植物生理学报 Physiology Journal 2017, 53 (5): 839–848 doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2017.1003 839

甘薯及其近缘野生种Ipomoea lacunosa种间体细胞杂种的特性鉴定和遗 传组成分析 贾礼聪, 翟红, 何绍贞, 孙亚萍, 杨育峰, 刘庆昌* 中国农业大学农业部甘薯生物学与生物技术重点实验室/教育部作物杂种优势研究与利用重点实验室/北京市作物遗传改 良重点实验室, 北京100193

摘要: 以甘薯( batatas)品种‘徐薯18’ (2n=6x=90)及其近缘野生种I. lacunosa (K61, 2n=2x=30)的种间体细胞杂种XL1 为材料, 利用形态学与细胞学分析、酯酶同工酶、重金属离子胁迫的离体鉴定、扩增片段长度多态性(AFLP)、甲基化敏 感扩增多态性(MSAP)等技术对XL1的特性和遗传组成进行了分析。结果表明, XL1对铝和铬的耐受性显著高于‘徐薯18’, 胁迫条件下, XL1的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性显著高于‘徐薯18’, 而丙二醛(MDA)含量显著低于‘徐薯 18’。XL1的基因组含有双亲的特异条带和改变的条带, XL1的胞嘧啶甲基化位点由双亲的特异位点和改变的位点组成, XL1中‘徐薯18’特异的基因组条带和甲基化位点比例显著高于I. lacunosa的比例。XL1具有与‘徐薯18’相同的叶绿体和线 粒体基因组组成。本研究进一步证明了体细胞杂交在甘薯遗传改良上的重要作用, 同时, 本研究结果将有助于甘薯近缘野 生种中的有益基因发掘, 也有助于进一步理解甘薯栽培种的进化和系统发育。 关键词: 甘薯; I. lacunosa; 体细胞杂种; 特性鉴定; 遗传和表观遗传变异

甘薯[Ipomoea batatas, 2n=6x=90]是重要的粮 和表观遗传上的巨大改变, 这些改变可以导致体 食、饲料、工业原料和新型能源作物, 其适用性 细胞杂种表型的多样性(Liu和Xia 2014; Xu等 广, 耐贫瘠性强, 具有重要的经济价值和广阔的开 2014)。因此, 在获得体细胞杂种后, 明确体细胞杂 发利用前景, 在我国粮食安全和能源安全中起着 种内的双亲遗传组分可以从遗传本质上认识体细 非常重要的作用(Zang等2009; 李爱贤等2009; Liu 胞杂种, 这样既有利于了解杂种遗传组分的遗传规 2011)。改良甘薯的产量、品质和抗性是甘薯的重 律, 也可以探讨双亲遗传物质间的互作以及细胞核 要育种目标。 与细胞质遗传物质间的互作。进而在获得表型后, 甘薯近缘野生种中含有许多甘薯中所不具有 可以深入探究杂种遗传组成与表型性状之间的关 的高淀粉、抗病虫、抗逆等优良基因, 为改良甘 系, 为体细胞杂种用于育种实践奠定基础。 薯品种和拓宽甘薯基因库提供了重要的基因资源 I. lacunosa (K61, 2n=2x=30)对土壤中高浓度 (Huang和Sun 2000; Cao等2009)。然而甘薯组植物 的金属离子具有较好的耐受性(Kambhampati等 间存在的种间有性杂交不亲和性, 使甘薯近缘野 2003)。Zhang等(2002)诱导融合甘薯品种‘徐薯18’ 生种优良基因资源的利用受到限制(Dhir等 和I. lacunosa的原生质体, 获得了甘薯种间体细胞 1998)。体细胞杂交技术可以很好地实现远缘物种 杂种, 并从中筛选得到一个具有膨大块根的杂种, 之间遗传物质的交流, 被证明是一种克服有性杂 命名为XL1。但是对于XL1的特性和遗传组成尚 交不亲和的有效方法。目前, 利用原生质体融合 未明确, 因此, 本研究以XL1及其亲本‘徐薯18’与 的方法, 已经获得了甘薯及其近缘野生种的大量 I. lacunosa为材料, 研究体细胞杂种XL1的特性和 种间体细胞杂种。例如, 由甘薯与抗旱的野生种 遗传组成, 探讨体细胞杂交过程引起的遗传与表 I. triloba的融合原生质体获得体细胞杂种植株(Liu 观遗传变异对体细胞杂种表型的可能影响, 为进 等1993; Yang等2009); 由甘薯与抗根腐病和抗根结 一步获得具有野生种优良基因和甘薯优良农艺性 状的育种材料 以及更好地了解甘薯的进化与系 线虫病的野生种I. trifida (4x)的融合原生质体获得 , 统发育奠定基础。 了再生植株(Belarmino 1993); 由甘薯与耐病毒的 野生种I. cairica的融合原生质体获得体细胞杂种 植株(Guo等2006)。 收稿 2017-02-15 修定 2017-05-03 资助 国家甘薯产业技术体系(CARS-11)和国家自然科学基金 许多研究表明 新形成的体细胞杂种在双亲 , (31461143017)。 遗传物质相互适应的过程中, 会产生基因组结构 * 通讯作者(E-mail: [email protected]) 840 植物生理学报

