Bakalářská Práce

PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

Bakalářská práce

Daniela Gábrišová

Brno 2019

PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

Funkce a význam enzymu P450 u rostlin Bakalářská práce

Daniela Gábrišová

Vedoucí práce: doc. RNDr. Jana Řepková, CSc.

Ústav experimentální biologie

Brno 2019

Bibliografický záznam

Autor: Daniela Gábrišová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Název práce: Funkce a význam enzymu P450 u rostlin

Studijní program: Experimentální biologie

Studijní obor: Molekulární biologie a genetika

Vedoucí práce: doc. RNDr. Jana Řepková, CSc.

Akademický rok: 2018/2019

Počet stran: 41 Klíčová slova: cytochrom P450; rostlinné sekundární metabolity; funkce P450

Bibliografický záznam

Autor: Daniela Gábrišová Prírodovedecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentálnej biológie Názov práce: Funkcia a význam enzýmu P450 u rastlín

Študijný program: Experimentálna biológia

Študijný odbor: Molekulárna biológia a genetika

Vedúci práce: Doc. RNDr. Jana Řepková, CSc.

Akademický rok: 2018/2019

Počet strán: 41 Kľúčové slová: cytochróm P450; rastlinné sekundárne metabolity; funkcia P450

Bibliographic Entry

Author: Daniela Gábrišová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Title of Thesis: P450 enzyme in plants – function and meaning

Degree programme: Experimental Biology

Field of Study: Molecular Biology and Genetics

Supervisor: doc. RNDr. Jana Řepková, CSc.

Academic Year: 2018/2019

Number of Pages: 41

Keywords: cytochrome P450; plant secondary metabolites; P450 function

Abstrakt Tato bakalářská práce je zaměřena na rostlinné cytochromy P450, na jejich vlastnosti a především jejich funkci a využití. Jedná se o největší rodinu enzymů u rostlin, která se podílí na biosyntéze strukturních polymerů, obranných mechanismech, či hormonální signalizaci. Produkty, jejichž reakce tyto enzymy katalyzují však využívá i člověk.

Abstrakt Táto bakalárska práca je zameraná na rastlinné cytochrómy P450, na ich vlastnosti a predovšetkým ich funkciu a využitie. Jedná sa o najväčšiu rodinu enzýmov u rastlín, ktorá sa podieľa na biosyntéze štruktúrnych polymérov, obranných mechanizmoch, či hormonálnej signalizácii. Produkty, ktorých reakcie tieto enzýmy katalyzujú však využíva aj človek.

Abstract

This bachelor thesis is focused on plant cytochromes P450, their properties and especially their function and usage. It is the largest plant family of enzymes involved in the biosynthesis of structural polymers, defense mechanisms, and hormonal signaling. Products of the reactions that these enzymes catalyze are also used by humans.

Poděkování

Na tomto místě bych chtěla poděkovat své vedoucí bakalářské práce doc. RNDr. Janě Řepkové, CSc. za pomoc, cenné rady a návrhy na zlepšení a čas, který mi při psaní této práce věnovala.

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Text práce jsem vypracovala podle pravidel a zodpovídám za jeho jazykovou správnost.

Brno, 2. května 2019 …………………………………. Daniela Gábrišová

Obsah

1. Úvod ...... 10 2. Charakteristika cytochrómov P450 ...... 11 2.1. Chemické vlastnosti ...... 11 2.2. Názvoslovie cytochrómov P450 ...... 12 2.3. Evolúcia cytochrómov P450 ...... 13 2.3.1. Vznik cytochrómových rodín ...... 13 2.3.2. Fylogenetické stromy ...... 14 3. Metódy štúdia cytochrómov P450 ...... 16 4. Význam cytochrómov P450 pre rastliny ...... 19 4.1. Stavebné zložky ...... 21 4.2. Obranné mechanizmy ...... 21 4.3. Metabolizmus fytohormónov ...... 23 4.4. Iné funkcie ...... 23 5. Význam cytochrómov P450 pre človeka a úprava genómu rastlín ...... 25 5.1. Úprava genómu rastlín ...... 25 5.2. Využitie vo farmaceutickom priemysle ...... 26 5.3. Využitie v poľnohospodárstve ...... 27 5.4. Fytoremediácia ...... 29 5.5. Využitie v potravinárstve a význam v ľudskej strave ...... 31 6. Záver ...... 32

7. Prehľad literatúry ...... 33

1. Úvod Cytochrómy P450 sú proteíny, ktoré katalyzujú široké spektrum reakcií a boli identifikované vo všetkých ríšach organizmov, vrátane vírusov. Pôvodne boli objavené ako bunkové pigmenty, vo všeobecnosti je však ich najvýznamnejšou úlohou metabolizmus hormónov a xenobiotík, teda látok, ktoré sa v organizme prirodzene nevyskytujú. U rastlín tvoria najväčšiu rodinu enzymatických proteínov – gény kódujúce tieto enzýmy zaberajú približne 1% celého genómu rastliny. Toto množstvo však nepredstavuje funkčnú redundanciu, teda schopnosť rozličných enzýmov vykonávať tú istú funkciu, ale naznačuje rôznorodosť využitia cytochrómu P450 a zložitosť rastlinného metabolizmu. Pre rastliny sú dôležité pri tvorbe nízkomolekulových sekundárnych metabolitov, ktorých neprítomnosť, na rozdiel od primárnych metabolitov, nespôsobí nevyhnutne smrť organizmu, ale môže znížiť ich obranyschopnosť, plodnosť, či schopnosť adaptácie a komunikácie s inými organizmami a tým v konečnom dôsledku aj ich životaschopnosť. Sekundárne metabolity sú druhovo špecifické, každý rastlinný druh tvorí svoju vlastnú kombináciu metabolitov vyžadovanú pre prežitie v danom prostredí a môžu tak slúžiť aj na usmernenie pri taxonomickej klasifikácii. V súčasnosti je množstvo rastlinných sekundárnych metabolitov využívaných v potravinárskom priemysle ako ochucovadlá a arómy, pri výrobe liečiv, či už priamo ako ich zložky alebo ako vzory pri výrobe syntetických liekov, a v poľnohospodárstve napríklad pri fytoremediácii. Pochopenie komplexnosti genetickej determinácie sekundárnych metabolitov a ich funkcie v rámci biosyntetických dráh vedie k možnosti úprav genómu rastlín a tým napríklad k umelému zlepšeniu obranyschopnosti poľnohospodárskych a technických plodín voči hmyzu, patogénom a herbicídom, možnosti zvýšiť obsah živín a antioxidantov v rastlinách, či znížiť náklady na výrobu látok využívaných vo farmaceutickom priemysle. Cieľom tejto práce je na úvod charakterizovať rastlinné cytochrómy P450, ako z hľadiska chemického, tak i evolučného, a následne popísať ich význam. Jadrom práce je zhrnutie poznatkov o funkciách, ktoré cytochrómy pre rastliny spĺňajú a ich využitie človekom v rôznych odvetviach. Súčasťou je aj stručný popis metód molekulárnej biológie, ktoré sú uplatňované pri skúmaní a úprave genómu, nakoľko sa od nich odvíja práve mnoho možností ľudského využitia týchto enzýmov.

2. Charakteristika cytochrómov P450

2.1. Chemické vlastnosti Cytochrómy P450 tvoria veľkú skupinu hemoproteínových enzýmov patriacich medzi porfyríny – obsahujú hémovú prostetickú skupinu. Sú klasifikované ako monooxygenázy, teda enzýmy zo skupiny oxidoreduktáz, katalyzujúce prenos jednej molekuly O2 na substrát. Ich hydrofóbne substráty sa tak môžu stať reaktívnejšími a rozpustnejšími. Tieto proteíny sú u eukaryot membránovo viazané na cytoplazmatickú membránu alebo na endoplazmatické retikulum pomocou krátkeho hydrofóbneho úseku na svojom N-konci (Williams et al., 2000). Vo všeobecnosti sú rozdelené do štyroch tried podľa spôsobu presunu elektrónov. Väčšina rastlinných cytochrómov P450 spadá do II. triedy a je zložená z dvoch integrálnych membránových proteínov – samotného P450 a NADPH-cytochróm P450 reduktázy, viazanej na povrch endoplazmatického retikula a sprostredkovávajúcej prenos elektrónov. Väčšina reakcií je založená na heterolytickom štiepení molekulárneho kyslíka a následnom naviazaní jedného z atómov na substrát a redukcii druhého atómu na vodu, pričom cytochrómy získavajú elektróny potrebné k štiepeniu z NADPH pomocou NADPH- cytochróm P450 reduktázy. Afinitu P450 k reduktáze zrejme zvyšuje naviazanie substrátu spôsobujúce u P450 konformačné zmeny (Denisov et al., 2007). K aktivácii dochádza naviazaním molekulárneho kyslíka na hémové železo. Na hémové železo sa môže viazať aj molekula oxidu uhoľnatého a tvoriť tak redukovanú formu enzýmu s typickým absorpčným maximom pri vlnovej dĺžke 450 nm (Omura, Sato, 1964). Komplex P450-CO je neaktívny a nazývaný P450. Pre väčšinu reakcií je typická inhibícia prostredníctvom CO a zvrátenie tejto inhibície svetlom s vlnovou dĺžkou 450 nm. Reakcie, ktoré P450 katalyzujú sú nevratné a pomalé v porovnaní s ďalšími krokmi metabolických ciest a je náročné ich umelo napodobniť. Sú veľmi rôznorodé a často komplexné, regio- a stereošpecifické. Patria medzi ne napríklad dealkylácia, dehydratácia, dimerizácia, dekarboxylácia, izomerizácia, redukcia, štiepenie väzby C-C, hydroxylácia či epoxidácia. Aj v prípade nízkej sekvenčnej homológie si cytochrómy P450 zachovávajú konzervovanú terciárnu štruktúru a zároveň diverzitu substrátov a redoxných partnerov. Najkonzervovanejšie je jadro proteínu okolo hému, čím sa zachováva reakčný mechanizmus. Konzervovaná štruktúra jadra je tvorená zväzkom štyroch α-helixov (D, E, I, L), α-helixami J a K, dvomi sadami β-reťazcov a otočky nazývanej „meander“. Najcharakteristickejšou zachovávanou sekvenciou je sekvencia Phe-X-X-Gly-X-Arg-X-Cys-X-Gly, nachádzajúca sa 11 pred helixom L, obsahujúca absolútne konzervovaný cysteín, ktorý slúži ako ligand hémového železa. Ďalšími konzervovanými sekvenciami sú motív Glu-X-X-Arg, zrejme potrebný pre stabilizáciu štruktúry, a sekvencia Ala/Gly-Gly-X-Asp/Glu-Thr-Thr/Ser, zodpovedajúca za prenos protónov (Werck-Reichhart, Feyereisen, 2000).

