Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera
Magda Viviana Gamboa Abril
Zootecnista
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias Agrarias, Programa Interfacultades
Bogotá, Colombia
Año 2014
Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera
Magda Viviana Gamboa Abril
Zootecnista
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de: Magister en Ciencias
Directora: MSc., Microbióloga. Judith Figueroa Ramírez Codirectora: Ph.D., Ingeniera de alimentos. Amanda Consuelo Díaz Moreno
Línea de Investigación: Ciencia y Tecnología de Alimentos Grupo de Investigación: Ciencia y Tecnología Apícola -AYNI-
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias Agrarias, Programa Interfacultades
Bogotá, Colombia
Año 2014
Dedicatoria
En primer lugar a Dios y de manera especial a las asociaciones de apicultores ASOAPIGAR, ASOAPIBOY y ASOAPICOM; Al Grupo de Ciencia y Tecnología Apícola de la Universidad Nacional de Colombia -AYNI- y a Fermín Chamorro.
Agradecimientos
Agradezco a Dios y a mi familia por su apoyo, esfuerzo y comprensión incondicionales y por mostrarme el conocimiento y la educación como una herramienta necesaria para mi superación personal. Jorge y Carolina por su ejemplo, esfuerzo, consejos y motivación. A Mario por darme una nueva perspectiva y apoyarme en la culminación de mis metas. A la profesora Judith, por su gran apoyo, sabiduría, comprensión, amistad y seguimiento a mis metas. A la profesora Amanda Consuelo Díaz por su paciencia, sabiduría y apoyo. A mis queridos amigos y colegas del grupo de Ciencia y Tecnología Apícola – AYNI, en especial a Divian, Monse, Andres, Cesar y Carla. Al Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos -ICTA- y al Laboratorio de Microbiología de Medicina Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá por facilitar sus instalaciones y equipos para la realización de este trabajo. A los integrantes del grupo de investigación de los productos de las abejas en el Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos –ICTA-, en especial a Carlitos, Carolina, Dayan, Dany, Juana, Carlos e Ivonne. Al Laboratorio de investigaciones en abejas – LABUN, por su iniciativa e interés en éste proyecto y en especial a Fer, Diana, Paula y Angela por su compañerismo y apoyo. A las asociaciones de apicultores y sus representantes: Asociación de Apicultores de Boyacá (ASOAPIBOY), Asociación Apícola Comunera (ASOAPICOM) y Asociación de Apicultores de García Rovira (ASOAPIGAR) por su interés y colaboración para el desarrollo de éste trabajo y por las muestras suministradas para la realización del mismo. A los apicultores Oscar Miguel Joya Arenales, Ramón Gálvis Rodríguez, Josue Joya Arenales, José Tobias Villamizar Díaz, Edgar Duarte Casas, Raúl Correa, Javier Joya, Josue Olinto Joya, Julio Bolivar, Ruth Tatiana Niño, Enrique Buitrago, Heriberto Castellanos Vargas, Edgar Enrique Correa, María Antonia Joya Joya, Nelson Martín Manrique, Maria Yesica Espinel Riaño, Gilberto Palacio Lozano, Baudilio Vilahona Joya, Gregorio Parra Archilo y a todos aquellos que han unido sus esfuerzos para el crecimiento del sector con su trabajo y su apoyo a la academia y la investigación. VIII Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera
Al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, a través del apoyo al programa de Investigación: Estrategias para establecer la denominación de origen de los productos de las abejas en Colombia.
Resumen y Abstract IX
Resumen
En Colombia, la miel de mielato proviene del corredor de bosques de roble (Quercus humboldtti) localizados en la zona andina oriental donde las abejas Apis mellifera colectan el mielato, producto de la extracción de la savia por parte del insecto Stigmacoccus asper. Fueron colectadas 74 muestras de 20 municipios y se realizaron los análisis de calidad microbiológica, perfil aromático, parámetros fisicoquímicos, capacidad antibacteriana y antioxidante. El 73.5% de las muestras recolectadas fueron adecuadas al control de calidad microbiológico. Los análisis de perfil aromático junto con parámetros fisicoquímicos permitieron la identificación del 74% de las muestras como mieles de mielato. Estas mieles presentaron una conductividad eléctrica de 10.3mS/cm, 16.61.4% de contenido de humedad, pH de 4.40.4, acidez total de 36.98.0meq/kg, 0.450.3% de cenizas, 0.030.01% de sólidos insolubles, rotación específica de (-0.7)(- 10.6), glucosa más fructosa de 69.311.9% color de 88.723.9mmPfund, actividad diastasa de 25.628.1ND y 4.13.4mg/kg de hidroximetilfurfural. La capacidad antibacteriana de las mieles de mielato completas sobre siete bacterias de referencia ATCC se encontró en promedios entre 20 y 40% y sin actividad peróxido entre 40 y 80%. La actividad antioxidante por el método TEAC fue de 75.154.1 mmol de Trolox/100g de miel de mielato y el contenido de Fenoles Totales fue de 76.723.7mg/100g de miel de mielato de roble.
Palabras clave: Quercus humboldtti, análisis fisicoquímico, perfil aromático, actividad antibacteriana, actividad no peróxido, producto forestal no maderable.
X Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera
Abstract
In Colombia, honeydew honey is a beekeeping product from oak forests (Quercus humboldtti) of the eastern Andes where the bees Apis mellifera collect the honeydew; which is a result of the extraction of the sap by the insect Stigmacoccus asper. 74 samples were collected from 20 municipalities and the analysis performed on these honeys corresponded to the microbiological quality, aromatic profile, physicochemical parameters, and antibacterial and antioxidant capacity. 73.5% of the samples met the microbiological quality control. The analysis of the aromatic profile along with the physicochemical parameters allowed the identification of 74% of the samples as honeydew honeys. These honeys presented an electrical conductivity of 10.3mS/cm, 16.61.4% of moisture content, pH of 4.40.4, total acidity of 36.98.0meq/kg, 0.450.3% of ash, 0.030.01% of insoluble solids, specific rotation of (-0.7)(-10.6), 69.311.9% of glucose plus fructose, color of 88.723.9mmPfund, diastase activity of 25.64.1 and 28.13.4mg/kg and 4.13.4mg/kg of hidroximetilfurfural. The antibacterial ability tested in honeydew honeys with peroxide activity on seven ATCC reference bacteria was found in averages between 20 and 40% and in the honeys without peroxide activity, between 40 and 80%. The antioxidant activity by the TEAC method was of 75.154.1 mmol of Trolox/100g and the Total Phenols content was 76.723.7mg/100g of honeydew honey.
Keywords: Quercus humboldtti, physicochemical analysis, aromatic profile, antibacterial, activity non-peroxide, non-timber forest product. Contenido XI
Contenido
Pág.
Resumen ...... IX
Lista de figuras ...... XIII
Lista de tablas ...... XV
Introducción ...... 17
1. Indicadores fisicoquímicos y sensoriales de Mieles de Mielato; un contexto mundial para su reconocimiento en Colombia ...... 31 1.1 Resumen ...... 31 1.2 Introducción ...... 33 1.3 Mielato ...... 34 1.4 Miel de mielato en el mundo ...... 36 1.5 Designación de la miel de mielato ...... 37 1.6 Indicadores de calidad para miel de mielato ...... 37 1.6.1 Conductividad, Cenizas y minerales ...... 39 1.6.2 pH y Acidez ...... 41 1.6.3 Color ...... 42 1.6.4 Azúcares y Rotación específica ...... 42 1.6.5 Humedad ...... 45 1.7 Indicadores de mielato ...... 45 1.8 Evaluación Sensorial ...... 46 1.9 Referencias ...... 47 2. Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de Colombia ...... 55 2.1 Resumen ...... 55 2.2 Introducción ...... 57 2.3 Materiales y Métodos ...... 58 2.3.1 Muestras de miel ...... 58 2.3.2 Control de calidad microbiológico ...... 59 2.3.3 Perfil aromático ...... 59 2.3.4 Análisis Fisicoquímicos ...... 60 2.3.5 Análisis Estadístico ...... 61 2.4 Resultados y discusión ...... 61 2.4.1 Control de calidad microbiológico ...... 61 2.4.2 Perfil aromático ...... 63 2.4.3 Análisis Fisicoquímicos ...... 64 XII Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera
2.5 Referencias ...... 82
3. Valoración de propiedades bioactivas presentes en mieles de mielato de roble y mieles de origen floral de la región andina de Colombia ...... 89 3.1 Resumen ...... 89 3.2 Introducción ...... 91 3.3 Materiales y Métodos ...... 96 3.3.1 Muestras de miel ...... 96 3.3.2 Capacidad Antimicrobiana ...... 97 3.3.3 Preparación de extractos de miel para análisis de capacidad antioxidante y contenido de fenoles totales ...... 98 3.3.4 Capacidad Antioxidante y Contenido de Fenoles Totales ...... 98 3.3.5 Análisis Estadístico ...... 99 3.4 Resultados y discusión ...... 100 3.4.1 Capacidad antibacteriana de mieles de mielato con y sin la actividad del peróxido de hidrógeno ...... 100 3.4.2 Capacidad antioxidante en mieles de mielato de roble ...... 107 3.5 Referencias ...... 109
4. Conclusiones y recomendaciones ...... 111 4.1 Conclusiones ...... 111 4.2 Recomendaciones ...... 112
A. Anexo: Tipificación de mieles de mielato de roble (Quercus humboldtti) de Boyacá y Santander ...... 113
B. Anexo: “Miel de Roble” ...... 119
C. Anexo: Articulo de Revisión en proceso de publicación en revista indexada, categoría B: Acta Agronómica ...... 145
D. Anexo: Matriz de análisis de perfil aromático mediante la utilización del equipo de nariz electrónica...... 157
E. Anexo: Matriz de análisis fisicoquímicos ...... 159
F. Anexo: Matriz de análisis de capacidad Antimicrobiana ...... 167
G. Anexo: Matriz de análisis de capacidad antioxidante y contenido de fenoles totales ...... 173
H. Anexo: Participación en evento científico ...... 175
I. Anexo: Impacto en la cadena apícola nacional ...... 179
Bibliografía ...... 183
Contenido XIII
Lista de figuras
Pág. Figura 2-1: Análisis de componentes principales para los compuestos volátiles de mieles examinados por nariz electrónica ...... 64 Figura 2-2: Conductividad eléctrica según el origen botánico y comparación con el límite europeo para mieles de mielato ...... 65 Figura 2-3: Contenido de cenizas según el origen botánico y comparación con la norma europea de calidad para miel de abejas ...... 66 Figura 2-4: Contenido de minerales según el origen botánico de las mieles de la zona andina ...... 67 Figura 2-5: Acidez lactónica y pH según el origen botánico de las mieles de la zona andina ...... 68 Figura 2-6: Acidez libre y total según el origen botánico y comparación con el límite europeo para mieles de mielato ...... 69 Figura 2-7: Color en la escala Pfund de mieles de diferente origen botánico ...... 70 Figura 2-8: Color de acuerdo a las coordenadas triestímulo de CIELAB ...... 71 Figura 2-9: Contenido de glucosa, fructosa y sacarosa de según el origen botánico 72 Figura 2-10: Contenido de azúcares reductores y totales según el origen botánico y comparación con el límite europeo para mieles de mielato ...... 73 Figura 2-11: Rotación específica de muestras de miel con diferente origen botánico 74 Figura 2-12: Contenido de humedad según el origen botánico y comparación con el límite europeo para mieles...... 75 Figura 2-13: Análisis de componentes principales para los análisis fisicoquímicos de mieles según su origen botánico ...... 76 Figura 2-14: Análisis de componentes principales para los análisis fisicoquímicos de variables de peso Lambda de Wilks con diferencias significativas en el origen ...... 78 Figura 2-15: Análisis de componentes principales para los análisis fisicoquímicos y análisis de compuestos volátiles por nariz electrónica ...... 79 Figura 3-1: Frecuencia relativa de mieles de mielato de roble con capacidad bactericida con y sin actividad peróxido ...... 100 Figura 3-2: Frecuencia relativa de mieles de néctar con capacidad bactericida con y sin actividad peróxido ...... 102 Figura 3-3: Capacidad antibacteriana de mieles completas de mielato de roble y de néctar 105 XIV Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera
Figura 3-4: Capacidad antibacteriana de mieles de mielato de roble y mieles de néctar sin actividad peróxido ...... 106 Figura 3-5: Capacidad antioxidante y contenido de fenoles totales ...... 108 Figura 4-1: Capacitación y reconocimiento en campo del recurso mielato para los apicultores de la asociación ASOAPIGAR en julio de 2010 ...... 179 Figura 4-2: Capacitación y reconocimiento en campo del recurso mielato para los apicultores de la asociación ASOAPIBOY en julio de 2010 ...... 179 Figura 4-3: Miel de mielato de roble de apicultores de ASOAPIGAR ...... 180 Figura 4-4: Miel de mielato de roble comercial ...... 181
Contenido XV
Lista de tablas
Pág. Tabla 1.1. Conductividad eléctrica, contenido de cenizas y minerales en mieles de mielato ...... 40 Tabla 1.2. pH y Acidez de mieles de mielato ...... 41 Tabla 1.3. Color en mieles de mielato ...... 42 Tabla 1.4. Contenido de azúcares y rotación específica en mieles de mielato ...... 44 Tabla 1.5. Contenido de humedad en mieles de mielato ...... 45 Tabla 1.6. Indicadores de mielato ...... 46 Tabla 2.1. Número de muestras recolectadas y regiones de origen ...... 59 Tabla 2.2. Grupo de compuestos asociados a los sensores de óxido metálico (MOS) de la nariz electrónica ...... 60 Tabla 2.3. Parámetros fisicoquímicos y metodologías utilizadas para el análisis de mieles ...... 60 Tabla 2.4. Resumen descriptivo de la calidad microbiológica y el cumplimiento acorde con la Resolución 1057 de 2010...... 62 Tabla 2.5. Clasificación de mieles de acuerdo a PLS-DA e indicador de Kirkwood...... 80 Tabla 2.6. Características fisicoquímicas de mieles de mielato de roble de la zona andina oriental de Colombia...... 81 Tabla 3.1. Número de muestras recolectadas y regiones de origen ...... 97 Tabla 3.2. Capacidad antibacteriana con y sin actividad peróxido de mieles de mielato de roble ...... 101 Tabla 3.3. Capacidad antibacteriana con y sin actividad peróxido de mieles de néctar .103 Tabla 3.4. Tabla Post-Hoc para las diferencias significativas en la capacidad antibacteriana de mieles de mielato de roble sin actividad peróxido y de mieles de néctar con y sin actividad peróxido...... 104 Tabla 3.5. Capacidad antioxidante y contenido de fenoles totales ...... 107 Tabla 4.1. Resultados de análisis de perfil aromático ...... 157 Tabla 4.2. Resultados de análisis fisicoquímicos ...... 159 Tabla 4.3. Resultados de análisis antimicrobianos ...... 167 Tabla 4.4. Resultados de análisis antimicrobianos ...... 174
Introducción
En la producción de miel, la fuente de recursos más comúnmente aprovechada es el néctar de las flores; sin embargo existen otras fuentes de azúcares igualmente importantes y aceptadas por las abejas, como el mielato; el cual para el caso de Colombia se ha encontrado en los bosques de robles nativos (Quercus humboldtii) que dominan las masas boscosas de la codillera oriental (Chamorro et al., 2011; Chamorro et al., 2013) de Colombia y del Darien en Panamá. Este ecosistema se ubica entre los 1.100 y 3.400 metros de altitud (bosque subandino, andino y altoandino), formando bosques homogéneos y mixtos conocidos como robledales en las vertientes inter e intra andinas menos húmedas de las tres cordilleras y en especial en la cordillera Oriental alcanzando una extensión de 128.000 ha. (Cuatrecasas, 1958; Espinal, 1964; Ega, 1964; Lozano & Torres, 1974; Van der Hammen, 1974; Van der Hammen, 1989; Espinal, 1992; Espinal, 1993; Pacheco & Pinzón, 1997; Kapelle et al., 1992; Hooghiemtra et al., 2002; Fernández & Sork, 2002; Fernández & Sork, 2005; Galindo et al., 2003; Casas, 2004; Solano, 2006; Paz & Palacio-Mejía, 2006; Palacio-Mejía & Fernández, 2006; Garavito, n.d; González, Jarvis, & Palacio, 2006). El corredor de bosques de roble (Quercus humboldtti) es una de las zonas ecosistémicas continuas más extensa en el país y juega un papel primordial en la generación de bienes y servicios ambientales (Calderón & Sánchez, 2011; Fundación Natura Colombia, 2006; Sáenz, 2008); como la estabilidad del clima regional y de los flujos hidrológicos, la regulación de la escorrentía, control de erosión y retención de nutrientes y sedimentos. Además, este recurso arbóreo para la producción de mielatos, es una prioridad de conservación para el país debido a la expansión de la frontera agrícola y de la explotación irracional que ha presentado como especie maderable de fácil comercio durante aproximadamente 20 años.
A pesar de la ausencia de una designación clara como miel de mielato de roble, 10 años atrás en áreas boscosas con presencia de roble (Cárdenas et al., 2000) fue reportada la producción de miel y se había evaluado la viabilidad de implementar la apicultura en paisajes andinos con robledales como sistema productivo y de conservación (Joja-
18 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera
Sánchez & Daza-Pérez, 2010; Chamorro García, 2011). Más adelante, la miel y el polen provenientes de los bosques de roble fueron identificados como productos forestales no maderables de los bosques de roble dentro del Programa de investigación “Estrategias para la denominación de origen de los productos de la colmena”, financiado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural y desarrollado por la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá. Dentro de éste programa, el grupo de investigación en abejas (LABUN) del Departamento de Biología identificó igualmente al insecto productor del mielato, Stigmacoccus asper de la familia Stigmacoccidae (orden Hemíptera). Este insecto extrae la savia y produce una sustancia dulce (mielato), que luego es colectada por las abejas que visitan los troncos para alimentar sus colmenas. La miel generada por abejas Apis mellifera y recolectada por algunos apicultores presentes en la cordillera oriental, actualmente recibe el nombre de miel de mielato de roble y representa un recurso importante para el país debido a su origen.
A nivel mundial, este tipo de mieles son objeto de numerosos estudios, lo cual ha permitido su catalogación y la determinación de la autenticidad, garantizando a los consumidores la información pertinente para diferenciar el producto. Con el interés en ésta novedosa miel en el país; generar conocimiento sobre las características únicas de este producto se convierte en una oportunidad comercial para los apicultores de las regiones de Boyacá y Santander.
Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 19 Colombia
Objetivos
Objetivo General
Caracterizar mieles originarias de los mielatos colectados por Apis mellifera en el corredor de bosques de roble nativos de Colombia.
Objetivos Específicos
Valorar la calidad higiénica de las mieles de mielato procedentes de bosques de roble mediante la determinación de los grupos indicadores, mesófilos aerobios, coliformes, hongos y levaduras y búsqueda de patógenos específicos. Determinar el perfil aromático de mieles procedentes de bosques de robles nativos de roble, como criterio de diferenciación, mediante la utilización del equipo de nariz electrónica. Evaluar parámetros fisicoquímicos de mieles procedentes de bosques de robles nativos. Evaluar las propiedades bioactivas antioxidantes y antimicrobianas de las mieles de roble, mediante la determinación del contenido de fenoles totales, de la capacidad antioxidante y antibacteriana. Utilizar herramientas de estadística multivariada para analizar y diferenciar los mielatos procedentes de bosques de roble y mieles de otros orígenes botánicos.
Para determinar la calidad microbiológica de las mieles se realizaron recuentos microbiológicos de los grupos indicadores: mesófilos, mohos y levaduras, coliformes y anaerobios sulfito reductores bajo metodologías ICMF 2000. Así mismo se realizaron recuentos de Staphylococcus sp., como indicadores de contaminación por contacto directo con el manipulador y se estableció la presencia de los patógenos específicos Salmonella sp., Escherichia coli, Clostridium perfringens y Staphylococcus aureus (ICMF 2000). Durante el estudio fue requerida la estandarización y validación de las metodologías de evaluación en laboratorio. Estas metodologías correspondieron a la determinación de los 20 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera parámetros fisicoquímicos: contenido de humedad por el método de refractometría (969.38 A.O.A.C., 2012); pH mediante potenciometría, (Bogdanov et al., 1997), acidez libre y lactónica por volumetría, (962.19 A.O.A.C., 2012); cenizas por medio del método de gravimetría (920.18 A.O.A.C., 2012) y minerales (Na, K, Ca, Fe, Mg, Cu, Zn) mediante espectroscopia de absorción atómica, (968.08 A.O.A.C., 2012); contenido de carbohidratos por cromatografía líquida (979.21 A.O.A.C., 2012) azucares reductores por titulación (920.183 A.O.A.C., 2012); rotación específica mediante polarimetría (920.182 A.O.A.C., 2012); conductividad eléctrica por conductimetría (Bogdanov et al., 2002); color mediante fotometría (Fattori, 2004) y mediante la determinación de las coordenadas triestímulo del espacio CIELAB (CIE,1986; Díaz, 2009); sólidos insolubles según método recomendado en la NTC 1273, hidroximetilfurfural mediante espectrofotometría (980.23 A.O.A.C., 2012) y el índice de diastasa por espectrofotometría (958.09 A.O.A.C., 2012). El perfil aromático se realizó mediante el uso de una nariz electrónica PEN 3 (Airsense Analytics GmbH, Schwerin, Alemania), de acuerdo a la metodología estandarizada por el Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos -ICTA- (Zuluaga et al; 2011).
Por otra parte la bioactividad fue evaluada teniendo en cuenta el contenido de fenoles totales Folin-Cicalteau con algunas modificaciones (Buratti, 2007) la capacidad antioxidante TEAC (Actividad Antioxidante de equivalente de Trolox) (Barrios, 2009). La actividad antibacteriana fue medida mediante microdiluciones de mieles sin actividad del peróxido de hidrógeno por la técnica de Concentración mínima inhibitoria (Tan et al., 2009), teniendo en cuenta 7 microorganismos de referencia para valoración de antibióticos, según Farmacopea Americana; dentro de las cuales se evaluaron Escherichia coli, ATCC 31617; Salmonella enterica sp. enterica serovar Typhimurium, ATCC 14028; Klebsiella pneumoniae sp. pneumoniae, ATCC 700603; Pseudomonas aeruginosa, ATCC 10145; Kocuria rhizophila, 9341; Staphylococcus aureus sp. aureus Rosenbach, ATCC 6538 y Bacillus subtilis sp. spizizenii, ATCC 6633. El análisis estadístico se realizó de manera descriptiva para los resultados de calidad microbiológica y de actividad antimicrobiana mediante tablas y gráficos de frecuencia. Para la identificación de mieles de mielato se tuvo en cuenta el índice de Kirkwood (Kirkwood et al., 1960; Kirkwood et al., 1961; Vargas, 2006) y las variables fisicoquímicas y perfil aromático con mayor influencia en las muestras de acuerdo a las variables lambda de Wilks, principalmente considerando la conductividad eléctrica, debido a que es Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 21 Colombia un parámetro de importancia, descrito ampliamente en la literatura para este tipo de mieles con un valor superior a 0.8mS/cm, incluso como un parámetro de calidad y autenticidad (Bogdanov & Martin, 2002; Council of the European Union, 2002; International Honey Commission, 2008). Para la clasificación de mieles de mielato dentro del grupo de muestras se realizaron análisis de componentes principales y métodos estadísticos supervisados de clasificación, al igual que la comprobación de hipótesis mediante análisis estadísticos paramétricos (t-student) y no paramétricos (Mann-Withney, Kruskal Wallis). En la determinación de las propiedades funcionales de las mieles de mielato se realizaron correlaciones lineales entre el contenido de fenoles totales y capacidad antioxidante.