材料与方法 7 细胞质基因组分析 参照 等 的方法 用叶绿体基因组 1 植物材料 Jia (2016) , 和线粒体基因组 的通用简单序列重复 以甘薯[Ipomoea batatas (L.) Lam.]品种‘徐薯 DNA DNA 引物 分析体细胞杂 18’、近缘野生种I. lacunosa及其种间体细胞杂种 (simple sequence repeat, SSR) , 种 的叶绿体和线粒体基因组组成。 XL1植株为材料, 将其培养在MS固体培养基上进 XL1 行扩繁以备研究, 培养条件为(27±1)°C, 光照13 h·d-1, 8 数据处理 光强54 µmol·m-2·s-1。 用Microsoft Excel整理数据, SPSS 19.0软件进 2 形态学鉴定 行方差分析, 测定结果以平均数±标准差表示。 将体细胞杂种XL1及其亲本的离体培养植株 实验结果 移栽至温室成活后, 种植于大田进行形态学观 察。种植90 d后, 参照陆漱韵等(1998)书中的标准, 1 体细胞杂种XL1的特性 观察并记录植株的形态学特征。 将体细胞杂种XL1及其亲本‘徐薯18’和I. la- 3 染色体数分析 cunosa的离体培养植株移栽到营养钵中, 3月份在 参照刘庆昌等(1998)的方法进行染色体数分 温室驯化, 植株100%存活。5月上旬移栽到大田, 析, 取在MS固体培养基上继代培养3 d后形成的幼 90 d后观察记录地上部的形态特征, 10月中旬收获 根为材料, 采用火焰干燥法制片, 随机观察10个分 薯块, 观察记录地下部的形态特征。结果显示, 裂相, 将观察到的染色体条数取平均数作为杂种 XL1的主茎没有野生种I. lacunosa所具有的双茎缠 植株的染色体数。 绕特征; 叶色为浅绿色, 与I. lacunosa一致; 主叶脉 4 酯酶同工酶分析 为紫色, 明显区别于两个亲本; 茎节间长度和粗度 取体细胞杂种XL1及其亲本离体培养植株的 接近于‘徐薯18’; 产生膨大块根, 其薯皮为紫红色, 叶片, 参照刘庆昌等(1998)的方法进行酯酶同工酶 薯肉为白色, 均与‘徐薯18’一致(图1和表1)。 分析。 2 体细胞杂种XL1对铝和铬的耐受性 5 铝和铬胁迫处理 将体细胞杂种XL1及其亲本植株在分别含有 -1 -1 用离体鉴定的方法, 鉴定体细胞杂种XL1及 750 μmol·L AlCl3和200 μmol·L K2Cr2O7的MS固 其亲本植株对铝(Al3+)和铬(Cr6+)的耐受性。将XL1 体培养上胁迫培养4周后, 观察其生长状态和生根 -1 情况。结果显示 在不含 3+和 6+的 培养基上 及其亲本植株培养于分别含有750 μmol·L AlCl3 , Al Cr MS , -1 及其亲本植株生长正常 生根情况良好 徐薯 和200 μmol·L K2Cr2O7的MS固体培养基上进行胁 XL1 , ; ‘ 迫处理, 以在不含Al3+和Cr6+的MS固体培养基上培 18’的生根数最多, 但其根长比XL1和I. lacunosa短 养的植株作为对照。培养条件为(27±1)°C, 光照13 (图2和表2)。在含有Al3+的MS培养基上胁迫4周后, h·d-1, 光强54 µmol·m-2·s-1。胁迫培养4周后, 观察 XL1及其亲本的生长受到不同程度的抑制, 相比于 XL1及其亲本植株的生长状态, 测定植株根数、根 I. lacunosa, XL1的根数和根长有所减少, 但相比于 长及鲜重(FW)。参照Gao等(2011)的方法, 取植株 ‘徐薯18’, XL1的根数、根长和鲜重显著高于‘徐薯 叶片测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, 18’ (图2和表2)。在含有Cr6+的MS培养基上, XL1 SOD)和过氧化氢酶(catalase, CAT)活性以及丙二醛 的根长显著低于I. lacunosa, 但其根数和鲜重显著 (malondialdehyde, MDA)含量, 以确定其耐受性。 高于I. lacunosa和‘徐薯18’ (图2和表2)。胁迫培养4 6 AFLP和MSAP分析 周后, 测定植株的SOD与CAT活性及MDA含量, 结 用CTAB法提取体细胞杂种XL1及其亲本离体 果显示, XL1及其亲本的SOD与CAT活性和MDA 培养植株的DNA, 参照Jia等(2017)的方法进行扩增 含量相比于正常生长的植株均表现出不同程度的 片段长度多态性(amplified fragment length polymor- 增加, 表明XL1及其亲本对胁迫表现出了不同的生 phism, AFLP)和甲基化敏感扩增多态性(methyla- 理反应。在含有Al3+的MS培养基上, XL1的SOD活 tion-sensitive amplified polymorphism, MSAP)分析。 性显著低于I. lacunosa, 而显著高于‘徐薯18’; CAT 贾礼聪等: 甘薯及其近缘野生种Ipomoea lacunosa种间体细胞杂种的特性鉴定和遗传组成分析 841