2.2. Názvoslovie cytochrómov P450 Cytochrómy P450 boli pomenované podľa svojej funkcie pigmentu, vďaka ktorej boli objavené, a svojmu charakteristickému absorpčnému maximu pri svetelnej vlnovej dĺžke 450 nm. Systém názvoslovia jednotlivých enzýmov a génov, ktoré ich kódujú, bol založený na homológii aminokyselinových sekvencií a fylogenetickej príbuznosti a rozdeľuje ich do rodín a podrodín. Toto oficiálne názvoslovie bolo vytvorené výborom pre nomenklatúru P450 (Committee on Standardized Cytochrome P450 Nomenclature, David Nelson - http://drnelson.uthsc.edu/CytochromeP450.html), aby sa predišlo duplikovaniu názvov. Každý názov začína skratkou CYP pre superrodinu cytochrómov P450, za ňou nasleduje rodina, do ktorej enzým spadá, vyjadrená arabskou číslicou a písmeno indikujúce podrodinu. Ak ide o gén, názov sa píše kurzívou. V názvoch pseudogénov, teda génov, ktoré neexprimujú funkčné proteíny, sa na konci CYP názvu uvádza písmeno P (napr. CYP2T2P). Rastlinné cytochrómy spadajú do rodín s číselným označením CYP71-CYP99 a CYP701- CYP999. Cytochrómy sú rozdeľované do jednotlivých rodín a podrodín podľa identity sekvencií – ak je rovná alebo vyššia ako 40 %, sú zaradené do rovnakej rodiny, ak je rovná alebo vyššia ako 55 %, sú zaradené do jednej podrodiny a ak je rovná alebo vyššia ako 97 %, ide o rôzne alelické varianty jedného génu. Avšak tieto pravidlá zaraďovania majú aj výnimky, a to najmä u rastlín, kde duplikácie génov komplikujú zaradenie na základe aminokyselinovej sekvencie. Rodiny sa ďalej môžu zoskupovať do klanov, teda skupín rodín, ktoré sa konštantne zhlukujú vo fylogenetických stromoch. Je možné, že toto zhlukovanie naznačuje evolúciu cytochrómov P450 (Nelson et al., 2004). Klany je možné rozdeliť podľa počtu rodín, ktoré obsahujú na jednorodinové (napr. CYP51) a viacrodinové (napr. CYP71). S narastajúcim množstvom sekvencií sa predpokladá vznik nových klanov, rodín a podrodín.

2.3. Evolúcia cytochrómov P450 Vzhľadom na variabilitu funkcií cytochrómov P450 je poznanie ich evolučných vzťahov v rastlinných genómoch dôležité pre pochopenie vývoja biochemickej diverzity rastlín (Prall et al., 2016). V rámci evolúcie si rastliny vynahradili svoju imobilitu produkciou obrovského množstva rôznorodých sekundárnych metabolitov, ktoré im pomáhajú pri adaptácii na biotický aj abiotický stres a k tomu viedol práve vývoj enzýmov zodpovedných za syntézu týchto látok. V rastlinnom genóme sa počas evolúcie množstvo génov pre cytochrómy P450 výrazne zvýšilo, počet anotovaných cytochrómov u rastlín prevyšuje všetky ostatné taxóny (Nelson, Werck-Reichhart, 2011). Okrem množstva génov narástla aj ich diverzita. Tieto zmeny sú spôsobené rozsiahlymi génovými duplikáciami, ktoré môžu viesť k strate funkcie génov (vzniku pseudogénov), ale aj k nadobudnutiu nových funkcií (Werck- Reichhart, Feyereisen, 2000; Bak et al., 2011). Mnohé skupiny génov ovplyvnených duplikáciami sa vyvinuli tak, že katalyzujú za sebou idúce kroky jednej metabolickej cesty. Je to veľmi bežné pre cytochrómy spadajúce do tej istej podrodiny. Množstvo rodín resp. podrodín u jedného organizmu tak zvyčajne koreluje z množstvom funkcií cytochrómov potrebných pre daný organizmus. Cytochrómy spadajúce do jednej podrodiny môžu okrem fungovania v rovnakej metabolickej dráhe katalyzovať podobné reakcie na rôznych substrátoch (Nelson, Werck-Reichhart, 2011). Práve gény ktoré vznikli duplikáciami zostávajú v genóme pri sebe. Analýza genómu viniča (Vitis vinifera) ukázala, že hoci sa gény cytochrómov P450 vyskytujú na všetkých 19 chromozómoch, toto rozloženie nie je rovnomerné a niektoré chromozómy nesú veľké množstvo týchto génov (chromozómy 6, 18 a 19), zatiaľ čo iné (chromozóm 5) veľmi málo. Až 78% skúmaných génov sa vyskytovalo v zhlukoch (angl. clusters; skupiny génov, ktoré sa vo fylogenetických stromoch konštantne zhlukujú), v rámci ktorých si boli sekvencie génov podobné a teda častokrát spadajúce do tej istej rodiny (Ilc et al., 2018).

2.3.1. Vznik cytochrómových rodín Proces diverzifikácie cytochrómov odzrkadľuje vývoj rastlín. V období prechodu rastlín na súš došlo k významnému rozvoju klanov CYP71, CYP72 a CYP85. Taktiež vznikali úplne nové rodiny, napríklad u oddelenia Marchantiophyta došlo k vzniku rodín CYP73, CYP74, CYP88, CYP98, CYP736 a CYP761, ktorá sa nachádza aj u machov, no neskôr sa v evolúcii stráca (Nelson, Werck-Reichhart, 2011). Enzýmy z rodín CYP73 a CYP98 sa podieľajú na syntéze lignínu, ktorý tvorí základnú zložku rastlinných bunkových

13 stien, poskytuje im mechanickú podporu a umožňuje suchozemským rastlinám rásť do výšky (Gou et al., 2018). Okrem toho bolo pre suchozemské rastliny potrebné vyvinúť ochranu proti vysúšaniu a UV žiareniu. Porovnanie genómov Oryza sativa, obsahujúceho 356 génov pre cytochrómy P450 a Arabidopsis thaliana, ktorý ich obsahuje 246, naznačuje, že dve tretiny známych rodín P450 vznikli ešte pred rozlíšením jedno- a dvojklíčnolistových rastlín, ku ktorému došlo približne pred 200 miliónmi rokov, avšak toto číslo sa v budúcnosti pri sekvenovaní genómov ďalších druhov rastlín môže zvýšiť. Pred odčlenením nahosemenných a krytosemenných rastlín už existovali zástupcovia všetkých klanov okrem klanu CYP727 (Nelson et al., 2004). Medzi evolučne najstaršie cytochrómy patrí rodina CYP51, ktorá sa ako jediná nachádza u húb, rastlín aj živočíchov a zodpovedá za katalýzu demetylácie pri syntéze sterolov v membránach (Bak et al., 2011). Ďalšou odvekou rodinou je CYP97, ktorá sa objavuje už u rodu Chlamydomonas a jej zástupcovia sa nachádzajú vo všetkých rastlinách, väčšinou v jednej kópii, čo naznačuje dôležitú funkciu, ktorou je syntéza karotenoidov (Nelson, Werck-Reichhart, 2011; Bak et al., 2011). Vo veľmi vzácnych prípadoch môže dôjsť k strate celej rodiny z genómu celej fylogenetickej vetvy rastlín, ako sú napríklad rosidy, ktorým chýba rodina CYP709. Inak je strata cytochrómových rodín v priebehu evolúcie obmedzená jednotlivé nižšie taxóny, zvyčajne druhy. Dva príbuzné taxóny, ktoré stratili tú istú CYP rodinu sú vzácne (Nelson, Werck-Reichhart, 2011).

2.3.2. Fylogenetické stromy P450 tvoria superrodinu s veľmi rôznorodými sekvenciami a preto tvorba fylogenetických stromov nie je jednoduchá. Pôvodne boli zaraďované do dvoch skupín – A-typ a non-A-typ. Väčšina cytochrómov P450 podieľajúcich sa na tvorbe sekundárnych metabolitov patrila do skupiny A-typ, zatiaľ čo pod non-A-typ spadali rôznorodejšie enzýmy podieľajúce sa najmä na metabolizme lipidov a hormónov. Ďalšie sekvenovanie rastlinných genómov však ukázalo, že cytochrómy patriace do skupiny A-typ tvoria najväčší zo štrnástich klanov P450 a skupina bola premenovaná na klan CYP71 (Bak et al., 2011). Sekvenačné projekty poskytujú možnosť sledovať vývoj CYP rodín od najstarších eukaryot, kde boli prítomné rodiny CYP51 a o niečo neskôr CYP61. Významným projektom sekvenovania rastlinných genómov je 1KP (The 1000 plants) project. Pochádza z neho viac ako polovica známych CYP sekvencií (Nelson, 2017). Ide o medzinárodný projekt, ktorý získal dáta z transkriptómov vyše tisíc rastlinných druhov so zástupcami zo všetkých 14 významných vývojových vetiev. Jeho cieľom bolo uľahčiť riešenie fylogenetických otázok (Matasci et al., 2014). Po filtrovaní a spracovaní dát z tohto projektu zostalo takmer 172 tisíc sekvencií rastlinných cytochrómov P450, ktoré boli fylogeneticky zoradené do 9 taxónov. Následne boli pomocou BLAST porovnávané s už známymi génmi a sekvencie s identitou vyššou ako 40% boli zaradené do rodín. U sekvencií s identitou nižšou ako 40% môže ísť o novú rodinu alebo o predom nerozoznanú kontamináciu (Nelson, 2017). Príklad fylogenetického stromu je uvedený na obr. 1.

Obr. 1: Fylogenetický strom cytochrómov P450 z vínnej révy. Zarovnanie sekvencií proteínov cytochrómov P450 bolo použité na vytvorenie najpravdepodobnejšieho stromu. Modrou farbou je znázornený klan CYP71. Farebne označené cytochrómy patria do siedmich najväčších fylogenetických zhlukov (Ilc et al., 2018).