Los análisis de acuerdo a las metodologías aplicadas permitieron la catalogación y diferenciación de la miel de mielato de roble frente a mieles de tipo floral, lo cual genera un impacto y agrega valor en la tradición de productos autóctonos, posicionamiento comercial y de ingreso para los apicultores, beneficiarios del estudio; quienes actualmente comercializan en el mercado la miel con el nombre de miel de mielato, mielato de roble y miel de rocío de bosques de roble con sus características composicionales definidas y por ende con un precio comparativamente mayor frente a otros tipos de mieles. Los resultados fisicoquímicos de las mieles mostraron compatibilidad composicional con mieles de mielato a nivel mundial (White, 1980; Mateo & Bosch-Reig, 1997; Mateo & Bosch-Reig, 1998; Campos et al., 2000; Council of the European Union, 2002; Terrab et al. 2003; Soria, 2004; Persano Oddo & Piro, 2004; Bogdanov & Gfeller, 2006; Bentabol et al., 2011) como se describe a partir del segundo capítulo en éste documento, donde se presentan las características propias de la miel de mielato de roble comparadas con referencias y normativas internacionales.
Actualmente en la Norma Técnica Colombiana -NTC 1273- y la resolución 1057 de 2010 definen las mieles de mielato y mielada como mieles de recursos extraflorales y sugieren como requisito para éste tipo de mieles, un contenido aparente de azúcar reductor, calculado como azúcar invertido de mínimo 45%; no obstante, es el único parámetro planteado para éste tipo de mieles y no es específico para la miel de mielato de roble de Colombia. Debido a la novedad del producto, éste no se reconoce en los documentos 22 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera normativos nacionales, razón por la cual, la tipificación de éste tipo de mieles es un aporte a su reconocimiento en cuanto a su composición y propiedades funcionales por parte de los actores de la cadena productiva de las abejas y la apicultura.
Marco de referencia
Miel como alimento La miel es un alimento dulce y viscoso producido principalmente por las abejas melíferas (Apis mellifera) a partir del néctar de plantas diferentes flores y secreciones de plantas o insectos chupadores, el cual gracias a sus propiedades naturales continua siendo utilizado como edulcorante y como una sustancia terapéutica alternativa para el tratamiento de enfermedades en el hombre y los animales a lo largo de la historia de la humanidad (Bonet, 1994; Llambrich, 1996; Sánchez, 2007; Pohl, 2009). En Colombia acuerdo con la Resolución 1057 de 2010 del Ministerio de Protección Social, en la definición de la miel indica además la transformación por combinación con sustancias específicas propias de las abejas; depositada, deshidratada, almacenada y colocada dentro de las celdillas del panal para su madurez.
Debido a su dulzor, color y sabor, la miel a menudo es también utilizada a como un ingrediente o un conservante natural de alimentos manufacturados. Es igualmente un alimento muy energético, con valores nutritivos e incluso profilácticos gracias a su composición química comprendida principalmente por azúcares simples. Dependiendo de el origen botánico y la composición química del néctar de la miel que producen plantas o de las secreciones obtenidas por las abejas, la miel contiene mezcla de diferentes carbohidratos, incluyendo fructosa, glucosa, maltosa, sacarosa, proteínas, aminoácidos, compuestos fenólicos, ácidos orgánicos, pigmentos, vitaminas y minerales (Abu-Tarbush et al., 1993; Przybylowski, 2001; Belitz et al., 2004; Hernández et al., 2005; Rodríguez et al., 2006; Osman et al., 2007; Pohl 2009). La composición de la miel varía de acuerdo a la flora colectada, la dinámica enzimática y procesamiento de la fuente botánica por parte las abejas y a las condiciones ambientales, de cosecha envasado y almacenamiento (Crane, 1980; Wilson et al, 1932). Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 23 Colombia
La miel puede ser considerada como una fuente esencial de metales en la dieta diaria. Sin embargo, la ingesta de metales a partir de la miel es baja debido a que se consume en pequeñas cantidades. Por lo general, contribuye con los requerimientos dietarios de muchos metales mayores y menores.
En Colombia el consumo promedio aparente de este producto apícola fue en 2007 de 1.600 toneladas, correspondientes a un consumo estimado per cápita de 35 gramos (FAO, 2008). La demanda la miel ha sido registrada para consumo directo y, en mayor medida, como medicamento para enfermedades respiratorias y gripales. Por otra parte la producción en 2010, fue de 2089 toneladas (Restrepo Salazar 2011), representando el 0,1% de la producción mundial total. La miel de abejas en el país se comercializa a un mayor valor en el mercado interno en comparación con mercados externos. Sin embargo, cuando se trata de mieles reconocidas internacionalmente y con ciertas propiedades, estas se comercializan a valores más altos. En el país, existe una escasa cultura de consumo de miel de abejas y de otros productos apícolas, sin embargo la demanda de los productos apícolas supera considerablemente la oferta brindada, de tal forma se han creado inconvenientes en esta cadena productiva tales como la adulteración (Martínez Anzola 2006). Entre los factores más importantes que explican esta situación, están la falta de seguridad que el consumidor tiene sobre la autenticidad de los productos y la percepción sobre los mismos. Por lo mismo, es importante promover y publicitar los productos apícolas, con el propósito de generar un cambio gradual en los hábitos de consumo en el país, para aumentar significativamente el consumo a corto plazo (Laverde Rodríguez et al. 2010)
Experiencias de otros países han demostrado que la diferenciación de los productos y el cumplimiento de los estándares de calidad internacionales generan valor agregado a los productos de las abejas y facilitan su posicionamiento comercial (Devillers et al., 2004; Finola et al., 2007; Guyot‐Declerck et al., 2002; Mendes et al., 1998; Zuluaga Domínguez 2010).
24 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera
Conductividad eléctrica, cenizas y minerales
Conductividad eléctrica La conductividad eléctrica de un producto como la miel puede definirse como la capacidad que tiene de conducir corriente eléctrica y su expresión varía de acuerdo a los sólidos que contenga en solución, además del voltaje aplicado, del tipo, número, carga, y movilidad de los iones presentes; de la viscosidad del medio en el que éstos han de moverse y de la temperatura al momento de su medición. Este parámetro es un indicador del contenido de ácidos y cenizas en la miel y entre mayor sea su contenido, mayor será la conductividad (Bogdanov et al., 1997). Tambien es un buen criterio para determinar el origen de mieles como lo ha sido reportado y muchas veces es usado como una herramienta de rutina para el control de calidad (Mateo y Bosch‐Reig, 1997, 1998; Mateo et al., 1992; Zuluaga Dominguez, 2010). Este parámetro es determinado tradicionalmente mediante un potenciómetro y la unidad de medición utilizada comúnmente es en Siemens/cm (S/cm), en millonésimas de unidades, es decir microSiemens/cm (μS/cm), o en milésimas es decir miliSiemens/cm (mS/cm). Generalmente para realizar mediciones comparativas, la temperatura estándar es de 20 ºC ó 25º C y específicamente para la miel es recomendada la técnica descrita por los métodos armonizados de la Comisión Europea (Bogdanov, 2002; Bogdanov, Martín et al., 1997).
Cenizas Las cenizas son el resultado de la descomposición de la materia orgánica por calcinación de la miel y es un parámetro de calidad que se considera adecuado para identificar el origen botánico de la miel de abejas debido a que las mieles florales poseen un contenido de cenizas menor que las mieles de mielato (Vorwohl, 1964).
Minerales La concentración de metales en la miel deriva principalmente del suelo; estos son transportados a las plantas a través de la raíz, pasan al néctar y por último a la miel mediante el pecoreo realizado por las abejas. Por consiguiente, la composición y el contenido de los metales en miel como sodio, potasio, calcio, magnesio, hierro, cobre y zinc, entre otros elementos químicos, se ven afectados por la composición del suelo Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 25 Colombia
(origen geográfico), la fuente de néctar, la densidad floral y composición del néctar y polen (origen botánico). La evaluación de la concentración de metales en la miel entonces es útil para la clasificación de la miel según sus orígenes botánico y geográfico (Lachman y Kolihová, 2007; Pohl, 2009; Zuluaga Dominguez, 2010). La composición mineral es también considerado un parámetro adecuado para identificar mieles adulteradas, porque la composición mineral de la melaza que usualmente se emplea para ello, es diferente a la de la miel (Fattori, 2004; Felsner & Cano, 2004), o se presenta una disminución en el contenido de minerales cuando la miel es adulterada por dilución con agua y adición de jarabe de glucosa (Fernández‐Torres & Pérez‐ Bernal, 2005; Zuluaga Dominguez, 2010). pH y acidez La miel presenta una reacción acida característica condicionada por el contenido de ácidos orgánicos y sales minerales (en especial potasio; sodio y calcio). Sin embargo su apreciación queda en segundo plano, enmascarada por el dulzor de sus componentes mayoritarios; los carbohidratos (Piana et al, 1989; Díaz, 2009). La acidez y el pH de la miel son parámetros que también permiten clasificar a la miel de acuerdo con su origen geográfico y botánico. La elevada acidez de la miel contribuye en gran medida a su sabor característico y puede ser responsable de sus propiedades antisépticas y estabilidad contra el desarrollo microbiano.
La acidez libre de la miel proviene de todos los ácidos en estado libre, en tanto la acidez lactónica puede considerarse como una reserva potencial de acidez ya que la reserva en lactonas origina ácidos cuando la miel se alcaliniza. Las lactonas están constituidas básicamente por las glucolactonas, que están en equilibrio con el acido gluconico formado por acción de la glucosa oxidasa (Estupiñan et al., 1998; Cavia et al., 2007; Díaz, 2009)
El principal ácido es el glucónico (Stinson et al., 1960), que se forma por acción de la glucosa oxidasa (de la abeja) sobre la glucosa. Este ácido se genera a partir del néctar por acción de las abejas, durante el proceso de transformación del néctar a miel (Fattori, 2004; Zuluaga Dominguez, 2010). Otros ácidos orgánicos (algunos volátiles), que 26 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera contribuyen a la acidez de la miel son: málico, butírico, cítrico, tartárico, maleico y succínico, fórmico y oxálico.
Color El color es la percepción de la luz de una cierta longitud de onda reflejada por un objeto. Se incluye dentro de las propiedades ópticas de la apariencia que dependen de las modificaciones cromáticas y geométricas de la luz en la interacción con el alimento, forma física y modo de presentación (Hutchings, 1977; Zandamela, 2008). El color es una característica de tipo organoléptico asociado a la presencia de pigmentos como carotenos, xantofilas y a compuestos fenólicos, como flavonoides, que se encuentran en el néctar de las flores y es uno de los atributos de calidad que puede determinar el rechazo o aceptación de la miel (Huidobro et al., 1984; Díaz, 2009). La presencia de color en la miel puede justificarse también sobre la base de la reacción de Maillard que ocurre por condensación de azúcares con grupos aminos libres, aminoácidos y proteínas (Persano et al., 1988; Zuluaga Dominguez, 2010). La naturaleza del color como parámetro discriminante del origen botánico y geográfico de las mieles, permite complementar otras propiedades y factores de calidad como el contenido de minerales, polifenoles, actividad diastásica, aminoácidos libres de hidroximetilfurfural (Salamanca & Serra Belenguer, 2002; Bertoncelj et al., 2007).
El color de las mieles es una propiedad física que puede variar del blanco a tonos pardos y oscuros casi negros, pasando por tonalidades amarillo, ámbar, ámbar rojizo, verdoso y marrón. Algunas mieles tienen la propiedad de emitir fluorescencia al ser iluminadas por la luz ultravioleta. Por otro lado existen diferencias entre mieles claras y oscuras, observándose en las primeras, ausencia de tirosina y triptófano, que por el contrario aparecen en las segundas (Barderán et al., 1994).
Azucares y Rotación especifica
Azucares La miel de abejas es una de las más complejas mezclas de carbohidratos producida en la naturaleza. Estos son los compuestos mayoritarios de la miel y representan aproximadamente el 80% de los componentes totales y el 95 % al 99% de los sólidos Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 27 Colombia totales. En consecuencia son responsables de propiedades fisicoquímicas como viscosidad, higroscopicidad, poder rotario, propiedades térmicas, etc. Además las propiedades antibacterianas dependen de su concentración (Huidobro y Simal, 1984). Los principales azucares son fructosa y glucosa resultantes de la hidrólisis de la sacarosa del néctar por acción de la invertasa de las abejas.
Los azucares reductores son definidos como el total de azucares reducidos por el reactivo de Fehling bajo condiciones especificas. La sacarosa es el principal disacárido no reductor. Entre los disacáridos reductores se encuentran (además de la maltosa) la isomaltosa , la maltulosa, la turanosa, la nigerosa, la kojibiosa, la melibiosa, b- gentibiosa, la trehalosa, etc., Entre los trisacáridos se pueden mencionar: rafinosa, erlosa, melesitosa, maltotriosa, etc. (Fattori, 2004; Diaz, 2009)
La tendencia a la granulación de la miel depende directamente de ciertos parámetros de sensibilidad (o índices de cristalización), entre ellos la glucosa, la relación glucosa/agua (D/W), glucosa-agua/fructosa (D-W/L), fructosa/glucosa (L/D) y la melesitosa; que al mismo tiempo dependen ampliamente de la fuente del néctar el origen geográfico. De modo específico, la miel suele cristalizar, rápidamente, cuando contiene más de 28- 30% de glucosa (Phillips, 1929; Kodounis, 1962; Bogdanov, 1993), cuando la relación D/W es de 2,1 e incluso más (Austin, 1953; Jamieson, 1954; White, 1962, 1975; Kodounis, 1962), cuando la relación D-W/L tiene un valor alto (Jackson Y Silsbee, 1924), cuando la relación L/D<1,14 (Jamieson, 1954; Kodounis, 1962; White, 1975), y el contenido de melesitosa es superior al 10% (Bogdanov, 1993).
Rotación especifica La rotación específica [α] D 20°C se define como la rotación de la luz polarizada producida por 1 gramo de sustancia seca ópticamente activa en 1 mL de solución, en un tubo de 1 dm de paso óptico, a 20 °C y a la longitud de onda correspondiente a la línea D del sodio (Fattori, 2004; Zuluaga Dominguez, 2010).
La miel de abejas es una de las más complejas mezclas de carbohidratos producida en la naturaleza. Los carbohidratos principales encontrados son glucosa y fructosa, los cuales conforman de 65 a un 75 % de los sólidos solubles totales en miel. La presencia de estos 28 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera carbohidratos le confiere a la miel la propiedad de desviar el plano de polarización de la luz polarizada. Dentro de los monosacáridos, la fructosa es el carbohidrato que se encuentra en mayor proporción lo que convierte a la miel de néctar en una solución de azucares levorrotatorios. La medición de la actividad óptica y posterior determinación del valor de la rotación específica, orienta sobre el origen de la miel y ayuda en la detección de adulteraciones con jarabe de glucosa, ya que pueden volverse dextrorrotatorias dependiendo del porcentaje de adulterantes.
La rotación angular depende de distintos factores: 1. Concentración de azúcar (sobre todo si se trata de glucosa o azúcar invertido). 2. Solvente, si la medición no se realiza en solución acuosa debe aclararse. 3. Otras sustancias disueltas como por ejemplo sales 4. Mutarrotación. 5. Temperatura. 6. Longitud del tubo de medición.
Humedad El contenido acuoso de la miel es un parámetro cuya determinación es importante porque de él depende notablemente su conservación, tendencia de cristalización, además de indicar su nivel de maduración y facilitar la identificación de posibles adulteraciones (Fattori, 2004; Zuluaga Dominguez, 2010). La miel es higroscópica, debido a su baja actividad de agua (Aw) con respecto al medio ambiente (Aw=0.55) y de tal forma tiene gran tendencia a captar agua. La humedad y por lo tanto la densidad y el contenido de sólidos solubles en la miel dependen de la humedad relativa de la atmósfera, de la ventilación de la colmena y del tiempo de la recolección (Díaz, 1966). El contenido de agua es uno de los parámetros más importantes porque influye en el peso específico, viscosidad, sabor, y condiciona por ello la conservación, palatabilidad, solubilidad y en definitiva el valor comercial (Piana et al., 1989; Diaz, 2009). Cuando el contenido en agua es superior al 20 %, la miel puede fermentar, cambiar el olor, sabor y aumentar la tendencia a cristalizar. Cuando la humedad es inferior al 15 %, la miel tiene una viscosidad demasiado elevada lo cual dificulta su manejo durante la comercialización y Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 29 Colombia puede ocasionar la cristalización de la misma en una masa excesivamente dura. El grado de humedad en la miel, puede ser empleado como parámetro para determinar el adecuado procesamiento del producto, su autenticidad, e incluso su origen floral (Diaz, 2009).
Sólidos insolubles Los sólidos insolubles son por lo general partículas de cera, insectos, material vegetal y polen. El contenido de sólidos insolubles es un parámetro de gran importacia para detectar el grado de impurezas en la miel (Bogdanov, 2002) durante la obtención por su influencia sen la calidad de la miel (Zandamela, 2008). El contenido máximo de sólidos insolubles es de 0.1% para mieles normales y de 0.5% para mieles prensadas (ICONTEC, 2007)
Actividad Diastasa Las enzimas digestoras de almidón en la abeja, por una parte alfa-amilasa, divide las cadenas de almidón al azar, produciendo dextrinas, en tanto enzima beta-amilasa, divide la azúcar reductora maltosa de los terminales de las cadenas de almidón. La actividad de diastasa es un excelente indicador de la calidad de una miel, debido a que puede estimar si la miel ha sufrido procesos como el sobrecalentamiento. Mientras mayor sea el contenido de esta enzima, mayor es su calidad. Por lo general ésta se expresa en gramos de almidón hidrolizados por hora a 40°C por cada 100 g de miel. Sobre los 27°C (80.6°F) la actividad de diastasa va disminuyendo según aumenta el tiempo de almacenaje (Diaz, 2009)
Hidroximetilfulfural El hidroximetilfurfural es un producto intermedio en la reacción de Maillard y en el caso de productos como la miel, ricos en carbohidratos, se produce mediante la deshidratación de las hexosas catalizadas por ácido. El contenido de HMF, junto con otros parámetros fisicoquímicos ayuda a concluir si una miel ha sido mal procesada (sobrecalentada) o adulterada (Zappalà et al., 2005; Zuluaga Dominguez, 2010). La cantidad de hidroximetilfurfural (HMF) aumenta según aumenta la temperatura y el tiempo a la que esté la miel expuesta a calentamiento o a almacenamiento prolongado. Como valor promedio se ha adoptado el de 3 mg/100g de miel, cualquier valor sobre éste será 30 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera tomado como indicación de miel de calidad inferior. Las mieles recién cosechadas, no calentadas arrojan valores de 1 a 5 mg/1000gr de HMF. Como dato curioso el HMF no es tóxico para los humanos, pero lo es para las abejas. Alimentar las abejas con miel sobre calentada o miel muy vieja pudiese ser tóxica para ellas. El almacenar la miel a una temperatura de o mayor de 20 °C aumentará el HMF por ±1 mg/1000g por mes. Sólo la fructosa se convierte en HMF por lo que la razón de fructosa a glucosa de la miel afectará la razón a la que se genera el HMF. Adulterar la miel con azúcar invertida aumenta drásticamente los niveles de HMF (Diaz, 2009)
1. Indicadores fisicoquímicos y sensoriales de Mieles de Mielato; un contexto mundial para su reconocimiento en Colombia
Physico-Chemical and Sensory Indicators of Honeydew Honey; a worldwide context for its recognition in Colombia
M. Viviana Gamboa Abril, Zootecnista Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá. [email protected]
1.1 Resumen
A nivel mundial las características propias de la miel de mielato, incluyendo los recursos botánicos y entomológicos que la originan, han sido ampliamente estudiados favoreciendo argumentos para sustentar la autenticidad de este tipo de miel. El objetivo de éste trabajo fue revisar estudios de 16 países sobre las características fisicoquímicas y sensoriales típicas de las mieles de mielato. Los parámetros fisicoquímicos que diferencian estas mieles, son la conductividad eléctrica con valores superiores a 0.86mS/cm, rangos de acidez total (7 - 62.71 meq/kg) y pH (3.6 - 6.91); contenido de cenizas (0.002 - 6.47%), alto contenido de minerales y oligosacáridos, rotación específica ((-7.8) - 30) y color (28.89-150 mmPfund); otros valores reportados son glucosa (13.5 - 40.7%), fructosa (22.1 - 42.9%), glucosa más fructosa (35.7 - 79.3%), melecitosa (0 - 21.46%) y contenido de prolina (123 - 689mg/kg). Dentro de las propiedades sensoriales de las mieles de mielato se destacan los colores oscuros, alta densidad, sabor a caramelo intenso, olores y sabores resinosos. A partir del establecimiento de parámetros de calidad representativos en este tipo de miel se han determinado indicadores de mielato como el índice de kirkwood, teniendo en cuenta el contenido de polen y micelas e
32 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera hifas de hongos (43.58 - 70.77). Las características propias de estas mieles permiten clasificarlas, tipificarlas y categorizarlas como mieles provenientes de mielato.
Palabras Clave: autenticidad, oligosacáridos, cenizas, sensorial, Kirkwood
Abstract
Globally, honeydew honey characteristics and its botanical and entomological origin have been extensively studied, favoring arguments to support the authenticity of this type of honey. This review includes studies from 16 countries regarding physicochemical and sensory characteristics of honeydew honeys. This type of honey can be differentiated by physicochemical parameters of electrical conductivity values over 0.86mS/cm, total acidity ranges between seven and 62.71 meq/kg and pH of 3.6-6.91; ash content of 0.002- 6.47%, richness in minerals and oligosaccharides; values of specific rotation from -7.8 to 30 and color between 28.89 and 150 mmPfund; other values reported are: glucose (13.5- 40.7%), fructose (22.1 - 42.9%), glucose plus fructose (35.7 - 79.3%), melecitosa (0- 21.46%) and proline content (123 - 1689mg/kg). Within the sensory properties of honeydew honeys highlights dark colors, high density, intense caramel flavor, resinous odor and taste. According to quality parameters of this type of honey, honeydew indicators have arisen, like the Kirkwood index with values between 43.58 and 70.77, this index is determined by the content of melisopalinological profile and physicochemical factors such as sugar content. The parameters presented in this paper allow the recognition of the authenticity of honeydew honeys.
