑1) = Formel 4.2 4 mit VF: Verdünnungsfaktor

∑ 푁푙푒푏푒푛푑푒 푍푒푙푙푒푛 푉푖푡푎푙푖푡ä푡 (%) = ∙ 100 Formel 4.3 ∑ 푁푙푒푏푒푛푑푒+푡표푡푒 푍푒푙푙푒푛

44 4.3 Allgemeine Zellkultur

4.3.3 Kultivierung von Insektenzellen in Suspensionskultur

In dieser Arbeit wird mit Spodoptera frugiperda (Sf21)-Insektenzellen gearbeitet, die als Suspensionskultur in silikonisierten Erlenmeyerkolben mit 10 % Füllvolumen bei 27 °C und 50 rpm im Schüttelinkubator kultiviert werden. Alle 3 - 4 Tage werden die Lebendzelldichte und Vitalität der Stammhaltungskultur bestimmt und die Zellen in frisches Ex-Cell® 420 Medium passagiert, wobei eine Zelldichte von 7∙105 Zellen∙mL-1 eingestellt wird. Sinkt die Vitalität der Kultur auf unter 95 % werden die Zellen zur Entfernung des alten Mediums beim Passagieren zusätzlich bei 180 g für 8 min abzentrifugiert und anschließend in frischem Medium resuspendiert. Für alle in dieser Arbeit beschriebenen Versuche werden Insektenzellen verwendet, die am Vortag passagiert worden sind und sich somit zu Versuchsbeginn in der exponentiellen Wachstumsphase befinden.

4.3.4 Kryokonservierung von Insektenzellen

Die Kryokonservierung von Insektenzellen ist die einzige Möglichkeit diese über einen längeren Zeitraum ohne Passagieren zu lagern. Die Vitalität der aufgetauten Kultur ist jedoch von der Dauer der Lagerung abhängig, weshalb die Zellen alle zwei bis drei Jahre aufgetaut, mehrfach passagiert und wieder eingefroren werden.

4.3.4.1 Einfrieren von Insektenzellen Pro Kryoröhrchen werden 5∙106 Zellen einer exponentiell wachsenden Kultur entnommen und bei 180 g für 8 min abzentrifugiert. Das Pellet wird in 1,26 mL frischem Medium resuspendiert und in ein Kryoröhrchen überführt. Zu den Zellen werden 0,36 mL fötales Kälberserum (FKS) und 0,18 mL Dimethylsulfoxid gegeben. Danach wird das Röhrchen bei einer definierten Abkühlrate von 1 °C∙min-1 für eine Stunde bei -20 °C gelagert und anschließend im ‑80 °C Schrank abgelegt.

4.3.4.2 Auftauen von Insektenzellen Die Zellen im Kryoröhrchen werden langsam in der Hand aufgetaut. Anschließend werden die Zellen vorsichtig resuspendiert, in ein 50 mL Falcon überführt und tropfenweise eiskaltes Medium zugegeben. Nach einem Zentrifugationsschritt bei 180 g für 8 min wird das Zellpellet in 5 mL raumwarmem Medium resuspendiert und in eine T-Flasche überführt. Nach einer einstündigen Inkubation bei 27 °C wird der Überstand mit den nicht adhärierten Zellen abgenommen und durch 5 mL frisches Medium ersetzt. Die Zellen werden weiter bei 27 °C kultiviert und bei Erreichen einer Lebendzelldichte von 1∙106 Zellen∙mL-1 in einen 100 mL Erlenmeyerkolben umgesetzt.

45 4 Methoden

4.3.5 Toxizitätstests

In dieser Arbeit wird zur Regulation der induzierbaren Promotoren mit den Substanzen

Doxycyclin und CuSO4 bzw. CuCl2 gearbeitet, die sich auf das Zellwachstum, die Vitalität und die Zellaktivität auswirken können. Aus diesem Grund soll vorab die Toxizität der Substanzen auf Sf21-Insektenzellen überprüft werden.

4.3.5.1 Einfluss auf Wachstum und Vitalität Die Toxizität einer Substanz kann anhand ihres Einflusses einer Zellkultur bestimmt werden. Hierzu werden Zellen einer exponentiell wachsenden Kultur bei 180 g für 8 min abzentrifugiert und anschließend mit frischem Medium auf eine LZD von 7∙105 Zellen∙mL-1 eingestellt. Zu je 15 mL Zellsuspension im 100 mL Erlenmeyerkolben wird das entsprechende Volumen eines Doxycyclin-, CuSO4- oder CuCl2-Stocks gegeben, um die gewünschte Konzentration einzustellen. Die Ausführung erfolgt für jede Konzentration im Triplikat. Die Kultivierung erfolgt bei 27 °C und 50 rpm im Schüttelinkubator, wobei täglich Probe gezogen wird und die LZD sowie die Vitalität der Kultur bestimmt werden. Im Vergleich zu einer mitgeführten, unbehandelten Kontrolle kann dadurch das Maß der Beeinträchtigung auf Wachstum und Vitalität durch die verwendete Substanz ermittelt werden.

4.3.5.2 Einfluss auf Zellstoffwechselaktivität Zur Bestimmung der toxischen Wirkung einer Substanz auf die Zellaktivität wird der MTT- Test verwendet. In eine 96-well Mikrotiterplatte werden hierzu pro well 200 µL Sf21- Insektenzellen einer exponentiell wachsenden Kultur mit einer Zelldichte von 3∙105 Zellen∙mL-1 in frischem Ex-Cell® 420 Medium ausgesät. Jede zu testende Bedingung wird in insgesamt vier wells durch Zugabe der entsprechenden CuCl2-Stocklösung eingestellt. Falls die Toxizität der Substanz auf infizierte Zellen untersucht werden soll, erfolgt die Infektion mit MOI 5 ebenfalls in diesem Schritt. Es werden außerdem eine unbehandelte Kontrolle zur Bestimmung des Referenzwertes sowie eine Blindprobe ohne Zellen mitgeführt. Nach einer 24-stündigen Inkubation bei 27 °C und 0 rpm wird das Medium aus den wells abgezogen und durch 200 µL einer 1:5 Verdünnung der 5 mg∙mL‑1 MTT-Stocklösung in Medium ersetzt. Die Mikrotiterplatte wird für 4 h bei 27 °C und 0 rpm inkubiert und anschließend bei 3.220 g für 10 min zentrifugiert, um die wasserunlöslichen Formazankristalle von der flüssigen Phase zu trennen, die daraufhin abgezogen wird. Die Lyse der Zellen erfolgt durch Zugabe von je 20 µL einer 0,4 % Igepal- Lösung und einer fünfminütigen Inkubation auf dem Schüttler bei 1.000 rpm und Raumtemperatur. Zum Lösen des Formazan werden je 180 µL Dimethylsulfoxid (DMSO) zugegeben und die Mikrotiterplatte für weitere 5 min auf dem Schüttler inkubiert. Die Messung der Extinktion bei 570 nm erfolgt anschließend im PlateReader.

46 4.4 Arbeiten mit Baculoviren

4.4 Arbeiten mit Baculoviren

4.4.1 Transfektion von Insektenzellen

Die aus E. coli DH10Bac™-Zellen isolierten rekombinanten Bacmide müssen zur Herstellung der Baculoviren in Insektenzellen transfiziert werden. Die Transfektion von Sf21-Insektenzellen wird in Anlehnung an das Protokoll des Transfektionsreagenzes Cellfectin® II im Zweifachansatz durchgeführt. Hierfür werden pro Ansatz je 100 µL Ex‑Cell® 420 Insektenzellmedium mit 8 µL Cellfectin® II Reagenz bzw. 2 µg Bacmid-DNA vermischt, anschließend vereint und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. In eine 6‑well Mikrotiterplatte werden 8∙105 Zellen pro well ausgesäht und mit je 2 mL frischem Medium aufgefüllt. Nachdem die Zellen adhäriert sind, wird tropfenweise die Cellfectin II/Bacmid-Mischung dazu pipettiert und dabei die Mikrotiterplatte immer wieder geschwenkt. Als Kontrolle wird ein well nur mit Cellfectin II aber ohne Bacmid- DNA mitgeführt. Die anschließende Inkubation der Zellen erfolgt im Inkubator bei 27 °C. Nach 3 – 5 h wird der Überstand durch 2,5 mL frisches, mit 10 % FKS supplementiertes, Medium ersetzt. Etwa 27 h später wird der Überstand, der die budded Viren enthält, abgenommen und zur weiteren Vermehrung der Viren verwendet.

4.4.2 Herstellung eines Virusstocks

Bei der Herstellung von qualitativ hochwertigen Baculovirus-Stocks soll die Bildung von defective interfering particles (DIPs) weitestgehend vermieden werden, weshalb hier mit sehr niedrigen multiplicities of infection (MOIs) gearbeitet wird. Zuerst werden Sf21- Insektenzellen mit einer Zelldichte von 7∙105 Zellen∙mL-1 in einem Erlenmeyerkolben vorgelegt und dazu das benötigte Volumen an Virussuspension pipettiert, um eine MOI von 0,01 einzustellen. Die Berechnung der MOI basiert auf dem, mittels Endpunkttitration bestimmten, infektiösen Virustiter. Nach der Infektion werden die Zellen bei 27 °C und 50 rpm inkubiert. Sobald die Vitalität der Kultur nach 3 ‑ 4 Tagen auf 85 % abfällt, werden die Zellen bei 180 g für 8 min abzentrifugiert. Das Zellpellet wird verworfen und der Überstand zur Abtrennung weiterer Zellbruchstücke erneut für 30 min bei 3.440 g und 4 °C zentrifugiert. Der die budded Viren enthaltende Überstand wird mit 2 % FKS versetzt und vor Licht geschützt im Kühlschrank gelagert.

4.4.3 Bestimmung des infektiösen Virustiters

Die Bestimmung der Konzentration an infektiösen Viruspartikeln erfolgt mittels Endpunkttitration. Hierfür werden 3∙106 Zellen einer exponentiell wachsenden Kultur entnommen, 8 min bei 180 g abzentrifugiert und in 12 mL frischem Medium

47 4 Methoden resuspendiert, um eine Zelldichte von 2,5∙105 Zellen∙mL-1 zu erhalten. Je 900 µL dieser Zellsuspension werden in zwölf Reaktionsgefäße vorgelegt. Zu zehn der Reaktionsgefäße werden im Anschluss 100 µL einer zuvor vorbereiteten, zehnstufigen dekadischen Virusverdünnungsreihe (100 – 10-9) pipettiert und kurz gevortext. Zu den anderen beiden Reaktionsgefäßen werden je 100 µL Medium gegeben. Aus jedem Reaktionsgefäß, also den zehn Verdünnungsstufen und den beiden Kontrollen, werden je 100 µL in acht wells einer 96-well Mikrotiterplatte pipettiert und bei 27 °C kultiviert. Nach 7 und 10 Tagen werden die Mikrotiterplatten unter dem Mikroskop auf Anzeichen von Infektion -1 überprüft und der Virustiter in TCID50∙mL nach der Methode von (Reed und Muench, 1938) bestimmt. Anzeichen der Infektion sind stark vergrößerte Zellen sowie die Produktion des Markerproteins eGFP.

4.4.4 Bestimmung des Viruspartikeltiters

Neben der Bestimmung des infektiösen Virustiters über Endpunkttitration kann durch den quantitativen Nachweis der Gene ie-1 und egfp auf dem Virusgenom mittels real-time PCR auch die Konzentration der Gesamtviruspartikel bestimmt werden. Das Verhältnis der Anzahl der Kopien beider Gene zueinander gibt zudem Aufschluss über den Anteil an egfp+-Viren im Vergleich zu ie-1+-Viren und ist somit ein Indikator für das Auftreten von Deletionsmutanten und die Qualität der Virusstocks.

Zur Bestimmung des Viruspartikeltiters wird die Virus-DNA aus 200 µL Virussuspension mit Hilfe des High Pure Viral Nucleic Acid Kits nach Herstellerangaben extrahiert und anschließend 1:100 mit H2ODEPC verdünnt. Davon werden, wie Tabelle 4.10 zeigt, 3,5 µL pro Ansatz für die real-time PCR eingesetzt.

Tabelle 4.10: Zusammensetzung der PCR-Ansätze zur Viruspartikeltiterbestimmung mittels real‑time PCR

Komponente Volumen Endkonzentration Supermix (2 x) 6,25 µL 1 x Forward Primer (5 µM) 0,625 µL 0,25 µM Reverse Primer (5 µM) 0,625 µL 0,25 µM

H2ODEPC 1,5 µL Virus DNA Template 3,5 µL variabel Summe 12,5 µL Der Supermix wird vorab hergestellt und enthält neben dem Puffer, die Hot Taq DNA-

Polymerase, dNTPs, MgCl2 und SYBR Green zur Detektion der doppelsträngigen DNA. Seine genaue Zusammensetzung ist in Kapitel 9.14 im Anhang aufgelistet. Zum Nachweis von ie-1 werden die Primer 49-F und 49-R verwendet und zum Nachweis von egfp die Primer 48-F und 48-R. Eine Auflistung der Primer und deren Eigenschaften ist in Tabelle 48 4.4 Arbeiten mit Baculoviren

9.14 im Anhang zu finden. Alle Komponenten werden in weißen Hard Shell Platten auf Eis zusammen pipettiert, mit SafeSeal Folie verschlossen, 1 min bei 100 g zentrifugiert und anschließend im CFX Connect vermessen. Die Primer sind so designt worden, dass sie bei derselben Temperatur von 65 °C hybridisieren, wodurch das in Tabelle 4.11 beschriebene Temperaturprogramm für alle Ansätze genutzt werden kann.

Tabelle 4.11: PCR-Temperaturprogramm Viruspartikeltiterbestimmung

Schritt Temperatur Dauer Zyklen Initiale Denaturierung 95 °C 5 min 1 Denaturierung 95 °C 20 s 40 Primerhybridisierung 65 °C 20 s Denaturierung 95 °C 10 s 1 Schmelzkurve 55 - 95 °C ∆ 5 s pro ∆ 0,5 °C 1 Von jeder Probe werden zwei technische Replikate vermessen, sowie zwei NTCs pro Primerkombination. Die Aufnahme der Fluoreszenz erfolgt nach jedem abgeschlossenen Denaturierungs- und Hybridisierungs-Zyklus. Die Auswertung der Daten zur Bestimmung der Cq-Werte erfolgt mittels Regression mit der Software CFX-Manager von Bio-Rad. Durch Einsetzen der erhaltenen Cq-Werte des Gens ie-1 in die zum jeweiligen Virus gehörige Kalibrierfunktion (Formel 4.4 bis Formel 4.6) kann der Viruspartikeltiter berechnet werden. Die Erstellung der Kalibrierfunktionen ist im Anhang in Kapitel 9.5 erläutert.

Tabelle 4.12: Kalibrierfunktionen zur Quantifizierung der Viruspartikeltiter mittels rt-PCR

AcMNPV Kalibrierfunktion -Pe 푉푖푟푢푠푝푎푟푡푖푘푒푙푡푖푡푒푟 (VP∙mL‑1) = 1,05 ∙ 1012 ∙ 푒−0,686∙퐶푞 Formel 4.4 -Me 푉푖푟푢푠푝푎푟푡푖푘푒푙푡푖푡푒푟 (VP∙mL‑1) = 7,91 ∙ 1011 ∙ 푒−0,686∙퐶푞 Formel 4.5 -DHTePt 푉푖푟푢푠푝푎푟푡푖푘푒푙푡푖푡푒푟 (VP∙mL‑1) = 4,02 ∙ 1012 ∙ 푒−0,686∙퐶푞 Formel 4.6 -DHTe Das Verhältnis der egfp+-Viren zu den ie-1+-Viren, das auch als Anteil egfp+-Viren bezeichnet wird, kann zusätzlich durch Formel 4.7 berechnet werden.

퐶푞 푁푒푔푓푝+ 1,99 푖푒−1 (%) = 퐶푞 ∙ 100 Formel 4.7 푁푖푒−1+ 1,97 푒푔푓푝

49 4 Methoden

4.4.5 Promotorstudien

Zur Charakterisierung der verwendeten Promotoren Polyhedrin-Promotor (Ppolh),

Metallothionein-Promotor (Pmtn) und PTight aus dem Tet-Off System werden Insektenzellen mit den jeweiligen Viren infiziert und anschließend die Expression des Markerproteins eGFP untersucht.

4.4.5.1 Promotorstudien in Suspensionskultur

Die Untersuchung der Regulation der Promotoren PTight und PMnt wird für jede Bedingung im Triplikat durchgeführt. Je nach Ansatzvolumen wird die benötigte Anzahl an Sf21- Insektenzellen aus einer exponentiell wachsenden Kultur entnommen, bei 180 g für 8 min zentrifugiert, mit frischem Medium auf eine Lebendzelldichte von 7∙105 Zellen∙mL-1 eingestellt und in einen Erlenmeyerkolben mit 12 % Füllvolumen überführt. Zur Einstellung der gewünschten Kupfer- bzw. Doxycyclin-Konzentration wird das benötigte Volumen der jeweiligen Stocklösungen in den Kolben pipettiert und kurz resuspendiert. Die Infektion erfolgt durch Zugabe eines definierten Volumens des entsprechenden Virusstocks direkt in die Zellsuspension. Das benötigte Volumen an Virussuspension errechnet sich aus dem einzustellenden MOI, dem infektiösen Virustiter, der Lebendzelldichte und des Kulturvolumens. Nach der Infektion werden die Zellen bei 27 °C und 50 rpm im Schüttelinkubator kultiviert und zu den angegebenen Zeitpunkten beprobt. Abhängig vom Versuchsaufbau werden die Lebendzelldichte, Vitalität, eGFP- Fluoreszenz und -Ausbeute mittels Durchflusszytometrie sowie der Virustiter bestimmt.

4.4.5.2 Promotorstudien in 96-well Mikrotiterplatten Die Verwendung von 96-well Mikrotiterplatten ermöglicht im Vergleich zu Erlenmeyerkolben das gleichzeitige Testen mehrerer Bedingungen, wodurch der Probendurchsatz erheblich erhöht werden kann. Hierfür werden Sf21-Insektenzellen aus einer exponentiell wachsenden Kultur entnommen, bei 180 g für 8 min zentrifugiert und mit frischem Medium auf eine Lebendzelldichte von 3∙105 Zellen∙mL-1 eingestellt. Für jede zu testende Bedingung wird 1 mL der Zellsuspension in ein Reaktionsgefäß vorgelegt, die benötigte Menge an Doxycyclin- oder Kupfer-Lösung zugegeben und danach mit dem gewünschten Virus und MOI 5 infiziert. Vorversuche haben gezeigt, dass diese Zelldichte/MOI- Kombination in den 96-well Mikrotiterplatten die besten Bedingungen für eine Fluoreszenzmessung am PlateReader liefert. Nachdem die Proben homogenisiert worden sind, werden pro Bedingung vier wells á 200 µL mit Zellsuspension gefüllt und die Mikrotiterplatte bei 27 °C inkubiert. Im Gegensatz zum Erlenmeyerkolben adhärieren die Zellen am Boden der wells und lassen sich nur schwer wieder ablösen, weshalb größtenteils auf die Beprobung verzichtet wird und die Mikrotiterplatten täglich, wie in Kapitel 4.5.5.1 beschrieben, im PlateReader auf eGFP-Fluoreszenz hin untersucht werden.

50 4.4 Arbeiten mit Baculoviren

4.4.6 Interferenz-Test

Das in Kapitel 2.3.4 beschriebene Phänomen der Interferenz äußert sich in einer reduzierten Produktion des rekombinanten Proteins und einer verringerten Ausbeute an intakten Viren. Um den Einfluss defekter Viruspartikel auf die eGFP- und Virusproduktion in infizierten Sf21-Insektenzellen zu untersuchen, wird ein Interferenz-Test durchgeführt.

Hierzu werden Sf21-Insektenzellen mit dem Virusstock AcMNPV-DHTePt P7-6 infiziert, wobei drei verschiedene MOI (1, 5 und 10) eingestellt werden. Parallel dazu wird entweder eine von drei Verdünnungen (1:1, 2:3, 1:3) des Virusstock AcMNPV-DHTePt P15 oder das gleiche Volumen Medium zu den Zellen gegeben. Da der Virusstock AcMNPV- DHTePt P15 zu maximal 0,1 % aus intakten Viren besteht, variiert der Anteil an DIPs innerhalb der Ansätze mit gleicher MOI, während der Anteil intakter Viren nahezu identisch bleibt. Aus der Kombination der drei eingesetzten MOI mit den vier unterschiedlichen DIP-Zusätzen ergeben sich insgesamt zwölf mögliche Varianten, die in Tabelle 4.13 aufgeführt sind.

Tabelle 4.13: Übersicht über die zwölf Variationen aus MOI und DIP-Verdünnung zur Untersuchung der Auswirkungen der Interferenz mit dem Virus AcMNPV-DHTePt

DIP-Verdünnung (%(v/v) Virusstock P15 in Medium) 0 % 33 % 66 % 100 %

1 V1 V2 V3 V4

6)

- 5 V5 V6 V7 V8 MOI (P7 10 V9 V10 V11 V12 Zur Durchführung des Interferenz-Tests werden je Variation 50 µL Zellsuspension mit einer LZD von 3∙106 Zellen∙mL-1 mit dem Virus AcMNPV-DHTePt P7-6 und der angegebenen MOI infiziert, bevor 450 µL der DIP-Verdünnung aus dem Virusstock P15 zugegeben werden. Die Zellen wurden anschließend im Vierfachansatz in einer 96-well Mikrotiterplatte mit 100 µL Füllvolumen pro well bei 27 °C ungeschüttelt inkubiert. Nach zwei Stunden wird die Inkubation unterbrochen, um das alte Medium abzunehmen und durch je 100 µL frisches Medium zu ersetzen. Als Kontrolle werden nicht infizierte Zellen mitgeführt. Vom nächsten Tag an wird die eGFP-Fluoreszenz täglich am PlateReader, wie in Kapitel 4.5.5.1 erläutert, gemessen. Nach 70 h wird der Überstand aus den vier zusammengehörenden wells abgenommen, vereinigt und daraus der infektiöse Virustiter, wie in Kapitel 4.4.3 beschrieben, bestimmt. Um die Entwicklung der eGFP-Fluoreszenz weiter verfolgen zu können, werden in die wells wieder je 100 µL frisches Medium gegeben.

51 4 Methoden

4.5 Expressions-Analytik

Die Charakterisierung der in dieser Arbeit untersuchten Promotoren basiert hauptsächlich auf der Analyse der durch sie regulierten eGFP-Expression. Die eGFP-Expression kann hierbei entweder auf mRNA-Ebene mittels Reverse Transkription Polymerase- kettenreaktion (PCR) oder auf Proteinebene nachgewiesen werden. Zu den Proteinnachweisen zählen immunhistologische Verfahren wie Western Blot und ELISA sowie die Detektion der eGFP-Fluoreszenz am Durchflusszytometer oder PlateReader.

4.5.1 Reverse Transkription Polymerasekettenreaktion

Im Gegensatz zur normalen PCR wird bei der real-time Reverse Transcription PCR (rt-RT- PCR) die DNA-Amplifikation in Echtzeit (real-time) gemessen, wodurch auf die anfänglich in der Probe vorhandene Menge des zu untersuchenden DNA-Fragments geschlossen werden kann. Diese Methode wird deshalb zur relativen Quantifizierung der Expression von egfp und dem Tetracyclin-Transaktivator-Gen (tta), bezogen auf die 28S rRNA, als Referenzgen genutzt.

4.5.1.1 RNA-Extraktion und Reverse Transkription In der PCR kann nur DNA und nicht RNA als Template eingesetzt werden, weshalb die zu untersuchende RNA zuerst in cDNA umgeschrieben werden muss. Hierfür wird die RNA aus einer Probe von 2∙106 Zellen mit Hilfe des peqGOLD Total RNA Kits nach Herstellerangaben extrahiert und anschließend die RNA-Konzentration am NanoDrop bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessen. Die RNA-Lösung wird entweder bei -80 °C gelagert oder zur Weiterverwendung auf Eis gestellt. Da die RNA-Proben häufig noch mit genomischer DNA verunreinigt sind, die zu falschen Ergebnissen in der RT-PCR führt, wird als nächstes ein DNA-Verdau mit dem RapidOut DNA Removal Kit durchgeführt. Der Verdau und die anschließende Entfernung der DNase I erfolgen nach Herstellerangaben, wobei 2 µg RNA in einem Reaktionsvolumen von 20 µL eingesetzt werden. Zur Umschrift von 500 ng RNA in cDNA mit Hilfe des iScript cDNA Synthesis Kits werden oligo(dT)- und random hexamer-Primer in einem Gesamtvolumen von 20 µL eingesetzt. Die Reverse Transkription erfolgt nach Herstellerangaben.

52 4.5 Expressions-Analytik

4.5.1.2 Durchführung der real-time PCR

Die cDNA wird 1:100 mit H2ODEPC verdünnt, wovon 4 µL bzw. 1 ng für die PCR eingesetzt werden. Die Zusammensetzung eines Reaktionsansatzes ist in Tabelle 4.14 zu sehen.

Tabelle 4.14: Zusammensetzung der PCR-Ansätze zur Genexpressionsanalyse mittels rt-RT-PCR

Komponente Volumen Endkonzentration Supermix (2 x) 6,25 µL 1 x Forward Primer (5 µM) 0,625 µL 0,25 µM Reverse Primer (5 µM) 0,625 µL 0,25 µM

H2ODEPC 1 µL RNA Template 4 µL 0,08 ng∙µL-1 Summe 12,5 µL Zur Quantifizierung der eGFP-Expression werden die Primer 48-F und 48-R verwendet, die ein 118 bp langes DNA-Fragment erzeugen. Unter den untersuchten Referenzgenen (28S rRNA, Peptidyl Prolyl Isomerase A (ppi), Ribosomales Protein L14 (l14), Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (gapdh), Tubulin (tub)) ist die 28S rRNA die Einzige, die trotz der Infektion über die Zeit konstant exprimiert und deshalb als Referenzgen festgelegt wird (siehe Abbildung 9.5 im Anhang 9.1). Die Amplifikation der DNA-Fragmente erfolgt ebenfalls über das in Tabelle 4.11 dargestellte Temperaturprogramm.

Für jede Probe werden technische Duplikate gemessen und zwei no reverse transcription Kontrollen (NRT) mitgeführt, um den Anteil unverdauter genomischer DNA in der Probe zu überprüfen. Bei den NRTs wird statt cDNA 1 ng DNase I behandelte RNA in die PCR eingesetzt. Eine Differenz der Cq-Werte zwischen cDNA- und RNA-Probe von sieben oder mehr Zyklen bedeutet, dass die Verunreinigung mit genomischer DNA nicht ausreicht, um die Messung signifikant zu verfälschen. Ferner werden für jede Primerkombination zwei NTCs mitgeführt, um die Bildung von Primerdimeren zu überprüfen. Die Auswertung der Daten zur Bestimmung der Cq-Werte erfolgt mit der Software CFX Manager von Bio-Rad mittels Regression. Zur Normalisierung der Messwerte des Zielgens auf das Referenzgen und die Kontrolle wird die erweiterte ∆∆Cq-Methode unter Berücksichtigung der Effizienzen der unterschiedlichen Primerpaare angewandt. Mittels Formel 4.8 kann so die relative Expression R berechnet werden.

∆퐶푞푍푖푒푙푔푒푛(퐾표푛푡푟표푙푙푒−푃푟표푏푒) (1 + 퐸)푍푖푒푙푔푒푛 푅 (%) = ∙ 100 Formel 4.8 ∆퐶푞푅푒푓푒푟푒푛푧푔푒푛(퐾표푛푡푟표푙푙푒−푃푟표푏푒) (1 + 퐸)푅푒푓푒푟푒푛푧푔푒푛 mit R: relative Expression

E: Effizienz des jeweiligen Primerpaares

53 4 Methoden

4.5.2 Zelllyse

Um das intrazellulär gebildete eGFP analysieren zu können, müssen die Zellen lysiert werden. Hierfür werden 8∙105 Zellen bei 380 g für 10 min abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wird auf Eis gelagert und in 300 µL nativem Lysepuffer (s. Anhang Kapitel 9.14) resuspendiert. Die Zelllyse erfolgt für 30 min im eisgekühlten Ultraschallbad. Im Anschluss werden die Zellbruchstücke bei 16.000 g und 4 °C für 30 min abzentrifugiert und der eGFP-haltige Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und entweder weiterverwendet oder bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert.

4.5.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Mit Hilfe der SDS-PAGE können Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt und anhand eines mitgeführten Protein-Größenstandards identifiziert werden. Das mit dieser Methode untersuchte Protein eGFP besitzt ein Molekulargewicht von 27 kDa.

4.5.3.1 Herstellung der Gele Die verwendeten 1 mm dicken Mini-Polyacrylamid-Gele bestehen aus einem 12 % Trenn- und einem 5 % Sammelgel (s. Anhang Kapitel 9.14), die nach dem Gießen jeweils 30 min und anschließend bei 4 °C über Nacht auspolymerisieren.

4.5.3.2 Trennung der Proteine Die Proben werden, wie in Kapitel 4.5.2 beschrieben, lysiert und mit 5-fach konzentriertem Probenauftragspuffer versetzt. Die Denaturierung erfolgt für 10 min bei 95 °C und 350 rpm im Thermomixer. Das Gel wird mit je 10 µL Probe bzw. 6 µL eines geeigneten Protein-Größenstandards befüllt. Soll das Gel später für einen Western Blot eingesetzt werden, ist darauf zu achten, einen vorgefärbten Größenstandard zu verwenden. Der Lauf erfolgt in zwei Stufen bei 70 V für 15 min zur Sammlung und bei 120 V für weitere 90 min zur Trennung der Proteine. Die Zusammensetzung des verwendeten Laufpuffers ist in Kapitel 9.14 beschrieben. Im Anschluss kann das Gel entweder gefärbt oder für einen Western Blot eingesetzt werden.

4.5.3.3 Detektion der Proteine Um ein Diffundieren der Proteine im Gel zu verhindern, werden die Proteine über Nacht auf einem Wippschüttler in Fixierlösung inkubiert. Zur Visualisierung der Proteine wird das Gel im Anschluss in Coomassie-Blau-Lösung (s. Anhang Kapitel 9.14) für 30 min -

120 min gefärbt. Der Hintergrund des Gels wird durch Schwenken in H2Obidest wieder entfärbt und die Proteinbanden in der Dokumentations-Kammer mit der Software Image Lab und dem vorinstallierten Programm „Coomassie blue for protein gels“ detektiert.

54 4.5 Expressions-Analytik

4.5.4 Western Blot

Im Western Blot werden die Proteine nach der SDS-PAGE auf eine Nitrocellulosemembran übertragen und spezifisch durch die Bindung an Antikörper nachgewiesen.

4.5.4.1 Semi-Dry Elektroblotting Entsprechend der Größe des eingesetzten Polyacrylamidgels aus der SDS-PAGE werden die Nitrocellulosemembran sowie vier Stücke Whatman-Filter zurechtgeschnitten und in Transferpuffer (s. Anhang Kapitel 9.14) getränkt. Zwei der Filterstücke werden auf die Kathode des Blotting-Gerätes gelegt und darauf möglichst luftblasenfrei die Membran platziert. Der Reihe nach werden das Polyacrylamidgel und die anderen beiden Filterstücke sowie die Anode obenauf platziert und das Gerät verschlossen. Nach dem Blotting bei 2 mA∙cm-2 für 90 min wird über den mitgeführten vorgefärbten Größenstandard kontrolliert, ob die Proteine auf die Membran übertragen worden sind.

4.5.4.2 Immunodetektion Die Membran wird über Nacht bei 4 °C in Blocking-Puffer (s. Anhang Kapitel 9.14) inkubiert, der am nächsten Tag durch 10 mL einer 1:5000 in Blocking-Puffer verdünnten Anti-eGFP-HRP Antikörperlösung ersetzt wird. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Membran dreimal für 10 min mit Waschlösung gewaschen. Zur Detektion über Chemilumineszenz wird die Membran für 5 min in 5 mL Clarity™ Western ECL Substrat geschwenkt. Anschließend werden in der Dokumentationskammer von Bio- Rad im Modus „High Sensitivity“ zehn Bilder mit einem Abstand von je 60 s aufgenommen und summiert. Darüber wird zur Dokumentation des vorgefärbten Größenmarkers, mit Hilfe der Software Image Lab, eine Aufnahme des Gels im Modus „Colorimetric“ gelegt.

4.5.5 Fluoreszenzmessung am PlateReader

4.5.5.1 Intakte Zellen Die Messung der eGFP-Fluoreszenz von in 96-well Mikrotiterplatten kultivierten Insektenzellen zur Untersuchung der Promotoraktivität erfolgt nicht-invasiv im PlateReader bei 27 °C. Pro well werden 100 Messpunkte mit einem Abstand von 0,72 mm und 100 Blitzen pro Sekunde bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 509 nm aufgenommen. Aufgrund von auftretenden Randeffekten werden für die Auswertung der Daten nur die inneren 36 Messpunkte jedes wells verwendet. Um zwischen eGFP-positiven (eGFP+) und eGFP-negativen (eGFP-) Zellen unterscheiden zu können, muss anhand einer mitgeführten, nicht infizierten, Kontrollkultur zuerst ein Schwellenwert festgesetzt werden. Dieser wird definiert als derjenige Wert, oberhalb dessen noch zwei weitere Messwerte liegen.

55 4 Methoden

Dadurch wird verhindert, dass einzelne Ausreißer nach oben die Messung verfälschen. Als nächstes wird jeder Messwert der Proben mit dem Schwellenwert verglichen und für jedes well aus den Werten, die größer als der Schwellenwert und somit eGFP-positiv sind, der Mittelwert gebildet. Von diesem Mittelwert wird im nächsten Schritt der Mittelwert der Messwerte der nicht infizierten Kontrollkultur abgezogen und dadurch die bereinigte, relative Fluoreszenzintensität bestimmt.

Da die bereinigte, relative Fluoreszenzintensität nur die Fluoreszenzintensität der eGFP+- Messwerte innerhalb eines wells beschreibt, kann sie auch als bereinigte eGFP- -1 Produktion Pb mit der Einheit RFU∙Zelle betrachtet werden. Im Gegensatz dazu bezieht sich die durchschnittliche Fluoreszenzintensität bzw. eGFP-Produktion Pd auf alle Messwerte eines wells und wird über Formel 4.9 berechnet.

̅̅̅̅̅̅ ‑1 푒퐺퐹푃 − 푃푟표푑푢푘푡푖표푛 푃푑 (RFU∙Z ) = 퐹퐼푏 ∙ 퐴푛푡푒푖푙푒퐺퐹푃+ Formel 4.9 mit Pd: durchschnittliche eGFP-Produktion (PlateReader) -1 FIb: bereinigte, relative Fluoreszenzintensität (RFU∙Z ) + AnteileGFP+: prozentualer Anteil eGFP -Messwerte (%)

4.5.5.2 Zelllysat Bei der Messung der eGFP-Fluoreszenz lysierter Zellen kann aufgrund der Homogenität der Probe eine Quantifizierung des eGFP-Gehaltes der Probe durch eine Kalibriergerade durchgeführt werden. Hierzu wird die Probe, wie in Kapitel 4.5.2 beschrieben, lysiert und mit 0,9 % NaCl-Lösung je nach erwartetem eGFP-Gehalt 1:2 bis 1:10 verdünnt. In eine schwarze 96-well Mikrotiterplatte werden im Dreifachansatz pro Vertiefung 100 µL der verdünnten Probe pipettiert und die Fluoreszenzintensität am PlateReader bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 509 nm gemessen. Als Referenz bzw. zur Bestimmung der Autofluoreszenz wird eine Kontrolle, bestehend aus nicht infizierten Zellen und somit ohne eGFP, mitgeführt. Die Berechnung des eGFP-Gehalts pro Zelle erfolgt anschließend nach Formel 4.10.

푉퐹 ∙ (퐹퐼푃푟표푏푒 − 퐹퐼푅푒푓푒푟푒푛푧) 푉푍푒푙푙푙푦푠푎푡 푐(푒퐺퐹푃)(μg∙Zelle‑1) = ∙ Formel 4.10 23233 푁푍푒푙푙푒푛 mit VF: Verdünnungsfaktor FI: Fluoreszenzintensität (λ : 488 nm, λ : 509 nm) Ex Em VZelllysat: Gesamtvolumen des Zelllysats, (0,3 mL)

NZellen: Anzahl der lysierten Zellen

Soll statt dem eGFP-Gehalt pro Zelle die eGFP-Konzentration in der Zellsuspension ‑1 (µg∙mL ) berechnet werden, wird NZellen durch das entnommene Probenvolumen in mL ersetzt.

56 4.5 Expressions-Analytik

4.5.5.3 Erstellung der Kalibriergerade Zur Erstellung der Kalibrierung werden 8∙105 mit dem Virus AcMNPV-Pe infizierte Zellen, wie in Kapitel 4.5.2 beschrieben, lysiert und die eGFP-Konzentration des Zelllysats von 49 µg∙mL-1 mittels ELISA (s. Kapitel 0) bestimmt. Die Probe wird anschließend in den Verhältnissen 1:1 bis 1:320 mit 0,9 % NaCl-Lösung verdünnt, wovon je 100 µL pro well am PlateReader bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 509 nm gemessen werden. Daraus ergibt sich die in Abbildung 4.1 dargestellte Kalibrierkurve, die im Bereich 0 ‑ 5 µg∙mL-1 linear ist.

4,0

) 5 3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5 Fluoreszenzintensität ( RFU x10 RFU ( Fluoreszenzintensität 0,0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 eGFP-Konzentration (µg∙mL-1)

Abbildung 4.1: Kalibrierkurve zur Quantifizierung der eGFP-Konzentration in Zelllysaten mittels Fluoreszenzmessung am PlateReader Die eingezeichnete Kalibrierfunktion für den linearen Bereich ist in Formel 4.11 dargestellt. Anhand der Kalibrierfunktion für den linearen Bereich (siehe Formel 4.11) kann die eGFP- Konzentration in der gemessenen Lösung berechnet werden.

푉퐹 ∙ (퐹퐼푃푟표푏푒 − 퐹퐼푅푒푓푒푟푒푛푧) 푐(푒퐺퐹푃)(μg∙mL‑1) = Formel 4.11 23.233 mit VF: Verdünnungsfaktor

FI: Fluoreszenzintensität (λEx: 488 nm, λEm: 509 nm)

4.5.6 Durchflusszytometrie

In der Durchflusszytometrie werden einzelne Zellen anhand ihrer optischen Antwort auf Lichtquellen verschiedener monochromatischer Wellenlängen analysiert. In den Zellen enthaltene Chromophore wie 4',6-Diamidin-2-Phenylindol (DAPI) oder Fluoreszenz- proteine wie eGFP werden von Licht entsprechender Wellenlänge angeregt und emittieren ein Fluoreszenzsignal. Das Chromophor DAPI diffundiert schneller durch die beschädigte Zellmembran toter Zellen und interkaliert dort in die DNA, wodurch tote

57 4 Methoden

Zellen angefärbt und dadurch von Lebenden unterschieden werden können. Hierzu werden 400 µL Zellsuspension mit 0,25 mg∙L-1 DAPI für 3 min inkubiert und im Anschluss am CytoFLEX S von Beckman Coulter bei einer Flussrate von 60 µL∙min-1 50.000 events detektiert. Die verwendete Systemkonfiguration ist in Tabelle 4.15 zusammengestellt.

Tabelle 4.15: Verwendete Systemkonfiguration des CytoFLEX S

Chromophor/Fluoreszenzkanal Laser Filter eGFP 488 nm 525/40 nm BP DAPI 405 nm 450/45 nm BP APC 638 nm 660/20 nm BP Vor und nach der Analyse von Proben wird die Einstellung und Leistung der Laser durch die Referenzmessung von fluoreszierenden calibration beads überprüft. Die Auswertung der Daten erfolgt mit Hilfe der Software FlowJo. Im ersten Schritt wird in einem SSC-FSC- Plot über alle „Zellen“ gegated, um Zellbruchstücke oder andere Partikel von der weiteren Analyse auszuschließen.

Die Zellen werden daraufhin anhand ihrer DAPI-Färbung in einem Histogramm in lebende und tote Zellen unterteilt. Die lebenden Zellen werden weiter in eGFP+- und eGFP-- Zellen unterschieden. Hierzu werden die Fluoreszenzkanäle APC und eGFP übereinander aufgetragen und die Gates anhand einer mitgeführten Negativkontrolle aus nicht- infizierten Zellen gesetzt. Die Fluoreszenzintensitäten der eGFP-positiven, lebenden Zellen werden gemittelt und als bereinigte, relative Fluoreszenz oder bereinigte eGFP- -1 Produktion Db mit der Einheit RFU∙Zelle bezeichnet. Die bereinigte eGFP-Produktion Db wird zum Vergleich der eGFP-Expression infizierter Zellen im Rahmen der Charakterisierung der Promotoren herangezogen.

Um nicht nur die eGFP-Expression der eGFP+-Zellen, sondern die der gesamten Kultur betrachten zu können, wurde in Formel 4.12 die durchschnittliche eGFP-Produktion Dd definiert. Die eGFP-Produktion Dd berücksichtigt neben der Fluoreszenzintensität und dem Anteil eGFP+-Zellen auch die Vitalität der Kultur. Denn von ihr hängt nicht nur der Anteil lebendiger und somit potentiell produzierender Zellen ab, sondern auch die Qualität des hergestellten rekombinanten Proteins.

̅̅̅̅̅̅ ‑1 eGFP − 푃푟표푑푢푘푡푖표푛 퐷푑 (RFU∙Z ) = 퐹퐼푏 ∙ 퐴푛푡푒푖푙푒퐺퐹푃+ ∙ 푉 Formel 4.12 mit Dd: durchschnittliche eGFP-Produktion (Durchflusszytometer) -1 FIb: bereinigte, relative Fluoreszenzintensität (RFU∙Z ) + AnteileGFP+: prozentualer Anteil eGFP -Zellen (%) V: Vitalität der Zellkultur (%)

58 4.6 Kupfer-Analytik

4.5.7 Enzyme-linked immunosorbent Assay

Das von den mit dem Virus AcMNPV-Pe infizierten Insektenzellen produzierte eGFP wird über einen GFP Enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA) der Firma Cell Biolabs Inc. quantifiziert. Wie in Kapitel 4.5.2 beschrieben, werden hierfür 8∙105 Zellen lysiert und der Überstand 1:560.000 in 0,9 % NaCl-Lösung verdünnt. Die Durchführung des ELISA erfolgt nach Herstellerangaben, wobei zu jeder Messung eine Kalibriergerade aus mitgeliefertem GFP-Standard erstellt wird, die einen Bereich von 0 ‑ 2 ng∙mL-1 abdeckt und zur Berechnung der eGFP-Konzentration verwendet wird. Die für die Proben verwendete Kalibriergerade ist in Abbildung 4.2 dargestellt.

4,0

3,5

3,0

)

-

(

2,5 450 nm 2,0

1,5

Extinktion 1,0 y = 1,883x 0,5 R² = 0,992 0,0 0 0,5 1 1,5 2 eGFP-Konzentration (ng∙mL-1)

Abbildung 4.2: Kalibriergerade zur Berechnung der eGFP-Konzentration von ELISA-Proben

4.6 Kupfer-Analytik

Die Messung der Kupferionen-Konzentration in Zelllysaten und Medium erfolgt durch das Bayreuther Zentrum für Ökologie und Umweltforschung (BayCEER). Medienproben werden unbehandelt an BayCEER gesendet, wohingegen Zellproben vorab lysiert werden müssen. Hierzu werden 107 Sf21-Insektenzellen bei 180 g für 8 min abzentrifugiert, in 10 mL PBS pH 7,4 gewaschen und ein weiteres Mal bei 500 g für 8 min zentrifugiert. Das

Zellpellet wird anschließend in 10 mL H2Obidest resuspendiert und die Zellen durch Zugabe von 1 mL Salpetersäure lysiert. Die weitere Bearbeitung und Messung der Zelllysate sowie der Medienproben wird von BayCEER durchgeführt. Die erhaltenen Kupferionen- Konzentrationen beziehen sich auf das Zelllysat und müssen noch in die intrazelluläre Kupferionen-Konzentration umgerechnet werden.

59 4 Methoden

Hierzu wird zuerst das Zellvolumen mit Formel 4.13 unter der Annahme eines durchschnittlichen Zelldurchmessers von 18 µm berechnet. Die intrazelluläre Kupferionen-Konzentration ergibt sich dann aus Formel 4.14.

4 푉 (L) = 푁 ∙ ∙ 휋 ∙ 푟3 Formel 4.13 푍푒푙푙푒푛 푍푒푙푙푒푛 3 푍푒푙푙푒 mit VZellen: Volumen des Zellpellets 7 NZellen: Anzahl der eingesetzten Zellen, (10 Zellen)

rZelle: Durchschnittlicher Zellradius, (9 µm)

푐퐶푢 ∙ 푉푃푟표푏푒 푐퐶푢,푖푛푡푟푧푒푙푙푢푙ä푟(µM) = Formel 4.14 푉푍푒푙푙푒푛 mit cCu, intrazellulär: intrazelluläre Kupferionen-Konzentration

cCu: Kupferionen-Konzentration in der Probe (µM)

VProbe: Volumen der Probe (L)

60

5 Ergebnisse

5.1 Molekularbiologische Arbeiten

Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die zur Herstellung der rekombinanten Baculoviren benötigten Bacmide konstruiert und kloniert. Hierzu wurden für die Konstrukte mit dem

Polyhedrin-Promotor (Ppolh), dem Metallothionein-Promotor (Pmtn) sowie für das Tet-Off

System (PTight) zuerst die entsprechenden Transfervektoren erstellt und mit deren Hilfe anschließend die rekombinanten Bacmide. Die Namen der Transfervektoren beginnen mit p während Bacmide mit einem b gekennzeichnet werden. Die den folgenden Ergebnissen zu Grunde liegenden Klonierungspläne sind im Anhang in Kapitel 9.4 dargestellt. Die Plasmidkarten befinden sich im Anhang in Kapitel 9.2.

5.1.1 Herstellung des Kontroll-Standard Bacmids bPpolhegfp

Im Bacmid bPpolhegfp wird die Expression des egfp Gens durch den Polyhedrin-Promotor kontrolliert, der aufgrund seiner Stärke den Standard-Expressions-Promotor im BEVS darstellt. Das aus diesem Bacmid hergestellte Virus AcMNPV-Pe dient daher als Kontrolle für die Maximalexpression.

Die egfp-Sequenz wurde für Sf21-Insektenzellen Codon-optimiert (siehe Kapitel 9.3), bei Geneart bestellt und in Form des Plasmids pMA-T-egfp geliefert. Der Transfervektor zur

Herstellung des Bacmids bPpolhegfp war das Plasmid pPpolhegfp, das durch Insertion von egfp in das Plasmid pFastBac1 (p) generiert wurde. Hierzu wurden die Plasmide pFastBac1 und pMA-T-egfp durch eine Retransformation in E. coli DH5α amplifiziert, mittels Alkalischer Lyse aufgereinigt und durch eine Kontrollrestriktion überprüft. Das zugehörige Agarosegel ist in Abbildung 5.1 gezeigt.

Sowohl das linearisierte Plasmid pFastBac1 in den Spuren 1 + 2, als auch die DNA- Fragmente des pMA-T-egfp in den Spuren 4 ‑ 7 zeigen die erwarteten Banden bei 4.775 bp bzw. 2.380 bp und 726 bp.

61 5 Ergebnisse

Abbildung 5.1: Nachweis der Plasmidintegrität der Ausgangsplasmide pFastBac1 und pMA‑T‑egfp Agarosegel der Kontrollrestriktion des Plasmids pFastBac1 mit dem Restriktionsenzym BamHI und des Plasmids pMA‑T‑egfp mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI. Spuren 1 + 2: pFastBac1 (BamHI, linearisiert), erwartete Fragmentgröße 4.775 bp; Spur 3: 1 kb DNA-Größenstandard; Spuren 4 - 7: pMA-T-egfp (BamHI + XbaI), erwartete Fragmentgrößen: 726 bp, 2.380 bp. Nachdem die Plasmide positiv überprüft worden sind, wurden sie zur Vorbereitung auf die Ligation mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI behandelt. Das Vektorrückgrat pFastBac1 wurde anschließend dephosphoryliert, wohingegen die egfp-DNA über eine Agarose-Gelelektrophorese abgetrennt wurde. Für die Ligation zum Transfervektor pPpolhegfp wurde ein Vektor zu Insert Verhältnis von 1:5 verwendet. Nach der Transformation ergaben sich über 100 Kolonien für den ligierten Transfervektor pPpolhegfp und keine Kolonien für die Negativkontrolle. Sechs Kolonien wurden gepickt, vermehrt, die Plasmid-DNA mittels Alkalischer Lyse extrahiert und einer Kontrollrestriktion unterzogen, deren Ergebnis in Abbildung 5.2 dargestellt ist.

Abbildung 5.2: Integrationsnachweis des Zielgens egfp im Ligationsprodukt pPpolhegfp Agarosegel der Kontrollrestriktion des Plasmids pPpolhegfp mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI. Spur 1: 1 kb DNA-Größenstandard; Spuren 2 - 7: pPpolhegfp (BamHI + XbaI), Klone 1 - 6, erwartete Fragmentgrößen: 726 bp, 4.710 bp. In den Gelspuren 2, 3, 4, 6 und 7 sind die erwarteten DNA-Fragmente bei 4.710 bp und 726 bp zu erkennen, Klon 4 in Spur 5 hingegen zeigt eine etwas niedrigere Bande des Vektorrückgrats. Das Plasmid aus Klon 1 wurde ausgewählt, sequenziert und für die

Transformation in E. coli DH10Bac™ Zellen zur Transposition des Ppolhegfp-Genkonstrukts ins Bacmid verwendet.

62 5.1 Molekularbiologische Arbeiten

Die Transformation ergab sechs weiße Kolonien, die gepickt und über Nacht vermehrt wurden, um anschließend die Bacmid-DNA zu isolieren. Im Anschluss wurde eine Kontroll- PCR durchgeführt, die die im Agarosegel in Abbildung 5.3 gezeigten, ca. 3.000 bp langen, DNA-Fragmente ergab.

Abbildung 5.3: Integrationsnachweis des Zielkonstruktes Ppolhegfp im Bacmid bPpolhegfp Agarosegel der Kontroll-PCR des Bacmids bPpolhegfp mit den pUC/M13 Primern. Spur 1: 1 kb DNA- Größenstandard; Spuren 2 - 7: bPpolhegfp (pUC/M13 Primer), Klone 1 - 6, erwartete Fragmentgröße: ca. 3.020 bp; Spur 8: NTC. In der 2. und 3. Spur in Abbildung 5.3 sind keine Banden der erwarteten Fragmentgröße von 3.020 bp zu erkennen und die entsprechende Bande in Spur 4 ist sehr schwach. Hingegen ist die Bande bei ca. 3.000 bp in den Spuren 5 ‑ 7 deutlich sichtbar. Zur Herstellung des Virus wurde das Bacmid aus Klon 4 für die Transfektion in Sf21- Insektenzellen verwendet.

5.1.2 Herstellung des Metallothionein-Promotor Bacmids bPmtnegfp

Das Bacmid bPmtnegfp enthält das eGFP-Gen unter Kontrolle des durch Kupferionen induzierbaren Promotors Pmtn. Das aus diesem Bacmid hergestellte Virus AcMNPV-Me wird zur Untersuchung der Promotoraktivität des Pmtn durch Bestimmung der kupferabhängigen egfp-Expression eingesetzt.

5.1.2.1 Klonierung des Transfervektors pPmtnegfp Wie aus dem Klonierungsplan in Abbildung 9.15 hervorgeht, erfolgt die Herstellung des pPmtnegfp in drei Schritten. Zuerst wird durch Entfernen des Ppolh aus dem Plasmid pFastBac1 das Vektorrückgrat vorbereitet. Für das Insert wird egfp aus dem Plasmid pMA-

T-egfp in das Plasmid pGEM-Pmtn hinter den Pmtn kloniert und das Pmtnegfp-Konstrukt anschließend mittels PCR amplifiziert. Zuletzt erfolgt die Ligation des Pmtnegfp-

Konstruktes in das vorbereitete Vektorrückgrat p∆Ppolh.

63 5 Ergebnisse

Bereitstellung des Vektorrückgrats p∆Ppolh

Das zum Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System gehörende Plasmid pFastBac1, diente als Transfervektor, um nach dem Austausch des Ppolh durch den Pmtn und das eGFP- Gen eben diese Gene in das Bacmid zu übertragen.

Der Vektor pFastBac1 wurde mit den Restriktionsenzymen BstZ17I und XbaI geschnitten und das 220 bp große Ppolh-Fragment vom Vektorrückgrat mittels Agarose- Gelelektrophorese getrennt. Das Agarosegel in Abbildung 5.4 zeigt die gewünschten Banden bei 4.555 bp, aus denen die DNA isoliert wurde.

Abbildung 5.4: Trennung des pFastBac1 Rückgrats vom Ppolh-Fragment Agarosegel der Restriktion des Plasmids pFastBac1 mit den Restriktionsenzymen BstZ17I und XbaI. Spur 1: 1 kb DNA-Größenstandard; Spuren 2 + 3: pFastBac1 (BstZ17I + XbaI), erwartete Fragmentgrößen: 220 bp, 4.555 bp. Bevor das geschnittene Plasmid für eine Ligation eingesetzt werden konnte, wurden die Schnittstellen noch dephosphoryliert.

Bereitstellung des Inserts Pmtnegfp

Für das Insert, bestehend aus dem Pmtn und egfp, wurde die Codon-optimierte egfp-

Sequenz (siehe Kapitel 9.3) aus dem Plasmids pMA‑T‑egfp verwendet. Der Pmtn befand sich auf dem Plasmid pGEM-Pmtn, in welches das eGFP-Gen mittels der Restriktionsschnittstellen BamHI und XbaI downstream des Promotors eingebracht wurde. Die Ligation erfolgte in vier verschiedenen Vektor zu Insert Verhältnissen von 1:1, 1:3, 1:5 und 1:7. Nach der Transformation der Ligationsansätze wurden sechs Klone für eine Kontrollrestriktion ausgewählt, von denen, wie in Abbildung 5.5 zu sehen ist, vier Klone in den Gelspuren 8 ‑ 11 die erwarteten Banden bei 1.610 bp und 4.726 bp zeigen.

64 5.1 Molekularbiologische Arbeiten

Abbildung 5.5: Integrationsnachweis des Zielgens egfp im Ligationsprodukt pGEM-Pmtnegfp Agarosegel der Kontrollrestriktion des Plasmids pGEM-Pmtnegfp mit den Restriktionsenzymen EcoRV und PstI. Spur 1: 1 kb DNA-Größenstandard; Spuren 2 - 7: pGEM-Pmtnegfp (unbehandelt),

Klone 1 - 6; Spuren 8 ‑ 13: pGEM-Pmtnegfp (EcoRV + PstI), Klone 1 - 6, erwartete Fragmentgrößen: 1.610 bp, 4.726 bp; Spur 14: Mastermix ohne Plasmid.

