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Entwicklung eines neuartigen, induzierbaren Baculovirus-Insektenzell- Expressionssytems Der Technischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Zur Erlangung des Doktorgrades Dr.-Ing. vorgelegt von Ricarda Friebe aus Dachau Als Dissertation genehmigt von der Technischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 05.10.2018 Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Reinhard Lerch 1. Gutachter: Prof. Dr. Rainer Buchholz 2. Gutachter: Prof. Dr. Barbara Kappes Meiner Familie „Nur wenige wissen, wie viel man wissen muss, um zu wissen, wie wenig man weiß.“ Werner Heisenberg Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Mein besonderer Dank gilt hierbei Herrn Prof. Rainer Buchholz für die Möglichkeit, meine Promotion am Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik durchführen zu können, sowie für seine Unterstützung in jeglicher Hinsicht. Frau Prof. Barbara Kappes möchte ich ganz besonders für die Begutachtung meiner Arbeit bedanken. Ein großes Dankeschön geht auch an Frau Prof. Kathrin Castiglione und Herrn Prof. Wolfgang Kreis für die Übernahme des Prüfungsvorsitzes bzw. der mündlichen Prüfung. Die Promotion am BVT war eine ganz besondere Zeit für mich, geprägt von sehr vielen schönen Momenten, aber auch einigen herben Rückschlägen. Bei allen Mitarbeitern des BVT, vor allem auch bei den mittlerweile Ehemaligen, möchte ich mich für diese schönen Momente bedanken, die wir gemeinsam erlebt haben. Besonderer Dank gilt meinen Mit-DoktorandInnen für die zahlreichen Gelegenheiten, die Herausforderungen des Projektes einmal vergessen zu können und für die vielen „social events“ auch außerhalb des Lehrstuhls. Von ganzem Herzen danke ich Juliane Richter für die unglaublich tolle Atmosphäre im Büro und im Labor, die vielen fachlichen (und vor allem nicht so fachlichen) Gespräche sowie für die Unterstützung in allen Lebenslagen. Herrn Ludwig Körber gilt mein herzlicher Dank für die vielen Anregungen und seine Geduld, sich in ein ihm komplett unbekanntes Thema hineinzudenken. Herrn Andreas Perlick möchte ich für sein jederzeit offenes Ohr und seine stets diplomatische Ehrlichkeit danken, die uns allen das ein oder andere Schmunzeln ins Gesicht gezaubert hat. Frau Christine Schülein möchte ich recht herzlich für Ihre positive Art und die aufmunternden Worte danken, aufgrund derer ich zum Schreiben immer gerne ins Büro gekommen bin. Mein Dank gilt weiterhin Frau Christine Friedl und Frau Elke Heidenreich für die tolle Zusammenarbeit im Labor und die allzeit freund(schaft)liche Atmosphäre. Allen meinen Studenten, HiWis und WiHis danke ich ebenfalls für die tolle Zusammenarbeit und das mir entgegengebrachte Vertrauen. Zu guter Letzt möchte ich mich von ganzem Herzen bei meiner Familie, meinem Freund und meinen engsten Freunden bedanken. Ihr habt mir stets das Selbstvertrauen, den Rückhalt, die Liebe und die nötige Kraft gegeben, ohne die ich diese Arbeit nicht hätte vollenden können. Danke, dass Ihr an mich glaubt und immer für mich da seid! DANKE! Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Stand des Wissens 2 2.1 Das Baculovirus 2 2.1.1 Klassifizierung 2 2.1.2 Aufbau 4 2.1.3 Replikationszyklus in vivo am Beispiel des AcMNPV 6 2.2 Einsatz von Baculoviren als Biopestizid 9 2.2.1 Baculovirus-Präparate 9 2.2.2 Entwicklungsmöglichkeiten Baculovirus-basierter Biopestizide 12 2.2.3 Rekombinante Baculoviren zum Pflanzenschutz 14 2.2.4 Produktion von Baculoviren 17 2.3 Einsatz von Baculoviren zur Proteinproduktion 20 2.3.1 Herstellung gentechnisch veränderter Baculoviren 21 2.3.2 Insektenzelllinien 22 2.3.3 Proteinproduktion 23 2.3.4 Deletionsmutanten 25 2.3.5 Vergleich mit anderen Expressionssystemen 26 2.4 Promotoren 27 2.4.1 Metallothionein-Promotor 28 2.4.2 Tetracyclin-reguliertes System 29 2.5 Markerprotein enhanced green fluorescent proteine 30 3 Zielsetzung 33 4 Methoden 34 4.1 Ablauf der Herstellung rekombinanter Baculoviren 34 4.2 Molekularbiologische Methoden 35 4.2.1 Herstellung chemisch kompetenter Zellen 35 4.2.2 Transformation chemisch kompetenter E. coli Zellen 35 4.2.3 Isolation und Aufreinigung von DNA 37 4.2.4 Bestimmung der DNA-Konzentration 39 4.2.5 DNA-Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion 39 4.2.6 Enzymatische DNA-Restriktion 41 4.2.7 Agarose-Gelelektrophorese 42 4.2.8 Dephosphorylierung 43 4.2.9 Ligation mit T4 DNA-Ligase 43 4.2.10 Sequenzierung von Plasmiden 44 4.3 Allgemeine Zellkultur 44 I Inhaltsverzeichnis 4.3.1 Silikonisieren von Erlenmeyerkolben 44 4.3.2 Bestimmung der Lebendzelldichte und Vitalität einer Insektenzellkultur 44 4.3.3 Kultivierung von Insektenzellen in Suspensionskultur 45 4.3.4 Kryokonservierung von Insektenzellen 45 4.3.5 Toxizitätstests 46 4.4 Arbeiten mit Baculoviren 47 4.4.1 Transfektion von Insektenzellen 47 4.4.2 Herstellung eines Virusstocks 47 4.4.3 Bestimmung des infektiösen Virustiters 47 4.4.4 Bestimmung des Viruspartikeltiters 48 4.4.5 Promotorstudien 50 4.4.6 Interferenz-Test 51 4.5 Expressions-Analytik 52 4.5.1 Reverse Transkription Polymerasekettenreaktion 52 4.5.2 Zelllyse 54 4.5.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 54 4.5.4 Western Blot 55 4.5.5 Fluoreszenzmessung am PlateReader 55 4.5.6 Durchflusszytometrie 57 4.5.7 Enzyme-linked immunosorbent Assay 59 4.6 Kupfer-Analytik 59 5 Ergebnisse 61 5.1 Molekularbiologische Arbeiten 61 5.1.1 Herstellung des Kontroll-Standard Bacmids bPpolhegfp 61 5.1.2 Herstellung des Metallothionein-Promotor Bacmids bPmtnegfp 63 5.1.3 Herstellung der Bacmide bDHPTightegfp und bDHPTightegfp-Ppolhtta mit dem Tet-Off System (PTight) 67 5.2 Zellkultur 70 5.2.1 Adaption der Zellen an Kupfersulfat 70 5.2.2 Kupfer-Toxizitätstest 71 5.2.3 Doxycyclin-Toxizitätstest 73 5.3 Metallothionein-Promotor 74 5.3.1 Herstellung der Virusstocks AcMNPV-Me 74 5.3.2 Regulation des Metallothionein-Promotors durch Kupferionen - I 75 5.3.3 Regulation des Metallothionein-Promotors durch Kupferionen - II 82 5.3.4 Aktivierungskinetik des Metallothionein-Promotors 89 5.4 PTight-Promotor des Tet-Off Systems 94 5.4.1 Herstellung der Virusstocks AcMNPV- DHTe und -DHTePt 94 5.4.2 Regulation des PTight durch Doxycyclin 96 5.4.3 Aktivierungskinetik des PTight 107 II Inhaltsverzeichnis 5.5 Der Standardpromotor Polyhedrin-Promotor 110 5.5.1 Herstellung der Virusstocks AcMNPV-Pe 110 5.5.2 Regulation der Genexpression