Keywords: Authenticity, oligosaccharides, ashes, Kirkwood.
Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 33 Colombia
1.2 Introducción
La miel de mielato es un producto que las abejas obtienen principalmente en épocas secas a partir la colección del mielato, el cual es una sustancia rica en azúcares, minerales y otros componentes que resultan de la extracción de partes vivas de las plantas por insectos chupadores denominados fitófagos (Hemíptera) (Sternheimer, 1977; Crane, 1980; Aparna & Rajalakshmi, 1999; Council of the European Union, 2002; ICONTEC, 2007; Bentabol et al., 2011). Debido a la importancia de la diferenciación y categorización de este producto por su origen, los parámetros fisicoquímicos son utilizados en la generación de índices y perfiles fisicoquímicos, (White, 1980; Persano Oddo & Piro, 2004) que correlacionados con los indicadores melisopalinológicos, aumentan la efectividad en la diferenciación (Prodolliet & Hischenhuber, 1998; Campos et al. 2003).
Históricamente la investigación ha planteado características sensoriales como: colores oscuros, (Piana et al., 2004) altas densidades, muy lenta cristalización (Campos et al., 2003) o no cristalización en algunos casos (Manikis & Thrasivoulou, 2001; Vargas, 2006), olores y sabores resinosos y de caramelo intenso. En cuanto estudios realizados sobre esta miel con respecto a la composición de la miel de mielato, demuestran que el contenido de azúcares es mucho más complejo que en mieles de néctar (Ortiz, 2005); así mismo sucede con otros parámetros y niveles de concentración de compuestos como: oligosacáridos, minerales, elementos volátiles, ácidos orgánicos alifáticos, aminoácidos, ácidos fenólicos, éteres y proteínas (Anklam, 1998; Soria, 2004; Sanz et al., 2005). Estas características han sido ampliamente exploradas con diferentes enfoques, haciendo correlaciones y análisis para establecer parámetros de clasificación y diferenciación (Terrab et al., 2003; Soria, 2004; Bentabol et al., 2011); permitiendo determinar la autenticidad de la miel de mielato en diferentes latitudes.
En general estas mieles presentan parámetros fisicoquímicos diferentes a los de la miel de néctar como por ejemplo, valores superiores de conductividad eléctrica (Campos et al., 2000; Council of the European Union, 2002; Persano Oddo & Piro, 2004; Bogdanov & Gfeller, 2006), acidez, pH, cenizas y oligosacáridos; valores positivos de rotación específica (White, 1980) y valores bajos de monosacáridos. (Mateo & Bosch-Reig, 1997; 34 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera
Mateo & Bosch-Reig, 1998; Campos et al., 2000; Bogdanov & Gfeller, 2006; Bentabol et al, 2011). De acuerdo a las normativas y los estudios realizados en 16 países para las diferentes mieles de mielato, a continuación se presentan los indicadores para la autenticidad de éste producto.
1.3 Mielato
El hecho de que la miel provenga de insectos fue mencionado como posible en 1696 por Van Leeuwenheok, en tanto Ehrenfels (Ehrenfels, 1829) pensaba que era una exudación de las plantas. Luego Stern (Stern, 1841), Stoehr (Stoehr, 1842), Noerdlinger (Noerdlinger, 1854), y Buechen (Buechen, 1891) afirmaron que el mielato provenía exclusivamente de los insectos, áfidos; sin embargo hasta la década de 1960, algunos apicultores europeos no creían o no querían creer que la miel podría tener ésta procedencia (Pechhacker, 2008; International Honey Commission, 2008). A partir de su reconocimiento, los apicultores en el continente europeo se han familiarizado con el concepto de miel de mielato y su origen, donde hay un flujo importante, especialmente en las zonas alpinas (Europa Central). Posteriormente han sido identificados en América, principalmente en Brasil, la miel negra de bracatinga (Mimosa scabrella) e Inga (Inga uruguensis) (Campos et al. 2003).
El mielato es una sustancia azucarada consumida por muchos organismos, gracias a que se produce en grandes cantidades en relación con el tamaño en escala del insecto; lo cual permite el aumento de la biodiversidad cuando se dispone de éste, ya sea cuando se encuentra fresco o cristalizado. Esta ventaja natural es importante en países con estaciones al comienzo de la primavera y el otoño con ambientes que carecen de densidad y diversidad de poblaciones.
El insecto productor del mielato con su aparato bucal utiliza unas piezas adaptadas para perforar las partes tiernas de la planta, llegando hasta los vasos conductores y succionando por tanto las sustancias azucaradas del floema, esto es, la savia elaborada. Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 35 Colombia
La savia generalmente presenta un alto contenido de carbohidratos derivados de la fotosíntesis y un bajo contenido de aminoácidos esenciales, proteínas y productos secundarios de la planta en pequeñas cantidades (Grant & Beggs, 1989; Molyneux et al., 1990). El contenido de aminoácidos en la savia puede variar de acuerdo a la especie de la planta, la parte de la planta de donde se extrae y al momento del día en que se obtiene la savia (Fisher, 1983, 1987; Fisher & Gifford, 1986; Hendrix & Salvucci, 1998; Sandstrom et al., 2000). La savia contiene glucosa, fructosa, maltosa y en mayor proporción, sucrosa (Zimmermann & Ziegler, 1975; Wäckers, 2000). Un estudio en el 2002 indica que el contenido de la savia puede cambiar de acuerdo a la época del año pero el del mielato no (Yao & Akimoto, 2002; Woola et al, 2006). Actualmente el mielato más que un exceso de azúcar, se reconoce como una sustancia metabolizada por los insectos y su producción es un reflejo de las necesidades metabólicas (Crane, 1975; Rhodes et al., 1996). El procesamiento es realizado gracias a la ayuda de la simbiosis con una bacteria intestinal que ayuda al áfido a obtener los aminoácidos suficientes para su crecimiento, que pueden no encontrarse en la savia (Wilkinson et al., 1997; Dixon, 1998; Sandstrom & Moran, 1999). La concentración osmótica de la savia se reduce a través de la dilución y la conversión de azucares complejos; como resultado, el mielato excretado es nutricionalmente distinto de la savia con la incorporación de los azucares sintetizados y aminoácidos balanceados por el áfido (Baker, n.d.). El intestino de los insectos chupadores de savia está provisto de unas cámaras filtrantes que retiran cualquier líquido en exceso durante la digestión, sin necesidad de cruzar todo el intestino y en el tubo digestivo las moléculas de azúcar son fraccionadas y después recombinadas según nuevas disposiciones. El mielato es una sustancia que comprende además de los azucares aportados por la savia, azucares como melesitosa, elrosa (fructomaltosa), rafinosa, trealosa, manitol, sorbitol, melobiosa y xylosa (Wäckers, 2000; Leroy et al., 2009); aminoácidos no esenciales (78% de los aminoácidos totales) como asparagina, glutamina, glutamato y otros como alanina, arginina, cisteína, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, valina. Los dos primeros son aminoácidos típicamente encontrados en varios de los insectos productores de mielato (Sasaki et al., 1990; Douglas et al., 1992). 36 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera
El contenido de azucares se ha reportado por encima del 5% de glucosa, con proporciones variables de fructosa y sucrosa y oligosacáridos del 30% y hasta del 80% en algunos insectos. Mielatos como aquellos producidos por insectos en Nueva Zelanda contienen pequeñas cantidades de nitrógeno y grandes cantidades de azucares de bajo peso molecular que son consumidos fácilmente (Grant & Beggs, 1989; Beggs et al., 2005) La producción de mielato y la composición variable de su contenido depende entonces de la especie y dinámica del insecto, de la planta huésped y de las condiciones del medio (Cloutier, 1986; Malcolm, 1990; Bristow, 1991; Hendrix et al., 1992; Völkl et al., 1999; Yao et al., 2001; 2002; Faria et al., 2007; Leroy et al., 2009).
1.4 Miel de mielato en el mundo
Las mieles de mielato más conocidas a nivel mundial son aquellas originarias del continente europeo, a partir de abetos en Grecia, Alemania, Francia, Turquía, Italia, Suiza, Eslovaquia y Polonia; de pinos en Turquía, Grecia, Suiza e Italia; de robles en Croacia, Serbia, Macedonia, Bulgaria, Italia, Francia, Grecia, Polonia y Colombia. Dentro de estos países, los mayores productores de miel de mielato son Turquía a partir del recurso Pinus brutia por el insecto escama Marchalina hellenica (Bacandritsos et al., 2004; Nicolaos Bacandritsos & Saitanis, 2006); Grecia con miel de pinos y abetos de Abies cephalonica y Alemania con abeto Abies alba por los insectos Cinara pectinatae y Cinara confinis. Otros recursos de mielato se han encontrado en África donde se han observado abejas, incluso en el frijol, trébol y trigo (Pechhacker, 2008; International Honey Commission, 2008). Igualmente en Australia y Sudamérica (Chile, Brasil), las abejas recogen mielato de varios insectos y árboles. En Brasil producen miel negra de S. paranaenses (Hodgson et al., 2007), de “Caule da bracatinga” (Leguminosae Mimosoideae Mimoso sp.) (Campos et al., 2002) o de ingá (Inga uruguensis) (Campos et al., 2003; Vargas, 2006) y en México donde la miel es un producto de importancia económica, el mielato de Stigmacoccus sp. no se utiliza como un recurso de forrajeo en las abejas domésticas Apis mellifera (Hodgson et al., 2007). Desde 1841 el origen de la miel de mielato ha sido considerado a partir de los insectos fitófagos y su ecosistema, sin embargo en países en proceso de consolidación de la Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 37 Colombia apicultura como Colombia, en el 2011 fue reconocida la producción de miel de mielato de insectos Stigmagoccus asper (Kondo, 2001) en el corredor de bosques de roble nativos Quercus humboldtti (Chamorro, 2011).
1.5 Designación de la miel de mielato
Aunque su reconocimiento es mundial, en la denominación del producto se presentan designaciones como miel de mielato, miel de roció o miel de mielada y otros nombres como miel de bosque, miel negra, miel de selva negra o miel del recurso del que proviene, como por ejemplo, miel de pino o miel de abeto (Crozier, 1981; Gürel, Karkacier et al., 1998; Campos et al., 2003; Sanz et al., 2005; Bacandritsos et al., 2006; Bogdanov & Gfeller, 2006; González-Paramás et al., 2006; Bobis et al., Marghitas et al., 2008; International Honey Commission, 2008; Primorac et al., 2009; Bentabol et al., 2011). Es importante hacer distinción de sus nombres puesto que tanto para el productor como para el consumidor es menos preciso su reconocimiento. Cabe mencionar que el término mielada en países como Argentina es utilizado para referirse al momento de una floración masiva que produce un gran ingreso de néctar (Díaz, 2004) y en general la miel de mielada se reconoce como una fuente extra floral que puede involucrar o no la savia extraída por insectos fitófagos; sin embargo la norma técnica colombiana NTC 1273 hace aclaración al respecto, indicando que el producto que involucra la intervención de estos insectos es denominado como miel de mielato (ICONTEC, 2007).
1.6 Indicadores de calidad para miel de mielato
Dentro de la gran diversidad de recursos botánicos y entomológicos originarios del mielato, existen parámetros de común denominación para la distinción de estas mieles frente a aquellas provenientes del néctar de las flores dentro de los cuales se incluyen métodos fisicoquímicos, melisopalinológicos y sensoriales. (Accorti et al., 1989; Persano et al. 1995; Salinas et al, 1995; Latorre et al, 1999; Soria, 2004; Serrano et al, 2004; Corbella & Cozzolino, 2006; Conti et al., 2007). A partir de los parámetros fisicoquímicos, en la Comunidad Económica Europea han establecido metodologías y normatividad para este producto; el cual se caracteriza principalmente por conductividad eléctrica superior a 0.8 mS/cm (Bogdanov et al. 1995; Persano Oddo & Piro, 2004); alto contenido de 38 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera cenizas, usualmente superior al 1%, sin embargo la Comunidad Económica Europea exige que cualquier tipo de miel se encuentre por debajo de éste valor (Hernández et al., 2005; Pisani et al. 2008; Pohl, 2009); alto contenido de minerales en orden descendente de potasio, calcio, magnesio, sodio, sulfuro y fósforo (Lachman et al., 2007; Pawel et al., 2009); valores de pH mayores a 4.5 y alta presencia de acidez, especialmente de acidez libre con valores medios de 33.5 meq/kg (Kirkwood et al., 1960; Karkacier et al., 1998- 1992; Bogdanov et al., 2000; Fattori, 2004; Bogdanov et al., 2009); altos niveles de oligosacáridos, especialmente melecitosa superior a 0.5 g/100 g (Maurizio, 1975; Lombard et al. 1984; Foldhazi, 1994; Weston et al., 1999; Sanz et al., 2004; De la fuente et al., 2007; Bogdanov, 2008); mayores valores de sacarosa aparente, menor contenido de glucosa, fructosa, glucosa+fructosa, >45g/100g (Foldhazi, 1994; Weston et al. 1999; Bogdanov et al., 2000; Council Of The European Union, 2001; Ivanov, 2008; Thrasyvoulou, 2008); valores positivos de rotación específica (Kirkwood et al, 1960; Kirkwood et al, 1961; Sacchi et al., 1963; Battaglini et al., 1973; Piazza et al, 1991; Persano Oddo et al. 1995, Persano Oddo et al., 1997) y humedad con contenidos usualmente bajos registrados a partir de un 14% (Bacandritsos et al., 2006; Marghitas et al., 2008).
Las diferencias entre mieles de mielato con respecto al contenido de sacarosa, agua, acidez total y hidroximetilfurfural (HMF), son causadas aparentemente por: el insecto productor del mielato, la planta y finalmente las condiciones climáticas (temperatura, humedad relativa, velocidad y dirección del viento) durante colección de mielato. De igual manera Maurizio (Maurizio, 1976) confirma que la composición del mielato varía de acuerdo al insecto. En general no se presenta un solo parámetro capaz de diferenciar entre mieles de mielato y mieles florales, para ello la combinación de parámetros fisicoquímicos en forma de índice puede ser una forma más precisa de identificación; no obstante para las mieles suizas, por ejemplo, el parámetro que probablemente ha logrado este efecto ha sido el oligosacárido, melecitosa. (Bogdanov et al., 2006). Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 39 Colombia
1.6.1 Conductividad, Cenizas y minerales
Uno de los parámetros fisicoquímicos más importantes y más común en la diferenciación de mieles de mielato es la conductividad eléctrica por presentar valores superiores con respecto a las mieles provenientes del néctar; sin embargo también pueden presentarse mieles florales con alta conductividad eléctrica (Talpay et al, 1985; Mateo et al., 1992, Bogdanov, 1995; Mateo et al., 1997, Mateo et al., 1998; Campos et al., 2001; European Economic Community, 2002; Persano Oddo & Piro, 2004; Sanz et al., 2005; Bogdanov, 2009; Bentabol et al., 2011;), usualmente por encima de 1mS/cm (Accorti et al., 1986; Bogdanov, 2002; Tsigouri et al. 2004). Haciendo las respectivas aclaraciones la Comunidad Económica Europea en la norma para la miel lo presenta como un factor diferenciador, el cual para la miel de origen floral es menor de 0.8 mS/cm, en tanto la miel de mielato puede estar por encima de éste valor (Tabla 1.1). Esta medida está relacionada fundamentalmente con el contenido de sales minerales, ácidos orgánicos, proteínas y posiblemente con compuestos como azúcares; permitiendo estimar su origen (floral o de mielato) y orientar cual ha sido la fuente de néctar (Crane, 1975). Mayor sea el contenido de cenizas y acidez que se encuentren en la miel, mayor es el valor de conductividad eléctrica (Bogdanov et al., 1997; Bogdanov et al. 2000). Inicialmente el contenido mineral se determinó como un criterio de calidad de la miel. Hoy en día, esta medición, en términos de calidad, generalmente se sustituye por la determinación de conductividad eléctrica (Codex, 2001; Bogdanov et al., 2007; Bogdanov, 2009).
Las cenizas y la proporción de minerales: sodio, potasio, calcio, magnesio, hierro, cobre y zinc, son componentes menores, presentando gran variabilidad en la frecuencia y concentración en cada tipo de miel (Tuzen M., 2007); por ello pueden ser considerados como parámetros complementarios en la denominación de origen (Feller-Demalsey, 1990; Nozal Nalda et al., 2005; Lachman & Kolihová, 2007; Bogdanov, Haldimann, et al. 2007) y como indicadores ambientales (Uren et al., 1998; Przybylowski et al., 2001). Usualmente se encuentra que las mieles oscuras y en particular las mieles de mielato, son más ricas en minerales (Vorwohl 1989; Pohl, 2009). El contenido típico en estas mieles suele ser mayor al 1%, diferente a las mieles de néctar con 0.1–0.3% (Lachman et al., 2007; Bogdanov, Haldimann, et al. 2007; Pisani, 2008; Pohl 2009; Bogdanov 2009). 40 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera
Valores entre 1.07 y 4023 mg/kg han sido reportados para minerales como Na, Mg, K, Ca, Fe, Mn, Zn y Sr, en tanto para Ba, Co, Ni, As, Cd, Sb, Pb, Th, U, se reportan valores entre 1 y 5900 ug/kg. (Hernández et al., 2005; Pisani, 2008; Pohl 2009). Minerales como Al, Cr, Se y Tl normalmente no son detectables, sin embargo para mieles de mielato estos elementos pueden llegar a ser cuantificables (Pisani et al. 2008). Según la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura -FAO-, en la revisión del año 2000 del Codex Alimentarius, indica que la miel de mielato posee mayor contenido de potasio, tal como se observa en lista (Tabla 1.1). Este elemento es seguido por calcio, magnesio, sodio, azufre y fósforo (Lachman 2007; Pohl 2009). Por otra parte en estudios comparativos con distintas mieles, han encontrado mayores concentraciones de calcio en mieles de néctar que en mieles de mielato (Lachman J., 2007).
Tabla 1.1. Conductividad eléctrica, contenido de cenizas y minerales en mieles de mielato Parámetro Parámetro Contenido Límite Rango Rango de minerales Contenido de minerales Europeo mg/kg mg/kg
K 333-4506.9 Sr 1.59-2.01
Ca 3.72-409 Ni 0.028–1.966
Cl 148.9-396.1 Ba 0.026-1.294
Na 8.51-255.37 Pb 0.012-0.89
P 255 (3.52) Cd 0-0.103
Mg 1.48-150 Co 0.0391- 0.0566
B 1.03–54.9 Cr 0.001-0.026
Al 5.14–46.7 As 0.00797-0.07
S 46.1 (0.81) U 0-00958-0.0148
Zn 0.669-39.7 Sb 0.00663-0.00924
Mn 0.429-13.8 Th 0.00104-0.00294
Fe 0.386-13.7
Br 11.2 Conductividad mS/cm 0.22-2.41 >0.8
Cu 0.228–3.317 Contenido de cenizas % 0.002-6.47 Máximo 1% Referencias: Fernandez 1994; Persano et al., 1995; Mateo & Bosch-Reig, 1997; Gürel et al., 1998; Mateo et al., 1998; Bogdanov et al., 2000; Persano et al., 2000; Bacandritsos, 2002; Campos et al., 2003; Bacandritsos et al., 2004; Dinkov, 2003; Lazaridou et al.,2003; Sabatini & Barbattini, 2003; Terrab et al., 2003; Sahinler & Gul, 2004; ; Persano Oddo & Piro, 2004; Tsigouri et al., 2004; Meda et al, 2005; Vorlová et al., 2005; Vargas, 2006; Bogdanov et al., 2007; Conti et al., 2007; Lachman et al.,2007; Bobis et al., 2008; Bogdanov et al., 2008; Georgiev et al., 2008; Pisani et al., 2008; International Honey Commission, 2008; Marghitas et al., 2008; Mića et al., 2008; Golob & Plestenjak, 2009; Pisani et al., 2009; Primorac et al., 2009; Pohl, 2009; Primorac et al., 2009; Chudzinska & Baralkiewicz, 2010; Gallina et al., 2010; Pisani et al., 2010; Bentabol et al., 2011; Vanhanen et al., 2011; Kasperová et al., 2012; Serap, 2012; Fermo, 2013; Kędzierska- Matysek et al., 2013 Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 41 Colombia
1.6.2 pH y Acidez
El pH y la acidez de la miel son datos que de igual forma permiten clasificar a la miel de acuerdo a su origen geográfico y botánico (Zuluaga Domínguez, 2010); por ende son considerados como parámetros diferenciadores entre mieles de mielato y mieles florales (Crane, 1983; Campos et al., 2001; Suarez-Luque, 2002; Sanz et al., 2005). De acuerdo a Salinas et al. 1994, la acidez es una de las fuentes de mayor variación en las mieles (Maurizio, 1985), puesto que las mieles ricas en cenizas (mielatos) muestran generalmente valores altos de pH (Persano et al., 1995; Bogdanov, 2009) y de acidez total (Karkacier et al., 1992; Persano et al., 1995; Karkacier et al., 1998; Sanz et al., 2005; Pérez et al. 2007; Vela et al. 2007; González Lorente, De Lorenzo Carretero, & Pérez Martín, 2008; Bentabol Manzanares et al., 2011); sin embargo, en mieles de origen floral éste último parámetro presenta generalmente un mayor contenido (Gürel et al., 1998; Primorac, Angelkov, Mandić, et al., 2009). Algunas mieles de mielato pueden presentar valores bajos de acidez libre (Ruoff, 2006). El pH de la miel en general está comprendido entre 3.5 y 4.5 (Fattori, 2004), en tanto la acidez presenta valores menores a 50 meq/1000 g (Bogdanov et al, 2000). Teniendo en cuenta éstos valores, a continuación se observan las diferencias para las mieles de mielato.
