UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE CIÊNCIAS Characterization of mRNA Dysfunctional Mechanisms Associated with the Genetic Disease Cystic Fibrosis Doutoramento em Bioquímica Especialidade de Genética Molecular Verónica Manuela Rôxo Felício Tese orientada por: Professora Doutora Margarida Amaral Documento especialmente elaborado para a obtenção do grau de doutor 2018 UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE CIÊNCIAS Characterization of mRNA Dysfunctional Mechanisms Associated with the Genetic Disease Cystic Fibrosis Doutoramento em Bioquímica Especialidade de Genética Molecular Verónica Manuela Rôxo Felício Tese orientada por: Professora Doutora Margarida Amaral Júri: Presidente: ● Doutora Amélia Pilar Grases dos Santos Silva Rauter, Professora Catedrática e Presidente do Departamento de Química e Bioquímica da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa (FCUL) Vogais: ● Doutora Luísa Maria Ferreira Romão Loison, Investigadora Principal do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge; ● Doutora Luísa Maria Quental Mota Vieira, Investigadora Principal da Unidade de Genética e Patologia Molecular do Hospital do Divino Espírito Santo de Ponta Delgada ● Doutra Margarida Sofia Pereira Duarte Amaral, Professora Catedrática da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa; ● Doutora Rita Maria Pulido Garcia Zilhão Aranha Moreira, Professora Auxiliar da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa; ● Doutora Margarida Henriques da Gama Carvalho, Professora Auxiliar da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa; Documento especialmente elaborado para a obtenção do grau de doutor Fundação para a Ciência e Tecnologia do Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior, SFRH/BD/87478/2012 2018 Aos meus filhos Francisco e Xavier E ao meu marido Gonçalo OS três pilares da minha vida I II Acknowledgments/Agradecimentos Agradeço a todos os que contribuíram, de forma direta ou indireta, para a realização deste trabalho. Salientando o meu agradecimento: Em especial à minha orientadora Professora Doutora Margarida Amaral, por todo o apoio e suporte, pela transmissão de conhecimentos, por me ter proporcionado a excelente oportunidade de trabalhar no seu laboratório e por toda a confiança em mim depositada ao longo destes anos. Agradeço toda a paciência, motivação, desafios propostos e a oportunidade de trabalhar com alguém com tanta dedicação, entusiasmo, determinação e rigor. À Doutora Anabela Ramalho, uma grande impulsionadora do meu doutoramento e que me deu todas as bases para o mesmo. Os seus ensinamentos de trabalho de bancada foram uma mais valia na realização do trabalho laboratorial, tudo o que aprendi sobre genotipagem, PCR, mini-genes, mutações é a si que devo. Obrigada pela sua disponibilidade para as minhas dúvidas e pela sua ajuda na resolução de problemas. Ao ministério da Ciência e Ensino Superior e à Fundação para a Ciência e a Tecnologia, por terem possibilitado a realização deste trabalho, através da concessão da bolsa de doutoramento de que fui recipiente. Ao Departamento de Química e Bioquímica da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa e ao BioISI - Biosystems & Integrative Sciences Institute por me acolherem durante o meu trabalho de doutoramento. Quero agradecer à Dra. Celeste Barreto, à Dra. Luísa Pereira, ao Dr. Carlos Lopes, e ao Dr. José Cavaco pela colaboração preciosa com pacientes de FQ. Comecei este doutoramento rodeada de pessoas maravilhosas que foram seguindo as suas vidas ao longo do tempo, mas a quem devo muito. Marta Palma, Marisa Sousa, Inna Uliyakina e Simão Luz não estiveram presentes fisicamente até ao fim, mas mesmo longe ajudaram. Muito obrigada pelo constante apoio, amizade e disponibilidade para ajudar em qualquer questão. Os vossos conselhos e sugestões foram absolutamente fulcrais para a minha evolução enquanto pessoa e cientista. Quero agradecer todos os meus colegas de laboratório: À Susana Igreja pela ajuda e apoio nas experiências, projetos, relatórios e na minha tese de doutoramento; ao Hugo Botelho muito obrigada por todos os ensinamentos de microscopia, análise de resultados, pelas folhas de excel super cromas para os ensaios de efluxo e pela maravilhosa capacidade que tens para tornares tudo mais fácil de perceber. Mas principalmente, muito obrigada pelas pausas, III pelos momentos de desanuviar a cabeça e organizar ideias; ao Luka Clarke pela ajuda, partilha de conhecimentos e companhia no trabalho com pacientes. ao Professor Carlos Farinha pelos ensinamentos; ao Luís Marques pela paciência no microscópio e pelas pausas para café; à Sofia Correia, à Madalena, à Margarida, à Sofia Ramalho, à Iris Silva, à Ines Pankonien, ao Luís Sousa obrigada pelas conversas de laboratório que ajudaram na resolução de alguns problemas