Die korrekte Sequenz des aus Klon 2 isolierten Plasmids pGEM-Pmtnegfp wurde mittels Sanger-Sequenzierung bestätigt.

Für die Herstellung des Plasmids pPmtnegfp wurde das DNA-Fragment Pmtnegfp inklusive der 5‘ XbaI Schnittstelle mit den Primern 38-F und 47-R mittels PCR aus dem Plasmid pGEM-Pmtnegfp amplifiziert und dabei einseitig die Restriktionsschnittstelle BstZ17I angehängt. In Abbildung 5.6 ist das Agarosegel der PCR für verschiedene Temperaturen zu sehen.

Abbildung 5.6: Nachweis der Amplifikation des Zielkonstruktes Pmtnegfp aus dem Plasmid pGEM-Pmtnegfp Agarosegel der PCR mit den Primern 38-F und 47-R bei einem Temperaturgradienten von 55 °C bis

70 °C. Spuren 1 + 14: 100 bp DNA-Größenstandard; Spuren 2 - 13: pGEM-Pmtnegfp (38-F + 47-R), erwartete Fragmentgröße: 1.259 bp. Die erwartete Bande bei 1.259 bp ist in jeder Spur vorhanden, jedoch befinden sich nur in den Gelspuren 10 und 11 bei 65,9 °C und 67,2 °C keine weiteren Banden. Aus diesem Grund wurde die DNA aus diesen PCR Ansätzen mit den Restriktionsenzymen BstZ17I und XbaI behandelt und anschließend zur Entfernung der zum Teil nicht hitzeinaktivierbaren

Enzyme aufgereinigt. Das Insert Pmtnegfp war daraufhin bereit zur Ligation.

65 5 Ergebnisse

Ligation Pmtnegfp in p1∆Ppolh

Bei der Ligation wurden drei verschiedene Verhältnisse von Insert zu Vektor eingesetzt (3:1, 4:1 und 5:1) und insgesamt 15 Klone gepickt, vermehrt und die Plasmide extrahiert. Alle Plasmide wurden mittels zweier unabhängiger Kontrollrestriktionen auf die Anwesenheit des Inserts überprüft. Die Ergebnisse sind in Abbildung 5.7 zu sehen.

Abbildung 5.7: Integrationsnachweis des Zielkonstruktes Pmtnegfp im Ligationsprodukt pPmtnegfp Oben: Agarosegel der Kontrollrestriktion des Plasmids pPmtnegfp mit dem Restriktionsenzym XbaI. Spuren 1 + 17: 1 kb DNA-Größenstandard; Spuren 2 - 16: pPmtnegfp (XbaI, linearisiert), Klone 1 ‑ 15, erwartete Fragmentgröße: 5.779 bp.

Unten: Agarosegel der Kontrollrestriktion des Plasmids pPmtnegfp mit dem Restriktionsenzym BglI.

Spuren 1 + 17: 1 kb DNA-Größenstandard; Spuren 2 - 16: pPmtnegfp (BglI), Klone 1 ‑ 15, erwartete Fragmentgrößen: 1.268, 2.003, 2.508 bp. Aus allen Plasmiden, die die erwarteten Fragmentgrößen zeigen, wurde das Plasmid pPmtnegfp aus Klon 5 ausgewählt und die korrekte Insertion des Pmtn sowie des eGFP-Gens durch Sequenzierung bestätigt.

5.1.2.2 Herstellung des Bacmids bPmtnegfp

Die Herstellung des Bacmids bPmtnegfp erfolgte durch Transformation des Transfervektors pPmtnegfp (Klon 5) in E. coli DH10Bac™ Zellen. Es wurden zehn weiße Kolonien gepickt, vermehrt und die Bacmide isoliert. Durch eine Kontroll-PCR wurde die Integration des gewünschten Genabschnitts überprüft. Da der forward Primer im Bacmid bPmtnegfp nicht nur im Bacmidrückgrat, sondern auch im Insert bindet, wurden zwei DNA-Fragmente erwartet. Auf dem Agarosegel in Abbildung 5.8 sind die Ergebnisse der PCR für alle zehn Klone zu sehen. Die erwarteten Banden bei 1.831 bp und 3.364 bp sind bis auf bei Klon 8

66 5.1 Molekularbiologische Arbeiten bei allen Klonen deutlich zu erkennen. Allerdings existieren auch noch zwei weitere Banden bei ca. 2.600 bp und knapp unterhalb von 8.000 bp, weshalb die PCR wiederholt wurde. Das Ergebnis war aber identisch und ist hier nicht dargestellt.

Abbildung 5.8: Integrationsnachweis des Zielkonstruktes Pmtnegfp im Bacmid bPmtnegfp Agarosegel der Kontroll-PCR des Bacmids bPmtnegfp mit den pUC/M13 Primern. Spur 1: 1 kb DNA- Größenstandard; Spuren 2 - 11: bPmtnegfp (pUC/M13 Primer), Klone 1 - 10, erwartete Fragmentgrößen: ca. 1.831 bp, ca. 3.364 bp; Spur 12: NTC. Obwohl eine Sanger-Sequenzierung aufgrund der Größe der Bacmide von 136 kb nicht erfolgreich war, wurden die Bacmide bPmtnegfp aus Klon 2 und 4 für die Virus-Herstellung verwendet.

5.1.3 Herstellung der Bacmide bDHPTightegfp und bDHPTightegfp-Ppolhtta mit dem Tet-Off System (PTight)

Das Bacmid bDHPTightegfp-Ppolhtta wurde aus dem Transfervektor pDHPTightegfp-Ppolhtta hergestellt, dessen Plasmidkarte in Kapitel 9.2.8 dargestellt ist. Das Plasmid pDHPTightegfp-

Ppolhtta basiert auf dem Transfervektor pFastBacDual (pD), in dem der p10-Promotor durch ein Konstrukt, bestehend aus dem Promotor PTight, dem eGFP-Gen und einem SV40 poly(A) Signal, flankiert von HS4 core insulator Sequenzen, ersetzt wurde. Die

Isolatorsequenzen wurden eingefügt, um eine ungewollte Aktivierung des PTight durch den starken Ppolh oder sonstige, auf dem Bacmid vorhandene, enhancer-Sequenzen zu verhindern. Die HS4 core insulator Sequenzen enthalten repetitive Elemente, die zur Ausbildung loop-förmiger Sekundärstrukturen der DNA und dadurch zu einer Trennung der Promotoren Pmtn und Ppolh führen. Downstream des Ppolh wurde das Gen für den

Tetracyclin-Transaktivator (tta) integriert. Dem Transfervektor pDHPTightegfp zur

Herstellung des Bacmids bDHPTightegfp und somit des Virus AcMNPV-DHTe fehlt das tTA- Gen, wodurch der Promotor nicht aktiviert werden kann und dieses Konstrukt als

Kontrolle für die Basalaktivität des Promotors PTight dient. Das Virus mit dem vollständigen Konstrukt wird als AcMNPV-DHTePt bezeichnet und zur Untersuchung der Doxycyclin- abhängigen egfp-Expression verwendet.

67 5 Ergebnisse

5.1.3.1 Herstellung des Bacmids bDHPTightegfp

Das Plasmid pDHPTightegfp wurde bei GeneArt bestellt und nach der Lieferung durch eine Retransformation in E. coli SURE Zellen amplifiziert. Die extrahierte Plasmid-DNA wurde einer Kontrollrestriktion unterzogen, die die für das Plasmid pDHPTightegfp erwarteten DNA-Fragmente der Größe 1.268, 2.508 und 3.858 bp lieferte, siehe Abbildung 5.9.

Abbildung 5.9: Nachweis der Plasmidintegrität des Ausgangsplasmids pDHPTightegfp Agarosegel der Kontrollrestriktion des Plasmids pDHPTightegfp mit dem Restriktionsenzym BglI.

Spuren 1, 8, 15: 1 kb DNA-Größenstandard; Spuren 2 ‑ 7: pDHPTightegfp (unbehandelt), Klone 1 - 6;

Spuren 9 ‑ 14: pDHPTightegfp (BglI), Klone 1 - 6, erwartete Fragmentgrößen: 1.268, 2.508, 3.858 bp. Für die Sequenzierung und Transformation in E. coli DH10Bac™ Zellen wurde Klon pDHPTightegfp 5 ausgewählt. Es wurden zehn weiße Kolonien gepickt, vermehrt und die Bacmid-DNA isoliert, mit der eine Kontroll-PCR durchgeführt wurde, deren Ergebnisse in Abbildung 5.10 dargestellt sind.

Abbildung 5.10: Integrationsnachweis des Zielkonstruktes HS4-PTightegfp-HS4 im Bacmid bDHPTightegfp Agarosegel der Kontroll-PCR des Bacmids bDHPTightegfp mit den pUC/M13 Primern. Spuren 1 + 12: 1 kb DNA-Größenstandard; Spuren 2 - 11: bDHPTightegfp (pUC/M13 Primer), Klone 1 - 10, erwartete Fragmentgröße: ca. 4.965 bp; Spur 13: NTC. Da keiner der Klone eine einzelne Bande bei ca. 5.000 bp zeigt, wurden die Bacmide bDHPTightegfp aus den Klonen 1, 4 und 5 für die Transfektion in Sf21-Insektenzellen verwendet und das Bacmid aus Klon 1 zusätzlich zum Sequenzieren geschickt. Leider war eine Sequenzierung aufgrund der Größe des Bacmids wieder nicht erfolgreich.

68 5.1 Molekularbiologische Arbeiten

5.1.3.2 Herstellung des Bacmids bDHPTightegfp-Ppolhtta

Das Plasmid pDHPTightegfp-Ppolhtta wurde bei GeneArt bestellt und nach der Lieferung durch eine Retransformation in E. coli SURE Zellen amplifiziert. Die, mittels der

Retransformation in E. coli SURE Zellen gewonnenen, Klone des Plasmids pDHPTightegfp-

Ppolhtta wurden einer Kontrollrestriktion unterzogen und zeigten, wie in Abbildung 5.11 zu sehen ist, die erwarteten DNA-Fragmente der Größe 1.268, 2.508 und 4.623 bp. Zusätzliche Banden stammen von ungeschnittenem Plasmid.

Abbildung 5.11: Nachweis der Plasmidintegrität des Ausgangsplasmids pDHPTightegfp-Ppolhtta Agarosegel der Kontrollrestriktion des Plasmids pDHPTightegfp-Ppolhtta mit dem Restriktionsenzym

BglI. Spuren 1 + 9 + 16: 1 kb DNA-Größenstandard; Spuren 2 ‑ 8 und 10 ‑ 14: pDHPTightegfp-Ppolhtta

(BglI), Klone 1 ‑ 12, erwartete Fragmentgrößen: 1.268, 2.508, 4.623 bp; Spur 15: pDHPTightegfp (BglI), erwartete Fragmentgrößen: 1.268, 2.508, 3.858 bp; Spur 17: Mastermix ohne Plasmid.

Zur Herstellung des Bacmids bDHPTightegfp-Ppolhtta mittels Transformation des

Transfervektors pDHPTightegfp-Ppolhtta in E. coli DH10Bac™ Zellen wurde Klon 9 verwendet. Es wurden zwölf Kolonien gepickt, vermehrt, die Bacmid-DNA extrahiert und mittels PCR auf die Integration des Inserts überprüft. Das zugehörige Agarosegel ist in Abbildung 5.12 dargestellt und zeigt bei allen Klonen, außer Klon 6, eine Bande bei 300 bp, was dem leeren Bacmid ohne Insert entspricht.

Abbildung 5.12: Integrationsnachweis des Zielkonstruktes HS4-PTightegfp-HS4-Ppolhtta im Bacmid bDHPTightegfp-Ppolhtta Agarosegel der Kontroll-PCR des Bacmids bDHPTightegfp-Ppolhtta mit den pUC/M13 Primern. Spuren 1 + 8: 1 kb DNA-Größenstandard; Spuren 2 - 7 und 9 - 14: bDHPTightegfp-Ppolhtta (pUC/M13 Primer), Klone 1 - 12, erwartete Fragmentgröße: ca. 5.330 bp; Spur 15: NTC.

69 5 Ergebnisse

Da Klon 6 der einzige Klon mit einem rekombinanten Bacmid war, wurde er für die Transfektion in Sf21-Insektenzellen ausgewählt.

5.2 Zellkultur

5.2.1 Adaption der Zellen an Kupfersulfat

Die Regulation des Metallothionein-Promotors Pmtn erfolgt durch Kupferionen, die entweder durch Zugabe von Kupferchlorid (CuCl2) oder Kupfersulfat (CuSO4) bereitgestellt werden. Aus Vorversuchen war bekannt, dass eine Kupferionen-Konzentration von 500 µM bereits nach 22 h zu einer Reduktion um 25 % und eine Konzentration von 1.000 µM zu einer Reduktion um 50 % der Zellaktivität von Sf21-Insektenzellen führt, unabhängig vom eingesetzten Kupfersalz. Zur Aktivierung des Pmtn in anderen Expressionssystemen wird häufig eine Konzentration von ca. 500 µM Cu2+ eingesetzt (siehe Kapitel 2.4.1), weshalb die Sf21-Insektenzellen vorab an diese Kupferkonzentration adaptiert werden sollten. Hierzu wurden die Zellen, wie in Kapitel 4.3.3 beschrieben, über einen Zeitraum von drei Wochen kultiviert, mit dem Unterschied, dass dem Medium

500 µM CuSO4 zugesetzt wurden. Die LZD und Vitalität der im Triplikat geführten Kulturen wurden alle 2 - 3 Tage bestimmt und mit denen der drei Kontrollkulturen ohne Kupfer verglichen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 5.13 veranschaulicht.

1E+7107 100

90

---

)

1 80

-

mL 70

∙ .... 60 6 1E+610 50

40 Vitalität (%) Vitalität 30 0 µM CuSO 20 Lebendzelldichte (Z Lebendzelldichte LZD 0 µM 4

10 500LZD 500µM CuSOµM 4 1E+5105 0 0 5 10 15 20 Prozesszeit (d)

Abbildung 5.13: Adaption von Sf21-Insektenzellen an CuSO4 Zeitlicher Verlauf der LZD und Vitalität von Sf21-Insektenzellen, die entweder in Medium mit

500 µM CuSO4 oder in Kupfer-freiem Medium (Kontrolle) kultiviert wurden. In Abbildung 5.13 ist zu erkennen, dass die Zellen die ohne Kupfer kultiviert wurden zwar höhere LZD erreichen, sich in der Vitalität allerdings kaum von den Zellen auf Kupfer

70 5.2 Zellkultur unterscheiden. In der ersten Kultivierungswoche liegt die ermittelte LZD der Zellen auf Kupfer im Schnitt 31 ± 14 %, in der zweiten Woche noch 19 ± 3 % und in der dritten Woche nur noch 1 ± 18 % unterhalb der Kontrolle. Somit nähert sich die LZD der Zellen auf 500 µM CuSO4 über die Kultivierungsdauer von 21 Tagen an die LZD der Kontrolle an.

5.2.2 Kupfer-Toxizitätstest

5.2.2.1 Adaptierte Sf21-Insektenzellen (500 µM CuSO4)

Die in Kapitel 5.2.1 beschriebenen, an 500 µM CuSO4 adaptierten, Sf21-Insektenzellen wurden einem Kupfer-Toxizitätstest unterzogen, um herauszufinden, ob sich ihre erhöhte Toleranz gegenüber Kupferionen auch bei Kupferkonzentrationen oberhalb von 500 µM positiv auf Zellwachstum und Vitalität auswirkt. Zwar werden zur Aktivierung des Pmtn häufig Kupferkonzentrationen im Bereich von 500 µM verwendet (siehe Kapitel 2.4.1), es ist aber nicht ausgeschlossen, dass im Baculovirus-Insektenzell-Expressionssystem höhere Konzentrationen benötigt werden. Der Kupfer-Toxizitätstest wurde, wie in Kapitel 4.3.5.1 erläutert, in Triplikaten durchgeführt, wobei die getesteten Konzentrationen in einem

Bereich von 200 µM ‑ 1.000 µM CUSO4 mit einem Abstand von je 200 µM lagen. Als weitere und höchste Konzentration wurden 2.000 µM eingesetzt. Die Kolben wurden täglich beprobt und LZD und Vitalität bestimmt, die in Abbildung 5.14 über die Kultivierungsdauer von 4 Tagen aufgetragen sind.

1E+8108 100 0Stammhaltung µM CuSO4

90 200200 µM µM CuSO4

---

) 80 400400 µM µM CuSO 1 4 -

7

mL 1E+710 70 600600 µM µM CuSO ∙ .... 4

60 800800 µM µM CuSO4

50 1.0001000 µM CuSO4

40 2.0002000 µM CuSO 1E+6106 (%) Vitalität 4 30

Lebendzelldichte (Z Lebendzelldichte 20 10 1E+5105 0 0 24 48 72 96 Prozesszeit (d)

Abbildung 5.14: Kupfer-Toxizitätstest mit adaptierten Sf21-Insektenzellen

Zeitlicher Verlauf der LZD und Vitalität von bereits an 500 µM CuSO4 adaptierten Sf21- Insektenzellen, die bei verschiedenen CuSO4 -Konzentrationen im Bereich von 0 µM (Kontrolle) bis 2.000 µM kultiviert wurden.

71 5 Ergebnisse

Die Verläufe der LZD und Vitalität der Sf21-Insektenzellkulturen auf 200 µM bis 600 µM

CuSO4 entsprechen in etwa dem der Kontrollkultur ohne CuSO4. Die LZD weicht über die Kultivierungszeit durchschnittlich um 7 % und maximal um 31 % von der Kontrolle ab, während bei der Vitalität eine maximale Abweichung von 5 % gemessen wurde.

Im Gegensatz dazu ist bei den Kulturen mit 800 µM und 1.000 µM bereits ein Einfluss des

CuSO4 auf das Zellwachstum, nicht jedoch auf die Vitalität, feststellbar. An Tag 3 wird dies besonders deutlich, da die Zellen auf 800 µM bzw. 1.000 µM nur ca. 60 % der LZD der Kontrolle erreichen. Ein starker Einfluss auf Wachstum und Vitalität der Zellen ist nur bei einer CuSO4-Konzentration von 2.000 µM zu erkennen. Hier sinkt die Vitalität bereits nach einem Tag auf unter 50 % ab, einhergehend mit einer Reduktion der LZD von 7∙105 Zellen∙mL-1 auf 3,7∙105 Zellen∙mL-1.

Durch die Adaption der Zellen an 500 µM CuSO4 wachsen die Sf21-Insektenzellen bis zu einer CuSO4-Konzentration von 600 µM ohne Beeinträchtigungen. Eine erhöhte Resistenz gegenüber Kupferionen ist bei höheren Konzentrationen allerdings nicht gegeben.

5.2.2.2 Nicht adaptierte Zellen Bei der kontinuierlichen Passage von Zellkulturen kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Zellen sich mit der Passagenzahl, durch beispielsweise Mutationen, verändern, wovon auch ihre Toleranz gegenüber Kupfersalzen betroffen sein könnte. Aus diesem Grund wurde ein weiterer Kupfer-Toxizitätstest an nicht adaptierten Zellen durchgeführt. Die Durchführung erfolgte hierbei wie in Kapitel 4.3.5.2 beschrieben, wobei der Einfluss von

0 ‑ 2.000 µM CuCl2 auf die Zellaktivität nicht infizierter und mit dem Virus AcMNPV-Me P4 infizierter Sf21-Insektenzellen bestimmt wurde. Die Ergebnisse des MTT-Tests sind in Abbildung 5.15 dargestellt.

In Abbildung 5.15 ist zu erkennen, dass bei nicht infizierten Zellen bereits eine Cu2+- Konzentration von 400 µM zu einer Reduktion der Zellaktivität um 50 % führt. Bei infizierten Zellen wird dieser Wert erst durch Zugabe von 700 µM CuCl2 erreicht. Die Zellaktivität sinkt bei steigender Kupferionen-Konzentration weiter ab, bis sie bei

2.000 µM CuCl2 einen Wert von 25 % annimmt, was dem 1,8-Fachen des Blindwertes entspricht.

72 5.2 Zellkultur

1,0

n. inf.

)

- (

AcMNPV-Me 0,8

Blindumsatz 570 nm

0,6

0,4

0,2 Normierte Extinktion Normierte

0,0 0 500 1.000 1.500 2.000 CuCl -Konzentration (µM) 2 Abbildung 5.15: Kupfer-Toxizitätstest mit infizierten und nicht-infizierten Sf21-Insektenzellen Abhängigkeit der mittels MTT-Test gemessenen normierten Extinktion als Maß der Stoffwechselaktivität infizierter und nicht-infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me P4, MOI 5) von der im Kulturmedium eingestellten CuCl2-Konzentration nach 24-stündiger Inkubation. Die Normierung erfolgte jeweils auf die mitgeführten Kontrollen ohne Kupfer. Die durchgezogene Linie stellt den zellunabhängigen Blindumsatz dar. Im Gegensatz zu den Vorversuchen, ist nun in dem Konzentrationsbereich um 500 µM, in dem der Pmtn aktiviert werden soll, bereits ein deutlicher Einfluss der Kupferionen auf die Zellaktivität feststellbar, der aber bei infizierten Zellen weniger stark ausgeprägt ist.

5.2.3 Doxycyclin-Toxizitätstest

Die Regulation des PTight erfolgt über die Variation der Doxycyclin-Konzentration im Medium. Um zu überprüfen, ob das Doxycyclin einen Einfluss auf das Wachstum und die Vitalität von Sf21-Insektenzellen hat, wurde, wie in Kapitel 4.3.5 beschrieben, ein Toxizitätstest im Bereich von 0,01 - 100 ng∙mL-1 Doxycyclin durchgeführt.

73 5 Ergebnisse

1E+7107 100 0 ngbla∙mL bla-1 bla Dox bla

-1

90 0,01 ng∙mL Dox

---

) ) 80 0,1 -1 1 0,1 ng∙mL Dox -

70 1 ng∙mL-1 Dox ....

60 10 ng∙mL-1 Dox 1E+6106 50 100 ng∙mL-1 Dox

40 Vitalität (%) Vitalität 30

Lebendzelldichte (Z∙mL Lebendzelldichte 20 10 1E+5105 0 0 24 48 72 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.16: Doxycyclin-Toxizitätstest mit Sf21-Insektenzellen Zeitlicher Verlauf der LZD und Vitalität von Sf21-Insektenzellen, die bei verschiedenen Doxycyclin- Konzentrationen im Bereich von 0 ng∙mL-1 (Kontrolle) bis 100 ng∙mL-1 kultiviert wurden. Anhand der in Abbildung 5.16 über die Zeit aufgetragenen LZD und Vitalitäten ist kein signifikanter Unterschied zwischen der Kontrolle ohne Doxycyclin und den Zellen, die über drei Tage in Doxycyclin-haltigem Medium kultiviert wurden, zu erkennen.

5.3 Metallothionein-Promotor

Die Regulation der Expression des Markerproteins eGFP durch den Metallothionein-

Promotor (Pmtn) soll in Abhängigkeit verschiedener Kupferkonzentrationen und Kultivierungssysteme untersucht werden. Hierzu wird das Virus AcMNPV-Me verwendet, das zur Steuerung der egfp-Expression den Metallothionein-Promotor trägt.

5.3.1 Herstellung der Virusstocks AcMNPV-Me

Die Viren AcMNPV-Me 2 und 4 wurden im Zweifachansatz durch die, in Kapitel 4.4.1 beschriebene, Transfektion der Bacmide bPmtnegfp Klon 2 bzw. 4 in Sf21-Insektenzellen hergestellt. Die nach drei Tagen abgenommenen P1-Stocks jedes Klons wurden gepoolt und vollständig zur weiteren Virusamplifikation in 100 mL Schüttelkolben eingesetzt. Die Virusüberstände der P2-Stocks wurden an Tag 4 bei 90,0 % Vitalität (AcMNPV-Me 2) und 94,0 % Vitalität (AcMNPV-Me 4) geerntet und die Virustiter laut Kapitel 4.4.4 und Kapitel 4.4.3 mittels real-time PCR und Endpunkttitration bestimmt. Die Ergebnisse der aus der PCR Analyse berechneten Viruspartikeltiter sowie die infektiösen Titer sind in Tabelle 5.1 zusammengefasst.

74 5.3 Metallothionein-Promotor

Die beiden P2-Stocks bestehen zu 100 % aus egfp+-Viren, also Viren, die das eGFP-Gen enthalten. Allerdings besitzen sie sehr unterschiedliche infektiöse Virustiter von 8 ‑1 5 ‑1 2,30∙10 TCID50∙mL und 2,15∙10 TCID50∙mL . Die Viruspartikeltiter unterscheiden sich hingegen nur um den Faktor 3,8. Da der infektiöse Titer des AcMNPV-Me 4 sehr gering war, wurde der P2-Stock in 30 mL Volumen, wie in Kapitel 4.4.2 beschrieben, zweimal weiter amplifiziert und bei 77,6 % und 81,6 % Vitalität geerntet. Die infektiösen Virustiter sowie die Viruspartikeltiter des P3- und P4-Stocks sind ebenfalls in Tabelle 5.1 aufgeführt. Durch die Amplifizierung konnte der infektiöse Titer um das 300-Fache und der Viruspartikeltiter um das 2,4-Fache gesteigert werden, wohingegen der Anteil egfp+-Viren auf 84,1 % gesunken ist.

Tabelle 5.1: Analyse verschiedener Stocks der Viren AcMNPV-Me 2 und 4 mittels rt-PCR und Endpunkttitration

AcMNPV-Me Infektiöser Titer Viruspartikeltiter Anteil egfp+-Viren ‑1 -1 Klon Passage TCID50∙mL (VP∙mL ) (%) 2 P2 2,30∙108 2,37∙108 100,4 4 P2 2,15∙105 6,65∙107 102,3 4 P3 1,00∙107 6,04∙107 88,3 4 P4 6,31∙107 1,58∙108 84,1 Für die weiteren Arbeiten wurden aufgrund der hohen Titer die Stocks AcMNPV-Me 2 P2 und AcMNPV-Me 4 P3 und P4 verwendet.

5.3.2 Regulation des Metallothionein-Promotors durch Kupferionen - I

In diesem Kapitel werden die Ergebnisse der Kupfer-abhängigen Regulation des Pmtn unter Verwendung des Virus AcMNPV-Me Klon 2, in dem sich das eGFP-Gen direkt downstream des Pmtn befindet, vorgestellt.

Die Kupferabhängigkeit der, durch den Pmtn gesteuerten, egfp-Expression wurde sowohl in an 500 µM CuSO4 adaptierten und nicht adaptierten Zellen untersucht, siehe Kapitel 4.4.5.1. In beiden Fällen wurde mit MOI 1 in 500 mL Erlenmeyerkolben und

Kupferkonzentrationen im Bereich von 0 bis 2.000 µM CuSO4 gearbeitet. Die erste

Probenahme erfolgte 2 h nach Zugabe der CuSO4-Lösung und danach für weitere 4 Tage im Abstand von 24 h. Bestimmt wurden die Vitalität und LZD der Kulturen sowie die egfp- Expression und Viruspartikeltiter mittels PCR.

75 5 Ergebnisse

5.3.2.1 Adaptierte Zellen

In Abbildung 5.17 sind die Ergebnisse des Versuchs, die Pmtn-gesteuerte egfp-Expression in adaptierten Zellen zu regulieren, für die CuSO4-Konzentrationen 0, 500, 700 und 1.000 µM dargestellt. Aufgetragen ist die auf das Referenzgen 28S rRNA normierte egfp- Expression über die Kultivierungsdauer. Als Kontrollen wurden nicht infizierte Zellen und

Zellen, die mit dem Virus AcMNPV-Pe infiziert wurden, bei einer CuSO4-Konzentration von 700 µM mitgeführt. Das Virus AcMNPV-Pe trägt egfp hinter dem Polyhedrin-Promotor und dient als Positivkontrolle.

101,00 n.n. inf.inf. 700

-1

) 100,1 00 µMµM CuSOCu 4 -

500500 µMµM CuSOCu 4 100,0-2 700700 µMµM CuSOCu 4

-3

100,0 1.0001000 µMµM CuCuSO4 Expression ( Expression

- AcMNPVPolh 700-Pe -4 egfp 100,0 NRTNRT

100,0-5

Normierte 100,0-6

100,0-7 0 24 48 72 96 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.17: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten egfp-Expression in infizierten, adaptierten Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 2 P2, MOI 1) bei verschiedenen Kupferkonzentrationen Während 2 hpi noch keine egfp-Expression stattgefunden hat, kann nach 24 h bereits bei beiden Promotoren eine Aktivierung festgestellt werden. Im weiteren Verlauf steigt die egfp-Expression weiter an, bis sie ab Tag 2 ein Plateau erreicht. Es ist deutlich zu erkennen, dass die egfp-Expression unter dem Pmtn unabhängig von der Konzentration an Kupferionen immer etwa gleich stark ist und an Tag 4 nur 7,4 % der Expression durch den

Ppolh entspricht.

Um zu überprüfen, ob die egfp-mRNA auch zum eGFP-Protein translatiert wird, wurde zusätzlich, wie in Kapitel 4.5.3 beschrieben, eine SDS-PAGE durchgeführt, deren SDS-Gel in Abbildung 5.18 dargestellt ist.

76 5.3 Metallothionein-Promotor

Abbildung 5.18: Nachweis der Pmtn-gesteuerten eGFP-Produktion durch AcMNPV-Me 2 SDS-Gel zur Detektion von eGFP in Zelllysaten infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 2 P2, MOI 1) bei verschiedenen Kupferkonzentrationen. Spuren 1 + 10: Proteinmarker

(10 kDa ‑ 250 kDa); Spuren 2 ‑ 6: 1.000 µM CuSO4, Probenahme an den Tagen 0 ‑ 4, eGFP ist durch einen grünen Rahmen markiert; Spur 7: 0 µM CuSO4 an Tag 4, eGFP ist durch einen roten Rahmen markiert; Spur 8: eGFP-Standard 50 ng∙µL-1; Spur 9: eGFP-Standard 20 ng∙µL‑1. Im SDS-Gel in Abbildung 5.18 sind neben den Lysaten von mit dem Virus AcMNPV-Me 2 P2 infizierten, adaptierten Sf21-Insektenzellen in den Spuren 2 ‑ 7 auch zwei Spuren mit unterschiedlichen Mengen eines eGFP-Standards zu sehen (Spuren 8 + 9). Die eGFP- Standards dienen zur leichteren Identifizierung der eGFP-Banden in den Zelllysaten. In Vorversuchen wurde außerdem mittels Western Blot eindeutig nachgewiesen, dass es sich bei den entsprechenden Banden der Zelllysatproben um eGFP handelt. Die Zellen in den Spuren 2 ‑ 6 wurden bei 1.000 µM CuSO4 kultiviert und stammen aus Proben der Tage 0 ‑ 4. Es ist zu erkennen, dass das 27 kDa große eGFP (grün umrahmt) bereits ab Tag 1 produziert wird und die Bande in der Probe von Tag 2 noch deutlicher wird. An den Tagen 3 und 4 wird die Bande wieder schwächer. In Spur 7 ist eine Probe infizierter Zellen, die ohne zusätzliches Kupfer kultiviert wurden, von Tag 4 aufgetragen, die ebenfalls eine Bande auf Höhe des eGFP enthält (rot umrahmt), was die Ergebnisse der rt-RT-PCR bestätigt.

77 5 Ergebnisse

Die zeitlichen Verläufe der zugehörigen LZD sowie der Vitalitäten sind in Abbildung 5.19 dargestellt.

7 1E+710 100 n.k. inf. 700 Z

80 .... 0C: µM 0 µM CuSO Cu4 (Z)

--- 60 ) )

1 500E: 500 µM µM CuSO Cu4 (Z) - 40 700F: 700 µM µM CuSO Cu 4(Z)

20 (%) Vitalität 1.000G: 1000 µM µM CuSO Cu 4(Z) 1E+6106 0 AcMNPVPolh 700- PeZ -20

-40 Lebendzelldichte (Z∙mL Lebendzelldichte -60 -80 1E+5105 -100 0 24 48 72 96 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.19: Zeitlicher Verlauf der LZD und Vitalität von infizierten, adaptierten Sf21- Insektenzellen (AcMNPV-Me 2 P2, MOI 1) bei unterschiedlichen Kupferkonzentrationen

Die nicht infizierte Kontrolle auf 700 µM CuSO4 zeigt Wachstum und erreicht eine maximale Zelldichte von 4,1∙106 Zellen∙mL-1 bei 88 % Vitalität. Im Gegensatz dazu kann bei den infizierten Zellen keine Proliferation beobachtet werden. Nach 70 h beginnen die LZD deutlich abzusinken, einhergehend mit einem Abfall der Vitalitäten. Hierbei ist eine starke

Abhängigkeit der Vitalität von der CuSO4-Konzentration zu erkennen, da die Vitalität der Zellen mit der höchsten Kupferkonzentration von 1.000 µM bereits nach 45 h auf 79 % abnimmt, wohingegen die Zellen ohne Kupfer noch eine Vitalität von 96 % aufweisen.

Dazwischen liegen die Vitalitäten der Ansätze mit 500 µM und 700 µM CuSO4 bei einem Werte von 85 %. Ab 45 h fallen alle Vitalitäten stark ab und erreichen Endwerte zwischen 20 % und 40 %.

Neben der LZD und der Vitalität wurde auch der Viruspartikeltiter mittels real-time PCR bestimmt. Die Daten sind in Abbildung 5.20 zusammengefasst und zeigen einen Anstieg der Viruspartikeltiter zwischen 0 h und 48 h mit einem anschließenden Plateau bei ca. 7∙107 VP∙mL‑1. Auffällig sind die unterschiedlichen Starttiter der Viren AcMNPV‑Me und AcMNPV-Pe von ca. 2∙105 VP∙mL-1 und 1∙106 VP∙mL-1, wobei nach 96 h bei beiden Viren vergleichbare Titer erreicht werden.

78 5.3 Metallothionein-Promotor

1E+9109 0C: µM 0 µM CuSO Cu4

500E: 500 µM µM CuSO Cu4 ) 8

1 1E+810 -

700F: 700 µM µM CuSO Cu 4 mL

∙

1.000G: 1000 µM µM CuSO Cu 4 1E+7107 AcMNPVPolh 700-Pe

1E+6106

5

Viruspartikeltiter (VP Viruspartikeltiter 1E+510

1E+4104 0 24 48 72 96 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.20: Zeitlicher Verlauf der Viruspartikeltiter im Überstand von infizierten, adaptierten Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 2 P2, MOI 1) bei unterschiedlichen Kupfer- konzentrationen

Es kann festgehalten werden, dass eine Regulation des Pmtn mit dem Virus AcMNPV-Me 2 durch Variation der CuSO4-Konzentration nicht erfolgreich war. Da hierfür kein offensichtlicher Grund vorlag, wurden im nächsten Schritt die Kupferkonzentrationen in den Zellen und im Medium untersucht.

5.3.2.2 Kupferkonzentrationen im Medium und in Sf21-Insektenzellen Aufgrund der Tatsache, dass sich die egfp-Expression nicht durch die eingestellte Kupferionen-Konzentration regulieren ließ, wurden Medium- und Zellproben genommen und deren Kupfergehalt vom Bayreuther Zentrum für Ökologie und Umweltforschung (BayCEER) bestimmt. Untersucht wurden sowohl Zellen, die dauerhaft in Medium mit bzw. ohne zugesetztem CuSO4 kultiviert wurden, als auch Zellen, die nur eine Passage in kupferhaltigem Medium kultiviert wurden und anschließend eine weitere Passage in Medium ohne Kupfer-Zusatz. Die Dauer einer Passage beträgt in diesem Fall 3 Tage. Zudem wurde die inhärente Kupferkonzentration des Ex-Cell® 420 Insektenmediums bestimmt. Die gemessenen Kupferkonzentrationen sind in Tabelle 5.2 zusammengefasst.

79 5 Ergebnisse

Tabelle 5.2: Kupferkonzentrationen in adaptierten und nicht-adaptierten Sf21-Insektenzellen sowie im Nährmedium Messung der Kupferionen-Konzentration durch das Bayreuther Zentrum für Ökologie und Umweltforschung (BayCEER). 1) Die Nachweisgrenze liegt bei 0,08 µM in der gemessenen Probe, was einer intrazellulären Kupferionen-Konzentration von 24 µM entspricht.

Probe Cu2+ (µM) 1) Zellen ohne CuSO4 < 24

Zellen in 500 µM CuSO4 468

Zellen in 600 µM CuSO4 602

Zellen nach einer Passage in 500 µM CuSO4 203 Ex-Cell® 420 Insektenmedium 2

Ex-Cell® 420 Insektenmedium mit 500 µM CuSO4 479 Die gemessenen Werte entsprechen den eingestellten Kupferionen-Konzentrationen und das verwendete Medium Ex-Cell® 420 enthält an sich nur eine sehr geringe Kupferionen-

Konzentration von 2 µM. Zellen, die für eine Passage in 500 µM CuSO4-haltigem Medium kultiviert wurden, besitzen 3 Tage nach dem Umsetzen in Medium ohne Kupferzusatz noch eine Kupferionen-Konzentration von ca. 200 µM. Während sowohl die Zellen ohne

CuSO4 als auch das Nährmedium keine zur Aktivierung des Promotors ausreichend hohen Kupferionen-Konzentrationen aufwiesen, war der Kupfergehalt in den adaptierten Zellen hoch genug, um den Pmtn auch ohne weitere Kupfer-Supplementierung des Mediums zu aktivieren. Aus diesem Grund wurde im nächsten Schritt versucht, den Pmtn in nicht- adaptierten Zellen zu induzieren.

5.3.2.3 Nicht adaptierte Zellen

Die Regulation der egfp-Expression durch den Pmtn im Virus AcMNPV-Me 2 war in adaptierten Zellen auch bei verschiedenen Kupferkonzentrationen nicht möglich, weshalb der Versuch mit nicht-adaptierten Zellen wiederholt wurde. In Abbildung 5.21 ist die normierte egfp-Expression bei 0, 700 und 2.000 µM CuSO4 über die Zeit dargestellt, wobei die 2.000 µM CuSO4 in einem Ansatz zum Zeitpunkt der Infektion und in einem anderen Ansatz 24 hpi zugegeben wurden. Hierdurch sollte untersucht werden, ob es sich positiv auf die egfp-Expression auswirkt, wenn die Zellen parallel zur Infektion nicht der Toxizität hoher Kupferkonzentrationen ausgesetzt sind.

Wie bereits bei den adaptierten Zellen konnte aber auch hier kein Unterschied der egfp- Expression zwischen den verschiedenen Kupferionen-Konzentrationen und Zugabe-

Zeitpunkten beobachtet werden. Der Pmtn wird kupferunabhängig auch bei 0 µM CuSO4 aktiviert.

80 5.3 Metallothionein-Promotor

101,00 00 µMµM CuSOCuSOCu 44

-1

) 100,1 700700 µMµM CuSOCuSOCu 44 -

2.0002.0002000 µMµM CuCuSOCuSO44 100,0-2 2.0002.0002000 CuµMµM 24 CuSOCuSO44 (24(24 h)h)

100,0-3 Expression ( Expression

- NRTNRT

-4 egfp 100,0

100,0-5

Normierte 100,0--66

10100,0--77 0 24 48 72 96 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.21: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten egfp-Expression in infizierten, nicht- adaptierten Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 2 P2, MOI 1) bei unterschiedlichen Kupferkonzentrationen Auch hier wurden die LZD sowie die Vitalität der Proben bestimmt und in Abbildung 5.22 graphisch dargestellt.

8 1E+810 100 0 µM CuSO4

80 .... 700 µM CuSO4

--- 60 ) ) 7 1 1E+7 2.000 µM CuSO4 - 10 40 2.000 µM CuSO4

20 (%) Vitalität (24 h) 1E+6106 0 -20 -40 1E+5105

-60 Lebendzelldichte (Z∙mL Lebendzelldichte -80 1E+4104 -100 0 24 48 72 96 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.22: Zeitlicher Verlauf der LZD und Vitalität von infizierten, nicht-adaptierten Sf21- Insektenzellen (AcMNPV-Me 2 P2, MOI 1) bei unterschiedlichen Kupferkonzentrationen Es ist zu erkennen, dass die infizierten Zellen in allen vier Ansätzen nicht mehr proliferieren. Während bei 0 µM und 700 µM CuSO4 die LZD erst nach 72 h beginnt abzusinken, nimmt die LZD bei den Ansätzen mit 2.000 µM CuSO4 bereits 24 h nach Zugabe des Kupfersalzes deutlich ab. Dieser Verlauf spiegelt sich auch in den Vitalitäten wieder, die bei den Ansätzen mit 0 µM und 700 µM CuSO4 identisch verlaufen und erst ab 81 5 Ergebnisse

48 h fallen, wohingegen bei den Ansätzen mit 2.000 µM CuSO4 die Zellvitalität bereits 24 h nach Kupferzugabe (0 hpi und 24 hpi) abnimmt.

Der zeitliche Verlauf der Viruspartikeltiter ist in Abbildung 5.23 dargestellt. Ausgehend von einem Starttiter um 7∙105 VP∙mL-1 steigt der Titer der Ansätze mit 0 µM und 700 µM 8 -1 CuSO4 identisch an und erreicht den höchsten Wert bei 94 h mit 1,2∙10 VP∙mL . Der

Ansatz, dem bei der Infektion 2.000 µM CuSO4 zugesetzt wurden, hat durchwegs einen niedrigeren Viruspartikeltiter von maximal 1,3∙107 VP∙mL-1. Diesen Wert übersteigt der

Ansatz, dem die 2.000 µM CuSO4 erst 24 hpi zugesetzt wurden, nur minimal, obwohl er nach 23 h einen deutlich höheren Viruspartikeltiter aufweist, der sich im weiteren Verlauf aber kaum noch erhöht.

1E+9109 0H: µM 0 µM CuSO Cu4

700I: 700 µM µM CuSO Cu 4 ) 88

1 1E+810 -

2.000K: 2000 µM µM CuSO Cu 4 mL

∙ 2.0002000 24hµM CuSO 107 4 1E+710 (24 h)

1E+6106

5

Viruspartikeltiter (VP Viruspartikeltiter 1E+510

1E+4104 0 24 48 72 96 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.23: Zeitlicher Verlauf der Viruspartikeltiter im Überstand infizierter, nicht- adaptierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 2 P2, MOI 1) bei unterschiedlichen Kupferkonzentrationen Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass eine Kupferionen-abhängige

Regulation des Pmtn mit dem Virus AcMNPV-Me 2 weder in adaptierten noch in nicht- adaptierten Sf21-Insektenzellen möglich war.

5.3.3 Regulation des Metallothionein-Promotors durch Kupferionen - II

Der Versuch, den Pmtn durch verschiedene Kupferkonzentrationen zu regulieren, war bei Verwendung des Virus AcMNPV-Me 2 nicht erfolgreich. Aus diesem Grund wurde aus dem Bacmid b1∆PpolhPmtnegfp Klon 4 ein weiterer Virusstock hergestellt und untersucht.

In diesem Kapitel werden die Ergebnisse der Kupfer-abhängigen Regulation des Pmtn unter Verwendung des Virus AcMNPV-Me Klon 4 vorgestellt. Auch im Virus AcMNPV-Me 4 befindet sich das eGFP-Gen direkt downstream des Pmtn und kann daher als Reportergen 82 5.3 Metallothionein-Promotor für die Promotoraktivität fungieren. Im Gegensatz zu den vorherigen Experimenten wurde die egfp-Expression dieses Mal anhand der eGFP-Fluoreszenz im PlateReader oder mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Außerdem wurden die beiden Kultivierungssysteme 96- well Mikrotiterplatte und Schüttelkolben verglichen.

5.3.3.1 Kultivierungssystem 1: 96-well Mikrotiterplatte Die Verwendung von 96-well Mikrotiterplatten ermöglicht die parallele Untersuchung mehrerer Bedingungen, wie beispielsweise den Einfluss des gewählten Kupfersalzes oder der eingestellten Kupferionen-Konzentration auf die egfp-Expression. In einem ersten

Screening wurden die beiden Kupfersalze CuSO4 und CuCl2 in Konzentrationen von 0, 100, 500, 1.000 und 1.500 µM, wie in Kapitel 4.4.5.2 beschrieben, getestet. Die am PlateReader gemessene und nach Kapitel 4.5.5.1 ausgewertete bereinigte eGFP-

Produktion Pb ist in Abbildung 5.24 dargestellt.

6.000 0Cu µM 0 Cu2+

)

1 -

Z 100CuCl2 µM 100 CuCl2

∙ 5.000

500CuCl2 µM 500 CuCl2

(RFU

b 4.000 1.000CuCl2 µM 1000 CuCl2

1.500CuCl2 µM 1500 CuCl2 3.000 100CuSO4 µM 100 CuSO4

Produktion P Produktion

- 500CuSO4 µM 500 CuSO4 2.000

1.000CuSO4 µM 1000 CuSO4

1.000 1.500CuSO4 µM 1500 CuSO4

Ber. eGFP Ber. 0 0 24 48 72 96 120 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.24: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Pb infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P3, MOI 5) bei verschiedenen Konzentrationen der Kupfersalze CuCl2 und CuSO4 Die Bildung von eGFP kann bereits 17 hpi nachgewiesen werden und erreicht ihr

Maximum nach drei Tagen. Beim Vergleich der beiden Kupfersalze ist zu sehen, dass CuCl2 in einer stärkeren egfp-Expression resultiert, was bei einer Konzentration von 100 µM besonders deutlich wird. Höhere Kupferkonzentrationen führen zu einer niedrigeren eGFP-Produktion bis bei 1.500 µM gar keine Fluoreszenz oberhalb der Autofluoreszenz mehr gemessen werden kann. Eine Betrachtung der entsprechenden wells unter dem Mikroskop zeigt, dass hier viele Zellen bereits nach einem Tag tot und zum Teil desintegriert sind.

83 5 Ergebnisse

Dies zeigt sich auch am, in Abbildung 5.25 dargestellten, Anteil der eGFP+-Messwerte, also den Messwerten, die oberhalb des, basierend auf der Autofluoreszenz, festgelegten Schwellenwertes liegen. Die Ansätze mit 100 µM Cu2+ zeigen mit ca. 93 % bereits 17 hpi den höchsten Anteil eGFP+-Messwerte, der von den Ansätzen mit 500 µM erst 40 hpi erreicht wird. Bei allen höheren Kupferionen-Konzentrationen können keine nennenswerten Anteile eGFP+-Messwerte mehr detektiert werden.

100 0Cu µM 0 Cu2+

90 100CuCl2 µM 100 CuCl2

80 500CuCl2 µM 500 CuCl2

70 1.000CuCl2 µM 1000 CuCl2

60 1.500CuCl2 µM 1500 CuCl2

Messwerte (%) Messwerte

- 50 + 100CuSO4 µM 100 CuSO4

40 500CuSO4 µM 500 CuSO4

30 1.000CuSO4 µM 1000 CuSO4

Anteil eGFP Anteil 20 1.500CuSO4 µM 1500 CuSO4 10 0 0 24 48 72 96 120 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.25: Zeitlicher Verlauf des Anteils eGFP+-Messwerte infizierter Sf21-Insektenzellen

(AcMNPV-Me 4 P3, MOI 5) bei verschiedenen Konzentrationen der Kupfersalze CuCl2 und CuSO4

Durch das erste Screening konnte gezeigt werden, dass CuCl2 aufgrund der stärkeren eGFP-Produktion besser zur Induktion des Pmtn geeignet ist als CuSO4, weshalb im

Folgenden nur noch CuCl2 verwendet wurde.

Für eine genauere Bestimmung der optimalen Induktionskonzentration wurden weitere

CuCl2-Konzentrationen von 0 µM bis 300 µM in 50 µM Schritten und von 300 µM bis 600 µM in 100 µM Schritten untersucht. Das Ergebnis der Fluoreszenzmessung am PlateReader ist in Abbildung 5.26 und der Anteil der eGFP+-Messwerte in Abbildung 5.27 dargestellt.

84 5.3 Metallothionein-Promotor

0Mtn-P µM CuCl Cu 20

) 6.000

1 -

Z 50 µM CuCl

∙ Mtn-P Cu 502

5.000 100Mtn-P µM Cu CuCl 1002

(RFU

b 150Mtn-P µM Cu CuCl 1502 4.000 200Mtn-P µM Cu CuCl 2002

3.000 250Mtn-P µM Cu CuCl 2502

Produktion P Produktion

- 300Mtn-P µM Cu CuCl 3002 2.000 400Mtn-P µM Cu CuCl 4002

500Mtn-P µM Cu CuCl 500 1.000 2

Ber. eGFP Ber.

600Mtn-P µM Cu CuCl 6002 0 0 24 48 72 96 120 144

Prozesszeit (h)

Abbildung 5.26: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten, bereinigten eGFP -Produktion Pb infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P3, MOI 5) bei verschiedenen CuCl2- Konzentrationen

Abbildung 5.26 zeigt eine maximale Promotoraktivität zwischen 100 µM und 200 µM CuCl . Höhere Konzentrationen führen, wie bereits beim Vergleich der Kupfersalze in 2 Abbildung 5.24 zu erkennen war, zu einem Abfall der Fluoreszenzintensität einhergehend mit einem schlechteren Zustand der Zellen. In der Kontrolle ohne Kupfer zeigen ungefähr

10 % der Messwerte eine gewisse Basalaktivität des Pmtn im Bereich von etwa 4 % der maximal gemessenen Expression an Tag 3.

100 0Mtn-P µM CuCl Cu 02

90 50Mtn-P µM CuCuCl 502

80 100Mtn-P µM Cu CuCl 1002

70 150Mtn-P µM Cu CuCl 1502

60

200Mtn-P µM Cu CuCl 2002 Messwerte (%) Messwerte

- + 50 250Mtn-P µM Cu CuCl 2502

40 300Mtn-P µM Cu CuCl 3002 30 400Mtn-P µM Cu CuCl 4002

Anteil eGFP Anteil 20 500Mtn-P µM Cu CuCl 5002 10 600Mtn-P µM Cu CuCl 6002 0 0 24 48 72 96 120 144 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.27: Zeitlicher Verlauf des Anteils eGFP+-Messwerte infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P3, MOI 5) bei verschiedenen CuCl2-Konzentrationen

85 5 Ergebnisse

Die beste Induktion des Pmtn bei der Kultivierung in 96-well Mikrotiterplatten konnte durch CuCl2-Konzentrationen in einem Bereich zwischen 100 µM und 200 µM erzielt werden.

5.3.3.2 Kultivierungssystem 2: Schüttelkolben

Nachdem die benötigten Kupferkonzentrationen zur Induktion des Pmtn in der 96-well Mikrotiterplatte bekannt waren, sollte herausgefunden werden, ob sich diese Daten in geschüttelter Suspensionskultur reproduzieren lassen. Zuerst wurde der Verlauf der eGFP-Produktion bei unterschiedlichen Kupferionen-Konzentrationen anhand der messbaren intrazellulären eGFP-Fluoreszenz aufgenommen und dadurch die beste

Induktionskonzentration für den Pmtn ermittelt. In einem weiteren Experiment wurde die unter Maximalexpression des Pmtn erreichte eGFP-Konzentration bei der zuvor bestimmten, optimalen CuCl2-Konzentration untersucht.

Verlauf der Kupfer-induzierten eGFP-Produktion

Zur Untersuchung der Kupfer-abhängigen Aktivierung des Pmtn wurden, wie in Kapitel

4.4.5.1 erläutert, Sf21-Insektenzellen mit MOI 0,1 infiziert und folgende CuCl2- Konzentrationen eingestellt: 0, 50, 100, 200, 400 und 800 µM. Als Kontrolle wurde eine nicht infizierte Kultur ohne CuCl2 mitgeführt. Die Kultivierung erfolgte über 6 Tage, wobei die Kolben täglich beprobt wurden. Neben der LZD und Vitalität wurden die eGFP- Fluoreszenz pro Zelle sowie der Anteil eGFP+-Zellen mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die Zellwachstums- und Vitalitätsverläufe sind in Abbildung 5.28 gezeigt. Die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Analyse sind in Abbildung 5.29 und Abbildung 5.30 dargestellt.

Die nicht infizierte Kontrolle wächst bis Tag 4 (≙ 91 h) mit einer durchschnittlichen spezifischen Wachstumsrate µ von 0,08 h-1 und erreicht eine maximale LZD von 5,2∙106 Zellen∙mL-1 bei einer Vitalität von 91,8 %. Die mit dem AcMNPV-Me infizierten Kulturen wachsen noch bis Tag 2 (≙ 48 h) mit einer reduzierten durchschnittlichen spezifischen Wachstumsrate µ von 0,02 h-1, die daraufhin bei ca. 1,2∙106 Zellen∙mL-1 stagniert (0 µM CuCl2) oder aufgrund der steigenden Anzahl toter Zellen wieder etwas abfällt. Ferner ist zu erkennen, dass die Kultur mit der höchsten Konzentration von

800 µM CuCl2 das geringste Wachstum und die mit Abstand schlechteste Vitalität aufweist. Auch in den anderen Kulturen ist ein Konzentrations-abhängiger negativer

Einfluss des CuCl2 auf Zellwachstum und Vitalität festzustellen. Bei der Kultur ohne Zusatz von CuCl2 steigt die Vitalität von Tag 5 auf Tag 6 noch einmal an, wohingegen bei allen anderen Ansätzen ein weiterer Abfall der Vitalitäten auf 56 % bis 45 % beobachtet werden kann.

86 5.3 Metallothionein-Promotor

8 1E+810 100 n.Kontrolle inf.

80 …. 0Cu µM 0 CuCl2

--- 60 ) )

1 50Cu µM 50 CuCl - 2

1E+7107 40 100Cu 100µM CuCl2

20 (%) Vitalität 200Cu 200µM CuCl2 0 400Cu 400µM CuCl2 -20 800 µM CuCl 1E+6106 Cu 800 2 -40

Lebendzelldichte (Z∙mL Lebendzelldichte -60 -80 1E+5105 -100 0 24 48 72 96 120 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.28: Zeitlicher Verlauf der LZD und Vitalität infizierter Sf21-Insektenzellen

(AcMNPV-Me 4 P3, MOI 0,1) bei verschiedenen CuCl2-Konzentrationen Die dazu gehörige, bereinigte eGFP-Produktion ist in Abbildung 5.29 veranschaulicht. Der prozentuale Anteil der lebenden und eGFP+-Zellen ist in Abbildung 5.30 dargestellt.

35.000 n.Kontrolle inf.

) 1 - 30.000 0Cu µM 0 CuCl2

50Cu µM 50 CuCl2

(RFU∙Z

25.000 b 100Cu 100µM CuCl2

20.000 200Cu 200µM CuCl2

400Cu 400µM CuCl2 15.000

Produktion D Produktion 800Cu 800µM CuCl2 - 10.000

5.000 Ber. eGFP Ber.

0 0 24 48 72 96 120 Prozesszeit (%)

Abbildung 5.29: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Db infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P3, MOI 0,1) bei verschiedenen CuCl2- Konzentrationen An Tag 0, also direkt nach der Infektion, ist noch keine eGFP-Fluoreszenz, sondern nur Autofluoreszenz detektierbar. Nach 24 h produzieren bereits alle Ansätze außer der nicht

87 5 Ergebnisse infizierten Kontrolle eGFP, wobei die Produktion im Rahmen der Standardabweichung proportional zur Kupferkonzentration ist.