Tabla 1.2. pH y Acidez de mieles de mielato Parámetro Rango Limite Europeo pH 3.6-6.91
Acidez Libre 14.2-52.5 <50 meq/kg Acidez Lactónica meq/kg 0-9.7
Acidez Total meq/kg 7-62.71 <50 Persano et al., 1995; Gürel et al., 1998; Aparna & Rajalakshmi, 1999; Golob & Plestenjak, 1999; Bogdanov et al., 2000; Persano et al., 2000; Bogdanov et al., 2002; Campos et al., 2003; Bacandritsos et al., 2004; Lazaridou et al.,2003; Sabatini & Barbattini, 2003; Terrab et al., 2003; Sahinler et al., 2003; Persano Oddo & Piro, 2004; Sahinler & Gul, 2004; Sanz et al., 2005; Vorlová et al., 2005; Bacandritsos et al., 2006; Bogdanov et al., 2006; Vargas, 2006; Bacandritsos et al., 2006; Lazariduo et al., 2006; Ruoff., 2006; Conti et al., 2007; Bobis et al., 2008; Bogdanov et al., 2008; Pisani et al., 2008; Conti et al., 2007; International Honey Commission, 2008; Marghitas et al., 2008; Bogdanov, 2009; Primorac et al., 2009; Bogdanov, 2009; Primorac et al., 2009; Bentabol et al., 2011
42 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera
1.6.3 Color
Generalmente ha sido correlacionado con la madurez, contenido de minerales, polen y compuestos fenólicos (Bertoncelj et al., 2007). De acuerdo con Anklam (Anklam 1998), Fernández-Torres (Fernández-Torres et al., 2005) y Kasperová (Kasperová et al., 2012), las mieles más oscuras poseen un mayor contenido de minerales. En general estas mieles presentan un amplio rango de tonos ámbar, desde el amarillo hasta casi negro (Tabla 1.3). En Croacia por ejemplo, visualmente el color de las muestras varía de ámbar a tonos rojizos, verdosos (abeto blanco suizo) y marrón rojizo (Primorac et al, 2009), en tanto muestras de Macedonia varía de color ámbar brillante a marrón y marrón oscuro con sombras (Bogdanov, et al. 2008). Gracias a éstas diferencias aportadas por el color, aparte del sabor y el aroma, éste parámetro sirve para indicar el origen botánico (Terrab et al. 2004). En el método de CIELAB, según Lomas (1996) indica las magnitudes relacionadas con la respuesta visual, estas son: L* (claridad), C* (cromaticidad), hab* o tono, que es el atributo de una sensación visual a los colores percibidos como rojo, amarillo, verde o azul, donde a* representa la oposición visual rojo-verde y b* representa la oposición visual amarillo-azul (Díaz Moreno, 2009). Con respecto a éste método se indican mayores valores para a*,b* y Cab* (Ortiz Valbuena, 2005; Terrab et al., 2003).
Tabla 1.3. Color en mieles de mielato Parámetro Rango Color mm Pfund 28.89-150 L* 4.455-39.39 CIE (L*a*b*) a*0.17-23.28 b* -4.79-36.06 Persano et al., 1995; Persano Oddo & Piro, 2004; Tsigouri et al., 2004; Vargas, 2006; Bentabol et al., 2011; Kasperová et al., 2012
1.6.4 Azúcares y Rotación específica
La miel de mielato, contiene menores cantidades de glucosa (Siddiqui, 1970; Doner 1977; Moreira et al., 2001) y fructosa y mayores niveles de oligosacáridos, principalmente melecitosa y erlosa (Foldhazi 1994; Weston et al. 1999). Tseko Ivanov en el 2008 confirma mayores valores de sacarosa aparente, menor contenido de glucosa, fructosa, glucosa + fructosa (Thrasyvoulou, 2008), azúcares reductores y contenido aparente de azúcares totales, así como menor actividad de la enzima glucosa oxidasa. Debido a una Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 43 Colombia composición con menor contenido de la suma de glucosa mas fructosa en éstas mieles los estándares europeos fueron modificados de un mínimo de 60g a 45g/100g, en tanto las mieles florales se mantienen en un mínimo de 60g. (Council of the European Union 2001).
La miel a partir generada a partir de éste recurso, dentro de sus altos niveles de oligosacáridos presenta alrededor del 5% más que la miel de néctar, en particular de los trisacaridos melecitosa y rafinosa (Lombard et al. 1984; Maurizio, 1975, Weston et al. 1999; Foldhazi 1994). Así mismo han encontrado altas concentraciones, hasta de 6.57% de melecitosa, en muestras españolas y la cantidad de erlosa encontrada por estos autores es el mismo que el de varias mieles monoflorales de 2.35%. Gracias a los frecuentes reportes del trisacárido melecitosa, éste ha sido propuesto como un indicativo de la miel de mielato (Sanz et al. 2004). Así, el porcentaje de melecitosa en bajas concentraciones indica entonces la ocurrencia de mieles de néctar y un contenido superior a 0.5/100 g, puede admitirse como una miel que contiene mielato (Bogdanov et al., 2008).
Muestras evaluadas en Croacia han sido reportadas como mieles que presentan una variedad de azúcares con un mayor contenido de maltosa (con celobiosa y trealosa), rafinosa y melecitosa (con erlosa). Otros azúcares reportados son cr-trehalosa (Maurizio, 1975; Lombard et al. 1984), teanderosa, celosa, maltotriosa, panosa y concentraciones de isomaltosa significativamente más altas que en mieles florales.
En tanto a la orientación dextrorotatoria, la miel de mielato tiende a presentar las mismas características de mieles adulteradas en cuanto a éste parámetro; (Tabla 4) sin embargo la miel de mielato posee altas cantidades de oligosacáridos como melecitosa y elrosa (Foldhazi 1994; Ivanov, 1986) que son fuertemente dextrorrotatórias; de tal forma los valores reportados para la miel de mielato en cuanto a su rotación específica suelen ser extremos. En mieles europeas han reportado valores negativos para éste parámetro, no obstante para mielatos se han registrado valores positivos (Kirkwood et al, 1960; Kirkwood et al, 1961; Sacchi et al 1963; Battaglini et al. 1973; Piazza et al, 1991; Persano Oddo et al., 1995; Persano Oddo et al., 1997;). Esta condición ha conllevado a la frecuente utilización 44 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera de ésta variable para distinguir entre miel floral y miel de mielato, aún cuando sus límites no han sido establecidos (Battagline, 1973; Bogdanov, 2000). Un ejemplo de una de las mieles más comunes originadas del mielato, es la miel de Metcalfa, la cual ha podido ser diferenciada por su contenido rico en maltotriosa y particularmente por sus altos valores de dextrinas (Bogdanov, 2009).
A continuación se presentan datos de referencia internacional sobre el contenido de azúcares y la rotación específica de mieles de mielato.
Tabla 1.4. Contenido de azúcares y rotación específica en mieles de mielato
Límite Parámetro Rango Parámetro Rango Europeo Fructosa/Glucosa 0.8-1.69 Azúcares Reductores % 55.73 -84.75 ≥ 45 g /100 g Fructosa % 22.1-42.9 Glucosa + Fructosa 35.7-79.3 >45 Glucosa % 13.5-40.7 Sacarosa % 0-14 Celobiosa 1.4-1.7 Melecitosa % 0-21.46 Laminaribiosa 1.1-1.2 Trealosa % 0-3.3 Maltulosa 2.51-22.6 Maltosa % 0.2-24.1 Nigerosa 10.1-13 Isomaltosa % 0-13.4 Kojiobiosa 0.15-22.2 Raffinosa % 0-6.3 Trealulosa 6.6-9.8 Erlosa % 0-3.3 Palatinosa 1.7-3.1 Panosa % 0.1-1.9 Gentiobiosa 0.3-0.6 Isomalto-triosa % 0-2.04 Melibiosa 0.2 Malto-triosa % 0.1-1.3 Kestosa 3-4.2 Malto-tetraosa % 0.1-8 Teanderosa 0.4-0.7 Turanosa % 0.71–22.5 Azucares Totales % 66.47-84.75 Xylosa % 0.0 - 0.4 Rotación Específica (-7.8) – 30 Fernandez 1994; Persano et al., 1995; Mateo & Bosch-Reig, 1997; Aparna & Rajalakshmi, 1999; Golob & Plestejak, 1999; Bogdanov et al., 2000; Persano et al., 2000; Bogdanov & Martin, 2002; Campos et al., 2003; Dinkov, 2003; Lazaridou et al.,2003; Sabatini & Barbattini, 2003; Sahinler & Gul., 2003; Terrab et al., 2003; Bacandritsos et al., 2004; Sahinler & Gul, 2004; Persano Oddo & Piro, 2004; Sanz et al., 2005; Bacandritsos et al., 2006; Vargas, 2006; Bogdanov & Gfeller, 2006; Bacandritsos et al., 2006; Lazariduo et al., 2006; Ruoff, 2006; De la fuente et al., 2007; Conti et al., 2007; Bobis et al., 2008; Bogdanov et al., 2008; International Honey Commission, 2008; Bogdanov, 2009; Golob & Plestenjak, 2009; Primorac et al., 2009; Bogdanov, 2009; Primorac et al., 2009; Bentabol et al., 2011
Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 45 Colombia
1.6.5 Humedad
El contenido de humedad de mieles de mielatos es similar en relación a las mieles de origen floral, sin embargo es frecuente encontrar en estas mieles, contenidos bajos, incluso a partir de un 14% (Bacandritsos, 2006; Marghitas et al. 2008). Por otra parte éste factor es presentado como una variable discriminante para la diferenciación entre mieles de distintos recursos (Mateo Rufino 1997), no obstante como se documenta en éste artículo de revisión, pueden ser utilizados otros parámetros que se ajustan mejor a éste objetivo.
Tabla 1.5. Contenido de humedad en mieles de mielato
Parámetro Rango Límite Europeo Humedad % 13-23.27 <20 Mateo & Bosch-Reig, 1997; Aparna & Rajalakshmi, 1999; Golob & Plestenjak, 1999; Bogdanov et al., 2000; Persano et al., 2000; Campos et al., 2003; Bacandritsos et al., 2004; Dinkov, 2003; Lazaridou et al.,2003; Sabatini & Barbattini, 2003; Sahinler & Gul, 2003; Terrab et al., 2003; Bacandritsos et al., 2004; Persano Oddo & Piro, 2004; Sahinler & Gul, 2004; Sanz et al., 2005; Bacandritsos et al., 2006; Lazariduo et al., 2006; Vargas, 2006; Bacandritsos et al., 2006; Ruoff, 2006; Conti et al., 2007; Bobis et al., 2008; Bogdanov et al., 2008; International Honey Commission, 2008; Marghitas et al., 2008; Bogdanov, 2009; Bogdanov, 2009; Primorac et al., 2009; Gallina et al., 2010; Bentabol et al., 2011
1.7 Indicadores de mielato
Actualmente, el análisis botánico de mieles orientado por expertos funciona como un factor de autenticidad en caso de duda sobre la determinación del origen de una miel de mielato (Kaspar 2004; Bogdanov 2008); sin embargo son múltiples las formas de lograr una distinción de ésta miel. Dentro de estas formas pueden ser muy útiles las evaluaciones a nivel sensorial y/o fisicoquímico, dentro de los cuales existe una amplia variedad de parámetros que funcionan como diferenciadores. El uso de éstos parámetros en funciones discriminantes fue inicialmente utilizado por Kirkwood (Kirkwood, 1960) en la generación de un índice que logra la categorización de la miel según su origen botánico (kirkwood et al., 1960; Kirkwood, 1961; White, 1980). Otros análisis que involucran perfiles fisicoquímicos (Persano & Piro, 2004) al ser comparados con los indicadores melisopalinológicos, aumentan la efectividad en la diferenciación (Prodolliet & Hischenhuber, 1998; Campos et al., 2003;). 46 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera
El índice de Kirkwood es determinado a partir del establecimiento de la ecuación X = -
8.3X1 – 12.3X2 + 1.4X3, utilizando los parámetros de pH (X1), cenizas en materia seca
(X2) y azúcares reductores en base de materia seca (X3); de tal forma se determina un valor X de un umbral para la diferenciación entre estos dos tipos de miel; siendo adoptado el valor límite de 73.1, para el cual una muestra por debajo de éste valor se clasifica como miel de mielato (Campos et al., 2003; Bogdanov et al., 2006; Bogdanov, 2008). Como se observa en la tabla, los valores del indicador Kirkwood se encuentran por debajo del valor límite, sin embargo en las mezclas naturales de mieles de mielato con mieles de tipo floral, estos valores pueden estar cercanos e incluso por encima del límite, sin embargo para ésta revisión no se discuten las interfases entre los dos tipos de mieles. Además del indicador de kirkwood han sido propuestos otros índices como los elementos de mielato (Dimou et al., 2006) y el denominado indicador de mielato con los valores de referencia presentados en la tabla a continuación.
Tabla 1.6. Indicadores de mielato
Parámetro Rango de valores reportados Límites Indicador de mielato Kirkwood 43.58-70.77 <73.1 HED (Elementos de mielato) 65-100 PG (Granos de polen) 10.5-530 HED/PG (Indicador de mielato) 0.2-17.1 ≥3 Campos et al., 2003; Dinkov, 2003; Persano Oddo & Piro, 2004; Soria et al., 2004; Tsigouri et al., 2004; Vargas, 2006; International Honey Commission, 2008; Marghitas et al., 2008
1.8 Evaluación Sensorial
Piana et al., 2004 especifica el perfil sensorial de las mieles de mielato de diferentes países europeos a partir de la evaluación y de criterios de selección de referencia en conformidad con las propiedades fisicoquímicas y melisopalinológicas (Persano Oddo & Piro, 2004). Entre las características más relacionadas para la distinción de las mieles de mielato, se presentan sensorialmente en la evaluación visual, colores oscuros; entre rojo, marrón y cercano a negro con tonos normales de miel y algunas veces fluorescencias verdes. En evaluaciones olfativas y de aroma determinan intensidad media a alta con descripciones: leñosa, cálida, caramelo, resinosa, más aromática a balsámica (Abeto), aroma a malta (Pino), floral, fruta fresca y vegetal. También en aroma se describen las Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 47 Colombia sensaciones leñosa y cálida, con persistencia o postgusto medio y con otras percepciones algunas veces astringentes y picantes. En cuanto a la evaluación gustativa las mieles presentan una intensidad media, dulzura con acento débil (Árbol) y media (Pino), carácter salado Bentabol simposio; acidez débil y amargura ausente. Otras características sensoriales son la baja percepción de granulación en la boca Perez simposio, altas densidades y muy lenta cristalización (Persano et al. 1995; Campos et al. 2003; Tsigouri et al. 2004; Persano & Piro, 2004; Bogdanov et al., 2008; Bogdanov et al., 2009).
Agradecimientos
El autor presenta sus agradecimientos particularmente a Consuelo Díaz Moreno y a Judith Figueroa Ramírez de la Universidad Nacional de Colombia por la asesoría científica y revisión crítica del documento.
1.9 Referencias
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2. Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de Colombia
Honeydew Honey of Oak (Quercus Humboldtti) from de East Andean Zone from Colombia
M. Viviana Gamboa Abril1*, Consuelo Díaz-Moreno2, Judith Figueroa Ramírez3 Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá. [email protected]
1. Grupo en Ciencia y Tecnología Apícola -AYNI- Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia 2. Profesora asociada, Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos -ICTA- 3. Profesora asociada, Grupo en Ciencia y Tecnología Apícola -AYNI- Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia * Autor a quien se debe dirigir la correspondencia: [email protected]
2.1 Resumen
Con el interés de identificar y catalogar mieles de mielato de roble de la zona andina oriental, fueron recolectadas 74 mieles de apiarios de 20 municipios con actividad apícola en regiones cercanas a masas boscosas de roble. Se determinó para las mieles, la calidad microbiológica, el perfil aromático utilizando nariz electrónica y 12 parámetros fisicoquímicos. Teniendo en cuenta el índice que categoriza las mieles de mielato de acuerdo al contenido de azúcares reductores, cenizas y pH, denominado como índice de kirkwood y considerando variables de importancia según la probabilidad de distribución multivariada de lambda de Wilkes para éste tipo de mieles, se determinó la clasificación entre mieles de mielato y mieles de otros orígenes botánicos. En cuanto al control de calidad, el 73.5% de las muestras cumplieron con los requisitos microbiológicos de acuerdo a la resolución 1057 de 2010 del Ministerio de la Protección Social. El modelo PLS-DA con variables de peso fisicoquímicas y perfil aromático identificó las muestras con origen botánico de mielato en el 47.7%, en tanto el índice de Kirkwood identifico con
56 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
éste origen al 75% de las muestras. Las mieles clasificadas como miel de mielato presentaron conductividad eléctrica de 10.3mS/cm, contenido de humedad de 16.41.4%, pH de 4.40.4, acidez total de 36.98.0meq/kg, cenizas de 0.450.3%, sólidos insolubles de 0.030.01%, rotación específica de (-0.7)(-10.6), glucosa más fructosa de 69.311.9% color de 88.723.9 mmPfund, hidroximetilfurfural de 4.13.4mg/kg y actividad diastasa de 25.628.1ND.
Palabras Clave: PLS-DA, composición fisicoquímica, perfil aromático, Kirkwood
Abstract
To identify honeydew honeys from Colombia, 74 samples of honeys were collected from 20 municipalities located in the eastern Andes where the beekeeping takes place close to oak woodlands. The microbiological quality, aromatic profile by means of an electronic nose and 12 physicochemical parameters were determined for the collected samples. To categorize the samples according to the botanical origin, chemical parameters as important as electrical conductivity over 0.8mS/cm were evaluated to designate the botanical group, also by the determination of the Kirkwood index, which contemplates the reducing sugars, ash and pH. 73.5% of the samples met the microbiological requirements according to resolution 1057 of 2010 of the Ministry of Social Protection. The model of PLS-DA, which included variables Wilk’s lambda from physicochemical and aromatic profile, classified 47.7% of the samples as honeydew honeys, while the Kirkwood index identified 75% of the samples with this botanical origin. Samples identified as honeydew honeys presented an electrical conductivity of 10.3mS/cm, moisture content of 16.41.4%, pH of 4.40.4, total acidity of 36.98.0meq/kg, 0.450.3% ash content, insoluble solids of 0.030.01%, specific rotation of (-0.7) (-10.6), 69.311.9% of glucose plus fructose, color of 88.723.9 mmPfund, 25.628.1ND of diastase activity and 4.13.4mg/kg of hydroxymethylfurfural.
Keywords: PLS-DA, chemical composition, aromatic profile, Kirkwood.
Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 57 Colombia
2.2 Introducción
Actualmente la miel de mielato de roble es comercializada en los departamentos de Boyacá, Cundinamarca y Santander gracias a su reciente reconocimiento e introducción en el mercado por parte de apicultores de las asociaciones correspondientes a éstos departamentos; no obstante sus características de identidad y autenticidad no se encuentran referenciadas en la norma para la miel nacional, razón que dificulta su catalogación por parte de los actores de la cadena apícola colombiana. Además de ser un producto apícola novedoso en el país, posee una importancia inherente a su origen botánico y entomológico puesto que proviene de masas boscosas, donde la presencia del robledal favorece el desarrollo de especies de menor porte (sotobosque), sin embargo durante 20 años aproximadamente, el roble ha sido una especie maderable de fácil comercio, lo cual ha incidido en que su aprovechamiento sea inadecuado en la mayoría de los casos, generando así un conflicto debido a la paulatina desaparición y el establecimiento de vedas a su explotación (Fernández, 1977; Calderón & Sánchez, 2011; Chamorro et al., 2011).
El mielato es un subproducto metabólico de las cochinillas (Stigmacoccus asper) que se nutren de savia, éste recurso se observa en forma de gotas pequeñas de un volumen variable cercano a 100ul (Golan, 2008), presenta un alto contenido de oligosacáridos y es utilizado por las abejas Apis mellifera para la producción de miel de mielato de roble (Quercus humboldtti). La composición del mielato varía de acuerdo a la fuente botánica, la especie del insecto y a las condiciones ambientales. En el roble la producción de éste recurso es evidenciada por una capa negra sobre la corteza formada por fumaginas; estos son hongos superficiales que se caracterizan por tener micelios oscuros y solamente se pueden desarrollar en presencia de grandes cantidades de mielato, que les sirve como medio de crecimiento (Barth 1970; Mibey 1997; Chamorro García, 2011; Chamorro et al., 2013;). En el primer estudio palinológico y entomológico de las mieles de la zonas muestreadas en éste estudio, Chamorro, Nates Parra y Kondo en el 2013 señalaron que el mielato de los bosques de roble constituye una fuente de azúcares para las abejas melíferas tan importante como el néctar en los paisajes andinos fragmentados de la Cordillera Oriental. 58 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
De acuerdo al análisis palinológico identificaron en 24 muestras, 2 mieles de mielato y 12 mieles con la presencia de fuentes botánicas como Brassica (Brassicaceae), Eucalyptus globulus Labill. (Myrtaceae), Weinmannia (Cunoniaceae), Asteraceae y Melastomataceae. En el este estudio del 2013, los autores indican que las abejas prefieren el néctar floral ante el mielato y según Barth (1970) la miel de mielato nunca se produce de forma pura y usualmente puede estar acompañado por porcentajes variables de miel floral, puesto que las abejas al mismo tiempo que recolectan mielato no dejan de visitar flores para recoger néctar (Chamorro et al., 2013).
Con el objetivo de aportar a la catalogación de la miel de mielato en Colombia se realizó la caracterización de su composición fisicoquímica y se evalúo el perfil aromático, el cual fue comparado con mieles de otro origen botánico. Este trabajo de investigación presenta las características propias de estas mieles, se compara con referencias internacionales para mieles de mielato, el índice de kirkwood y se realizó el estudio quimiométrico utilizando métodos estadísticos multivariados para la diferenciación de mieles de néctar y mieles de mielato.
2.3 Materiales y Métodos
2.3.1 Muestras de miel
Se seleccionaron apiarios de colmenas de Apis mellifera en áreas con presencia de bosques de roble previamente reconocidas en zonas ubicadas entre 2400 y 2800 msnm, en la vertiente occidental de la Cordillera Oriental de Colombia, en los departamentos de Boyacá, Cundinamarca y Santander. 74 muestras fueron colectadas de cosechas realizadas entre 2008 y 2011 de 3 asociaciones de apicultores, ASOAPIGAR, ASOAPIBOY y ASOAPICOM, quienes se ubican en los 20 municipios que se muestran en la tabla a continuación.
Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 59 Colombia
Tabla 2.1. Número de muestras recolectadas y regiones de origen
Departamento Municipio No. De muestras Belén, Boavita, Buenavista, Caldas, Chiquinquirá, Boyacá 40 Ráquira, San mateo, Soatá Tutazá, Pauna Cundinamarca Guacheta 4 Charalá, Piedecuesta, San Andres, Santa Bárbara, Santander 30 Cerrito, Concepción, Enciso, Malaga, Molagavita TOTAL 74
2.3.2 Control de calidad microbiológico
El control de calidad microbiológica se realizó para un grupo de 49 mieles, correspondientes a 39 mieles de mielato y 10 mieles florales, mediante recuentos microbiológicos de los grupos indicadores: mesófilos, mohos y levaduras, coliformes y anaerobios sulfito reductores bajo metodologías ICMF 2000. Así mismo se realizaron recuentos de Staphylococcus sp., como indicadores de contaminación por contacto directo con el manipulador y se estableció la presencia de los patógenos específicos Salmonella sp., Escherichia coli, Clostridium perfringens y Staphylococcus aureus.