e também proporcionaram um ambiente divertido. Em último, mas muito importante, pessoas que considero mais que colegas de laboratório, pessoas que considero amigas. Sara Canato, obrigada por tudo, obrigada pelo apoio, pela ajuda, pela cumplicidade, foste mais que uma colega de trabalho. Nikhil Awatade, thank you for the teachings, for the opportunity to work closer to the patients, for the conversations, for the long hours of work always with good disposition. Remain the memories of days and nights making lungs, that October will never be forgotten. João Santos, Joana Lérias, Arsénia Massinga, Iris Silva e José Múrias vocês foram suportes importantes no laboratório, proporcionaram momentos maravilhosos no trabalho, mas principalmente estiveram presentes na minha vida. Todos vocês deixaram marca em mim como cientista pelas conversas e sugestões, mas marcaram-me muito mais como pessoa, obrigada por isso. Não posso deixar de agradecer às três da vida airada, Ana Luísa e Sara Fernandes, pelas conversas, pelas fugidas ao café, pelo apoio, carinho e amizade que sempre transmitiram. Pelas loucuras e pelos momentos sérios, um muito obrigado, foram um grande pilar nesta fase da minha vida, em muitas alturas pensei que não aguentava, mas vocês mostraram que tudo se faz e que em grupo é muito mais fácil. Á minha família devo muito mais que um simples obrigado. Mãe e pai vocês sempre foram a minha inspiração, a minha força ajudaram-me a remar em direção aos meus objetivos. A vocês devo ter chegado ao fim desta etapa. Ao meu irmão agradeço as vezes que me deu na cabeça e me deu força para chegar ao fim. Às minhas avós, aos meus tios, aos meus padrinhos, aos meus priminhos e afilhada, à minha cunhada e sobrinha agradeço os momentos de distração e alegrias que me ajudaram a superar momentos mais difíceis deste doutoramento. Aos meus sogros agradeço a motivação e a insistência e ajuda para terminar esta fase da minha vida. Foram uma grande ajuda neste processo final, sem vocês não teria conseguido. Aos meus filhos, Francisco e Xavier e ao meu marido Gonçalo, os pilares da minha vida, que me fazem levantar todos os dias com um sorriso e me mostram que eu sou capaz, aos meus 3 homens a quem eu devo tudo…OBRIGADA por compreenderem as minhas ausências, a minha falta de tempo e por vezes de paciência. Gonçalo sem o teu encorajamento e compreensão, teria sido impossível para mim terminar o meu doutoramento. IV Verónica Manuela Rôxo Felício foi bolseira de doutoramento da Fundação para a Ciência e Tecnologia do Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior. SFRH/BD/87478/2012 V VI SUMMARY Cystic Fibrosis (CF) is the most common autosomal disease in Caucasians, with an estimated incidence of 1:6000 births in Portugal. The most relevant clinical aspect of its classic manifestation is chronic lung disease, which is the main cause of morbidity and mortality. Other symptoms include, pancreatic dysfunction, male infertility and high concentrations of chloride (Cl-) in sweat. However, even though the classic form of the disease is well defined, its pathophysiology is not completely understood with this pleiotropic disease having highly variable manifestations of clinical phenotypes. Novel therapies aim to correct the basic defect, specifically focusing on the rescue of Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) function in CF airways. Most of these CFTR modulator strategies target the F508del, the most common mutation. Nevertheless, widespread evidence has demonstrated that a significant number of CF- causing mutations affect splicing efficiency and the stability of mRNA molecules. Here, we propose to elucidate the regulatory mechanisms underlying these CF-associated mutations. To this end, our aims are: 1) to identify CFTR gene mutations in individuals with non-CF chronic lung diseases, namely chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma and disseminated bronchiectasis (DB); 2) to identify CFTR gene mutations in individuals with a suspicion of CF, followed by the analysis of CFTR expression in their native tissues to characterize the impact of CFTR splicing or premature termination codon (PTC) mutations in the structure and levels of mRNA; 3) to identify key factors in the nonsense/mediated decay (NMD) pathway by automated microscopy screens using a cell model expressing a novel CFTR NMD-PTC/read-through mini-gene reporter; and 4) to screen for novel compounds suppressing PTC mutations by automated microscopy screens using the previous cell-based model, as potential corrective therapies for CF. The expected results will provide knowledge on RNA-processing dysfunction and on the efficacy of novel RNA modulator compounds towards a "personalised medicine" approach. Regarding the first objective, our data show that 7 (out of 136) patients with non-CF