Dies spiegelt sich in der Anzahl infizierter Zellen nicht wieder, da in den Kulturen mit

100 µM und 800 µM CuCl2 nur 14 % der Zellen eGFP-Fluoreszenz zeigen, wohingegen es in den anderen kupferhaltigen Ansätzen 25 % bis 32 % sind.

100 n.Kontrolle inf. 90 0Cu µM 0 CuCl2

80

50Cu µM 50 CuCl2 70 100Cu 100µM CuCl2 60

200Cu 200µM CuCl2 Zellen (%) Zellen

-

+ 50 400Cu 400µM CuCl2 40 800Cu 800µM CuCl2 30

Anteil eGFP Anteil 20 10 0 0 24 48 72 96 120 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.30: Zeitlicher Verlauf des Anteils eGFP+-Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P3,

MOI 0,1) bei verschiedenen CuCl2-Konzentrationen

Anhand der Kulturen ohne CuCl2 kann festgestellt werden, dass der Pmtn auch in Suspensionskultur durchgehend eine gewisse Basalaktivität von etwa 15 %, bezogen auf die bereinigte Maximalproduktion, besitzt. Zwischen dem ersten und dem dritten Tag steigt die bereinigte eGFP-Produktion der drei höchsten Kupferkonzentrationen weiter an, wobei sich der Unterschied zwischen den verschiedenen Kupferkonzentrationen verstärkt und die Zellen auf 800 µM CuCl2 das meiste eGFP produzieren, gefolgt von den Zellen auf 400 µM und 200 µM. Am wenigsten eGFP bilden die Ansätze mit 50 µM und

100 µM CuCl2, deren eGFP-Expression sich über den Verlauf der Kultivierung auch kaum ändert. Dieser Trend ist auch im Anteil eGFP+-Zellen erkennbar, der von 82 % bei 800 µM bis zu ca. 23 % bei 100 µM CuCl2 reicht. Ab dem dritten Tag sinkt bei allen Ansätzen der Anteil eGFP+-Zellen. Damit einhergehend stoppt die Akkumulation von eGFP in den infizierten Zellen, sodass die eGFP-Produktion nicht weiter ansteigt (800 µM CuCl2) bzw. fällt, wie bei den Ansätzen mit 200 µM und 400 µM zu sehen ist.

Für die Kultivierung der infizierten Sf21-Insektenzellen im Schüttelkolben kann festgehalten werden, dass der Pmtn bei einer CuCl2-Konzentration von 800 µM am stärksten induziert wird und die infizierten Zellen bei dieser Konzentration, trotz der toxischen Wirkung der Kupferionen, das meiste eGFP produzieren. 88 5.3 Metallothionein-Promotor

Maximalexpression bei 800 µM CuCl2

Aus den bisherigen Ergebnissen geht hervor, dass die maximale Aktivierung des Pmtn bei

800 µM CuCl2 erfolgt. Um einen Vergleich der Expressionsstärke der verschiedenen in dieser Arbeit untersuchten Promotoren zu ermöglichen, wurde daher in einem weiteren Versuch die Konzentration an gebildetem eGFP bestimmt. Hierzu wurden Sf21-

Insektenzellen auf 800 µM CuCl2 mit dem Virus AcMNPV-Me P4 und MOI 3 infiziert, täglich beprobt und die eGFP-Konzentration, wie in Kapitel 4.5.5.2 beschrieben, bestimmt. Die eGFP-Konzentration ist in Abbildung 5.31 bezogen auf das Kulturvolumen und pro Zelle dargestellt.

35 35

30 30

---

....

) )

) )

1

-

1 -

25 25 Z

∙

mL ∙ 20 20

15 15

10 10 (fg Konzentration

-

Konzentration (ng Konzentration -

5 5 eGFP eGFP

0 0 0 24 48 72 96 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.31: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten eGFP-Konzentration in infizierten Sf21- Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P4, MOI 3, 800 µM CuCl2) In Abbildung 5.31 ist zu erkennen, dass das meiste eGFP in den ersten 30 hpi gebildet und hierbei eine maximale Konzentration von 24 ng∙mL-1 Zellsuspension erreicht wird, was einer eGFP-Konzentration von 29 fg∙Zelle-1 entspricht. Während dem weiteren Kultivierungsverlauf sinkt die eGFP-Konzentration, einhergehend mit einem Abfall der Vitalität, kontinuierlich bis auf einen Wert von 4 ng∙mL-1 Zellsuspension ab. Der Verlauf der zugehörigen Zelldichten und Vitalitäten ist in Abbildung 9.4 im Anhang gezeigt.

5.3.4 Aktivierungskinetik des Metallothionein-Promotors

Das vorherige Kapitel beschäftigte sich mit der Regulierbarkeit der egfp-Expression durch den Pmtn in Abhängigkeit der Kupferionen-Konzentration. Um den Promotor im Rahmen des BEVS weiter zu charakterisieren, wurde zudem die Kinetik des Pmtn genauer untersucht. In diesem Kapitel sind die Ergebnisse hierzu dargestellt, wobei zuerst darauf

89 5 Ergebnisse eingegangen wird, bis zu welchem Zeitpunkt nach Infektion der Promotor noch aktiviert werden kann. Im Anschluss werden die Ergebnisse der Untersuchung der Induktionskinetik des Promotors, also wie lange es dauert, bis der Promotor nach Kupferzugabe induziert wird, gezeigt.

5.3.4.1 Zeitabhängige Induzierbarkeit

Zur Untersuchung der Induktionskinetik des Pmtn mittels real-time PCR und Durchflusszytometer sollten Sf21-Insektenzellen mit dem Virus AcMNPV-Me 4 in Medium ohne zugesetztem Kupfer infiziert werden. Um zu verhindern, dass die, mittels real-time PCR bestimmten, Werte zur egfp-Expression durch den steigenden Anteil infizierter Zellen während der ersten beiden Tage nach Infektion verfälscht werden, sollte das CuCl2 erst 48 hpi zu den infizierten Zellen gegeben und dadurch der Promotor aktiviert werden. Der daraufhin beobachtbare Anstieg der egfp-Expression sollte nur auf die Aktivierung des Promotors zurückgeführt werden können, da sich der Anteil infizierter Zellen zu diesem

Zeitpunkt nicht mehr stark verändert. Es hat sich jedoch gezeigt, dass der Pmtn durch eine

CuCl2-Zugabe 48 hpi nicht mehr induziert werden kann und die Zellen folglich kein eGFP produzieren. Aus diesem Grund wurden verschiedene Induktionszeitpunkte in einer 96- well Mikrotiterplatte getestet. Die Durchführung erfolgte, wie in Kapitel 4.4.5.2 beschrieben, mit der Änderung, dass zur Induktion immer 200 µM CuCl2 eingesetzt wurden, die zu den folgenden Zeitpunkten nach Infektion zu den Zellen pipettiert wurden: 0, 6, 12, 24, 32 und 48 hpi. Die eGFP-Fluoreszenz wurde im Anschluss stündlich am PlateReader gemessen. In Abbildung 5.32 ist die bereinigte eGFP-Produktion Pb über die Zeit aufgetragen und in Abbildung 5.33 der zugehörige Anteil eGFP+-Messwerte. Sowohl in Abbildung 5.32, als auch in Abbildung 5.33, sind der Übersichtlichkeit halber keine Standardabweichungen durch Fehlerbalken dargestellt. Eine Version der beiden Abbildungen inklusive Fehlerbalken ist im Anhang 9.1 in Abbildung 9.1 und Abbildung 9.2 zu finden.

Zellen, in denen die Induktion des Pmtn durch 200 µM CuCl2 direkt nach der Infektion durchgeführt wurde, zeigen nach etwa 10 h erste eGFP-Fluoreszenz, die bis zum Ende der Messung auf eine maximale, bereinigte eGFP-Produktion von 1.000 RFU∙Zelle-1 ansteigt. In den Ansätzen, in denen die egfp-Expression 6 hpi bzw. 12 hpi induziert wurde, verschiebt sich der Start der eGFP-Produktion entsprechend um 6 h bzw. 12 h nach hinten. Die stärkste Zunahme der Fluoreszenzintensität ist jeweils in den ersten 30 h nach Beginn der eGFP-Produktion zu verzeichnen, gefolgt von einer Übergangsphase, in der bereits weniger eGFP gebildet wird. Ab 70 hpi erreicht die eGFP-Produktion unabhängig vom Induktionszeitpunkt ein Plateau, wobei der Ansatz der nach 12 hpi induziert wurde, das höchste Signal liefert, gefolgt von den Ansätzen die 6 hpi und 0 hpi induziert wurden.

90 5.3 Metallothionein-Promotor

Zwar konnte der Pmtn auch dann noch induziert werden, wenn das CuCl2 erst 24, 32 oder 48 hpi zu den Zellen gegeben wurde, allerdings wurde in diesen Fällen deutlich weniger eGFP gebildet.

1.400

0 h

) 1

- 1.200 6 h Z ∙ 12 h 24 h

(RFU 1.000

b 32 h 800 48 h

600

Produktion P Produktion - 400

200 Ber. eGFP Ber.

0 0 24 48 72 96 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.32: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Pb infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P4, MOI 5) bei unterschiedlichen Induktionszeitpunkten

Induktion durch Zugabe von 200 µM CuCl2. Darstellung ohne Standardabweichungen. Die Verläufe der zugehörigen Anteile eGFP+-Messwerte sind in Abbildung 5.33 gezeigt.

100 0 h 6 h

90 12 h 80 24 h 70 32 h

60 48 h Messwerte (%) Messwerte

- 50 + 40 30

Anteil eGFP Anteil 20 10 0 0 24 48 72 96 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.33: Zeitlicher Verlauf des Anteils eGFP+-Messwerte infizierter Sf21-Insektenzellen

(AcMNPV-Me 4 P4, MOI 5) bei unterschiedlichen Induktionszeitpunkten des Pmtn Induktion durch Zugabe von 200 µM CuCl2. Darstellung ohne durch Fehlerbalken repräsentierte Standardabweichungen.

91 5 Ergebnisse

Die Induktion des Pmtn bis 12 hpi führt mit einer Verzögerung von etwa 10 h zu einem steilen Anstieg der eGFP+-Messwerte, durch den innerhalb weiterer 10 h ein Anteil eGFP+- Messwerte zwischen 80 % und 90 % erreicht wird. Bei 50 hpi beträgt der Anteil eGFP+- Messwert bei allen Ansätzen, die bis einschließlich 12 hpi induziert worden sind, bereits 100 %. Im Gegensatz dazu erhöht sich der Anteil eGFP+-Messwert nur langsam, wenn die Induktion 24 hpi oder später erfolgte. Während die Ansätze, die 24 hpi induziert worden sind, bis zum Ende der Kultivierungsdauer bei 95 hpi noch fast einen Anteil eGFP+- Messwerte von 100 % erreichen, sinkt dieser Wert für spätere Induktionszeitpunkte immer weiter ab.

Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass eine Induktion des Pmtn zwar bis 48 hpi möglich ist, die eGFP-Produktion Pb bei einer Induktion 24 hpi oder später aber im Vergleich zu früheren Induktionszeitpunkten stark reduziert ist. Die Induktion zum

Zeitpunkt 12 hpi resultierte in der stärksten, bereinigten eGFP-Produktion Pb und wurde daher für die Untersuchung der Induktionskinetik übernommen.

5.3.4.2 Induktionskinetik Aufgrund der, in Kapitel 5.3.4.1 dargestellten, Ergebnisse wurde für den nächsten Versuch in Schüttelkolben der Zeitpunkt der CuCl2-Zugabe auf 12 hpi vorgezogen und die eingesetzte MOI auf 1 erhöht. Dadurch sollte eine möglichst simultane Infektion der gesamten Kultur erreicht werden, sodass ausgeschlossen werden kann, dass die Messung der egfp-Expression von einer Änderung der Anzahl infizierter Zellen beeinflusst wird. In Abbildung 5.34 sind die gemessene bereinigte eGFP-Produktion sowie der Anteil eGFP+- Zellen für den Zeitpunkt der Induktion (12 hpi) sowie für drei im Abstand von 2,5 h folgende Zeitpunkte dargestellt. Während kurz nach der Infektion noch keine eGFP- Fluoreszenz detektiert werden kann, liefern 12 hpi nur 2,3 % der Zellen ein eGFP-Signal. 2,5 h nach Induktion, also 14,5 hpi, fällt die bereinigte eGFP-Produktion der Zellen auf

200 µM CuCl2 leicht ab, da nun mehr Zellen beginnen eGFP zu produzieren, wodurch der berechnete Mittelwert über alle eGFP+-Zellen erst einmal sinkt, um daraufhin bis 36 hpi wieder stetig anzusteigen. Gleichzeitig steigt der Anteil eGFP+-Zellen ebenfalls an und erreicht 36 hpi einen Wert von 41 %. Im Gegensatz dazu nimmt die bereinigte eGFP- Produktion pro Zelle bei den nicht-induzierten Zellen ohne Kupfer ab 12 hpi kontinuierlich ab, während der Anteil eGFP+-Zellen leicht ansteigt und 36 hpi knapp 20 % erreicht.

92 5.3 Metallothionein-Promotor

7.000 100

00 µMcu CuCl2

--- 90

) ) 6.000 1 200200 µMcu CuCl

- 2

Z

∙ 80 ....

5.000 Cu+2-Zugabe 70

(RFU

b 60

4.000

Zellen (%) Zellen -

50 + 3.000

40

Produktion D Produktion - 2.000 30

20 eGFP Anteil 1.000

Ber. eGFP Ber. 10 0 0 0 6 12 18 24 30 36 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.34: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Db infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P4, MOI 1) sowie des Anteils eGFP+-Zellen nach Induktion des Promotors

Die Induktion erfolgte 12 hpi durch Zugabe von 200 µM CuCl2 zum Kulturmedium. Als Kontrolle wurde eine Kultur in Kupfer-freiem Medium mitgeführt. Die Expressionskinetik wurde zusätzlich zur eGFP-Fluoreszenz auch auf mRNA-Ebene untersucht. Das Ergebnis der rt-RT-PCR anhand der egfp-Sequenz ist in Abbildung 5.35 als normierte Expression dargestellt.

1,2 0ohne µM CuCl Cu 2

) 200200 µM cu CuCl - 1,0 2

0,8 Expression ( Expression

- 0,6 egfp 0,4 Cu+2-Zugabe

0,2 Normierte

0,0 0 6 12 18 24 30 36 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.35: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten egfp-Expression infizierter Sf21- Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P4, MOI 1) nach Induktion des Promotors

Die Induktion erfolgte 12 hpi durch Zugabe von 200 µM CuCl2 zum Kulturmedium. Als Kontrolle wurde eine Kultur in Kupfer-freiem Medium mitgeführt.

93 5 Ergebnisse

Innerhalb der ersten 12 hpi steigen die eGFP mRNA-Level auch in Abwesenheit von CuCl2 aufgrund der Basalaktivität des Pmtn leicht an. Nach der Induktion durch die Zugabe von

200 µM CuCl2 zum Medium ist eine deutliche Erhöhung der egfp-Expression innerhalb der ersten 7,5 h nach Induktion um das 5-Fache und bis 36 hpi um das 10-Fache zu erkennen (rote Kurve in Abbildung 5.35). Die eGFP mRNA-Level in der Kontrolle ohne Kupfer

(schwarze Quadrate in Abbildung 5.35) steigen aufgrund der Basalaktivität des Pmtn ebenfalls an, allerdings flacher, und erreichen 36 hpi 60 % des Wertes der mit Cu2+ induzierten Zellen. Die zugehörigen Verläufe der LZD sowie der Vitalität sind im Anhang 9.1 in Abbildung 9.3 dargestellt.

Eine Zusammenfassung der Ergebnisse aus Fluoreszenz- und mRNA-Analyse ergibt, dass die egfp-Expression bereits 2,5 h nach Induktion des Pmtn nachgewiesen werden kann.

5.4 PTight-Promotor des Tet-Off Systems

In diesem Kapitel werden die Ergebnisse der Untersuchung der Expression des

Reporterproteins eGFP durch den Promotor des Tet-Off Systems PTight in Abhängigkeit verschiedener Doxycyclin-Konzentrationen dargestellt. Das hierfür verwendete Virus wird als AcMNPV-DHTePt bezeichnet und exprimiert zwei heterologe Gene. Die egfp-

Expression wird hierbei durch den PTight reguliert, der durch das zweite heterologe Protein namens Tetracyclin Transaktivator (tTA) aktiviert wird. Um sicherzustellen, dass ausreichende Mengen tTA zur Verfügung stehen, wird die Expression des tTA-Gens (tta) durch den starken Polyhedrin-Promotor gesteuert. In Abhängigkeit der Doxycyclin-

Konzentration bindet tTA an den PTight, wodurch die Aktivität des Promotors und damit die eGFP-Produktion reguliert werden kann. Doxycyclin agiert in diesem System als

Inhibitor und führt zu einer Hemmung der PTight-gesteuerten egfp-Expression. Als

Kontrolle für die Basalaktivität des PTight dient das Virus AcMNPV-DHTe, dem das tta fehlt, wodurch eine gezielte Aktivierung des Promotors verhindert wird.

5.4.1 Herstellung der Virusstocks AcMNPV- DHTe und -DHTePt

Die Viren AcMNPV-DHTePt und AcMNPV-DHTe wurden durch die in Kapitel 4.4.1 beschriebene Transfektion der Bacmide bDHPTightegfp-Ppolhtta Klon 6 und bDHPTightegfp Klone 1, 4 und 5 in Insektenzellen hergestellt. Je zwei wells wurden gepoolt und für die Vermehrung der Viren in 100 mL Erlenmeyerkolben verwendet.

94 5.4 PTight-Promotor des Tet-Off-Systems

5.4.1.1 Virusstocks AcMNPV-DHTe Die P2-Stocks des AcMNPV-DHTe (aus den Klonen 1, 4 und 5) wurden nach 3 Tagen bei Vitalitäten von 92,6 %, 98,7 % und 95,2 % geerntet und die Virustiter mittels real-time PCR analysiert. Die Viren AcMNPV-DHTe wurden in 300 mL Erlenmeyerkolben laut dem Protokoll aus Kapitel 4.4.2 weiter amplifiziert und die P3-Stocks nach 3 Tagen bei 93,5 %, 96,8 % und 95,4 % Vitalität geerntet. Die Berechnung der infektiösen Virustiter mittels Endpunkttitration war aufgrund der geringen eGFP-Produktion und der damit einhergehenden schlechten Detektierbarkeit infizierter Zellen nicht möglich. Stattdessen wurde für alle AcMNPV-DHTe Stocks der Viruspartikeltiter mittels real-time PCR bestimmt, wobei für eine qualitative Beurteilung zusätzlich die Primer für egfp eingesetzt wurden. Die berechneten Viruspartikeltiter sowie der Anteil egfp+-Viren sind in Tabelle 5.3 zusammengefasst. Der Stock AcMNPV-DHTe 5 P3 wurde aufgrund des höchsten Anteils egfp+-Viren für alle weiteren Versuche als Kontrolle für die Basalaktivität eingesetzt.

Tabelle 5.3: Analyse verschiedener Stocks des Virus AcMNPV-DHTe mittels real-time PCR

AcMNPV-DHTe Viruspartikeltiter Anteil egfp+-Viren -1 Klon Passage (VP∙mL ) (%) 1 P2 1,39∙108 85,2 4 P2 9,14∙105 94,9 5 P2 9,11∙107 105,7 1 P3 3,11∙108 70,1 4 P3 2,58∙108 80,5 5 P3 2,97∙108 83,1

5.4.1.2 Virusstocks AcMNPV-DHTePt Der P2-Stock des AcMNPV-DHTePt wurde bei 86,6 % Vitalität geerntet und davon sowohl der infektiöse Titer als auch der Viruspartikeltiter bestimmt. Ausgehend von diesem P2- Stock wurden seriell weitere Virusstocks nach dem in Kapitel 4.4.2 beschriebenen Vorgehen erstellt. Die hergestellten Virus-Stocks sowie die zugehörigen Titer, Vitalitäten bei der Ernte und real-time PCR Ergebnisse sind in Abbildung 5.51 in Kapitel 5.6 zusammengefasst. Alle zur Untersuchung der Regulation des PTight verwendeten Virusstocks sind in Tabelle 5.4 aufgeführt.

95 5 Ergebnisse

Tabelle 5.4: Analyse verschiedener Stocks des Virus AcMNPV-DHTePt mittels real-time PCR und Endpunkttitration

AcMNPV-DHTePt Infektiöser Titer Viruspartikeltiter Anteil egfp+-Viren -1 -1 Klon Passage (TCID50∙mL ) (VP∙mL ) (%) 6 P3 3,16∙108 3,45∙108 86,3 6 P7-2 8,00∙107 3,14∙109 30,0 6 P7-6 3,16∙108 6,18∙108 18,6

5.4.2 Regulation des PTight durch Doxycyclin

In diesem Kapitel werden die Ergebnisse der Doxycyclin-vermittelten Regulation des PTight unter Verwendung des Virus AcMNPV-DHTePt vorgestellt. Im Virus AcMNPV-DHTePt wird die egfp-Expression durch den PTight und die tta-Expression durch den Ppolh reguliert.

Die Untersuchung der Regulation des Tet-Off Systems mit dem PTight erfolgte für ein erstes Screening der, zum Abschalten des Promotors benötigten, minimalen Doxycyclin- Konzentration in der 96-well Mikrotiterplatte. Anschließend wurde in Schüttelkolben der Verlauf der eGFP-Produktion sowie die maximal produzierbare eGFP-Konzentration bestimmt. Abschließend wurde die minimale Doxycyclin-Konzentration zur Hemmung des

PTight auch für infizierte Sf21-Insektenzellen in Schüttelkultur untersucht.

5.4.2.1 Kultivierungssystem 1: 96-well Mikrotiterplatte Die Regulation des Tet-Off Systems wurde zuerst in 96-well Mikrotiterplatten in einem Konzentrationsbereich von 0 ‑ 100 ng∙mL-1 Doxycyclin in 5 ng∙mL-1 Schritten getestet. Die Versuchsdurchführung erfolgte wie in Kapitel 4.4.5.2 beschrieben und bei der Auswertung der am PlateReader gemessenen Fluoreszenzwerte wurde nach der Anweisung in Kapitel 4.5.5.1 vorgegangen. In Abbildung 5.36 sind die zeitlichen Verläufe der bereinigten eGFP- Produktion infizierter Sf21-Insektenzellen bei den verschiedenen Doxycyclin- Konzentrationen dargestellt. Für die Infektion wurde das Virus AcMNPV-DHTePt P7-2 verwendet. Zur Überprüfung der Basalaktivität wurde das Kontrollvirus AcMNPV-DHTe in Doxycyclin-freiem Medium mitgeführt. Bei den beiden niedrigsten Doxycyclin- Konzentrationen 0 ng∙mL-1 und 0,1 ng∙mL-1 ist nach 42 h ein Anstieg der eGFP-Produktion -1 Pb in den Ansätzen mit dem AcMNPV-DHTePt von etwa 160 RFU auf 1.560 RFU∙Zelle bzw. 1.720 RFU∙Zelle-1 zu erkennen. Bei 5 ng∙mL-1 Doxycyclin wurden aufgrund eines unbekannten Fehlers durchwegs nur sehr niedrige Fluoreszenzwerte gemessen, was zu einer bereinigten eGFP-Produktion von 0 RFU∙Zelle-1 geführt hat. Alle Ansätze mit Doxycyclin-Konzentrationen über 5 ng∙mL-1 sowie das Kontrollvirus zeigen nur eine leichte Erhöhung der gemessenen, bereinigten eGFP-Produktion.

96 5.4 PTight-Promotor des Tet-Off-Systems

Die Basalaktivität des Promotors PTight in Abwesenheit seines Aktivators tTA entspricht hier in etwa der Aktivität des PTight bei maximaler Hemmung.

1.800 )

1 -1

- cDoxycyclin (ng∙mL ):

Z ∙ 1.600 0 0,1

(RFU 1.400 5 10 b 15 20 1.200 25 30

1.000 35 40

45 50 Produktion P Produktion

- 800 55 60 600 65 70

400 75 80 Ber. eGFP Ber. 85 90 200 95 100 0 AcMNPVKon -DHTe 0 24 48 72 96 120 144 168 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.36: Zeitlicher Verlauf der PTight-gesteuerten, bereinigten eGFP -Produktion Pb infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-DHTePt P7-2, MOI 5) bei verschiedenen Doxycyclin- Konzentrationen Aus Abbildung 5.37, in der der prozentuale Anteil der über dem Schwellenwert liegenden Messwerte (eGFP+-Messwerte) dargestellt ist, ist außerdem ersichtlich, dass bei den höheren Konzentrationen bis 69 h nur ein sehr geringer Anteil aller gemessenen Werte zur berechneten, bereinigten eGFP-Produktion beiträgt.

-1 100 cDoxycyclin (ng∙mL ):

90 0 0,1

80 5 10 15 20 70 25 30

60 35 40

Messwerte (%) Messwerte - + 50 45 50 40 55 60 30 65 70 75 80

Anteil eGFP Anteil 20 85 90 10 95 100 0 AcMNPVKon -DHTe 0 24 48 72 96 120 144 168 Prozesszeit (h)

+ Abbildung 5.37: Zeitlicher Verlauf des Anteils eGFP -Messwerte infizierter Sf 21-Insektenzellen (AcMNPV-DHTePt P7-2, MOI 5) bei verschiedenen Doxycyclin-Konzentrationen

97 5 Ergebnisse

Im Vergleich dazu steigt der Anteil der eGFP+-Messwerte bei den beiden niedrigen Konzentrationen (0 ng∙mL-1 und 0,1 ng∙mL-1) bereits nach 20 h deutlich an und erreicht bei 69 h schon 92 % bzw. 96 %. Ab 115 h liegt er bei 100 %, wohingegen bei den Konzentrationen ab 5 ng∙mL-1 nur Maximalwerte zwischen 67 % und 96 % erreicht werden.

Bisher konnte gezeigt werden, dass bereits 10 ng∙mL-1 Doxycyclin ausreichen, um die bereinigte eGFP-Produktion durch den PTight bis auf das Niveau der Basalaktivität zu hemmen. Da hierbei der Bereich zwischen 0,1 ng∙mL-1 und 10 ng∙mL-1 Doxycyclin nicht genauer aufgelöst werden konnte, wurden zur Bestimmung der minimalen, benötigten Doxycyclin-Konzentration im nächsten Schritt weitere Konzentrationen untersucht.

Die Durchführung erfolgte auch hier mit dem Virus AcMNPV-DHTePt P7-2, wie in Kapitel 4.4.5.2 beschrieben, mit der Änderung, dass statt MOI 5 ein MOI von 0,1 eingesetzt wurde. In Abbildung 5.38 ist die bereinigte eGFP-Produktion Db an Tag 4 über die untersuchten Doxycyclin-Konzentrationen 0, 0,1, 1, 2, 10 und 100 ng∙mL-1 aufgetragen. Der zugehörige Anteil an eGFP+-Zellen ist ebenfalls dargestellt. Diese Messergebnisse basieren auf der durchflusszytometrischen Fluoreszenzmessung, wie in Kapitel 4.5.6 beschrieben, von jeweils 5.000 Events, für die die Zellen vorab vorsichtig aus den wells gelöst wurden. Hierdurch sollte eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse mit denen aus Schüttelkolben erleichtert werden, da PlateReader und Durchflusszytometer auf unterschiedlichen Messsystemen basieren und daher eventuell unterschiedliche Sensitivitäten besitzen.

In Abbildung 5.38 ist deutlich zu sehen, dass sich die eGFP-Produktion Db bei einer Doxycyclin-Konzentration von 2 ng∙mL-1 nur noch auf Höhe der Basalaktivität (AcMNPV- DHTe) befindet. Bei weiterer Erhöhung der Doxycyclin-Konzentration sinkt die bereinigte eGFP-Produktion unter das Niveau der Basalaktivität, die ca. 24 % der Maximalaktivität des Promotors ausmacht. Der Anteil eGFP+-Zellen beträgt beim Kontrollvirus 4,7 % und beim AcMNPV-DHTePt 12,3 % bis 22,3 %.

98 5.4 PTight-Promotor des Tet-Off-Systems

90.000 100 eGFP-Produktion

Produktion ) 90 1 80.000

- + Z

eGFP pos ∙ eGFP -Zellen 70.000 80

Basalaktivität (RFU 70 b 60.000

60 (%) Zellen - 50.000 + 50 40.000

40 Produktion D Produktion - 30.000

30 eGFP Anteil 20.000 20

Ber. eGFP Ber. 10.000 10 0 0 0,01 0,1 1 10 100 Doxycyclin-Konzentration (ng∙mL-1)

Abbildung 5.38: Konzentrations-Wirkungs-Kurve zur Doxycyclin-vermittelten Hemmung der

PTight-gesteuerten eGFP-Expression in der 96-well Mikrotiterplatte mit Angabe des Anteils eGFP+-Zellen

Aufgetragen sind die bereinigte eGFP-Produktion Db infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV- DHTePt P7-2, MOI 0,1, 5 dpi) sowie der Anteil eGFP+-Zellen in Abhängigkeit der eingesetzten

Doxycyclin-Konzentration. Die durchgezogene Linie stellt die Basalaktivität des PTight in Abwesenheit von tTA dar. Es kann festgehalten werden, dass im Schüttelkolben eine vollständige Hemmung der -1 bereinigten eGFP-Produktion Db bereits ab 2 ng∙mL eintritt. Als vollständige Hemmung wird hierbei eine Reduktion der bereinigten eGFP-Produktion Db auf Werte kleiner oder gleich der Basalaktivität in Abwesenheit von tTA bezeichnet.

5.4.2.2 Kultivierungssystem 2: Schüttelkolben Das größere zur Verfügung stehende Kultivierungsvolumen im Schüttelkolben erlaubt neben der Fluoreszenzmessung der Zellen auch die Bestimmung der LZD, Vitalität sowie des Virustiters und bei Bedarf der eGFP-Konzentration. In diesem Kapitel werden zuerst der Verlauf der PTight-gesteuerten eGFP-Produktion sowie der Einfluss des Doxycyclins auf weitere Messgrößen beschrieben. Anschließend werden die unter Verwendung des PTight maximal erzielten eGFP-Konzentrationen dargelegt. Zuletzt werden die Ergebnisse zur Ermittlung der minimalen Doxycyclin-Konzentration, die zur maximalen Hemmung des

PTight im Schüttelkolben notwendig ist, gezeigt.

99 5 Ergebnisse

Verlauf der eGFP-Produktion

Bevor die Doxycyclin-regulierte egfp-Expression in geschüttelten Erlenmeyerkolben bei verschiedenen Doxycyclin-Konzentrationen untersucht wurde, wurden in einem Vorversuch nur die Konzentrationen 0, 10 und 100 ng∙mL-1 getestet und hierbei der

Verlauf der bereinigten eGFP-Produktion Db betrachtet. Hierzu wurden Sf21- Insektenzellen, wie in Kapitel 4.4.5.1 beschrieben, im Einfacheinsatz mit dem Virus AcMNPV-DHTePt P7‑2 mit MOI 1 in 300 mL Erlenmeyerkolben infiziert und daraufhin über 4 Tage täglich beprobt. Aus allen Proben wurden die LZD und die Vitalität bestimmt. An den Tagen 0, 2, 3 und 4 wurde auch die eGFP-Fluoreszenz am Durchflusszytometer gemessen, wohingegen die infektiösen Virustiter und die Viruspartikeltiter nur an den Tagen 0, 2 und 4 ermittelt wurden. Die Ergebnisse sind in Abbildung 5.39 bis Abbildung 5.41 dargestellt. In Abbildung 5.39 sind die zeitlichen Verläufe der LZD und Vitalitäten zu sehen. Die Zellen ohne Doxycyclin wachsen innerhalb der ersten 24 h noch von 6,25∙105 Zellen∙mL-1 auf 1∙106 Zellen∙mL-1 und bleiben dann trotz sinkender Vitalität bei dieser Zelldichte, während die Zellen auf 10 ng∙mL-1 und 100 ng∙mL‑1 Doxycyclin sich bereits von Beginn an nicht mehr vermehren. Die Vitalität der Kultur auf 100 ng∙mL-1 beginnt hierbei schon einen Tag früher abzusinken als die der anderen beiden Kulturen einhergehend mit einer Reduktion der LZD auf 4,8∙105 Zellen∙mL-1.

1E+7107 100 00 ng L ∙mL-1 Dox

-1

90 1010 ng∙mL L Dox

---

) ) 80 100 L -1 1 100 ng∙mL Dox

-

mL 70

∙ .... 60 6 1E+610 50

40 Vitalität (%) Vitalität 30

Lebendzelldichte (Z Lebendzelldichte 20 10 1E+5105 0 0 24 48 72 96 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.39: Zeitlicher Verlauf der LZD und Vitalität infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-DHTePt P7-2, MOI 1) bei verschiedenen Doxycyclin-Konzentrationen (n = 1)

In Abbildung 5.40 sind die Verläufe der bereinigten eGFP-Produktion Db sowie der Anteil der eGFP+-Zellen für die drei verschiedenen Doxycyclin-Konzentrationen aufgetragen.

100 5.4 PTight-Promotor des Tet-Off-Systems

40.000

100 .... -1 00P ng∙mL Dox

---

) ) 35.000 80 -1

1 1010P ng∙mL Dox

- Z ∙ 60 30.000 100100P ng∙mL-1 Dox

Zellen (%) Zellen

- +

(RFU 40

b 25.000 20 20.000 0

15.000 -20 eGFP Anteil Produktion D Produktion - -40 10.000 -60 5.000

-80 Ber. eGFP Ber. 0 -100 0 24 48 72 96 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.40: Zeitlicher Verlauf der PTight-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Db infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-DHTePt P7-2, MOI 1) sowie des Anteils eGFP+-Zellen bei verschiedenen Doxycyclin-Konzentrationen (n = 1) Am zweiten Tag nach der Infektion ist eine deutliche Zunahme der bereinigten eGFP- Produktion bei allen Ansätzen erkennbar, wobei die Zellen ohne Doxycyclin am meisten und die Zellen mit 100 ng∙mL-1 Doxycyclin am wenigsten eGFP produzieren. Die eGFP-

Produktion Db steigt über die nächsten 49 h weiter an, jedoch nicht mehr so stark wie bis 47 hpi. Bei der letzten Messung nach 96 hpi besitzen die eGFP+-Zellen ohne Doxycyclin mit 23.200 RFU eine etwa um den Faktor 2,8 stärkere Fluoreszenz als die Zellen mit 100 ng∙mL-1 Doxycyclin und eine 1,5-fach höhere Fluoreszenz als die Zellen mit 10 ng∙mL-1 Doxycyclin. Der Anteil eGFP+-Zellen verläuft synchron mit der Fluoreszenzintensität, wobei die höchsten Werte in dem Ansatz ohne Doxycyclin und die geringsten Werte bei 100 ng∙mL-1 Doxycyclin erzielt werden.

Die zugehörigen Titer an infektiösem Virus und Viruspartikeln sowie der Anteil an Viren, die das eGFP-Gen tragen (egfp+-Viren), sind in Abbildung 5.41 dargestellt. Beginnend bei 5 -1 7 -1 7∙10 TCID50∙mL steigt der infektiöse Titer an Tag 2 auf ca. 3 ‑ 4∙10 TCID50∙mL an und bleibt dann nahezu konstant. Im Vergleich dazu ergeben sich durch die PCR-Analyse von ie-1 durchwegs deutlich höhere Viruspartikeltiter, die im extremsten Fall (0 ng∙mL-1 Doxycyclin; Tag 4) um den Faktor 39 über den infektiösen Titern liegen. Ferner ist zu sehen, dass die mittels PCR bestimmten Viruspartikeltiter von Tag 2 auf Tag 3 noch weiter ansteigen, wohingegen die infektiösen Titer in diesem Zeitraum fast unverändert bleiben. Der Anteil egfp+-Viren liegt zu Beginn der Kultivierung bei ca. 20 % und sinkt innerhalb von 47 hpi auf seinen finalen Wert von durchschnittlich 13 % ab.

101 5 Ergebnisse

1E+101010 -1 100 00I ng∙mL Dox

---

- ) )

. . -1 1

90 1010I ng∙mL Dox

- -

. . 9

1E+910 -

mL -1

.... ) )

∙ 80 100100I ng∙mL Dox

1 -

50

70 mL ∙ 1E+8108

60

Viren (%) Viren - 50 + 1E+77 10 40 egfp

30 Anteil Anteil 1E+6106 20

Viruspartikeltiter (VP Viruspartikeltiter 10 Infektiöser Virustiter (TCID Virustiter Infektiöser 1E+5105 0 0 24 48 72 96 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.41: Zeitlicher Verlauf der infektiösen Virustiter, der Viruspartikeltiter sowie der egfp+-Viren im Überstand infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-DHTePt P7-2, MOI 1) bei verschiedenen Doxycyclin-Konzentrationen (n = 1)

Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die PTight-gesteuerte eGFP-Produktion erst in der sehr späten Phase der Infektion beginnt, anschließend aber über mehrere Tage hinweg eGFP gebildet wird. Der Einfluss von Doxycyclin auf Wachstum und Vitalität der infizierten Sf21-Insektenzellen ist bei 10 ng∙mL-1 noch vernachlässigbar, nimmt mit steigender Doxycyclin-Konzentration jedoch weiter zu. Eine Auswirkung des Doxycyclins auf die Bildung von egfp--Deletionsmutanten unter den Viren konnte nicht beobachtet werden.

Maximalexpression des PTight

Um die maximal mögliche, durch den PTight gesteuerte eGFP-Produktion zu ermitteln, wurden Sf21-Insektenzellen ohne Doxycyclin mit dem Virus AcMNPV-DHTePt P3 und MOI 3 infiziert, täglich beprobt und die eGFP-Konzentration, wie in Kapitel 4.5.5.2 beschrieben, bestimmt. Die eGFP-Konzentration bezogen auf das Volumen der Zellsuspension oder die Zelle ist in Abbildung 5.42 dargestellt.

Die eGFP-Konzentration steigt in den ersten 30 hpi nur leicht auf einen Wert von 2,8 ng∙mL-1 Zellsuspension an und vervierfacht sich in den folgenden 40 h auf 11,7 ng∙mL-1 Zellsuspension, was einer eGFP-Konzentration von 7,5 fg∙Zelle-1 entspricht. Zwischen 70 hpi und 95 hpi ändert sich die eGFP-Konzentration nur noch minimal und erreicht Maximalwerte von 12,7 ng∙mL-1 Zellsuspension bzw. 8,4 fg∙Zelle-1.

102 5.4 PTight-Promotor des Tet-Off-Systems

18 18

16 16

---

.... ) )

14 14 )

1

-

1

-

Z

∙ mL

∙ 12 12

10 10

8 8

6 6

Konzentration (fg Konzentration

- Konzentration (ng Konzentration

- 4 4

2 2 eGFP eGFP

0 0 0 24 48 72 96 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.42: Zeitlicher Verlauf der PTight-gesteuerten eGFP-Konzentration in infizierten Sf21- Insektenzellen (AcMNPV-DHTePt P3, MOI 3, 0 ng∙mL-1 Doxycyclin) Der Verlauf der zugehörigen Zelldichten und Vitalitäten ist in Abbildung 9.4 im Anhang gezeigt.

Doxycyclin-abhängige Hemmung der egfp-Expression

Für eine genauere Untersuchung der Abhängigkeit der egfp-Expression von der Doxycyclin-Konzentration wurden Sf21-Insektenzellen im Triplikat mit einer MOI von 0,1 in 100 mL Erlenmeyerkolben mit dem Virus AcMNPV-DHTePt P7-2 infiziert, nachdem zuvor folgende Doxycyclin-Konzentrationen eingestellt worden waren: 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40 und 50 ng∙mL-1. Nach 5 Tagen wurden die LZD, die Vitalität, der Viruspartikeltiter mittels PCR sowie die eGFP-Fluoreszenz mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die LZD sowie die Vitalität sind in Abbildung 5.43 über die eingestellten Doxycyclin- Konzentrationen aufgetragen. Die LZD schwanken in einem Bereich von 2,5∙106 bis 3,5∙106 Zellen∙mL-1 bei konstant hohen Vitalitäten zwischen 90 % und 95 %.

103 5 Ergebnisse

4,0E+64∙106 100

90

--- ) )

1 6 - 3,0E+63∙10 80

mL

∙ 70

.... 60 6 2,0E+62∙10 50

40 30 (%) Vitalität 1,0E+61∙106 Lebendzelldichte (Z Lebendzelldichte 20

10

0,0E+0 0 0 0 10 20 30 40 50 Doxycyclin-Konzentration (ng∙mL-1)

Abbildung 5.43: Einfluss der Doxycyclin-Konzentration auf LZD und Vitalität infizierter Sf21- Insektenzellen (AcMNPV-DHTePt P7-2, MOI 0,1)

Mittels Durchflusszytometrie wurde die bereinigte eGFP-Produktion Db der Zellen sowie der Anteil eGFP+-Zellen bestimmt, die in normierter Form in Abbildung 5.44 dargestellt sind.

1,2 100

90

---

) )

1 1,0 -

80 ....

Z ∙ 70

(RFU 0,8

b 60

Zellen (%) Zellen - 0,6 50 + 40

0,4 Produktion D Produktion

- 30 20 eGFP Anteil 0,2

10 Ber. eGFP Ber. 0,0 0 0 10 20 30 40 50 Doxycyclin-Konzentration (ng∙mL-1)

Abbildung 5.44: Konzentrations-Wirkungs-Kurve zur Doxycyclin-vermittelten Hemmung der + PTight-gesteuerten eGFP-Expression in Schüttelkultur mit Angabe des Anteils eGFP -Zellen Aufgetragen sind die normierte, bereinigte eGFP-Produktion Db infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-DHTePt P7-2, MOI 0,1, 5 dpi) sowie der Anteil eGFP+-Zellen in Abhängigkeit der eingesetzten Doxycyclin-Konzentration.

104 5.4 PTight-Promotor des Tet-Off-Systems

Die aus der Fluoreszenzmessung gewonnen Daten zur eGFP-Produktion in Abbildung 5.44 zeigen einen Abfall der bereinigten eGFP-Produktion von 0 ng∙mL-1 bis 20 ng∙mL-1 Doxycyclin, die in einem Plateau mündet, in dem die bereinigte eGFP-Produktion unterhalb der Basalaktivität liegt. Das bedeutet, dass die eGFP-Produktion ab einer Doxycyclin-Konzentration von 20 ng∙ml-1 vollständig gehemmt wird. Als vollständige Hemmung wird auch hier eine Reduktion der bereinigten eGFP-Produktion auf Werte kleiner oder gleich der Basalaktivität in Abwesenheit des tTA bezeichnet, die hier bei 8 % der Maximalexpression des PTight liegt. Aus Abbildung 5.44 geht ebenfalls hervor, dass der Anteil an eGFP+-Zellen abhängig von der Doxycyclin-Konzentration ist. Während bei Doxycyclin-Konzentrationen unter 20 ng∙ml-1 noch 20 ‑ 30 % der Zellen eGFP produzieren, sind es bei höheren Konzentrationen aufgrund der Hemmung des PTight nur noch etwa 10 %.

Zusätzlich zur eGFP-Produktion wurden die Proben mit RT-PCR untersucht und die relativen egfp- und tta-Expressionen, bezogen auf die Ansätze ohne Doxycyclin, berechnet, die in Abbildung 5.45 gezeigt sind.

1,2 7

6

1,0

---

....

) )

) ) - 5 - 0,8 4

0,6

Expression ( Expression

Expression ( Expression -

3 - tta egfp 0,4 2

0,2 1

Normierte Normierte

0,0 0 0 10 20 30 40 50 Doxycyclin-Konzentration (ng∙mL-1)

Abbildung 5.45: Konzentrations-Wirkungs-Kurve zur Doxycyclin-vermittelten Hemmung der

PTight-gesteuerten egfp-Expression sowie der Ppolh-gesteuerten tta-Expression in Schüttelkultur Aufgetragen sind die normierte egfp- und tta-Expression infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV- DHTePt P7-2, MOI 0,1, 5 dpi) in Abhängigkeit der eingesetzten Doxycyclin-Konzentration. Zur

Bestimmung der Basalaktivität (durchgezogene Linie) des PTight in Abwesenheit seines Aktivators tTA wurde eine Kontrollkultur mitgeführt, die mit dem Virus AcMNPV-DHTe infiziert wurde.

Im Vergleich zu der, anhand der eGFP-Fluoreszenz bestimmten, Regulation des PTight ist in Abbildung 5.45 die relative egfp-Expression, die mittels rt-RT-PCR bestimmt wurde, aufgetragen. Wie auch in Abbildung 5.44 nimmt die egfp-Expression bei steigender Doxycyclin-Konzentration zunächst ab, da das Doxycyclin an tTA bindet, wodurch dieses

105 5 Ergebnisse

nicht mehr für die Aktivierung des PTight zur Verfügung steht. Die egfp-Expression bildet dann aber kein Plateau, sondern sinkt weiter bis 40 ng∙mL-1, was 13 % der gemessenen Maximalexpression entspricht. Im Vergleich dazu beträgt die egfp-Expression der

Basalaktivitäts-Kontrolle nur 3 %. Das bedeutet, dass der PTight auch im durch Doxycyclin gehemmten Zustand noch eine, im Vergleich zur Basalaktivität ohne tTA, deutlich erhöhte Aktivität aufweist. Sowohl die relative Expression des egfp als auch des tta steigen bei 50 ng∙mL-1 Doxycyclin wieder an, was auf einen offensichtlichen Pipettierfehler zurückzuführen ist. Allgemein kann für die tta-Expression festgestellt werden, dass sie bei 0 ng∙mL-1 und 5 ng∙mL-1 Doxycyclin unterhalb, bei 10 ng∙mL-1 und 15 ng∙mL-1 gleichauf und bei höheren Doxycyclin-Konzentrationen oberhalb der relativen egfp-Expression liegt.

Die jeweils erreichten Viruspartikeltiter sowie der Anteil der egfp+-Viruspartikel sind in Abbildung 5.46 aufgetragen. Die meisten Viruspartikel wurden in den Ansätzen mit 10, 15 und 50 ng∙mL-1 Doxycyclin gebildet, wobei der Unterschied zwischen dem größten und kleinsten Wert nur Faktor 2,8 beträgt und die Werte allgemein sehr hohe Standardabweichungen aufweisen. Der Anteil an egfp+-Viren bewegt sich über alle Doxycyclin-Konzentrationen hinweg in einem Bereich von 14 ± 2 %.

77,E+8∙108 100

66,E+8∙108 90

---

) ) ....

1

- 80

55,E+8∙108 mL ∙ 70

44,E+8∙108 60

Viren (%) Viren - 50 + 33,E+8∙108 40 egfp

22,E+8∙108 30 Anteil Anteil 20 Viruspartikeltiter (VP Viruspartikeltiter 11,E+8∙108 10 0,E+0 0 0 0 10 20 30 40 50 Doxycyclin-Konzentration (ng∙mL-1)

Abbildung 5.46: Einfluss der Doxycyclin-Konzentration auf die Viruspartikeltiter und den Anteil egfp+-Viren im Überstand infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-DHTePt P7-2, MOI 0,1, 5 dpi) Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass, bei der Kultivierung von mit dem Virus AcMNPV-DHTePt infizierten Sf21-Insektenzellen im Schüttelkolben, eine Doxycyclin- Konzentration von 20 ng∙mL-1 für eine vollständige Hemmung der bereinigten eGFP- Produktion ausreichend ist, auch wenn sich diese vollständige Hemmung auf mRNA- Ebene nicht widerspiegelt.

106 5.4 PTight-Promotor des Tet-Off-Systems

5.4.3 Aktivierungskinetik des PTight

Zur genaueren Charakterisierung des PTight wurde dessen Aktivierungskinetik untersucht. Die in diesem Kapitel vorgestellten Ergebnisse zeigen, wie lange es dauert, bis die Aktivität des Promotors anhand der eGFP-Fluoreszenz nachgewiesen werden kann. Außerdem wird dargestellt, ob und bis zu welchem Zeitpunkt nach Infektion ein Wechsel vom inhibierten in den aktiven Zustand des PTight möglich ist.

5.4.3.1 Induktionskinetik In den bisher gezeigten Ergebnissen zur Abhängigkeit der egfp-Expression von der Doxycyclin-Konzentration wurden die Ansätze immer nur täglich beprobt. Um einen zeitlich höher aufgelösten Verlauf der PTight-regulierten eGFP-Produktion zu erhalten, wurden Sf21-Insektenzellen in einer 96-well Mikrotiterplatte mit dem Virus AcMNPV- DHTePt P3 infiziert und für 95 h bei 27 °C ohne Doxycyclin im PlateReader kultiviert. Hierbei wurde stündlich die eGFP-Fluoreszenz aufgenommen. Der Verlauf der bereinigten + eGFP-Produktion Pb ist zusammen mit dem Anteil eGFP -Messwerte in Abbildung 5.47 dargestellt.

3.500

100

__

) )

.. 1

- 3.000

o

..

Z ∙ 80

2.500

(RFU

b

2.000 60 Messwerte (%) Messwerte

1.500 -

40 +

Produktion P Produktion - 1.000 20

500 eGFP Anteil Ber. eGFP Ber.

0 0 0 24 48 72 96 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.47: Zeitlicher Verlauf der PTight-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Pb sowie des Anteils eGFP+-Messwerte infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-DHTePt P3, MOI 5, 0 ng∙mL-1 Doxycyclin) Aus Abbildung 5.47 wird ersichtlich, dass die eGFP-Produktion anhand der eGFP- Fluoreszenz erst ab 24 hpi detektiert werden kann. Während der Anteil eGFP+-Messwerte zwischen 28 hpi und 40 hpi auf beinahe 100 % ansteigt, akkumuliert in dieser Zeit nur wenig eGFP (280 RFU∙Zelle-1).

107 5 Ergebnisse

Die bereinigte eGFP-Produktion nimmt zwischen 40 hpi und 70 hpi mit 48 RFU∙Zelle-1∙h-1 am stärksten zu, bis die Kurve bei ca. 1.700 RFU∙Zelle-1 beginnt abzuflachen und die eGFP- Produktionsrate auf 27 RFU∙Zelle-1∙h-1 abfällt. Die maximale eGFP-Produktion wurde nach einer Kultivierungsdauer von 95 h gemessen und beträgt 2.350 RFU∙Zelle-1.

Diese Ergebnisse bestätigen die im Kapitel 5.4.2 gemachte Beobachtung, dass der PTight erst in der sehr späten Phase der Infektion aktiviert wird und daraufhin über mehrere Tage aktiv bleibt.

5.4.3.2 Zeitabhängige Induzierbarkeit

Die bisherigen Ergebnisse zur Regulation des PTight wurden unter gleichbleibenden Bedingungen gewonnen, das heißt, die eingesetzte Doxycyclin-Konzentration wurde zu Beginn der Kultivierung eingestellt und über deren Dauer nicht verändert. Bei der Herstellung rekombinanter Viren für den Pflanzenschutz reicht es aus, wenn die Hemmung der Produktion des rekombinanten Proteins durch Zugabe von Doxycyclin zum Medium zuverlässig funktioniert und die Viren am Ende durch Ultrazentrifugation abgetrennt werden können. Ist das Ziel aber die Produktion eines rekombinanten Proteins, dessen Expression erst eine gewisse Zeit nach Infektion, z.B. bei Erreichen einer definierten Infektionsrate, eingeschaltet werden soll, muss das System auf Änderungen der Doxycyclin-Konzentration reagieren können.

Um dies zu überprüfen wurden Sf21-Insektenzellen, wie in Kapitel 4.4.5.2 beschrieben, bei einer Doxycyclin-Konzentration von 2 ng∙mL-1 in einer 96-well Mikrotiterplatte ausgesät und mit dem Virus AcMNPV-DHTePt P7-2 infiziert. Wie bereits in Kapitel 5.4.2.1 gezeigt, ist diese Doxycyclin-Konzentration für eine vollständige Hemmung der eGFP- Produktion in 96-well Mikrotiterplatten ausreichend. Nach 24 hpi bzw. 48 hpi wurde ein Medienwechsel durchgeführt, wobei das frische Medium entweder auf eine Doxycyclin- Konzentration von 0 ng∙mL-1 oder 2 ng∙mL-1 eingestellt war. Die eGFP-Fluoreszenz wurde 136 hpi am Durchflusszytometer detektiert. Eine Übersicht über den Ablauf und die Medienwechsel ist in Abbildung 5.48 A dargestellt.

Zum Vergleich der erreichten, bereinigten eGFP-Produktion Db wurden verschiedene Kontrollen herangezogen. Mit dem Virus AcMNPV-DHTePt P7-2 infizierte Zellen wurden ohne Doxycyclin kultiviert und dabei auch den Medienwechseln unterzogen. Sie stellten die jeweilige Positivkontrolle mit der maximal erreichbaren eGFP-Produktion Db dar (roter Pfeil in Abbildung 5.48 B). Als Negativkontrollen wurden sowohl nicht infizierte, als auch mit dem Virus AcMNPV-DHTe P3 infizierte Zellen ohne Doxycyclin mitgeführt.

108 5.4 PTight-Promotor des Tet-Off-Systems

Die zu den, in Abbildung 5.48 A veranschaulichten, vier Bedingungen gehörige und auf die jeweilige Positivkontrolle normierte bereinigte eGFP-Produktion ist in Abbildung 5.48 B als Balken dargestellt. Die grauen Balken entsprechen den Proben, denen nach dem

Waschen wieder Doxycyclin zugesetzt wurde und somit der Aktivität des PTight im gehemmten Zustand, die Werte von 10 % und 19 % annimmt. Die grünen Balken repräsentieren die nach 136 hpi erreichbare eGFP-Produktion Pb, nachdem der Promotor durch Entfernen des Doxycyclins entweder 24 hpi oder 48 hpi aktiviert wurde. Im Vergleich zur Kontrolle ohne Doxycyclin produzieren die Zellen, die 24 hpi auf Doxycyclin- freies Medium umgestellt wurden, in den verbleibenden 112 h (≙ 82 % der Zeit) noch so viel eGFP, dass sie auf 83 % der maximalen eGFP-Produktion Pb kommen. Zellen, bei denen Doxycyclin erst 48 hpi entfernt wurde, erreichen in den 88 h bis zur Messung

(≙ 65 % der Zeit) nur noch 43 % der möglichen eGFP-Produktion Pb.