2.3.3 Perfil aromático
El análisis de compuestos volátiles se realizó según la metodología propuesta por Zuluaga et al., 2011, con un equipo de nariz electrónica, Airsense Analytics GmbH PEN3 (Schwerin, Alemania), la cual comprende un arreglo de diez sensores de óxido metálico (MOS). La evaluación de las mieles se realizó con 3g con una estabilización del headspace de 20 min, a una temperatura de estabilización de 40 °C, medida por 150 segundos a un flujo de gas a la cámara de sensores de 60 ml/min. Los grupos de compuestos analizados por ésta metodología son descritos en la siguiente tabla (Tabla 2.2).
60 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
Tabla 2.2. Grupo de compuestos asociados a los sensores de óxido metálico (MOS) de la nariz electrónica
No. Sensor Grupo de Compuestos 1 W1C Compuestos aromáticos 2 W5S Amplio rango de compuestos, especialmente nitrogenados 3 W3C Compuestos aromáticos 4 W6S Principalmente hidrógeno 5 W5C Compuestos aromáticos y alifáticos 6 W1S Hidrocarburos de cadena corta 7 W1W Compuestos azufrados 8 W2S Alcoholes 9 W2W Compuestos azufrados y clorados 10 W3S Compuestos alifáticos de cadena corta Fuente: Zuluaga Dominguez, 2010
2.3.4 Análisis Fisicoquímicos
Se determinaron 12 parámetros fisicoquímicos de acuerdo a los métodos oficiales y de referencia.
Tabla 2.3. Parámetros fisicoquímicos y metodologías utilizadas para el análisis de mieles
Parámetro Método Referencia Equipo fisicoquímico Refractómetro de mesa 969.38 A.O.A.C, Humedad Refractometría ABBE (Euromex, 2012; Holanda) Bogdanov 2002, Conductividad eléctrica Conductimetría Bogdanov et al., Mettler Toledo, Suiza 1997 Bogdanov et al., pH Potenciometría 1997 Mettler Toledo, T70, Acidez libre y lactónica 962.19 A.O.A.C, Suiza Titulación y total 2012 920.181 A.O.A.C, Contenido de cenizas Gravimetría 2012 Contenido de minerales Equipo de absorción Espectroscopia de 968.08 A.O.A.C., (Na, K, Ca, Fe, Mg, Cu atómica AA 240 (Varian absorción atómica 2012 y Zn) Inc., EE.UU.) Sólidos insolubles NTC 1273
920.182 A.O.A.C, Polarímetro Polax-2L Rotación específica Polarimetría 2012 (Atago, Japón) 920.183 A.O.A.C, Azucares reductores Titulación -- 2012 Color Fotometría Fattori, 2004 Colorímetro Minolta Colorimetría CIE 1986 Espectrofotometro
Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 61 Colombia
triestímulo Hewlett- Packard 8453A 958.09 A.O.A.C, Actividad diastasa Espectrofotometría Espectrofotómetro 2012 (JASCO UV/VIS V 530, 980.23 A.O.A.C, Hidroximetilfulfural Espectrofotometría Japón) 2012
2.3.5 Análisis Estadístico
Se realizó estadística descriptiva para el análisis del control de calidad y los valores fueron comparados con la Resolución 1057 del 2010 del Ministerio de la Protección Social.
Se realizó una clasificación inicial de las muestras de acuerdo al contenido de conductividad eléctrica, el cual es descrito en la literatura como un parámetro de calidad y de autenticidad para las mieles de mielato con un valor superior a 0.8mS/cm (Bogdanov & Martin, 2002; Council of the European Union, 2002; International Honey Commission, 2008). Conforme a las agrupaciones se realizaron análisis de componentes principales (PCA), se determinaron variables de peso según Lambda de Wilks y se comprobó la clasificación de las muestras teniendo en cuenta el método estadístico supervisado de análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) utilizando como herramienta los programas estadísticos de MATLAB Y MINITAB.
Una vez establecida la clasificación de las muestras por origen botánico, se realizaron pruebas de hipótesis univariadas para los parámetros fisicoquímicos y el perfil aromático y se compararon las clases asignadas con el índice de Kirkwood (X). Este índice es hallado teniendo en cuenta el pH (x1), contenido de cenizas (x2) y rotación específica (X3) en la fórmula X= -8.3 x1 – 12.3 x2+ 1.4 X3. Aquellas muestras con un índice menor 73.1 son consideradas como mieles de mielato (Kirkwood et al., 1960; Kirkwood et al., 1961; Campos et al., 2003).
2.4 Resultados y discusión
2.4.1 Control de calidad microbiológico
Teniendo en cuenta la Resolución 1057 del 2010 del Ministerio de la protección social, los resultados indican que el 73.5% de las muestras cumplen con los requisitos exigidos 62 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia en las normas respectivas (Tabla 2.2). Aquellas muestras que no se encuentran dentro de los parámetros de la norma presentaron recuentos altos de mesófilos y hongos y levaduras.
Tabla 2.4. Resumen descriptivo de la calidad microbiológica y el cumplimiento acorde con la Resolución 1057 de 2010.
Miel de Máximo en el Máximo permitido Grupo Indicador Miel floral Mielato estudio (UFC/g) (UFC/g) Recuento de microorganismos 90% (9) 89.7% (35) 85x102 100 mesófilos Recuento de hongos y 2 80% (8) 74.4% (29) 21x10 100 levaduras Recuento de coliformes 100% Menos de 10 Menos de 10 Totales Recuento de coliformes Menos de 10 N.A fecales Recuento de Menos de 10 N.A Staphylococcus sp. Recuento de anaerobio- sulfito 100% Menos de 10 100 reductor Patógenos
Específicos Salmonella / 25 g 100% Ausencia Ausencia
Staphylococcus Ausencia N.A aureus/g Clostridium Ausencia N.A perfringens/g Total control de 80% (8) 71.8% (28) 73.5% (36) calidad *Frecuencia Relativa (Frecuencia Absoluta), N.A: No Aplica
Las mieles de mielato presentaron 71.8% de cumplimiento, en tanto las mieles florales, el 80% de las muestras cumplió con los requisitos de la calidad microbiológica. Tanto las mieles de mielato como las mieles florales presentaron mayores frecuencias en el cumplimiento de mesófilos (89.7% y 90%) comparativamente con hongos y levaduras (80 y 74.4%) y todas cumplieron con los requisitos para coliformes totales y fecales. microorganismos anaerobio sulfito reductores y no se encontró la presencia de los Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 63 Colombia patógenos específicos Salmonella sp., E.coli, Staphilococcus aureus y Clostridium perfringens.
En las visitas de campo, entrevistas con los productores y observación del proceso de beneficio directamente en los apiarios, se evidenció una ligera dificultad en el proceso de beneficio por la composición propia de la miel de mielato, puesto que ésta tiende a ser más densa que otro tipo de mieles, lo cual requiere de un mayor esfuerzo físico por parte del apicultor para la extracción en la centrífuga manual y así mismo un periodo de tiempo ligeramente más largo para lograr extraer la miel de los cuadros lo mejor posible. Así mismo la adherencia del producto a las superficies requiere de los apicultores una mejor limpieza de los equipos. Teniendo en cuenta el tiempo de exposición de éste producto en el proceso de beneficio, la riqueza en azúcares inherente a este tipo de miel y las condiciones de bosque húmedo de su origen botánico, es posible considerar una mayor sensibilidad de éste producto sobre la presencia de hongos y levaduras, no obstante el hecho de que la mayoría de mieles no presenten estos mismos recuentos, indica que los apicultores requieren mejorar o estandarizar sus procesos productivos para lograr cumplir con la calidad esperada para un producto de gran potencial como el del presente estudio.
2.4.2 Perfil aromático
Se realizó el análisis de componentes principales (PCA) para las señales de los compuestos aromáticos analizados por los 10 sensores de la nariz electrónica, el cual mostró una explicación de la varianza del 85.26% a partir de dos componentes. La distribución de los grupos botánicos inicialmente no se observa de manera definida cuando se tienen en cuenta todos los sensores en el análisis (figura 2-1. A,B).
64 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
Figura 2-1: Análisis de componentes principales para los compuestos volátiles de mieles examinados por nariz electrónica
A. B. score plot loading plot
class 1 W3S 0.6 2.5 class 2
2 0.4 W6S 1.5
1 0.2
W2S 0.5 W3C W1S 0 W1C
0 W5C PC PC 2 - EV = 14.09%
PC PC 2 - EV = 14.09% W2W -0.5 -0.2 W5S -1 -0.4 -1.5 W1W -2 -0.6 -4 -2 0 2 4 6 8 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 PC 1 - EV = 71.17% PC 1 - EV = 71.17% Miel de mielato de roble Miel de otras fuentes Botánicas
2.4.3 Análisis Fisicoquímicos
Conductividad eléctrica, cenizas y contenido de minerales
El promedio para el parámetro de conductividad eléctrica en mieles de mielato fue de 1.0290.3 mS/cm y en mieles florales fue de 0.542mS/cm (figura 2-2). Entre estas mieles se encontraron diferencias significativas con la prueba de Mann-Withney con un p valor inferior a 0.01. El valor promedio obtenido en las mieles de mielato correspondió a los reportes de literatura de rangos entre 0.22 y 2.41mS (Accorti et al., 1986; Bogdanov, 2002; Tsigouri et al. 2004). En la norma de calidad para miel de abejas de la Unión Europea, la conductividad mínima en mieles de mielato es de 0.8 mS/cm, de tal forma las mieles de mielato colectadas en la zona andina oriental de Colombia cumplen con éste parámetro diferencial en mieles con este origen botánico.
Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 65 Colombia
Figura 2-2: Conductividad eléctrica según el origen botánico y comparación con el límite europeo para mieles de mielato mS/cm 2,5
2,0
1,5 a
1,0 b 0,5
0,0 Mielato de Roble Otras fuentes Origen botánico de la miel
Valor mínimo para corresponder a miel de mielato según el límite europeo : 0,8 mS/cm (a,b) p<0,01, Diferencias significativas halladas por prueba U de Mann-Whitney
En el contenido de cenizas se presentaron valores por lo general más altos en mieles de mielato de roble, con un promedio de 0.45% (figura 2-3). Este resultado se encontró de acuerdo con los valores reportados en la literatura y con el límite recomendado por Unión Europea de un máximo de 1% (Lachman et al., 2007; Bogdanov, Haldimann, et al. 2007; Pisani, 2008; Pohl 2009; Bogdanov 2009). Para mieles en el que su origen botánico es el néctar floral se reportan valores entre 0.1–0.3%, rango para el cual las mieles de origen floral en éste estudio, presentaron valores semejantes con un promedio de 0.28%.
66 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
Figura 2-3: Contenido de cenizas según el origen botánico y comparación con la norma europea de calidad para miel de abejas
% 1,2
1,0
0,8 a
0,6
0,4 b
0,2
0,0 Mielato de Roble Otras fuentes Origen botánico de la miel
Valor máximo para corresponder a miel de mielato según el límite europeo : 1% (a,b) p=0,04, Diferencias significativas halladas por prueba de Mann-Whitney
El contenido de minerales en las mieles de mielato de roble colombianas se encontró entre 1.7 y 1108 mg/kg (K:1108.4mg/kg, Na:145mk/kg, Ca:95.9 mg/kg, Fe: 6.86 mg/kg, Mg:62.3 mg/kg, Cu:1.75mg/kg, Zn:17.4mg/kg), donde el calcio fue el único mineral que se encontró con un valor promedio mayor en mieles de otro origen botánico que en mieles de mielato, con 110.9mg/kg y aunque no se presentaron diferencias significativas en éste estudio, éste tipo de diferencias con mieles de mielato ya ha sido reportado en la literatura (Lachman J., 2007). Los minerales analizados en éste estudio sobre este tipo de mieles, presentaron valores dentro de los rangos reportados en la literatura entre 1.07 y 4023 mg/kg (Hernández et al., 2005; Pisani, 2008; Pohl 2009). La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura -FAO-, en la revisión del año 2000 del Codex Alimentarius, indica que el contenido de potasio es mayor en mieles de mielato que en mieles florales; esta proporción se encontró de igual manera en éste estudio con diferencias significativas (figura 2-4).
Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 67 Colombia
Figura 2-4: Contenido de minerales según el origen botánico de las mieles de la zona andina mg/kg mg/kg 2000,0 220,0 a a 1800,0 200,0 1600,0 180,0 1400,0 160,0 a 140,0 1200,0 a b 120,0 1000,0 b 100,0 a 800,0 a 80,0 600,0 60,0 400,0 40,0 a 200,0 b 20,0 a b a b 0,0 0,0 Mielato Otras K Na Ca Mg Zn Fe Cu de Roble fuentes Mielato Otras fuentes
(a,b) p<0,01, Diferencias significativas halladas por prueba U de Mann-Whitney (a,b) p<0,01, Diferencias significativas (a,b) p<0,01, Diferencias significativas halladas en Fe por prueba t de Student halladas por prueba U de Mann-Whitney (a,a) p>0,05, Sin diferencias significativas halladas por prueba U de Mann-Whitney La conductividad está relacionada fundamentalmente con el contenido de sales minerales, ácidos orgánicos, proteínas y posiblemente con compuestos como azúcares (Crane, 1975), de tal forma cuando estos parámetros son mayores, la conductividad es mayor (Bogdanov et al., 1997; Bogdanov et al. 2000). Esta relación se encontró igualmente en este estudio, debido a que el contenido de estos parámetros fue mayor en mieles de mielato.
pH y Acidez
Las mieles de mielato presentaron valores de pH de 4.4, acidez lactónica de 0.6meq/kg, acidez libre de 36.1meq/kg y acidez total (36.9meq/kg), en tanto las mieles de otro origen botánico presentaron un pH de 4.0, acidez libre de 29.6meq/kg, acidez total de 30.5meq/kg y mayor acidez lactónica (0.8meq/kg) con respecto a las mieles de mielato, aunque no con diferencias significativas (figura 2-5).
10,010,0 10,0 10,0 9,09,0 9,0 9,0 8,08,0 8,0 8,0 7,07,0 7,0 7,0 10,06,06,0 6,0 6,0 5,09,0 aa 5,0 a a 5,0 bb b 5,0 b 4,04,08,0 4,0 4,0 3,03,07,0 3,0 68 Estudio e identificaci3,0 ón de características de composición y bioactividad propias 2,02,06,0 2,0 a 2,0 a a a de miel de mielato de Apisa mellifera, recurso valioso del corredora de robles a 1,0 1,01,05,0 b 1,0 0,00,04,0 0,0 0,0 nativos de Colombia 3,0 pHpH Acidez lactónicapH (meq/kg) Acidez lactónicapH (meq/kg) Acidez lactónica (meq/kg) Mielato Otras fuentes 2,0 10,010,0MielatoMielato10,010,0 Otras fuentes 10,0a 10,0 10,010,0Mielato10,0 Otras fuentes 10,0 Figuraa 2-5: Acidez lactónica y pH según el origen botánico de las mieles de la zona (a,b)(a,b) P<0,01,P<0,01, DiferenciasDiferencias9,09,0 significativas significativas9,0 enen pHpH porpor pruebaprueba(a,b) de Mann P<0,01,-Whitney Diferencias9,0 significativas9,0 en pH por prueba(a,b) de Mann P<0,01,-Whitney Diferencias9,09,0 significativas en pH por prueba de Mann-Whitney 1,0 (a,a)(a,a) P>0,05,P>0,05, Sin Sin diferencias diferencias significativas significativas9,0 enen A.A. lactónicalactónica(a,a) porpor pruebaP>0,05, de Sin Mann diferencias-Whitney9,0 significativas en A. lactónica(a,a) por prueba P>0,05, de Sin Mann diferencias-Whitney significativas9,0 en A. lactónica por prueba de Mann-Whitney9,0 0,0 8,08,0 8,08,0 8,0 8,0 andina8,08,0 8,0 8,0 pH 7,07,0 7,07,0 Acidez lactónica (meq/kg)7,0 7,0 7,07,0 7,0 7,0 10,06,06,0Mielato10,06,06,0 Otras fuentes 10,06,0 6,0 6,06,0 6,0 6,0 (a,b) P<0,01, Diferencias5,05,09,0 5,05,0 significativas9,0 en apH por pruebaa de Mann-Whitney5,09,0 5,0 aa a 5,05,0 5,0 aa a a (a,a) P>0,05, Sin diferencias significativas en A. lactónica por pruebab de bMann5,0-Whitney bb b bb b 5,0 b 4,04,08,0 4,04,08,0 4,08,0 4,0 4,04,0 4,0 4,0 3,03,07,0 3,03,07,0 3,07,0 3,0 3,03,0 3,0 3,0 2,02,06,0 2,02,06,0 2,06,0 2,0 aa aa 2,02,0 2,0 aa a 2,0 aa a a a aa aa a aa a a 5,0 5,0 a a 1,0 1,0 a 1,0 1,01,0 1,01,0 b b 1,05,0 b 1,0 1,0 1,0 0,00,04,0 0,00,04,0 0,04,0 0,0 0,00,0 0,0 0,0 3,0 3,0 pH pH 3,0 Acidez lactónicaAcidez lactónicapHpH (meq/kg)(meq/kg)pH (meq/kg)(meq/kg) AcidezAcidez lactónica lactónicaAcidez lactónica pH(meq/kg)pH (meq/kg) pH(meq/kg) AcidezAcidez lactónica lactónicaAcidez lactónica pH(meq/kg) (meq/kg) (meq/kg) Acidez lactónica (meq/kg) MielatoMielatoOtras fuentesOtras fuentes Mielato Otras fuentes 2,0 2,0 MielatoMielatoOtras2,0 fuentesOtras fuentes a MielatoMielatoa OtrasOtras fuentesfuentes a MielatoMielatoOtras fuentesOtras fuentes Mielato Otras fuentes (a,ba) p<0,01(a,b)a, Diferencias P<0,01, Diferencias significativas significativas en pH por pruebaen pH por(a,b) de aprueba Mann P<0,01,-Whitney de Mann Diferencias-Whitney significativas en pH por prueba de Mann-Whitney ((a,ba,b)) p<0,01p<0,01(a,b)(a,b),, DiferenciasDiferencias P<0,01,P<0,01, Diferencias significativas significativas en pH porpor pruebaenpruebaen pHpH porpor(a,b) (a,b) dede prueba prueba MannMann P<0,01,P<0,01,--Whitney dede MannMann DiferenciasDiferencias--WhitneyWhitney significativas significativas en en pH pH por por prueba prueba de de(a,b Mann Mann) p<0,01-Whitney-Whitney(a,b), Diferencias P<0,01, Diferencias significativas significativas en pH por pruebaen pH por(a,b) de prueba Mann P<0,01,-Whitney de Mann Diferencias-Whitney significativas en pH por prueba de Mann-Whitney 1,0 1,0 (a,a) p>0,05(a,a), Sin P>0,05, diferencias Sin diferencias significativas significativas en A. lactónica en A.(a,a) por lactónica prueba P>0,05, por de Sin pruebaMann diferencias-Whitney de Mann significativas-Whitney en A. lactónica por prueba de Mann-Whitney ((a,aa,a)) p>0,05p>0,05(a,a)(a,a),, SinSin P>0,05,P>0,05, diferenciasdiferencias Sin diferencias significativas significativas en1,0 A. lactónica en A.A.(a,a)(a,a) porpor lactónicalactónica prueba prueba P>0,05,P>0,05, porpor dede Sin Sinprueba pruebaMannMann diferenciasdiferencias--WhitneyWhitney de de Mann Mann significativas significativas--WhitneyWhitney en en A. A. lactónica lactónica por( pora,a prueba) prueba p>0,05(a,a) de de, MannSin Mann P>0,05, diferencias-Whitney-Whitney Sin diferencias significativas significativas en A. lactónica en A.(a,a) por lactónica prueba P>0,05, por de Sin pruebaMann diferencias-Whitney de Mann significativas-Whitney en A. lactónica por prueba de Mann-Whitney 0,0 0,0 0,0 pH pH Acidez lactónicaAcidez lactónicapH (meq/kg) (meq/kg) Acidez lactónica (meq/kg) MielatoMielatoOtras fuentesOtras fuentes Mielato Otras fuentes (a,b) p<0,01(a,b), Diferencias P<0,01, Diferencias significativas significativas en pH por pruebaen pH por(a,b) de prueba Mann P<0,01,-Whitney de Mann Diferencias-Whitney significativas en pH por prueba de Mann-Whitney (a,a) p>0,05(a,a), Sin P>0,05, diferenciasEn Sinlas diferencias significativas mieles significativas en de A. lactónica mielato en A.(a,a) por lactónica prueba P>0,05, de por de ro Sin pruebaMannble diferencias-Whitney de colombianas, Mann significativas-Whitney en A. selactónica encontró por prueba demayor Mann-Whitney acidez libre y total comparada con mieles de otro origen botánico, mostrando diferencias significativas (Figura 2-5). En mieles de origen floral, la acidez total es un parámetro que presenta generalmente mayores valores (Gürel et al., 1998; Primorac, Angelkov, Mandić, et al., 2009), no obstante Ruoff en el 2006, indica que algunas veces las mieles de néctar pueden presentar menores valores comparativamente con mieles de mielato. La acidez según los límites europeos presenta valores menores a 50 meq/1000 g (Bogdanov et al, 2000), límite dentro del cual se encontraron las mieles de la zona andina.
Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 69 Colombia
Figura 2-6: Acidez libre y total según el origen botánico y comparación con el límite europeo para mieles de mielato
meq/kg 70,0 60,0
50,0 a a 40,0 b b 30,0 20,0 10,0 0,0 Acidez libre Acidez total Mielato Otras fuentes
Valor máximo para corresponder a miel de mielato según el límite europeo : 50 meq/kg (a,b) p<0,01, Diferencias significativas halladas por prueba U de Mann-Whitney Al igual que en la conductividad eléctrica y contenido de cenizas, el contenido de acidez total y pH fueron mayores en mieles de mielato (figuras 2-3, 2-5, 2-6), lo cual se encuentra acorde con la literatura internacional, donde se presentan rangos de pH entre 3.6 y 6.91, acidez lactónica entre 0 y 9.7 meq/kg, acidez libre entre 14.2 y 52.5 y acidez total de 62.71 (Persano et al., 1995; Bogdanov, 2009, Karkacier et al., 1992; Persano et al., 1995; Karkacier et al., 1998; Sanz et al., 2005; Pérez et al. 2007; Vela et al. 2007; González Lorente, De Lorenzo Carretero, & Pérez Martín, 2008; Bentabol Manzanares et al., 2011),
Color En las mieles de mielato de roble se observaron colores oscuros con algunos visos rojizos y/o vino tinto brillante correspondientes a un promedio 88.7 mm en la escala Pfund, el cual se refiere a colores ámbar. En las mieles de diferente origen botánico también se encontró un promedio correspondiente a colores ámbar con un promedio un ligeramente más bajo de 73.6mmPfund.