图1 XL1及其亲本的形态学特征 Fig.1 Morphological characteristics of XL1 and it parents K61: I. lacunosa; X18: ‘徐薯18’。下同。A、B和C: 分别种植于大田的K61、XL1和X18; D: XL1及其亲本的成熟叶片; E: XL1及其亲 本的主茎; F: XL1及其亲本的膨大块根。

表1 XL1及其亲本‘徐薯18’和I. lacunosa的形态学特征 Table 1 Morphological characteristics of XL1 and its parents ‘Xushu 18’ and I. lacunosa

材料 双茎缠绕 茎节间长度* 茎节间粗度** 成熟叶叶形 叶的裂片 成熟叶叶色 叶脉色 薯皮色 薯肉色

‘徐薯18’ 无双茎缠绕 中等 中间 心脏形 微小 深绿色 所有叶脉着紫色 紫红色 白色 XL1 无双茎缠绕 中等 中间 心脏形 微小 浅绿色 主脉部分着紫色 紫红色 白色 I. lacunosa 双茎缠绕 长 很细 心脏形 无裂 浅绿色 绿色 无 无

参照陆漱韵等(1998)书中的标准。*很短: 小于3 cm; 短: 3~5 cm; 中等: 6~9 cm; 长: 10~12 cm; 很长: 大于12 cm。**很细: 小于4 mm; 细: 4~6 mm; 中间: 7~9 mm; 粗: 10~12 mm; 很粗: 大于12 mm。

的活性显著高于I. lacunosa和‘徐薯18’; MDA含量 于I. lacunosa, 而显著高于‘徐薯18’; CAT的活性显 显著低于‘徐薯18’, 而显著高于I. lacunosa (表2)。 著高于I. lacunosa和‘徐薯18’; MDA含量显著低于 在含有Cr6+的MS培养基上, XL1的SOD活性显著低 ‘徐薯18’和I. lacunosa (表2)。以上结果表明, XL1 842 植物生理学报