3. Metódy štúdia cytochrómov P450

Skúmanie genómu a jednotlivých génov je nápomocné pri snahe porozumieť ich funkcii, štruktúre, či významu pre organizmus. Tieto poznatky sú ďalej využívané na pochopenie komplexných mechanizmov fungovania daného organizmu a genetickej determinácie jeho fenotypu. Veľký význam analýzy ľudského genómu spočíva v diagnostike mnohých ochorení. U rastlín má poznanie ich genómu, alelických variant a mutácií zase význam pri šľachtení a genetických modifikáciách. Rastliny majú najväčšie genómy zo všetkých organizmov a ich analýza je o to náročnejšia. Medzi najdôležitejšie metódy využívané na analýzu genómu patrí sekvenovanie, teda stanovenie primárnej štruktúry (poradia nukleotidov) DNA. Existuje niekoľko techník sekvenovania, v súčasnosti sa využíva najmä sekvenovanie novej generácie (NGS, z angl. Next Generation Sequencing) a sekvenovanie tretej generácie. Princípom NGS je masívne paralelné sekvenovanie mnohých fragmentov DNA. Najskôr je potrebná príprava templátu, tzv. DNA knižnice – dochádza k fragmentácii genómovej DNA na kratšie úseky, ktoré budú samostatne sekvenované. Ďalej nasleduje amplifikácia templátu pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR, z angl. Polymerase Chain Reaction), na zvýšenie detekčného signálu. Samotné sekvenovanie môže prebiehať rôzne, podľa použitej technológie. U všetkých dochádza k syntéze komplementárneho vlákna k analyzovanej DNA a jednotlivé nukleotidy sú potom rozoznávané odlišnými spôsobmi. Napríklad technológie SOLiD (Shendure et al., 2005) a Illumina (https://www.illumina.com/) využívajú k rozlíšeniu nukleotidov značenie fluorescenčnými farbami, technológia Ion Torrent využíva zmenu pH elektrochemickou detekciou vodíkových iónov uvoľňovaných pri replikácii sekvenovaného templátu a technológia 454 využíva uvoľnenie pyrofosfátu pri enzymatickej syntéze DNA (Nyrén et al., 1987). Výsledkom sú sekvencie krátkych fragmentov, ktoré sa zostavujú do kontigov – reťazcov za sebou idúcich fragmentov DNA, vytvárajúcich spojitú sekvenciu. Technológie sekvenovania tretej generácie sú novšie, ich výhodou je analýza molekuly DNA v celku a stačí na ňu malé množstvo vzorky. Ich nedostatkom je však nižšia presnosť, preto je vhodné tieto metódy kombinovať. Zdrojom sekvencií pre ďalší výskum môžu byť sekvenačné projekty, ako už spomínaný 1KP projekt, z ktorého pochádza množstvo identifikovaných P450 sekvencií. Sekvencie sú ďalej analyzované – zisťuje sa, ktoré oblasti kódujú proteíny, kde sú hranice exónov a intrónov, kde sa nachádzajú regulačné sekvencie. Predikcia eukaryotických génov je náročnejšia kvôli nízkej hustote kódujúcich sekvencií. Metódy hľadania génov môžu

16 byť založené napríklad na hľadaní podobností s už popísanými génmi. Tieto metódy využívajú programy pre priloženie sekvencií (napr. BLAST), avšak veľkou nevýhodou je, že nedokážu identifikovať gény, ktoré ešte v databáze nie sú. Ďalším spôsobom je predikcia na základe hľadania určitých signálov, ako sú iniciačné a terminačné kodóny, promotory, väzobné miesta pre ribozómy alebo transkripčné faktory, či terminátory transkripcie. Táto analýza je súčasťou anotácie génov – popisu lokalizácie génov v rámci genómu, identifikácie ich kódujúcich oblastí a funkcií. Gény pre cytochrómy P450 boli podrobne analyzované napríklad u Arabidopsis thaliana (Nelson et al., 2004; Bak et al., 2011; http://www.p450.kvl.dk/p450.shtml), Oryza sativa (Nelson et al., 2004), Glycyrrhiza uralensis (Ramilowski et al., 2013; Mochida et al., 2016), Coffea arabica (Ivamoto et al., 2015), či Vitis vinifera (Ilc et al., 2018). Takto identifikované a popísané gény sú ukladané vo verejne dostupných genetických databázach, ktoré sú prevádzkované svetovými bioinformatickými inštitúciami, ako NCBI (National Center for Biotechnology Information - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) alebo EBI (European Bioinformatics Institute - https://www.ebi.ac.uk/). V databázach nukleotidových sekvencií sa nachádzajú dáta získané z odborných pracovísk a obsahujú desiatky až stovky miliónov sekvencií. Okrem nich existujú aj databázy obsahujúce celé genómy organizmov, napríklad GOLD (Genomes OnLine Database - https://gold.jgi.doe.gov/). Polohu génov je možné zistiť okrem sekvenovania genómov aj genetickým mapovaním. Ide o metódu, ktorá informuje o tom, ako sú gény od seba navzájom vzdialené. Je založená na analýze frekvencie rekombinácie alel jednotlivých chromozómov. Čím ďalej sú od seba gény vzdialené, tým stúpa pravdepodobnosť, že pri meióze dôjde k prekríženiu chromatíd medzi nimi a teda k rekombinácii. Po testovacom krížení podiel rekombinantných jedincov z celkového počtu udáva relatívnu vzdialenosť medzi génmi (tzv. Morganovo číslo). Funkciu daného génu je možné predikovať podľa podobnosti s inými génmi, ktorých funkcia už je známa. Táto predikcia sa potvrdzuje prostredníctvom experimentálnej štúdie, v ktorej je možné po ovplyvnení expresie génu zaznamenať zmenu fenotypu. V prípade génov kódujúcich cytochrómy P450, predstavuje zmenu fenotypu zastavenie, alebo obmedzenie tvorby sekundárneho metabolitu, za ktorý sú dané enzýmy zodpovedné. Expresiu je možné ovplyvniť pozitívne (nadmerná expresia), alebo negatívne (inaktivácia génu). Nadmernú expresiu génu je možné docieliť vložením vektora obsahujúceho niekoľko kópií génu záujmu do hostiteľskej bunky. Tento princíp je dnes využívaný na produkciu proteínov potrebných napríklad v medicíne. Rastlinné gény CYP97A4 a CYP97A2 boli pomocou vektoru pCOLADuet™-1 vložené do baktérie Escherichia coli, ktorá začala produkovať karotény

(Quinlan et al., 2006). K inaktivácii génu dochádza zastavením jeho transkripcie (Sitnicka et al., 2014). Často využívaným spôsobom ako zastaviť transkripciu je cielená mutagenéza v genóme pomocou metódy CRISPR/Cas9. CRISPR sú krátke DNA repetície, do ktorých sa inkorporuje cudzorodá DNA, komplementárna k časti sekvencie génu, ktorého expresiu treba zastaviť. Interagujú z Cas9 endonukleázou – enzýmom, ktorý je pomocou CRISPR navedený k požadovanej sekvencii a štiepi DNA. Po rozštiepení nemôže dochádzať k vzniku celého proteínu a ak k nemu dôjde už na začiatku transkribovaného génu, proteín nevzniká vôbec. Metóda CRISPR/Cas9 bola použitá napríklad na zníženie expresie génu CYP734A4, ktorý sa zúčastňuje katabolizmu brassinosteroidov. Jeho zvýšená expresia u ryže totiž spôsobuje vznik mutantných rastlín postihnutých trpasličím vzrastom (Qian et al., 2017).

4. Význam cytochrómov P450 pre rastliny Vzhľadom na rôznorodosť cytochrómov P450 je jasné, že pokrývajú aj široké spektrum funkcií. Podieľajú sa na vývoji a raste rastliny, komunikácii s prostredím a signálnych dráhach v rámci organizmu, metabolizme xenobiotík a detoxikácii, ochrane pred UV žiarením, patogénmi, hmyzom a bylinožravcami. Všetky tieto aspekty sú dôležité pre prežitie rastlín. K splneniu väčšiny týchto úloh prispievajú cytochrómy tým, že katalyzujú špecifické kroky pri syntéze sekundárnych metabolitov. Zúčastňujú sa aj ich rozkladu, čím pomáhajú udržiavať homeostázu organizmu. Rastliny sú schopné tvoriť obrovské množstvo rôznych sekundárnych metabolitov (zahŕňajú viac ako 200 000 rastlinných produktov (Mizutani, 2012)), ktoré sú druhovo špecifické a mnoho z nich je tak možné nájsť len u niekoľkých druhov (Rasool, Mohamed, 2016). Príkladom môže byť rodina CYP725, ktorá sa vyskytuje len u rodu Taxus a 7 cytochrómov z nej sa podieľa na syntéze taxolu - látke s protirakovinovými účinkami (Mizutani, 2012). Práve gény kódujúce cytochrómy P450 sú kľúčom diverzite rastlinných sekundárnych metabolitov. Väčšina ich katalytických funkcií týchto proteínov je však zatiaľ neznáma. Sekundárne metabolity môžeme rozdeliť na 3 hlavné skupiny – terpenoidy, fenylpropanoidy a dusíkaté zlúčeniny. Terpenoidy tvoria zložky membrán, fytohormónov a obranných a signálnych molekúl. Fenylpropanoidy sú fytoalexíny sprostredkovávajúce ochranu proti UV žiareniu. Medzi dusíkaté metabolity patria napríklad alkaloidy a glukozinoláty. Cytochrómy P450 je možné rôzne rozdeliť podľa procesov, na akých sa podieľajú. V tejto časti práce sú kvôli lepšej prehľadnosti rozdelené podľa základných významov pre rastliny, ktorými sú podiel na tvorbe stavebných zložiek organizmu, početné obranné mechanizmy, vplyv na rast a vývoj prostredníctvom fytohormónov a iné funkcie. Jedným z najdôležitejších cytochrómov P450 pre rastlinu je CYP73A5, ktorý katalyzuje para-hydroxyláciu kyseliny škoricovej, jeden zo základných krokov pri biosyntéze fenylpropanoidov (Russel, 1971). Za túto reakciu zodpovedá u Arabidopsis len jeden gén (At2g30490) a mutácie v ňom spôsobujú trpasličí vzrast rastlín, samčiu sterilitu, zníženú tvorbu fenylpropanoidov a tým aj zníženú tvorbu lignínu, čo spôsobuje kolabovanie xylémových ciev. CYP73A5 stojí na začiatku fenylpropanoidovej dráhy vedúcej k rôznym dôležitým metabolitom ako sú lignany a lignín, flavonoidy a izoflavonoidy, kumaríny, kutín,

19 suberín, katechín, či stilbenoidy, ktoré budú ďalej v tejto kapitole charakterizované (Schilmiller et al., 2009). Fenylpropanoidová dráha je znázornená na obr. 2.

Obr. 2: Diverzifikácia fenylpropanoidov na základe všeobecnej fenylpropanoidovej dráhy. Šedou farbou sú označené metabolity šikimátovej dráhy a centrálny metabolit p-kumaroyl-CoA (Vogt, 2010).

4.1. Stavebné zložky Medzi absolútne najstaršie funkcie cytochrómov P450 patrí podieľanie sa na biosyntéze sterolov – organických chemických látok zo skupiny steroidov, ktoré majú v polohe 3 hydroxylovú skupinu a v polohe 17 alifatický reťazec. Sú štruktúrnymi zložkami bunkových membrán a dokážu meniť ich tekutosť a priepustnosť. Sú súčasťou lipidových raftov, membránových mikrodomén, ktoré sa podieľajú na prenose signálov, proliferácii a diferenciácii bunky a obrane proti patogénom (Mongrand et al., 2004; Morikawa et al., 2006) a to napríklad znížením výdaja živín do apoplastu bunky, kde sa pri bakteriálnej infekcii môžu nachádzať patogény a rastlina tak získava imunitu (Wang et al., 2012). V malom množstve sú tiež potrebné pre aktiváciu bunkového cyklu a meiózu a sú prekurzormi pre syntézu steroidov. CYP51G katalyzuje 14α-demetyláciu – nevyhnutný krok pri biosyntéze sterolov (Bak et al., 1997; Cabello-Hurtado et al., 1997; Bak et al., 2011). CYP710A1 a CYP710A11 kódujú enzým C-22 sterol desaturázu, ktorá produkuje stigmasterol z β-sitosterolu (Morikawa et al., 2006). Ďalšou dôležitou stavebnou zložkou rastlín je lignín, komplexný nepravidelný biopolymér tvorený fenylpropanoidovými jednotkami, nachádzajúci sa v bunkových stenách rastlín. Po celulóze je druhým najrozšírenejším polymérom na svete. Poskytuje im mechanickú podporu, čím umožňuje rast do výšky a vďaka hydrofóbnym vlastnostiam aj vodotesnosť xylémových ciev. Jeho syntéza si vyžaduje aktivitu troch cytochrómov P450 – CYP73A5, CYP98A3, CYP84A1 (Gou et al., 2018).