70 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
Figura 2-7: Color en la escala Pfund de mieles de diferente origen botánico mmPfund 160,0 140,0 120,0 a
100,0 b 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 Mielato de Roble Otras fuentes Origen botánico de la miel
(a,b) p<0,01, Diferencias significativas por prueba U de Mann-Whitney
Como sucede con los anteriores parámetros fisicoquímicos, el color está correlacionado con el contenido de minerales, y así mismo el valor promedio en la escala milimétrica de Pfund es más alto en mieles de mielato, presenta diferencias significativas (p<0.01) con respecto a las mieles florales. Este resultado sugiere un mayor contenido de minerales en mieles más oscuras como se reporta a nivel internacional (Anklam 1998; Fernández- Torres et al., 2005; Kasperová et al., 2012). .
Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 71 Colombia
Figura 2-8: Color de acuerdo a las coordenadas triestímulo de CIELAB
L* 80 mS/cm 60 2,5 40 2,0 hab a* 20
1,5 0
1,0
0,5
Cab b* 0,0 ΔEab* = 25.2 Mielato deMielato Roble de Roble OtrasOtras fuentes fuentes Origen botánico de la miel
Diferencias significativas en L*,a* por prueba de Mann-Whitney con p<0,01 Diferencias significativas en hab por prueba de t de Student p<0,01 p>0,01. Sin diferencias significativas en b* y Cab por prueba de Mann-Whitney
De acuerdo a la colorimetría triestímulo (CIE, 1986), las mieles de mielato presentaron en promedio una menor claridad (L*:42.1), mayores matices rojo (a*:14.6) y amarillo (b*:24.07), una cromaticidad o Cab* de 33.7 y tono o hab de 65.1; que en mieles de otras fuentes como el néctar, con una mayor claridad (L*:65.5) y menores matices rojo (a*:5.4) y amarillo (b*:22.9) una cromaticidad de 30.4 y una tonalidad de 76.04. La diferencia en la percepción del color entre miel de mielato y mieles de otras fuentes botánicas (ΔEab*) presentó un valor de 25.2, lo cual indica que el ser humano puede fácilmente diferenciar estas mieles por el color. Las magnitudes correspondientes a la respuesta visual en mieles de mielato fueron compatibles con otros estudios con matices de a* entre 0.17 y 23.08 y de b* entre -4.8 y 36.1 (Terrab et al., 2003; Ortiz Valbuena, 2005), no obstante la claridad en mieles de mielato de robles colombianas fue mayor que la reportada en los estudios presentados por Ortíz y Terrab y compañía con valores entre 4.5 y 23.7.
Azúcares y rotación específica
La miel de mielato presentó 6.9% de contenido de sacarosa y 29.6% de glucosa, valores semejantes a los econtrados en mieles con otro origen botánico con 6.7% de sacarosa y 72 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
30.8 de glucosa; mientras que el contenido de fructosa presentó diferencias significativas, siendo mayor el promedio de fructosa en mieles de mielato con 41.5% y menor en mieles de otro origen botánico con 34.7%.
Figura 2-9: Contenido de glucosa, fructosa y sacarosa de según el origen botánico
% 50,0 a 45,0 b a 40,0 a 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 a a 5,0 0,0 Sacarosa Glucosa Fructosa Mielato Otras fuentes
(a,b) p=0,01, Diferencias significativas en fructosa por prueba de Mann-Whitney (a,a) p>0,05, Sin diferencias significativas en sacarosa y glucosa por prueba de Mann-Whitney
Glucosa + Fructosa. p=0.624, Glucosa/Fructosa. p<0.01,g
En cuanto a la relación entre glucosa y fructosa (Fructosa/Glucosa) se encontró un promedio en mieles de mielato un promedio de 1.3 con diferencias significativas (p<0.01) frente a mieles de otros origenes botánicos con un promedio de 1.1. En los límites europeos con respecto al contenido glucosa mas fructosa esta especificado un mínimo 45g/100g para mieles de mielato (Council of the European Union 2001), límite para el cual las mieles de este estudio se encuentran por encima con un valor promedio de 69.2g/100g.
El contenido de azúcares reductores fue de 66.68.7% y de azúcares totales de 71.46.7% en mieles de mielato y de 72.16.7% de azúcares reductores y 85.46.4% de azúcares totales en mieles con otras fuentes botánicas (figura 2-10).
Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 73 Colombia
Figura 2-10: Contenido de azúcares reductores y totales según el origen botánico y comparación con el límite europeo para mieles de mielato
% 100,0 90,0 b a a 80,0 a 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 Azúcares Reductores Azúcares Totales Mielato Otras fuentes Valor mínimo para corresponder a miel de mielato según el límite europeo : 45 meq/kg (a,b) p=0.02, Diferencias significativas en A. Totales por prueba t de Student (a,a) p=0,1 Sin diferencias significativas en A. Reductores por prueba t de Student La miel de mielato contiene menores cantidades de glucosa (Siddiqui, 1970; Doner 1977; Moreira et al., 2001) y fructosa y mayores valores de sacarosa aparente (Tseko, 2008; Thrasyvoulou, 2008). Estos resultados son semejantes a lo reportado en la literatura con respecto al menor contenido de azúcares reductores y totales, mas no con los contenidos de fructosa, glucosa y sacarosa. Esto puede deberse a que como lo indica Chamorro en el 2013, las abejas tienen diversas fuentes de pecoreo, preferiblemente de fuentes florales, así la miel de mielato puede resultar mezclada con otras fuentes e influir en el contenido de carbohidratos.
En cuanto a la rotación específica se encontraron diferencias significativas entre el origen botánico de las muestras con valores superiores para las mieles de mielato de roble (- 0.7) y menores para las mieles de otras fuentes botánicas (-6.9). En la literatura la rotación específica en mieles de mielato se encuentra entre -7.8 y 30 y usualmente se indican valores positivos para estas mieles (Kirkwood et al, 1960; Kirkwood et al, 1961; Sacchi et al 1963; Battaglini et al. 1973; Piazza et al, 1991; Persano Oddo et al., 1995; Persano Oddo et al., 1997).
74 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
Figura 2-11: Rotación específica de muestras de miel con diferente origen botánico
35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 a 10,0 5,0 b 0,0 -5,0 -10,0 -15,0 -20,0 Mielato de Roble Otras fuentes Origen botánico de la miel (a,b) p=0,01. Diferencias significativas por prueba de Mann-Whitney
Los valores positivos de rotación especifica corresponden a una orientación dextrorotatoria, ésta orientación se atribuye en las mieles de mielato al alto contenido y amplia variedad de oligosacáridos, entre otros melecitosa y elrosa (Foldhazi 1994; Ivanov, 1986), los cuales son fuertemente dextrorrotatorios. La rotación positiva se encuentra también en mieles adulteradas y no debe confundirse con mieles de mielato, por ello deben tenerse en cuenta otros parámetros fisicoquímicos aquí presentados que fácilmente las pueden diferenciar.
Humedad
El contenido de humedad de las mieles procedentes de la zona andina no presentó diferencias significativas en el origen botánico de mieles, con un promedio de 16.6% en mieles de mielato y de 17.1% en mieles de otras fuentes botánicas. Este contenido coincide con lo demostrado en otros estudios de mieles de mielato (Bacandritsos, 2006; Marghitas et al. 2008).
Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 75 Colombia
Figura 2-12: Contenido de humedad según el origen botánico y comparación con el límite europeo para mieles.
% 25,0 22,5 20,0 a a 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0 2,5 0,0 Mielato de Roble Otras fuentes Origen botánico de la miel
Valor máximo recomendado por los límites europeos para mieles: <20% (a,a) p=0,125, Sin diferencias significativas por prueba t de Student
Las mieles de mielato según la literatura presentan un rango de 13-23.3% en el contenido de humedad, el cual es usualmente similar a mieles de origen floral, sin embargo es frecuente encontrar en mieles de mielatos, contenidos bajos (Bacandritsos, 2006; Marghitas et al. 2008).
Según los análisis univariados de los parámetros fisicoquímicos se encontraron diferencias significativas entre mieles de mielato y mieles de otras fuentes botánicas de acuerdo a las variables de conductividad eléctrica; contenido de cenizas y minerales (K, Na, Zn, Fe y Cu); pH, acides libre y total; color en la escala Pfund y en las variables de colorimetría triestímulo L*, a* y hab; contenido de fructosa y de fructosa/glucosa; azucares totales y rotación específica. Dentro estos parámetros en las mieles de mielato, las variables que presentaron un promedio significativamente menor con respecto a las mieles de otro origen botánico fueron el contenido de azúcares totales y las variables de colorimetría triestímulo L* y hab. Otras variables analizadas para éstas mieles, pero que debido a la ausencia de diferencias significativas, no son recomendadas para un análisis discriminante, son el contenido de los minerales Ca y Mg, el contenido de sacarosa, glucosa, glucosa más fructosa y azucares reductores, acidez lactónica, las variable de triestímulo b* y Cab* y el contenido de humedad. 76 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
A continuación se encuentran los análisis multivariados mediante el uso de análisis de componentes principales teniendo en cuenta los parámetros fisicoquímicos (Figura 2-13 A y B). El PCA muestra una distribución con una varianza explicada del 82% a partir de 7 componentes. Dentro de ésta distribución los componentes 1 y 2 explican el 46.27% de la varianza y se observan grupos definidos por el origen, correspondientes a las mieles de mielato (Figura 2-13 A) y a las mieles florales (Figura 2-13 B).
Figura 2-13: Análisis de componentes principales para los análisis fisicoquímicos de mieles según su origen botánico
A. B. score plot loading plot
class 1 A. lactónica 4 0.1 Humedad class 2 Fru/Glu 3 0 RE K A. total 2 Cenizas A. libre Sac Cu CE AD -0.1 Color 1 pH Na Ca Az. Total 0 -0.2 Fe Mg Az. Reductor
PC PC 2 - EV = 14.82% Zn
PC PC 2 - EV = 14.82% -1 -0.3 -2 Glu
-3 -0.4 G:W Fru Glu +Fruc -0.3 -0.25 -0.2 -0.15 -0.1 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 -6 -4 -2 0 2 4 PC 1 - EV = 33.11% PC 1 - EV = 33.11% Miel de mielato de roble Miel de otras fuentes Botánicas Variables en loading plots: CE:Conductividad eléctrica, cenizas, minerales (K, Na, Ca, Fe, Mg, Cu y Zn), pH, A. lactónica:Acidez lactónica, A. libre: Acidez libre, A. Total: Acidez total, Sac:Sacarosa Rotación específica, Glu:Glucosa, Fru:Fructosa, Glu+Fru:Glucosa más Fructosa, G:W Glucosa/Contenido de humedad, Az.Reductor: Azucares reductores, Az. Total: Azucares totales, RE: Rotación Específica, AD: Actividad Diastasa, Color y Humedad.
Las variables que explican la agrupación de las mieles de mielato son precisamente aquellas que en los análisis univariados presentaron diferencias significativas y un mayor contenido en estas mieles. Estas variables son la conductividad eléctrica, contenido de cenizas y los minerales K, Cu, Na, Fe y Zn, pH y acidez libre y total, color y fructosa/glucosa. Una variable que no presentó diferencias significativas pero que si presenta un mayor contenido en mieles de mielato, es el Mg (figura 2-13 A, B), motivo por el cual este mineral se encuentra en el cuadrante donde se observan las mieles de mielato. Las mieles de otro origen botánico son explicadas por las variables con diferencias significativas por su menor contenido mayor contenido de fructosa y azúcares Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 77 Colombia totales. Las variables que mejor explican la variación fueron identificadas por Lambda de Wilks, donde la conductividad eléctrica, acidez lactónica, el contenido de minerales, glucosa y sacarosa y el indicador de fructosa/glucosa, explican la distribución en un PCA con cinco componentes, una varianza del 80% y de los cuales los componentes 1 y 2 explican el 47.93%.
Generalmente se presenta una correlación entre el contenido de cenizas, conductividad, pH, acidez y color y como se indicó anteriormente, las mieles más oscuras son las que tienden a presentan un mayor contenido de éstos parámetros, como las mieles de mielato de este estudio; las cuales se encuentran asociadas en los mismos cuadrantes en el análisis de componentes principales.
Al determinar las variables con mayor peso por la prueba de Lambda de Wilks sobre los parámetros fisicoquímicos que presentaron diferencias significativas, se encontró que las variables que mejor explican la distribución de las muestras fueron la conductividad eléctrica, el contenido de cenizas, pH, acidez libre y rotación específica. Estas fueron utilizadas para realizar un PCA que con un solo componente, se logró explicar el 70.5% de la varianza (figura 2-14 A, B). En el score plot se observa una división evidente entre el origen botánico, debido a que las variables seleccionadas presentan un mayor contenido en mieles de mielato y por ello se ubican en cuadrantes diferentes con respecto a las mieles de otro origen botánico, además porque éstas últimas presentan un menor contenido de éstas variables.
78 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
Figura 2-14: Análisis de componentes principales para los análisis fisicoquímicos de variables de peso Lambda de Wilks con diferencias significativas en el origen A. B.
score plot loading plot
-0.32 A. libre
2 -0.34
1 -0.36
-0.38 0 -0.4 -1 -0.42
-2 PC PC 1 - EV = 70.5% PC PC 1 - EV = 70.5% -0.44 pH
-3 -0.46 CE
-0.48 -4 class 1 RE class 2 Cenizas -0.5 0 10 20 30 40 50 60 1 2 3 4 5 samples variables
Miel de mielato de roble Miel de otras fuentes Botánicas Variables en loading plots: CE:Conductividad eléctrica, cenizas, pH, A. libre: Acidez libre, RE: Rotación Específica
Considerando una matriz de 44 muestras, se identificaron nuevamente las variables de peso por lambda de Wilks, esta vez teniendo en cuenta el análisis de perfil aromático junto con los parámetros fisicoquímicos. Las variables identificadas con mayor importancia en la explicación de la distribución de los datos, fueron la conductividad eléctrica, el contenido de cenizas y sensores de nariz electrónica W1C, W5C y W5S. Estas variables analizadas en un PCA presentaron a las mieles de mielato en un grupo explicado principalmente por la conductividad eléctrica y el contenido de cenizas, debido a que sus valores promedio son mayores en estas mieles; y por los sensores, en especial de compuestos nitrogenados (W5S) (figura 2-15 A,B). Por otra parte las mieles de diferente origen botánico, forman un grupo más compacto explicado por su baja conductividad eléctrica y bajo contenido de cenizas y por los sensores que determinan compuestos aromáticos y alifáticos. Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 79 Colombia
Figura 2-15: Análisis de componentes principales para los análisis fisicoquímicos y análisis de compuestos volátiles por nariz electrónica A. B.
score plot loading plot
0.6 2.5 class 1 CE Cenizas class 2 2 0.5
1.5 0.4 W5C
1 W1C 0.3
0.5 0.2 0
0.1 PC PC 2 - EV = 22.18% -0.5 PC 2 - EV = 22.18% 0 -1
-1.5 -0.1
W5S -0.2 -2 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 PC 1 - EV = 63.8% PC 1 - EV = 63.8% Miel de mielato de roble Miel de otras fuentes Botánicas Variables en loading plots: CE:Conductividad eléctrica, cenizas, W1C:Compuestos aromáticos,W5C:Compuestos aromáticos y alifáticos, W5S:Amplio rango de compuestos, especialmente nitrogenados
Con el PCA exclusivamente del perfil aromático se logró una explicación con un solo componente de máximo 74% y con solamente los análisis fisicoquímicos se logró un máximo de 82%, en tanto el uso de los parámetros fisicoquímicos junto con el perfil aromático en el análisis de PCA permitió una mayor explicación de la distribución grupal de las muestras del 85.4% con dos componentes principales.
De acuerdo a las variables de peso identificadas por Lambda de Wilks se evaluó la clasificación de las muestras por PLS-DA, para el cual se obtuvo una tasa de no error en el entrenamiento de 1 y en la validación de 1. Este análisis comparado con el indice de kirkwood, presentó un valor de asignación grupal de mieles de mielato semejante cuando son identificadas inicialmente con éste origen botánico, sin embargo según el índice de kirkwood, 14 de las muestras planteadas inicialmente como mieles florales, no tendrían éste origen, sino que serían mieles de mielato (tabla 2.5).
80 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
Tabla 2.5. Clasificación de mieles de acuerdo a PLS-DA e indicador de Kirkwood.
Predicha por Predicha por Índice de Clase entrenamiento validación Kirkwood Miel de Miel Miel de Miel Miel de Miel Real mielato floral mielato floral mielato floral Miel de mielato 21 0 21 0 19 2 Miel floral 0 23 0 23 14 9
El indice de Kirkwood presento un portentaje de clasificación acertado de muestras de mieles de mielato en 19 de 21 muestras, correspondiente al 90% con respecto a las clases determinadas por PLS-DA y éste modelo obtuvo 21/21, es decir un 100%. Teniendo en cuenta los primeros hallazgos palinológicos y entomológicos reportados para las mieles de mielato de roble colombianas, donde sugieren un mayor porcentaje de muestras tipo mezcla entre mielato y diferentes fuentes botánicas (Chamorro et al., 2013); es probable que aquellas muestras confundidas por el índice de Kirkwood sean mezclas de éstas fuentes. Al tener en cuenta el perfil aromático y parámetros fisicoquímicos son identificadas estas mieles con una tasa de no error de 1, lo cual puede indicar el peso del origen botánico sobre la muestra y por ello son semejantes los resultados de clasificación entre la mieles originalemente planteadas como provenientes de mielato.
De acuerdo a la clasificación determinada por PLS-DA, a continuación se presenta la tabla con el promedio y la desviación estándar de los parámetros fisicoquímicos determinados en mieles de mielato de roble y son comparados con los rangos reportados para mieles de mielato en general.
Miel de Mielato de Roble (Quercus humboldtti) de la Zona Andina Oriental de 81 Colombia
Tabla 2.6. Características fisicoquímicas de mieles de mielato de roble de la zona andina oriental de Colombia.
Referencias Miel de Miel de mielato de roble mielato Parámetro Unidad Media ± Des.Est Mínimo Máximo Conductividad mS/cm 1.0 ± 0.3 0.22 2.41 eléctrica % (Base Cenizas 0.451 ± 0.272 0.002 6.47 seca) Na mg/kg 145.038 ± 54.601 8.51 255,37 K mg/kg 1108.360 ± 702.305 333 4506.9 Ca mg/kg 95.993 ± 35.168 3.72 409 Fe mg/kg 6.869 ± 2.821 0.386 13.7 Mg mg/kg 62.300 ± 26.308 1.48 150 Cu mg/kg 1.753 ± 1.115 0.228 3.317 Zn mg/kg 17.410 ± 11.063 0.669 39.7 pH 4.391 ± 0.376 3.6 6.91 Acidez libre meq-Kg 36.123 ± 8.327 14.2 52.5 Acidez meq-Kg 0.565 ± 0.764 0 9.7 lactónica Acidez total meq-Kg 36.913 ± 8.044 7 62.71 mm Color 88.675 ± 23.906 28.89 150 Pfund L* 42.415 ± 3.666 4.455 23.7 a* 14.618 ± 2.107 0.17 23.08 b* 32.335 ± 4.390 (-4.79) 36.06 Cab 34.342 ± 4.002 Sacarosa % 6.862 ± 1.828 0 14 Glucosa % 29.696 ± 6.735 13.5 40.7 Fructosa % 41.472 ± 3.489 22.1 42.9 Glu +Fruc % 69.260 ± 11.957 35.7 79.3 Fru/Glu 1.371 ± 0.232 0.8 1.69 G:W 1.751 ± 0.347 Azúcares % 66.620 ± 8.775 55.73 84.75 Reductores Azúcares % 71.476 ± 6.723 66.47 84.75 Totales Rotación -0.699 ± -10.616 (-7.8) 30 Específica Humedad % 16.569 ± 1.461 13 23.27 Sólidos % 0.028 ± 0.013 0 0.09 Insolubles Actividad ND 25.632 ± 28.140 9 62.1 Diastasa HMF mg/kg 4.137 ± 3.391 0 58.8 Kirkwood 61.414 ± 14.563 43.58 70.77 Referencias: Persano et al., 1995; Mateo & Bosch-Reig, 1997; Gürel et al., 1998; Ohe et al., 2000; Bogdanov & Martin, 2002; Campos et al., 2003; Dinkov, 2003; Lazaridou et al.,2003; Sabatini & Barbattini, 2003; Terrab et al., 2003; Bogdanov et al., 2004; Sahinler & Gul, 2004; ; Persano Oddo & Piro, 2004; Sahinler & Gul, 2004; Tsigouri et al., 2004; Golob et al., 2005; Vorlová et al., 2005; Bacandritsos et al., 2006; Vargas, 2006; Bogdanov et al., 2007; Bogdanov & Gfeller, 2006; Bacandritsos et al., 2006; Bogdanov et al., 2007; Conti et al., 2007; Lachman et al.,2007; Bogdanov et al., 2008; Georgiev et al., 2008; Pisani et al., 2008; Bogdanov, 2009; Conti et al., 2007; International Honey Commission, 2008; Marghitas et al., 2008; Mića et al., 2008; Primorac et al., 2009; Bogdanov, 2009; Pohl, 2009; Primorac et al., 2009; Chudzinska & Baralkiewicz, 2010; Gallina et al., 2010; Bentabol et al., 2011; Vanhanen et al., 2011; Kasperová et al., 2012; Kędzierska-Matysek et al., 2013 82 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
Actualmente la norma técnica nacional no contempla lineamientos para la miel de mielato de roble colombiana debido a su reciente reconocimiento en el país; de manera que los resultados fueron comparados con los límites europeos ya que estos sugieren los valores de referencia para este tipo de mieles. Por otra parte las relaciones más divulgadas en la literatura con respecto a los parámetros fisicoquímicos se encontraron acorde con la conductividad eléctrica, contenido de cenizas y minerales y pH y acidez, debido a que los valores para mieles de mielato se mantuvieron más altos que en mieles de otras fuentes botánicas. La única relación que no se encontró acorde a lo usualmente reportado en la literatura, fue el contenido de sacarosa, glucosa y fructosa, debido a que en estas mieles se presentaron mayor contenido de glucosa y fructosa y menor contenido de sacarosa; sin embargo el contenido de azúcares reductores y totales, al igual que la rotación específica si fueron semejantes a lo usualmente reportado en mieles de mielato.
Agradecimientos
Los autores presentan agradecimientos a las asociaciones de apicultores de ASOAPIBOY, ASOAPIGAR y ASOAPICOM, al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural por la financiación del programa de investigación denominado Estrategias para establecer la denominación de origen de productos de las abejas en Colombia, del cual hizo parte éste estudio. A la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá y en particular al personal del Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y del laboratorio de Microbiología Veterinaria y de Zootecnia.