Infektion + + Dox 0,19 Dox 24 hpi - Dox 0,83 Medien- wechsel + Dox 0,10 48 hpi eGFP- - Dox Detektion 0,43

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 -1 Norm. ber. eGFP-Produktion Pb (RFU∙Z ) Abbildung 5.48: Schematische Darstellung des Versuchsablaufs zur Untersuchung des

Einschalteverhaltens des Tet-Off Systems sowie die jeweils erreichte, PTight-regulierte, bereinigte, normierte eGFP-Produktion Pb Der rote Pfeil stellt die Kontrolle dar, die ebenfalls den Medienwechseln unterzogen, dabei aber immer in Doxycyclin-freiem Medium kultiviert wurde. Durch das Entfernen des Doxycyclins zu verschiedenen Zeitpunkten während der

Kultivierung konnte gezeigt werden, dass der PTight auch 24 hpi bzw. 48 hpi noch aktiviert werden kann, wobei die Ausbeute bei der früheren Aktivierung sowohl insgesamt, als auch bezogen auf die zur Verfügung stehenden Produktionsdauer, höher ist.

109 5 Ergebnisse

5.5 Der Standardpromotor Polyhedrin-Promotor

In dieser Arbeit sollten nicht nur die beiden induzierbaren Promotoren PTight und Pmtn untersucht, sondern auch mit dem zur Proteinproduktion standardmäßig verwendeten

Ppolh verglichen werden. Hierbei wurde besonderes Augenmerk auf den zeitlichen Verlauf der Proteinexpression sowie die maximale Expressionsstärke der Promotoren gelegt.

5.5.1 Herstellung der Virusstocks AcMNPV-Pe

Das Virus AcMNPV-Pe wurde aus Bacmid bPpolhegfp Klon 4 durch Transfektion von Sf21- Insektenzellen, wie in Kapitel 4.4.1 beschrieben, hergestellt. Der P1-Stock wurde nach drei Tagen geerntet und zur weiteren Amplifikation in 100 mL Schüttelkolben eingesetzt. Bei einer Vitalität von 88,8 % wurde der Überstand an Tag 4 abgenommen. In einem weiteren Amplifikationsschritt, in einem 300 mL Schüttelkolben, wurde der P3-Stock hergestellt, der bei einer Vitalität von 90,7 % geerntet wurde. Sowohl vom P2- als auch vom P3-Stock wurden die infektiösen Titer sowie die Viruspartikeltiter bestimmt, die in Tabelle 5.5 zusammengefasst sind.

Tabelle 5.5: Analyse der verschiedenen Stocks des Virus AcMNPV-Pe mittels real-time PCR und Endpunkttitration

AcMNPV-Pe Infektiöser Titer Viruspartikeltiter Anteil egfp+-Viren -1 -1 Klon Passage (TCID50∙mL ) (VP∙mL ) (%) 4 P2 6,31∙107 6,38∙107 102,8 4 P3 2,15∙108 9,18∙107 80,1 Für die Versuche wurde aufgrund des höheren Titers sowie des zur Verfügung stehenden Stock-Volumens mit AcMNPV-Pe P3 gearbeitet.

5.5.2 Regulation der Genexpression durch den Polyhedrin-Promotor

In diesem Kapitel werden die Ergebnisse der Ppolh-gesteuerten egfp-Expression unter Verwendung des Virus AcMNPV-Pe, in dem sich das eGFP-Gen direkt downstream des

Ppolh befindet, vorgestellt.

Obwohl der Ppolh zu den konstitutiven Promotoren zählt, ist er nicht von Beginn der Infektion an aktiv. Er wird erst in der sehr späten Phase der Infektion ab ca. 18 hpi durch bis dahin gebildete virale Transkriptionsfaktoren aktiviert. Der Verlauf der eGFP- Produktion sowie die maximal produzierte eGFP-Menge wurden in dieser Arbeit untersucht und werden in diesem Kapitel beschrieben.

110 5.5 Der Standardpromotor Polyhedrin-Promotor

5.5.2.1 Verlauf der eGFP-Produktion Der Verlauf der eGFP-Produktion wurde durch stündliche Messungen der eGFP- Fluoreszenzintensität infizierter Sf21-Insektenzellen am PlateReader aufgenommen. Hierzu wurden die Zellen mit dem Virus AcMNPV-Pe P3 und MOI 5 in der 96-well Mikrotiterplatte infiziert und anschließend bei 27 °C im PlateReader kultiviert. In

Abbildung 5.49 ist der Verlauf der bereinigten eGFP-Produktion Pb sowie der Anteil der eGFP+-Messwerte aufgetragen.

1,52,E+5∙105

100

__ ) )

1

..

-

o

Z .. ∙ 80

(RFU

5 8.000

b 1,0∙101,E+5

60 6.000

4.000

Messwerte (%) Messwerte - 40 +

Produktion P Produktion 4 - 5,0∙105,E+4 2.000

0 10 20 30 40 20

eGFP Anteil Ber. eGFP Ber. 0,E+0 0 0 0 24 48 72 96 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.49: Zeitlicher Verlauf der Ppolh-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Pb sowie des Anteils eGFP+-Messwerte infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Pe P3, MOI 5) In Abbildung 5.49 ist zu erkennen, dass der Anteil eGFP+-Messwerte bereits zu Beginn der Kultivierung bei über 80 % liegt und die bereinigte eGFP-Produktion anfänglich statt 0 RFU∙Zelle-1 ca. 250 RFU∙Zelle-1 beträgt. Das ist auf bereits im Virusstock vorhandenes eGFP zurückzuführen, das bereits während der Herstellung des Virusstocks aus desintegrierten Zellen ausgetreten ist und somit nun in einer generell erhöhten eGFP- Fluoreszenz der entsprechenden wells resultiert. Ausgehend von diesem erhöhten -1 -1 Startwert beginnt die eGFP-Produktion Pb ab 19 hpi langsam mit 190 RFU∙Zelle ∙h anzusteigen. Zwischen 33 hpi und 45 hpi nimmt sie mit 1.158 RFU∙Zelle-1∙h-1 zu und im Zeitraum von 49 hpi bis 70 hpi um 2.438 RFU∙Zelle-1∙h-1. Ab 70 hpi flacht die Kurve leicht ab und die Steigung sinkt auf 1.709 RFU∙Zelle-1∙h-1. Nach einer Kultivierungsdauer von 95 h -1 wird eine maximale bereinigte eGFP-Produktion Pb von 115.260 RFU∙Zelle erreicht.

Die Ppolh-gesteuerte, bereinigte eGFP-Produktion Pb beginnt wie erwartet in der sehr späten Phase der Infektion nach ca. 19 hpi und steigt bis zum Ende der Messung an Tag 4 weiter an.

111 5 Ergebnisse

5.5.2.2 Maximalexpression

Zur Bestimmung der Maximalexpression des Ppolh wurden Sf21-Insektenzellen mit dem Virus AcMNPV-Pe P3 und MOI 3 infiziert. Die Kolben wurden täglich beprobt und die eGFP-Konzentration, wie in Kapitel 4.5.5.2 beschrieben, bestimmt. Der Verlauf der eGFP- Konzentration bezogen auf das Volumen oder die Zelle ist in Abbildung 5.50 dargestellt.

6.000 6.000

---

5.000 5.000 ....

) )

) )

1

-

1

-

Z

∙ mL ∙ 4.000 4.000

3.000 3.000

2.000 2.000

Konzentration (fg Konzentration

-

Konzentration (ng Konzentration -

1.000 1.000 eGFP eGFP

0 0 0 24 48 72 96 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.50: Zeitlicher Verlauf der Ppolh-gesteuerten eGFP-Konzentration in infizierten Sf21- Insektenzellen (AcMNPV-Pe P3, MOI 3) Die eGFP-Produktion in den infizierten Zellen ist bereits 30 hpi nachweisbar und beträgt 79 fg∙Zelle-1. Innerhalb der nächsten 40 h steigt die eGFP-Konzentration stark an und erreicht 70 hpi 4.136 fg∙Zelle-1 bzw. 4.308 ng∙mL-1 Zellsuspension. Während die volumenspezifische eGFP-Konzentration daraufhin noch weiter ansteigt, sinkt die eGFP- Konzentration pro Zelle aufgrund eines Anstiegs der Gesamtzelldichte leicht ab. Final werden Werte von 5.094 ng∙mL-1 Zellsuspension bzw. 3.966 fg∙Zelle-1 erreicht. Der Verlauf der zugehörigen Zelldichten und Vitalitäten ist in Abbildung 9.4 im Anhang gezeigt.

5.6 Viruscharakterisierung

Die Virusamplifikation ist immer auch mit der Bildung von Virusmutanten verbunden. Virusmutanten sind häufig Deletionsmutanten, denen beispielsweise nur ein einziges Gen oder ganze Genomabschnitte fehlen können. Ist von der Deletion nur das heterologe Gen (in diesem Fall egfp) betroffen, äußert sich das in einer verminderten Produktion des rekombinanten Proteins. Daher wurde in dieser Arbeit die Anhäufung dieser egfp--Viren durch serielle Passage des Virus AcMNPV-DHTePt analysiert. Sind von der Deletion allerdings die zur Replikation des Virus notwendigen Gene betroffen, können sich diese

112 5.6 Viruscharakterisierung

Deletionsmutanten nur mit Hilfe eines intakten Virus vermehren. Dieser Prozess wird als Interferenz und die defekten Viruspartikel als defective interfering particles (DIPs) bezeichnet (siehe Kapitel 2.3.4). Da DIPs sowohl einen negativen Einfluss auf die Produktion des rekombinanten Proteins, als auch auf die Virusamplifikation haben können, wurde ihr Einfluss auf die eGFP-Produktion im Rahmen eines Interferenz-Tests mit Hilfe des Virus AcMNPV-DHTePt untersucht.

5.6.1 Akkumulation von Deletionsmutanten durch serielle Passage

Die Replikation von Virusmutanten mit verkürztem Genom benötigt verhältnismäßig weniger Zeit, wodurch diese einen Vorteil gegenüber intakten Viren besitzen und im Laufe der Zeit akkumulieren. Für das Virus AcMNPV-DHTePt soll deshalb untersucht werden, ob egfp über mehrere Passagen stabil im Virus integriert bleibt. Als Referenzgen wird ie-1 herangezogen, das auf dem Virusgenom natürlicherweise genau einmal vorkommt. Ausgehend von dem Virusstock AcMNPV-DHTePt P2 wurden die Viren 13 Mal, wie in Kapitel 4.4.2 beschrieben, seriell passagiert und anschließend jeweils der infektiöse Virustiter, der Viruspartikeltiter sowie das Verhältnis der Häufigkeiten der Gene egfp und ie-1 (Anteil egfp+-Viren), wie in den Kapiteln 4.4.3 und 4.4.4 beschrieben, bestimmt. In Abbildung 5.51 sind die Vitalitäten der Zellen zum Erntezeitpunkt, die infektiösen Virustiter, die Viruspartikeltiter sowie der Anteil an egfp+-Viren über die entsprechende Passagenzahl aufgetragen.

1,E+111011

100

) inf.inf. Virustiter Titer 1 - 10

1,E+10 10 90

) mL

1 ViruspartikeltiterVP Titer

∙ -

50 80

mL 9 ∙ 1,E+910 VitalitätVit

70 AnteilAnteil egfp+-Viren

8 (%) Viren

1,E+810 60 - + 50

1,E+7107 egfp Vitalität (%) Vitalität 40 6 1,E+610 30 Anteil

Viruspartikeltiter (VP Viruspartikeltiter 20 5

Infektiöser Virustiter (TCID Virustiter Infektiöser 1,E+510 10 1,E+410 4 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Passage (-)

Abbildung 5.51: Entwicklung der infektiösen Titer, Viruspartikeltiter und des Anteils egfp+- Viren über mehrere Passagen unter Angabe der Zellvitalität bei Virusernte Bei der Ernte der Viren wurde darauf geachtet, dass die Vitalität einen Wert von ca. 85 % nicht unterschreitet. Lediglich die Viren der Passage 8 wurden bei einer niedrigeren

113 5 Ergebnisse

Vitalität von 76,5 % geerntet. Die anhand des ie-1 errechneten Viruspartikeltiter betragen in der 2. ‑ 4. Passage zwischen 3,5∙108 VP∙mL-1 und 5,5∙108 VP∙mL-1 und stimmen mit den, durch Endpunkttitration ermittelten, infektiösen Virustitern überein. Der Anteil egfp+- Viren in Passage 2 beträgt 59 % und schwankt zwischen den Passagen 3 bis 5 von 76 % bis 88 %. Passage 5 wurde bei einer sehr guten Vitalität von 96,6 % geerntet und besitzt 5 -1 einen infektiösen Virustiter von 2,9∙10 TCID50∙mL , der deutlich unterhalb des Viruspartikeltiters von 4,3∙107 VP∙mL-1 liegt und wahrscheinlich auf eine Falschbestimmung durch Pipettierfehler oder Ungenauigkeiten bei der Auswertung zurückzuführen ist. Von Passage 5 bis 8 steigen die infektiösen Virustiter bis auf 7 -1 3,2∙10 TCID50∙mL an, einhergehend mit einer Erhöhung der Viruspartikeltiter auf 4,9∙108 VP∙mL-1. Bei Betrachtung des Anteils egfp+-Viren in den eben genannten Passagen ist hingegen zu erkennen, dass der Prozentsatz an Viren, die egfp tragen, rapide sinkt. Ab Passage 8 verringert sich der infektiöse Virustiter mit jeder Passage weiter um insgesamt 4 -1 99,9 % bis auf einen Wert von 3,9∙10 TCID50∙mL , während die Viruspartikeltiter erst konstant bleiben und dann in den letzten drei Passagen um 73,8 % sinken. Die Differenz zwischen den infektiösen Virustitern und den Viruspartikeltitern spiegelt sich auch im Anteil egfp+-Viren wieder, der mit jeder Passage weiter sinkt und ab Passage 11 unter 1 % liegt. In der 15. Passage liegt der Anteil an Viren, in deren Genom egfp integriert ist, im Verhältnis zu den Viren, die ie-1 tragen nur noch bei 0,08 %.

Es kann festgehalten werden, dass die Bildung von egfp--Deletionsmutanten mit jeder Passage zunehmen kann, was in diesem Fall dazu geführt hat, dass nach 15 Passagen nur noch 0,08 % der detektierten Viruspartikel das eGFP-Gen enthalten.

5.6.2 Interferenz-Test

Im vorherigen Kapitel wurde die Bildung und Anhäufung von Deletionsmutanten durch serielle Passage des Virus AcMNPV-DHTePt in Sf21-Insektenzellen untersucht. Dabei wurde u. a. der Virusstock P15 erstellt, der, bezogen auf die detektierbaren Viruspartikel, zu über 99,9 % aus Deletionsmutanten besteht und zusätzlich einen unbekannten Anteil an DIPs enthält. Dieser Virusstock wurde zur Untersuchung der Interferenz von DIPs mit intakten Viren aus dem Virusstock AcMNPV-DHTePt P7-6 eingesetzt. Die Versuchsdurchführung erfolgte wie in Kapitel 4.4.6 beschrieben. Im Folgenden sind die Ergebnisse der täglichen Fluoreszenzmessung sowie die ermittelten infektiösen Virustiter an Tag 3 für die zwölf Variationen aus MOI und DIP-Verdünnung dargestellt. In Abbildung

5.52 sind die Verläufe der bereinigten eGFP-Produktion Pb über die Kultivierungsdauer von 8 Tagen gezeigt.

114 5.6 Viruscharakterisierung

900

) 1

- V1 (MOI 1; 0 %)

Z ∙

800 V2 (MOI 1; 33 %) (RFU

V3 (MOI 1; 66 %) b 700 V4 (MOI 1; 66 %) V5 (MOI 5; 0 %) 600 V6 (MOI 5; 33 %)

Produktion P Produktion V7 (MOI 5; 66 %) - 500 V8 (MOI 5; 100 %) 400 V9 (MOI 10; 0 %)

Ber. eGFP Ber. V10 (MOI 10; 33 %) 300 V11 (MOI 10; 66 %) V12 (MOI 10; 100 %) 200 0 24 48 72 96 120 144 168 192 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.52: Zeitlicher Verlauf der bereinigten eGFP-Produktion Pb von Sf21-Insektenzellen, die mit unterschiedlichen Verhältnissen aus DIPs und intakten Viren infiziert wurden Die jeweilige MOI sowie die DIP-Verdünnung ist für alle zwölf Ansätze zusätzlich in Tabelle 4.13 zusammengefasst.

Es fällt auf, dass die bereinigte eGFP-Produktion Pb nur bei den Variationen 1, 5 und 9, was den Ansätzen ohne zusätzliche Zugabe von DIPs bei MOI 1, 5 und 10 entspricht, ansteigt, wobei sie bei MOI 5 und 10 bereits nach 63 hpi und bei MOI 1 erst nach 92 hpi sichtbar wird. Alle anderen Variationen bilden keine über die Autofluoreszenz hinausgehende eGFP-Fluoreszenz aus. Der prozentuale Anteil der Messwerte, die als eGFP-positiv eingestuft wurden und somit zu den in Abbildung 5.52 gezeigten Werten beigetragen haben, ist in Abbildung 5.53 dargestellt. Hier wird deutlich, dass nur bei den Variationen 5 und 9 (MOI 5 bzw. 10, keine zusätzliche Zugabe von DIPs) genug Zellen infiziert wurden und eGFP produzieren, um ab Tag 3 einen Anteil an eGFP+-Messwerten von 100 % zu erreichen. Variation 1 (MOI 1, keine zusätzliche Zugabe von DIPs) setzt sich ebenfalls von den übrigen Variationen ab, indem der Anteil eGFP+-Messwerte über die Zeit stetig wächst und bis Tag 8 auf einen Wert von 93 % ansteigt. Die Zunahme des Anteils der eGFP+-Messwerte der anderen Variationen kann aufgrund der hohen Standardabweichungen vernachlässigt werden.

115 5 Ergebnisse

100 V1 (MOI 1; 0 %)

90 V2 (MOI 1; 33 %)

V3 (MOI 1; 66 %) 80 V4 (MOI 1; 100 %) 70 V5 (MOI 5; 0 %) 60 V6 (MOI 5; 33 %)

Messwerte (%) Messwerte 50

- V7 (MOI 5; 66 %) + 40 V8 (MOI 5; 100 %) 30 V9 (MOI 10; 0 %)

20 V10 (MOI 10; 33 %) Anteil eGFP Anteil V11 (MOI 10; 66 %) 10 V12 (MOI 10; 100 %) 0 0 24 48 72 96 120 144 168 192 Prozesszeit (h)

Abbildung 5.53: Zeitlicher Verlauf des Anteils eGFP+-Messwerte von Sf21-Insektenzellen, die mit unterschiedlichen Verhältnissen aus DIPs und intakten Viren infiziert wurden Die jeweilige MOI sowie die DIP-Verdünnung ist für alle zwölf Ansätze zusätzlich in Tabelle 4.13 zusammengefasst. Dass die Zugabe von DIPs sich auch auf die Replikation intakter Viren ausgewirkt hat, kann anhand der mittels Endpunkttitration bestimmten infektiösen Virustiter von Tag 3 festgestellt werden, die in Abbildung 5.54 in Abhängigkeit der eingesetzten DIP- Verdünnung dargestellt sind.

1,E+7107

MOI 1

) 1

- MOI 5

mL ∙ 6

50 1,E+610 MOI 10

1,E+5105

1,E+4104

Infektiöser Virustiter (TCID Virustiter Infektiöser

1,E+3103 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

DIP-Verdünnung (%(v/v) Virusstock P15 in Medium)

Abbildung 5.54: Einfluss der DIP-Konzentration auf die Produktion infektiöser Viren durch Sf21- Insektenzellen bei unterschiedlichen MOI (AcMNPV-DHTePt P7-6, 3 dpi)

116 5.6 Viruscharakterisierung

5 -1 6 -1 Die höchsten infektiösen Virustiter von 6,31∙10 TCID50∙mL bis 5,88∙10 TCID50∙mL wurden erreicht, wenn zusätzlich zu den intakten Viren aus dem Virusstock AcMNPV- DHTePt P7-6 nur Medium (entspricht der 0 % DIP-Verdünnung) zu den Zellen gegeben wurde. Bereits eine Erhöhung der DIP-Konzentration durch Zugabe der 33 % DIP- Verdünnung führt zu einer deutlichen Reduktion an gebildeten infektiösen Viren, was durch die Zugabe weiterer DIPs noch verstärkt wird. Den stärksten Einfluss auf die Virusreplikation hatten die DIPs in den Ansätzen mit MOI 1, gefolgt von MOI 5 und MOI 10. Während sich die infektiösen Titer ohne und mit maximaler Zugabe von DIPs bei MOI 1 um den Faktor 1.431 unterscheiden, betragen die Unterschiede bei MOI 5 nur Faktor 501 und bei MOI 10 nur Faktor 35. Der stärkste Abfall wurde hierbei jeweils zwischen dem Ansatz ohne zusätzliche DIPs und dem Ansatz mit der 33 % DIP- Verdünnung gemessen.

Mit Hilfe des Interferenz-Tests konnten die Auswirkungen von DIPs belegt werden, wodurch indirekt bewiesen werden konnte, dass sich im eingesetzten Virusstock AcMNPV-DHTePt P15 DIPs befinden, die während der seriellen Passage des Virus entstanden sind. Zu den untersuchten Auswirkungen zählen eine verminderte eGFP- Produktion sowie reduzierte infektiöse Virustiter.

117

6 Fehlerbetrachtung

Auf die allgemein bekannten Fehler, die in Form von Ungenauigkeiten beim Pipettieren, Ablesen, Wiegen und Messen auftreten, soll hier nicht genauer eingegangen werden. Stattdessen werden die verwendeten Methoden auf etwaige Fehlerquellen hin beleuchtet und erläutert, was zur Vermeidung dieser Fehler unternommen wurde. Allgemein wurden - insofern nicht anders angegeben - Versuche in Schüttelkolben im biologischen Triplikat und Versuche in 96-well Mikrotiterplatten im biologischen Vierfachansatz durchgeführt, sodass anhand der berechneten Standardabweichungen die biologische Variabilität der Proben beschrieben werden kann.

6.1 Toxizitätstest

Die Bestimmung der Kupfertoxizität auf Sf21-Insektenzellen erfolgt mittels MTT-Test, bei dem die Reduktion von MTT zu Formazan durch die in den Zellen vorhandenen Reduktionsäquivalente NADH und NADPH gemessen wird. Der Umsatz ist somit von der Glykolyserate abhängig und spiegelt die Stoffwechselaktivität der Zellen wieder. Der Test erlaubt allerdings keine Unterscheidung zwischen 50 Zellen mit maximaler Stoffwechselaktivität und 100 Zellen mit halbmaximaler Stoffwechselaktivität, weshalb die bestimmten Werte immer auf eine Kontrolle mit gleicher Zellzahl bezogen wurden.

6.2 Virustiterbestimmung

Der Erfolg der Virusproduktion sowie der Expression heterologer Proteine im Baculovirus- Insektenzell-Expressionssystem ist von der Robustheit und Effizienz des Produktionsprozesses abhängig. Hierfür ist es notwendig die Prozessparameter zu steuern und dadurch Abweichungen im Prozess zu minimieren. Die multiplicity of infection (MOI) ist hierbei einer der wichtigsten Parameter, da nicht reproduzierbare MOI zu Qualitätsschwankungen zwischen den Chargen führen können. Auf die zuverlässige Bestimmung der Virustiter muss daher besonderes Augenmerk gelegt werden. In dieser Arbeit kamen zur Virustiterbestimmung die beiden Methoden Endpunkttitration und rt- PCR zum Einsatz.

118 6.2 Virustiterbestimmung

6.2.1 Endpunkttitration

Zur Bestimmung des infektiösen Virustiters mittels Endpunkttitration werden Zellen in einer 96-well Mikrotiterplatte mit einer Verdünnungsreihe des zu untersuchenden Virusstocks infiziert und nach 7 ‑ 10 Tagen der Anteil an infizierten wells pro -1 Verdünnungsstufe bestimmt. Die Berechnung des infektiösen Titers in TCID50∙mL erfolgt nach der Methode von Reed und Muench (1938). Laut Roldão et al. (2011) verursachen Unterschiede in der eingesetzten Zelldichte, der Kultivierungsdauer sowie der Handhabung die größten Abweichungen des ermittelten Virustiters. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit immer mit einer Zelldichte von 2,5∙105 Zellen∙mL-1 gearbeitet, um einerseits ein Untersplitten der Zellen zu vermeiden und andererseits sicherzustellen, dass die Zellen nur im monolayer wachsen, was die spätere Auswertung erleichtert. Ferner wurden die Mikrotiterplatten jeweils nach 7 und 10 Tagen auf die Anzeichen einer Infektion hin untersucht, sodass die Inkubationszeiten immer identisch waren. Außerdem hatten die infizierten Zellen so genug Zeit, neue Viren zu bilden, die durch Sekundärinfektion weitere Zellen innerhalb eines wells infizieren konnten, wodurch die Identifizierung infizierter wells präziser wurde. Durch diese Maßnahmen konnten bei Dreifachbestimmungen Standardfehler im Bereich von 16 % bis 64 % erreicht werden.

Ein weiterer Aspekt, der bei der Beurteilung der Methode berücksichtigt werden muss, ist wie sich egfp--Deletionsmutanten und replikationsdefiziente Viren (DIPs, engl.: defective interfering particles) auf das Ergebnis des Test auswirken. Da die Bestimmung des infektiösen Titers hauptsächlich auf der Detektion der eGFP-Fluoreszenz infizierter Zellen beruht und die mit egfp--Deletionsmutanten und DIPs infizierten Zellen kein (oder weniger) eGFP produzieren, wird in diesem Fall die Infektion nicht erkannt und der infektiöse Titer zu niedrig berechnet.

Bei dem Virus AcMNPV-Me, in dem die egfp-Expression durch den Pmtn reguliert wird, wurde der Promotor im Rahmen der Endpunkttitration durch die Zugabe von 50 µM CuCl2 induziert, da die, aufgrund der Basalaktivität des Promotors produzierte, eGFP-Menge nicht ausreicht, um den Test fehlerfrei auszuwerten. Der Zugabezeitpunkt wurde bei der Analyse des P2-Stocks auf Tag 4 festgesetzt, sodass die Zellen dem toxisch wirkenden Kupfer nicht unnötig lange ausgesetzt sind, jedoch genug Zeit haben, um eGFP zu bilden.

Später hat sich allerdings herausgestellt, dass die Induktion des Pmtn nur bis maximal zwei Tage nach der Infektion möglich ist, weshalb davon ausgegangen werden kann, dass die Induktion bei der Virustiterbestimmung von P2 nicht erfolgreich war. Daraus folgt, dass ein Teil der infizierten Zellen nicht erfasst wurde und der infektiöse Titer zu niedrig berechnet wurde. Für die Bestimmung aller weiteren infektiösen Titer wurde das Kupfer gleich bei Infektion mit zu den Ansätzen gegeben.

119 6 Fehlerbetrachtung

6.2.2 Real-time Polymerasekettenreaktion

Als weitere Möglichkeit zur Bestimmung der Virustiter wurde eine real-time PCR- Methode basierend auf den Genen ie-1 und egfp im Baculovirusgenom etabliert. Beim Design der Primer wurde darauf geachtet, dass diese keine Primerdimere bilden und bei der gleichen Temperatur hybridisieren (65 °C). Die Abwesenheit von Primerdimeren, welche in zu hohen berechneten Virustitern resultieren, wurde durch eine Schmelzkurvenanalyse bestätigt. Die Aufreinigung der viralen DNA aus den Kultivierungsüberständen bzw. Virusstocks erfolgte über das High Pure Viral Nucleic Acid Kit, da dieses die reproduzierbarsten Ergebnisse lieferte. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass die DNA-Bindesäule bei extrem hohen Virustitern (> ca. 1∙109 VP∙mL-1) überladen war, was zu einer Verschlechterung der Wiederfindung und damit zur Berechnung eines zu niedrigen Virustiters führen kann. Die gewonnene

DNA wurde 10:1.000 in H2ODEPC verdünnt, wovon 3,5 µL für die PCR eingesetzt wurden. Dadurch wurde sichergestellt, dass die erhaltenen Cq-Werte im zulässigen Bereich oberhalb von 10 Zyklen liegen. Bei der Auswertung der PCR-Ergebnisse und der Erstellung der Kalibrierfunktionen wurden die unterschiedlichen Effizienzen der Primerpaare berücksichtigt. Die real-time PCR ist eine sehr präzise Methode, mit Standardfehlern von unter 1 % bei technischen Replikaten. Inklusive der Aufreinigung der viralen DNA konnten in dieser Arbeit Standardfehler von unter 2 % erzielt werden.

Die berechneten Virustiter werden als Viruspartikeltiter bezeichnet, um sie zum einen von den mittels Endpunkttitration bestimmen Virustitern zu differenzieren und zum anderen, um deutlich zu machen, dass mit dieser Methode keine Aussage über die Infektiosität der Viren getroffen werden kann, sondern nur über die Anwesenheit der untersuchten Gene. Aufgrund von Deletionen im viralen Genom können sich folgende vier, für diese Methode relevante, Genotypen bilden:

a) egfp+ und ie-1+ (intaktes Virus; eGFP-Produktion) b) egfp+ und ie-1- (DIP; keine eGFP-Produktion) c) egfp- und ie-1+ (replikationsfähige Deletionsmutante; keine eGFP-Produktion) d) egfp- und ie-1- (DIP; keine eGFP-Produktion)

Das führt zu einer Reihe von Überlegungen, die hier kurz dargestellt sind:

Da das IE-1-Gen zur Virusreplikation benötigt wird (Stewart et al., 2005; Crouch und Passarelli, 2005), wird die Annahme getroffen, dass ie‑1+-Viren replikationsfähig sind, wohingegen ie-1--Viren replikationsdefizient sind (Zwart et al., 2008). Es besteht jedoch auch die Möglichkeit, dass einem ie-1+-Virus andere für die Replikation essentielle Gene fehlen und es somit tatsächlich replikationsdefizient ist.

120 6.3 Interferenz-Test

Da anhand der hier vorgestellten Methode nicht zwischen den beiden Fällen unterschieden werden kann, muss dieser Sachverhalt bei der Interpretation der Daten berücksichtigt werden.

Der Vergleich der Häufigkeiten der Gene egfp und ie-1 zur Beurteilung der Qualität eines Virusstocks ist nur eine Näherung und darf nicht als realer Anteil egfp+-Viren an den ie-1+- Viren missinterpretiert werden. Ein Anteil egfp+-Viren von 20 % bedeutet also nicht zwangsweise, dass von 100 Viren 20 sowohl das IE-1- als auch das eGFP-Gen tragen (a) und 80 nur das IE-1-Gen, nicht aber egfp (c). Tatsächlich könnte es sich um 150 Viren handeln, von denen 100 ie-1+ und egfp- (c) sind, 20 ie-1- und egfp+ (b) und 30 die keines der beiden Gene besitzen (d).

Das eben beschriebene Szenario macht auch deutlich, dass DIPs der Kategorie (d) mittels PCR nicht detektiert werden können und die anderen drei Genotypen immer als Gemisch vorliegen können. Bei der Berechnung der MOI für die Infektion muss also festgelegt werden, auf welchen Titer (infektiöser Virustiter, egfp+- oder ie-1+-Viruspartikeltiter) die MOI bezogen sein soll.

6.3 Interferenz-Test

Zur Untersuchung des Einflusses von DIPs auf die Produktion des rekombinanten Proteins eGFP wurden zwei Virusstocks verwendet, von denen einer als Quelle für intakte Viren (P7-6) zum Einstellen der gewünschten MOI und der andere als Quelle für DIPs (P15) verwendet wurde. Bei der Berechnung des benötigten Inokulums zur Einstellung der gewünschten MOI wurden nur die intakten Viren aus dem Stock P7-6 berücksichtigt, da der Anteil intakter Viren im Stock P15 unter 0,1 % lag. Durch die Vernachlässigung der intakten Viren aus P15 haben sich tatsächlich minimal höhere MOI ergeben, als ursprünglich berechnet und angegeben. Allerdings wurde auch das Volumen des zugegebenen Stocks P15 bei der Berechnung vernachlässigt, sodass das tatsächliche Volumen maximal 10 % größer war als angenommen.

In Tabelle 6.1 sind die angegebenen und die tatsächlichen MOI unter Berücksichtigung der intakten Viren und des zusätzlichen Volumens aus Stock P15 für alle Ansätze zusammengefasst. Da sich die angegebenen und tatsächlichen MOI nur auf intakte Viren beziehen, ist in Tabelle 6.1 zusätzlich die auf alle Viruspartikel bezogene MOI angegeben. Zu den Viruspartikeln zählen neben den intakten Viren auch alle Deletionsmutanten, die mittels PCR über das IE-1-Gen nachgewiesen werden können. Nicht berücksichtigt sind DIPs, die aufgrund ihrer Deletionen nicht mittels PCR detektiert werden können, da ihre Konzentration in den Virusstocks unbekannt ist.

121 6 Fehlerbetrachtung

Tabelle 6.1: Übersicht über die verschiedenen MOI beim Interferenz-Test

Variation Angegebene MOI Tatsächliche MOI Tatsächliche MOI inkl. Mutanten 1 1 1,05 29 2 1 1,04 4.649 3 1 1,02 8.983 4 1 1,01 13.045 5 5 5,24 146 6 5 5,09 4.744 7 5 4,95 9.059 8 5 4,82 13.104 9 10 10,43 291 10 10 10,12 4.863 11 10 9,83 9.154 12 10 9,54 13.178 Aus Tabelle 6.1 wird ersichtlich, dass sich die tatsächlichen MOI um maximal 4,6 % von den angegebenen MOI unterscheiden. Es kann daher festgehalten werden, dass die durchgeführte vereinfachte Berechnung zu keinen Fehlern geführt hat, die die Standardabweichung im Rahmen der Pipettiergenauigkeit überschreiten.

6.4 Real-time Reverse Transkription Polymerasekettenreaktion

Bei der Durchführung einer rt-RT-PCR können an mehreren Stellen in der Planung, Probenvorbereitung und Datenauswertung Fehler auftreten, die durch die im Folgenden genannten Maßnahmen so gut wie möglich vermieden wurden.

Die beim Design der Primer festgelegte Hybridisierungstemperatur muss so gewählt werden, dass sie maximal 2 °C unterhalb der Schmelztemperatur der einzelnen Primer liegt, um unspezifische Bindungen zu vermeiden. Da es von Vorteil ist, wenn mehrere Reaktionen mit verschiedenen Primern parallel in einem Lauf durchgeführt werden können, wurde die Hybridisierungstemperatur in dieser Arbeit auf 65 °C festgelegt und die Primer entsprechend designt. Es wurde bei der Wahl der DNA-Sequenz der Primer weiterhin darauf geachtet, dass die Primer sich nicht selbst oder gegenseitig binden, da eine Vervielfältigung von Primerdimeren, in die der zur Detektion von doppelsträngiger DNA verwendete Farbstoff SYBR Green interkalieren kann, die Messergebnisse verfälscht. Nach jedem PCR-Lauf wurde daher eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt, in der Primerdimere, aufgrund ihrer vom Ziel-Fragment unterschiedlichen Schmelztemperatur, identifiziert werden können. Für jedes Primerpaar wurde die Effizienz bestimmt und bei der Auswertung der Daten im Rahmen der Expressionsanalyse berücksichtigt.

122 6.5 Fluoreszenzmessung intakter Zellen am PlateReader

Die Extraktion der zu untersuchenden RNA aus den Zelllysaten erfolgt über eine RNA- Bindesäule mit einer maximalen Bindekapazität für RNA-Moleküle über 200 bp von 100 µg. Um die Bindekapazität nicht zu überschreiten wurden in Vorversuchen verschiedene Zellzahlen für die Extraktion eingesetzt und die jeweiligen RNA-Ausbeuten dazu ins Verhältnis gesetzt. Es hat sich gezeigt, dass bis 4∙106 Zellen ein linearer Zusammenhang aus eingesetzter Zellzahl und erhaltener RNA besteht. Um sicher zu gehen, dass dieser Wert nicht überschritten wird, wurde eine Zellzahl von 2∙106 Zellen pro Säule festgelegt. Die extrahierte RNA ist sehr empfindlich gegenüber RNasen, weshalb alle Arbeiten auf Eis und unter Verwendung von H2ODEPC ausgeführt wurden. Alle Oberflächen sowie eingesetztes Equipment wurden zudem vorab mit RNase AWAY behandelt. Bevor die RNA als Vorlage für die Umschrift in cDNA eingesetzt werden kann, müssen eventuelle DNA-Kontaminationen entfernt werden, da diese in der PCR ebenfalls als template dienen und dadurch das Ergebnis verfälschen können. Hierzu wird die Probe zuerst über eine DNA-Bindesäule aufgereinigt und anschließend noch mit DNase I behandelt. Dennoch kann in der NRT-Kontrolle (als template wird hier die nicht in cDNA umgeschriebene RNA-Probe eingesetzt) noch DNA nachgewiesen werden. Da der Abstand zwischen den Cq-Werten der Proben und der NRT aber mehr als sieben Zyklen beträgt, was bedeutet, dass die Verunreinigung durch DNA weniger als 1 % des Messsignals ausmacht, kann eine Verfälschung der Messergebnisse durch die restliche DNA ausgeschlossen werden.

6.5 Fluoreszenzmessung intakter Zellen am PlateReader

Die Bestimmung der eGFP-Fluoreszenz in intakten, adhärent wachsenden Insektenzellen in 96-well Mikrotiterplatten unterliegt einigen nicht vermeidbaren Fehlern. Die Messung der eGFP-Fluoreszenz erfolgt in jedem well an 100 Messpunkten mit einem Abstand von 0,72 mm. Aufgrund von starken Randeffekten werden für die Auswertung nur die inneren 36 Messpunkte herangezogen. Obwohl darauf geachtet wurde, einen möglichst konfluenten Zellrasen zu erhalten, sollte die Bildung von mehreren Zellschichten vermieden werden. Daher wurden die Zelldichten zu Beginn der Kultivierung so gewählt, dass trotz weiterem Wachstum der Zellen über einen Tag die Zellen weiterhin als monolayer vorliegen. Dadurch sollte sichergestellt werden, dass möglichst an jedem Messpunkt auch eine Zelle getroffen wird und nicht eine Lücke zwischen den Zellen, wodurch ein falscher Fluoreszenzwert aufgenommen werden würde. Um eine synchrone Infektion der Zellen zu erreichen, wurde zur Infektion eine MOI von 5 eingesetzt.

123 6 Fehlerbetrachtung

Dennoch konnte beobachtet werden, dass nicht alle Zellen eGFP produzierten, was in einer inhomogenen Verteilung der Fluoreszenzwerte resultierte. An jedem der 36 Messpunkte kann eins der folgenden drei Szenarien eintreten:

1) eine eGFP-produzierende Zelle wird mittig getroffen 2) eine nicht eGFP-produzierende Zelle wird mittig getroffen 3) der Messpunkt liegt zwischen den Zell-Mittelpunkten

Während Szenario 1) zu einem sehr hohen Signal führt, resultiert aus Szenario 2) ein eher geringes Signal im Bereich der Autofluoreszenz der Zelle. Bei Szenario 3) sind aber alle Fluoreszenzwerte zwischen Szenario 1) und 2) möglich, je nach dem wo genau die Messung stattfindet. Daraus ergibt sich eine sehr hohe Standardabweichung mit Standardfehlern von bis zu ± 60 % für diese Methode. Diese Ungenauigkeit wird aber in Kauf genommen, da keine andere nicht-invasive Methode zur Verfolgung der eGFP- Produktion in den Zellen zur Verfügung steht.

Es muss außerdem beachtet werden, dass der Anteil der eGFP+-Messwerte nicht gleich dem Anteil eGFP+-Zellen ist. Der zeitliche Verlauf kann aber als grobe Näherung für den Verlauf des Anteils eGFP-positiver und somit infizierter Zellen herangezogen werden.

124

7 Diskussion

Baculoviren werden hauptsächlich in zwei Bereichen eingesetzt: als Biopestizid im Pflanzenschutz und zur Expression rekombinanter Proteine im Baculovirus-Insektenzell- Expressionssystem (BEVS). Wenn davon ausgegangen wird, dass die Expression eines rekombinanten Proteins im BEVS während der Virusamplifikation einen Selektionsnachteil gegenüber Viren darstellt, die aufgrund von Deletionen oder Mutationen in der Expressionskassette das rekombinante Gen nicht exprimieren, kann eine Hemmung der Proteinexpression während der Virusvermehrung diesen Selektionsnachteil reduzieren. Dadurch wäre der Anteil an Virusmutanten, die das rekombinante Protein nicht exprimieren, geringer, wodurch ein effizienteres scale-up mit anschließend höherer Proteinexpression erreicht werden kann (Fitzgerald und Walzel, 2012). Die Aktivierung der Expression des rekombinanten Gens durch einen induzierbaren Promotor zu einem speziellen Zeitpunkt nach der Infektion kann zudem zu einer synchroneren Proteinproduktion und einer homogeneren Proteinqualität führen.

Auch im Bereich der Herstellung rekombinanter Baculoviren für den Pflanzenschutz wäre ein induzierbarer Promotor zur Steuerung der Expression des heterologen, die insektizide Wirkung des Virus verstärkenden, Proteins von großem Vorteil. Wie bereits erwähnt, können diese rekombinanten Viren nicht in Larven hergestellt werden, da sie ihre Wirte zu schnell töten und dadurch keine wirtschaftlichen Ausbeuten erzielt werden können (Grzywacz und Moore, 2017). Durch den Einsatz eines induzierbaren Promotors kann die Expression des heterologen Gens während der Produktionsphase der Baculoviren gehemmt werden, wodurch Ausbeuten wie bei Wildtyp-Viren erzielt werden könnten. Die Hemmung der Expression des heterologen Gens hat nicht nur den Vorteil, dass die Wirte länger überleben und dadurch die Ausbeute steigt, sondern auch, dass keine zellulären Ressourcen für die Proteinproduktion verschwendet werden und stattdessen in die Produktion der Viren investiert werden können. Erst wenn das Virus auf dem Feld versprüht wurde und seinen Wirt infiziert hat, wird der Promotor aktiviert bzw. nicht mehr gehemmt und die Expression des Wirkstoffs beginnt.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher zwei rekombinante Viren mit den induzierbaren

Promotoren Metallothionein-Promotor Pmtn und dem PTight des Tet-Off Systems hergestellt, anhand der Expression des Reporterproteins eGFP charakterisiert und mit dem Polyhedrinpromotor Ppolh, dem Standardpromotor des BEVS, verglichen. Ferner wurde die Bildung von Deletionsmutanten der rekombinanten Viren sowie deren Auswirkung auf die eGFP-Produktion untersucht. Die in Kapitel 5 gezeigten Ergebnisse sollen im Folgenden diskutiert werden.

125 7 Diskussion

7.1 Herstellung der Viren

Für die Herstellung rekombinanter Baculoviren mussten zunächst die benötigten Transfervektoren und Bacmide durch molekularbiologische Arbeiten kloniert werden. Aus den Bacmiden wurden durch Transfektion von Sf21-Insektenzellen die rekombinanten Baculoviren hergestellt. Diese enthalten zur Expression des Reporterproteins eGFP entweder den Polyhedrin-Promotor (Ppolh), den Metallothionein-Promotor (Pmtn) oder das

Tet-Off System (PTight). Der Ppolh dient in diesem Zusammenhang als Standard-Promotor, mit dem die beiden regulierbaren Promotoren Pmtn und PTight verglichen werden sollen.

7.1.1 Herstellung der Bacmide

Im Bacmid bPpolhegfp wird die Expression des egfp Gens durch den Ppolh kontrolliert, der aufgrund seiner Stärke den Standard-Expressions-Promotor im BEVS darstellt. Das aus diesem Bacmid hergestellte Virus AcMNPV-Pe dient daher als Kontrolle für die Maximalexpression. Die Klonierung erfolgte, wie im Klonierungsplan in Kapitel 9.4.1 beschrieben, wobei am Ende mindestens drei von sechs erhaltenen Klonen das korrekte rekombinante Bacmid trugen, was mittels PCR bestätigt werden konnte. Im Agarosegel in Abbildung 5.3 waren bei allen sechs untersuchten Klonen, unabhängig von der erwarteten Bande bei ca. 3.000 bp, auch noch sehr schwache Banden bei ca. 8.000 bp zu sehen. Diese Bande tritt auch dann auf, wenn wie in Spur 2 keine Bande bei 3.000 bp zu sehen ist, weshalb es sich entweder um ein Produkt der Bildung von Primerdimeren oder um die eingesetzte Bacmid-DNA handelt. Da in der NTC keine Banden zu erkennen sind, kann die Bildung von Primerdimeren ausgeschlossen werden. Folglich stellt die Bande bei ca. 8.000 bp wahrscheinlich das eingesetzte Bacmid dar. Obwohl das Bacmid mit einer Länge von 136 kb nicht auf Höhe des 8.000 bp Größenstandards erwartet werden würde, ist es durchaus möglich, dass es im Agarosegel so weit wandert, falls das zirkuläre Bacmid als supercoil vorliegt. Ferner deckt sich die Intensität der Bande mit der eingesetzten Masse von etwa 10 ng Bacmid pro Spur.

Das Bacmid bPmtnegfp enthält das eGFP-Gen unter Kontrolle des durch Kupferionen induzierbaren Promotors Pmtn. Das aus diesem Bacmid hergestellte Virus AcMNPV-Me wird zur Untersuchung der Promotoraktivität des Pmtn durch Bestimmung der kupferabhängigen egfp-Expression eingesetzt. Die Klonierung erfolgte wie in Kapitel 9.4.2 beschrieben und erbrachte zehn Klone, die mittels PCR auf die korrekte Länge des Inserts

überprüft wurden. Da der verwendete forward Primer pUC/M13 im Bacmid bPmtnegfp nicht nur im Vektorrückgrat sondern auch im Insert bindet, wurden zwei DNA-Fragmente bei 1.831 bp und 3.364 bp erwartet.

126 7.1 Herstellung der Viren

Auf dem Agarosegel in Abbildung 5.8 sind neben den erwarteten Banden aber noch zwei weitere Banden zu sehen, die anhand der Primerbindestellen nicht erklärt werden können. Die höhere der beiden zusätzlichen Banden läuft bei etwa 8.000 bp und somit ungefähr auf der gleichen Höhe wie die zusätzliche Bande bei Bacmid bPpolhegfp in Abbildung 5.3, weshalb es sich hierbei wahrscheinlich auch um das eingesetzte Bacmid handelt. Eine weitere Bande bei ca. 2.600 bp könnte durch einen Abbruch der DNA- Replikation entstanden sein, der auf die supercoiled Struktur des Bacmids zurückzuführen ist.

Das Bacmid bDHPTightegfp-Ppolhtta enthält für die egfp-Expression den durch Doxycyclin regulierbaren Promotor PTight. Der zur Aktivierung des Promotors benötigte Tetracyclin-

Transaktivator (tTA) wird unter Kontrolle des starken Ppolh exprimiert, sodass sichergestellt werden kann, dass ausreichend viel tTA produziert wird. Durch zusätzlich eingefügte HS4 core insulator Sequenzen soll verhindert werden, dass der PTight durch den

Ppolh oder sonstige, auf dem Bacmid vorhandene, enhancer-Sequenzen aktiviert wird. Die HS4 core insulator Sequenzen enthalten repetitive Elemente, die bei der Vermehrung der Plasmide in E. coli DH5α dazu geführt haben, dass immer wieder Teile der DNA aus dem Plasmid entfernt wurden. Aus diesem Grund wurde zu E. coli SURE (stop unwanted rearrangement events) Zellen gewechselt. Dem SURE Stamm fehlen wichtige Enzyme zum Umbau und zur Deletion von DNA-Fragmenten, die in E. coli unübliche Sekundär- und Tertiärstrukturen bilden. Somit konnte das Plasmid trotz der Ausbildung loop-förmiger Sekundärstrukturen im Bereich der HS4 core insulator Sequenzen erfolgreich vermehrt werden. Zur Herstellung und Vermehrung des Bacmids mussten E. coli DH10Bac™ Zellen verwendet werden, die allerdings nur bei 30 °C kultiviert wurden. Durch das verlangsamte Wachstum der Zellen im Vergleich zur Kultivierung bei 37 °C wurde versucht das Auftreten von DNA-Deletionen zu vermeiden oder zumindest zu reduzieren. Die Kontroll- PCR der Bacmide (siehe Agarosegel in Abbildung 5.12) hat allerdings gezeigt, dass elf der zwölf erhaltenen Klone ein Bacmid ohne Insert enthalten, was der Bande bei 300 bp entspricht. Wäre das Insert vollständig eingebaut worden, müsste die PCR ein DNA- Fragment der Größe 5.330 bp ergeben, was im Agarosegel allerdings bei keinem Klon zu erkennen ist. Stattdessen sind bei einigen Klonen weitere Banden bei 3.500 bp, 5.000 bp und ca. 7.000 bp zu sehen. Dieses Ergebnis legt die Vermutung nahe, dass die Sekundärstrukturen verhindern, dass die DNA-Polymerase das Insert korrekt amplifizieren kann und dass selbst bei Vorhandensein des Inserts das erwartete DNA-Fragment nicht gebildet wird. Aus diesem Grund wurde entschieden mit dem Bacmid aus Klon 6 weiter zu arbeiten, da dieser Klon als einziger keine Bande bei 300 bp zeigte und somit potentiell das Insert enthält.

127 7 Diskussion

Dem Bacmid bDHPTightegfp fehlt im Vergleich zum Bacmid bDHPTightegfp-Ppolhtta das tTA-

Gen, wodurch der PTight nicht mehr gezielt aktiviert werden kann. Dieses Konstrukt dient daher als Kontrolle für die Basalaktivität des Promotors. Die Vermehrung des zugehörigen Transfervektors erfolgte ebenfalls in E. coli SURE Zellen und die Kultivierung der E. coli DH10Bac™ Zellen wurde aus den bereits genannten Gründen bei 30 °C durchgeführt. Die Größe des bei der Kontroll-PCR der Bacmide erwarteten DNA-Fragments beträgt 4.965 bp und ist bei keinem der zehn untersuchten Klone in Abbildung 5.10 zu erkennen. Stattdessen sind bei einigen Klonen wieder andere Banden bei 3.500 bp und 6.000 bp zu sehen. Die Klone 2, 6, 9 und 10 enthalten kein Insert und besitzen eine Bande bei 300 bp. Klone 9 und 10 besitzen allerdings zusätzlich die Bande bei 6.000 bp, was vermuten lässt, dass diese hohe Bande unabhängig vom Insert entsteht. Da anhand des Ergebnisses der Kontroll-PCR nicht festgestellt werden kann, welcher Klon mit Sicherheit das korrekte Bacmid enthält, wurden vorerst die Bacmide aus den Klonen 1, 4 und 5 für die Virusherstellung verwendet.

7.1.2 Herstellung der Virusstocks

Aus den vier Bacmiden mit den Promotoren Ppolh, Pmtn und PTight (mit und ohne tta) wurden durch Transfektion von Sf21-Insektenzellen die Viren AcMNPV-Pe, AcMNPV-Me, AcMNPV-DHTePt und AcMNPV-DHTe hergestellt. Die Volumina der P1-Stocks betrugen aufgrund der hohen Verdunstungsrate jeweils nur ca. 1,5 mL und wurden vollständig für die weitere Amplifizierung der Viren in 12 mL Kulturvolumen eingesetzt. Um eine Vorstellung von dem initialen infektiösen Virustiter im P1-Stock zu bekommen, wurde bei der Transfektion zur Herstellung des AcMNPV-Pe ein zusätzliches well angesetzt, dessen Überstand ausschließlich zur Bestimmung des infektiösen Titers verwendet wurde. Dieser 5 -1 betrug 2,6∙10 TCID50∙mL und lag damit deutlich unterhalb der in der Literatur 6 -1 7 -1 angegebenen Werte von 1,4∙10 TCID50∙mL bis 3,9∙10 TCID50∙mL (Anderson et al., 1995; Invitrogen by Life Technologies, 2015). Anderson et al. haben zwar die Konzentration der für die Transfektion verwendeten Bacmid-Lösung nicht bestimmt, konnten aber zeigen, dass unterschiedliche Mengen an eingesetztem Bacmid zu ähnlichen Titern führen (Anderson et al., 1995). Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Differenz der Titer nicht an der Menge des eingesetzten Bacmids liegt. Weitere Faktoren, die die Transformation und Virusproduktion beeinflussen können, sind die Zellaktivität und Zelldichte, das eingesetzte Medium sowie Medienzusätze, wie z.B. fötales Kälberserum (FKS), und das verwendete Transfektionsreagenz. Während vom Hersteller die mit bis zu 20 % FKS supplementierten Medien der Reihe Sf‑900 zur Transfektion empfohlen werden, wurde in dieser Arbeit mit dem Medium Ex-Cell® 420 gearbeitet, das mit nur 10 % FKS supplementiert wurde.

128 7.2 Virustiterbestimmung

Es ist bekannt, dass die Zellen in Ex-Cell® 420 Medium schlechter wachsen und weniger Protein produzieren als in beispielsweise Sf‑900 II (Kwon et al., 2003). Sowohl das reduzierte Wachstum, als auch die verminderte Proteinproduktion sind Anzeichen einer reduzierten Zellaktivität, die durch die Behandlung der Zellen mit Transfektionsreagenz noch weiter abnimmt und somit wahrscheinlich zu den schlechteren Virusausbeuten geführt hat.

Da die P1-Stocks aber aufgrund ihrer geringen Volumina in jedem Fall weiter amplifiziert werden müssen, spielt der initiale infektiöse Virustiter nur eine untergeordnete Rolle. Er wird einzig zur Berechnung der MOI bei der Herstellung der P2-Stocks gebraucht. Eine grobe Schätzung ergibt, dass die MOI bei Einsatz des gesamten P1-Stocks in etwa 0,05 beträgt und somit nur minimal über dem Wert von 0,01 liegt, der in dieser Arbeit als Richtlinie zur Herstellung weiterer Virusstocks gilt.

7.2 Virustiterbestimmung

Jede Infektion, sei es zur Virusvermehrung oder zur Produktion rekombinanter Proteine, sollte mit einer definierten MOI durchgeführt werden, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Die Standardmethode zur Bestimmung infektiöser Virustiter ist die Endpunkttitration, welche aber, wie in Kapitel 6.2.1 bereits erwähnt, verhältnismäßig ungenau und außerdem durch die lange Inkubationszeit von 10 Tagen recht zeitaufwendig ist. Deshalb sollte in dieser Arbeit alternativ der Virustiter mittels real-time PCR anhand des IE-1-Gens analog zur Methode von Lo und Chao ermittelt werden (Lo und Chao, 2004). Der Transkriptionsfaktor IE-1 ist essentiell für die Virusreplikation, weshalb vermutet wird, dass das IE-1-Gen auch über mehrere Passagen relativ stabil im Virusgenom integriert bleibt (Crouch und Passarelli, 2005; Stewart et al., 2005; Zwart et al., 2008). Die über das IE-1-Gen bestimmten Virustiter werden zur leichteren Unterscheidung in dieser Arbeit als Viruspartikeltiter bezeichnet. Während die Viruspartikeltiter in den niedrigen Passagen tendenziell noch gut mit den infektiösen Virustitern übereinstimmen, konnte beobachtet werden, dass die infektiösen Titer über die Passagenzahl abnehmen, wohingegen die Viruspartikeltiter etwa konstant bleiben (siehe Abbildung 5.51 und Abbildung 7.1). Dies ist auf die Bildung von Deletionsmutanten zurückzuführen, die prinzipiell in zwei Gruppen unterteilt werden können: replikationsfähige und replikationsdefiziente Virusmutanten (DIPs, engl.: defective interfering particles). Bei den replikationsfähigen Virusmutanten wurden nur nicht- essentielle Gene deletiert, zu denen beispielsweise auch die inserierten rekombinanten Gene, wie egfp, zählen.