4.2. Obranné mechanizmy Rastliny si počas evolúcie vytvorili množstvo obranných mechanizmov, ktorými sa bránia abiotickým aj biotickým faktorom. Chránia sa pred stratou vody, UV žiarením, toxickými látkami, bylinožravcami, hmyzom a patogénmi. Cytochrómy môžu k ochrane rastliny prispievať priamo, tvorbou obrannej látky, alebo nepriamo, tvorbou signálnej molekuly, ktorá spustí priebeh ďalšej reakcie. Povrch častí rastlín, ktoré sú vystavené vzduchu, je chránený kutikulou, ktorej nevyhnutnou zložkou je extracelulárny hydrofóbny biopolymér kutín. Kutikula chráni organizmus najmä pred stratou vody, ale aj pred UV žiarením a patogénmi. Kutín je tvorený hydroxylovanými mastnými kyselinami (najmä C16 a C18) a glycerolom. Za hydroxyláciu mastných kyselín zodpovedajú ω-hydroxylázy CYP86A8 a CYP86A2 (Wellesen et al., 2001; Xiao et al., 2004). Na tvorbe ďalších zložiek kutikuly sa podieľa aj alkán hydroxyláza MAH1 (kódovaná génom CYP96A15), ktorá katalyzuje tvorbu sekundárnych alkoholov a ketónov

(Greer et al., 2007). Na ochrane pred UV-B žiarením sa podieľajú okrem kutikuly aj flavonoidy, medzi nimi napríklad antokyaníny (Takahashi et al., 1991; Li et al., 1993). CYP86A1 kóduje proteín ω-hydroxylázu mastných kyselín, ktorá je kľúčovým enzýmom pri biosyntéze suberínu u Arabidopsis thaliana. Suberín je lipofilný biopolyester tvorený mastnými kyselinami, hydroxykyselinami a fenolickými látkami. Vytvára bariéru oddeľujúcu rozdielne pletivá, zabraňuje strate vody, iónov a živín a chráni rastlinu pred vstupom patogénov (Höfer et al., 2008). V koreňoch sa môže vyskytovať v endodermis vo forme tzv. Casparyho prúžkov, ktoré zabezpečujú, že všetky látky prijaté rastlinou z pôdneho roztoku najskôr prejdú cytoplazmatickou membránou do buniek, až potom sú transportované do stredného valca a rastlina tak môže filtrovať potencionálne škodlivé látky. Furanokumaríny sú toxické látky, ktoré sa vyskytujú najmä u čeľadí Apiaceae a Rutaceae. Za prítomnosti UV žiarenia sú schopné viazať sa na DNA a brániť replikácii a transkripcii a spôsobiť smrť bunky. Rastliny sa ich tvorbou bránia proti bylinožravcom (Li, et al., 2004). Za syntézu furanokumarínov sú zodpovedné podrodiny CYP71AJ a CYP71AZ (Larbat et al., 2007, Krieger et al., 2018). CYP71AZ prispievajú okrem tvorby furanokumarínov aj k tvorbe kumarínov (Krieger et al., 2018). K obrane rastlín prispievajú najmä svojimi antimikrobiálnymi účinkami (Laurin et al., 1999). Okrem toho vykazujú aj antioxidačné (Raj et al., 1998) inhibičné (Gnerre et al., 2000), protirakovinové (Riveiro et al., 2008) a protivírusové (Kostova et al., 2006) účinky. Ďalšími antimikrobiálnymi látkami, ktoré chránia rastliny pred fytopatogénnymi baktériami sú katechíny (Fukai et al., 1991). Vyznačujú sa aj antioxidačnými účinkami (Almajano et al., 2007). Okrem toho boli predmetom skúmania alelopatie – vzťahu organizmov, kde jeden prostredníctvom inhibítorov negatívne ovplyvňuje iný organizmus. Podľa jednej zo štúdií je (±)-katechín látka vylučovaná koreňmi invazívneho druhu Centaurea maculosa, pričom enantiomér (‒)-katechín je fytotoxický, zatiaľ čo (+)-katechín má antimikrobiálne účinky proti koreňovým patogénom (Bais et al., 2002). Táto štúdia však bola neskôr, v roku 2009 stiahnutá na základe nereprodukovateľnosti výsledkov a objavili sa ďalšie štúdie, ktoré teóriu (‒)-katechínu ako alelopatického inhibítoru nepodporujú (Blair et al., 2006; Duke et al., 2009). Príkladom látky, ktorá prispieva k ochrane nepriamo je kyselina salicylová. Funguje ako endogénny signál spúšťajúci systémovú získanú rezistenciu (SAR, z angl.systemic acquired resistance), pri ktorej napadnutie jednej časti rastliny patogénom spustí odpoveď celého organizmu. Nahromadenie kyseliny salicylovej a jej rozšírenie do celého organizmu indukuje tvorbu PR (z angl. pathogenesis-related) proteínov, ktoré priamo účinkujú proti

22 patogénom (Métraux et al., 1990; Yalpani et al., 1991). Kyselina salicylová taktiež vzniká z kyseliny škoricovej. Finálny krok katalyzuje 2-hydroxyláza kyseliny benzoovej (BA2H), patriaca medzi cytochrómy P450 (León et al., 1995).

4.3. Metabolizmus fytohormónov Cytochrómy P450 prispievajú ako k tvorbe, tak aj katabolizmu niektorých rastlinných hormónov. Zeatín je fytohormón patriaci medzi cytokiníny, hormóny podporujúce delenie buniek, ktoré sa zúčastňujú lokálnej aj diaľkovej signalizácie. Zeatín vzniká z adenínu a vyskytuje sa vo formách cis- a trans-. Biosyntézu trans-izoméru katalyzujú hydroxylázy patriace medzi enzýmy P450, kódované génmi CYP735A1 a CYP735A2 (Takei et al., 2004). Naopak, inhibičným fytohormónom je kyselina abscisová. Spomaľuje rast prostredníctvom zastavenia bunkového delenia v kambiu, v nevhodných podmienkach zastavuje dozrievanie plodov, zabraňuje predčasnému klíčeniu semien a urýchľuje starnutie poškodených buniek. Pri nedostatku vody v pôde sa jej v koreňoch vytvára väčšie množstvo, ktoré je transportované do listov a spôsobuje uzatváranie prieduchov, čím zabraňuje stratám vody. Množstvo kyseliny abscisovej v pletive je citlivo regulované jej syntézou de novo a katabolizmom. Kľúčovým krokom pre jej rozklad je hydroxylácia v polohe 8', ktorá je katalyzovaná enzýmami z podrodiny CYP707A (Saito et al., 2004). Ďalšou skupinou hormónov pozitívne ovplyvňujúcich rast sú giberelíny. Ide o izoprenoidy vznikajúce v terpenoidnej dráhe a na ich vzniku sa podieľajú enzýmy z podrodín CYP701A (Helliwell et al., 1998) a CYP88A (Helliwell et al., 2000). Opačnú funkciu má enzým CYP714D1 (16α,17-epoxidáza), ktorý sa zúčastňuje katabolizmu giberelínov, čím spomaľuje ich činnosť a zastavuje rast (Zhu et al., 2006). Brassinosteroidy sú rastlinné steroidné hormóny podporujúce rast a delenie buniek, nevyhnutné pre správny vývoj organizmu. Okrem rastu ovplyvňujú aj diferenciáciu ciev, kvitnutie, samčiu plodnosť, senescenciu a toleranciu k biotickému aj abiotickému stresu (Gudesblat, Russinova, 2011). Počas ich biosyntézy dochádza k niekoľkým za sebou idúcim oxidáciám, ktoré sú katalyzované enzýmami z podrodín CYP85A (Bishop et al., 1999; Nomura et al., 2005), CYP90B (Fujita et al., 2006), CYP90C a CYP90D (Ohnishi et al., 2006).

4.4. Iné funkcie Cytochrómy P450 zúčastňujú syntézy karotenoidov. Karotenoidy sú bežne sa vyskytujúce pigmenty, ktorých hlavnou úlohou je zachytávanie slnečnej energie pre fotosyntézu a ochrana chlorofylu pred poškodením vysokou dávkou fotónov. Zachovanie tejto

23 funkcie je potrebné pre správny rast a vývin rastlinných buniek (Mizutani, 2012). Najhojnejšie sa vyskytujúcim karotenoidom je luteín, ktorý je súčasťou fotosystému II. Na jeho syntéze sa podieľajú enzýmy CYP97C1, katalyzujúci hydroxyláciu ε-prstenca α- karoténov a CYP97A3, katalyzujúci hydroxyláciu β-prstenca α- a β-kratorénov (Tian et al., 2004; Kim et al., 2006). Ďalšími významnými pigmentmi sú opäť deriváty flavonoidov, antokyaníny. Zodpovedajú za červené, fialové a modré sfarbenie kvetov a plodov, sú teda významné pre prilákanie opeľovačov a zabezpečenie rozmnožovania. Vyskytujú sa však aj v iných častiach rastlín, väčšinou v epidermis. Ich farba sa mení podľa pH prostredia, v ktorom sa nachádzajú, u rastlín je to vakuola v bunke. Okrem pH vakuoly farbu ovplyvňuje aj počet hydroxylových skupín – čím ich je viac, tým výraznejšie modrú farbu látka získa. Túto hydroxyláciu katalyzujú flavonoid 3'-hydroxyláza a flavonoid 3'5'-hydroxyláza, patriace do rodiny CYP75 (Tanaka et al., 1998; Tanaka, Brugliera, 2013).

5. Význam cytochrómov P450 pre človeka a úprava genómu rastlín Sekundárne metabolity sú okrem rastlín využívané aj človekom, avšak umelo napodobniť ich prírodnú syntézu je veľmi zložité a finančne nevýhodné. Nestačí však ani ich získavanie z prírodných zdrojov, nakoľko rastliny väčšinou neobsahujú daných sekundárnych metabolitov veľké množstvo a výťažky sú nízke. Riešením by mohlo byť umelé zvýšenie rastlinnej produkcie pomocou genetických modifikácií, na to je však najskôr potrebné presne poznať mechanizmy syntetických reakcií, enzýmy katalyzujúce ich jednotlivé kroky a gény kódujúce tieto enzýmy (Rasool, Mohamed, 2016). Cytochrómy P450 a gény, ktoré ich kódujú sa preto stali objektom záujmu metabolického inžinierstva, teda optimalizácie genetických a regulačných procesov v bunke na zvýšenie produkcie určitej látky – v tomto prípade sekundárnych metabolitov, ktorých množstvo prirodzene tvorené rastlinou nie je pre ľudské využitie dostačujúce. Pomocou metabolického inžinierstva je možné zvýšiť tvorbu enzýmov podieľajúcich sa na produkcii látky, potlačiť nežiaduce vedľajšie cesty a optimalizovať lokalizáciu enzýmov v požadovaných pletivách. Limitujúcim faktorom však stále môže byť napríklad nedostatočný obsah substrátu v pletive (Morant et al., 2003). Okrem látok, ktoré sú človekom priamo spracovávané, je žiaduce aj zvýšenie obranyschopnosti proti hmyzu a patogénom. Ďalším inovatívnym aspektom je využitie schopnosti rastlín rozkladať xenobiotiká pri fytoremediácii.