2.5 Referencias
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3. Valoración de propiedades bioactivas presentes en mieles de mielato de roble y mieles de origen floral de la región andina de Colombia
Bioactive properties of nectar honey and oak honeydew honey from the Andean zone of Colombia
M. Viviana Gamboa Abril1*, Judith Figueroa Ramírez2, Consuelo Díaz-Moreno3 Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá. [email protected]
1. Grupo en Ciencia y Tecnología Apícola -AYNI- Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia 2. Profesora asociada, Grupo en Ciencia y Tecnología Apícola -AYNI- Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia 3. Profesora asociada, Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos -ICTA- * Autor a quien se debe dirigir la correspondencia: [email protected]
3.1 Resumen
50 muestras de miel de mielato de roble y 30 mieles de néctar de abejas Apis mellifera fueron colectadas en la cordillera oriental para evaluar su bioactividad en cuanto a la capacidad antibacteriana, antioxidante y contenido de fenoles totales. La capacidad antibacteriana fue evaluada mediante la técnica de concentración mínima inhibitoria por microdilución en mieles con y sin actividad del compuesto peróxido de hidrógeno frente a siete cepas bacterianas de referencia ATCC: Escherichia coli, Salmonella enterica, Klebsiella pneumoniae, Kocuria rhizophila, Staphylococcus aureus, Bacillus subtillis y
90 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
Pseudomonas aeruginosa. Las propiedades antioxidantes fueron evaluadas por espectrofotometría de acuerdo al método de actividad antioxidante equivalente a Trolox (TEAC) y al contenido de fenoles totales por el método de Folin-Cicalteau. Las mieles de mielato de roble con todos sus compuestos activos presentaron medianas de CMI entre 10 y 20% y en mieles de mielato sin peróxido de hidrógeno, medianas de CMI entre 20 y 40%. Las mieles de néctar completas y sin actividad peróxido presentaron medianas de CMI entre 20 y 80%. La capacidad antioxidante de mieles de mielato de roble fue de 75.154.1mmol Trolox/100g miel y de mieles de néctar fue de 85.356.9 mmol Trolox/100g miel. El contenido de fenoles totales en mieles de mielato de roble fue de 67.623.7mg ácido caféico/g miel y en mieles de néctar fue de 34.617.6 7mg ácido caféico/g miel.
Palabras Clave: Actividad No peróxido, antibacterial, antioxidante, Folin-Cicalteau, TEAC
Abstract
50 samples of oak honeydew honey and 30 samples from nectar honeys produced by Apis mellifera were collected in the Andean region to assess the bioactive properties. The antibacterial capacity was assessed using the technique of minimum inhibitory concentration by microdilution in honeys with and without activity of the hydrogen peroxide compound, over seven ATCC reference strains: Escherichia coli, Salmonella enterica, Klebsiella pneumoniae, Kocuria rhizophila, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis and Pseudomonas aeruginosa. The antioxidant properties were evaluated by spectrophotometry according to the method of Trolox equivalent antioxidant activity (TEAC) and total phenol content by Folin-Cicalteau. In Oak Honeydew honeys the antibacterial capacity was found with MIC medians between 10 and 20% and when analyzed without peroxide activity, these honeys presented MIC between 20 and 40%. Nectar honeys with and without peroxide activity presented MIC medians between 20 and 80%. The antioxidant activity was found in oak honeydew honeys with values of 75.154.1mmol Trolox/100g honey and in nectar honeys of 85.356.9 mmol Trolox/100g Capítulo 3 91
honey. Content of total phenol was of 67.623.7mg caffeic acid/g of oak honeydew honey and of 34.617.6 7 mg caffeic acid/g of nectar honey.
Keywords: Non peroxide activity, antibacterial, antioxidant, Folin-cicaulteau, TEAC
3.2 Introducción
Las abejas Apis mellifera entre sus recursos botánicos utilizan el néctar de las flores y el mielato (subproducto metabólico dulce de insectos fitófagos) para la elaboración de la miel. La única miel de mielato hasta ahora reportada en el país, es la miel de mielato de roble (Quercus humboldtti), la cual se produce en áreas con masas boscosas ubicadas en la cordillera oriental. El recurso botánico que las abejas colectan para la elaboración de éste tipo de miel es resultado de la extracción de la savia por parte del insecto Stigmacoccus asper (Chamorro et al., 2013). Las características composicionales y cualidades sensoriales de las mieles pueden variar dependiendo de la fuente botánica y de igual manera sus propiedades bioactivas son influenciadas por el recurso (Bogdanov, 1997; Persano Oddo y Piro, 2004; Soria et al., 2005; Montenegro et al., 2009; Escuredo et al., 2012; Nates-Parra et al., 2013). Entre las propiedades bioactivas de las mieles se atribuyen las capacidades antimicrobianas y antioxidantes, las cuales suelen presentarse con mayor potencial en mieles de mielato (Bogdanov, 1997, 2008; Dinkov, 2003; Vorlová et al., 2005). Ejemplo de ello son las diferencias significativas (P < 0.01) encontradas entre mieles de néctar y mieles de mielato de la República Checa, con un efecto más alto por parte de las mieles de mielato. Este estudio encontró igualmente que a mayor conductividad en la miel, mayor actividad antimicrobiana con un coeficiente de correlación estadísticamente significativo (P < 0.05). Con el objetivo de evaluar las propiedades bioactivas en mieles de mielato roble y mieles de néctar procedentes de la región andina donde se ubican los departamentos de Boyacá, Cundinamarca y Santander; fueron evaluados el contenido de fenoles totales, la capacidad antioxidante y capacidad antibacteriana con y sin actividad peróxido sobre éstas mieles.
92 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
Capacidad Antibacteriana
Históricamente se conoce la utilidad de los productos naturales como la miel en medicina tradicional de muchas culturas para el tratamiento de heridas sépticas, cicatrización de lesiones de piel, quemaduras, úlceras crónicas, alergias y afección de garganta entre otras (Allen et al., 1991); evidencia de ello es el papiro de Ebers 1500 años a. C y autores como Hipocrates registran en el conocimiento tradicional, cultural y en medicina natural, el uso de la miel como una opción efectiva en el tratamiento de heridas (Mariño et al., 2010). La primera publicación realizada sobre el efecto antibacterial fue publicada por Ketel en 1983 (Molan, 1992) y desde entonces un gran número de científicos han tratado de encontrar el mecanismo de este efecto (Molan, 1992; Armstrong & Otis, 1995; Weston, 2000). Todos estos estudios han permitido establecer que no todos los tipos de miel presentan el mismo tipo de actividad antimicrobiana (Molan, 1992). El efecto bactericida en general en las mieles es resultado de la acción de dos tipos de compuestos ampliamente reconocidos (Bogdanov, 1984; Bogdanov, 1997; Bogdanov, 2008); el primero proviene de la producción natural de peróxido de hidrógeno a partir de la enzima glucoxidasa incorporada por la abeja y que actúa sobre la oxidación de la glucosa para producir ácido glucónico más peróxido, el cual es reconocido como un potente antiséptico que protege la integridad de la miel. Otro grupo de compuestos conocidos como compuestos de actividad no peróxido, comprenden sustancias como flavonoides como la pinocembrina, ácidos aromáticos, compuestos volátiles, antioxidantes fenólicos, lisozima y otros compuestos nitrogenados, obtenidos de diversas fuentes en el pecoreo y producidos por las abejas (Floris and Prota, 1989; Ferrese et al., 1993; Cooper et al., 1999, 2002; Rodriguez, 2003; Fattori, 2004; Estrada et al., 2005). Además de estos compuestos, la miel expresa factores que favorecen el efecto como la osmolaridad y la acidez, debido a que la miel es una solución súper saturada de sacáridos que en promedio presenta una actividad de agua entre 0.562 y 0.620, y un pH bajo en un rango entre 3.2 y 4.5. (Tysset et al., 1980); lo cual hace de la miel un ambiente inhóspito para la supervivencia de algunos microorganismos (Molan, 1992). Es probable que los ácidos orgánicos sean responsables también de la actividad antimicrobiana, por ello es considerada importante la medida individual de estos ácidos, para los cuales se Capítulo 3 93 han reportado los ácidos orgánicos no aromáticos como malico, citrico y D-gluconico (Bogdanov, 1997).
De acuerdo con la literatura, las propiedades antibacterianas tanto en mieles florales como en mieles de mielato, son consecuencia principalmente del recurso botánico colectado por las abejas; sobre el tema, Kwakman y Zaat en el 2012 indican además que los mecanismos antimicrobianos pueden ser muy complejos y pueden variar de acuerdo al microorganismo en estudio, así como de la sinergia de los componentes (Kwakman & Zaat, 2012). La actividad antimicrobiana en mieles ha sido principalmente atribuida a la presencia de peróxido de hidrogeno (Estrada et al., 2005). Este compuesto es producido eficientemente únicamente luego de diluir la miel, no obstante su actividad puede ser limitada al realizar pruebas con mieles in vivo en mamíferos, debido a la acción de enzimas presentes en los tejidos. A diferencia de este compuesto, la actividad no peróxido puede llegar a ser insensible al calentamiento y a la exposición a la luz y se mantiene intacta luego del almacenamiento por largos periodos de tiempo (Molan, 1992; Bogdanov, 2008) Los fitoquímicos son reconocidos por inhibir un amplio rango de bacterias Gram positivas y Gram negativas (Cooper et al., 2002; Cardenas, 2008) como Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli y Salmonella typhimurium (Molan, 1992). Además, el uso de la miel se ha recomendado en casos generados por patógenos oportunistas como Micrococcus luteus y Pseudomonas aeruginosa en pacientes inmunocomprometidos, donde ha mostrado ser efectiva (Estrada et al., 2005; Bernal et al., 2011). Otros autores como Vorlová y colaboradores en el 2005 registran la actividad más alta en mieles de mielato en concentraciones entre 10% y 20% en cepas como Listeria monocytogenes CCM 4699, Staphylococcus aureus CCM 3953, Escherichia coli CCM 4787 y Salmonella typhimurium F 8332 (STM). Concentraciones de miel entre 25 y 50 (MIC g/100 mL) también han sido reportadas frente a cepas de E coli y S. Aureus (Mato et al., 2003).
94 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
Capacidad Antioxidante
Los compuestos fenólicos son sustancias orgánicas ampliamente distribuidas en el reino vegetal. Se sintetizan como metabolitos secundarios de las plantas y presentan en su estructura uno o más anillos aromáticos con al menos un sustituyente hidroxilo. Los flavonoides son una serie considerable de pigmentos fenólicos que alcanzan normalmente niveles de 0,5% en polen, 10% en propóleos y casi 6000 μg kg-1 en miel. Dentro de componentes antioxidantes en la miel se reportan los flavonoides, como pinocembrina, pinobanksina, quercetina, kaempferol, crisina, galangina y otras; ácidos fenólicos, acido ascórbico, catalasa, peroxidasa, carotenoides y los productos de la reacción de Maillard (Muñoz et al., 2007).
Algunos estudios indican que la actividad antioxidante está fuertemente relacionada con el contenido total de fenoles (Al-Mamary et al., 2002; Gheldorf & Engeseth, 2002; Aljadi & Kamaruddin, 2004; Beretta et al., 2005; Meda et al., 2005; Blasa et al., 2006) y con el color (Frankel et al., 1998; Berreta et al., 2005;). Otros estudios indican una baja correlación o una correlación poco significativa entre estos parámetros (r: 0,003) y sugieren la presencia de otros componentes responsables de la capacidad antioxidante de las mieles además del contenido de flavonoides o ácidos fenólicos (Gheldof et al., 2002; Giorgiana 2008). Algunos argumentos que explican esta variación son el tipo de muestra que se analiza (miel entera o extracto), el proceso de extracción y tipo de almacenamiento, la compleja composición de la miel, la amplia gama de compuestos y a la interacción de los mismos, la gran variabilidad en sus actividades antioxidantes (Gheldof et al., 2002) y a que las mieles que exhiben quercetina, pinocembrina y galangina son escasas. Aun cuando la literatura indica una baja correlación de estos factores, actualmente siguen siendo utilizados como un índice de su capacidad antioxidante (Munoz et al., 2007). Aparte existen reportes indicando el rol de los aminoácidos en la exhibición de propiedades antioxidantes y es claro que no todos los productos de la planta presentan la misma composición de fenoles (Rice-Evans et al., 1996) ni la misma capacidad antioxidante, por ello lo que puede llegar a importar mas es la calidad y no la cantidad de polifenoles, lo cual puede servir como una mejor Capítulo 3 95 determinación de la capacidad antioxidante (Beretta et al., 2005; Blasa et al., 2006 Saxena, 2010)
La capacidad antioxidante y el tipo de compuestos se ven influenciados por el origen botánico; por ejemplo, autores como Meda et al, en el 2005, Vela et al., en el 2007, González en el 2007, Marghitas en el 2008, Dinkov en el 2008, Giorgiana en el 2008, Bobis et al., en el 2008 y Özkök et al., en el 2010; indican la superioridad de las mieles de mielato con respecto a mieles de néctar y sugieren la presencia de compuestos fenólicos y flavonoides, ácido ascórbico, ácido benzoico, cinámico y agliconas flavonoides (Ferreres et al., 1992; Andrade et al., 1997; Ferreres et al., 1994; Martos et al., 2000, Tomás-Barberán et al., 2001). La actividad antioxidante de TEAC ha sido reportada entre 34.9 y 203.21 μmoles equivalentes de Trolox/100 g con un contenido de fenoles entre 38.15 y 182.10 5 (mg EGA. /100 g). De 17 ácidos orgánicos reportados en la miel (Crane, 1990), los ácidos orgánicos no aromáticos también pueden ser usados como predictores de la actividad antioxidante (Mato et al., 2003).
Existen diversos métodos para evaluar la actividad antioxidante ya sea in vitro o in vivo. Una de las estrategias más aplicadas en las medidas in vitro de la capacidad antioxidante consiste en determinar la actividad del antioxidante frente a sustancias cromógenas de naturaleza radical, donde la pérdida de color ocurre de forma proporcional con la concentración. No obstante, las determinaciones de la capacidad antioxidante realizadas in vitro solo son una aproximacion de lo que ocurre en situaciones complejas in vivo.
Varios estudios indican diferentes métodos para determinar la capacidad antioxidante como FRAP (ferric reducing antioxidant power), DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), ORAC (oxigen radical absorbance capacity) y TEAC (Trolox equivalent antioxidant activity) (Berreta & al., 2005; Blasa & al., 2005; Aljadi & Kamaruddin, 2004). El DPPH es un radical libre que puede obtenerse directamente sin una preparación previa, mientras que el ABTS tiene que ser generado tras una reacción que puede ser química (dióxido de manganeso, persulfato potasio, ABAP) enzimática (peroxidase, mioglobulina), o también electroquímica. Con el ABTS se puede medir la actividad de compuestos de naturaleza hidrofílica y lipofílica, mientras que el DPPH solo puede disolverse en medio orgánico. El radical ABTS tiene, además, la ventaja de que su espectro presenta máximos de absorbancia a 414, 654, 754 y 815 nm en medio 96 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia alcohólico, mientras que el DPPH presenta un pico de absorbancia a 515 nm y el DMPD a 505 nm.
Entre los métodos químicos utilizados para determinar la capacidad antioxidante (captación de radicales libres), el radical ABTS es uno de los más rápidos, originando resultados reproducibles y coherentes. Además, el ABTS presenta importantes ventajas; muestra varios máximos de absorción y una buena solubilidad, permitiendo el ensayo de compuestos tanto de naturaleza lipofílica como hidrofílica. ABTS es uno de los más aplicados, al considerarse un método de elevada sensibilidad, práctico, rápido y muy estable; a pesar de esto los valores actividad antioxidante pueden depender del tiempo escogido para efectuar la medida. La absorbancia medida por el método ABTS se determinada a los 1 y 7 minutos Kuskoski 2005
3.3 Materiales y Métodos
3.3.1 Muestras de miel
50 muestras de miel de mielato de roble de colmenas de Apis mellifera y 30 mieles de néctar floral fueron colectadas en 30 municipios ubicados en la región andina de la cordillera oriental de Colombia. Las muestras fueron conservadas en refrigeración hasta la evaluación de la bioactividad teniendo en cuenta la capacidad antioxidante y antibacteriana.
Capítulo 3 97
Tabla 3.1. Número de muestras recolectadas y regiones de origen
No. De Departamento Municipio muestras Boavita, Buenavista, Caldas, Chiquinquirá, Ráquira, San mateo, Boyacá 29 Soatá, Tutazá, Viracachá Cundinamarca Bogotá, Fusagasugá, Guacheta, Silvania, Tibacuy, Une 14 Hato, Cerrito, Charalá, Enciso, Malaga, Molagavita, Oiba, Páramo, Santander Piedecuesta, Pinchote, San Andres, Santa Bárbara, Socorro, Valle 37 de San José TOTAL 80
3.3.2 Capacidad Antimicrobiana
Mieles completas
En 20 mieles de mielato de roble y 30 mieles de néctar mieles con todos sus compuestos activos (completas), se determinó la actividad antimicrobiana por la técnica de Concentración Mínima Inhibitoria -CMI- en microdiluciones (Tan et al., 2009), evaluando las cepas bacterianas Gram negativas: Escherichia coli, ATCC 31617; Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium, ATCC 14028 y Klebsiella pneumoniae, subsp. pneumoniae, ATCC 700603; y las cepas Gram positivas: Kocuria rhizophila, ATCC 9341; Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach, ATCC 6538 y Bacillus subtilis subsp. spizizenii, ATCC 6633. Se realizaron 6 microdiluciones seriadas con concentraciones de miel de 2.5, 5, 10, 20, 40 y 80% en caldo Mueller Hinton. Las cepas fueron inoculadas en las microdiluciones a una concentración de 0.5 en la escala Mc. Farland, medida por densidad óptica en solución salina estéril en Desichek (BioMérieux Inc DensiCHECK™ Plus). La visualización de la capacidad bactericida se obtuvo por resiembra en agar Mueller Hinton luego de 24 horas de incubación.
Mieles sin actividad peróxido
En 50 muestras de miel de mielato de roble y 30 mieles de néctar, se evaluó la capacidad bactericida de acuerdo a la misma metodología utilizada en mieles completas con tratamiento previo de las muestras para la neutralización del peróxido mediante la acción de la enzima catalasa de hígado bovino (3900 UND/mg de proteína. Sigma-Aldrich), con 0.06 g por cada 30 ml de agua destilada estéril y diluida al 80% en la solución madre de 98 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia miel. Para el análisis de estas muestras se incluyó la bacteria Gram negativa Pseudomonas aeruginosa, ATCC 10145.
3.3.3 Preparación de extractos de miel para análisis de capacidad antioxidante y contenido de fenoles totales
Para realizar los análisis de capacidad antioxidante y contenido de fenoles totales se prepararon 21 extractos de miel de mielato de roble y 18 extractos de miel de néctar. En cada extracto fueron utilizados 5 g de la muestra correspondiente y fueron diluidos en 10ml de metanol (reactivo analítico CHEMI, 99.8%). Luego de ser homogeneizados y filtrados, los extractos se mantuvieron en la oscuridad a -20°C hasta el momento del análisis.
3.3.4 Capacidad Antioxidante y Contenido de Fenoles Totales
Capacidad antioxidante equivalente a Trolox -TEAC-
La actividad antioxidante fue determinada por la decoloración del catión radical ABTS a una absorbancia de 734 nm (Buratti, 2007). La reacción es obtenida utilizando ABTS (7 mM) con persulfato potásico (2.45 mM, concentración final) incubados a temperatura ambiente (±25ºC) y en la oscuridad durante 16 horas. Una vez formado el radical ABTS se diluye con etanol hasta obtener un valor de absorbancia comprendido entre 0,70 (±0,1) a 754 nm (longitud de onda de máxima absorción). Las muestras filtradas se diluyen con etanol hasta que se produce una inhibición del 20 al 80%, en comparación con la absorbancia del blanco, tras añadir 20 µL de la muestra. A 980 µL de dilución del radical ABTS así generado se le determina la A754 a 30ºC, se añade 20 µL de la muestra (dilución de antocianos) y se mide de nuevo la A754 pasado 1 minuto. La absorbancia se mide de forma continua transcurridos 7 minutos. El antioxidante sintético de referencia, Trolox, se ensaya a una concentración de 0-15 µM (concentración final) en etanol, en las mismas condiciones, lo que se hace también con ácido ascórbico (0-20 mg/100 mL). La absorbancia comparada con estándar Trolox fue expresada como Capítulo 3 99 capacidad antioxidante equivalente a Trolox -TEAC- en 100 gramos de miel (Moon & Shibamoto, 2009).
Contenido de Fenoles Totales
El contenido de fenoles totales fue determinado por el método de Folin-Cicalteau por espectrofotometría en un rango de 700 a 765nm. El método consiste en detectar la concentración de polifenoles por la formación de sales de molibdeno de color azul, cuantificables por espectrofotometría en un rango de 700 a 750nm. Es basado en la reducción de un complejo de fosfowolframato-fosfomolibdato por la presencia de compuestos fenólicos (Stratil et al., 2006). El extracto es oxidado por el reactivo de Folin- Ciocalteu y neutralizado por la adición de carbonato de sodio (Lima et al., 2009; ICTA). La curva de referencia se realizó teniendo en cuenta una solución madre de 100mg/ml de ácido caféico y los resultados fueron expresados en mg de ácido caféico por 100 g de miel. Las absorbancias fueron medidas en un espectrofotómetro JASCO V530 (Tokio, Japón).
3.3.5 Análisis Estadístico
Se realizó el análisis de las variables antibacterianas mediante estadística descriptiva, utilizando pruebas de hipótesis por análisis no paramétricos de Mann Withney para el origen botánico entre mielato y néctar y pruebas de kruskal Wallis para el análisis entre microorganismos. Tanto para los resultados de actividad antibacteriana como de actividad antioxidante y contenido de fenoles totales se realizaron gráficos de intervalos de confianza y para el análisis de la capacidad antioxidante y contenido de fenoles totales, se realizaron pruebas de hipótesis por t de Student.
100 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
3.4 Resultados y discusión
3.4.1 Capacidad antibacteriana de mieles de mielato con y sin la actividad del peróxido de hidrógeno
En la evaluación de la capacidad antibacteriana de 20 mieles de mielato de roble completas, el 100% de las muestras presentaron capacidad antibacteriana sobre E.coli, S. enterica, K. rhizophila y S. aureus, mientras que el 95% de las muestras fueron activas sobre K. pneumoniae y el 60% sobre B. subtilis (figura 3-1). Al evaluar mieles de mielato de roble sin la actividad peróxido el total de las muestras lograron mantener la capacidad antibacteriana sobre S. aureus y P. aeruginosa.