durch den Polyhedrin-Promotor 110 5.6 Viruscharakterisierung 112 5.6.1 Akkumulation von Deletionsmutanten durch serielle Passage 113 5.6.2 Interferenz-Test 114 6 Fehlerbetrachtung 118 6.1 Toxizitätstest 118 6.2 Virustiterbestimmung 118 6.2.1 Endpunkttitration 119 6.2.2 Real-time Polymerasekettenreaktion 120 6.3 Interferenz-Test 121 6.4 Real-time Reverse Transkription Polymerasekettenreaktion 122 6.5 Fluoreszenzmessung intakter Zellen am PlateReader 123 7 Diskussion 125 7.1 Herstellung der Viren 126 7.1.1 Herstellung der Bacmide 126 7.1.2 Herstellung der Virusstocks 128 7.2 Virustiterbestimmung 129 7.3 Interferenz und Passageneffekt 132 7.3.1 Auswirkungen der Interferenz bei serieller Passage 132 7.3.2 Inhibierung der Proteinproduktion durch Interferenz 134 7.4 Metallothionein-Promotor 138 7.4.1 Unterschiedliches Verhalten der Klone 2 und 4des AcMNPV-Me 138 7.4.2 Regulation des Metallothionein-Promotors durch Kupferionen 140 7.4.3 Kinetik des Metallothionein-Promotors 145 7.5 PTight-Promotor des Tet-Off Systems 148 7.5.1 Regulation des PTight durch Doxycyclin 148 7.5.2 Kinetik des PTight 150 7.6 Vergleich der induzierbaren Promotoren mit dem Polyhedrin-Promotor 153 7.7 Fazit 157 8 Ausblick 159 9 Anhang 199 9.1 Weitere erhobene Daten 199 9.1.1 Induktionskinetik Pmtn 199 9.1.2 Maximalexpression 201 9.1.3 Hemmung der zelleigenen Genexpression 201 9.2 Plasmidkarten 202 9.2.1 pFastBac1 202 III Inhaltsverzeichnis 9.2.2 pMA-T-egfp 202 9.2.3 pPpolhegfp 203 9.2.4 pGEM-Pmtn 203 9.2.5 pGEM-Pmtnegfp 204 9.2.6 pPmtnegfp 204 9.2.7 pDHPTightegfp 205 9.2.8 pDHPTightegfp-Ppolhtta 205 9.3 Gensequenzen 206 9.3.1 Codon-optimierte egfp DNA-Sequenz 206 9.3.2 Drosophila Metallothionein-Promotor DNA-Sequenz 206 9.3.3 PTight-Promotor DNA-Sequenz 206 9.3.4 tta DNA-Sequenz 207 9.4 Klonierungspläne 208 9.4.1 pPpolhegfp 208 9.4.2 pPmtnegfp 209 9.5 Kalibrierfunktionen zur Viruspartikelbestimmung mittels real-time PCR 210 9.6 Chemikalien und Reagenzien 211 9.7 Verbrauchsmaterialien 213 9.8 Laborequipment 214 9.9 Software 215 9.10 Kitsysteme 216 9.11 Enzyme 216 9.12 Antikörper 216 9.13 Medien 217 9.14 Puffer und Lösungen 217 9.15 Organismen 218 9.16 DNA-Fragmente (Restriktionen) 219 9.17 DNA-Fragmente (PCR) 219 9.18 Primerspezifikationen 220 IV Zusammenfassung Baculoviren sind hochgradig wirtsspezifische Viren, die zum einen im Rahmen des Baculovirus-Insektenzell-Expressionssystems zur Expression rekombinanter Proteine und zum anderen als Biopestizid bei der Bekämpfung von Fraß-Schädlingen bei einer Vielzahl von Nutzpflanzen eingesetzt werden können. Bisher ist die Anwendung als Expressionssystem auf nicht-toxische Proteine beschränkt, da die Toxizität der Proteine sich negativ auf die Vitalität der Insektenzellen auswirkt, wodurch die Ausbeute an rekombinantem Protein drastisch sinkt. Dies gilt auch für die Vermehrung rekombinanter Baculoviren, die zum Einsatz im Pflanzenschutz ein rekombinantes Protein exprimieren, welches die insektizide Wirkung der Viren verstärken soll, da hier ebenfalls verminderte Virusausbeuten aufgrund der reduzierten Vitalität der Insektenzellen beschrieben wurden. Diese Problematik könnte durch den Einsatz induzierbarer Promotoren zur Steuerung der