129 7 Diskussion

Für die Replikation notwendige Gene, wie ie-1, sollten hingegen nicht von den Deletionen betroffen sein, sodass der anhand des IE-1-Gens bestimmte Viruspartikeltiter den replikationsfähigen Anteil der Viruspopulation wiederspiegeln sollte. Dieser Viruspartikeltiter deckt sich nur dann mit dem mittels Endpunkttitration berechneten infektiösen Titer, wenn sich unter den replikationsfähigen Viren keine egfp--Mutanten (Viren, denen das eGFP-Gen fehlt) befinden. Da egfp--Mutanten aufgrund der fehlenden eGFP-Fluoreszenz bei der Bestimmung des infektiösen Titers über Endpunkttitration nicht erfasst werden, wird der infektiöse Titer zu niedrig berechnet und stellt daher eigentlich einen infektiösen, egfp+-Virustiter dar.

Aus diesem Grund wurde die PCR-Methode um das eGFP-Gen erweitert und daraus zum einen ein egfp+-Viruspartikeltiter und zum anderen der Anteil egfp+-Viren im Verhältnis zu ie-1+-Viren berechnet. In Abbildung 7.1 sind die Verläufe des infektiösen Titers sowie der beiden mittels PCR bestimmten Viruspartikeltiter des AcMNPV-DHTePt von Passage 2 bis Passage 15 aufgetragen.

1,E+9109

) inf.Inf. VirustiterTiter 1

-

) + mL

1 8 egfp -Viruspartikeltiter ∙ - 1,E+810 50 +

mL ieie-1-1 -Viruspartikeltiter ∙

1,E+7107

1,E+6106

Viruspartikeltiter (VP Viruspartikeltiter 1,E+5105

Infektiöser Virustiter (TCID Virustiter Infektiöser

1,E+410 4 0 2 4 6 8 10 12 14 Passage (-)

Abbildung 7.1: Entwicklung des infektiösen Titers sowie der beiden mittels PCR bestimmten Viruspartikeltiter des AcMNPV-DHTePt von Passage 2 bis Passage 15 Der anhand des eGFP-Gens berechnete egfp+-Viruspartikeltiter liegt nur maximal um den Faktor 5 oberhalb des infektiösen Titers, wohingegen sich der anhand des IE-1-Gens berechnete Viruspartikeltiter vor allem bei höheren Passagen bis zu Faktor 3.000 vom infektiösen Titer unterscheidet. Der ie-1+-Viruspartikeltiter stellt somit keine geeignete Methode dar, um den Titer der potentiell eGFP-produzierenden Viren zu bestimmen. In Kombination mit dem egfp+-Viruspartikeltiter erhält man jedoch eine zuverlässige Methode zur Ermittlung des Titers der replikationsfähigen Viren und zusätzlich die Information wie viele der Viren potentiell in der Lage sind egfp zu exprimieren.

130 7.2 Virustiterbestimmung

Natürlich kann es auch egfp+-Deletionsmutanten geben, die trotzdem kein egfp exprimieren, da ihnen die hierfür benötigten Gene fehlen. Diese Mutanten sind ein Grund, warum die egfp+-Viruspartikeltiter zum Teil bis um den Faktor 5 größer sind als die mittels Endpunkttitration ermittelten infektiösen Titer. Ein weiterer Grund für diesen Unterschied liegt in der verminderten eGFP-Produktion und dadurch schlechteren Detektierbarkeit jener Zellen, die zusätzlich zu dem intakten Virus auch noch mit einem DIP infiziert wurden (siehe Kapitel 7.3.2). Sowohl die Endpunkttitration als auch die Viruspartikeltiterbestimmung anhand der Gene ie-1 und egfp können allerdings keine Aussage über das Vorhandensein oder die Anzahl von DIPs liefern. Wie im nächsten Kapitel diskutiert wird, haben DIPs aber einen großen Einfluss auf die Virusvermehrung und Produktion des rekombinanten Proteins, weshalb die Konzentration an DIPs im Virusstock von großem Interesse ist. Eine Eigenschaft, die DIPs gemeinsamen haben, ist, dass sie mehrere Kopien gewisser Gen-Loki, wie den non-hr Replikationsursprung im Gen p94, akkumulieren (Lee und Krell, 1994; Pijlman et al., 2002; Pijlman et al., 2003a). Unter Ausnutzung dieses Gen-Lokus kann die PCR-Methode erweitert und dadurch zukünftig die Detektion von DIPs ermöglicht werden. Da der non-hr Replikationsursprung aber in der Anzahl an Kopien schwanken kann, ist nur eine Abschätzung und keine absolute Quantifizierung der DIPs möglich (Zwart et al., 2013).

Mittels PCR können außerdem auch rekombinante Gene nachgewiesen werden, deren Genprodukte im Rahmen einer Endpunkttitration nicht einfach durch beispielsweise Fluoreszenz detektiert werden können. In diesem Fall wäre die Bestimmung des infektiösen Titers mittels Endpunkttitration nur anhand der Anzeichen der Infektion (z.B. vergrößerte Zellen) möglich, was extrem aufwendig und ungenau ist (Roldão et al., 2009). Ferner könnte nicht zwischen einer Infektion durch Viren mit bzw. ohne rekombinantem Gen unterschieden werden.

Die Bestimmung der Viruspartikeltiter mittels PCR ist daher der Endpunkttitration vorzuziehen, da in kürzerer Zeit deutlich mehr Informationen gewonnen werden können. Diese erlauben die Bestimmung der Zusammensetzung des Virusstocks aus intakten Viren, replikationsfähigen Deletionsmutanten und DIPs und somit die Beurteilung der Qualität des Virusstocks.

131 7 Diskussion

7.3 Interferenz und Passageneffekt

Durch die Verwendung sehr kleiner MOI bei der Infektion soll verhindert werden, dass DIPs und intakte Viren dieselbe Zelle infizieren und sich die DIPs unter Ausnutzung der vom Helfer-Virus zur Verfügung gestellten Genprodukte vermehren können. Dieser Vorgang wird als Interferenz bzw. Virusinterferenz bezeichnet (Palomares et al., 2005).

Da DIPs aufgrund ihrer Deletionen häufig ein, im Vergleich zu intakten Viren, verkürztes Genom aufweisen, können sie schneller repliziert werden und besitzen dadurch einen Selektionsvorteil. Die Folge ist eine Akkumulation von DIPs in der Zelle und gegebenenfalls in der gesamten Kultur, einhergehend mit einem Abfall des infektiösen Virustiters (Kool et al., 1991). Wird ein DIP-haltiger Virusstock über mehrere Passagen vermehrt, kommt dieser Effekt, der sinkenden infektiösen Virustiter, besonders stark zur Geltung, weshalb er auch als Passageneffekt bezeichnet wird (Krell, 1996).

7.3.1 Auswirkungen der Interferenz bei serieller Passage

Um zu überprüfen, ob die gewählte MOI von 0,01 ausreicht, um den Passageneffekt zu verhindern, wurden zusätzlich zu den bereits erstellten Passagen P2 ‑ P6 des Virus AcMNPV-DHTePt neun weitere Passagen hergestellt. Die zugehörigen infektiösen Virustiter sind in Abbildung 5.51 über die Passagenzahl aufgetragen und zeigen, dass der Passageneffekt selbst bei MOI 0,01 noch auftritt, insofern bereits ausreichend viele DIPs im Virusstock vorliegen. Während in den ersten Passagen der infektiöse Titer noch leicht ansteigt, fällt er mit jeder weiteren Passage weiter ab, bis er nur noch 0,1 % seines Ausgangswertes besitzt. Eine Reduktion des infektiösen Titers um den Faktor 1.000 wurde auch von Pijlman et al. berichtet, wobei das Virus hier zwanzigmal passagiert wurde (Pijlman et al., 2003a). Sowohl bei den in dieser Arbeit gezeigten, als auch bei den von Pijlman et al. durchgeführten Versuchen muss allerdings berücksichtigt werden, dass die Bestimmung des infektiösen Titers durch Endpunkttitration erfolgt, wobei die Anzahl infizierter wells anhand der Fluoreszenz des von infizierten Zellen produzierten eGFPs ermittelt wird. Das bedeutet, dass Viren, die zwar infektiös und replikationsfähig sind, aufgrund von Deletionen jedoch das eGFP-Gen verloren haben, mit dieser Methode nicht als infektiöse Viren erkannt werden. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit zusätzlich mittels PCR der Anteil egfp+-Viren im Verhältnis zu ie-1+-Viren bestimmt und der Viruspartikeltiter anhand des IE-1-Gens berechnet. Bei einem Vergleich der Verläufe wird deutlich, wie die drei Parameter zusammen hängen. Zu Beginn liegen die Werte der infektiösen Titer und Viruspartikeltiter noch ziemlich nahe bei einander, was für P5 nicht mehr der Fall ist, da der infektiöse Virustiter von P5 deutlich unterhalb des allgemeinen Verlaufs liegt.

132 7.3 Interferenz und Passageneffekt

Vermutlich ist dies auf eine nicht bemerkte Falschbestimmung des infektiösen Virustiters zurückzuführen, was zur Folge hatte, dass bei der Infektion von P6 eine etwa um den Faktor 100 höhere MOI eingestellt wurde als angenommen (MOI 1 statt MOI 0,01). Obwohl der Anteil egfp+-Viren in P5 noch 88 % betrug, sank er in P6 auf 52 % ab, was durch die Infektion mit MOI 1 verursacht wurde. Von da an wird der Anteil egfp+-Viren mit jeder Passage geringer, bis er bei P11 auf unter 0,5 % abfällt. Das Auftreten von Deletionsmutanten bei serieller Passage und kontinuierlich betriebenen Prozessen wurde in der Literatur schon mehrfach beschrieben und versucht, durch gezielte gentechnische Veränderung des viralen Genoms, zu verhindern (Pijlman et al., 2003a; Pijlman et al., 2004).

Eigentlich wäre zu erwarten, dass bei der Kombination aus MOI 0,01 und einem Anteil an Deletionsmutanten von über 99 % die Wahrscheinlichkeit, dass ein intaktes Virus und eine Deletionsmutante dieselbe Zelle infizieren und es zur Interferenz kommt, extrem gering sein müsste. Folglich könnten sich die replikationsfähigen Viren wieder ungehindert vermehren, wohingegen die replikationsdefizienten Viren minimiert würden. Diese Oszillation der Virustiter wurde schon mehrfach beobachtet und über mathematische Modelle beschrieben (Gooijer et al., 1992; Frank, 2000; Zwart et al., 2013). In diesem Experiment ist es allerdings so, dass sich die eingestellte MOI von 0,01 immer aus dem infektiösen Titer berechnet, wodurch sich die auf alle Viruspartikel bezogene MOI umgekehrt proportional zum Anteil der egfp+-Viren verhält, was in Abbildung 7.2 veranschaulicht ist.

3420 100 AnteilAnteil egfp+-Viren

3218 90

p(np(n>1)≥1)

16

) -

1) (%) 1) 80

(

≥ 14 MOIMOIalle Viruspartikel 70 12

Viren (%) Viren 60 - + 10

50 Viruspartikel alle egfp

40 8 MOI 6

Anteil Anteil 30

20 4 Wahrscheinlichkeit p(n Wahrscheinlichkeit 10 2

0 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Passage (-)

Abbildung 7.2: Auftragung der auf alle Viruspartikel bezogenen MOI, des Anteil egfp+-Viren sowie der Wahrscheinlichkeit, dass eine Zelle von mehr als einem Virus infiziert wird, über die Passagenzahl

133 7 Diskussion

Bei einem Anteil egfp+-Viren von 2,3 % (P10) bzw. 0,3 % (P11) ergibt sich eine auf alle Viruspartikel bezogene MOI von 2,4 bzw. 11,8. Somit liegen die Wahrscheinlichkeiten, dass eine Zelle von mehr als einem Virus infiziert wird, bei 90,5 % bzw. 100 % und es wird klar, warum vorhandene DIPs sich weiter vermehren können und der infektiöse Titer nicht wieder ansteigt.

Zur Berechnung der auf der Poisson-Verteilung basierenden Wahrscheinlichkeit p, dass eine Zelle von n Viren infiziert wird, wurde Formel 7.1 angewendet, die in Abbildung 7.3 graphisch veranschaulicht ist.

푀푂퐼푛 푝(푛) = ∙ 푒−푀푂퐼 Formel 7.1 푛! mit n: Anzahl der Viren, die eine Zelle infizieren Quelle: Palomares et al., 2005

100

90

80 70 60 50 p(n=1)

40 p(np(n>1)≥1)

30 p(np(n>2)≥2)

Wahrscheinlichkeit p (%) p Wahrscheinlichkeit 20 p(np(n>3)≥3) 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MOI (-)

Abbildung 7.3: Wahrscheinlichkeit, dass eine Zelle von n Viren infiziert wird in Abhängigkeit der eingesetzten MOI laut Poisson-Verteilung aus Formel 7.1

7.3.2 Inhibierung der Proteinproduktion durch Interferenz

Die Interferenz äußert sich aber nicht nur in der Hemmung der Replikation intakter Viren, sondern damit einhergehend auch in einer verminderten Proteinproduktion infizierter Zellen. Deshalb wurde in Kapitel 5.6.2 der Einfluss unterschiedlicher Mengen an Deletionsmutanten und DIPs auf die eGFP-Produktion untersucht. Dabei wurden ausgehend von dem infektiösen Titer des Virusstocks AcMNPV-DHTePt P7-6 Zellen mit MOI 1, 5 und 10 infiziert. Bei der Infektion wurden zusätzlich vier verschiedene

134 7.3 Interferenz und Passageneffekt

Konzentrationen an DIPs aus Passage 15 zu den Ansätzen gegeben. Da im Rahmen dieser Arbeit die DIP-Konzentrationen der Virusstocks nicht bestimmt wurden, kann keine exakte Angabe über die Anzahl an jeweils zugegebenen DIPs gemacht werden. Pijlman et al. (2001) konnten nachweisen, dass AcMNPV-DIPs bereits nach zwei Passagen in Zellkultur gebildet werden und Giri et al. (2012) haben gezeigt, dass der Anteil an DIPs bis Passage 12 auf ca. 70 % ansteigt und dann bis Passage 32 etwa konstant bleibt. Daher kann angenommen werden, dass sich in Passage 15 des Virus AcMNPV-DHTePt ausreichend viele DIPs befinden, um diesen Virusstock als Quelle für DIPs zur Untersuchung ihres Einflusses auf die Proteinproduktion und Virusreplikation einsetzen zu können. Unter der beispielhaften Annahme, dass der Anteil an DIPs im Virusstock P7-6 30 % und in der 15. Passage 70 % beträgt (und den aus diesen Annahmen und den Ergebnissen der PCR-Analyse der Gene ie-1 und egfp berechneten Anteilen an intakten Viren und replikationsfähigen egfp--Deletionsmutanten), würden in den zwölf Versuchsansätzen die in Abbildung 7.4 dargestellten Verhältnisse von DIPs zu intakten Viren vorliegen.

1.600

MOI 1

) - 1.400 MOI 5

1.200 MOI 10

Viren ( Viren

- +

1.000 egfp 800

600

400

Verhältnis DIPs / DIPs Verhältnis 200

0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

DIP-Verdünnung (%(v/v) Virusstock P15 in Medium)

Abbildung 7.4: Das Verhältnis von DIPs zu egfp+-Viren in Abhängigkeit der verwendeten DIP- Verdünnung und eingestellten MOI für die zwölf verschiedenen Versuchsansätze Eine Übersicht über die zwölf Variationen ist in Tabelle 4.13 gegeben. Zur Berechnung wurden folgende Annahmen über die Zusammensetzung der verwendeten Virusstocks getroffen: AcMNPV-DHTePt P7-6 (12,6 % intakte Viren (egfp+ und ie-1+); 54,4 % replikationsfähige egfp-- Deletionsmutanten; 30 % DIPs) und AcMNPV-DHTePt P15 (0,02 % intakte Viren (egfp+ und ie-1+); 30 % replikationsfähige egfp--Deletionsmutanten; 70 % DIPs). Die Produktion von eGFP konnte nur in den Ansätzen ohne Zugabe von zusätzlichen DIPs (0 % DIP-Verdünnung; ca. doppelte so viele DIPs wie egfp+-Viren) nachgewiesen werden. Bereits die am niedrigsten dosierte Zugabe von DIPs aus Passage 15 (33 % DIP- Verdünnung; Faktor 90 mehr DIPs als intakte Viren bei MOI 10) hat bei allen MOI zu einer

135 7 Diskussion vollständigen Inhibierung der eGFP-Produktion geführt. Pijlman et al. (2001) konnten ab der 31. Passage ihres Virus keine eGFP-Produktion mehr feststellen, wobei die DIP- Konzentration nicht bestimmt wurde. In einer von van Lier et al. (1992) veröffentlichten Arbeit brach die Produktion des rekombinanten Proteins β-Galaktosidase nach knapp 40 Tagen kontinuierlicher Prozessführung ein. Als die drei Hauptgründe für den Verlust der Produktion heterologer Proteine im BEVS gelten die Virus-Interferenz aufgrund von DIPs, spontane Deletionen der rekombinanten Gene sowie die Anhäufung viraler DNA- Sequenzen, die eine Rolle bei der DNA-Replikation spielen (Pijlman et al., 2006). Da die Kontrolle ohne zusätzliche Zugabe von DIPs eGFP exprimiert hat, können die letzten beiden Gründe als Ursache für die Hemmung der eGFP-Produktion in den Ansätzen mit DIP-Zugabe ausgeschlossen werden. Somit konnte eindeutig gezeigt werden, dass die Inhibierung der eGFP-Produktion eine Folge der Interferenz ist, verursacht durch die zusätzlich zugegebenen DIPs.

Doch auch in den Ansätzen ohne zusätzlich zugegebene DIPs ist ein gewisser Anteil an DIPs aus dem Virusstock P7-6 vorhanden, der sich in Abhängigkeit der MOI auf die Proteinproduktion auswirkt. Laut der in Abbildung 7.3 graphisch veranschaulichten Poisson-Verteilung müssten bei MOI 5 und MOI 10 initial alle, und bei MOI 1 nur 63 % der Zellen mit mindestens einem Virus infiziert werden. Dies spiegelt sich im Verlauf der Versuchsergebnisse wieder, da die eGFP-Fluoreszenz bei den Ansätzen mit MOI 5 und MOI 10 ab 63 hpi detektiert werden kann und zu diesem Zeitpunkt bereits 100 % der Messwerte eGFP-positiv sind. Der Grund, warum eGFP nicht schon früher gebildet wird, ist der zur egfp-Expression eingesetzte Promotor PTight, der aufgrund des verwendeten Genkonstrukts erst in der sehr späten Phase der Infektion aktiviert wird (siehe Kapitel 7.5.2).

Im Gegensatz zu MOI 5 und MOI 10 werden bei MOI 1 etwa 37 % der Zellen erst zeitversetzt durch Sekundärinfektion infiziert. Die eGFP-Produktion läuft daher teils verzögert und nicht synchron ab, was sich dadurch zeigt, dass eGFP erst 92 hpi detektiert werden kann und nur 60 % der Messwerte eGFP-positiv sind. Da weniger Zellen infiziert sind und die eGFP-Produktion asynchron verläuft, wird bei dem Ansatz mit MOI 1 im Durchschnitt auch ein Drittel weniger eGFP gebildet als bei den Ansätzen mit MOI 5 und MOI 10. Entgegen der Erwartung, dass bei MOI 5 und MOI 10 gleich viel eGFP produziert werden sollte, da in beiden Fällen bereits zu Beginn alle Zellen infiziert worden sind, haben die Zellen mit MOI 10 knapp 15 % weniger eGFP gebildet als die Zellen mit MOI 5. Dies kann ebenfalls auf die durch DIPs hervorgerufene Interferenz zurückgeführt werden. Obwohl der Virusstock P7-6 in diesem Versuch als Quelle für intakte Viren verwendet wurde, enthielten nur 18,6 % der mittels PCR detektierten Viren das eGFP-Gen und der Anteil an DIPs in diesem Virusstock war unbekannt.

136 7.3 Interferenz und Passageneffekt

Bei steigender MOI erhöht sich auch die Anzahl an Viren, die dieselbe Zelle infizieren (siehe Abbildung 7.5), sodass die Wahrscheinlichkeit, dass ein intaktes Virus und ein DIP in einer Zelle zusammentreffen und es zur Interferenz kommt, steigt. Der Effekt, dass DIP- haltige Virusstocks bei höheren MOI zu einer reduzierten Produktion des heterologen Proteins führen, wurde auch von Wickham et al. (1991) beschrieben.

40 MOI 1 35

MOI 5

30 MOI 10 25

20

15

Wahrscheinlichkeit p (%) p Wahrscheinlichkeit 10

5

0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Anzahl n (-) Viren Abbildung 7.5: Einfluss der MOI auf die Anzahl n an Viren, die dieselbe Zelle infizieren laut Poisson-Verteilung in Formel 7.1 Neben der eGFP-Produktion wurden auch die infektiösen Virustiter mittels Endpunkttitration an Tag 3 nach Infektion bestimmt und in Abbildung 5.54 aufgetragen. Wie auch Kool et al. (1991) in einem vergleichbaren Experiment zeigen konnten, sinkt der infektiöse Virustiter in Abhängigkeit der DIP-Konzentration aufgrund von Interferenz. Während Kool et al. von einer MOI-unabhängigen Reduktion der Virustiter um den Faktor 100 berichteten, wurde in dieser Arbeit ein Einfluss der MOI auf das Ausmaß der Titerreduktion (Faktor 35 bei MOI 10 bis Faktor 1.431 bei MOI 1) festgestellt. Ursache hierfür sind wahrscheinlich Unterschiede in der Qualität des zur Einstellung der MOI verwendeten Virusstocks sowie der Menge an zugegebenen DIPs. Bei einem Virusstock, der bereits einen nicht zu vernachlässigen Anteil an DIPs enthält, wirkt sich die Zugabe weiterer DIPs nicht mehr so stark auf die Replikation intakter Viren aus, weil ohnehin schon die meisten Zellen mit einem intakten Virus und einem DIP infiziert sind (siehe Abbildung 7.5). Das bestätigt die Vermutung, dass der verwendete Virusstock P7-6 bereits viele DIPs enthält, wohingegen Kool et al. vermutlich einen Virusstock mit deutlich niedrigerer DIP-Konzentration verwendet haben.

137 7 Diskussion

Es kann festgehalten werden, dass die Bildung von DIPs auch durch die Wahl niedriger MOI nicht verhindert werden kann und DIPs sich sowohl auf die Virus- als auch auf die Proteinproduktion negativ auswirken. Deshalb sollten nur Virusstocks niedriger Passagen (P < 6) als Inokulum für die Virus- bzw. Proteinproduktion zum Einsatz kommen. Gerade die Herstellung des Inokulum-Virusstocks für die großtechnische Anwendung bedarf aber häufig mehrerer Amplifizierungsrunden, um ausreichend hohe Virustiter oder Volumina zu erhalten (Palomares et al., 2015).

Daher ist es von besonderem Interesse die Mechanismen, die zur Bildung von DIPs führen, weiter zu erforschen und mit den gewonnenen Erkenntnissen eine neue Generation von rekombinanten Baculoviren zu entwickeln, die weniger anfällig für die Bildung von DIPs sind. Einige Ansätze zur Erhöhung der genetischen Stabilität rekombinanter Viren sind die Deletion oder Veränderung bekannter Rekombinationssequenzen (Pijlman et al., 2002; Pijlman et al., 2003a; Giri et al., 2010) sowie die Einflussnahme durch Veränderung der Medienzusammensetzung. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass der Zusatz von Polyaminen und Cholesterol zum Medium den Anteil defekter Viruspartikel deutlich senken konnte. Polyamine erhöhen die Membranstabilität und stabilisieren Nukleinsäuren während Cholesterol die Membranfluidität positiv beeinflusst und somit das budding der Viren verbessert (Monteiro et al., 2016). Aber erst wenn die Bildung von DIPs kontrolliert bzw. verhindert werden kann, besteht die Möglichkeit effiziente großtechnische Verfahren und kontinuierliche Prozesse zu etablieren.

7.4 Metallothionein-Promotor

In dieser Arbeit wurde das rekombinante Virus AcMNPV-Me hergestellt, mit dessen Hilfe die Funktionalität und Regulierbarkeit des Metallothionein-Promotors Pmtn im BEVS untersucht werden konnte. Hierbei wurde sowohl die zur Induktion des Promotors benötigte Kupferionen-Konzentration bestimmt, als auch der zeitliche Verlauf der durch den Pmtn gesteuerten egfp-Expression genauer betrachtet.

7.4.1 Unterschiedliches Verhalten der Klone 2 und 4 des AcMNPV-Me

Zur Untersuchung des Pmtn im BEVS wurden zwei verschiedene Klone des Virus AcMNPV- Me verwendet. Zwar haben die Bacmide 2 und 4 zur Herstellung der beiden Virusstocks bei der Kontroll-PCR gleich lange DNA-Fragmente erzeugt (siehe Abbildung 5.8), sie scheinen sich aber dennoch in ihrer DNA-Sequenz zu unterscheiden. Nur so lässt sich erklären, warum die Regulation des Pmtn bei AcMNPV-Me 4 funktioniert, wohingegen der

138 7.4 Metallothionein-Promotor

Promotor im AcMNPV-Me 2 keinerlei Reaktion auf unterschiedliche Kupferionen- Konzentrationen zeigt, was in Abbildung 5.17 und Abbildung 5.21 zu sehen ist.

Die im Versuch aus Abbildung 5.17 verwendeten Zellen wurden vorab über mehrere

Wochen an 500 µM CuSO4 adaptiert, was dazu geführt hat, dass die intrazelluläre Kupferkonzentration auf 468 µM Cu2+ angestiegen ist (siehe Tabelle 5.2). Auch durch eine 3-tägige Kultivierung der Zellen in Medium ohne Kupferzusatz sank die intrazelluläre Konzentration nur auf 203 µM Cu2+ ab. Diese Kupferionen-Konzentration reicht, wie spätere Ergebnisse belegen (siehe Kapitel 7.4.2), immer noch aus, um den Promotor zu aktivieren. Daher wurde der Versuch mit nicht-adaptierten Sf21-Insektenzellen wiederholt, wobei auch hier keine Kupfer-induzierte Regulation des Pmtn beobachtet werden konnte. Vielmehr lässt die parallel zum Ppolh verlaufende egfp-Expression des Pmtn im AcMNPV-Me 2 auf eine Kupfer-unabhängige Aktivierung des Promotors schließen. Lo et al. (2002) haben auf dem Genom des AcMNPV eine DNA-Sequenz upstream des Polyhedrin-Gens entdeckt, die als starker Transkriptionsaktivator fungiert. Sie konnten außerdem zeigen, dass die Aktivatorsequenz nicht nur viruseigene Promotoren, wie den

Pp35, sondern auch den Minimalpromotor des humanen Cytomegalovirus (PminCMV) sowie den Hitzeschockpromotor PHS70 aus Drosophila aktivieren kann. Die ca. 2.000 bp lange Sequenz besteht u. a. aus den open reading frames ORF 4, 5 und 603 sowie lef2. Ein Vergleich der Aktivatorsequenz mit dem zur Herstellung des Virus AcMNPV-Me verwendeten Transfervektor pFastBac1 ergibt nur eine Übereinstimmung, die der

Sequenz des Ppolh entspricht und in Abbildung 7.6 an der roten Markierung erkennbar ist.

Abbildung 7.6: Vergleich der DNA-Sequenzen des Transfervektors pFastBac1 mit einem, die Aktivatorsequenz enthaltenden, Fragment des AcMNPV-wt Die Aktivatorsequenz besteht aus den ORFs 4, 5 und 603 sowie dem Gen lef2. Übereinstimmungen der DNA-Sequenz sind rot markiert. Im Gegensatz zu dem Transfervektor enthält das verwendete Bacmid die Aktivatorsequenz wahrscheinlich noch. Da die mini-attTn7 Zielsequenzen im Bacmid upstream von einem mini-F replicon und downstream von den Genen lacZα und aph (Kanamycin-Resistenz-Gen) flankiert werden, müsste untersucht werden, ob der

Promotor Pmtn über einen Abstand von mindestens 1.000 bp (lacZα und aph) hinweg aktiviert werden kann. Basierend auf ihren Ergebnissen zur Aktivierung verschiedener Promotoren in transient transfizierten und infizierten Insektenzellen, vermuten Bleckmann et al. (2016), dass eine weitere bekannte enhancer Sequenz namens hr5 für die Aktivierung des Pp10 verantwortlich ist, der auf dem viralen Genom 744 bp von hr5

139 7 Diskussion entfernt liegt. Lo et al. (2002) konnten zudem zeigen, dass es für die Aktivierung keine Rolle spielt, ob sich die Aktivatorsequenz up- oder downstream des Promotors befindet.

Falls die Kupfer-unabhängige Aktivierung des Pmtn im Virus AcMNPV-Me 2 auf die Aktivatorsequenz zurückzuführen ist, impliziert das auch, dass diese Aktivatorsequenz im Virus AcMNPV-Me 4 durch Mutationen oder Deletionen inaktiviert wurde. Daher wurde versucht, die Genome beider Viren von der Firma GATC nach der Methode von Sanger sequenzieren zu lassen, was aber leider aufgrund der Genomgröße nicht erfolgreich war. Für Folgearbeiten würde es sich daher anbieten die DNA-Sequenz mittels Next Generation Sequencing bestimmen zu lassen, obwohl diese Methode aktuell noch deutlich kostspieliger ist.

7.4.2 Regulation des Metallothionein-Promotors durch Kupferionen

Der Pmtn kann durch beispielsweise Cadmium-, Zink- und Kupferionen induziert werden, wobei Kupfer, im Vergleich zu den anderen Schwermetallen, die geringste zytotoxische Aktivität in Sf9-Zellen, einem Subklon der Sf21-Zelllinie, besitzt und deshalb für diese Arbeiten ausgewählt wurde (Lanier et al., 1997).

Neben der im Ergebnisteil dargestellten Charakterisierung des Promotors anhand der bereinigten eGFP-Produktion soll, durch Betrachtung der durchschnittlichen eGFP- Produktion der gesamten Kultur, auch die Beurteilung des Promotors im Rahmen eines Prozesses ermöglicht werden. Hierzu werden je nach Messsystem (PlateReader oder Durchflusszytometer) die in Kapitel 4.5.5.1 und Kapitel 4.5.6 eingeführten Formeln (Formel 4.9 und Formel 4.12) zur Berechnung der durchschnittlichen eGFP-Produktionen

Pd und Dd herangezogen. Dadurch wird gewährleistet, dass Proben mit einer hohen bereinigten Fluoreszenz, die aber nur durch wenige infizierte Zellen erzeugt wird, nicht fälschlicherweise positiver hinsichtlich der gesamten eGFP-Produktion bewertet werden, als Proben mit leicht geringerer bereinigter Fluoreszenz, die allerdings aus einem deutlich größeren Anteil infizierter Zellen resultiert. Der sowohl anhand der bereinigten (siehe Abbildung 5.24), als auch anhand der durchschnittlichen eGFP-Produktion (siehe Tabelle

7.1) dargestellte Vergleich der beiden Kupfersalze CuCl2 und CuSO4 in einem Konzentrationsbereich von 0 µM ‑ 1.500 µM zeigt eine bis um 20 % stärkere eGFP-

Produktion bei Verwendung von CuCl2, weshalb für alle weiteren Versuche CuCl2 eingesetzt wurde.

140 7.4 Metallothionein-Promotor

Tabelle 7.1: Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen der Kupfersalze CuCl2 und CuSO4 auf die normierte, durchschnittliche eGFP-Produktion Pd infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P3, MOI 5) Prozesszeit (h)

0 17 40 65 97 114 136

Kontrolle 0,00 0,00 0,00 0,01 0,02 0,04 0,00

100 µM 0,00 0,36 0,82 0,99 1,00 0,93 0,74

2 500 µM 0,00 0,02 0,33 0,55 0,54 0,52 0,30

CuCl 1.000 µM 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 1.500 µM 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

100 µM 0,00 0,33 0,74 0,83 0,81 0,75 0,58

4 500 µM 0,00 0,01 0,31 0,51 0,50 0,46 0,23 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 CuSO 1.000 µM 1.500 µM 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Zur Bestimmung der optimalen Induktionskonzentration wurde ein weiteres Screening in der 96-well Mikrotiterplatte durchgeführt. In Abbildung 7.7 sind hierzu sowohl die bereinigte (siehe auch Abbildung 5.26) als auch die durchschnittliche eGFP-Produktion über die Kupferionen-Konzentration aufgetragen. Es ist zu erkennen, dass beide Kurven identisch verlaufen, was für eine homogene und synchrone Infektion spricht. Aus

Abbildung 7.7 geht außerdem hervor, dass der Pmtn bereits auf geringe Kupferionen-

Konzentrationen reagiert und um 25 µM CuCl2 seine halbmaximale Aktivität besitzt. Im

Bereich zwischen 100 µM und 200 µM CuCl2 erreicht er die höchste, anhand der eGFP- Produktion messbare, Aktivität.

bereinigt

1,0 1,0

durchschnittlich )

1

)

-

1

-

Z

∙

Z

∙ 0,8 0,8

(RFU

(RFU

d

b

0,6 0,6

0,47 RFU∙Z-1 / 25 µM

0,4 0,4

Produktion P Produktion

-

Produktion P Produktion

- Normierte, bereinigte Normierte,

0,2 0,2

Normierte, durchschnittliche Normierte,

eGFP eGFP

0,0 0,0 0 100 200 300 400 500 600 CuCl -Konzentration (µM) 2

Abbildung 7.7: Vergleich der Pmtn-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Pb mit der durchschnittlichen eGFP-Produktion Pd infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P3, MOI 5, 79 hpi) bei verschiedenen Kupferionen-Konzentrationen

141 7 Diskussion

Vergleicht man die zur Maximalinduktion des Pmtn benötigte Kupferionen-Konzentration in 96-well Mikrotiterplatten und Schüttelkolben anhand der bereinigten eGFP-Produktion (siehe Abbildung 5.29), fällt auf, dass in Schüttelkolben bis zu 4-fach höhere Kupferionen- Konzentrationen eingesetzt werden können. Trotz der im Vergleich zu den niedrigeren

Kupferionen-Konzentrationen deutlich schlechteren Vitalität der Kultur mit 800 µM CuCl2 (siehe Abbildung 5.28) wird bei dieser Bedingung mit Abstand am meisten eGFP produziert, was sich sowohl in der bereinigten, als auch in der durchschnittlichen eGFP-

Produktion in Abbildung 7.8 wiederspiegelt. Die Basalaktivität des Pmtn beträgt laut der bereinigten eGFP-Produktion Db (siehe Abbildung 5.29) 15 % der Maximalexpression. Da dieser Wert aber nur von 10 % der Zellen verursacht wird und die restlichen infizierten Zellen so wenig eGFP produzieren, dass sie unterhalb des definierten Schwellenwertes liegen, ist die Angabe der Basalaktivität, basierend auf der durchschnittlichen eGFP-

Produktion Dd in Abbildung 7.8, korrekter. Die Basalaktivität des Pmtn beträgt dann nur noch 2 % bei einer maximalen Induzierbarkeit um den Faktor 50. Eine ebenfalls 50-fache

Induktion des Pmtn in Mosquito-Zellen wird von Kovach et al. (1992) beschrieben.

) 1 - 16.000 0Datenreihen2 µM CuCl2

50Datenreihen1 µM CuCl2

14.000

(RFU∙Z

d 100Datenreihen3 µM CuCl2 12.000 200Datenreihen4 µM CuCl2 10.000 400Datenreihen5 µM CuCl2

8.000

800Datenreihen6 µM CuCl2

Produktion D Produktion - 6.000

4.000

2.000

Durchschn. eGFP Durchschn. 0 0 24 48 72 96 120 Prozesszeit (h)

Abbildung 7.8: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten, durchschnittlichen eGFP-Produktion Dd infizierter Sf21-Insektenzellen bei unterschiedlichen Kupferionen-Konzentrationen (AcMNPV- Me 4 P3, MOI 0,1) Ein Vergleich der Kupfer-Konzentrationen mit der Literatur zeigt, dass bei Verwendung des Pmtn in Drosophila Schneider (S2) Zellen zur Promotorinduktion häufig die vom

Hersteller und Springer Protocols empfohlenen 500 µM CuSO4 eingesetzt werden (Backovic und Krey, 2016; Homepage Invitrogen Life Technologies). Einige Arbeitsgruppen haben den Promotor jedoch genauer charakterisiert und unterschiedliche Kupferionen- Konzentrationen getestet.

142 7.4 Metallothionein-Promotor

Johansen et al. (1989) und Deml et al. (1999) haben bei 200 µM CuSO4 die höchste Expression des rekombinanten Proteins erreicht, Angelichio et al. (1991) lagen mit 500 µM genau im empfohlenen Bereich und Bunch et al. (1988), Hegedus et al. (1998), Santos et al. (2007) und Cherbas et al. (2015) mussten deutlich höhere Konzentrationen zwischen 700 µM und 1 mM CuSO4 einsetzen. Die zur maximalen Induktion des Pmtn benötigte Cu2+-Konzentration schwankt in Drosophila Schneider (S2)-Zellen sehr stark und ist offensichtlich noch von weiteren Faktoren als nur der verwendeten Zelllinie abhängig. Zwar wurde in allen Versuchen mit S2-Zellen gearbeitet, es hat aber jedes Labor seine eigene Kulturführung. Treten in einer Arbeitsgruppe Veränderungen der Zellen durch beispielsweise Mutationen auf, so könnten sich deren Ergebnisse bereits stark von denen anderer Arbeitsgruppen unterscheiden. Weitere Einflussfaktoren, die die unterschiedlichen Ergebnisse der Literaturwerte erklären könnten, sind das zu exprimierende Protein, die FKS-Konzentration sowie die Kultivierungstemperatur. Da in dieser Arbeit zur Analyse der Kupfer-induzierten

Expression durch den Pmtn nur eGFP als Reporterprotein verwendet wurde und die Kultivierung der Zellen immer serumfrei bei 27 °C erfolgte, kann die beobachtete

Diskrepanz der CuCl2-Konzentrationen zwischen den Kultivierungssystemen 96-well Mikrotiterplatte und Schüttelkolben allerdings auf keinen dieser Faktoren zurückgeführt werden. 2+ Der unterschiedliche Bedarf an Cu zur maximalen Induktion des Pmtn muss folglich direkt mit dem gewählten Kultivierungssystem in Zusammenhang stehen. Anhand der veröffentlichen Daten kann nicht immer nachvollzogen werden, in welchem Kultivierungssystem (adhärent oder in Suspension, geschüttelt oder nicht geschüttelt, Kulturvolumen) die S2-Zellen kultiviert wurden, weshalb nicht festgestellt werden kann, ob auch hier ein Einfluss des Kultivierungssystems auf die benötigte Kupferionen- Konzentration vorliegt.

Kovach et al. (1992) konnten zeigen, dass der Pmtn in Mosquito-Zellen bei 200 µM CuSO4 am stärksten induziert wird. Unterschiede zwischen verschiedenen Zelllinien können auch auf eine unterschiedlich ausgeprägte Kupfer-Sensitivität zurückzuführen sein. Lanier et al.

(1997) konnten zeigen, dass der Pmtn in Sf9-Zellen durch 2 mM CuSO4 aktiviert wird und dass diese hohe Kupferkonzentration keinen negativen Einfluss auf das Wachstum der Zellen hat, was allerdings durch die Supplementierung des Mediums mit 10 % FKS unterstützt worden ist.

Es ist daher möglich, dass der Pmtn in Sf21-Insektenzellen durch höhere Kupferionen- Konzentrationen noch stärker induziert wird, was aber anhand der messbaren eGFP- Produktion nicht festgestellt werden kann. Denkbar ist z.B., dass höhere Kupferionen- Konzentrationen zwar zu einer gesteigerten Ableserate des eGFP-Gens und somit zu einer vermehrten mRNA-Synthese führen, welche letztlich aber nicht in einer gleichermaßen erhöhten eGFP-Produktion resultieren. Grund hierfür ist vermutlich, dass höhere

143 7 Diskussion

Kupferionen-Konzentrationen zunehmend toxisch wirken (Gaetke, 2003) und den Zellmetabolismus derart beeinflussen, dass die Stoffwechselaktivität signifikant abnimmt und deshalb keine Translation der mRNA in das Protein eGFP erfolgen kann. Diese Hypothese wird auch durch die Ergebnisse des Toxizitätstests in Abbildung 5.15 gestützt, welche zeigen, dass bereits bei Konzentrationen von 500 µM CuCl2 die Stoffwechselaktivität auf etwa 50 ‑ 60 % und bei 1.500 µM auf knapp über 30 % absinkt. Dieser Effekt ist besonders gut in der 96-well Mikrotiterplatte zu sehen (Abbildung 7.7), da hier die eGFP-Produktion ein deutliches Maximum bei 100 µM bis 200 µM CuCl2 besitzt und danach steil abfällt.

In Schüttelkolben kultivierte Zellen hingegen steigern die eGFP-Produktion bis zur höchsten untersuchten Kupferionen-Konzentration von 800 µM. Der durch die Cu2+-

Zytotoxizität verursachte Abfall der eGFP-Produktion tritt hier offenbar erst bei CuCl2- Konzentrationen über 800 µM auf. Es konnte nicht final geklärt werden, warum Sf21- Insektenzellen im Schüttelkolben toleranter gegenüber höheren Kupferionen- Konzentrationen sind als in der 96-well Mikrotiterplatte. Ein möglicher Grund könnte aber sein, dass die Zellen im Schüttelkolben besser mit Sauerstoff versorgt werden als in der 96-well Mikrotiterplatte, in der der Sauerstofftransport von der Medium/Luft-Grenzfläche zum Boden der wells hauptsächlich über Diffusion erfolgt. Dies ist vor allem bei infizierten Zellen von besonderer Bedeutung, da diese einen deutlich erhöhten Sauerstoffbedarf aufweisen (Weiss et al., 1982). Hinzu kommt, dass die Zelldichte im Schüttelkolben mit ca. 7∙105 Zellen∙mL-1 in etwa doppelt so hoch ist wie in der 96-well Mikrotiterplatte (3∙105 Zellen∙mL-1) und damit auch mehr Signalproteine, wie z.B. Wachstumsfaktoren, gebildet werden, die sich positiv auf Wachstum und Vitalität der Zellen auswirken. Die Kombination aus erhöhtem Sauerstoffeintrag und der in höherer Konzentration zur Verfügung stehenden Signalpeptide könnte die Differenz in der Kupfertoleranz und die damit einhergehenden Unterschiede in der eGFP-Produktion erklären.

Ein weiterer Unterschied zwischen den beiden Kultivierungssystemen 96-well Mikrotiterplatte und Schüttelkolben liegt im Anteil der eGFP+-Messwerte. Bei der Kultivierung der Zellen in 96-well Mikrotiterplatten (Abbildung 5.27) waren an Tag 3 bereits alle Messwerte eGFP-positiv, unabhängig von der eingesetzten CuCl2-

Konzentration (in einem Bereich von 25 µM ‑ 600 µM CuCl2). Im Gegensatz hierzu kann bei Suspensionszellen eine Abhängigkeit des Anteils eGFP+-Zellen von der Kupferionen- Konzentration beobachtet werden, da bei höheren Kupferionen-Konzentration auch mehr Zellen leuchteten. Eine mögliche Ursache hierfür ist, dass durch die vermehrte eGFP- Produktion bei höheren Kupferionen-Konzentrationen der Unterschied der gemessenen Fluoreszenzintensität zur Autofluoreszenz der Zellen deutlicher wird, wodurch auch kleinere Zellen als eGFP-positiv erkannt werden.

144 7.4 Metallothionein-Promotor

Bei niedrigen Kupferionen-Konzentrationen hingegen fällt es schwer zwischen kleinen eGFP+-Zellen und großen, nicht infizierten Zellen mit starker Autofluoreszenz zu unterscheiden.

Ein weiterer, nicht Methoden-basierter, Grund für die Zunahme eGFP+-Zellen bei höheren Kupferionen-Konzentrationen könnte in den Nebenwirkungen der Kupferionen an sich liegen. Übersteigt die Kupferionen-Konzentration die Kapazität der Zellen Kupfer intrazellulär an Proteine zu binden, führen freie Kupferionen nicht nur zu oxidativem Stress, sondern auch zu einer Reihe weiterer Auswirkungen (Gaetke et al., 2014). Beispielsweise konnten Santos et al. (2010) zeigen, dass die Gene einiger am Cholesterol- Metabolismus beteiligter Enzyme herunter reguliert werden, wodurch der Zelle weniger Cholesterol zur Verfügung steht. Cholesterol ist ein wichtiger Bestandteil der Zellmembran und sorgt unter anderem für die nötige Stabilität. Ein Cholesterol-Mangel kann sich in einer Verflüssigung der Zellmembran äußern, womit Viren leichter in die Zelle eindringen können. Dies resultiert in einer gesteigerten Infektionsrate und einem erhöhten Anteil infizierter, und somit eGFP-produzierender Zellen. Dieser Effekt entspricht genau den im Rahmen dieser Arbeit gemachten Beobachtungen.

7.4.3 Kinetik des Metallothionein-Promotors

Der Einsatz induzierbarer Promotoren im BEVS erfordert eine genaue Charakterisierung der Kinetik der Promotoren. Hierzu zählt zum einen die Dauer zwischen Induktion und nachweisbarer Genexpression und zum anderen die Zeitspanne nach Infektion, in der der Promotor aktiviert werden kann.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Pmtn bis 48 hpi induziert werden kann, wobei die eGFP-Produktion in den Ansätzen, die 24 hpi oder später induziert wurden, deutlich unterhalb derer in den Ansätzen, die vor 24 hpi induziert wurden, liegt. Die stärkste eGFP-Produktion Pb konnte bei einer Induktion 12 hpi beobachtet werden (siehe Abbildung 5.32). Eigentlich wäre zu erwarten gewesen, dass Zellen, die bei 0 hpi induziert werden, am meisten eGFP produzieren, da ihnen im Vergleich zu einer späteren Induktion mehr Zeit für die Produktion zur Verfügung steht. Bei einem Vergleich der Verläufe der Anteile eGFP+-Messwerte in Abbildung 5.33 ist zu erkennen, dass die Kurven für die Induktionszeitpunkte 0, 6 und 12 hpi anfänglich zeitversetzt aber parallel verlaufen. Der Unterschied besteht einzig in den verschieden großen Anteilen eGFP+-Messwerte, die nach Ende dieser ca. 10-stündigen Phase des steilen Anstiegs erreicht werden. Obwohl statistisch gesehen bei einer MOI von 5 initial alle Zellen infiziert sein müssten, ist dies anscheinend nicht der Fall, weshalb der Anteil eGFP+-Messwerte nach der Induktion bei 0 hpi nur auf 80 % ansteigt.

145 7 Diskussion

Im Gegensatz dazu erhöht sich der Anteil eGFP+-Messwerte bei der Induktion nach 12 h auf fast 100 %, da zu diesem Zeitpunkt bereits deutlich mehr Zellen infiziert sind und die eGFP-Produktion synchroner abläuft. Eine weitere mögliche Ursache für die verstärkte eGFP-Produktion nach Induktion bei 12 hpi ist, dass den Zellen vor der Induktion mehr Energie zur Virusreplikation zur Verfügung stand, wodurch innerhalb der Zellen eine größere Anzahl an Kopien der viralen DNA und somit des Pmtnegfp Konstruktes vorliegt. Dies spiegelt sich auch in der Produktbildungsrate wieder, die für den Induktionszeitpunkt 12 hpi deutlich größer ist als für 0 hpi.

Für alle Ansätze gilt, dass die eGFP-Produktion bis 45 hpi am stärksten ist, im Bereich zwischen 45 hpi und 50 hpi stagniert und ab ca. 70 hpi zum Erliegen kommt. Grund hierfür ist wahrscheinlich, dass zur Aktivierung des Pmtn ein sogenannter metal-responsive transcription factor-1 (MTF-1) benötigt wird, der im BEVS von den Sf21-Zellen zur Verfügung gestellt werden muss (Günther et al., 2012). Durch die Infektion und die Übernahme der Kontrolle durch das Baculovirus wird die Expression zelleigener Gene herunter reguliert (Rohrmann, 2013). So betragen beispielsweise 48 hpi die mRNA-Level der Gene gapdh, ppi, l14 und tub nur noch etwa 1 % ‑ 2 % ihres Normalwertes (siehe Abbildung 9.5 im Anhang 9.1). Von dieser Runterregulierung zelleigener Gene ist vermutlich auch das für MTF-1 kodierende Gen betroffen, sodass die intrazelluläre MTF‑1-Konzentration sinkt und der Promotor nicht mehr ausreichend aktiviert werden kann. Hinzu kommt, dass MTF-1, im Zusammenspiel mit einer Reihe weiterer zelleigener Proteine, höchstwahrscheinlich nur die zelleigene RNA-Polymerase II rekrutieren kann, die auch für die Transkription viraler Gene in der frühen Phase der Infektion verantwortlich ist (Kelly et al., 2016). In der späten und sehr späten Infektionsphase übernimmt eine Virus-kodierte RNA Polymerase die Transkription der viralen Gene, weshalb die zelleigene RNA-Polymerase II nicht mehr benötigt und deshalb abgeschaltet wird (Passarelli, 2007).

Neben der Frage bis wann der Pmtn induziert werden kann, ist es auch interessant zu wissen, wie lange es ab Induktion dauert, bis der Promotor aktiviert wird und die entsprechende mRNA bzw. das Zielprotein nachgewiesen werden können. Johansen et al. (1989) berichten, dass die Akkumulation des rekombinanten Proteins unter Verwendung des Pmtn in S2-Zellen schon 4 h nach Induktion beginnt und Santos et al. (2007) konnten, ebenfalls in S2-Zellen, rekombinantes eGFP 5 h nach Induktion detektieren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass bereits 2,5 h nach Induktion eine, im Vergleich zu einer nicht induzierten Kontrollkultur, erhöhte eGFP mRNA-Konzentration und durchschnittliche eGFP-Produktion Dd vorliegt. Die Zunahme der durchschnittlichen eGFP-

Produktion Dd geht aus Abbildung 7.9 hervor, in der zusätzlich zum Vergleich die bereinigten eGFP-Produktion aus Abbildung 5.34 über die Kultivierungsdauer aufgetragen ist.

146 7.4 Metallothionein-Promotor

7.000 300.000

....

) ) 1

0 µM CuCl - --- 0 cu be 2

Z

) )

∙ 1

- 6.000

Z 200200 µM cu beCuCl2 250.000

∙

(RFU

+2 d

(RFU 5.000 Cu -Zugabe

b 200.000

4.000

150.000 Produktion D Produktion

3.000 - Produktion D Produktion - 100.000 2.000

1.000 50.000 Ber. eGFP Ber.

0 0 eGFP Durchschn. 0 6 12 18 24 30 36 Prozesszeit (h)

Abbildung 7.9: Vergleich der Pmtn-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Db mit der durchschnittlichen eGFP-Produktion Dd infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P4, MOI 1) nach Induktion des Promotors

Die Induktion erfolgte 12 hpi durch Zugabe von 200 µM CuCl2 zum Kulturmedium. Als Kontrolle wurde eine Kultur in Kupfer-freiem Medium mitgeführt.

Während die bereinigte eGFP-Produktion Db nach Kupferzugabe erst einmal abzusinken scheint, steigt der Wert der durchschnittlichen eGFP-Produktion Dd an und liegt bereits 2,5 h nach Induktion über der nicht induzierten Kontrolle. Die verhältnismäßig hohe bereinigte eGFP-Produktion bei 12 h basiert nur auf der Fluoreszenz von 2,3 % der Zellen und spiegelt deshalb natürlich nicht die durchschnittliche eGFP-Produktion der Kultur wieder. Durch die Induktion des Pmtn steigt die eGFP-Produktion in den infizierten Zellen an, sodass mehr Zellen als eGFP-positiv eingestuft werden. Da diese Zellen aber erst sehr wenig eGFP gebildet haben und somit eine geringe Fluoreszenz besitzen, sinkt der berechnete Mittelwert der bereinigten eGFP-Produktion zuerst ab, um dann mit andauernder egfp-Expression wieder anzusteigen, wodurch der vermeintliche Knick im Verlauf der Kurve entsteht.

147 7 Diskussion

7.5 PTight-Promotor des Tet-Off Systems

In dieser Arbeit wurde ein rekombinantes Baculovirus hergestellt, in dessen Genom alle Komponenten des Tet-Off Systems vorhanden sind. Die Expression des Tetracyclin

Transaktivators (tTA) wird durch den viruseigenen Ppolh und das Reportergen egfp durch den induzierbaren Promotor PTight reguliert. Um eine ungewollte Aktivierung des PTight durch den benachbarten Ppolh oder andere auf dem Plasmid vorhandene Aktivatorsequenzen zu verhindern, wurden die beiden Promotoren durch HS4 core insulator Sequenzen getrennt (Sarkar et al., 2006; Wang et al., 2009). Dieses Vorgehen wurde im Zusammenhang mit der Untersuchung Tetracyclin-regulierter Systeme auch für andere Isolatorsequenzen schon häufiger beschrieben (Stebbins et al., 2001; Anastassiadis et al., 2002). Mit Hilfe dieses, als AcMNPV-DHTePt bezeichneten, Virus wurden die Regulierbarkeit des PTight im BEVS in Abhängigkeit der eingesetzten Doxycyclin-Konzentration sowie der Verlauf der eGFP-Produktion analysiert.

7.5.1 Regulation des PTight durch Doxycyclin

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die durch den PTight gesteuerte egfp-Expression bei verschiedenen Doxycyclin-Konzentration untersucht und dabei festgestellt, dass die Aktivierung bzw. Inhibierung des Promotors auch vom gewählten Kultivierungssystem abhängig ist. Ein Vergleich der, in den Kultivierungssystemen 96-well Mikrotiterplatte und Schüttelkolben erzielten, Hemmung ist in Abbildung 7.10 anhand der durchschnittlichen eGFP-Produktion Dd als Konzentrations-Wirkungs-Kurve dargestellt. Die Kurven verlaufen synchron mit den bereinigten eGFP-Produktionen Db in Abbildung 5.38 und Abbildung 5.44, jedoch liegen die Basalaktivitäten bei der durchschnittlichen eGFP-Produktion, aus den gleichen Gründen wie beim Pmtn, deutlich niedriger. Die Basalaktivität des PTight, also die Aktivität des Promotors in Abwesenheit seines Transaktivators tTA, beträgt in der 96- well Mikrotiterplatte knapp 6 % und im Schüttelkolben nur 0,3 %. Dadurch ergibt sich für die Kultivierung in der 96-well Mikrotiterplatte eine höhere, für die maximale Hemmung der eGFP-Produktion notwendige Doxycyclin-Konzentration von 10 ng∙mL-1 statt 2 ng∙mL‑1, wobei die durchschnittliche eGFP-Produktion auch dann noch über der Basalaktivität liegt.