对Al3+和Cr6+具有不同的胁迫抗性, 且XL1对胁迫 的耐受性优于‘徐薯18’。 3 体细胞杂种XL1的遗传和表观遗传变异 3.1 染色体数分析 对XL1的染色体进行观察, 结果显示XL1具有 86~89条染色体(图3), 染色体数目远小于其双亲染 色体数目之和, 接近于‘徐薯18’的染色体数, 表明 体细胞杂交过程中发生了染色体消除现象。 3.2 酯酶同工酶分析 对XL1及其亲本进行酯酶同工酶分析, 结果 显示XL1具有双亲的特征酶带(图4), 表明XL1为 ‘徐薯18’和I. lacunosa的种间体细胞杂种植株。在 同工酶谱上, XL1的酶带也并不是两个融合亲本酶 带的简单加和, 既有新酶带的产生, 也有亲本特征 酶带的丢失(图4), 说明体细胞杂交引起了杂种中 双亲染色体的重组、丢失等现象的发生, 从而产 生了一些新的酶或抑制了一些酶的产生。 3.3 AFLP分析 对XL1及其亲本植株进行AFLP分析, 结果显 示, 43对EcoRI+MspI引物组合共产生了1 649个条 带, 其中XL1的805个(48.82%)条带来自两个融合 亲本, 844个(51.18%)条带在XL1中发生了改变(表 3)。在48.82%的遗传条带中, 17.22%为两个融合亲 本共有的条带, 25.05%的条带来自‘徐薯18’, 6.55% 来自I. lacunosa (表3)。在51.18%的改变条带中, 3.03%为两个融合亲本共有条带在XL1中发生了丢 图2 培养4周后XL1及其亲本的生长和生根情况 失 的 徐薯 特异条带在 中发生了丢 Fig.2 The growth and rooting of XL1 and its parents , 9.04% ‘ 18’ XL1 cultured for 4 weeks 失, 32.99%的I. lacunosa特异条带在XL1中发生了 -1 -1 AlCl3浓度为750 μmol·L , K2Cr2O7浓度为200 μmol·L 。 丢失, 6.12%为新产生的条带(表3)。

表2 XL1及其亲本‘徐薯18’和I. lacunosa对重金属的耐受性比较 Table 2 Comparison of heavy metal tolerance between XL1 and its parents ‘Xushu 18’ and I. lacunosa

活性 活性 含量 -1 SOD / CAT / MDA / 材料 处理 根数 根长/cm 植株鲜重/g·株 -1 U·g-1 (FW) U·g-1 (FW) nmol·g (FW)

‘徐薯18’ MS 46.67±2.96a 6.87±0.45cd 2.39±0.18a 102.35±1.53f 123.51±1.35d 1.24±0.19f -1 c f f e c b MS+750 μmol·L AlCl3 2.33±0.88 0.37±0.09 0.24±0.04 124.44±1.78 139.48±0.88 21.32±0.36 -1 bc e d e g a MS+200 μmol·L K2Cr2O7 3.33±0.33 4.27±0.54 0.65±0.07 132.22±2.39 77.15±1.56 24.45±0.36 XL1 MS 3.67±0.33bc 15.67±0.85ab 1.73±0.13b 99.86±1.83g 110.73±2.07e 1.07±0.67f -1 bc de d c b c MS+750 μmol·L AlCl3 3.67±0.67 5.57±0.35 0.62±0.03 162.93±1.25 167.24±1.13 13.47±0.26 -1 b c c d a d MS+200 μmol·L K2Cr2O7 6.67±1.45 8.60±0.68 1.09±0.08 141.85±1.10 188.21±0.65 10.70±0.26 I. lacunosa MS 4.67±1.20bc 16.93±2.43a 1.55±0.09b 137.69±1.84d 86.33±1.02f 1.67±0.64f -1 bc b de a d e MS+750 μmol·L AlCl3 6.00±0.58 14.57±0.44 0.50±0.02 207.95±1.53 122.49±0.95 9.09±0.08 -1 bc ab de b e c MS+200 μmol·L K2Cr2O7 3.33±0.67 15.27±0.54 0.43±0.01 177.67±1.77 112.31±1.16 13.64±0.34 不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。 贾礼聪等: 甘薯及其近缘野生种Ipomoea lacunosa种间体细胞杂种的特性鉴定和遗传组成分析 843