5.1. Úprava genómu rastlín Keď sú známe sekvencie a funkcie génov, tieto poznatky sú využiteľné na úpravu genómu organizmu. Vznikajú tak geneticky modifikované organizmy, v dnešnej dobe využívané najmä v potravinárstve. Príkladom je Golden Rice Project (http://www.goldenrice.org/), jeden z prvých úspešných projektov využívajúcich genetické inžinierstvo na tvorbu sekundárneho metabolitu. Jeho účelom je zníženie nedostatku vitamínu A v strave obyvateľov rozvojových krajín. Nedostatok vitamínu A spôsobuje oslepnutie a zníženie imunity a jeho následkami trpia milióny detí. Tento projekt, spustený v roku 2001, poskytol niekoľkým krajinám semená geneticky upravenej ryže, z ktorých vyrástli rastliny významne obohatené o β-karotén, ktorý sa v tele premieňa na vitamín A. Gény je možné preniesť do bunky rôznymi biologickými, biochemickými, či fyzikálnymi spôsobmi. Ak je DNA prenášaná do eukaryotickej bunky, ide o transfekciu.

Vhodnou metódou pre úpravu rastlinných genómov je transfekcia pomocou baktérie Agrobacterium tumefaciens, ktorá je schopná svoj Ti plazmid preniesť do rastlinnej bunky. Tento plazmid v prirodzenom stave spôsobuje u napadnutej rastliny tvorbu nádoru, pre účely genetickej modifikácie je však najskôr upravený. Pomocou restrikčných enzýmov je rozštiepený plazmid aj cudzorodá DNA, z ktorej je vyštiepený fragment, ktorý má byť do bunky vložený, v tomto prípade obsahuje gén kódujúci požadovaný cytochróm P450. Následne sú oba reťazce spojené pomocou ligázy. Rekombinantná DNA je prijatá bakteriálnou bunkou, ktorá napáda rastlinnú bunku a prenesie do nej svoj plazmid, ktorý však po úprave nie je pre rastlinu nebezpečný. Po prijatí sa plazmid začleňuje do genómu rastliny a jeho gény sú exprimované ako rastlinné (Gelvin, 2003). Tento postup bol použitý napríklad na vloženie génu LACERATA, kódujúceho enzým CYP86A8, do mutantných rastlín Arabidopsis vykazujúcich vývojové abnormality, za účelom navrátenia normálneho fenotypu (Wellesen et al., 2001). Jednou z fyzikálnych metód transfekcie rastlinných buniek je biolistika. Princípom tejto metódy je vstreľovanie čiastočiek kovu (napr. zlata) pokrytých fragmentami DNA do bunky pomocou tzv. génovej pištole. Môže pôsobiť nielen na jadrovú DNA, ale aj na organely – túto metódu je teda možné použiť aj na úpravu chloroplastovej DNA. Vstrelená DNA môže zostať v extrachromozomálnom stave a udržať sa len dočasne (tzv. prechodná transfekcia), alebo sa začlení do chromozómu rastliny a zostáva v bunke dlhodobo (tzv. stabilná transfekcia). Ďalšou fyzikálnou metódou je elektroporácia. Pri tejto metóde sú rastlinné bunky vystavené krátkemu elektrickému pulzu o vysokom napätí. Následkom je elektrický šok, pri ktorom dôjde k dočasnému otvoreniu pórov v plazmatickej membráne bunky a DNA môže preniknúť dovnútra.

5.2. Využitie vo farmaceutickom priemysle Rastlinné sekundárne metabolity sú kvôli svojim účinkom na ľudský organizmus významné pre výrobu liečiv. Mnoho farmaceutík sa vyrába priamo z nich, alebo sú založené na ich chemickej štruktúre. Avšak nie všetky je možné vyťažiť z rastlín v dostatočnom množstve, alebo pripraviť synteticky za takú cenu, aby mohli byť bežne verejne dostupné. Umelé zvýšenie produkcie požadovaných látok rastlinou pomocou genetického inžinierstva umožňuje zníženie nákladov na výrobu liečiv a tým aj ich cenu. Veľkou skupinou sekundárnych metabolitov využívanou vo farmaceutickom priemysle a medicíne sú alkaloidy. Z morfínu a kodeínu sa vyrábajú silné analgetiká, chinín je významným liekom proti malárii, strychnín sa využíva na liečbu svalovej atrofie, či porúch 26 zraku a sluchu, efedrín zase na liečbu astmy, nízkeho tlaku a narkolepsie a veratrín na liečbu reumatizmu. Ďalšími účinkami alkaloidov sú napríklad antitusické, sedatívne, obstipačné, protihnačkové, vazodilatačné, antihyperglykemické, antibakteriálne, antipyretické, stimulačné a psychotropné účinky. Paclitaxel, taktiež známy ako taxol, je syntetizovaný cez terpenoidovú dráhu, na ktorej sa podieľajú cytochrómy P450. Je významným cytostatikom, využívaným na liečbu rakoviny vaječníka, prsníka, pľúc, krčka maternice, prostaty, tráviaceho traktu, leukémie, sarkómu a lymfómu. Izoluje sa z tisu krátkolistého (Taxus brevifolia), výťažok je však nízky, čo v minulosti spôsobilo jeho masívny výrub. Je známy kvôli svojej schopnosti podporovať polymerizáciu mikrotubulov v bunke a zastaviť bunkový cyklus rôznych typov buniek v mitóze. Mitóza sa zastavuje v metafáze, keď sa chromozómy dostanú do ekvatoriálnej roviny a ich centroméry sa prostredníctvom kinetochórov spájajú s deliacim vretienkom. Kinetochóry, ktoré nevytvorili stabilné spojenie s mikrotubulmi deliaceho vretienka, aktivujú signalizačnú kaskádu, ktorá odďaľuje ďalší priebeh mitózy (Weaver, 2014). Bipolárne usporiadanie sesterských chromatíd spôsobuje v kinetochóroch napätie, ktoré pomáha stabilizovať ich interakciu s mikrotubulmi. Paclitaxel spôsobuje uvoľnenie tohto napätia a spojenie je destabilizované, čím dochádza k zastaveniu mitózy (Waters et al., 1998). Toto zastavenie môže spôsobiť smrť bunky, alebo vznik tetraploidnej G1 bunky, ktorá môže ďalej normálne fungovať, zastaviť sa v tomto stave alebo taktiež zomrieť. Od akých faktorov závisí ďalší osud bunky zatiaľ nie je známe. Okrem tohto efektu, môže paclitaxel spôsobiť aj tvorbu multipolárneho deliaceho vretienka. V tomto prípade nedochádza k zastaveniu mitózy, ale chromozómy sa rozdeľujú niekoľkými smermi a môžu vzniknúť viac ako dve dcérske bunky, ktoré, pokiaľ prídu o dôležité chromozómy, zahynú (Weaver, 2014). Palina ročná (Artemisia annua) obsahuje enzým CYP71AV1, ktorý sa podieľa na syntéze prekurzoru antimalarika artemisinínu. Vložením génu CYP71AV1 a ďalších, ktoré sa na syntéze podieľajú, do kvasinky Saccharomyces cerevisiae bola uľahčená jeho produkcia (Ro et al., 2006). Medzi ďalšie rastlinné sekundárne metabolity využívané v medicíne ďalej patria napríklad ginsenosidy, triterpenické saponíny, či glycirrhizín (Rasool, Mohamed, 2015).

5.3. Využitie v poľnohospodárstve Už od pradávna sa ľudia prostredníctvom šľachtenia snažili získať rastliny na pestovanie s čo najlepšími vlastnosťami, dnes sú možnosti oveľa širšie vďaka tvorbe transgénnych rastlín. Pomocou génového inžinierstva je možné preniesť gén, ktorý obsahuje len niekoľko druhov rastlín, aj na rastliny kultúrne a dať im tak vlastnosti, ktoré by boli 27

šľachtením nedosiahnuteľné. Pridaním génov kódujúcich cytochrómy P450 do genómov kultúrnych plodín je možné zlepšiť ich obranyschopnosť, čo môže významne prispieť zvýšeniu výnosov. Rezistencia voči herbicídom umožňuje v poľnohospodárstve ich používanie na ochranu kultúrnych rastlín pred nežiaducou burinou bez toho, aby boli ohrozené pestované rastliny. Už pred dvadsiatimi rokmi sa podarilo vytvoriť transgénne rastliny tabaku (Nicotiana tabacum), ktoré obsahovali gén pre CYP71A10 zo sóje (Glycine max), katalyzujúci metabolizmus fenylmočovinových herbicídov na polárnejšie zložky. Takto pozmenené rastliny tabaku boli schopné ľahšie rozložiť herbicídy, čo zvýšilo ich toleranciu k obsahu týchto látok v prostredí (Siminszky, et al., 1999). Okrem rastlinných cytochrómov boli použité aj ľudské, ktoré voči herbicídom vykazujú širšiu substrátovú špecifitu a vyššiu aktivitu ako rastlinné (Inui, Ohkawa, 2005). Dôležitou funkciou ľudských cytochrómov P450 je metabolizmus xenobiotík, mnohé z nich sú schopné zneškodniť nielen herbicídy, ale aj insekticídy a priemyselné chemikálie. Okrem zlepšenia obranyschopnosti je značnou výhodou možnosť zrýchliť rast a vývin rastlín. Jeden z pomerne nedávnych výskumov sa zaoberá transgénnymi rastlinami tabaku a rajčiaku (Solanum lycopersicum) obsahujúcich cicavčí gén CYP11A1, kódujúci mitochondriálny enzým podieľajúci sa na tvorbe steroidov (Shpakovski et al., 2017). Táto štúdia dokázala, že zložky systému biosyntézy živočíšnych steroidných hormónov sú kompatibilné s hormonálnym systémom rastlín a môžu sa doňho aktívne zapájať, čím prispievajú k rastu, vývinu a imunite rastliny. Transgénne rastliny tabaku začali kvitnúť priemerne o 2 týždne skôr ako kontrolné rastliny, ich semená klíčili rýchlejšie a líšili sa taktiež výškou, priemerom stonky, veľkosťou listov, hmotnosťou semien a väčším množstvom biomasy a jej zrýchlenej tvorby. Okrem morfologických rozdielov vykazovali aj výrazne zvýšenú odolnosť voči patogénnej hube Botrytis cinerea. Preskúmané boli aj samotné rastlinné bunky - v transmisnom elektrónovom mikroskope boli badateľné zmeny v tvare mitochondrií, čo je dôkazom toho, že bolo možné vložiť funkčný cicavčí cytochróm P450 do rastlinnej mitochondrie. Transgénne rastliny rajčiaku vykazovali taktiež zrýchlený rast a vývin, ale aj zvýšenú odolnosť voči suchu, a po zaliatí vodou aktívnejšiu regeneráciu. Zmena fenotypu u oboch druhov rastlín je pravdepodobne spôsobená zvýšenou tvorbou progesterónu, ktorý bol objavený u mnohých rastlinných druhov a je kľúčový pre tvorbu steriodov. Ďalší výskumný tím sa venoval modifikácii syntézy brassinosteroidov pomocou rastlinného enzýmu CYP85A3, ktorý sa na ich syntéze podieľa (Jin et al., 2017). Táto štúdia