148

7.5 PTight-Promotor des Tet-Off Systems

) 1

- SchüttelkolbenSK Z ∙ 1,0

Mikrotiterplatte96

(RFU

d 0,8 BasalaktivitätSK Ba Schüttelkolben 0,6 Basalaktivität96 Ba

Mikrotiterplatte

Produktion D Produktion - 0,4

0,2

Durchschn. eGFP Durchschn. 0,0 0,1 1 10 100 Doxycyclin-Konzentration (ng∙mL-1)

Abbildung 7.10: Konzentrations-Wirkungs-Kurve zur Doxycyclin-vermittelten Hemmung der

PTight-gesteuerten, durchschnittlichen eGFP-Produktion Aufgetragen ist die durchschnittliche eGFP-Produktion Dd infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-DHTePt P7-2, MOI 0,1, 5 dpi) in Abhängigkeit der eingesetzten Doxycyclin- Konzentration. Während also in 96-well Mikrotiterplatten bereits 10 ng∙mL-1 Doxycyclin ausreichen, um die eGFP-Produktion Dd im Vergleich zur Kontrolle ohne Doxycyclin zu 87 % zu hemmen, kann bei der gleichen Konzentration in Schüttelkolben noch keine Inhibierung beobachtet werden. Erst ab einer Konzentration von 15 ng∙mL-1 Doxycyclin zeigt sich eine verminderte eGFP-Produktion Dd, die durch die Erhöhung der Doxycyclin-Konzentration auf 20 ng∙mL-1 zu 96 % gehemmt wird.

Im Vergleich dazu wird für stabil transfizierte Säugerzelllinien berichtet, dass 10 ng∙mL-1 Doxycyclin zu einer fast vollständigen Inhibierung auf bis zu 0,001 % der Maximalexpression führen können (Berens und Hillen, 2003). Wu et al. (2000) konnten zeigen, dass in Sf21-Insektenzellen, die mit zwei Plasmiden transfiziert wurden, die zusammen alle Komponenten des Tet-Off Systems enthalten, 100 ng∙mL-1 Tetracyclin benötigt wurden, um die Expression des Reportergens Luciferase um ebenfalls 96 % zu reduzieren. Die Basalaktivität in Abwesenheit von tTA lag bei unter 1 %, bezogen auf den maximal induzierten Zustand. Durch einen direkten Vergleich von Tetracyclin und Doxycyclin konnten Wu und Chao (2008) nachweisen, dass Doxycyclin schon bei ‑1 10 ng∙mL zu einer signifikanten Inhibierung der Genexpression durch den PTight führt, wohingegen etwa die 10-fache Tetracyclin-Konzentration notwendig war, um die gleiche Hemmung zu erzielen. Das erklärt den Unterschied in den zur maximalen Hemmung benötigten Doxycyclin- bzw. Tetracyclin-Konzentrationen zwischen dieser Arbeit und den Ergebnissen von Wu et al. (2000).

149 7 Diskussion

Bezüglich der Basalaktivität wurde erwartet, dass diese in einem System, in dem sich der

Promotor PTight auf dem viralen Genom befindet, deutlich höher sein müsste, als in einem auf der Transfektion von Plasmiden basierten System. Denn je häufiger der Promotor und das Reportergen in der Zelle vorkommen, desto häufiger können sie auch abgelesen werden. Und während bei transienten Transfektionen bis zu 400 Kopien eines Plasmids in der Zelle vorliegen können (Douris et al., 2006), kann die Anzahl der Virusgenome innerhalb einer Zelle 84.000 Kopien erreichen (Kelly et al., 2016). Tatsächlich unterschieden sich die Basalaktivitäten aber stärker zwischen den Kultivierungssystemen, als zwischen den verschiedenen Trägern der PTightegfp Gensequenz. Dies kann zumindest teilweise auf das Vorgehen zur Detektion der eGFP-Fluoreszenz zurückgeführt werden. Um sicherzustellen, dass die Messergebnisse aus beiden Kultivierungssystemen vergleichbar sind, wurden sowohl die Zellen aus den Schüttelkolben, als auch die Zellen aus der 96-well Mikrotiterplatte für diesen Versuch am Durchflusszytometer analysiert. Hierzu wurden die in der 96-well Mikrotiterplatte adhärent wachsenden Sf21- Insektenzellen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren vom Boden der wells gelöst. Da infizierte Zellen weniger stark adhärieren und somit leichter abgelöst werden können, waren sie in der gewonnen Probe eventuell überproportional präsent, was bei der Berechnung der durchschnittlichen eGFP-Produktion zu erhöhten Werten geführt haben könnte.

7.5.2 Kinetik des PTight

Zur Aktivierung des PTight wird tTA benötigt, dessen Expression im Virus AcMNPV-DHTePt durch den Ppolh gesteuert wird. Da der Ppolh ein viruseigener Promotor der sehr späten Phase ist, wird tTA auch erst entsprechend spät gebildet. Zur Veranschaulichung der

Abhängigkeit des PTight vom Ppolh sind in Abbildung 7.11 die Verläufe der durchschnittlichen eGFP-Produktion Pd für beide Promotoren aufgetragen, die sich kaum von den im Ergebnisteil gezeigten Verläufen der bereinigten eGFP-Produktion Pb unterschieden (siehe Abbildung 5.47 und Abbildung 5.49). Es ist deutlich zu erkennen, dass die vom Ppolh gesteuerte eGFP-Produktion Pd ab 22 hpi leicht ansteigt, weshalb erwartet werden kann, dass die tTA-Produktion in mit dem Virus AcMNPV-DHTePt infizierten Zellen ebenfalls zu dieser Zeit beginnt. Erst durch die Bindung von tTA an die

TRE-Sequenz innerhalb des Promotors wird der PTight induziert, sodass eine signifikante,

PTight-abhängige eGFP-Produktion Pd in Abbildung 7.11 erst ab ca. 33 hpi mit einer Verzögerung von etwa 11 h beobachtet werden kann. Zwar konnte schon ab ca. 24 hpi eGFP-Fluoreszenz erfasst werden, diese ging aber von nur 2 % der Zellen aus (siehe Abbildung 5.47) und wird daher bei der Berechnung der durchschnittlichen eGFP- Produktion vernachlässigbar klein.

150 7.5 PTight-Promotor des Tet-Off Systems

Da in dem Zeitraum von 28 hpi bis 33 hpi keine Messdaten aufgenommen wurden, kann nicht festgestellt werden, ab wann die eGFP-Produktion exakt beginnt.

3.000 120.000

) ) ) )

1 225

-

1 -

Z 8.000

∙ Z

200 ∙

2.500 175 100.000 (RFU

6.000

(RFU

d 150 d 125 2.000 80.000

100 4.000

..

o 75

..

---

1.500 50 2.000 60.000

Tight

Produktion P Produktion

polh Produktion P Produktion

- 25

P

- P 0 0 1.000 20 25 30 35 40 40.000

500 20.000 Durchschn. eGFP Durchschn. 0 0 eGFP Durchschn. 0 24 48 72 96 Prozesszeit (h)

Abbildung 7.11: Zeitlicher Verlauf der PTight- und Ppolh-gesteuerten durchschnittlichen eGFP- Produktion Pd infizierter Sf21-Insektenzellen (PTight: AcMNPV-DHTePt P3, Ppolh: AcMNPV-Pe P3; beide MOI 5) In stabil transfizierten Säugerzelllinien konnte die Produktion des Reporterproteins bereits 4 h nach Induktion nachgewiesen werden (Berens und Hillen, 2003). In Drosophila hingegen dauerte es nach Umstellung auf Doxycyclin-freie Nahrung 6 h bis zur Induktion der Expression des Zielgens (Stebbins und Yin, 2001).

Um die Kinetik des PTight unabhängig von der Ppolh-abhängigen tTA-Produktion zu bestimmen, wurde der Versuch dahingehend modifiziert, dass die egfp-Expression bereits zu Beginn durch die Zugabe von Doxycyclin zum Medium gehemmt wurde. Erst nachdem die Zellen ausreichend tTA gebildet hatten, hätte der PTight durch einen Medienwechsel und das Entfernen von Doxycyclin induziert werden sollen. Rennel und Gerwins (2002) konnten allerdings zeigen, dass ein einfacher Austausch des Kultivierungsmediums nicht ausreicht, um das Doxycyclin aus den Zellen zu entfernen, da es unspezifisch unter anderem an Zellmembranen bindet. Aus diesem Grund wurde 30 min nach dem Medienwechsel ein zusätzlicher Waschschritt durchgeführt. Da die am PlateReader gemessenen Fluoreszenzintensitäten allerdings alleine durch den Medienwechsel und das Waschen sprunghaft anstiegen, konnten die gewonnen Daten nicht sinnvoll ausgewertet werden.

Es konnte allerdings gezeigt werden, dass der PTight auch 24 hpi und 48 hpi noch induziert werden kann und sich die eGFP-Produktionsrate durch eine Induktion 24 hpi sogar steigern lässt, was in Abbildung 7.12 veranschaulicht ist.

151 7 Diskussion

Während in Abbildung 5.48 die normalisierte, bereinigte eGFP-Produktion zum Zeitpunkt 136 hpi aufgetragen ist, ist in Abbildung 7.12 die normalisierte, durchschnittliche eGFP- Produktion bezogen auf die zur Verfügung stehende Produktionsdauer dargestellt.

Infektion + + Dox 0,24 Dox 24 hpi - Dox 1,09 Medien- wechsel + Dox 0,12 48 hpi eGFP- - Dox 0,62 Detektion

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 -1 Norm. durschn. eGFP-Produktion Pd (RFU∙Z ) Abbildung 7.12: Schematische Darstellung des Versuchsablaufs zur Untersuchung des Einschaltverhaltens des Tet-Off Systems sowie die jeweils erreichte, normierte, durchschnittliche eGFP-Produktion Pd bezogen auf die Produktionsdauer Die Normierung erfolgte auf eine Kontrolle (roter Pfeil), die ebenfalls den Medienwechseln unterzogen, dabei aber immer in Doxycyclin-freiem Medium kultiviert wurde.

Da die Induktion des PTight nach 24 hpi und 48 hpi erfolgte, die Messung der Fluoreszenzintensität aber für alle Ansätze 136 hpi durchgeführt wurde, haben sich für die verschiedenen Ansätze unterschiedlich lange Produktionszeiträume ergeben (siehe Abbildung 7.13), die bei der Berechnung der eGFP-Produktion in Abbildung 7.12 berücksichtigt wurden. Die bei Induktion nach 24 hpi gemessene erhöhte eGFP-

Produktion wurde auch beim Pmtn beobachtet und ist wahrscheinlich auf die gleichen Ursachen zurückzuführen.

Abbildung 7.13: Skizze des zeitlichen Verlaufs der eGFP-Produktion nach unterschiedlichen

Induktionszeitpunkten des PTight

152 7.6 Vergleich der induzierbaren Promotoren mit dem Polyhedrin-Promotor

7.6 Vergleich der induzierbaren Promotoren mit dem Polyhedrin-Promotor

Bei einem Vergleich der induzierbaren Promotoren Pmtn und PTight mit dem Ppolh interessiert vor allem die Expressionsstärke und der zeitliche Verlauf der eGFP- Produktion, da diese beiden Eigenschaften entscheidend für die spätere Anwendung der Promotoren im BEVS sind. Der Zeitpunkt der höchsten eGFP-Produktion ist hierbei zum einen ein entscheidender Faktor bei der Bestimmung des besten Erntezeitpunktes in Abhängigkeit der Raum-Zeit-Ausbeute. Zum anderen hängt die Fähigkeit der Zellen posttranslationale Modifikationen, wie z.B. Glykosylierungen, auszubilden stark davon ab, in welcher Phase der Infektion sie sich befinden. Es ist bekannt, dass in der sehr späten Phase der Infektion posttranslationale Modifikationen, ebenso wie die Sekretion rekombinanter Proteine, abnehmen (Harrison und Jarvis, 2006; Li et al., 2012), weshalb für entsprechende rekombinante Proteine Promotoren zu bevorzugen sind, die in der frühen Phase der Infektion aktiviert werden. Um den Vergleich der in dieser Arbeit untersuchten induzierbaren Promotoren Pmtn und PTight mit dem Standardpromotor Ppolh zu erleichtern, sind die Verläufe der durchschnittlichen eGFP-Produktion Pd aller drei

Promotoren in Abbildung 7.14 zusammengefasst.

) )

1

- ) )

1 P

25 Ppolhpolh Z -

1,0 ∙

Z ∙ PPTightTight

(RFU

d (RFU 20 PPmtn

d mtn 0,8

15 0,6 mtn

, P ,

polh

Produktion P Produktion

-

Tight

P

Produktion P Produktion P - 10 0,4

5 0,2 Durchschn. eGFP Durchschn.

Durchschn. eGFP Durchschn. 0 0,0 0 24 48 72 96 120 Prozesszeit (h)

Abbildung 7.14: Zeitlicher Verlauf der normierten, durchschnittlichen eGFP-Produktion Pd von mit verschiedenen Viren infizierten Sf21-Insektenzellen -1 Pmtn: AcMNPV-Me 4 P4 (200 µM CuCl2), PTight: AcMNPV-DHTePt P3 (0 ng∙mL Doxycyclin), Ppolh: AcMNPV-Pe P3; alle: MOI 5

153 7 Diskussion

Die durch den Ppolh gesteuerte eGFP-Produktion Pd beginnt nach ca. 20 hpi zu steigen, was den Eintritt in die sehr späte Phase der Infektion kennzeichnet. Im Bereich von 50 hpi bis 80 hpi besitzt die Kurve die größte Steilheit, was bedeutet, dass in dieser Zeit das meiste eGFP in den Zellen akkumuliert und der Ppolh die höchste Expressionsrate aufweist.

Der Ppolh ist mit Abstand der stärkste Promotor und erreicht nach 116 h eine um den

Faktor 25 höhere eGFP-Produktion als der zweitstärkste Promotor Pmtn in seinem

Maximum bei 79 h. Damit liegt der Pmtn im Bereich des ie-1-Promotors, unter dem ca.

Faktor 25 - 50 weniger rekombinantes Protein gebildet wird, als unter dem Ppolh (Jarvis et al., 1996). Die höchste Pmtn-regulierte eGFP-Produktion Pd findet zwischen 20 hpi und 50 hpi statt, was sich mit den Beobachtungen von Johansen et al. (1989) deckt, die von einer maximalen Promotoraktivität in S2-Zellen ab 20 h nach Induktion berichten.

Im Gegensatz hierzu zeigt sich in Abbildung 5.31 die maximale eGFP-Produktion des Pmtn nur bis 30 hpi. Betrachtet man allerdings die Vitalität der Zellkultur in Abbildung 9.4 wird klar, dass es sich bei dem 30 h-Wert nicht wirklich um das Maximum der Promotoraktivität handelt. Vielmehr hat das schnelle Absterben der Zellen aufgrund der hohen CuCl2-Konzentration von 800 µM zu einer deutlich verminderten eGFP-Produktion ab ca. 30 hpi geführt. Die höchste gemessene eGFP-Konzentration für den Pmtn betrug deshalb auch nur 24 ng∙mL-1 Zellsuspension (Abbildung 5.31) und lag ca. Faktor 1.000 unter der Konzentration, die Ivey-Hoyle et al. (1991) in S2-Zellen erzielen konnten. Chang et al. (2014) konnten bei der Expression der humanen Cyclooxygenase-1, ebenfalls in S2- Zellen, eine 20-fach höhere Protein-Konzentration erreichen.

Unter Verwendung des Ppolh konnte in dieser Arbeit eine maximale eGFP-Konzentration von 4,3 µg∙mL-1 Zellsuspension gemessen werden (Abbildung 5.50), die nur minimal unter der von Son et al. (2006) publizierten, und unter vergleichbaren Bedingungen entstandenen, eGFP-Konzentration von 4,8 µg∙mL-1 liegt.

Die geringste Aktivität der getesteten Promotoren zeigt der PTight, der sowohl bezogen auf die durchschnittliche eGFP-Ausbeute, als auch auf die gemessene eGFP-Konzentration von 12,7 ng∙mL-1 Zellsuspension (Abbildung 5.42) nur ca. 50 % der eGFP-Produktion des

Pmtn erzielen konnte. Im Vergleich dazu konnten Mizuguchi und Hayakawa (2002) in Adenovirus-infizierten SK HEP-1 Zellen ca. 10.000 pg∙(105 Zellen)-1 Luciferase produzieren, was etwa dem 12-Fachen der in dieser Arbeit gewonnen eGFP-Konzentration entspricht.

Die schlechte Expression durch den PTight ist möglicherweise auf eine nicht ausreichende Aktivierung des Promotors durch tTA zurückzuführen.

Zwar wurde zur tTA-Produktion der sehr starke Ppolh eingesetzt, die Ergebnisse der Analyse der tta-Expression mittels rt-RT-PCR zeigen aber, dass die tta-mRNA Level im Bereich niedriger Doxycyclin-Konzentrationen unterhalb derer von egfp liegen (siehe Abbildung 5.45). 154 7.6 Vergleich der induzierbaren Promotoren mit dem Polyhedrin-Promotor

Das bedeutet, dass entweder sehr viel egfp exprimiert und letztlich aber nicht in das Protein eGFP translatiert wurde, weshalb es sich in der Messung der Fluoreszenz nicht wiederspiegelt, oder die tta-Expression tatsächlich sehr gering war.

Während die DNA-Sequenz des eGFP-Gens im Rahmen dieser Arbeit auf S. frugiperda Codon-optimiert wurde, ist eine solche Optimierung für die DNA-Sequenz des tTA-Gens nicht erfolgt. Das tTA-Gen lag im verwendeten Ausgangsplasmid mit der ursprünglichen E. coli Codon-usage vor und wurde unverändert eingesetzt, wodurch die schlechte Expression und Produktion des Transaktivators erklärt werden kann. Für weitere Untersuchungen ist es daher ratsam die DNA-Sequenz für Sf-Insektenzellen Codon zu optimieren.

Nachdem der Verlauf der eGFP-Produktion und die Stärke der Promotoren ausführlich diskutiert wurden, soll abschließend noch auf die daraus ableitbaren Empfehlungen eingegangen werden. In Abbildung 7.15 sind hierfür die Raum-Zeit-Ausbeuten über die Dauer der Kultivierung aufgetragen.

1.400 90

mtn

PPpolh , P , polh 80 1.200

) P ) PTTight

Tight 1

-

h 70

) P )

∙ 1

1 PM -

- 1.000 mtn

Z

h

∙ ∙

60 1

-

Z ∙ 800 50 80 80 600 40 60 60

Ausbeute (RFU Ausbeute 30

- 400 40 40

Ausbeute (RFU Ausbeute -

Zeit 20 - 20 20

200 Zeit 10 -

Raum 0 0

0 0 0 10 20 30 40 Raum 0 24 48 72 96 120 Prozesszeit (h)

Abbildung 7.15: Zeitlicher Verlauf der eGFP-Raum-Zeit-Ausbeuten von mit verschiedenen Viren infizierten Sf21-Insektenzellen -1 Pmtn: AcMNPV-Me 4 P4 (200 µM CuCl2), PTight: AcMNPV-DHTePt P3 (0 ng∙mL Doxycyclin), Ppolh: AcMNPV-Pe P3; alle: MOI 5

Aus Abbildung 7.15 wird ersichtlich, dass die Raum-Zeit-Ausbeute für Pmtn 22 hpi ca. doppelt so groß ist wie für Ppolh und bei ca. 52 hpi ihr Maximum besitzt. Gerade bei der

Herstellung glykosylierter rekombinanter Proteine mit Hilfe des Pmtn ist daher der Zeitraum zwischen 52 hpi und 80 hpi für die Ernte zu empfehlen. Durch den frühen Abbruch der Kultivierung sollte die Kultur noch eine gute (> 85 %) Vitalität besitzen, sodass auch die Degradation des rekombinanten Proteins durch freigesetzte Proteasen

155 7 Diskussion minimiert wird. Liegt das Ziel eher in der Produktion von sehr großen Mengen des rekombinanten Proteins, wobei homogene posttranslationale Modifikationen nicht von besonderem Interesse sind, sollte weiterhin auf den Ppolh gesetzt werden, der eine bis zu 15-fach höhere maximale zeitspezifische Ausbeute erzielen kann. Der beste

Erntezeitpunkt liegt hier zwischen 93 hpi und 117 hpi. Obwohl der Ppolh sein Maximum der Ausbeute bei 93 hpi besitzt, kann es sich in Anbetracht des Aufwandes der Vor- und Nachbereitung eines batch-Prozesses lohnen, die Kultivierung einige Stunden länger laufen zu lassen. Es sollte hierbei jedoch bedacht werden, dass mit Absinken der Vitalität immer mehr intrazelluläres rekombinantes Protein ins Kulturmedium freigesetzt wird und somit bei der Ernte der Zellen nicht mehr zur Verfügung steht.

156 7.7 Fazit

7.7 Fazit

Ziel dieser Arbeit war es, die beiden induzierbaren Promotoren PTight und Pmtn im Rahmen des BEVS zu charakterisieren, um festzustellen, ob sie für den Einsatz zur Expression rekombinanter Proteine oder für die Verwendung in rekombinanten Baculoviren zum Pflanzenschutz geeignet sind. Hierbei hat sich gezeigt, dass die Funktionalität und Regulierbarkeit beider Promotoren im BEVS gegeben ist, die Expressionsstärke erwartungsgemäß allerdings deutlich unterhalb der des standardmäßig verwendeten Ppolh liegt. Der Ppolh ist der stärkste bekannte Promotor im BEVS und wird in der sehr späten

Phase der Infektion aktiviert. Um gegen den Ppolh zu bestehen, müssen alternative Promotoren entweder bereits direkt nach der Infektion aktivierbar sein, um für die Produktion glykosylierter Proteine eingesetzt zu werden, oder aber eine sehr gute Regulierbarkeit durch ihre Induktoren aufweisen, was vor allem für die Expression toxischer Proteine und den Einsatz von rekombinanten Baculoviren als Biopestizid von Bedeutung ist.

Das Tet-Off System besticht hier durch die geringe PTight-Aktivität im gehemmten Zustand, der bereits durch sehr niedrige Doxycyclin-Konzentrationen von 20 ng∙mL-1 erreicht werden kann. Es besteht allerdings Optimierungsbedarf bezüglich der Codon-usage des tTA-Gens sowie des Promotors zu dessen Expression. Während eine Anpassung der tTA- DNA-Sequenz an die Codon-usage der Sf-Insektenzellen zu einer erhöhten tTA-Produktion und somit zu einer stärkeren Aktivierung des PTight führen kann, kann durch die Wahl eines Promotors der frühen Phase, wie beispielsweise dem Pie-1, die Induktion des PTight ebenfalls früher erfolgen, was sich positiv auf die insektizide Wirkung rekombinanter Viren auswirken könnte. Durch die Möglichkeit der Inhibierung der Produktion des rekombinanten Proteins während der Virusvermehrung in Zellkultur und die Aktivierung der Proteinproduktion in infizierten Schädlingen ohne die Notwendigkeit eines zusätzlich zu versprühenden Induktors, eignet sich das Tet-Off System sehr gut für die Produktion rekombinanter Viren, die im Pflanzenschutz Anwendung finden sollen.

Der durch Kupferionen induzierbare Pmtn besitzt ebenfalls eine geringe Basalaktivität, zeichnet sich aber vor allem durch seine frühe Expression aus, was bei der Produktion glykosylierter Proteine von Vorteil ist. Eine Erhöhung der Expressionsstärke des Pmtn und somit der Ausbeute an rekombinantem Protein könnte durch die Kombination des Pmtn mit enhancer-Sequenzen wie hr5 oder up erreicht werden. Hierbei muss allerdings beachtet werden, dass bei der Verwendung von enhancer-Sequenzen eine Induktion des Promotors auch in Abwesenheit seines Induktors eintreten kann. In diesem Fall wäre der 2+ Pmtn nicht mehr durch die Cu -Konzentration regulierbar, was aber für die Expression nicht-toxischer rekombinanter Proteine, wie das E2 Glykoprotein, das als Impfstoff gegen die klassische Schweinepest zugelassen ist, auch nicht notwendig ist.

157 7 Diskussion

Soll der Pmtn hingegen zur Expression von für die Zellen toxischen Proteinen eingesetzt werden, bietet er die Möglichkeit die Proteinproduktion gezielt zum gewünschten

Zeitpunkt einzuschalten. Durch Verwendung des Pmtn könnten Prozesse realisiert werden, bei denen die Primärinfektion mit einer sehr niedrigen MOI erfolgt und eine vollständige Infektion der Zellkultur durch Sekundärinfektion erreicht wird. Der Promotor wird erst aktiviert, wenn alle Zellen infiziert sind, wodurch sich eine synchrone Proteinproduktion sowie eine homogene Produktqualität, die sonst nur durch den Einsatz sehr hoher MOI bei der Primärinfektion erzielt werden kann, ergibt. Dadurch wird das benötigte Inokulum deutlich verringert, weshalb die Virusstocks nicht so häufig passagiert werden müssen, wodurch wiederum die Bildung von Deletionsmutanten und DIPs reduziert wird. Wie in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, treten Deletionsmutanten und DIPs bereits nach wenigen Passagen auf und können die Ausbeute an rekombinantem Protein und Virus drastisch beeinflussen, weshalb die Qualität der verwendeten Virusstocks immer überprüft werden sollte.

Ebenfalls denkbar ist ein Einsatz des Pmtn zur Expression heterologer Proteine in Baculoviren, die als Biopestizid genutzt werden sollen. Hierzu müssen allerdings die zur Induktion des Promotors benötigten Kupferionen ebenfalls auf dem Feld ausgebracht und von den Insektenlarven aufgenommen werden. Da dies nicht umsetzbar ist, könnte alternativ ein Zwei-Komponenten-System getestet werden, in dem der Pmtn für siRNAs kodiert, die durch RNA Interferenz zum silencing des heterologen Gens auf mRNA-Ebene führen, während das heterologe Gen selbst durch den Ppolh oder einen anderen starken, konstitutiven Promotor exprimiert wird. Bei der Herstellung der rekombinanten Viren in

Zellkultur kann so durch den Zusatz von Kupferionen zum Medium der Pmtn aktiviert werden, wodurch die gebildete siRNA die Produktion des heterologen Proteins verhindert. Dadurch werden die Zellen nicht durch die toxische Wirkung des heterologen Proteins beeinträchtigt, wodurch hohe Virusausbeuten erzielt werden können. Bei der Ernte der Viren wird das Cu2+-haltige Medium größtenteils entfernt, sodass keine Kontamination der Felder mit Kupferionen befürchtet werden muss. Infiziert das rekombinante Virus einen Schädling, wird der Pmtn nicht aktiviert, weshalb das heterologe Protein ungestört produziert werden kann und dadurch die insektizide Wirkung des Baculovirus verstärkt.

158

8 Ausblick

Die Erforschung alternativer Promotoren zur Anwendung in Baculoviren ist zentraler Bestandteil der Weiterentwicklung sowohl des Baculovirus-Insektenzell- Expressionssystems als auch rekombinanter Baculoviren zum Pflanzenschutz. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Tet-Off System ebenso wie der aus Drosophila stammende Metallothionein-Promotor in infizierten Sf21-Insektenzellen funktioniert und ihre Aktivität in Abhängigkeit der Induktor-Konzentration reguliert werden kann.

Neben der Optimierung dieser beiden Promotorsysteme sollten auch weitere, bisher nicht im BEVS getestete, Promotoren untersucht werden. Ein interessanter Ansatz sind beispielsweise optogenetische Systeme, die eine Regulation der Genexpression durch Licht unterschiedlicher Wellenlänge ermöglichen (Motta-Mena et al., 2014). Durch die Licht-induzierte Steuerung des Promotors kann auf die Zugabe chemischer Induktoren zum Kulturmedium verzichtet werden, die häufig eine zusätzliche Belastung für den Prozess darstellen.

Während die Entwicklung rekombinanter Baculoviren für die Nutzung als Expressionssystem zur Herstellung rekombinanter Proteine oder virus-like particles (VLPs) und als virale Vektoren zum Einsatz in der Gentherapie stetig voranschreitet (Felberbaum, 2015), ist dieser Trend bei der Entwicklung Baculovirus-basierter Biopestizide noch nicht zu erkennen. In Anbetracht der Häufung von Skandalen um chemische Pestizide, wie Glyphosat, und der damit einhergehenden wachsenden Ablehnung gegenüber chemischen Pestiziden, werden Biopestizide immer weiter in den Vordergrund rücken. Das Bewusstsein der Menschen für ihre Gesundheit und Umwelt steigt, was sich in dem immer größer werdenden Angebot an Bio-Produkten in den Supermärkten wiederspiegelt. Wegen der strengen Richtlinien für Bio-Produkte, können hier keine chemischen Pestizide eingesetzt werden, was zu den verminderten Erträgen im Bio- Anbau beiträgt. Um dieses Problem zu lösen, müssen neben den bereits zur Verfügung stehenden Biopestiziden weitere und vor allem wirksamere Biopestizide erforscht und auf den Markt gebracht werden.

Der Einsatz rekombinanter Baculoviren mit verbesserter insektizider Wirkung stellt hier nur ein mögliches Beispiel dar. Bisher konnte gezeigt werden, dass gentechnisch veränderte Baculoviren, die beispielsweise Insekten-spezifische Toxine exprimieren, kein Risiko für den Menschen, die Umwelt und Nicht-Zielorganismen darstellen (Li et al., 1999; Smith et al., 2000; Kreutzweiser et al., 2001; Boughton et al., 2003; Sun et al., 2004). Zudem ist ein horizontaler Gentransfer der inserierten Gene zwar theoretisch möglich, konnte bisher aber weder beobachtet noch nachgewiesen werden (Inceoglu et al., 2001). 159 8 Ausblick

Dennoch besteht vor allem im westlichen Europa weiterhin eine starke Abneigung gegenüber der Einführung gentechnisch veränderter Baculoviren zum Pflanzenschutz. Erst wenn sich die gesellschaftliche Wahrnehmung, durch beispielsweise bessere Aufklärung, ändert, kann in Europa ein Markt für rekombinante Biopestizide geschaffen werden (Szewczyk et al., 2011). Es sollte daher auch im Interesse der Regierungen liegen, die Gentechnik durch Aufklärungskampagnen von ihrem schlechten Image zu befreien und dadurch den Weg für innovative, zukunftsorientierte Entwicklungen zu ebnen.

160

Literaturverzeichnis Abrol, D. P. (Hg.) (2012): Integrated pest management. Principles and practice. Wallingford. CABI. Ackermann, H. W.; Smirnoff, W. A. (1983): A morphological investigation of 23 baculoviruses. Journal of invertebrate pathology 41, S. 269–280. Adoga, M. (Hg.) (2012): Molecular Virology. Rijeka, Kroatien. InTech. Ali, M. P.; Kato, T.; Park, E. Y. (2015): Improved insecticidal activity of a recombinant baculovirus expressing spider venom cyto-insectotoxin. Applied microbiology and biotechnology 99 (23), S. 10261–10269. Almeida, A. F. d.; Macedo, G. R. d.; Chan, L. C. L.; Pedrini, M. R. d. S. (2010): Kinetic analysis of in vitro production of wild-type Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus. Braz. arch. biol. technol. 53 (2), S. 285–291. Anastassiadis, K.; Kim, J.; Daigle, N.; Sprengel, R.; Schöler, H. R.; Stewart, A. F. (2002): A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene 298 (2), S. 159–172. Anders, K.; Buschow, C.; Charo, J.; Blankenstein, T. (2012): Depot formation of doxycycline impairs Tet-regulated gene expression in vivo. Transgenic research 21 (5), S. 1099– 1107. Anderson, D.; Harris, R.; Polayes, D.; Ciccarone, V.; Donahue, R.; Gerard, G. et al. (1995): Rapid Generation of Recombinant Baculovirus and Expression of Foreign Genes Using the Bac-To-Bac Baculovirus Expression System. Focus 17 (2), S. 53–58. Angelichio, M. L.; Beck, J. A.; Johansen, H.; Ivey-Hoyle, M. (1991): Comparison of several promoters and polyadenylation signals for use in heterologous gene expression in cultured Drosophila cells. Nucleic Acids Research 19 (18), S. 5037–5043. Ardisson-Araújo, D. M. P.; Morgado, F. D. S.; Schwartz, E. F.; Corzo, G.; Ribeiro, B. M. (2013): A new theraphosid spider toxin causes early insect cell death by necrosis when expressed in vitro during recombinant baculovirus infection. PloS one 8 (12). Arrizubieta, M.; Simón, O.; Torres-Vila, L. M.; Figueiredo, E.; Mendiola, J.; Mexia, A. et al. (2016): Insecticidal efficacy and persistence of a co-occluded binary mixture of Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus (HearNPV) variants in protected and field- grown tomato crops on the Iberian Peninsula. Pest management science 72 (4), S. 660–670. Ashour, M.-B.; Ragheb, D. A.; El-Sheikh, E. A.; Gomaa, E. A.; Kamita, S. G.; Hammock, B. D. (2007): Biosafety of Recombinant and Wild Type Nucleopolyhedroviruses as Bioinsecticides. IJERPH 4 (2), S. 111–125. Au, S.; Wu, W.; Pante, N. (2013): Baculovirus nuclear import: open, nuclear pore complex (NPC) sesame. Viruses 5 (7), S. 1885–1900.

161 Literaturverzeichnis

Au, S.; Wu, W.; Zhou, L.; Theilmann, D. A.; Panté, N. (2016): A new mechanism for nuclear import by actin-based propulsion used by a baculovirus nucleocapsid. Journal of cell science 129 (15), S. 2905–2911. Aucoin, M. G.; Mena, J. A.; Kamen, A. A. (2010): Bioprocessing of Baculovirus Vectors. A Review. CGT 10 (3), S. 174–186. Ayres, M. D.; Howard, S. C.; Kuzio, J.; Lopez-Ferber, M.; Possee, R. D. (1994): The complete DNA sequence of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. Virology 202, S. 586–605. Backovic, M.; Krey, T. (2016): Stable Drosophila Cell Lines: An Alternative Approach to Exogenous Protein Expression. In: David W. Murhammer (Hg.): Baculovirus and insect cell expression protocols. Third edition. New York. Humana Press, S. 349-358. Bangham, C. R.M.; Kirkwood, T. B.L. (1993): Defective interfering particles and virus evolution. Trends in Microbiology 1 (7), S. 260–264. Beas-Catena, A.; Sánchez-Mirón, A.; García-Camacho, F.; Contreras-Gómez, A.; Molina- Grima, E. (2014): Baculovirus biopesticides: An overview. The Journal of Animal & Plant Sciences 24 (2), S. 362–373. Becnel, J. J. (2006): Prospects for the Mosquito Baculovirus Cuninpv as a Tool for Mosquito Control. Journal of the American Mosquito Control Association 22 (3), S. 523–526. Behle, R.; Birthisel, T. (2014): Formulation of entomopathogens as bioinsecticides. In: Juan Morales-Ramos, M. Guadalupe Rojas und David Shapiro-Ilan (Hg.): Mass Production of Beneficial Organisms. Invertebrates and Entomopathogens. Elsevier Science, S. 483– 517. Berens, C.; Hillen, W. (2003): Gene regulation by tetracyclines. Constraints of resistance regulation in bacteria shape TetR for application in eukaryotes. Eur J Biochem 270 (15), S. 3109–3121. Bergold, G. H. (1953): Insect Viruses. In: Advances in Virus Research Volume 1, Bd. 1. Elsevier, S. 91–139. Bernard, A. R.; Kost, T. A.; Overton, L.; Cavegn, C.; Young, J.; Bertrand, M. et al. (1995): Recombinant protein expression in a Drosophila cell line. Comparison with the baculovirus system. In: Barry C. Buckland, John G. Aunins, Theodora A. Bibila, Wei- Shou Hu, David K. Robinson und Weichang Zhou (Hg.): Cell Culture Engineering IV, Bd. 1. Dordrecht. Springer Netherlands, S. 139–144. Bijlani, S.; Nahar, A. S.; Ganesan, K. (2017): Improved Tet-On and Tet-Off systems for tetracycline-regulated expression of genes in Candida. Current genetics. Black, B. C.; Brennan, L. A.; Dierks, P. M.; Gard, I. E. (1997): Commercialization of baculovirus insecticides. In: Lois K. Miller (Hg.): The Baculoviruses. Boston, MA. Springer US, S. 341–387.

162 Literaturverzeichnis

Bleckmann, M.; Fritz, M. H.-Y.; Bhuju, S.; Jarek, M.; Schurig, M.; Geffers, R. et al. (2015): Genomic Analysis and Isolation of RNA Polymerase II Dependent Promoters from Spodoptera frugiperda. PloS one 10 (8). Bleckmann, M.; Schurig, M.; Chen, F.-F.; Yen, Z.-Z.; Lindemann, N.; Meyer, S. et al. (2016): Identification of Essential Genetic Baculoviral Elements for Recombinant Protein Expression by Transactivation in Sf21 Insect Cells. PloS one 11 (3). Blissard, G. W.; Rohrmann, G. F. (1990): Baculovirus Diversity And Molecular Biology. Annual review of entomology 35 (1), S. 127–155. Blissard, G. W.; Wenz, J. R. (1992): Baculovirus gp64 envelope glycoprotein is sufficient to mediate pH- dependent membrane fusion. JOURNAL OF VIROLOGY 66 (11), S. 6829– 6835. Bonneton, F.; Théodore, L.; Silar, P.; Maroni, G.; Wegnez, M. (1996): Response of Drosophila metallothionein promoters to metallic, heat shock and oxidative stresses. FEBS letters 380 (1-2), S. 33–38. Boughton, A. J.; Obrycki, J. J.; Bonning, B. C. (2003): Effects of a protease-expressing recombinant baculovirus on nontarget insect predators of Heliothis virescens. Biological Control 28 (1), S. 101–110. Bradshaw, C. J. A.; Leroy, B.; Bellard, C.; Roiz, D.; Albert, C.; Fournier, A. et al. (2016): Massive yet grossly underestimated global costs of invasive insects. Nature communications 7, S. 12986. Brondyk, W. H. (2009): Selecting an Appropriate Method for Expressing a Recombinant Protein. In: Richard R. Burgess und Murray P. Deutscher (Hg.): Guide to protein purification, Bd. 463. 2nd ed. Amsterdam, Boston. Elsevier/Academic Press, S. 131– 147. Bryson, T. D.; Weber, C. M.; Henikoff, S. (2010): Baculovirus-encoded protein expression for epigenomic profiling in Drosophila cells. Fly 4 (3), S. 258–265. Buchholz, R.; Huebner, H. (2000): Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung von Viren. Angemeldet durch Buchholz, R.; Huebner, H. Anmeldenr: DE1998123250. Veröffentlichungsnr: DE19823250 C1. Buckland, B.; Boulanger, R.; Fino, M.; Srivastava, I.; Holtz, K.; Khramtsov, N. et al. (2014): Technology transfer and scale-up of the Flublok recombinant hemagglutinin (HA) influenza vaccine manufacturing process. Vaccine 32 (42), S. 5496–5502. Buerger, P.; Hauxwell, C.; Murray, D. (2007): Nucleopolyhedrovirus introduction in Australia. Virologica Sinica 22 (2), S. 173–179. Bunch, T. A.; Grinblat, Y.; Goldstein, L. S.B. (1988): Characterization and use of the Drosophila metallothlortein promoter in cultured Drosophila melanogaster cells. Nucleic Acids Research 16 (3), S. 1043–1081.

163 Literaturverzeichnis

Burden, J. P.; Hails, R. S.; Windass, J. D.; Suner, M. M.; Cory, J. S. (2000): Infectivity, speed of kill, and productivity of a baculovirus expressing the itch mite toxin txp-1 in second and fourth instar larvae of Trichoplusia ni. Journal of invertebrate pathology 75 (3), S. 226–236. Burges, H. D.; Jones, K. A. (1998): Formulation of bacteria, viruses and protozoa to control insects. In: H. D. Burges (Hg.): Formulation of Microbial Biopesticides. Dordrecht, Netherlands. Kluwer Academic Publishers, S. 33–127. Carinhas, N.; Bernal, V.; Yokomizo, A. Y.; Carrondo, M. J. T.; Oliveira, R.; Alves, P. M. (2009): Baculovirus production for gene therapy. The role of cell density, multiplicity of infection and medium exchange. Applied microbiology and biotechnology 81 (6), S. 1041–1049. Chan, L. C. L.; Reid, S. (2016): Development of Serum-Free Media for Lepidopteran Insect Cell Lines. In: David W. Murhammer (Hg.): Baculovirus and insect cell expression protocols. Third edition. New York. Humana Press, S. 161–196. Chang, J. H.; Choi, J. Y.; Jin, B. R.; Roh, J. Y.; Olszewski, J. A.; Seo, S. J. et al. (2003): An improved baculovirus insecticide producing occlusion bodies that contain Bacillus thuringiensis insect toxin. Journal of invertebrate pathology 84 (1), S. 30–37. Chang, K. H.; Park, J.-H.; Hwang-Bo, J.; Chung, D. K.; Kim, W.; Chung, I. S. (2014): Drosophila melanogaster S2 cells are more suitable for the production of recombinant COX-1 than Trichoplusia ni BTI TN-5B1-4 cells. Biotechnol Bioproc E 19 (5), S. 803–810. Chen, X.; Sun, X.; Hu, Z.; Li, M.; O'Reilly, D. R.; Zuidema, D.; Vlak, J. M. (2000): Genetic engineering of Helicoverpa armigera single-nucleocapsid nucleopolyhedrovirus as an improved pesticide. Journal of invertebrate pathology 76 (2), S. 140–146. Cherbas, L.; Hackney, J.; Gong, L.; Salzer, C.; Mauser, E.; Zhang, D.; Cherbas, P. (2015): Tools for Targeted Genome Engineering of Established Drosophila Cell Lines. Genetics 201 (4), S. 1307–1318. Cherry, A. J.; Parnell, M. A.; Grzywacz, D.; Jones, K. A. (1997): The Optimization of in Vivo Nuclear Polyhedrosis Virus Production in Spodoptera exempta (Walker) and Spodoptera exigua (Hübner). Journal of invertebrate pathology 70 (1), S. 50–58. Cherry, A. J.; Rabindra, R. J.; Parnell, M. A.; Geetha, N.; Kennedy, J. S.; Grzywacz, D. (2000): Field evaluation of Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus formulations for control of the chickpea pod-borer, H. armigera (Hubn.), on chickpea (Cicer arietinum var. Shoba) in southern India. Crop Protection 19 (1), S. 51–60. Choi, J. Y.; Wang, Y.; Kim, Y.-S.; Kang, J. N.; Roh, J. Y.; Woo, S.-D. et al. (2008): Insecticidal activities of recombinant Autographa californica nucleopolyhedrovirus containing a scorpion neurotoxin gene using promoters from Cotesia plutellae bracovirus. Journal of Asia-Pacific Entomology 11 (3), S. 155–159.

164 Literaturverzeichnis

Chuang, K.-H.; Ho, S.-H.; Song, Y.-L. (2007): Cloning and expression analysis of heat shock cognate 70 gene promoter in tiger shrimp (Penaeus monodon). Gene 405 (1-2), S. 10– 18. Claus, J. D.; Gioria, V. V.; Micheloud, G. A.; Visnovsky, G. (2012): Production of insecticidal baculoviruses in insect cell cultures: potential and limitations. In: S. Soloneski und M Larramendy (Hg.): Insecticides—Basic and Other Applications. Rijeka, Kroatien. InTech, S. 127–152. Clontech Laboratories (2012a): Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems User Manual. Clontech Laboratories (2012b): Tet-Off® Advanced Inducible Gene Expression Systems User Manual. Contreras-Gómez, A.; Sánchez-Mirón, A.; García-Camacho, F.; Molina-Grima, E.; Chisti, Y. (2014): Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnology progress 30 (1), S. 1–18. Corish, P.; Tyler-Smith, C. (1999): Attenuation of green fluorescent protein half-life in mammalian cells. Protein Engineering, Design and Selection 12 (12), S. 1035–1040. Cormack, B. P.; Valdivia, R. H.; Falkow, S. (1996): FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene 173 (1), S. 33–38. Cory, J. S.; Evans, H. F. (2007): Viruses. In: L. A. Lacey und H. K. Kaya (Hg.): Field Manual of Techniques in Invertebrate Pathology: Application and Evaluation of Pathogens for Control of Insects and Other Invertebrate Pests. 2. Aufl. Dordrecht, Netherlands. Springer, S. 149–174. Cory, J. S.; Hoover, K. (2006): Plant-mediated effects in insect-pathogen interactions. Trends in ecology & evolution 21 (5), S. 278–286. Crouch, E. A.; Passarelli, A. L. (2005): Effects of baculovirus transactivators IE-1 and IE-2 on the Drosophila heat shock 70 promoter in two insect cell lines. Archives of virology 150 (8), S. 1563–1578. Cuartas, P.; Barrera, G.; Barreto, E.; Villamizar, L. (2014): Characterisation of a Colombian granulovirus (Baculoviridae. Betabaculovirus ) isolated from Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) larvae. Biocontrol Science and Technology 24 (11), S. 1265– 1285. Cubitt, A. B.; Heim, R.; Adams, S. R.; Boyd, A. E.; Gross, L. A.; Tsien, R. Y. (1995): Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends in Biochemical Sciences 20 (11), S. 448–455. Dalton, T. P.; Solis, W. A.; Nebert, D. W.; Carvan III, M. J. (2000): Characterization of the MTF-1 transcription factor from zebrafish and trout cells. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology 126 (3), S. 325–335.

165 Literaturverzeichnis

Davenport, D.; Nicol, J. A. C. (1955): Luminescence in Hydromedusae. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences 144 (916), S. 399–411. Day, R. N.; Davidson, M. W. (2009): The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews 38 (10), S. 2887–2921. Deml, L.; Wolf, H.; Wagner, R. (1999): High level expression of hepatitis B virus surface antigen in stably transfected Drosophila Schneider-2 cells. Journal of virological methods 79 (2), S. 191–203. Donaldson, M.; Wood, H. A.; Kulakosky, P. C.; Shuler, M. L. (1999): Glycosylation of a recombinant protein in the Tn5B1-4 insect cell line. Influence of ammonia, time of harvest, temperature, and dissolved oxygen. Biotechnol. Bioeng. 63 (3), S. 255–262. Douris, V.; Swevers, L.; Labropoulou, V.; Andronopoulou, E.; Georgoussi, Z.; Iatrou, K. (2006): Stably Transformed Insect Cell Lines. Tools for Expression of Secreted and Membrane‐anchored Proteins and High‐throughput Screening Platforms for Drug and Insecticide Discovery. In: Insect Viruses: Biotechnological Applications, Bd. 68. Elsevier, S. 113–156. Dow, J. A. T. (1992): pH Gradients in Lepidopteran Midgut. J. exp. Biol. 172, S. 335–375. Drugmand, J.-C.; Schneider, Y.-J.; Agathos, S. N. (2012): Insect cells as factories for biomanufacturing. Biotechnology advances 30 (5), S. 1140–1157. Eberle, K. E.; Asser-Kaiser, S.; Sayed, S. M.; Nguyen, H. T.; Jehle, J. A. (2008): Overcoming the resistance of codling moth against conventional Cydia pomonella granulovirus (CpGV-M) by a new isolate CpGV-I12. Journal of invertebrate pathology 98 (3), S. 293– 298. Eberle, K. E.; Jehle, J. A. (2006): Field resistance of codling moth against Cydia pomonella granulovirus (CpGV) is autosomal and incompletely dominant inherited. Journal of invertebrate pathology 93 (3), S. 201–206. Eberle, K. E.; Jehle, J. A.; Hübner, J. (2012): Microbial control of crop pests using insect viruses. In: D. P. Abrol (Hg.): Integrated pest management. Principles and practice. Wallingford. CABI, S. 281–298. Elanchezhyan, K. (2009): Insect cell culture and biotechnology. Current Biotica 3 (3), S. 458–489. Eldridge, R.; Horodyski, F. M.; Morton, D. B.; O'Reilly, D. R.; Truman, J. W.; Riddiford, L. M.; Miller, L. K. (1991): Expression of an eclosion hormone gene in insect cells using baculovirus vectors. Insect Biochemistry 21 (3), S. 341–351. Eldridge, R.; O'Reilly, D. R.; Hammock, B. D.; Miller, L. K. (1992): Insecticidal properties of genetically engineered baculoviruses expressing an insect juvenile hormone esterase gene. Applied and environmental microbiology 58 (5), S. 1583–1591.

166 Literaturverzeichnis

El-Sheikh, E. A.; Mamtha, M. D.; Ragheb, D. A.; Ashour, M. B. A. (2011): Potential of juvenile hormone esterase as a bio-insecticide: an overview. Egyptian Journal of Biological Pest Control 21 (1), S. 103–110. Erlandson, M. (2008): Insect Pest Control by Viruses. In: B. W. J. Mahy und Marc H. V. van Regenmortel (Hg.): Encyclopedia of Virology. 3. Aufl. Oxford. Elsevier, S. 125–133. Federici, B. A. (1997): Baculovirus Pathogenesis. In: Lois K. Miller (Hg.): The Baculoviruses. Boston, MA. Springer US, S. 33–59. Felberbaum, R. S. (2015): The baculovirus expression vector system. A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology journal 10 (5), S. 702–714. Ferrelli, M. L.; Berretta, M. F.; Belaich, M.; Ghringhelli, P. D.; Sciocco-Cap, A.; Romanowski, V. (2012): The Baculoviral Genome. In: Maria Garcia und Victor Romanowski (Hg.): Viral Genomes - Molecular Structure, Diversity, Gene Expression Mechanisms and Host-Virus Interactions. InTech Open Access, S. 3–32. Fitzgerald, J. D.; Walzel, B. (2012): Inducible Baculovirus System in Insect Cells. Veröffentlichungsnr: US 2012/0309052 A1. Frank, S. A. (2000): Within-host spatial dynamics of viruses and defective interfering particles. Journal of theoretical biology 206 (2), S. 279–290. Friesen, P. D. (2007): Insect Viruses. In: Bernard N. Fields, David M. Knipe und Peter M. Howley (Hg.): Fields virology. 5. Aufl. Philadelphia, PA, USA. Wolters Kluwer, Lippincott Williams & Wilkins. Funk, C. J.; Braunagel, S. C.; Rohrmann, G. F. (1997): Baculovirus Structure. In: Lois K. Miller (Hg.): The Baculoviruses. Boston, MA. Springer US, S. 7–32. Furuta, M.; Schrader, J. O.; Schrader, H. S.; Kokjohn, T. A.; Nyaga, S.; McCullough, A. K. et al. (1997): Chlorella virus PBCV-1 encodes a homolog of the bacteriophage T4 UV damage repair gene denV. Applied and environmental microbiology 63 (4), S. 1551– 1556. Fuxa, J. R. (2004): Ecology of insect nucleopolyhedroviruses. Agriculture, Ecosystems & Environment 103 (1), S. 27–43. Gaetke, L. (2003): Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. Toxicology 189 (1-2), S. 147–163. Gaetke, L. M.; Chow-Johnson, H. S.; Chow, C. K. (2014): Copper: Toxicological relevance and mechanisms. Archives of toxicology 88 (11), S. 1929–1938. Gan-Mor, S.; Matthews, G. A. (2003): Recent Developments in Sprayers for Application of Biopesticides—an Overview. Biosystems Engineering 84 (2), S. 119–125. George, S.; Jauhar, A. M.; Mackenzie, J.; Kieβlich, S.; Aucoin, M. G. (2015): Temporal Characterization of Protein Production Levels From Baculovirus Vectors Coding for GFP

167 Literaturverzeichnis

and RFP Genes Under Non-Conventional Promoter Control. Biotechnology and Bioengineering 112 (9), S. 1822–1831. Girardie, J.; Chaabihi, H.; Fournier, B.; Lagueux, M.; Girardie, A. (2001): Expression of neuroparsin cDNA in insect cells using baculovirus vectors. Arch. Insect Biochem. Physiol. 46 (1-2), S. 26–35. Giri, L.; Feiss, M. G.; Bonning, B. C.; Murhammer, D. W. (2012): Production of baculovirus defective interfering particles during serial passage is delayed by removing transposon target sites in fp25k. The Journal of general virology 93 (Pt 2), S. 389–399. Giri, L.; Li, H.; Sandgren, D.; Feiss, M. G.; Roller, R.; Bonning, B. C.; Murhammer, D. W. (2010): Removal of transposon target sites from the Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus fp25k gene delays, but does not prevent, accumulation of the few polyhedra phenotype. The Journal of general virology 91 (Pt 12), S. 3053–3064. Glare, T.; Caradus, J.; Gelernter, W.; Jackson, T.; Keyhani, N.; Köhl, J. et al. (2012): Have biopesticides come of age? Trends in Biotechnology 30 (5), S. 250–258. Goley, E. D.; Ohkawa, T.; Mancuso, J.; Woodruff, J. B.; D'Alessio, J. A.; Cande, W. Z. et al. (2006): Dynamic nuclear actin assembly by Arp2/3 complex and a baculovirus WASP- like protein. Science (New York, N.Y.) 314 (5798), S. 464–467. Gomes, A. R.; Byregowda, S. M.; Veeregowda, B. M.; Balamurugan, V. (2016): An Overview of Heterologous Expression Host Systems for the Production of Recombinant Proteins. Adv. Anim. Vet. Sci. 4 (7), S. 346–356. Gooijer, C. D. de; Koken, R. H.; van Lier, F. L.; Kool, M.; Vlak, J. M.; Tramper, J. (1992): A structured dynamic model for the baculovirus infection process in insect-cell reactor configurations. Biotechnology and Bioengineering 40 (4), S. 537–548. Gossen, M.; Bujardt, H. (1992): Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, S. 5547–5551. Gotoh, T.; Fukuhara, M.; Kikuchi, K.-I. (2008): Mathematical model for change in diameter distribution of baculovirus-infected Sf-9 insect cells. Biochemical Engineering Journal 40 (2), S. 379–386. Granados, R. R.; Lawler, K. A. (1981): In vivo pathway of Autographa californica baculovirus invasion and infection. Virology 108 (2), S. 297–308. Granados, R. R.; Li, G.; Blissard, G. W. (2007): Insect cell culture and biotechnology. Virol. Sin. 22 (2), S. 83–93. Green, M. R.; Sambrook, J. (2012): Molecular cloning. A laboratory manual. 4th ed. Cold Spring Harbor, N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Gröner, A. (1990): Safety to nontarget invertebrates of baculoviruses. In: Marshall Laird, Lawrence A. Lacey und Elizabeth W. Davidson (Hg.): Safety of microbial insecticides. Boca Raton, Fla. CRC Press, S. 135–147.