图3 XL1的根尖细胞染色体数 Fig.3 Chromosomes in root tip cells of XL1 A、B和C: 染色体数分别为86、88和89条。

3.4 MSAP分析 对XL1及其亲本植株进行MSAP分析的结果 显示, 56对EcoRI+HpaII/MspI引物组合共检测到 1 546个甲基化位点, 其中XL1的836个(54.08%)位 点来自两个融合亲本, 710个(45.92%)位点在XL1 中发生了改变(图6和表4)。在54.08%的遗传位点 中, 14.75%为两个融合亲本共有的位点, 34.54%来 自‘徐薯18’, 4.77%来自I. lacunosa (表4)。在 45.92%的改变位点中, 3.75%为两个融合亲本共有 位点在XL1中发生了丢失, 3.23%的‘徐薯18’特异 图4 XL1及其亲本的酯酶同工酶图谱 条带在XL1中发生了丢失, 24.64%的I. lacunosa特 Fig.4 Electrophoretic patterns of esterase isozymes 异位点在XL1中发生了丢失; 同时, XL1产生了 in XL1 and its parents 14.29% (221条)的新位点(表4)。 3.5 细胞质基因组组成 利用得到的AFLP指纹图谱, 进一步分析体细 使用8对通用叶绿体SSR引物分析XL1的叶绿 胞杂种XL1及其亲本‘徐薯18’和I. lacunosa间的遗 体基因组组成, 结果显示XL1的扩增条带与‘徐薯 传距离, 非加权组平均法(unweighted pair-group 18’一致(图7), 说明体细胞杂种XL1的叶绿体基因 method with arithmetic means, UPGMA)聚类分析 组来自‘徐薯18’。用2对线粒体通用SSR引物对体 将XL1和‘徐薯18’分在同一个分支上, 而I. lacunosa 细胞杂种XL1及其亲本的总DNA进行扩增, 结果 被单独聚类到一个分支上(图5), 表明XL1与‘徐薯 显示XL1的扩增带型与‘徐薯18’一致(图8), 表明 18’具有较近的遗传关系。 XL1的线粒体基因组来自栽培种亲本‘徐薯18’。

表3 XL1的遗传变异分析 Table 3 Genetic variations in XL1

遗传的条带 改变的条带

条带类型 丢失的条带 新产生的条带 条带数 百分比/% 条带数 百分比/% 条带数 百分比/%

双亲共有条带 284 17.22 50 3.03 ‘徐薯18’特异条带 413 25.05 149 9.04 I. lacunosa特异条带 108 6.55 544 32.99 合计 805 48.82 743 45.06 101 6.12 844 植物生理学报