28 dokázala, že jeho nadmerná expresia podporuje tvorbu xylému bez toho, aby ovplyvnila zvyšok bunky. Transgénne rastliny topoľa (Populus davidiana × Populus bolleana) rástli rýchlejšie ako kontrolné rastliny - narástli vyššie, s hrubšou stonkou, väčšími listami a väčšou hmotnosťou výhonkov, a to vďaka zvýšenej produkcii xylému. Takto zrýchlený rast a zvýšená tvorba biomasy predstavuje potenciál génu CYP85A3 pre tvorbu geneticky modifikovaných rýchlo rastúcich stromov, čo môže nielen podporiť hospodárstvo a drevospracujúci priemysel, ale aj zlepšiť súčasnú ekologickú situáciu vysádzaním nových rýchlo rastúcich lesov. Ďalší z rodiny CYP85, CYP85A1 sa taktiež podieľa na syntéze brassinosteroidov. Jeho nadmerná expresia u transgénnych rastlín tabaku zlepšila vývoj koreňov a zvýšila tak odolnosť voči suchu. Okrem toho sa zvýšila aj ich tolerancia k vysokému obsahu solí v pôde (Duan et al., 2017). Inými spôsobmi ako vylepšiť obranu rastlín je úprava signálnych dráh zvýšením množstva alebo rýchlosti tvorby signálnych molekúl, či zvýšenie tvorby obranných látok, ktoré už rastlina obsahuje.

5.4. Fytoremediácia Okrem vylepšenia obranyschopnosti kultúrnych rastlín majú cytochrómy P450 ďalší význam, a to zlepšenie kvality nášho životného prostredia. Rastliny sú schopné metabolizovať xenobiotiká, ktorými môžu byť rôzne toxické chemické látky v pôde, vode, či ovzduší. Fytoremediácia je spôsob čistenia prostredia pomocou rastlín, ktoré z neho do seba vstrebú škodlivé látky a následne ich metabolizujú na menej toxické až úplne neúčinné. Jej jednoznačnými výhodami sú finančná nenáročnosť a bezpečnosť, pretože predstavujú minimálny zásah do prírody, hoci je táto metóda časovo náročnejšia a obmedzená hĺbkou, do ktorej korene rastlín siahajú. Jednými z významných polutantov sú už vyššie spomínané herbicídy. Ďalším využitím genetickej modifikácie rastlín a zlepšeniu ich schopnosti metabolizovať herbicídy je teda nie len ich vyššia odolnosť, ale aj očistenie prostredia. Herbicídy môžu totiž znečisťovať nie len pôdu, ale byť aj splavované do vôd a zabíjať fytoplanktón, čím môžu narúšať rovnováhu v ekosystéme. Aby boli rastliny schopné pôdu týchto látok zbaviť, musia byť voči nim rezistentné, pretože znečistenie prostredia zastavuje ich rast. Taktiež by mali mať veľké množstvo biomasy, aby mohli vstrebať a premeniť väčšie množstvo škodlivín a mali by byť ľahko kultivovateľné (Kawahigashi, 2009). Cytochrómy P450 sa podieľajú na prvej fáze metabolizmu xenobiotík, kde dochádza k ich premene na menej hydrofóbne látky. Transgénne rastliny obsahujúce cicavčie cytochrómy, ako napríklad CYP1A1, CYP2B6 a CYP2C19, vykazovali schopnosť

29 metabolizovať širšie spektrum látok. Obr. 3 znázorňuje cytochrómy, ktoré sa podieľajú na metabolizme konkrétnych pesticídov (Inui, Ohkawa, 2005).

Obr. 3: P450-dependentné metabolické reakcie herbicídov a ďalších chemikálií (Inui, Ohkawa, 2005).

Škodlivé látky sa však nenachádzajú len v pôde a vode, ale aj vo vzduchu a to aj priamo v ľudských obydliach. Patria medzi ne napríklad benzén, toulén a formaldehyd, ktoré sa nachádzajú vo farbách, lepidlách a čistiacich prostriedkoch a ich hromadenie v obytných priestoroch môže predstavovať zdravotné riziko. Hoci ich rastliny prirodzene dokážu vstrebať cez listy a rozložiť, táto schopnosť zvyčajne nie je efektívna. Na jej vylepšenie bol použitý gén kódujúci enzým CYP2E1 z cicavčej pečene. Jeho začlenenie do genómu petúnie (Petunia hybrida) spôsobilo zvýšenie schopnosti tejto rastliny odstrániť benzén a toulén z ovzdušia a zvýšenie rezistencie voči formaldehydu obsiahnutému v kultivačnom médiu. Absorpcia benzénu a toulénu bola meraná kvantitatívnou plynovou chromatografiou (Zhang et al., 2011). CYP2E1 je schopný metabolizovať aj ďalšie nebezpečné polutanty, ako napríklad trichlóretylén a dibrómetán (Doty et al., 2000).

5.5. Využitie v potravinárstve a význam v ľudskej strave Rastlinné sekundárne metabolity sú bežne využívané v potravinárstve ako arómy, ochucovadlá, či korenia. Známym ochucovadlom je napríklad vanilín, ktorý sa využíva okrem potravinárskeho priemyslu aj pri výrobe mydiel, či parfémov. Okrem toho môžu byť použité aj ako konzervanty (Tsukiyama et al., 2002) Sú však aj dôležitou zložkou stravy, prispievajúce k nášmu zdraviu. Významné sú napríklad flavonoidy, polyfenoly, izotiokyanáty, či karotenoidy. Sú to antioxidanty, ktoré v ľudskom tele vychytávajú kyslíkové a dusíkové radikály a zabraňujú tak vzniku oxidačného stresu, ktorý spôsobuje kardiovaskulárne ochorenia a poškodenie DNA spojené so vznikom rakoviny. Pravdepodobne najznámejším sekundárnym metabolitom, ktorý je bežne konzumovaný, je kofeín. Jeho príjem pre organizmus síce nie je nevyhnutný, no vďaka svojim povzbudzujúcim účinkom je veľmi obľúbený. Ďalšími konzumovanými alkaloidmi sú teobromín a chinín. Genetické inžinierstvo je využiteľné aj na zvýšenie produkcie zdraviu prospešných látok v kultúrnych plodinách. Príkladom sú látky vznikajúce na glukozinolátovej dráhe, ktoré majú protirakovinové účinky (Arumugam, Razis, 2018), či metabolity fenylpropanoidovej dráhy. Jedným z nich je genisteín, jednoduchý izoflavonoid s protirakovinovými účinkami. Tie sú zrejme spôsobené jeho schopnosťou zastavovať angiogenézu, teda tvorbu nových kapilár, ktoré by nádor vyživovali (Varinska et al., 2015). Prirodzene sa nachádza v obmedzenom množstve rastlín, napríklad v sóji, ktorá tvorí významnú zložku stravy v Ázii. Genisteín je spájaný práve s tamojším zníženým výskytom rakoviny a kardiovaskulárnych ochorení a preto je objektom záujmu pre tvorbu zdraviu prospešných transgénnych rastlín. Má štruktúru podobnú estrogénu, zaraďuje sa medzi fytoestrogény a je produktom enzýmu CYP93C (Morant et al., 2003). Významnou alternatívou úpravy genómu je zvýšenie nutričnej hodnoty plodín, či odstránenie ich toxických zložiek, za ktorých tvorbu zodpovedajú cytochrómy P450 pomocou cielených mutácií v génoch, ktoré ich kódujú. Príkladom je maniok jedlý (Manihot esculenta), ktorého koreň je významnou súčasťou stravy obyvateľov rozvojových krajín a vyrába sa z neho tapioková múka, vhodná pre alergikov. Obsahuje však toxické kyanogénne glykozidy linamarín a lotaustralín, na ktorých syntéze sa podieľajú enzýmy CYP79D1 a CYP79D2 (Morant et al., 2003).

6. Záver Napriek tomu, že boli cytochrómy P450 objavené už pred vyše päťdesiatimi rokmi (Omura, Sato, 1964), mnoho z ich funkcií zostáva naďalej neznámych. Vďaka dostupnosti sekvenácie genómov sa vynárajú stále nové gény s novými funkciami, ktoré sú postupne analyzované a charakterizované. Vo všeobecnosti je ich funkciou katalýza reakcií pri tvorbe sekundárnych metabolitov. Ich význam pre rastliny je nepopierateľný, pretože sa zúčastňujú reakcií už na samotných začiatkoch dôležitých metabolických dráh, ktoré vedú k vzniku množstva rôznych metabolitov, ktoré majú v rastlinách taktiež odlišné funkcie, ktorých poznanie sa neustále prehlbuje. Jedná sa o stavebné látky (napr. lignín), látky chrániace rastlinu pred abiotickými faktormi (napr. kutín) aj patogénmi (napr. suberín, či rôzne fytoalexíny), fytohormóny či pigmenty. Hoci sa nejedná o metabolity primárne, porucha v ich syntéze môže značne znížiť životaschopnosť rastliny. Sekundárne metabolity môže do veľkej miery využívať aj človek. Významné sú pre nás antioxidačné schopnosti látok ako sú flavonoidy, ktoré môžeme bežne prijímať z rastlinnej potravy a chránia nás pred zdravotnými problémami spôsobenými oxidačným stresom. Rôzne sekundárne metabolity izolované z rastlín sa využívajú pri výrobe liečiv, aróm a ochucovadiel, no využiteľné sú aj samotné enzýmy P450 v rastlinách. Ich účasť pri rozkladaní škodlivých látok sa využíva pre očistenie životného prostredia prostredníctvom fytoremediácie. Možnosti využitia sekundárnych metabolitov sú stále rozvíjané rozličnými smermi za pomoci genetického inžinierstva, ktoré sa zaoberá úpravou genómu, vrátane génov kódujúcich tieto cytochrómy. Cieľmi do budúcnosti je zjednodušenie zložitej a nákladnej produkcie liečiv, ktoré momentálne nie sú komerčne dostupné, zvýšenie výnosov v poľnohospodárstve na základe zlepšenej obranyschopnosti rastlín a využitie a zvýšenie efektívnosti transgénnych rastlín pri fytoremediácii, nakoľko ide o jednoduchú a finančne nenáročnú metódu, ktorá nenarúša prostredie. Najskôr je však potrebné enzýmy P450 a ich gény podrobne preskúmať a spoznať ich vlastnosti a funkcie, na ktorých sa potom môžu zakladať ďalšie výskumy.