168 Literaturverzeichnis

Grzywacz, D. (2017): Basic and Applied Research: Baculovirus. In: Lawrence A. Lacey (Hg.): Microbial control of insect and mite pests. From theory to practice. Amsterdam, Boston. Elsevier/Academic Press, S. 27–46. Grzywacz, D.; Moore, D.; Rabindra, R. J. (2014): Mass Production of Entomopathogens in Less Industrialized Countries. In: Juan Morales-Ramos, M. Guadalupe Rojas und David Shapiro-Ilan (Hg.): Mass Production of Beneficial Organisms. Invertebrates and Entomopathogens. Elsevier Science, S. 519–561. Grzywacz, D.; Moore, S. (2017): Production, Formulation, and Bioassay of Baculoviruses for Pest Control. In: Lawrence A. Lacey (Hg.): Microbial control of insect and mite pests. From theory to practice. Amsterdam, Boston. Elsevier/Academic Press, S. 109– 124. Grzywacz, D.; Mushobozi, W. L.; Parnell, M.; Jolliffe, F.; Wilson, K. (2008): Evaluation of Spodoptera exempta nucleopolyhedrovirus (SpexNPV) for the field control of African armyworm (Spodoptera exempta) in Tanzania. Crop Protection 27 (1), S. 17–24. Grzywacz, D.; Parnell, M.; Kibata, G.; Oduor, G.; Ogutu, W.; Miano, D.; Winstanley, D. (2004): The development of endemic baculoviruses of Plutella xylostella (diamondback moth, DBM) for control of DBM in East Africa. In: Nancy M. Endersby und Peter M. Ridland (Hg.): The management of diamondback moth and other crucifer pests. Proceedings of the Fourth International Workshop. Melbourne, Victoria, Australia, 26- 29 November 2001. Gosford, NSW. Regional Institute, S. 197–206. Günther, V.; Lindert, U.; Schaffner, W. (2012): The taste of heavy metals: gene regulation by MTF-1. Biochimica et biophysica acta 1823 (9), S. 1416–1425. Hajós, J. P.; Pijnenburg, J.; Usmany, M.; Zuidema, D.; Závodszky, P.; Vlak, J. M. (2000): High frequency recombination between homologous baculoviruses in cell culture. Archives of virology 145 (1), S. 159–164. Hammock, B.; Wroblewski, V.; Harshman, L.; Hanzlik, T.; Maeda, S.; Philpott, M. et al. (1990a): Cloning, Expression and Biological Activity of the Juvenile Hormone Esterase from Heliothis virescens. In: H. H. Hagedorn, J. G. Hildebrand, M. G. Kidwell und J. H. Law (Hg.): Molecular Insect Science. Boston, MA. Springer US, S. 49–56. Hammock, B. D.; Bonning, B. C.; Possee, R. D.; Hanzlik, T. N.; Maeda, S. (1990b): Expression and effects of the juvenile hormone esterase in a baculovirus vector. Natue 344 (6265), S. 458–461. Harrison, R. L.; Bonning, B. C. (2000): Use of Scorpion Neurotoxins to Improve the Insecticidal Activity of Rachiplusia ou Multicapsid Nucleopolyhedrovirus. Biological Control 17 (2), S. 191–201. Harrison, R. L.; Bonning, B. C. (2001): Use of Proteases to Improve the Insecticidal Activity of Baculoviruses. Biological Control 20 (3), S. 199–209.

169 Literaturverzeichnis

Harrison, R. L.; Jarvis, D. L. (2006): Protein N‐Glycosylation in the Baculovirus–Insect Cell Expression System and Engineering of Insect Cells to Produce “Mammalianized” Recombinant Glycoproteins. In: Insect Viruses: Biotechnological Applications, Bd. 68. Elsevier, S. 159–191. Hauxwell, C. (2008): Against the one hundredth locust: the commercial use of insect pathogens. Microbiology Australia 29, S. 45–47. Hawtin, R. E.; Zarkowska, T.; Arnold, K.; Thomas, C. J.; Gooday, G. W.; King, L. A. et al. (1997): Liquefaction of Autographa californica nucleopolyhedrovirus-infected insects is dependent on the integrity of virus-encoded chitinase and cathepsin genes. Virology 238 (2), S. 243–253. Hayakawa, T.; Ko, R.; Okano, K.; Seong, S. I.; Goto, C.; Maeda, S. (1999): Sequence analysis of the Xestia c-nigrum granulovirus genome. Virology 262 (2), S. 277–297. Hayakawa, T.; Shimojo, E.-i.; Mori, M.; Kaido, M.; Furusawa, I.; Miyata, S. et al. (2000): Enhancement of baculovirus infection in Spodoptera exigua (Lepidoptera. Noctuidae) larvae with Autographa californica nucleopolyhedrovirus or Nicotiana tabacum engineered with a granulovirus enhancin gene. Appl. Entomol. Zool. 35 (1), S. 163– 170. Hefferon, K. L.; Miller, L. K. (2002): Reconstructing the replication complex of AcMNPV. European Journal of Biochemistry 269 (24), S. 6233–6240. Hefferon, K. L.; Oomens, A. G.; Monsma, S. A.; Finnerty, C. M.; Blissard, G. W. (1999): Host cell receptor binding by baculovirus GP64 and kinetics of virion entry. Virology 258 (2), S. 455–468. Hegedus, D. D.; Pfeifer, T. A.; Hendry, J.; Theilmann, D. A.; Grigliatti, T. A. (1998): A series of broad host range shuttle vectors for constitutive and inducible expression of heterologous proteins in insect cell lines. Gene 207 (2), S. 241–249. Heim, R.; Cubbitt, A. B.; Tsien, R. Y. (1995): Improved green fluorescence. Nature 373 (6516), S. 663–664. Herniou, E. A.; Arif, B. M.; Becnel, J. J.; Blissard, G. W.; Bonning, B. C.; Harrison, R. et al. (2012): Baculoviridae. In: Andrew M. Q. King, Elliot Lefkowitz, Michael J. Adams und Eric B. Carstens (Hg.): Virus Taxonomy. Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. New York, NY, USA. Elsevier Academic Press, S. 163–173. Hitchman, R.; Possee, R.; King, L. (2009): Baculovirus Expression Systems for Recombinant Protein Production in Insect Cells. Recent Patents on Biotechnology 3 (1), S. 46–54. Hodgson, J. J.; Arif, B. M.; Krell, P. J. (2007): Reprogramming the chiA expression profile of Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus. The Journal of general virology 88 (Pt 9), S. 2479–2487.

170 Literaturverzeichnis

Homepage der Europäischen Kommission: Pestizid-Datenbank. Online verfügbar unter http://ec.europa.eu/food/plant/pesticides/eu-pesticides- database/public/?event=activesubstance.selection&language=EN, zuletzt geprüft am 20.07.2017. Homepage ICTV: International Committee on Taxonomy of Viruses. Online verfügbar unter https://talk.ictvonline.org/taxonomy/, zuletzt geprüft am 21.09.2017. Homepage Invitrogen Life Technologies: pMT/BiP/V5-His A, B, and C. Anleitungen und Protokolle. Online verfügbar unter https://assets.thermofisher.com/TFS- Assets/LSG/manuals/pmtbipv5his_man.pdf, zuletzt geprüft am 22.11.2017. Homepage ThermoFisher Scientific: Online-Produktkatalog. Online verfügbar unter https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/24040032, zuletzt geprüft am 06.10.2017. Hong, T.; Summers, M. D.; Braunagel, S. C. (1997): N-terminal sequences from Autographa californica nuclear polyhedrosis virus envelope proteins ODV-E66 and ODV-E25 are sufficient to direct reporter proteins to the nuclear envelope, intranuclear microvesicles and the envelope of occlusion derived virus. Proceedings of the National Academy of Sciences 94 (8), S. 4050–4055. Horton, H. M.; Burand, J. P. (1993): Saturable Attachment Sites for Polyhedron-Derived Baculovirus on Insect Cells and Evidence for Entry via Direct Membrane Fusion. JOURNAL OF VIROLOGY 67 (4). Huber, J. (1986): Practical applications for insect control. In: Robert R. Granados und Brian A. Federici (Hg.): The Biology of Baculoviruses, Volume I: Biological Properties and Molecular Biology. 1. Aufl. Boca Raton, FL. CRC Press, Inc. Hughes, P. R.; Wood, H.A.; Breen, J. P.; Simpson, S. F.; Duggan, A. J.; Dybas, J. A. (1997): Enhanced Bioactivity of Recombinant Baculoviruses Expressing Insect-Specific Spider Toxins in Lepidopteran Crop Pests. Journal of invertebrate pathology 69 (2), S. 112– 118. Ignoffo, C. M. (1999): The first viral pesticide: past present and future. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 22, S. 407–417. Ignoffo, C. M.; Couch, T. L. (1981): The nucleopolyhedrosis virus of Heliothis species as a microbial pesticide. In: H. D. Burges (Hg.): Microbial Control of Pests and Plant Diseases. London. Academic press, S. 329–362. Ikonomou, L.; Schneider, Y.-J.; Agathos, S. N. (2003): Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol 62 (1), S. 1–20. Inceoglu, A. B.; Kamita, S. G.; Hinton, A. C.; Huang, Q.; Severson, T. F.; Kang, K.; Hammock, B. D. (2001): Recombinant baculoviruses for insect control. Pest management science 57 (10), S. 981–987.

171 Literaturverzeichnis

Inceoglu, A. B.; Kamita, S.G.; Hammock, B. D. (2006): Genetically Modified Baculoviruses: A Historical Overview and Future Outlook. In: B. C. Bonning (Hg.): Insect Viruses: Biotechnological Applications, Bd. 68. Elsevier, S. 323–360. Invitrogen by Life Technologies (2002): Bac-to-Bac® Baculovirus Expression Systems - Instruction manual. CAT. NO. 10359-016, 10608-016. Invitrogen by Life Technologies (2015): Bac-to-Bac® Baculovirus Expression System. An efficient site-specific transposition system to generate baculovirus for high-level expression of recombinant proteins. Ishii, M.; Kunimura, J. S.; Jeng, H. T.; Penna, T. C. V.; Cholewa, O. (2007): Evaluation of the pH- and thermal stability of the recombinant green fluorescent protein (GFP) in the presence of sodium chloride. Applied biochemistry and biotechnology 137-140 (1-12), S. 555–571. Ishimwe, E.; Hodgson, J. J.; Clem, R. J.; Passarelli, A. L. (2015): Reaching the melting point: Degradative enzymes and protease inhibitors involved in baculovirus infection and dissemination. Virology 479-480, S. 637–649. Ishiyama, S.; Ikeda, M. (2010): High-level expression and improved folding of proteins by using the vp39 late promoter enhanced with homologous DNA regions. Biotechnol Lett 32 (11), S. 1637–1647. Ivey-Hoyle, M.; Culp, J. S.; Chaikin, M. A.; Hellmig, B. D.; Matthews, T. J.; Sweet, R. W.; Rosenberg, M. (1991): Envelope glycoproteins from biologically diverse isolates of immunodeficiency viruses have widely different affinities for CD4. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88, S. 215–516. Jarvis, D. L. (2009): Baculovirus–Insect Cell Expression Systems. In: Richard R. Burgess und Murray P. Deutscher (Hg.): Guide to Protein Purification, 2nd Edition, Bd. 463. Elsevier, S. 191–222. Jarvis, D. L.; Weinkauf, C.; Guarino, L. A. (1996): Immediate-early baculovirus vectors for foreign gene expression in transformed or infected insect cells. Protein expression and purification 8 (2), S. 191–203. Jehle, J. A.; Blissard, G. W.; Bonning, B. C.; Cory, J. S.; Herniou, E. A.; Rohrmann, G. F. et al. (2006): On the classification and nomenclature of baculoviruses: a proposal for revision. Archives of virology 151 (7), S. 1257–1266. Jenkins, N. E.; Grzywacz, D. (2000): Quality Control of Fungal and Viral Biocontrol Agents - Assurance of Product Performance. Biocontrol Science and Technology 10 (6), S. 753– 777. Jenkins, N. E.; Grzywacz, D. (2003): Towards the standardization of quality control of fungal and viral biological control agents. In: J. C. van Lenteren (Hg.): Quality control

172 Literaturverzeichnis

and production of biological control agents: theory and testing procedures. Wallingford. CABI, S. 247–263. Joermann, G. (2017a): Liste der zugelassenen Pflanzenschutzmittel in Deutschland mit Informationen über beendete Zulassungen. Hg. v. Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit. Online verfügbar unter www.bvl.bund.de/infopsm. Joermann, G. (2017b): Zugelassene Pflanzenschutzmittel - Auswahl für den ökologischen Landbau. Hg. v. Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit. Online verfügbar unter www.bvl.bund.de/infopsm. Johansen, H.; van der Straten, A.; Sweet, R.; Otto, E.; Maroni, G.; Rosenberg, M. (1989): Regulated expression at high copy number allows production of a growthinhibitory oncogene product in Drosophila Schneider cells. Genes & Development 3 (6), S. 882– 889. Johanson, K.; Appelbaum, E.; Doyle, M.; Hensley, P.; Zhao, B.; Abdel-Meguid, S. S. et al. (1995): Binding Interactions of Human Interleukin 5 with Its Receptor α Subunit. J. Biol. Chem. 270 (16), S. 9459–9471. Joosten, C. E.; Shuler, M. L. (2003): Production of a sialylated N-linked glycoprotein in insect cells. Role of glycosidases and effect of harvest time on glycosylation. Biotechnology progress 19 (1), S. 193–201. Joshi, L.; Shuler, M. L.; Wood, H. A. (2001): Production of a sialylated N-linked glycoprotein in insect cells. Biotechnology progress 17 (5), S. 822–827. Kadwell, S. H.; Overton, L. K. (2016): Protein Expression in insect and mammalian cells using baculovirus in wave bioreactors. In: David W. Murhammer (Hg.): Baculovirus and insect cell expression protocols. Third edition. New York. Humana Press, S. 263–284. Kamita, S. G.; Kang, K.-D.; Hammock, B. D.; Inceoglu, A. B. (2005): Genetically Modified Baculoviruses for Pest Insect Control. In: Lawrence I. Gilbert, Kostas Iatrou und Sarjeet S. Gill (Hg.): Comprehensive molecular insect science. 1st ed. Amsterdam, New York. Elsevier, S. 271–322. Kelly, B. J.; King, L. A.; Possee, R. D. (2016): Introduction to Baculovirus Molecular Biology. In: David W. Murhammer (Hg.): Baculovirus and insect cell expression protocols, Bd. 1350. Third edition. New York. Humana Press, S. 25–50. King, A. M. Q.; Lefkowitz, E.; Adams, M. J.; Carstens, E. B. (Hg.) (2012): Virus Taxonomy. Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. New York, NY, USA. Elsevier Academic Press. Kool, M.; Voncken, J. W.; van Lier, F.L.J.; Tramper, J.; Vlak, J. M. (1991): Detection and analysis of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus mutants with defective interfering properties. Virology 183 (2), S. 739–746.

173 Literaturverzeichnis

Kovach, M. J.; Carlson, J. O.; Beaty, B. J. (1992): A Drosophila metallothionein promoter is inducible in mosquito cells. Insect molecular biology 1 (1), S. 37–43. Krell, P. J. (1996): Passage effect of virus infection in insect cells. Cytotechnology 20 (1-3), S. 125–137. Kreutzweiser, D.; England, L.; Shepherd, J.; Conklin, J.; Holmes, S. (2001): Comparative effects of a genetically engineered insect virus and a growth-regulating insecticide on microbial communities in aquatic microcosms. Ecotoxicology and environmental safety 48 (1), S. 85–98. Kroemer, J. A.; Bonning, B. C.; Harrison, R. L. (2015): Expression, delivery and function of insecticidal proteins expressed by recombinant baculoviruses. Viruses 7 (1), S. 422– 455. Kwon, M. S.; Dojima, T.; Park, E. Y. (2003): Comparative characterization of growth and recombinant protein production among three insect cell lines with four kinds of serum free media. Biotechnol Bioproc E 8 (2), S. 142–146. Lacey, L. A. (Hg.) (2017): Microbial control of insect and mite pests. From theory to practice. Amsterdam, Boston. Elsevier/Academic Press. Lacey, L. A.; Grzywacz, D.; Shapiro-Ilan, D. I.; Frutos, R.; Brownbridge, M.; Goettel, M. S. (2015): Insect pathogens as biological control agents. Back to the future. Journal of invertebrate pathology 132, S. 1–41. Lacey, L. A.; Shapiro-Ilan, D. I. (2008): Microbial control of insect pests in temperate orchard systems. Potential for incorporation into IPM. Annual review of entomology 53, S. 121–144. Lacey, L. A.; Thomson, D.; Vincent, C.; Arthurs, S. P. (2008): Codling moth granulovirus. A comprehensive review. Biocontrol Science and Technology 18 (7), S. 639–663. Lacey, L.A.; Frutos, R.; Kaya, H.K.; Vail, P. (2001): Insect Pathogens as Biological Control Agents. Do They Have a Future? Biological Control 21 (3), S. 230–248. Lanier, L. M.; Storm, K.; Shafaie, A.; Volkman, L. E. (1997): Copper Treatment Increases Recombinant Baculovirus Production and Polyhedrin and p10 Expression. BioTechniques 23 (4). Lapointe, R.; Thumbi, D.; J., C. (2012): Recent Advances in Our Knowledge of Baculovirus Molecular Biology and Its Relevance for the Registration of Baculovirus-Based Products for Insect Pest Population Control. In: Sonia Soloneski (Hg.): Integrated Pest Management and Pest Control - Current and Future Tactics. InTech, S. 481–522. Lasa, R.; Pagola, I.; ibañez, I.; Belda, J. E.; Williams, T.; Caballero, P. (2007): Efficacy of Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus as a biological insecticide for beet armyworm control in greenhouses of southern Spain. Biocontrol Science and Technology 17 (3), S. 221–232.

174 Literaturverzeichnis

Lauzon, H. A. M.; Lucarotti, C. J.; Krell, P. J.; Feng, Q.; Retnakaran, A.; Arif, B. M. (2004): Sequence and organization of the Neodiprion lecontei nucleopolyhedrovirus genome. JOURNAL OF VIROLOGY 78 (13), S. 7023–7035. Lee, H.; Krell, P. J. (1994): Reiterated DNA fragments in defective genomes of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus are competent for AcMNPV-dependent DNA replication. Virology 202 (1), S. 418–429. Lee, J. M.; Chung, H. Y.; Kim, K. I.; Yoo, K. H.; Hwang-Bo, J.; Chung, I. S.; Park, J.-H. (2011): Synthesis of double-layered rotavirus-like particles using internal ribosome entry site vector system in stably-transformed Drosophila melanogaster. Biotechnol Lett 33 (1), S. 41–46. Li, H.; Tang, H.; Sivakumar, S.; Philip, J.; Harrison, R. L.; Gatehouse, J. A.; Bonning, B. C. (2008): Insecticidal activity of a basement membrane-degrading protease against Heliothis virescens (Fabricius) and Acyrthosiphon pisum (Harris). Journal of insect physiology 54 (5), S. 777–789. Li, J.; Heinz, K. M.; Flexner, J.L.; McCutchen, B. F. (1999): Effects of Recombinant Baculoviruses on Three Nontarget Heliothine Predators. Biological Control 15 (3), S. 293–302. Li, S.; Wang, H.; Hu, Z.; Deng, F. (2012): Genetic modification of baculovirus expression vectors. Virol. Sin. 27 (2), S. 71–82. Li, X.; Zhao, X.; Fang, Y.; Jiang, X.; Duong, T.; Fan, C. et al. (1998): Generation of Destabilized Green Fluorescent Protein as a Transcription Reporter. J. Biol. Chem. 273 (52), S. 34970–34975. Lindert, U.; Leuzinger, L.; Steiner, K.; Georgiev, O.; Schaffner, W. (2008): Characterization of metal-responsive transcription factor (MTF-1) from the giant rodent capybara reveals features in common with human as well as with small rodents (mouse, rat). Short communication. Chemistry & biodiversity 5 (8), S. 1485–1494. Lo, H.-R.; Chao, Y.-C. (2004): Rapid titer determination of baculovirus by quantitative real- time polymerase chain reaction. Biotechnology progress 20 (1), S. 354–360. Lo, H.-R.; Chou, C.-C.; Wu, T.-Y.; Yuen, J. P.-Y.; Chao, Y.-C. (2002): Novel Baculovirus DNA Elements Strongly Stimulate Activities of Exogenous and Endogenous Promoters. J. Biol. Chem. 277 (7), S. 5256–5264. Long, G.; Pan, X.; Kormelink, R.; Vlak, J. M. (2006): Functional entry of baculovirus into insect and mammalian cells is dependent on clathrin-mediated endocytosis. JOURNAL OF VIROLOGY 80 (17), S. 8830–8833. Lu, A.; Miller, L. K.; Krell, P.; Vlak, J. M.; Rohrmann, G. (1997): Baculovirus DNA Replication. In: Lois K. Miller (Hg.): The Baculoviruses. Boston, MA. Springer US.

175 Literaturverzeichnis

Lua, L. H. L.; Pedrini, M. R. S.; Reid, S.; Robertson, A.; Tribe, D. E. (2002): Phenotypic and genotypic analysis of Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus serially passaged in cell culture. The Journal of general virology 83 (Pt 4), S. 945–955. Lua, L. H.L.; Reid, S. (2003): Growth, viral production and metabolism of a Helicoverpa zea cell line in serum-free culture. Cytotechnology 42 (3), S. 109–120. Lucarotti, C. J.; Morin, B.; Graham, R. I.; Lapointe, R. (2007): Production, application, and field performance of Abietiv™, the balsam fir sawfly nucleopolyhedrovirus. Virol. Sin. 22 (2), S. 163–172. Luckow, V. A.; Lee, S. C.; Barry, G. F.; Olins, P. O. (1993): Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. JOURNAL OF VIROLOGY 67 (8), S. 4566–4579. Lycett, G. J.; Kafatos, F. C.; Loukeris, T. G. (2004): Conditional expression in the malaria mosquito Anopheles stephensi with Tet-On and Tet-Off systems. Genetics 167 (4), S. 1781–1790. Lynn, D. E.; Harrison, R. L. (2016): Available Lepidopteran Insect Cell Lines. In: David W. Murhammer (Hg.): Baculovirus and insect cell expression protocols. Third edition. New York. Humana Press, S. 119–142. Ma, P. W.K.; Davis, T. R.; Wood, H.A.; Knipple, D. C.; Roelofs, W. L. (1998): Baculovirus expression of an insect gene that encodes multiple neuropeptides. Insect Biochemistry and Molecular Biology 28 (4), S. 239–249. Maeda, S. (1989): Increased insecticidal effect by a recombinant baculovirus carrying a synthetic diuretic hormone gene. Biochemical and biophysical research communications 165 (3), S. 1177–1183. Martensen, P. M.; Justesen, J. (2001): Specific inhibitors prevent proteolytic degradation of recombinant proteins expressed in High Five cells. BioTechniques 30 (4), 782-4, 786, 788 passim. Matsushima, Y.; Garesse, R.; Kaguni, L. S. (2004): Drosophila mitochondrial transcription factor B2 regulates mitochondrial DNA copy number and transcription in schneider cells. J. Biol. Chem. 279 (26), S. 26900–26905. Maur, A. A. d.; Belser, T.; Elgar, G.; Georgiev, O.; Schaffner, W. (1999): Characterization of the Transcription Factor MTF-1 from the Japanese Pufferfish (Fugu rubripes) Reveals Evolutionary Conservation of Heavy Metal Stress Response. Biological chemistry 380 (2), S. 1138. McKenzie, M. J.; Mett, V.; Reynolds, P. H. S.; Jameson, P. E. (1998): Controlled cytokinin production in transgenic tobacco using a copper-inducible promoter. Plant Physiol. 116, S. 969–977.

176 Literaturverzeichnis

Mena, J. A.; Kamen, A. A. (2011): Insect cell technology is a versatile and robust vaccine manufacturing platform. Expert review of vaccines 10 (7), S. 1063–1081. Mettenmeyer, A. (2002): Viral insecticides hold promise for bio-control. Farming Ahead 124, S. 50–51. Miller, L. K. (1988): Baculoviruses as Gene Expression Vectors. Annual Review of Microbiology (42), S. 177–199. Mizuguchi, H.; Hayakawa, T. (2002): The tet-off system is more effective than the tet-on system for regulating transgene expression in a single adenovirus vector. The journal of gene medicine 4 (3), S. 240–247. Monteiro, F.; Bernal, V.; Chaillet, M.; Berger, I.; Alves, P. M. (2016): Targeted supplementation design for improved production and quality of enveloped viral particles in insect cell-baculovirus expression system. Journal of Biotechnology 233, S. 34–41. Moore, S. D. (2002): The Development and Evaluation of Cryptophlebia leucotreta Granulovirus (CrleGV) as a Biological Control Agent for the Management of False Codling Moth. Dissertation. Rhodes University, Grahamstown, South Africa. Moore, S. D.; Kirkman, W.; Richards, G. I.; Stephen, P. R. (2015): The Cryptophlebia leucotreta granulovirus-10 years of commercial field use. Viruses 7 (3), S. 1284–1312. Moscardi, F. (1999): Assessment of the application of baculoviruses for control of Lepidoptera. Annual review of entomology 44, S. 257–289. Moscardi, F.; Souza, M. L. de; Castro, M. E. B. de; Lara Moscardi, M.; Szewczyk, B. (2011): Baculovirus Pesticides. Present State and Future Perspectives. In: Iqbal Ahmad, Farah Ahmad und John Pichtel (Hg.): Microbes and Microbial Technology. New York, NY. Springer New York, S. 415–445. Motta-Mena, L. B.; Reade, A.; Mallory, M. J.; Glantz, S.; Weiner, O. D.; Lynch, K. W.; Gardner, K. H. (2014): An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology 10 (3), S. 196–202. Mülhardt, C. (2009): Der Experimentator: Molekularbiologie, Genomics. 6. Aufl. Heidelberg. Spektrum, Akad. Verl. (Der Experimentator). Murhammer, D. W. (Hg.) (2016): Baculovirus and insect cell expression protocols. Third edition. New York. Humana Press. Nagamine, T.; Sako, Y. (2016): A Role for the Anti-Viral Host Defense Mechanism in the Phylogenetic Divergence in Baculovirus Evolution. PloS one 11 (5). Nakai, M. (2009): Biological control of tortricidae in tea fields in Japan using insect viruses and parasitoids. Virol. Sin. 24 (4), S. 323–332. Ohkawa, T.; Volkman, L. E.; Welch, M. D. (2010): Actin-based motility drives baculovirus transit to the nucleus and cell surface. The Journal of cell biology 190 (2), S. 187–195.

177 Literaturverzeichnis

Ohkawa, T.; Washburn, J. O.; Sitapara, R.; Sid, E.; Volkman, L. E. (2005): Specific binding of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus occlusion-derived virus to midgut cells of Heliothis virescens larvae is mediated by products of pif genes Ac119 and Ac022 but not by Ac115. JOURNAL OF VIROLOGY 79 (24), S. 15258–15264. Orakçi, O. (2009): Polyelektrolyt-basierter UV-Schutz für Biopestizide. Dissertation. Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik. Friedrich-Alexander-Universität, Erlangen- Nürnberg. O'Reilly, D. R.; Kelly, T. J.; Masler, E. P.; Thyagaraja, B. S.; Moy Robson, R.; Shaw, T. C.; Miller, L. K. (1995): Overexpression of Bombyx mori prothoracicotropic hormone using baculovirus vectors. Insect Biochemistry and Molecular Biology 25 (4), S. 475–485. O'Reilly, D. R.; Miller, L. K. (1991): Improvement of a Baculovirus Pesticide by Deletion of the EGT Gene. Nat Biotechnol 9 (11), S. 1086–1089. Organisation for Economic Co-operation and Development (2011): OECD Issue Paper on Microbial Contamination Limits for Microbial Pest Control Products. Series on Pesticides No. 65. Paris. Online verfügbar unter http://www.oecd.org/officialdocuments/ publicdisplaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono%282011%2943&doclanguage=en. Ormö, M.; Cubitt, A. B.; Kallio, K.; Gross, L. A.; Tsien, R. Y.; Remington, S. J. (1996): Crystal Structure of the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein. Science 273. Orth, P.; Schnappinger, D.; Hillen, W.; Saenger, W.; Hinrichs, W. (2000): Structural basis of gene regulation by the tetracycline inducible Tet repressor–operator system. Nature Structural Biology 7 (3), S. 215–219. Otto, E.; Allen, J. M.; Young, J. E.; Palmiter, R. D.; Maroni, G. (1987): A DNA Segment controlling Metal-regulated Expression of the the Drosophila melanogaster Metallothionein Gene Mtn. MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY 7 (5), S. 1710–1715. Palomares, L.; Estrada-Mondaca, S.; Ramírez, O. (2005): Principles and Applications of the Insect Cell-Baculovirus Expression Vector System. In: Sadettin Ozturk und Wei-Shou Hu (Hg.): Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, Bd. 30. CRC Press, S. 627–692. Palomares, L. A.; Mena, J. A.; Ramírez, O. T. (2012): Simultaneous expression of recombinant proteins in the insect cell-baculovirus system. Production of virus-like particles. Methods (San Diego, Calif.) 56 (3), S. 389–395. Palomares, L. A.; Realpe, M.; Ramírez, O. T. (2015): An Overview of Cell Culture Engineering for the Insect Cell-Baculovirus Expression Vector System (BEVS). In: Mohamed Al-Rubeai (Hg.): Animal Cell Culture, Bd. 9. Cham. Springer International Publishing, S. 501–519.

178 Literaturverzeichnis

Passarelli, L. A. (2007): Baculovirus RNA Polymerase：Activities，Composition，and Evolution. Virologica Sinica 22 (2), S. 94–107. Patterson, G.; Day, R. N.; Piston, D. (2001): Fluorescent protein spectra. Journal of cell science 114, S. 837–838. Payne, C. C. (1982): Insect viruses as control agents. Parasitology 84 (04), S. 35. Pearson, M. N.; Groten, C.; Rohrmann, G. F. (2000): Identification of the Lymantria dispar Nucleopolyhedrovirus Envelope Fusion Protein Provides Evidence for a Phylogenetic Division of the Baculoviridae. JOURNAL OF VIROLOGY 74 (13), S. 6126–6131. Pearson, M. N.; Rohrmann, G. F. (2002): Transfer, Incorporation, and Substitution of Envelope Fusion Proteins among Members of the Baculoviridae, Orthomyxoviridae, and Metaviridae (Insect Retrovirus) Families. JOURNAL OF VIROLOGY 76 (11), S. 5301– 5304. Pedrini, M. R. S.; Reid, S.; Nielsen, L. K.; Chan, L. C. L. (2011): Kinetic characterization of the group II Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus propagated in suspension cell cultures. Implications for development of a biopesticides production process. Biotechnology progress 27 (3), S. 614–624. Pennock, G. D.; Shoemaker, C.; Miller, L. K. (1984): Strong and regulated expression of Escherichia coli beta-galactosidase in insect cells with a baculovirus vector. Mol. Cell. Biol. 4 (3), S. 399–406. Petrik, D. T.; Iseli, A.; Montelone, B. A.; van Etten, J. L.; Clem, R. J. (2003): Improving baculovirus resistance to UV inactivation. Increased virulence resulting from expression of a DNA repair enzyme. Journal of invertebrate pathology 82 (1), S. 50–56. Pijlman, G. P.; Dortmans, J. C. F. M.; Vermeesch, A. M. G.; Yang, K.; Martens, D. E.; Goldbach, R. W.; Vlak, J. M. (2002): Pivotal role of the non-hr origin of DNA replication in the genesis of defective interfering baculoviruses. JOURNAL OF VIROLOGY 76 (11), S. 5605–5611. Pijlman, G. P.; Roode, E. C.; Fan, X.; Roberts, L. O.; Belsham, G. J.; Vlak, J. M.; van Oers, M. M. (2006): Stabilized baculovirus vector expressing a heterologous gene and GP64 from a single bicistronic transcript. Journal of Biotechnology 123 (1), S. 13–21. Pijlman, G. P.; van den Born, E.; Martens, D. E.; Vlak, J. M. (2001): Autographa californica baculoviruses with large genomic deletions are rapidly generated in infected insect cells. Virology 283 (1), S. 132–138. Pijlman, G. P.; van Schijndel, J. E.; Vlak, J. M. (2003a): Spontaneous excision of BAC vector sequences from bacmid-derived baculovirus expression vectors upon passage in insect cells. The Journal of general virology 84 (Pt 10), S. 2669–2678.

179 Literaturverzeichnis

Pijlman, G. P.; Vermeesch, A. M.G.; Vlak, J. M. (2003b): Cell line-specific accumulation of the baculovirus non-hr origin of DNA replication in infected insect cells. Journal of invertebrate pathology 84 (3), S. 214–219. Pijlman, G. P.; Vrij, J. de; van den End, F. J.; Vlak, J. M.; Martens, D. E. (2004): Evaluation of baculovirus expression vectors with enhanced stability in continuous cascaded insect-cell bioreactors. Biotechnology and Bioengineering 87 (6), S. 743–753. Pinedo, F. J.R.; Moscardi, F.; Luque, T.; Olszewski, J. A.; Ribeiro, B. M. (2003): Inactivation of the ecdysteroid UDP-glucosyltransferase (egt) gene of Anticarsia gemmatalis nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) improves its virulence towards its insect host. Biological Control 27 (3), S. 336–344. Popham, H. J. R.; Nusawardani, T.; Bonning, B. C. (2016): Introduction to the Use of Baculoviruses as Biological Insecticides. In: David W. Murhammer (Hg.): Baculovirus and insect cell expression protocols, Bd. 1350. Third edition. New York. Humana Press, S. 383–392. Possee, R. D.; King, L. A. (2016): Baculovirus Transfer Vectors. In: David W. Murhammer (Hg.): Baculovirus and insect cell expression protocols, Bd. 1350. Third edition. New York. Humana Press, S. 51–71. Rajendra, W.; Hackett, K. J.; Buckley, E.; Hammock, B. D. (2006): Functional expression of lepidopteran-selective neurotoxin in baculovirus. Potential for effective pest management. Biochimica et biophysica acta 1760 (2), S. 158–163. Raza, F.; McGouran, J. F.; Kessler, B. M.; Possee, R. D.; King, L. A. (2017): Phosphorylation Induces Structural Changes in the Autographa californica Nucleopolyhedrovirus P10 Protein. JOURNAL OF VIROLOGY 91 (13). Reed, L. J.; Muench, H. (1938): A simple method of estimating fifty per cent endpoints. The American Journal of Hygiene 27 (3), S. 493–497. Regev, A.; Rivkin, H.; Inceoglu, B.; Gershburg, E.; Hammock, B. D.; Gurevitz, M.; Chejanovsky, N. (2003): Further enhancement of baculovirus insecticidal efficacy with scorpion toxins that interact cooperatively. FEBS letters 537 (1-3), S. 106–110. Reid, S.; Chan, L.; van Oers, M. M. (2014): Production of Entomopathogenic Viruses. In: Juan Morales-Ramos, M. Guadalupe Rojas und David Shapiro-Ilan (Hg.): Mass Production of Beneficial Organisms. Invertebrates and Entomopathogens. Elsevier Science, S. 437–482. Rennel, E.; Gerwins, P. (2002): How to make tetracycline-regulated transgene expression go on and off. Analytical Biochemistry 309 (1), S. 79–84. Reuveny, S.; Kim, Y. J.; Kemp, C. W.; Shiloach, J. (1993): Effect of temperature and oxygen on cell growth and recombinant protein production in insect cell cultures. Appl Microbiol Biotechnol 38 (5).

180 Literaturverzeichnis

Richter, J. (2017): Chlamydomonas reinhardtii als Expressionssystem für glykosylierte Proteine, am Beispiel der humanen β-Glucuronidase. Dissertation. Naturwissenschaftliche Fakultät. Friedrich-Alexander-Universität, Nürnberg-Erlangen. Rohrmann, G. F. (2008): Baculovirus Molecular Biology. 1st edition. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), National Center for Biotechnology Information. Rohrmann, G. F. (2011): Baculovirus Molecular Biology. 2nd Edition. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), National Center for Biotechnology Information. Rohrmann, G. F. (2013): Baculovirus Molecular Biology. 3rd edition. Bethesda (MD): National Center for Biotechnology Information (US). Roldão, A.; Oliveira, R.; Carrondo, M. J. T.; Alves, P. M. (2009): Error assessment in recombinant baculovirus titration. Evaluation of different methods. Journal of virological methods 159 (1), S. 69–80. Roldão, A.; Vicente, T.; Peixoto, C.; Carrondo, M. J. T.; Alves, P. M. (2011): Quality control and analytical methods for baculovirus-based products. Journal of invertebrate pathology 107 Suppl, S94-105. Rosinski, M.; Reid, S.; Nielsen, L. K. (2002): Kinetics of baculovirus replication and release using real-time quantitative polymerase chain reaction. Biotechnology and Bioengineering 77 (4), S. 476–480. Rossi, F. M. V.; Blau, H. M. (1998): Recent advances in inducible gene expression systems. Current Opinion in Biotechnology 9 (5), S. 451–456. Roux, L.; Simon, A. E.; Holland, J. J. (1991): Effects of Defective Interfering Viruses on Virus Replication and Pathogenesis In Vitro and In Vivo. In: Advances in Virus Research Volume 40, Bd. 40. Elsevier, S. 181–211. Saarinen, M. A.; Murhammer, D. W. (2003): The response of virally infected insect cells to dissolved oxygen concentration: recombinant protein production and oxidative damage. Biotechnology and Bioengineering 81 (1), S. 106–114. Santos, E. M.; Ball, J. S.; Williams, T. D.; Wu, H.; Ortega, F.; van Aerle, R. et al. (2010): Identifying health impacts of exposure to copper using transcriptomics and metabolomics in a fish model. Environmental science & technology 44 (2), S. 820–826. Santos, M. G.; Jorge, S. A. C.; Brillet, K.; Pereira, C. A. (2007): Improving heterologous protein expression in transfected Drosophila S2 cells as assessed by EGFP expression. Cytotechnology 54 (1), S. 15–24. Sari, D.; Gupta, K.; Thimiri Govinda Raj, D. B.; Aubert, A.; Drncová, P.; Garzoni, F. et al. (2016): The MultiBac Baculovirus/Insect Cell Expression Vector System for Producing Complex Protein Biologics. In: M. Cristina Vega (Hg.): Advanced Technologies for Protein Complex Production and Characterization, Bd. 896. Cham Heidelberg New York Dordrecht London. Springer, S. 199–215.

181 Literaturverzeichnis

Sarkar, A.; Atapattu, A.; Belikoff, E. J.; Heinrich, J. C.; Li, X.; Horn, C. et al. (2006): Insulated piggyBac vectors for insect transgenesis. BMC biotechnology 6, S. 27. Schmidt, F. R. (2004): Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Appl Microbiol Biotechnol 65 (4), S. 363–372. Séguin, C.; Prévost, J. (1988): Detection of a nuclear protein that interacts with a metal regulatory element of the mouse metallothionein 1 gene. Nucleic Acids Research 16 (22), S. 10547–10560. Shao, H.-L.; Dong, D.-J.; Hu, J.-D.; Wang, J.-X.; Zhao, X.-F. (2008): Construction of the recombinant baculovirus AcMNPV with cathepsin B-like proteinase and its insecticidal activity against Helicoverpa armigera. Pesticide Biochemistry and Physiology 91 (3), S. 141–146. Shapiro, M. (1986): In vivo production of Baculoviruses. In: R. R. Granados und B. A. Federici (Hg.): The Biology of Baculoviruses Volume II: Practical Application for Insect Control. Boca Raton, FL. CRC Press, S. 32–61. Shim, H. J.; Choi, J. Y.; Li, M. S.; Wang, Y.; Roh, J. Y.; Woo, S.-D. et al. (2009): A novel recombinant baculovirus expressing insect neurotoxin and producing occlusion bodies that contain Bacillus thuringiensis Cry toxin. Journal of Asia-Pacific Entomology 12 (4), S. 217–220. Shimomura, O. (2005): The discovery of aequorin and green fluorescent protein. Journal of Microscopy 217 (1), S. 3–15. Shimomura, O.; Johnson, F. H. (1962): Extraction, Purification and Properties of Aequorin, a Bioluminescent Protein from the Luminous Hydromedusan, Aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology 59, S. 223–239. Slack, J.; Arif, B. M. (2006): The Baculoviruses Occlusion‐Derived Virus: Virion Structure and Function. In: Advances in Virus Research, Bd. 69. Elsevier, S. 99–165. Smith, C. R.; Heinz, K. M.; Sansone, C. G.; Flexner, J. L. (2000): Impact of Recombinant Baculovirus Field Applications on a Nontarget Heliothine Parasitoid, Microplitis croceipes (Hymenoptera. Braconidae). ec 93 (4), S. 1109–1117. Smith, G. E.; Fraser, M. J.; Summers, M. D. (1983a): Molecular Engineering of the Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus Genome: Deletion Mutations Within the Polyhedrin Gene. JOURNAL OF VIROLOGY 46 (2), S. 584–593. Smith, G. E.; Summers, M. D.; Fraser, M. J. (1983b): Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), S. 2156–2165. Sohn, J.; Takahashi, M.; Okamoto, S.; Ishida, Y.; Furuta, T.; Hioki, H. (2017): A Single Vector Platform for High-Level Gene Transduction of Central Neurons. Adeno-Associated Virus Vector Equipped with the Tet-Off System. PloS one 12 (1).

182 Literaturverzeichnis

Son, J. H.; Buchholz, R.; Park, J.-K.; Kim, S. K. (2006): Production of baculoviruses and expression of green fluorescent protein in immobilised Sf21 insect cell cultivation. Biochemical Engineering Journal 29, S. 55–64. Song, J.; Wang, X.; Hou, D.; Huang, H.; Liu, X.; Deng, F. et al. (2016): The Host Specificities of Baculovirus per os Infectivity Factors. PloS one 11 (7). Sprengel, R.; Hasan, M. T. (2007): Tetracycline-controlled genetic switches. In: Robert Feil und Daniel Metzger (Hg.): Conditional Mutagenesis. An Approach to Disease Models. Berlin, Heidelberg. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, S. 49–72. Stebbins, M. J.; Urlinger, S.; Byrne, G.; Bello, B.; Hillen, W.; Yin, J. C. (2001): Tetracycline- inducible systems for Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences 98 (19), S. 10775–10780. Stebbins, M. J.; Yin, J. C. (2001): Adaptable doxycycline-regulated gene expression systems for Drosophila. Gene 270 (1-2), S. 103–111. Steineke, S. B. (2004): Populationsdynamik des Cydia pomonella Granulovirus. Dissertation. Johannes Gutenberg-Universität, Mainz. Steinke, W. E.; Giles, D. K. (1995): Delivery Systems for Biorational Agents. In: Franklin R. Hall und John Willard Barry (Hg.): Biorational pest control agents. Formulation and delivery, Bd. 595. [Place of publication not identified]. American Chemical Society, S. 80–94. Stevenson, P. C.; D'Cunha, R. F.; Grzywacz, D. (2010): Inactivation of baculovirus by isoflavonoids on chickpea (Cicer arietinum) leaf surfaces reduces the efficacy of nucleopolyhedrovirus against Helicoverpa armigera. Journal of chemical ecology 36 (2), S. 227–235. Stewart, T. M.; Huijskens, I.; Willis, L. G.; Theilmann, D. A. (2005): The Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus ie0-ie1 gene complex is essential for wild- type virus replication, but either IE0 or IE1 can support virus growth. JOURNAL OF VIROLOGY 79 (8), S. 4619–4629. Subramanian, S.; Santharam, G.; Sathiah, N.; Kennedy, J. S.; Rabindra, R. J. (2006): Influence of incubation temperature on productivity and quality of Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus. Biological Control 37 (3), S. 367–374. Sun, X.; Wang, H.; Sun, X.; Chen, X.; Peng, C.; Pan, D. et al. (2004): Biological activity and field efficacy of a genetically modified Helicoverpa armigera single-nucleocapsid nucleopolyhedrovirus expressing an insect-selective toxin from a chimeric promoter. Biological Control 29 (1), S. 124–137. Sun, X.; Wu, D.; Sun, X.; Jin, L.; Ma, Y.; Bonning, B. C. et al. (2009): Impact of Helicoverpa armigera nucleopolyhedroviruses expressing a cathepsin L-like protease on target and nontarget insect species on cotton. Biological Control 49 (1), S. 77–83.

183 Literaturverzeichnis

Szewczyk, B.; de Souza, M.; de Castro, M. (2012): Baculovirus biopesticides. In: Marcelo L. Larramendy, Sonia Soloneski und (Keine Angabe) (Hg.): Integrated pest management and pest control - current and future tactics. Rijeka. InTech, S. 25–36. Szewczyk, B.; de Souza, M. L.; de Castro, M. E. B.; Moscardi, M. L.; Moscardi, F. (2011): Baculovirus Biopesticides. In: Margarita Stoytcheva (Hg.): Pesticides - formulations, effects, fate. Rijeka. InTech, S. 25–36. Szewczyk, B.; Hoyos-Carvajal, L.; Paluszek, M.; Skrzecz, I.; Lobo de Souza, M. (2006): Baculoviruses-- re-emerging biopesticides. Biotechnology advances 24 (2), S. 143–160. Szewczyk, B.; Rabalski, L.; Krol, E.; Sihler, W.; Lobo de Souza, M. (2009): Baculovirus biopesticides - a safe alternative to chemical protection of plants. Journal of Biopestices 2 (2), S. 209–216. Thiem, S. M.; Cheng, X.-W. (2009): Baculovirus host-range. Virol. Sin. 24 (5), S. 436–457. Thompson, C. M.; Montes, J.; Aucoin, M. G.; Kamen, A. A. (2016): Recombinant Protein Production in Large-Scale Agitated Bioreactors using the Baculovirus Expression Vector System. In: David W. Murhammer (Hg.): Baculovirus and insect cell expression protocols. Third edition. New York. Humana Press, S. 241–261. Tramper, J.; Vlak, J. M. (1986): Some Engineering and Economic Aspects of Continuous Cultivation of Insect Cells for the Production of Baculoviruses. Ann NY Acad Sci 469 (1 Biochemical E), S. 279–288. Trowitzsch, S.; Bieniossek, C.; Nie, Y.; Garzoni, F.; Berger, I. (2010): New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production. Journal of structural biology 172 (1), S. 45–54. Tsien, R. Y. (1998): The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry 67. Vago, C.; Aizawa, K.; Ignoffo, C.; Martignoni, M. E.; Tarasevitch, L.; Tinsley, T. W. (1974): Editorial: Present status of the nomenclature and classification of invertebrate viruses. Journal of invertebrate pathology 23 (2), S. 133–134. Vakharia, V. N.; Raina, A. K.; Kingan, T. G.; Kempe, T. G. (1995): Synthetic pheromone biosynthesis activating neuropeptide gene expressed in a baculovirus expression system. Insect Biochemistry and Molecular Biology 25 (5), S. 583–589. van Beek, N.; Davis, D. C. (2016): Baculovirus Insecticide Production in Insect Larvae. In: David W. Murhammer (Hg.): Baculovirus and insect cell expression protocols, Bd. 1350. Third edition. New York. Humana Press, S. 393–405. van Lier, F.L.J.; van der Meijs, W.C.J.; Grobben, N. G.; Olie, R. A.; Vlak, J. M.; Tramper, J. (1992): Continuous β-galactosidase production with a recombinant baculovirus insect- cell system in bioreactors. Journal of Biotechnology 22 (3), S. 291–298. van Oers, M. M. (2011): Opportunities and challenges for the baculovirus expression system. Journal of invertebrate pathology 107 Suppl, S3-15.

184 Literaturverzeichnis van Oers, M. M.; Lynn, D. E. (2010): Insect Cell Culture. In: Encyclopedia of Life Sciences. Chichester. Wiley. van Oers, M. M.; Pijlman, G. P.; Vlak, J. M. (2015): Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology. The Journal of general virology 96 (Pt 1), S. 6–23. Vlak, J. M.; Gooijer, C. D.; Tramper, J.; Miltenburger, H. G. (Hg.) (2002): Insect Cell Culture: Fundamental and Applied Aspects. Dordrecht. Springer Netherlands. Wan, H.; Zhang, Y.; Zhao, X.; Ji, J.; You, H.; Li, J. (2015): Enhancing the insecticidal activity of recombinant baculovirus by expressing a growth-blocking peptide from the beet armyworm Spodoptera exigua. Journal of Asia-Pacific Entomology 18 (3), S. 535–539. Wang, Q.; Bosch, B.-J.; Vlak, J. M.; van Oers, M. M.; Rottier, P. J.; van Lent, Jan W M (2016): Budded baculovirus particle structure revisited. Journal of invertebrate pathology 134, S. 15–22. Wang, X.; Li, L.; Ding, S.; Huang, X.; Zhang, J.; Yin, J.; Zhong, J. (2009): Chicken HS4 insulator significantly improves baculovirus-mediated foreign gene expression in insect cells by modifying the structure of neighbouring chromatin in virus minichromosome. Journal of Biotechnology 142 (3-4), S. 193–199. Wanka, F.; Cairns, T.; Boecker, S.; Berens, C.; Happel, A.; Zheng, X. et al. (2016): Tet-on, or Tet-off, that is the question. Advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal genetics and biology : FG & B 89, S. 72–83. Ward, W. W.; Bokman, S. H. (1982): Reversible denaturation of Aequorea green- fluorescent protein. Physical separation and characterization of the renatured protein. Biochemistry 21 (19), S. 4535–4540. Warne, T.; Serrano-Vega, M. J.; Baker, J. G.; Moukhametzianov, R.; Edwards, P. C.; Henderson, R. et al. (2008): Structure of a beta1-adrenergic G-protein-coupled receptor. Nature 454 (7203), S. 486–491. Wei, L.; Perez-Rodriguez, M. A.; Rodriguez-Perez, M. A. (2016): Effect of recombinant baculovirus expressing CrV1 protein from Cotesia rubecula bracovirus against Pieris rapae in insecticidal toxicity. Entomological Research 46 (3), S. 179–184. Weiss, S. A.; Orr, T.; Smith, G. C.; Kalter, S. S.; Vaughn, J. L.; Dougherty, E. M. (1982): Quantitative measurement of oxygen consumption in insect cell culture infected with polyhedrosis virus. Biotechnol. Bioeng. 24 (5), S. 1145–1154. Wickham, T. J.; Davis, T.; Granados, R. R.; Hammer, D. A.; Shuler, M. L.; Wood, H. A. (1991): Baculovirus defective interfering particles are responsible for variations in recombinant protein production as a function of multiplicity of infection. Biotechnol Lett 13 (7), S. 483–488.

185 Literaturverzeichnis

Wu, C.; Deng, Z.; Long, Z.; Cai, Y.; Ying, Z.; Yin, H. et al. (2016): Generating a host range- expanded recombinant baculovirus. Scientific reports 6, S. 28072. Wu, T.-Y.; Liono, L.; Chen, S.-L.; Chen, C.-Y.; Chao, Y.-C. (2000): Expression of highly controllable genes in insect cells using a modified tetracycline-regulated gene expression system. Journal of Biotechnology 80 (1), S. 75–83. Wu, Y.-L.; Chao, Y.-C. (2008): The establishment of a controllable expression system in baculovirus. Stimulated overexpression of polyhedrin promoter by LEF-2. Biotechnology progress 24 (6), S. 1232–1240. Xue, J.-L.; Salem, T. Z.; Turney, C. M.; Cheng, X.-W. (2010): Strategy of the use of 28S rRNA as a housekeeping gene in real-time quantitative PCR analysis of gene transcription in insect cells infected by viruses. Journal of virological methods 163 (2), S. 210–215. Yamaji, H. (2014): Suitability and perspectives on using recombinant insect cells for the production of virus-like particles. Applied microbiology and biotechnology 98 (5), S. 1963–1970. Yang, J.-P. (2016): Small-scale production of recombinant proteins using the Baculovirus Expression Vector System. In: David W. Murhammer (Hg.): Baculovirus and insect cell expression protocols. Third edition. New York. Humana Press, S. 225–239. Yang, L.; Song, Y.; Li, X.; Huang, X.; Liu, J.; Ding, H. et al. (2012): HIV-1 virus-like particles produced by stably transfected Drosophila S2 cells. A desirable vaccine component. JOURNAL OF VIROLOGY 86 (14), S. 7662–7676. Yang, S.; Zhao, L.; Ma, R.; Fang, W.; Hu, J.; Lei, C.; Sun, X. (2017): Improving Baculovirus Infectivity by Efficiently Embedding Enhancing Factors into Occlusion Bodies. Applied and environmental microbiology 83 (14). Yang, T.-T.; Cheng, L.; Kain, S. R. (1996): Optimized Codon Usage and Chromophore Mutations Provide Enhanced Sensitivity with the Green Fluorescent Protein. Nucleic Acids Research 24 (22), S. 4592–4593. Young, J. C.; MacKinnon, E. A.; Faulkner, P. (1993): The Architecture of the Virogenic Stroma in Isolated Nuclei of Spodoptera frugiperda Cells in Vitro Infected by Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus. Journal of structural biology 110 (2), S. 141–153. Yu, H.; Meng, J.; Xu, J.; Liu, T.-X.; Wang, D. (2015): A Novel Neurotoxin Gene ar1b Recombination Enhances the Efficiency of Helicoverpa armigera Nucleopolyhedrovirus as a Pesticide by Inhibiting the Host Larvae Ability to Feed and Grow. PloS one 10 (8). Yu, H.; Zhou, B.; Meng, J.; Xu, J.; Liu, T.-X.; Wang, D. (2017): Recombinant Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus with arthropod-specific neurotoxin gene RjAa17f from Rhopalurus junceus enhances the virulence against the host larvae. Insect science 24 (3), S. 397–408.

186 Literaturverzeichnis

Zhang, B.; Egli, D.; Georgiev, O.; Schaffner, W. (2001): The Drosophila homolog of mammalian zinc finger factor MTF-1 activates transcription in response to heavy metals. Mol. Cell. Biol. 21 (14), S. 4505–4514. Zhang, F.; Saarinen, M. A.; Itle, L. J.; Lang, S. C.; Murhammer, D. W.; Linhardt, R. J. (2002): The effect of dissolved oxygen (DO) concentration on the glycosylation of recombinant protein produced by the insect cell-baculovirus expression system. Biotechnol. Bioeng. 77 (2), S. 219–224. Zhou, J.; Blissard, G. W. (2008): Identification of a GP64 subdomain involved in receptor binding by budded virions of the baculovirus Autographica californica multicapsid nucleopolyhedrovirus. JOURNAL OF VIROLOGY 82 (9), S. 4449–4460. Zitzmann, J.; Sprick, G.; Weidner, T.; Schreiber, C.; Czermak, P. (2017): Process Optimization for Recombinant Protein Expression in Insect Cells. In: Sivakumar Joghi Thatha Gowder (Hg.): New Insights into Cell Culture Technology. InTech. Zwart, M. P.; Erro, E.; van Oers, M. M.; Visser, J. A. G. M. de; Vlak, J. M. (2008): Low multiplicity of infection in vivo results in purifying selection against baculovirus deletion mutants. Journal of General Virology 89 (5), S. 1220–1224. Zwart, M. P.; Pijlman, G. P.; Sardanyés, J.; Duarte, J.; Januário, C.; Elena, S. F. (2013): Complex dynamics of defective interfering baculoviruses during serial passage in insect cells. Journal of biological physics 39 (2), S. 327–342.