Figura 3-1: Frecuencia relativa de mieles de mielato de roble con capacidad bactericida con y sin actividad peróxido
En las mieles de mielato sin la actividad peróxido entre el 90 y el 94% de las muestras lograron la inhibición de E.coli, K. rhizophila y S. entérica, mientras que para las bacterias K. pneumoniae y B. subtilis el porcentaje de muestras fue menor con 52 y 42% de frecuencias de muestras activas respectivamente. Los microorganismos más resistentes a las mieles de mielato sin actividad peróxido fueron más resistentes fueron K. pneumoniae y B. subtilis. Capítulo 3 101
En general la capacidad antibacteriana de las mieles de mielato de roble completas presentó medianas de CMI entre 10 y 20%, mientras que en éste mismo tipo de mieles sin actividad peróxido la capacidad antibacteriana presentó medianas de CMI entre el 20 y el 40% (tabla 3.2). La capacidad bactericida en las mieles de mielato completas se halló en concentraciones mínimas inhibitorias entre 2.5 y 80%, con una mediana de 20% sobre E.coli y B. subtilis y con el mismo rango y una mediana de 10% sobre S. aureus. Con rangos de inhibición entre el 5 y 80% y una mediana del 20%, las muestras fueron activas sobre S. enterica, K. pneumoniae y K. rhizophila (tabla 3.2). La actividad antimicrobiana de este tipo de mieles ha sido reportada en microorganismos como S. aureus en concentraciones de miel entre 2 y 4% (Bobis et al., 2008), en S. aureus y E.coli en concentraciones del 12.5% (Vargas, 2006) y en S. enterica y E.coli en concentraciones del 10 y 20% (Vorlová et al., 2005) tanto en mieles como en mieles de mielato. A pesar de que las cepas bacterianas en los trabajos realizados por estos autores no corresponden a las mismas utilizadas en éste estudio, si se evidencia rangos de efecto similar a los hallados en este estudio. Otro microorganismo para el cual se ha encontrado actividad antibacteriana en éste tipo de mieles son Helicobacter pylori (Bobis et al., 2008).
Tabla 3.2. Capacidad antibacteriana con y sin actividad peróxido de mieles de mielato de roble Miel de mielato de roble Miel de mielato de roble sin completas (n=20) actividad peróxido (n=50) Microorganismo CMI (%) CMI (%) Mediana Mín. Máx. Mediana Mín. Máx. E. coli 20a 2.5 80 40 bc 20 80 S. enterica 20 a 5 80 40 bc 20 80 K. pneumoniae 20 a 5 80 20 a 20 80 P. aeruginosa ------40 b 20 80 K. rhizophila 20 a 5 80 40 a 10 80 S. aureus 10 a 2.5 80 40 bc 20 80 B. subtilis 20 a 2.5 80 40 a 5 80 n: número de muestras evaluadas, Min.: Mínimo, Máx.: Máximo
Al eliminar la actividad peróxido en las mieles de mielato, el rango de inhibición tanto para S. aureus como para E.coli disminuyó de un rango de CMI 2.5-80% a 20%-80% con medianas del 40%. En el caso de K. rhizophila disminuyó de CMI 5-80% a 10-80% con mediana del 40% y en S. enterica y K. pneumoniae, de 5-80% a 20-80% con medianas 102 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia del 40% y 20% respectivamente. El rango más amplio de capacidad bactericida en mieles de mielato sin actividad peróxido se presentó al evaluar B subtilis con CMI entre 5 y 80% y con una mediana de 40%. Solamente el 42% de las mieles de mielato presentaron actividad antimicrobiana para B. subtilis.
En el caso de las mieles de néctar, al ser evaluadas con todos sus compuestos activos, el 96.6% de las muestras fueron activas a E. coli y S. enterica, el 90% a B.subtilis, el 83% a K. rhizophila y el 73.3% a K.pneumoniae (figura 3-2).
Figura 3-2: Frecuencia relativa de mieles de néctar con capacidad bactericida con y sin actividad peróxido
En las mieles de néctar sin actividad peróxido, el 98% de las muestras presentaron efecto inhibitorio en P. aeruginosa, el 83.3% en K. rhizophila, el 80% en E.coli, el 73.3% en B.subtilis y el 46.6% en K. pneumoniae. Al igual que en mieles de mielato de roble, el 100% de las mieles de néctar presentó capacidad bactericida con y sin peróxido de hidrógeno sobre S. aureus, hallándose a éste microorganismo como el más sensible a las mieles de la región andina en éste estudio. En el caso de S. enterica, tanto la miel de mielato como la miel de néctar presentaron un 90% de mieles activas sin actividad peróxido. Exceptuando los resultados en S. aureus y S. enterica, los porcentajes de Capítulo 3 103 muestras activas sin actividad peróxido en mieles de mielato fueron mayores en comparación con mieles de néctar.
En el caso de las mieles de néctar al ser evaluadas con todos sus compuestos activos se encontraron rangos de inhibición de CMI de 2.5 y 80% con una mediana del 40% sobre E. coli y S. aureus, y con el mismo rango pero con medianas del 20 y el 80% fueron inhibidas las bacterias B. subtilis y K. rhizophila respectivamente (tabla 3.3). En rangos de CMI entre 5 y 80% con medianas del 40 y el 20% fueron inhibidas las bacterias S. enterica y K. pneumoniae respectivamente.
Tabla 3.3. Capacidad antibacteriana con y sin actividad peróxido de mieles de néctar
Miel de néctar completa Miel de néctar sin actividad peróxido n=30 CMI (%) CMI (%) Microorganismo Mediana Mín. Máx. Mediana Mín. Máx. E. coli 40 abc 2.5 80 80 c 40 80 S. enterica 40 a 5 80 80 a 20 80 K. pneumoniae 20 a 5 80 20 a 20 80 P. aeruginosa ------40 a 20 80 K. rhizophila 80 a 2.5 80 80 a 20 80 S. aureus 40 a 2.5 80 40 a 10 80 B. subtilis 20 a 2.5 80 20 a 10 80 n: número de muestras evaluadas, Min.: Mínimo, Máx.: Máximo
En mieles de néctar sin actividad peróxido se encontró un rango de CMI entre 10 y 80% sobre S. aureus con una mediana del 40% y sobre B. subtilis con una mediana de 20%. En un rango de CMI entre 20 y 80% fueron inhibidas las bacterias S. enterica, K. rhizophila, P. aeruginosa y K. pneumoniae. La mayor actividad se encontró sobre K. pneumoniae con medianas del 20%, seguida de la actividad sobre P. aeruginosa con medianas del 40% y sobre S. enterica y K. rhizophila que fueron inhibidas con una mediana del 80%. La menor actividad antimicrobiana de las mieles de néctar sin actividad peróxido se encontró sobre E.coli en un rango de inhibición entre 40-80% con una mediana de 80%.
En las mieles de mielato de roble completas no se encontraron diferencias significativas entre los microorganismos evaluados, mientras que en las muestras sin actividad peróxido se presentaron diferencias significativas con respecto a la actividad antibacteriana sobre K. pneumoniae, así como también entre las bacterias P. aeruginosa y K. rhizophila (tabla 3.4). 104 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
En las mieles de néctar completas se encontraron diferencias significativas entre K. pneumoniae y las bacterias S. enterica y K. rhizophila, también entre S. enterica versus B. subtilis y entre K. rhizophila y las bacterias S. aureus y B.subtilis.
Tabla 3.4. Tabla Post-Hoc para las diferencias significativas en la capacidad antibacteriana de mieles de mielato de roble sin actividad peróxido y de mieles de néctar con y sin actividad peróxido Tipo de miel Microorganismos Miel de mielato de roble Miel de néctar Miel de néctar sin sin actividad peróxido completa actividad peróxido P valor 0.3927 <0.01 <0.01 E.coli x S.enterica
E.coli x K.pneumoniae x X
E.coli x P.aeruginosa x+
E.coli x K.rhizophila
E.coli x S.aureus
E.coli x B.subtilis X
S.enterica x K.pneumoniae x X X S.enterica x P.aeruginosa x+
S.enterica x K.rhizophila
S.enterica x S.aureus +
S.enterica x B.subtilis X X
K.pneumoniae x P.aeruginosa x
K.pneumoniae x K.rhizophila x X X K.pneumoniae x S.aureus x X
K.pneumoniae x B.subtilis x
P.aeruginosa x K.rhizophila + x+
P.aeruginosa x S.aureus
P.aeruginosa x B.subtilis
K.rhizophila x S.aureus x+ +
K.rhizophila x B.subtilis X X
S.aureus x B.subtilis X
x. Diferencias significativas entre los 7 microorganismos por prueba de Kruskal Wallis; +. Diferencias significativas por prueba de Kruskal Wallis, entre los 5 microorganismos inhibidos por un mayor número de muestras.
En mieles de néctar sin actividad peróxido, se hallaron diferencias significativas entre K. pneumoniae y las bacterias E. coli, S. enterica, K. rhizophila y S. aureus; entre B. subtilis y las bacterias E.coli, S.enterica, K. rhizophila y S. aureus; entre P. aeruginosa y las bacterias E. coli, S. enterica y K. rhizophila; y entre S. aureus y las bacterias S. enterica y K. rhizophila.
Capítulo 3 105
Por otra parte al comparar entre mieles de mielato de roble y mieles de néctar floral con todos sus compuestos activos, se encontraron diferencias significativas únicamente en la capacidad bactericida expresada contra K. rhizophila, para la cual fueron más activas las mieles de mielato con una mediana de 20%, mientras que las mieles de néctar presentaron una mediana de 80% (figura 3-3).
Figura 3-3: Capacidad antibacteriana de mieles completas de mielato de roble y de néctar
95% IC para la media 70 b 60
a a a a
50 a ) a a
% a (
40 a I
M a C a 30
20
10 i l 2 a la e la s s s 2 is 3 o E.colii_ icS.enterical K.pneumoniaeia l uK. rizhophilau uS. aureus_ i l B. subtilis_ .c l r e n ie te cc re s t is E o te n o s u o u u b il .c n o b .l c a re su t E e m m le o u b . l u K M r . a B. su S a e Miel de mielatoic S . . S n B .p M S K Miel de otras fuentes botánicas (aa) Sin diferencias significativas con p>0,05 por prueba de Mann-Withney (ab) Diferencias significativas con P(0,05) por prueba de Mann-Withney
En el caso del análisis de las muestras sin actividad peróxido, se presentaron diferencias significativas entre mieles de mielato y mieles de néctar en los microorganismos S. enterica, K. rhizophila y B. subtilis (figura 3-2). En el caso de S. enterica y K. rhizophila se presentó mayor capacidad antibacteriana por parte de las mieles de mielato de roble con medianas del 40%, mientras que en mieles de néctar las medianas fueron de 80%. K. rhizophila fue el microorganismo que presentó diferencias significativas en la capacidad bactericida entre mieles de mielato y mieles de néctar, tanto en mieles completas como en mieles sin actividad peróxido. 106 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
Figura 3-4: Capacidad antibacteriana de mieles de mielato de roble y mieles de néctar sin actividad peróxido
95% IC para la media 80 b b 70 a a a 60 a a a
) a
% (
50 a a
I M
C b 40 a a 30
20
4 3 2 1 2 1 1 a 2 1 4 3 4 3 _ E.coli_ S.enterica_ _ K.pneumoniae_ _ P.aeruginosa_ s K._ rizhophila_ _S. aureus_ _B. subtils_ li li a a a a a o s s s s is is o o ll ll ll ll s in u u u u il il .c .c e e ie ie o g c c e e t t E E n n s s in u c c r r b b o o b b g r co co au au su su lm lm le le u e o o . . . . a a K K r .a r r S S B B S S ae P ic ic . M M P Miel de mielato Miel de otras fuentes botánicas (aa) Sin diferencias significativas con p>0,05 por prueba de Mann-Withney (ab) Diferencias significativas con P(0,01) por prueba de Mann-Withney
Tanto en mieles de mielato como en mieles de néctar sin actividad peróxido, la capacidad bactericida fue mejor sobre los microorganismos K. pneumoniae y B. subtilis, no obstante solo fueron activas entre el 42 y 73% de las mieles evaluadas sobre éstos microorganismos.
En la actividad antimicrobiana de mieles de mielato y de néctar con y sin actividad peróxido no se encontraron diferencias significativas al asociarlas con la característica de la pared Gram positiva o Gram negativa.
Estos hallazgos demuestran que las mieles de néctar y de mielato con y sin actividad peróxido presentan perfiles únicos de actividad antimicrobiana sobre las bacterias, aún Capítulo 3 107 teniendo el mismo origen en la región andina y corresponder a la misma época de cosecha, este resultado muy probablemente es debido a la amplia variabilidad de la cobertura vegetal de la región en estudio.
3.4.2 Capacidad antioxidante en mieles de mielato de roble
La capacidad antioxidante evaluada por el método de equivalente Trolox (TEAC) en mieles de mielato presentó en promedio 75 mmol de Trolox por 100 gramos de miel y las mieles de néctar 85 mmol de Trolox por 100 gramos de miel; estos resultados no presentaron diferencias significativas entre los dos grupos. En cuanto al contenido de fenoles totales fue mayor en mieles de mielato con valores de 68 mg A. caféico/g de miel, que en mieles de néctar con valores de 68 mg A. caféico/100 g de miel con diferencias significativas (tabla 3.5 y figura 3-5).
Tabla 3.5. Capacidad antioxidante y contenido de fenoles totales
Capacidad Antioxidante Contenido de fenoles totales
TEAC (mmol Trolox/100 g miel) mg Acido Cafeico /100 g Miel
Miel de mielato de roble 7554 68±24 Miel de néctar 8557 35±18
En mieles en general han sido reportados entre 17.1 y 60 mg/ 100 g a. caféico (Buratti, 2007) valores dentro de los cuales se encontraron las mieles de néctar y para los cuales las mieles de mielato se encontraron por encima del rango. En mieles de mielato la actividad antioxidante ha sido reportada entre 27 y 279.24 mM equivalente de Trolox/100 g, rango dentro del cual las mieles de mielato de roble colombianas presentaron su capacidad antioxidante.
108 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
Figura 3-5: Capacidad antioxidante y contenido de fenoles totales
95% IC para la media 1,2 1,2 a
a
1,0 1,0 / de miel de/
0,8 a 0,8
/ gde/ miel caféico
Trolox 0,6 0,6 mmol b mgAcido 0,4 0,4
0,2 0,2 Mielato_de_Roble Otras_fuentes Mielato_de_roble Otras_fuentes Capacidad Antioxidante Contenido de Polifenoles Origen botánico de la miel Miel de mielato Miel de otras fuentes botánicas (aa) Sin diferencias significativas con p=0,6 por prueba de t de Student (ab) Diferencias significativas con P<0,01 por prueba de Mann-Withney
Puede concluirse de éste estudio que el 100% tanto las mieles de mielato de roble como las mieles de néctar poseen actividad antibacteriana y antioxidante con un contenido de fenoles totales superior en mieles de mielato. Las mieles de mielato presentaron mayor actividad antibacteriana sobre K. rhizophila y S.enterica con respecto a mieles de néctar. Particularmente en mieles de mielato la mayor capacidad antibacteriana se encontró en S.aureus y P. aeruginosa.
Agradecimientos
Los autores presentan agradecimientos a las asociaciones de apicultores de ASOAPIBOY, ASOAPIGAR y ASOAPICOM, a la Universidad Nacional de Colombia y al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural por la financiación del programa de investigación denominado Estrategias para establecer la denominación de origen de productos de las abejas en Colombia, del cual hizo parte éste estudio. Capítulo 3 109
3.5 Referencias
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4. Conclusiones y recomendaciones
4.1 Conclusiones
En la cordillera oriental de la zona andina colombiana, los apicultores obtienen miel de mielato de Roble, con características melisopalinológicas, sensoriales, fisicoquímicas y bioactivas únicas por su origen botánico de Quercus humboldtti, similares a otras mieles de mielato reportadas a nivel mundial.
Las magnitudes correspondientes a la respuesta visual en cuanto a las mieles de mielato de roble fueron compatibles con otros estudios, no obstante la claridad en mieles de mielato de robles colombianas fue mayor que la reportada en algunos estudios sobre mieles de mielato (Terrab et al., 2003; Ortiz Valbuena, 2005).
El análisis estadístico multivariado incluyendo el perfil aromático, el índice de Kirkwood y los parámetros fisicoquímicos permiten la diferenciación de las mieles de mielato y mieles de otros orígenes botánicos.
Los parámetros fisicoquímicos de mayor importancia en la identificación de la miel de mielato colombiana fueron: la conductividad eléctrica, el contenido de cenizas y minerales, la rotación específica y el contenido de azúcares reductores. Sus valores están dentro del rango establecido por la normatividad internacional.
La actividad bactericida de las mieles de mielato de roble con y sin peróxido de hidrogeno, permite concluir que las mieles poseen el potencial inhibitorio in vitro sobre las bacterias Escherichia coli, Salmonella enterica, Klebsiella pneumoniae, Kocuria rhizophila, Staphylococcus aureus, Bacillus subtillis y Pseudomonas aeruginosa. Las mieles de mielato presentaron menor contenido de glucosa y fructosa y mayor contenido de sacarosa, aunque en otros reportes de mieles de mielato usualmente ésta relación de azúcares es opuesta.
112 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
Las mieles de mielato presentaron capacidades antioxidante y antibacteriana comparables con mieles de mielato de otros países y un contenido de fenoles totales superior al ser comparadas con mieles de néctar.
4.2 Recomendaciones
Se recomienda estandarizar los procesos de extracción de la miel que aseguren la calidad microbiológica del producto.
Se recomienda la difusión de las características composicionales y de bioactividad de las mieles de mielato de roble aquí documentas que puedan orientar a los agentes involucrados en la cadena apícola colombiana y en especial al consumidor.
Se recomienda la revisión de los parámetros de calidad de esta miel especial en el marco de la normatividad nacional.
Las mieles de mielato que actualmente se encuentran en el mercado apícola nacional son denominadas como mielato de roble y no como miel de mielato de roble, motivo por el cual su designación y características composicionales argumentadas en éste documento, son un soporte para éste producto y su correcta denominación.
A. Anexo: Tipificación de mieles de mielato de roble (Quercus humboldtti) de Boyacá y Santander
114 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad de mieles de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
Anexo A. Tipificación de mieles de mielato de roble (Quercus humbotltii) de 115 Boyacá y Santander
116 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad de mieles de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
Anexo A. Tipificación de mieles de mielato de roble (Quercus humbotltii) de 117 Boyacá y Santander
B. Anexo: “Miel de Roble”
120 Estudio i identificación de características de composición y bioactividad de mieles de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
Anexo B. “Miel de Roble” 121
122 Estudio i identificación de características de composición y bioactividad de mieles de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
Anexo B. “Miel de Roble” 123
124 Estudio i identificación de características de composición y bioactividad de mieles de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
Anexo B. “Miel de Roble” 125
126 Estudio i identificación de características de composición y bioactividad de mieles de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
Anexo B. “Miel de Roble” 127
128 Estudio i identificación de características de composición y bioactividad de mieles de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
Anexo B. “Miel de Roble” 129
130 Estudio i identificación de características de composición y bioactividad de mieles de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
Anexo B. “Miel de Roble” 131
132 Estudio i identificación de características de composición y bioactividad de mieles de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
Anexo B. “Miel de Roble” 133
134 Estudio i identificación de características de composición y bioactividad de mieles de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
Anexo B. “Miel de Roble” 135
136 Estudio i identificación de características de composición y bioactividad de mieles de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
Anexo B. “Miel de Roble” 137
138 Estudio i identificación de características de composición y bioactividad de mieles de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
Anexo B. “Miel de Roble” 139
140 Estudio i identificación de características de composición y bioactividad de mieles de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
Anexo B. “Miel de Roble” 141
142 Estudio i identificación de características de composición y bioactividad de mieles de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
Anexo B. “Miel de Roble” 143
C. Anexo: Articulo de Revisión en proceso de publicación en revista indexada, categoría B: Acta Agronómica
146 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
Anexo C. Artículo de Revisión en proceso de publicación en revista indexada , 147 categoría B: Acta Agronómica
148 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
Anexo C. Artículo de Revisión en proceso de publicación en revista indexada , 149 categoría B: Acta Agronómica
150 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
Anexo C. Artículo de Revisión en proceso de publicación en revista indexada , 151 categoría B: Acta Agronómica
152 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
Anexo C. Artículo de Revisión en proceso de publicación en revista indexada , 153 categoría B: Acta Agronómica
154 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso del corredor de robles nativos de Colombia
Anexo C. Artículo de Revisión en proceso de publicación en revista indexada , 155 categoría B: Acta Agronómica
D. Anexo: Matriz de análisis de perfil aromático mediante la utilización del equipo de nariz electrónica
Tabla 4.1. Resultados de análisis de perfil aromático
158 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
E. Anexo: Matriz de análisis fisicoquímicos
Tabla 4.2. Resultados de análisis fisicoquímicos
160 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
Anexo E. Matriz de análisis fisicoquímicos 161
162 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
Anexo E. Matriz de análisis fisicoquímicos 163
164 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
Anexo E. Matriz de análisis fisicoquímicos 165
166 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
Reporte analítico de miel mielato en el laboratorio ILVO de Bélgica.
F. Anexo: Matriz de análisis de capacidad Antimicrobiana
Tabla 4.3. Resultados de análisis antimicrobianos
N.I.: No Inhibición
168 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
N.I.: No Inhibición
Anexo F. Matriz de análisis de capacidad antimicrobiana 169
N.I.: No Inhibición
170 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
N.I.: No Inhibición Anexo F. Matriz de análisis de capacidad antimicrobiana 171
N.I.: No Inhibición
G. Anexo: Matriz de análisis de capacidad antioxidante y contenido de fenoles totales
174 Título de la tesis o trabajo de investigación
Tabla 4.4. Resultados de análisis antimicrobianos
H. Anexo: Participación en evento científico
176 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de los robles nativos de Colombia
Anexo H. Participación en evento científico 177
I. Anexo: Impacto en la cadena apícola nacional
Apicultores capacitados que reconocen el producto y su recurso
Figura 4-1: Capacitación y reconocimiento en campo del recurso mielato para los apicultores de la asociación ASOAPIGAR en julio de 2010
Figura 4-2: Capacitación y reconocimiento en campo del recurso mielato para los apicultores de la asociación ASOAPIBOY en julio de 2010
180 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de robles nativos de Colombia
Apropiación del conocimiento y comercialización de la miel de mielato como Mielato de Roble
Figura 4-3: Miel de mielato de roble de apicultores de ASOAPIGAR
Anexo I. Impacto en la cadena apícola 181
Figura 4-4: Miel de mielato de roble comercial
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184 Estudio e identificación de características de composición y bioactividad propias de miel de mielato de Apis mellifera, recurso valioso de los robles nativos de Colombia
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