7. Prehľad literatúry

Almajano M. P., Delgado M. E., Gordon M. H. 2007. Albumin causes a synergistic increase in the antioxidant activity of green tea catechins in oil-in-water emulsions. Food Chem. 102: 1375-1382.

Arumugam A., Razis A. F. A. 2018. Apoptosis as a Mechanism of the cancer Chemopreventive Activity of Glucosinolates: a Review. Asian Pac. J. Cancer Prev. 19(6): 1439-1448.

Bais H. P., Walker T. S., Stermitz F. R., Hufbauer R. A., Vivanco J. M. 2002. Enantiomeric-Dependent Phytotoxic and Antimicrobial Activity of (±)-Catechin. A Rhizosecreted Racemic Mixture from Spotted Knapweed. Plant Physiol. 128: 1173-1179.

Bak S., Kahn R. A., Olsen C. E., Halkier B. A. 1997. Cloning and expression in Escherichia coli of the obtusifoliol 14α-demethylase of Sorghum bicolor (L.) Moench, a cytochrome P450 orthologous to the sterol 14α-demethylases (CYP51) from fungi and mammals. Plant J. 11(2): 191-201.

Bak S., Beisson F., Bishop G., Hamberger B., Höfer R., Paquette S., Werck-Reichhart S. 2011. Cytochromes P450. The Arabidopsis Book. Vol. 2011 | No. 9. DOI: 10.1199/tab.0144.

Bishop G. J., Nomura T., Yokota T., Harrison K., Noguchi T., Fujioka S., Takatsuto S., Jones J. D. G., Kamiya Y. 1999. The tomato DWARF enzyme catalyses C-6 oxidation in brassinosteroid biosynthesis. Plant Biol. 96: 1761-1766.

Blair A. C., Nissen S. J., Brunk G. R., Hufbauer R. A. 2006. A Lack of Evidence for an Ecological Role of the Putative Allelochemical (±)-Catechin in Spotted Knapweed Invasion Success. J. Chem. Ecol. 32: 2327-2331.

Cabello-Hurtado F., Zimmerlin A., Rahier A., Taton M., DeRose R., Nedelkina S., Batard Y., Durst F., Pallett K. E., Werck-Reichhart D. 1997. Cloning and Functional Expression in Yeast of a cDNA Coding for an Obtusifoliol 14α-demethylase (CYP51) in Wheat. Biochem. Bioph. Res. Co. 230: 381-385.

Denisov I. G., Baas B. J., Grinkova Y. V., Sligar S. G. 2007. Cooperativity in cytochrome P450 3A4: linkages in substrate binding, spin state, uncoupling, and product formation. J. Biol. Chem. 282: 7066-7076.

Doty S. L., Shang T. Q., Wilson A. M., Tangen J., Westergreen A. D., Newman L. A., Strand S. E., Gordon M. P. 2000. Enhanced metabolism of halogenated hydrocarbons in transgenic plants containing mammalian cytochrome P450 2E1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97(12): 6287-6291.

Duan F., Ding J., Lee D., Lu X., Feng Y., Song W. 2017. Overexpression of SoCYP85A1, a Spinach Cytochrome p450 Gene in Transgenic Tobacco Enhances Root Development and Drought Stress Tolerance. Front. Plant Sci. 8: 1909. DOI: 10.3389/fpls.2017.01909.

Duke S. O., Dayan F. E., Bajsa J., Meepagala K. M., Hufbauer R. A., Blair A. C. 2009. The case against (-)-catechin involvement in allelopathy of Centaurea stoebe (spotted knapweed). Plant Signaling & Behavior. 4(5): 422-424.

Fujita S., Ohnishi T., Watanabe B., Yokota T., Takatsuto S., Fujioka S., Yoshida S., Sakata K., Mizutani M. 2006. Arabidopsis CYP90B1 catalyses the early C-22

hydroxylation of C27, C28 and C29 sterols. Plant J. 45: 765-774.

Fukai K., Ishigami T., Hara Y. 1991. Antibacterial Activity of Tea Polyphenols against Phytopathogenic Bacteria. Agric. Biol. Chem. 55(7): 1895-1897.

Gelvin S. B. 2003. Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the “Gene-Jockeying” Tool. Microbiol. Mol. Biol. R. 67(1): 16-37.

Gnerre C., Catto M., Leonetti F., Weber P., Carrupt P. A., Altomare C., Carotti A., Testa B. 2000. Inhibition of Monoamine Oxidases by Functionalized Coumarin Derivatives: Biological Activities, QSARs, and 3D-QSARs. J. Med. 43: 4747-4758.

Gou M., Ran X., Martin D. W., Liu C. J. 2018. The scaffold proteins of lignin biosynthetic cytochrome P450 enzymes. Nat. Plants. 4: 299-310.

Greer S., Wen M., Bird D., Wu X., Samuels L., Kunst L., Jetter R. 2007. The Cytochrome P450 Enzyme CYP96A15 Is the Midchain Alkane Hydroxylase Responsible for Formation of Secondary Alcohols and Ketones in Stem Cuticular Wax of Arabidopsis. Plant Physiol. 145: 653-667.

Gudesblat G. E., Russinova E. 2011. Plants grow on brassinosteroids. Curr. Opin. Plant Biol. 14(5): 530-537.

Helliwell C. A., Sheldon C. C., Olive M. R., Walker A. R., Zeevaart J. A., Peacock W. J., Dennis E. S. 1998. Cloning of the Arabidopsis ent-kaurene oxidase gene GA3. Plant Biol. 95: 9019-9024.

Helliwell C. A., Chandler P. M., Poole A., Dennis E. S., Peacock W. J., 2000. The CYP88A cytochrome P450, ent-kaurenoic acid oxidase, catalyzes three steps of the gibberellin biosynthesis pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(4): 2065-2070.

Höfer R., Briesen I., Beck M., Pinot F., Schreiber L., Franke R. 2008. The Arabidopsis cytochrome P450 CYP86A1 encodes a fatty acid ω-hydroxylase involved in suberin monomer biosynthesis. J. Exp. Bot. 59(9): 2347-2360.

Ilc T., Arista G., Tavares R., Navrot N., Duchêne E., Velt A., Choulet F., Paux E., Fischer M., Nelson D. R., Hugueney P., Werck-Reichhart D., Rustenholz C. 2018. Annotation, classification, genomic organization and expression of the Vitis vinifera CYPome. PLOS ONE. 13(6): e0199902. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199902.

Inui H., Ohkawa H. 2005. Herbicide resistance in transgenic plants with mammalian P450 monooxygenase genes. Pest Manag. Sci. 61: 286-291.

Ivamoto S. T., Domingues D. S., Vieira L. G. E., Pereira L. F. P. 2015. Identification of the transcriptionally active cytochrome P450 repertoire in Coffea arabica. Genet. Mol. Res. 14(1): 2399-2412.

Jin Y. L., Tang R. J., Wang H. H., Jiang C. M., Bao Y., Yang Y., Liang M. X., Sun Z. C., Kong F. J., Li B., Zhang H. X. 2017. Overexpression of Populus trichocarpa CYP85A3 promotes growth and biomass production in transgenic trees. Plant Biotechnol. J. 15: 1309-1321.

Kawahigashi H. 2009. Transgenic plants for phytoremediation of herbicides. Curr. Opin. Biotechnol. 20: 225-230.

Kim J., DellaPenna D. 2006. Defining the primary route for lutein synthesis in plants: The role of Arabidopsis carotenoid β-ring hydroxylase CYP97A3. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103(9): 3474-3479.

Kostova I., Raleva S., Genova P., Argirova R. 2006. Structure-Activity Relationships of Synthetic Coumarins as HIV-1 Inhibitors. Bioinorg. Chem. Appl. Vol. 2006. Article ID: 68274. Pages 1-9. DOI: 10.1155/BCA/2006/68274.

Krieger C., Roselli S., Kellner-Thielmann S., Galati G., Schneider B., Grosjean J., Olry A., Ritchie D., Matern U., Bourgaud F., Hehn A. 2018. The CYP71AZ P450 Subfamily: A Driving Factor for the Diversification of Coumarin Biosynthesis in Apiaceous Plants. Front. Plant Sci. 9:820. DOI: 10.3389/fpls.2018.00820.

Larbat R., Kellner S., Specker S., Hehn A., Gontier E., Hans J., Bourgaud F., Matern U. 2007. Molecular Cloning and Functional Characterization of Psoralen Synthase, the First Committed Monooxygenase of Furanocoumarin Biosynthesis. J. Biol. Chem. 282(1): 542-554.

Laurin P., Ferroud D., Klich M., Dupuis-Hamelin C., Mauvais P., Lassaigne P., Bonnefoy A., Musicki B. 1999. Synthesis and in vitro evaluation of novel highly potent coumarin inhibitors of gyrase B. Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 2079-2084.

León J., Shulaev V., Yalpani N., Lawton M. A., Raskin I. 1995. Benzoic acid 2-hydroxylase, a soluble oxygenase from tobacco, catalyzes salicylic acid biosynthesis. Plant Biol. 92: 10413-10417.

Li J., Ou-Lee T. M., Raba R., Amundson R. G., Last R. L. 1993. Arabidopsis Flavonoid Mutants Are Hypersensitive to UV-B Irradiation. Plant Cell. 5: 171-179.

Li W., Zangerl A. R., Schuler M. A., Berenbaum M. R. 2004. Characterization and evolution of furanocoumarin-inducible cytochrome P450s in the parsnip webworm, Depressaria pastinacella. Insect Mol. Biol. 13(6): 603-613.

Matasci N., Hung L. H., Yan Z., Carpenter E. J., Wickett N. J., Mirarab S., Nguyen N., Warnow T., Ayyampalayam S., Barker M., Burleigh J. G., Gitzendanner M. A., Wafula E., Der J. P., dePamphilis C. W., Roure B., Philippe H., Ruhfel B. R., Miles N. W., Graham S. W., Mathews S., Surek B., Melkonian M., Soltis D. E., Soltis P. S., Rothfels C., Pokorny L., Shaw J. A., DeGironimo L., Stevenson D. W., Villarreal J. C., Chen T., Kutchan T. M., Rolf M., Baucom R. S., Deyholos M. K., Samudrala R., Tian Z., Wu X., Sun X., Zhang Y., Wang J., Leebens-Mack J., Wong. G. K. S. 2014. Data access for the 1,000 Plants (1KP) project. GigaScience. 3:17, [cit. 4. Februára 2019].

Métraux J. P., Signer H., Ryals J., Ward E., Wyss-Benz M., Gaudin J., Raschdorf K., Schmid E., Blum W., Inverardi B. 1990. Increase in Salicylic Acid at the Onset of Systemic Acquired Resistance in Cucumber. Science. 250: 1004-1006.

Mizutani M. 2012. Impacts of Diversification of Cytochrome P450 on Plant Metabolism. Biol. Pharm. Bull. 35(6): 824-832.

Mochida K., Sakurai T., Seki H., Yoshida T., Takahagi K., Sawai S., Uchiyama H., Muranaka T., Saito K. 2017. Draft genome assembly and annotation of Glycyrrhiza uralnesis, a medicinal legume. Plant J. 89: 181-194.