187

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 2.1: Schematische Darstellung des Aufbaus der occlusion bodies (OBs) von multiple und single Nucleopolyhedroviren (NPV) sowie Granuloviren (GV) ...... 3 Abbildung 2.2: Klassifizierung der Baculoviren ...... 3 Abbildung 2.3: Schematische Darstellung des Aufbaus von MNPV OBs, ODVs und BVs .. 5 Abbildung 2.4: Schematische Darstellung des zweiphasigen Replikationszyklus am Beispiel des AcMNPV ...... 6 Abbildung 2.5: Unterschiede zwischen den N-Glykanstrukturen in Insekten- und Säugetierzellen ...... 23 Abbildung 2.6: Mechanismus der Genregulation mittels Tet-Off System ...... 30 Abbildung 2.7: β-Fass-Struktur und ungefähre Dimensionen des GFP aus A. victoria .... 31 Abbildung 2.8: Anregungs- und Emissionspektren von GFP und eGFP ...... 32 Abbildung 4.1: Kalibrierkurve zur Quantifizierung der eGFP-Konzentration in Zelllysaten mittels Fluoreszenzmessung am PlateReader ...... 57 Abbildung 4.2: Kalibriergerade zur Berechnung der eGFP-Konzentration von ELISA- Proben ...... 59 Abbildung 5.1: Nachweis der Plasmidintegrität der Ausgangsplasmide pFastBac1 und pMA‑T‑egfp ...... 62

Abbildung 5.2: Integrationsnachweis des Zielgens egfp im Ligationsprodukt pPpolhegfp62

Abbildung 5.3: Integrationsnachweis des Zielkonstruktes Ppolhegfp im Bacmid

bPpolhegfp ...... 63

Abbildung 5.4: Trennung des pFastBac1 Rückgrats vom Ppolh-Fragment ...... 64 Abbildung 5.5: Integrationsnachweis des Zielgens egfp im Ligationsprodukt pGEM-

Pmtnegfp ...... 65

Abbildung 5.6: Nachweis der Amplifikation des Zielkonstruktes Pmtnegfp aus dem

Plasmid pGEM-Pmtnegfp ...... 65

Abbildung 5.7: Integrationsnachweis des Zielkonstruktes Pmtnegfp im Ligationsprodukt

pPmtnegfp ...... 66

Abbildung 5.8: Integrationsnachweis des Zielkonstruktes Pmtnegfp im Bacmid

bPmtnegfp ...... 67

Abbildung 5.9: Nachweis der Plasmidintegrität des Ausgangsplasmids pDHPTightegfp ... 68

Abbildung 5.10: Integrationsnachweis des Zielkonstruktes HS4-PTightegfp-HS4 im Bacmid

bDHPTightegfp ...... 68

Abbildung 5.11: Nachweis der Plasmidintegrität des Ausgangsplasmids pDHPTightegfp-

Ppolhtta...... 69

188 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 5.12: Integrationsnachweis des Zielkonstruktes HS4-PTightegfp-HS4-Ppolhtta im

Bacmid bDHPTightegfp-Ppolhtta ...... 69

Abbildung 5.13: Adaption von Sf21-Insektenzellen an CuSO4 ...... 70 Abbildung 5.14: Kupfer-Toxizitätstest mit adaptierten Sf21-Insektenzellen ...... 71 Abbildung 5.15: Kupfer-Toxizitätstest mit infizierten und nicht-infizierten Sf21- Insektenzellen ...... 73 Abbildung 5.16: Doxycyclin-Toxizitätstest mit Sf21-Insektenzellen ...... 74

Abbildung 5.17: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten egfp-Expression in infizierten, adaptierten Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 2 P2, MOI 1) bei verschiedenen Kupferkonzentrationen ...... 76

Abbildung 5.18: Nachweis der Pmtn-gesteuerten eGFP-Produktion durch AcMNPV-Me 2 77 Abbildung 5.19: Zeitlicher Verlauf der LZD und Vitalität von infizierten, adaptierten Sf21- Insektenzellen (AcMNPV-Me 2 P2, MOI 1) bei unterschiedlichen Kupferkonzentrationen ...... 78 Abbildung 5.20: Zeitlicher Verlauf der Viruspartikeltiter im Überstand von infizierten, adaptierten Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 2 P2, MOI 1) bei unterschiedlichen Kupfer-konzentrationen ...... 79

Abbildung 5.21: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten egfp-Expression in infizierten, nicht-adaptierten Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 2 P2, MOI 1) bei unterschiedlichen Kupferkonzentrationen ...... 81 Abbildung 5.22: Zeitlicher Verlauf der LZD und Vitalität von infizierten, nicht-adaptierten Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 2 P2, MOI 1) bei unterschiedlichen Kupferkonzentrationen ...... 81 Abbildung 5.23: Zeitlicher Verlauf der Viruspartikeltiter im Überstand infizierter, nicht- adaptierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 2 P2, MOI 1) bei unterschiedlichen Kupferkonzentrationen ...... 82

Abbildung 5.24: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Pb infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P3, MOI 5) bei

verschiedenen Konzentrationen der Kupfersalze CuCl2 und CuSO4 ...... 83 Abbildung 5.25: Zeitlicher Verlauf des Anteils eGFP+-Messwerte infizierter Sf21- Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P3, MOI 5) bei verschiedenen

Konzentrationen der Kupfersalze CuCl2 und CuSO4 ...... 84

Abbildung 5.26: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Pb infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P3, MOI 5) bei

verschiedenen CuCl2-Konzentrationen ...... 85 Abbildung 5.27: Zeitlicher Verlauf des Anteils eGFP+-Messwerte infizierter Sf21-

Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P3, MOI 5) bei verschiedenen CuCl2- Konzentrationen ...... 85

189 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 5.28: Zeitlicher Verlauf der LZD und Vitalität infizierter Sf21-Insektenzellen

(AcMNPV-Me 4 P3, MOI 0,1) bei verschiedenen CuCl2-Konzentrationen87

Abbildung 5.29: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Db infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P3, MOI 0,1) bei

verschiedenen CuCl2-Konzentrationen ...... 87 Abbildung 5.30: Zeitlicher Verlauf des Anteils eGFP+-Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4

P3, MOI 0,1) bei verschiedenen CuCl2-Konzentrationen ...... 88

Abbildung 5.31: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten eGFP-Konzentration in infizierten

Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P4, MOI 3, 800 µM CuCl2) ...... 89

Abbildung 5.32: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Pb infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P4, MOI 5) bei unterschiedlichen Induktionszeitpunkten ...... 91 Abbildung 5.33: Zeitlicher Verlauf des Anteils eGFP+-Messwerte infizierter Sf21- Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P4, MOI 5) bei unterschiedlichen

Induktionszeitpunkten des Pmtn ...... 91

Abbildung 5.34: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Db infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P4, MOI 1) sowie des Anteils eGFP+-Zellen nach Induktion des Promotors ...... 93

Abbildung 5.35: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten egfp-Expression infizierter Sf21- Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P4, MOI 1) nach Induktion des Promotors ...... 93

Abbildung 5.36: Zeitlicher Verlauf der PTight-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Pb infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-DHTePt P7-2, MOI 5) bei verschiedenen Doxycyclin-Konzentrationen ...... 97 Abbildung 5.37: Zeitlicher Verlauf des Anteils eGFP+-Messwerte infizierter Sf21- Insektenzellen (AcMNPV-DHTePt P7-2, MOI 5) bei verschiedenen Doxycyclin-Konzentrationen...... 97 Abbildung 5.38: Konzentrations-Wirkungs-Kurve zur Doxycyclin-vermittelten Hemmung

der PTight-gesteuerten eGFP-Expression in der 96-well Mikrotiterplatte mit Angabe des Anteils eGFP+-Zellen ...... 99 Abbildung 5.39: Zeitlicher Verlauf der LZD und Vitalität infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-DHTePt P7-2, MOI 1) bei verschiedenen Doxycyclin- Konzentrationen ...... 100

Abbildung 5.40: Zeitlicher Verlauf der PTight-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Db infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-DHTePt P7-2, MOI 1) sowie des Anteils eGFP+-Zellen bei verschiedenen Doxycyclin-Konzentrationen . 101 Abbildung 5.41: Zeitlicher Verlauf der infektiösen Virustiter, der Viruspartikeltiter sowie der egfp+-Viren im Überstand infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV- DHTePt P7-2, MOI 1) bei verschiedenen Doxycyclin-Konzentrationen 102

190 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 5.42: Zeitlicher Verlauf der PTight-gesteuerten eGFP-Konzentration in infizierten Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-DHTePt P3, MOI 3, 0 ng∙mL-1 Doxycyclin) ...... 103 Abbildung 5.43: Einfluss der Doxycyclin-Konzentration auf LZD und Vitalität infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-DHTePt P7-2, MOI 0,1) ...... 104 Abbildung 5.44: Konzentrations-Wirkungs-Kurve zur Doxycyclin-vermittelten Hemmung

der PTight-gesteuerten eGFP-Expression in Schüttelkultur mit Angabe des Anteils eGFP+-Zellen ...... 104 Abbildung 5.45: Konzentrations-Wirkungs-Kurve zur Doxycyclin-vermittelten Hemmung

der PTight-gesteuerten egfp-Expression sowie der Ppolh-gesteuerten tta- Expression in Schüttelkultur ...... 105 Abbildung 5.46: Einfluss der Doxycyclin-Konzentration auf die Viruspartikeltiter und den Anteil egfp+-Viren im Überstand infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-DHTePt P7-2, MOI 0,1, 5 dpi) ...... 106

Abbildung 5.47: Zeitlicher Verlauf der PTight-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Pb sowie des Anteils eGFP+-Messwerte infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-DHTePt P3, MOI 5, 0 ng∙mL-1 Doxycyclin) ...... 107 Abbildung 5.48: Schematische Darstellung des Versuchsablaufs zur Untersuchung des Einschalteverhaltens des Tet-Off Systems sowie die jeweils erreichte,

PTight-regulierte, bereinigte, normierte eGFP-Produktion Pb ...... 109

Abbildung 5.49: Zeitlicher Verlauf der Ppolh-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Pb sowie des Anteils eGFP+-Messwerte infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Pe P3, MOI 5) ...... 111

Abbildung 5.50: Zeitlicher Verlauf der Ppolh-gesteuerten eGFP-Konzentration in infizierten Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Pe P3, MOI 3) ...... 112 Abbildung 5.51: Entwicklung der infektiösen Titer, Viruspartikeltiter und des Anteils egfp+-Viren über mehrere Passagen unter Angabe der Zellvitalität bei Virusernte ...... 113

Abbildung 5.52: Zeitlicher Verlauf der bereinigten eGFP-Produktion Pb von Sf21- Insektenzellen, die mit unterschiedlichen Verhältnissen aus DIPs und intakten Viren infiziert wurden ...... 115 Abbildung 5.53: Zeitlicher Verlauf des Anteils eGFP+-Messwerte von Sf21-Insektenzellen, die mit unterschiedlichen Verhältnissen aus DIPs und intakten Viren infiziert wurden ...... 116 Abbildung 5.54: Einfluss der DIP-Konzentration auf die Produktion infektiöser Viren durch Sf21-Insektenzellen bei unterschiedlichen MOI (AcMNPV-DHTePt P7-6, 3 dpi) ...... 116

191 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 7.1: Entwicklung des infektiösen Titers sowie der beiden mittels PCR bestimmten Viruspartikeltiter des AcMNPV-DHTePt von Passage 2 bis Passage 15 ...... 130 Abbildung 7.2: Auftragung der auf alle Viruspartikel bezogenen MOI, des Anteil egfp+- Viren sowie der Wahrscheinlichkeit, dass eine Zelle von mehr als einem Virus infiziert wird, über die Passagenzahl ...... 133 Abbildung 7.3: Wahrscheinlichkeit, dass eine Zelle von n Viren infiziert wird in Abhängigkeit der eingesetzten MOI laut Poisson-Verteilung ...... 134 Abbildung 7.4: Das Verhältnis von DIPs zu egfp+-Viren in Abhängigkeit der verwendeten DIP-Verdünnung und eingestellten MOI für die zwölf verschiedenen Versuchsansätze ...... 135 Abbildung 7.5: Einfluss der MOI auf die Anzahl n an Viren, die dieselbe Zelle infizieren laut Poisson-Verteilung ...... 137 Abbildung 7.6: Vergleich der DNA-Sequenzen des Transfervektors pFastBac1 mit einem, die Aktivatorsequenz enthaltenden, Fragment des AcMNPV-wt ...... 139

Abbildung 7.7: Vergleich der Pmtn-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Pb mit der

durchschnittlichen eGFP-Produktion Pd infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P3, MOI 5, 79 hpi) bei verschiedenen Kupferionen- Konzentrationen ...... 141

Abbildung 7.8: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten, durchschnittlichen eGFP-

Produktion Dd infizierter Sf21-Insektenzellen bei unterschiedlichen Kupferionen-Konzentrationen (AcMNPV-Me 4 P3, MOI 0,1) ...... 142

Abbildung 7.9: Vergleich der Pmtn-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Db mit der

durchschnittlichen eGFP-Produktion Dd infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P4, MOI 1) nach Induktion des Promotors ...... 147 Abbildung 7.10: Konzentrations-Wirkungs-Kurve zur Doxycyclin-vermittelten Hemmung

der PTight-gesteuerten, durchschnittlichen eGFP-Produktion ...... 149

Abbildung 7.11: Zeitlicher Verlauf der PTight- und Ppolh-gesteuerten durchschnittlichen

eGFP-Produktion Pd infizierter Sf21-Insektenzellen (PTight: AcMNPV-

DHTePt P3, Ppolh: AcMNPV-Pe P3; beide MOI 5) ...... 151 Abbildung 7.12: Schematische Darstellung des Versuchsablaufs zur Untersuchung des Einschaltverhaltens des Tet-Off Systems sowie die jeweils erreichte,

normierte, durchschnittliche eGFP-Produktion Pd bezogen auf die Produktionsdauer ...... 152 Abbildung 7.13: Skizze des zeitlichen Verlaufs der eGFP-Produktion nach

unterschiedlichen Induktionszeitpunkten des PTight ...... 152 Abbildung 7.14: Zeitlicher Verlauf der normierten, durchschnittlichen eGFP-

Produktion Pd von mit verschiedenen Viren infizierten Sf21- Insektenzellen ...... 153

192 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 7.15: Zeitlicher Verlauf der eGFP-Raum-Zeit-Ausbeuten von mit verschiedenen Viren infizierten Sf21-Insektenzellen ...... 155

Abbildung 9.1: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Pb infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P4, MOI 5) bei unterschiedlichen Induktionszeitpunkten Induktion durch Zugabe von

200 µM CuCl2. Darstellung mit durch Fehlerbalken repräsentierte Standardabweichungen...... 199 Abbildung 9.2: Zeitlicher Verlauf des Anteils eGFP+-Messwerte infizierter Sf21- Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P4, MOI 5) bei unterschiedlichen

Induktionszeitpunkten des Pmtn ...... 200 Abbildung 9.3: Zeitlicher Verlauf der LZD und Vitalität infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P4, MOI 1) nach Induktion des Promotors ...... 200 Abbildung 9.4: Zeitlicher Verlauf der LZD und Vitalitäten mit verschiedenen Viren

infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P4 (800 µM CuCl2), AcMNPV-DHTePt P3, AcMNPV-Pe P3; alle: MOI 3) ...... 201 Abbildung 9.5: Expressionsverlauf potentieller Referenzgene in infizierten Sf21- Insektenzellen ...... 201 Abbildung 9.6: Plasmidkarte pFastBac1 ...... 202 Abbildung 9.7: Plasmidkarte pMA-T-egfp ...... 202

Abbildung 9.8: Plasmidkarte pPpolhegfp ...... 203

Abbildung 9.9: Plasmidkarte pGEM-Pmtn ...... 203

Abbildung 9.10: Plasmidkarte pGEM-Pmtnegfp ...... 204

Abbildung 9.11: Plasmidkarte pPmtnegfp ...... 204

Abbildung 9.12: Plasmidkarte pDHPTightegfp ...... 205

Abbildung 9.13: Plasmidkarte pDHPTightegfp-Ppolhtta ...... 205

Abbildung 9.14: Klonierungsplan zur Erstellung des Transfervektors pPpolhegfp ...... 208

Abbildung 9.15: Klonierungsplan zur Erstellung des Transfervektors pPmtnegfp ...... 209

193

Tabellenverzeichnis

Tabelle 2.1: Beispiele von Baculoviren als Biopestizide im Pflanzenschutz...... 11 Tabelle 2.2: Etablierte Insektenzelllinien zur in vitro Baculovirus-Produktion ...... 19 Tabelle 2.3: Vergleich verschiedener eukaryotischer Expressionssysteme ...... 27 Tabelle 4.1: Benennung der hergestellten Transfervektoren, Bacmide und Viren .... 34 Tabelle 4.2: Selektionsdruck durch Antibiotika-Zugabe ...... 36 Tabelle 4.3: Parameter zur Bestimmung der DNA-Konzentration in Lösungen ...... 39 Tabelle 4.4: Zusammensetzung der PCR-Ansätze – Taq DNA-Polymerase ...... 40 Tabelle 4.5: PCR-Temperaturprogramm – Taq DNA-Polymerase ...... 40 Tabelle 4.6: Zusammensetzung der PCR-Ansätze – Kapa HiFi DNA-Polymerase ...... 41 Tabelle 4.7: PCR-Temperaturprogramm – Kapa HiFi DNA-Polymerase ...... 41 Tabelle 4.8: Zusammensetzung der Ansätze für eine Kontrollrestriktion ...... 42 Tabelle 4.9: Zusammensetzung der Ligationsansätze...... 43 Tabelle 4.10: Zusammensetzung der PCR-Ansätze zur Viruspartikeltiterbestimmung mittels real‑time PCR ...... 48 Tabelle 4.11: PCR-Temperaturprogramm Viruspartikeltiterbestimmung ...... 49 Tabelle 4.12: Kalibrierfunktionen zur Quantifizierung der Viruspartikeltiter mittels rt- PCR ...... 49 Tabelle 4.13: Übersicht über die zwölf Variationen aus MOI und DIP-Verdünnung zur Untersuchung der Auswirkungen der Interferenz mit dem Virus AcMNPV-DHTePt ...... 51 Tabelle 4.14: Zusammensetzung der PCR-Ansätze zur Genexpressionsanalyse mittels rt-RT-PCR...... 53 Tabelle 4.15: Verwendete Systemkonfiguration des CytoFLEX S ...... 58 Tabelle 5.1: Analyse verschiedener Stocks der Viren AcMNPV-Me 2 und 4 mittels rt- PCR und Endpunkttitration ...... 75 Tabelle 5.2: Kupferkonzentrationen in adaptierten und nicht-adaptierten Sf21- Insektenzellen sowie im Nährmedium ...... 80 Tabelle 5.3: Analyse verschiedener Stocks des Virus AcMNPV-DHTe mittels real-time PCR ...... 95 Tabelle 5.4: Analyse verschiedener Stocks des Virus AcMNPV-DHTePt mittels real- time PCR und Endpunkttitration ...... 96 Tabelle 5.5: Analyse der verschiedenen Stocks des Virus AcMNPV-Pe mittels real- time PCR und Endpunkttitration ...... 110 Tabelle 6.1: Übersicht über die verschiedenen MOI beim Interferenz-Test ...... 122

194 Tabellenverzeichnis

Tabelle 7.1: Einfluss unterschiedlicher Konzentrationen der Kupfersalze CuCl2 und

CuSO4 auf die normierte, durchschnittliche eGFP-Produktion Pd infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P3, MOI 5) ...... 141 Tabelle 9.1: Übersicht über verwendete Chemikalien und Reagenzien ...... 211 Tabelle 9.2: Übersicht über verwendete Verbrauchsmaterialien...... 213 Tabelle 9.3: Übersicht über verwendetes Laborequipment ...... 214 Tabelle 9.4: Übersicht über verwendete Software ...... 215 Tabelle 9.5: Übersicht über die verwendeten Kits ...... 216 Tabelle 9.6: Übersicht über verwendete Enzyme ...... 216 Tabelle 9.7: Antikörper für Western Blot ...... 216 Tabelle 9.8: Übersicht über verwendete Nährmedien und deren ...... Zusammensetzung ...... 217 Tabelle 9.9: Zusammensetzung der verwendeten Puffer und Lösungen ...... 217 Tabelle 9.10: Verwendete Escherichia coli Stämme ...... 218 Tabelle 9.11: Verwendete Insektenzelllinie ...... 218 Tabelle 9.12: Übersicht über verwendete Restriktionsenzyme sowie die Größe der für das jeweilige Plasmid erwarteten DNA-Fragmente ...... 219 Tabelle 9.13: Übersicht über verwendete Primer sowie die Größe der für das jeweilige template erwarteten DNA-Fragmente ...... 219 Tabelle 9.14: Liste der verwendeten Primer ...... 220

195

Abkürzungsverzeichnis

Abkürzung Bedeutung A Adenin AaIT Androctonus australis insect toxin 1 AcMNPV Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus

AcMNPV-DHTe AcMNPV-Dual-HS4-PTight-egfp

AcMNPV-DHTePt AcMNPV-Dual-HS4-PTight-egfp-Ppolh-tta

AcMNPV-Me AcMNPV-Pmtn-egfp

AcMNPV-Pe AcMNPV-Ppolh-egfp BAC bacterial artificial chromosome BayCEER Bayreuther Zentrum für Ökologie und Umweltforschung BEVS baculovirus expression vector system Bt-Toxin Bacillus thuringiensis Toxin BV budded virus C Cytosin cfu colony forming units

CuCl2 Kupferchlorid

CuSO4 Kupfersulfat DAPI 4',6-Diamidin-2-Phenylindol DEPC Diethylpyrocarbonat DIP defective interfering particle DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribunukleinsäure dpi days post infection dsDNA doppelsträngige DNA E Primer-Effizienz E. coli Escherichia coli egfp Gen des eGFPs eGFP enhanced grün fluoreszierendes Protein EGT Ecdysteroid UDP-Glukosyltransferase ELISA enzyme-linked immunosorbent assay FI Fluoreszenzintensität FITC Fluorescein Isothiocyanat FKS fötales Kälberserum Formazan (E,Z)-5-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-1,3-diphenylformazan

196 Abkürzungsverzeichnis

Abkürzung Bedeutung G Guanin gapdh Gen der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase goi gene of interest GP64 Glykoprotein 64 GV Granuloviren hcf-1 host cell factor 1 hpi hours post infection hr5 Homologe Region 5 hrf-1 host range factor 1 HRP horseradish peroxidase hrs homologous regions ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses JHE Juvenilhormonesterase kb Kilobasenpaare l14 Gen des ribosomalen Proteins L14

LC50 letale Konzentration, um 50 % der infizierten Laven zu töten

LD50 letale Dosis, um 50 % der infizierten Laven zu töten

LT50 letale Zeit, Dauer bis 50 % der infizierten Laven gestorben sind LZD Lebendzelldichte MNPV multiple Nucleopolyhedroviren MOI multiplicity of infection MRE metal response elements MTF-1 metal-responsive transcription factor-1 MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid NaCS Natriumcellulosesulfat NADH Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (oxidierte Form) NADPH Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (reduzierte Form) NCBI National Center for Biotechnology Information NPV Nucleopolyhedroviren NRT no reverse transcription NTC no template control OB occlusion body ODV occlusion derived virus ORF open reading frame ori origin of replication P. Pastoris Pichia Pastoris PBS phosphate buffered saline

197 Abkürzungsverzeichnis

Abkürzung Bedeutung PCR Polymerasekettenreaktion pDADMAC Polydiallyldimethylammoniumchlorid PIF per os infectivity factor

PminCMV minimal CMV-Promotor

Pmtn Metallothionein-Promotor polh Gen des Polyhedrins

Pp10 p10-Promotor ppi Gen der Peptidyl Prolyl Isomerase A

Ppolh Polyhedrin-Promotor

PTight Promotor des Tet-Off Systems RFU relative fluorescence units RNA Ribonukleinsäure rpm rounds per minute rt-RT-PCR real-time Reverse Transkription Polymerasekettenreaktion SDS Natriumdodecylsulfat SDS-PAGE SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Sf Spodoptera frugiperda siRNA small interfering RNA SNPV single Nucleopolyhedroviren SURE-Zellen stop unwanted rearrangement events Zellen T Thymin

TA Primerhybridisierungs (annealing)-Temperatur

TCID50 tissue culture infection dose 50 tD Verdopplungszeit tetO tet-Operatorsequenz tetR Tetracyclin-Repressor-Protein TOH time of harvest TOI time of infection

TRE(mod) (modifiziertes) tetracycline-responsive element tTA Tetracyclin Transaktivator tta Gen des Tetracyclin Transaktivators tub Gen des Tubulins U units up upstream polyhedrin enhancer region VLP virus like particle VP Viruspartikel VP39 virales Protein 39

198

9 Anhang

9.1 Weitere erhobene Daten

9.1.1 Induktionskinetik Pmtn

2.000 0 h

) 1 - 1.800 6 h ∙Z 12 h 1.600

24 h

(RFU

b 1.400 32 h 1.200 48 h 1.000

800

Produktion P Produktion - 600 400

Ber. eGFP Ber. 200 0 0 24 48 72 96 Prozesszeit (h)

Abbildung 9.1: Zeitlicher Verlauf der Pmtn-gesteuerten, bereinigten eGFP-Produktion Pb infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P4, MOI 5) bei unterschiedlichen Induktionszeitpunkten

Induktion durch Zugabe von 200 µM CuCl2. Darstellung mit durch Fehlerbalken repräsentierte Standardabweichungen.

199 Anhang

110 0 h 100

6 h

90 12 h 80 24 h 70 32 h

60 48 h

Messwerte (%) Messwerte -

+ 50 40 30

Anteil eGFP Anteil 20 10 0 0 24 48 72 96 Prozesszeit (h)

Abbildung 9.2: Zeitlicher Verlauf des Anteils eGFP+-Messwerte infizierter Sf21-Insektenzellen

(AcMNPV-Me 4 P4, MOI 5) bei unterschiedlichen Induktionszeitpunkten des Pmtn Induktion durch Zugabe von 200 µM CuCl2. Darstellung mit durch Fehlerbalken repräsentierte Standardabweichungen.

1E+7107 100

90 ---

) ) 80

1

-

mL 70

∙ .... 60 6 1E+610 50

40 Vitalität (%) Vitalität 30

Lebendzelldichte (Z Lebendzelldichte 20 0ohne µM CuClCu 2

10 200mit µMCu CuCl2 1E+5105 0 0 6 12 18 24 30 36 Prozesszeit (h)

Abbildung 9.3: Zeitlicher Verlauf der LZD und Vitalität infizierter Sf21-Insektenzellen (AcMNPV- Me 4 P4, MOI 1) nach Induktion des Promotors

Die Induktion erfolgte 12 hpi durch Zugabe von 200 µM CuCl2 zum Kulturmedium. Als Kontrolle wurde eine Kultur in Kupfer-freiem Medium mitgeführt.

200 9.1 Weitere erhobene Daten

9.1.2 Maximalexpression

7

1E+710 100

80 ....

--- 60

) )

1 -

40

mL ∙

20 (%) Vitalität 1E+6106 0

-20 AcMNPV-Pe -40 AcMNPV-DHTePt

Lebendzelldichte (Z Lebendzelldichte -60 AcMNPV-Me -80 n. inf. Kontrolle 1E+5105 -100 0 24 48 72 96 Prozesszeit (h)

Abbildung 9.4: Zeitlicher Verlauf der LZD und Vitalitäten mit verschiedenen Viren infizierter

Sf21-Insektenzellen (AcMNPV-Me 4 P4 (800 µM CuCl2), AcMNPV-DHTePt P3, AcMNPV-Pe P3; alle: MOI 3)

9.1.3 Hemmung der zelleigenen Genexpression

10 28S 28S rRNA rRNA

gapdhgapdh

) - 1 l14l14

ppippi

tubulintubulin 0,1

0,01 Normierte Expression ( Expression Normierte

0,001 0 12 24 36 48 60 72 Prozesszeit (h)

Abbildung 9.5: Expressionsverlauf potentieller Referenzgene in infizierten Sf21-Insektenzellen Dargestellt als normierte Expression bezogen auf eine nicht infizierte Kontrollkultur.

201 Anhang

9.2 Plasmidkarten

9.2.1 pFastBac1

Abbildung 9.6: Plasmidkarte pFastBac1

9.2.2 pMA-T-egfp

Abbildung 9.7: Plasmidkarte pMA-T-egfp

202 9.2 Plasmidkarten

9.2.3 pPpolhegfp

Abbildung 9.8: Plasmidkarte pPpolhegfp

9.2.4 pGEM-Pmtn

Abbildung 9.9: Plasmidkarte pGEM-Pmtn

203 Anhang

9.2.5 pGEM-Pmtnegfp

Abbildung 9.10: Plasmidkarte pGEM-Pmtnegfp

9.2.6 pPmtnegfp

Abbildung 9.11: Plasmidkarte pPmtnegfp

204 9.2 Plasmidkarten

9.2.7 pDHPTightegfp

Abbildung 9.12: Plasmidkarte pDHPTightegfp

9.2.8 pDHPTightegfp-Ppolhtta

Abbildung 9.13: Plasmidkarte pDHPTightegfp-Ppolhtta

205 Anhang

9.3 Gensequenzen

9.3.1 Codon-optimierte egfp DNA-Sequenz

ATGGTGTCCAAGGGCGAGGAACTGTTCACCGGTGTCGTGCCCATCCTGGTCGAACTGGACGGCG ACGTGAACGGTCACAAGTTCTCCGTGTCTGGCGAAGGCGAGGGCGACGCTACCTACGGAAAGCT GACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCTTGGCCTACCCTGGTCACCACTCT GACCTACGGTGTCCAGTGCTTCTCCCGTTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGATTTCTTCAAGTC CGCTATGCCCGAGGGTTACGTGCAAGAGCGTACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGA CCCGTGCTGAAGTGAAGTTCGAAGGCGACACCCTCGTGAACCGTATCGAGCTGAAGGGTATCGA CTTCAAGGAAGATGGAAACATCCTGGGCCACAAGCTCGAGTACAACTACAACTCCCACAACGTGT ACATCATGGCCGACAAGCAAAAGAACGGCATCAAAGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGA GGACGGTTCCGTGCAGCTGGCTGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGTCCTGTGC TGCTGCCTGACAACCACTACCTGTCCACCCAGTCCAAGCTGTCCAAGGACCCCAACGAGAAGCGT GACCACATGGTGCTGCTCGAGTTCGTGACCGCTGCTGGTATCACCCTGGGCATGGACGAGCTGTA CAAGTAA

9.3.2 Drosophila Metallothionein-Promotor DNA-Sequenz

Metallothionein-Promotor aus Drosophila mit Consensus-Sequenz.

AATTCGTTGCAGGACAGGATGTGGTGCCCGATGTGACTAGCTCTTTGCTGCAGGCCGTCCTATCC TCTGGTTCCGATAAGAGACCCAGAACTCCGGCCCCCCACCGCCCACCGCCACCCCCATACATATGT GGTACGCAAGTAAGAGTGCCTGCGCATGCCCCATGTGCCCCACCAAGAGCTTTGCATCCCATACA AGTCCCCAAAGTGGAGAACCGAACCAATTCTTCGCGGGCAGAACAAAAGCTTCTGCACACGTCTC CACTCGAATTTGGAGCCGGCCGGCGTGTGCAAAAGAGGTGAATCGAACGAAAGACCCGTGTGTA AAGCCGCGTTTCCAAAATGTATAAAACCGAGAGCATCTGGCCAATGTGCATCAGTTGTGGTCAGC AGCAAAATCAAGTGAATCATCTCAGTGCAACTAAAGG

9.3.3 PTight-Promotor DNA-Sequenz

Promotor PTight, bestehend aus sieben tet-Operatorsequenzen gefolgt von einem minimal CMV-Promotor.

GAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAAC GATGTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAG AGAACGTATGTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGTTTATCCCTATCAGT GATAGAGAACGTATGTCGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGTCGAGGTAGGCGT GTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCC

206 9.3 Gensequenzen

9.3.4 tta DNA-Sequenz tta kodiert für den Tetracyclin Transaktivator (tTA, auch tetR(B)FFF genannt) mit drei Minimaldomänen (tandem repeats der minimalen Aktivierungsdomäne des Herpes Simplex Virus Proteins VP16). Codon-usage: E. coli

ATGTCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAGCGCATTAGAGCTGCTTAATGAGGTCGGAAT CGAAGGTTTAACAACCCGTAAACTCGCCCAGAAGCTTGGTGTAGAGCAGCCTACATTGTATTGGC ATGTAAAAAATAAGCGGGCCCTGCTCGACGCCTTAGCCATTGAGATGTTAGATAGGCACCATACT CACTTTTGCCCTTTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCTAAAAGTTTTAGA TGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCAAAAGTACATTTAGGTACACGGCCTACAGAAAAACA GTATGAAACTCTCGAAAATCAATTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTTTCACTAGAGAACGCGTT ATATGCACTCAGCGCTGTGGGGCATTTTACCTTAGGTTGCGTATTGGAAGATCAAGAGCATCAAG TCGCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCGCCATTATTACGACAAGCTATC GAATTATTTGATCACCAAGGTGCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGCGGA TTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGAGGGCCGGCCGACGCCCTTGACGATTTTGACTTAGA CATGCTCCCAGCCGATGCCCTTGACGACTTTGACCTTGATATGCTGCCTGCTGACGCTCTTGACGA TTTTGACCTTGACATGCTCCCCGGGTAA

207 Anhang

9.4 Klonierungspläne

9.4.1 pPpolhegfp

Abbildung 9.14: Klonierungsplan zur Erstellung des Transfervektors pPpolhegfp

208 9.4 Klonierungspläne

9.4.2 pPmtnegfp

Abbildung 9.15: Klonierungsplan zur Erstellung des Transfervektors pPmtnegfp

209 Anhang

9.5 Kalibrierfunktionen zur Viruspartikelbestimmung mittels real-time PCR

Die Erstellung der Kalibrierfunktionen für die verschiedenen Viren erfolgte in jeweils sechs Schritten:

1) Bestimmung des infektiösen Virustiters des P2-Virusstocks 2) Bestimmung der Cq-Werte der Gene ie-1 und egfp des P2-Virusstocks 3) Berechnung der relativen Häufigkeit von egfp zu ie-1 (Formel 4.7) 4) Berechnung des Viruspartikeltiters aus den Ergebnissen der Punkte 1) und 3) 5) Erstellung einer theoretischen Verdünnungsreihe 6) Auftragung der Daten und Anpassung der Kalibrierfunktion

Beispiel AcMNPV-Pe:

7 -1 1) Infektiöser Virustiter des P2-Virusstocks: 6,31∙10 TCID50∙mL

2) Cq-Wert ie-1: 14,15 und Cq-Wert egfp: 14,32

(1+퐸 )퐶푞푖푒−1 (1+0,986)14,15 3) 푅 = 푖푒−1 ∙ 100 = ∙ 100 = 98,89 % 퐶푞푒푔푓푝 14,32 (1+퐸푒푔푓푝) (1+0,971)

4) 푖푛푓푒푘푡푖ö푠푒푟 푇푖푡푒푟 6,31 ∙ 107 푉푖푟푢푠푝푎푟푡푖푘푒푙푡푖푡푒푟 = ∙ 100 = ∙ 100 푅 98,89

푉푖푟푢푠푝푎푟푡푖푘푒푙푡푖푡푒푟 = 6,38 ∙ 107 푉푃 ∙ 푚퐿−1 5) Theoretische Verdünnungsreihe: Verdünnung Cq-Wert* Infektöser Virustiter 1:1 14,15 6.38E+07 1:10 17,51 6.38E+06 1:100 20,86 6.38E+05 1:1.000 24,22 6.38E+04 *∆Cq bei jeder 1:10 Verdünnung entspricht der während der Primervalidierung ermittelten Steigung und kann aus der Primer-Effizienz berechnet werden: 푙푛10 푆푡푒푖푔푢푛푔 = = 3,357 ln (1 + 퐸푖푒−1)

210 9.6 Chemikalien und Reagenzien

6)

9.6 Chemikalien und Reagenzien

Tabelle 9.1: Übersicht über verwendete Chemikalien und Reagenzien

Produkt Hersteller 2-Mercaptoethanol 99 % Carl-Roth 2-Propanol ≥ 99,95 % Carl-Roth Ammoniumperoxodisulfat (APS) Merck Millipore Ammoniumsulfat Sigma-Aldrich Ampicillin Sigma-Aldrich Bluo-Gal Life Technologies Bromphenolblau Natriumsalz Carl-Roth Cellfectin II Invitrogen Clarity™ Western ECL Substrat Bio-Rad Coomassie Brilliant Blau G-250 Carl-Roth Diethylpyrocarbonat (DEPC) ≥ 97 % Carl-Roth Dimethylsulfoxid (DMSO) zur Synthese ≥ 99,8 %, Carl-Roth Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat ≥ 99,5 % Carl-Roth Doxycyclin-Hydrochlorid Sigma-Aldrich Essigsäure (Eisessig) 100 % Merck Millipore Ethanol ≥ 99,9 % Carl-Roth Ethidiumbromid Merck Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Carl-Roth

211 Anhang

Produkt Hersteller Ex-Cell® 420 (Pulver) Sigma-Aldrich Fötales Kälberserum (FKS), hitzeinaktiviert PAA Gentamicin Sigma-Aldrich Glycerin ≥ 99,5 % Carl-Roth Glycin ≥ 99 % Carl-Roth Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Life Technologies Kaliumchlorid ≥ 99,5 % Carl-Roth Kaliumdihydrogenphosphat ≥ 99 % Carl-Roth Kanamycin Sigma-Aldrich Kupfer(II)-sulfat Pentahydrat ≥ 98 % Sigma-Aldrich Kupferchlorid ≥ 98 % Carl-Roth Magnesiumchlorid ≥ 99 % Merck Magnesiumsulfat ≥ 99 % Merck Methanol ≥ 99,98 % Carl-Roth Milchpulver Fluka MTT Carl-Roth Natriumchlorid ≥ 99,8 % Carl-Roth Natriumdihydrogenphosphat Dihydrat ≥ 99 % Carl-Roth Natriumdodecylsulfat (SDS) ≥ 99,5 % Sigma-Aldrich Natriumhydrogencarbonat ≥ 99,5 % Carl-Roth Phosphorsäure ≥ 85 % Carl-Roth RNase AWAY® Carl-Roth Rotiphorese® Gel 30, wässrige 30 % Acrylamid-, Carl-Roth Bisacrylamid-Stammlösung im Verhältnis 37,5:1 Salzsäure, rauchend 37 % Carl-Roth Silikon-Lösung Serva Electrophoresis Sterillium Bode Chemie GmbH SYBR® Green (10.000x) Sigma-Aldrich TEMED 99 % Carl-Roth Tetracyclin Sigma-Aldrich TRIS ≥ 99,9 % Sigma-Aldrich Trypanblau Sigma-Aldrich Tween 20 Sigma-Aldrich

212 9.7 Verbrauchsmaterialien

9.7 Verbrauchsmaterialien

Tabelle 9.2: Übersicht über verwendete Verbrauchsmaterialien

Produkt Hersteller 1 kb DNA-Größenstandard Peqlab 100 bp DNA-Größenstandard Plus Peqlab 6-well Mikrotiterplatte Sarstedt 96-well Hard Shell PCR Platten, weiß Bio-Rad 96-well Mikrotiterplatte Sarstedt 96-well Mikrotiterplatte ELISA NUNC 96-well Mikrotiterplatte, schwarz Greiner calibration beads: Fluorospheres Daily QC CytpFlex Cellulose Acetate Filtermembran (0,2 μm) Stedim biotech Gelfärbeschalen Mini Carl-Roth Green Fluorescent Protein Antikoerper-online Hefeextrakt Carl-Roth Küvetten Sarstedt Mikroreaktionsgefäße 1,5 mL, 2 mL Sarstedt Mikroreaktionsgefäße 5 mL Eppendorf Nitrocellulose Membran Whatman, 3 mm Carl-Roth Parafilm "M" Pechiney Plastic Packaging, inc. PCR Tubes 0,2 mL (Flat Cap) Peqlab Petrischalen mit Nocken Sarstedt Pipettenspitzen 0,5 - 20 μL Brand, Sarstedt Pipettenspitzen 2 - 200 μL Brand, Sarstedt Pipettenspitzen 50 – 1.000 μL Brand, Sarstedt Pipettenspitzen 500 – 5.000 μL Brand, Sarstedt Plastibrand PD-Tips 2,5 mL Brand Polypropylen-Falcon 15 mL Sarstedt, Greiner Polypropylen-Falcon 50 mL Sarstedt, Greiner Prestained protein ladder I Thermo Scientific Rotilabo-Einmal-Wägeschalen Carl-Roth SafeSeal Folie Bio-Rad Semperguard Einmalhandschuhe comfort Semperit Technische Produkte GmbH Snap Caps 13 mL Sarstedt SOC Medium Life Technologies Sterilfilter Midistart 2000 (0,2 μm) Sartorius Trypton BD Biosciences

213 Anhang

9.8 Laborequipment

Tabelle 9.3: Übersicht über verwendetes Laborequipment

Produkt Hersteller Abzug Köttermann Labortechnik Accu-Jet Brand Autoklav, VX-95 Systec GmbH Bechergläser Schott, Simax Casting Chamber PerfectBlue Gel System Mini L Peqlab CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System Bio-Rad Eismaschine AF 80 Scotsman EnSpire 2300 Multilabel Reader Perkin Elmer EPS 601 Power Supply GE Healthcare Erlenmeyerkolben 100, 300, 500 ml Th. Geyer Feinwaage ABS 220-4 Kern Gefrierschrank, -80 °C New Brunswick Scientific Gel-Dokumentationssystem Peqlab Gel-Dokumentationssystem ChemieDocTM Bio-Rad Gelelektrophorese-Laufkammer Mini Bio-Rad Glaspipetten Precicolor HBG Germany Glasplatten für Gelelektrophorese Bio-Rad Gradient Thermo Cycler, Primus 96 advanced® Peqlab Heißluftsterilisator Heraeus Hera Safe Werkbank Kl. 2 Heraeus Instruments Inkubator INFORS HT Infors AG Inkubator Innova 44 New Brunswick Scientific Inkubator Minitron Infors AG Laborglasflaschen 0,5 - 5 L Duran, Schott, Simax Magnetrührer KMO 2B IKA-Werke Mikroskop Eclipse TE2000-U Nikon Mikroskop Eclipse TS 100 Nikon Mikrozentrifuge 5417R Eppendorf Nanodrop ND-1000 (Spektrophotometer) Nanodrop Nanophotometer (Spektrophotometer) Implen Neubauerzählkammer OptikLabor pH-Meter 766 Calimatic MP220 Mettler Toledo Pierce Semi-Dry Blotter Thermo Scientific

214 9.9 Software

Produkt Hersteller Pipette 0,5 - 10 μL Brand, Eppendorf Pipette 10 - 100 μL Brand, Eppendorf Pipette 100 – 1.000 μL Brand, Eppendorf Pipette 2 - 20 μL Brand, Eppendorf Pipette 20 - 200 μL Brand, Eppendorf Pipette 500 – 5.000 μL Brand Pipette HandyStep Brand PowerPac Basic Bio-Rad Reinstwasseranlage (bidestilliertes Wasser) Millipore Schüttler, Titramax 100 Heidolph Spacer Plates Bio-Rad Spülmaschine Professional G7883 Miele Standzylinder 50, 100, 500, 1.000 mL Th. Geyer Sterilstopfen aus Zellstoff Th. Geyer Thermoschüttler Thermomixer comfort Eppendorf Tischkühlzentrifuge 1-14K Sigma Laborzentrifugen GmbH Trockenschrank Heraeus Ultraschallbad, Sonorex super RK 106 Bandelin UV-Lampe; Intensilight C-HGFI Nikon Vakuumkonzentrator Concentrator 5301 Eppendorf Vortexer, Wisemix VM-10 Wisd laboratory instruments Waage Extend Sartorius Zentrifuge 5810 R Eppendorf Zentrifuge Biofuge pico Heraeus Instruments Zentrifuge Combi-Spin FVL-2400 N Peqlab

9.9 Software

Tabelle 9.4: Übersicht über verwendete Software

Software Hersteller CFX-Manager Bio-Rad FlowJo V10 FlowJo LLC Image Lab Bio-Rad SigmaPlot Systat Software GmbH SnapGene GSL Biotech LLC VisionCapt Analis

215 Anhang

9.10 Kitsysteme

Tabelle 9.5: Übersicht über die verwendeten Kits

Bezeichnung Hersteller Gel Extraction Kit Geneaid GFP ELISA Kit Cell Biolabs Inc. High Pure Viral Nucleic Acid Kit Roche Diagnostics Deutschland GmbH iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad PCR CleanUp Kit AveGene peqGOLD Total RNA Kit Peqlab Plasmid Mini Kits AveGene PureLink HiPure™ Plasmid DNA MiniPrep Kit Invitrogen RapidOut DNA Removal Kit Thermo Scientific

9.11 Enzyme

Tabelle 9.6: Übersicht über verwendete Enzyme

Bezeichnung Hersteller Antarktische Phosphatase AnP New England BioLabs GmbH (NEB) Hot Taq DNA-Polymerase Peqlab Kapa HiFi DNA-Polymerase Peqlab Restriktionsenzyme New England BioLabs GmbH (NEB) (BamHI, BglI, BstZ17I, EcoRV, PstI, XbaI) RNase A Peqlab T4 DNA-Ligase Roche Diagnostics Deutschland GmbH Taq Polymerase Peqlab

9.12 Antikörper

Tabelle 9.7: Antikörper für Western Blot

Bezeichnung Antigen Konjugat Hersteller Anti-eGFP-HRP eGFP Meerrettichperoxidase (HRP, Miltenyi Biotec GmbH engl. horseradish peroxidase)

216 9.14 Puffer und Lösungen

9.13 Medien

Tabelle 9.8: Übersicht über verwendete Nährmedien und deren Zusammensetzung

Bezeichnung Zusammensetzung LB-Medium 10 g∙L-1 Trypton, 5 g∙L-1 Hefeextrakt, 10 g∙L-1 NaCl, pH 7,0

LB-Medium mit Agar LB-Medium, 1,2 % (w/v) Agar SOC Medium 5 g∙L-1 Hefeextrakt, 20 g∙L-1 Trypton, 10 mM NaCl,

2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM Glucose -1 Ex-Cell® 420 30,78 g∙L Ex-Cell® 420 Pulver, 4,2 mM NaHCO3, 32,5 mM NaCl, pH 6,3 (HCl)

9.14 Puffer und Lösungen

Tabelle 9.9: Zusammensetzung der verwendeten Puffer und Lösungen

Bezeichnung Zusammensetzung Alk. Lyse f. Bac. Lsg. I 15 mM Tris-Cl (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH 8,0) Alk. Lyse f. Bac. Lsg. III 3 M Kaliumacetat, pH 5,5 (Essigsäure) Alk. Lyse f. Pl. Lsg. I 50 mM Glucose, 25 mM Tris-Cl (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH 8,0) Alk. Lyse f. Pl. Lsg. III 5 M Kaliumacetat; 2 M Essigsäure Alk. Lyse Lsg. II (Pl.+Bac.) 0,2 N NaOH, 1 % SDS -1 Ampicillin-Stocklsg. 100 mg∙mL in H2Obidest Blocking-Puffer 5 % Milchpulver in TBS-T Bluo-Gal-Stocklsg. 20 mg∙mL-1 in Dimethylformamid

CaCl2-Lösung 60 mM CaCl2, 15 %(v/v) Glycerin, 10 mM PIPES, pH 7,0

Fixierlösung (PA-Gele) 50 %(v/v) Ethanol (100 %), 0,03 %(v/v) Phosphorsäure (85 %) -1 Gentamicin-Stocklsg. 5 mg∙mL in H2Obidest -1 IPTG-Stocklsg. 40 mg∙mL in H2Obidest -1 Kanamycin-Stocklsg. 30 mg∙mL in H2Obidest -1 Kolloidale Coomassie 1,2 g∙L Coomassie Brilliant Blue G-250, 0,76 M (NH4)2SO4, Färbelösung 10 %(v/v) Phosphorsäure (85 %), 20 %(v/v) Ethanol (100 %)

Ladepuffer (6x) 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 0,03 %(v/v) Bromphenolblau, 0,03 %(v/v) Xylencyanol, 60 %(v/v) Glycerin, 60 mM EDTA Laufpuffer SDS-PAGE (5x) 17,3 mM SDS, 1,25 M Glycin, 125 mM TRIS

Lysepuffer, nativ 18,5 mM NaH2PO4 ∙ 2 H2O, 0,5 M NaCl, 3 mM KH2PO4, pH 7,4 (NaOH), 2 %(v/v) Igepal

MTT-Lösepuffer 2,7 mM KCl, 3,2 mM Na2HPO4

MTT-Lysepuffer 810 mL Isopropanol, 20 mL HCl (2 M), 150 mL SDS (20 %(w/w)), 20 mL H20bidest

217 Anhang

Bezeichnung Zusammensetzung

PBS 136,9 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 3,2 mM Na2HPO4, pH 6,3 Probenauftragspuffer (5x) 5 mL Glycerin, 2,5 mL Tris-HCl (1 M, pH 6,8), 0,4 g SDS, 2,5 mL 2-Mercaptoethanol, 0,025 g Bromphenolblau rt-PCR Supermix (2x) 50 U∙mL-1 Hot Taq DNA-Polymerase, 0,4 mM dNTPs, 20 %(v/v) Puffer Y, 4 mM MgCl2, 2 %(v/v) SYBR Green-Lsg. (10x)

Sammelgel, 5 % 1,4 mL H2Obidest, 0,33 mL Rotiphorese® Gel 30, 0,25 mL Tris-HCl (1 M, pH 6,8), 0,02 mL SDS-Lösung (10 %), 0,02 mL APS-Lösung (10%), 0,002 mL TEMED

SDS-Lösung 20 %(w/v) in H2Obidest TBS (10x) 0,5 M TRIS, 1,5 M NaCl, pH 7,6 (HCl)

TBS-T 0,1 %(v/v) Tween 20 in TBS -1 Tetracyclin-Stocklsg. 10 mg∙mL in H2Obidest

Transferpuffer 0,2 M Glycin, 25 mM TRIS, 1 mM EDTA, 20 %(v/v) Methanol

Trenngel, 12 % 1,6 mL H2Obidest, 2 mL Rotiphorese® Gel 30, 1,3 mL Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8), 0,05 mL SDS-Lösung (10 %), 0,05 mL APS-Lösung (10%), 0,002 mL TEMED

Trypanblau-Lsg. 0,2 %(w/v) in 0,9 % NaCl-Lsg

9.15 Organismen

Tabelle 9.10: Verwendete Escherichia coli Stämme

Bezeichnung Genotyp DH5α F-, endA1, hsdR17 (rk-,mk-), supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA1,Φ80d, lacZ[_]M15 MAX Efficiency™ DH10Bac™ F-mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 Δ lac X74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ - rps L nupG / pMON14272 / pMON7124 SURE e14-(McrA-) Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1 gyrA96 thi-1 (Stop Unwanted supE44 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5(Kanr) uvrC Rearrangement Events) [F ́ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)]

Tabelle 9.11: Verwendete Insektenzelllinie

Bezeichnung Ursprungsorganismus IPLB-Sf21AE Spodoptera frugiperda (Sf)

218 9.17 DNA-Fragmente (PCR)

9.16 DNA-Fragmente (Restriktionen)

Tabelle 9.12: Übersicht über verwendete Restriktionsenzyme sowie die Größe der für das jeweilige Plasmid erwarteten DNA-Fragmente Unterstrichene DNA-Fragmente enthalten das eGFP-Gen.

Plasmid Restriktionsenzyme Größe der erwarteten DNA-Fragmente (bp) pFastBac1 BamHI 4.775 BstZ17I + XbaI 4.555, 220 pMA-T-egfp BamHI + XbaI 2.380, 726 pPpolhegfp BamHI + XbaI 4.710, 726 pGEM-Pmtnegfp EcoRV + PstI 4.726, 1.610 p1∆PpolhPmtnegfp XbaI 5.779 BglI 2.508, 1.268, 2.003 pDPTightegfp BglI 3.858, 2.508, 1.268 pDPTightegfp-Ppolhtta BglI 4.623, 2.508, 1.268

9.17 DNA-Fragmente (PCR)

Tabelle 9.13: Übersicht über verwendete Primer sowie die Größe der für das jeweilige template erwarteten DNA-Fragmente

Template Primerpaar Größe der erwarteten DNA-Fragmente Effizienz (bp) (%) pGEM-Pmtnegfp 38-F + 47-R 1.259 - bPpolhegfp pUC/M13 3.020 - b∆PpolhPmtnegfp pUC/M13 3.364, 1.831 - bDPTightegfp pUC/M13 4.965 - bDPTightegfp-Ppolhtta pUC/M13 5.330 - egfp 48-F + 48-R 118 97,1 ie-1 49-F + 49-R 127 98,6 28S rRNA 50-F + 50-R 157 94,5

Pmtn 69-F + 69-R 152 98,5

219 Anhang

9.18 Primerspezifikationen

Tabelle 9.14: Liste der verwendeten Primer F: forward; R: reverse; Tm: Schmelztemperatur (unter Berücksichtigung der Salzkonzentration); 1) Quelle: Xue et al., 2010.

Name Sequenz Tm Schnitt- Zweck (5‘ → 3‘) (°C) stelle 38-F TTAAGCGTATACTATCATGTCTGGGGTAACGC 57 BstZ17I Klonierung 47-R TTAGGCACCCCAGGCTCT 60 - Klonierung pUC/M13-F CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG 65 - Kontroll-PCR pUC/M13-R AGCGGATAACAATTTCACACAGG 61 - Kontroll-PCR 48-F TGAAGTGAAGTTCGAAGGCG 58 - real-time PCR 48-R GTTGTGGGAGTTGTAGTTGT 56 - real-time PCR 49-F ACCTCCTCCTCCTCCTTTCA 60 - real-time PCR 49-R CGTCCAACGTTAGTGACAGC 60 - real-time PCR 50-F1) CGACGTTGCTTTTTGATCCT 56 - real-time PCR 50-R1) GCAACGACAAGCCATCAGTA 58 - real-time PCR 69-F TTGCAGGACAGGATGTGGTG 60 - real-time PCR 69-R ATGCGCAGGCACTCTTACTT 58 - real-time PCR

220