Mongrand S., Morel J., Laroche J., Claverol S., Carde J. P., Hartmann M. A., Bonneu M., Simon-Plas F., Lessire R., Bessoule J. J. 2004. Lipid Rafts in Higher Plant Cells. J. Biol. Chem. 279(35): 36277-36286.

Morant M., Bak S., Møller B. L., Werck-Reichhart D. 2003. Plant cytochromes P450: tools for pharmacology plant protection and phytoremediation. Curr. Opin. Biotechnol. 14: 151-162.

Morikawa T., Mizutani M., Aoki N., Watanabe B., Saga H., Saito S., Oikawa A., Suzuki H., Sakurai N., Shibata D., Wadano A., Sakata K., Ohta D. 2006. Cytochrome P450 CYP710A Encodes the Sterol C-22 Desaturase in Arabidopsis and Tomato. The Plant Cell. 18: 1008-1022.

Nelson D. R., Schuler M. A., Paquette S. M., Werck-Reichhart D., Bak S. 2004. Comparative Genomics of Rice and Arabidopsis. Analysis of 727 Cytochrome P450 Genes and Pseudogenes from a Monocot and a Dicot. Plant Physiol. 135: 756-772.

Nelson D. R., Werck-Reichhart D. 2011. A P450-centric view of plant evolution. Plant J. 66: 194-211.

Nelson D. R. 2017. Cytochrome P450 diversity in the tree of life. Biochim. Biophys. Acta Proteins Proteom. 1866: 141-154.

Nomura T., Kushiro T., Yokota T., Kamiya Y., Bishop G. J., Yamaguchi S. 2005. The Last Reaction Producing Brassinolide Is Catalyzed by Cytochrome P-450s, CYP85A3 in Tomato and CYP85A2 in Arabidopsis. J. Biol. Chem. 280(18): 17873-17879.

Nyrén P. 1987. Enzymatic Method for Continuous Monitoring of DNA Polymerase Activity. Anal. Biochem. 167: 235-238.

Ohnishi T., Szatmari A. M., Watanabe B., Fujita S., Bancos S., Koncz C., Lafos M., Shibata K., Yokota T., Sakata K., Szekeres M., Mizutani M. 2006. C-23 Hydroxylation by Arabidopsis CYP90C1 and CYP90D1 Reveals a Novel Shortcut in Brassinosteroid Biosynthesis. Plant Cell. 18: 3275-3288.

Omura T., Sato R. 1964. The Carbon Monoxide-binding Pigment of Liver Microsomes: I. EVIDENCE FOR ITS HEMOPROTEIN NATURE. J. Biol. Chem. 239: 2370-2378.

Prall W., Hendy O., Thornton L. E. 2016. Utility of a Phylogenetic Perspective in Structural Analysis of CYP72A Enzymes from Flowering Plants. PLOS ONE. 11(9): e0163024. DOI:10.1371/journal.pone.0163024.

Qian W., Wu Ch., Fu Y., Hu G., He Z., Liu W. 2017. Novel rice mutants overexpressing the brassinosteroid catabolic gene CYP734A4. Plant Mol. Biol. 93: 197-208.

Quinlan R. F., Jaradat T. T., Wurtzel E. T. 2007. Escherichia coli as a platform for functional expression of plant P450 carotene hydroxylases. Arch. Biochem. Biophys. 458: 146-157.

Raj H. G., Parmar V. S., Jain S. C., Goel S., Poonam, Himanshu, Malhotra S., Singh A., Olsen C. E., Wengel J. 1998. Mechanism of Biochemical Action of Substituted 4-Methylbenzopyran-2-ones. Part I: Dioxygenated 4-Methyl Coumarins as Superb Antioxidant and Radical Scavenging Agents. Bioorgan. Med. Chem. 6: 833-839.

Ramilowski J. A., Sawai S., Seki H., Mochida K., Yoshida T., Sakurai T., Muranaka T., Saito K., Daub C. O. 2013. Glycyrrhiza uralensis Transcriptome Landscape and Study of Phytochemicals. Plant Cell Physiol. 54(5): 697-710.

Rasool S., Mohamed R. 2016. Plant cytochrome P450s: nomenclature and involvement in natural product biosynthesis. Protoplasma. 253: 1197-1209.

Riveiro M. E., Vazquez R., Moglioni A., Gomez N., Baldi A., Davio C., Shayo C. 2008. Biochemical mechanisms underlying the pro-apoptotic activity of 7,8-dihydroxy-4-methylcoumarin in human leukemic cells. Biochem. Pharmacol. 75: 725-736.

Ro D. K., Paradise E. M., Ouellet M., Fisher K. J., Newman K. L., Ndungu J. M., Ho K. A., Eachus R. A., Ham T. S., Kirby J., Chang M. C. Y., Withers S. T., Shiba Y., Sarpong R., Keasling J. D. Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast. Nature. 440: 940-943.

Russel D. W. 1971. The Metabolism of Aromatic Compounds in Higher Plants. J. Biol. Chem. 246(12): 3870-3878.

Saito S., Hirai N., Matsumoto C., Ohigashi H. Ohta D., Sakata K., Mizutani M. 2004. Arabidopsis CYP707As Encode (+)-Abscisic Acid 8´-Hydroxylase, a Key Enzyme in the Oxidative Catabolism of Abscisic Acid. Plant Physiol. 134: 1439-1449.

Schilmiller A. L., Stout J., Weng J. K., Humphreys J., Ruegger M. O., Chapple C. 2009. Mutations in the cinnamate 4-hydroxylase gene impact metabolism, growth and development in Arabidopsis. Plant J. 60: 771-782.

Shendure J., Porreca G. J., Reppas N. B., Lin X., McCutcheon J. P., Rosenbaum A. M., Wang M. D., Zhang K., Mitra R. D., Church G. M. 2005. Accurate Multiplex Polony Sequencing of an Evolved Bacterial Genome. Science. 309: 1728-1732.

Shpakovski G. V., Spivak S. G., Berdichevets I. N., Babak O. G., Kubrak S. V., Kilchevsky A. V., Aralov A. V., Slovokhotov I. Y., Shpakovski D. G., Baranova E. N., Khaliluev M. R., Shematorova E. K. 2017. A key enzyme of animal steroidogenesis can function in plants enhancing their immunity and accelerating the processes of growth and development. BMC Plant Biol. 17(1): 119-131.

Siminszky B., Corbin F. T., Ward E. R., Fleischmann T. J., Dewey R. E. 1999. Expression of a soybean cytochrome P450 monooxygenase cDNA in yeast and tobacco enhances the metabolism of phenylurea herbicides. Plant Biol. 96: 1750-1755.

Sitnicka D., Figurska K., Orzechowski S. 2014. Functional Analysis of Genes. Medical Journal of Cell Biology. 2(1): 1-16. DOI: 10.2478/v10052-010-0001-y.

Takahashi A., Takeda K., Ohnishi T. 1991. Light-Induced Anthocyanin Reduces the Extent of Damage to DNA in UV-Irradiated Centaurea cyanus Cells in Culture. Plant Cell Physiol. 32(4): 541-547.

Takei K., Yamaya T., Sakakibara H. 2004. Arabidopsis CYP735A1 and CYP735A2 Encode Cytokinin Hydroxylases That Catalyze the Biosynthesis of trans-Zeatin. J. Biol. Chem. 279(40): 41866-41872.

Tanaka Y., Tsuda S., Kusumi T. 1998. Metabolic Engineering to Modify Flower Color. Plant Cell Physiol. 39(11): 1119-1126.

Tanaka Y., Brugliera F. 2013. Flower colour and cytochromes P450. Philos. Trans. R. Soc. B. 368: 20120432, [cit. 19. apríla 2019].

Tian L., Musetti V., Kim J., Magallanes-Lundback M., DellaPenna D. 2004. The Arabidopsis LUT1 locus encodes a member of the cytochrome P450 family that is required for carotenoid ε-ring hydroxylation activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(1): 402-407.

Tsukiyama R., Katsura H., Tokuriki N. Koayashi M. 2002. Antibacterial Activity of Licochalcone A against Spore-Forming Bacteria. Antimicrob. Agents Ch. 46(5): 1226-1230.

Varinska L., Gal P., Mojzisova G., Mirossay L., Mojzis J. 2015. Soy and Breast Cancer: Focus on Angiogenesis. Int. J. Mol. Sci. 16: 11728-11749.

Vogt T. 2010. Phenylpropanoid Biosynthesis. Mol. Plant. 3(1): 2-20. DOI: 10.1093/mp/ssp106

Wang K., Senthil-Kumar M., Ryu C. M., Kang L., Mysore K. S. 2012. Phytosterols Play s Key Role in Plant Innate Immunity against Bacterial Pathogens by Regulating Nutrient Efflux into the Apoplast. Plant Physiol. 158: 1789-1802.

Waters J. C., Chen R. H., Murray A. W., Salmon E. D. 1998. Localization of Mad2 to Kinetochores Depends on Microtubule Attachment, Not Tension. J. Cell Biol. 141(5): 1181-1191.

Weaver B. A. 2014. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol. Biol. Cell. 25: 2677-2681.

Wellesen K., Durst F., Pinot F., Benveniste I., Nettesheim K., Wisman E., Steiner-Lange S., Saedler H., Yephermov A. 2001. Functional analysis of the LACERATA gene of Arabidopsis provides evidence for different roles of fatty acid ω-hydroxylation in development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(17): 9694-9699.

Werck-Reichhart D., Feyereisen R. 2000. Cytochromes P450: a success story. Genome Biol. 1(6): reviews3003.1–reviews3003.9, [cit. 30. januára 2019].

< http://genomebiology.com/2000/1/6/reviews/3003.1>

Williams P.A., Cosme J., Sridhar V., Johnson E. F., McRee D. E. 2000. Mammalian Microsomal Cytochrome P450 Monooxygenase: Structural Adaptations for Membrane Binding and Functional Diversity. Mol. Cell. 5: 121-131.

Xiao F., Goodwin S. M., Xiao Y., Sun Z., Baker D., Tang X., Jenks M. A., Zhou J. M. 2004. Arabidopsis CYP86A2 represses Pseudomonas syringae type III genes and is required for cuticle development. EMBO J. 23: 2903-2913.

Yalpani N., Silverman P., Wilson T. M. Kleier D. A., Raskin I. 1991. Salicylic Acid Is a Systemic Signal and an Inducer of Pathogenesis-Related Proteins in Virus-Infected Tobacco. Plant Cell. 3: 809-818.

Zhang D., Xiang T., Li P., Bao L. 2011. Transgenic plants of Petunia hybrida harboring the CYP2E1 gene efficiently remove benzene and toluene pollutants and improve resistance to formaldehyde. Genet. Mol. Biol. 34(4): 634-639.

Zhu Y., Nomura T., Xu Y., Zhang Y. Peng Y., Mao B., Hanada A., Zhou H. Wan R., Li P., Zhu X., Mander L. N., Kamiya Y., Yamaguchi S., He Z. 2006. ELONGATED UPPERMOST INTERNODE Encodes a Cytochrome P450 Monooxygenase That Epoxidizes Gibberellins in a Novel Deactivation Reaction in Rice. Plant Cell. 18: 442-456.