讨 论

植物常规育种通过有性杂交使雌雄配子结合, 实现双亲遗传物质转移和重组, 在品种选育和性 状改良方面发挥了重要的作用。但是, 有性杂交 局限于种内或是一些亲缘关系相近的野生种和栽 培种之间, 例如香蕉、甘薯和马铃薯等这些植物 图5 XL1及其亲本的UPGMA聚类分析 有性生殖能力很低或不具备, 很难通过有性杂交 Fig.5 UPGMA dendrogram of XL1 and its parents 利用这些作物的近缘野生种来改良和培育新品种 (张金鹏等2014)。实践证明, 植物体细胞杂交通过 原生质体的融合, 打破了物种间的生殖隔离, 同时 也克服了植物花期不遇与有性杂交不亲和性; 植 物体细胞杂交不仅可以整合细胞核基因组, 还可 以实现细胞质基因组的遗传重组, 从而能够在扩 大植物可利用基因库的基础上转移单基因或多基 因控制的性状, 在短时间内创造出新的遗传变异 或育种材料甚至新的物种(Xia等2003; Yang等 2009; Yu等2012; Chen等2013; Xiao等2014)。在甘 薯育种中, 同样存在优良基因在栽培种中严重缺 乏的现象, 而甘薯组植物的种间杂交不亲和性又 限制了甘薯近缘野生种的优异基因在甘薯品种改 良中的应用。在本研究中, XL1不仅遗传了其栽培 种亲本‘徐薯18’的块根形成能力(图1和表1), 而且 具有同野生种亲本I. lacunosa对重金属胁迫的抗性 (图2和表2), 这些结果证明体细胞杂交在克服甘薯 组植物有性生殖隔离上的可行性, 以及这一技术 在甘薯抗逆育种上的重要性。 对于获得的体细胞杂种株系进行遗传组分和 图6 XL1及其亲本的MSAP分析 表型鉴定, 是确定体细胞杂种育种价值所必需的, Fig.6 MSAP analysis of XL1 and its parents 同时也是体细胞杂种细胞遗传学研究的重要内 图为引物组合EcoRI-ACG/HpaII (MspI)-TCG的扩增结果。泳 容。基于对体细胞杂种的认识 其遗传组分的鉴 道1、3和5为HpaII酶切的扩增结果; 泳道2、4和6为MspI酶切的扩 , 增结果; M: DNA Marker。 定主要包括核遗传组分和胞质遗传组分的鉴定。

表4 XL1的甲基化变异分析 Table 4 Methylation variations in XL1

遗传的位点 改变的位点

位点类型 丢失的位点 新产生的位点 位点数 百分比/% 位点数 百分比/% 位点数 百分比/%

双亲共有的位点 228 14.75 58 3.75 ‘徐薯18’特异的位点 534 34.54 50 3.23 I. lacunosa特异的位点 74 4.77 381 24.64 合计 836 54.08 489 31.63 221 14.29 贾礼聪等: 甘薯及其近缘野生种Ipomoea lacunosa种间体细胞杂种的特性鉴定和遗传组成分析 845

同时, 体细胞杂种在植株表型上会出现倾向某一 亲本或者呈现双亲中间型的形态, 如抗性、育性 或次生代谢产物的改变等, 利用遗传组分的构成 与目标性状的相关性分析, 可以为目标性状的遗 传研究、发掘目标基因等提供特殊的基础材料。 本研究对体细胞杂种XL1的染色体数目进行分析, 结果显示, XL1的染色体数目远小于两个融合亲本 的染色体数目之和(图3), 说明体细胞杂种的染色 图7 XL1及其亲本的叶绿体基因组分析 体发生了明显的消除; 这与本研究室之前的研究结 Fig.7 Chloroplast genome analysis of XL1 and its parents 果类似(刘庆昌等1998; Zhang等2002; Guo等 左为引物对ccSSR-13的扩增结果; 右为引物对NTCP3的扩增 结果; M: DNA Marker。 2006)。在本研究中, 体细胞杂种XL1可以形成膨大

图8 XL1及其亲本的线粒体基因组分析 Fig.8 Mitochondrial genome analysis of XL1 and its parents 左为引物对nad1-exonB/nad1-exonC的扩增结果; 右为引物对cob/rpS 10的扩增结果; M: DNA Marker。

块根, 其染色体数目为86~89条, 我们推测块根膨大 与重组, 基因组DNA序列的变异, 对于这些变异产 的能力与染色体数目接近于甘薯染色体数目有 生的机制, 我们推测可能是由于融合亲本间的遗 关。Yang等(2009)获得的一个甘薯及其近缘野生 传背景差异较大, 导致双亲染色体间存在不亲和, 种种间体细胞杂种KT1, 染色体数目为88, 其生长 或体细胞杂种在不断分裂, 达到遗传物质逐渐稳 习性接近于栽培种亲本, 并可以产生膨大块根。 定的过程中, 双亲的染色体发生很大程度的丢 为了明确体细胞杂种XT1的细胞核基因组组 失。Sun等(2014)发现在粳稻与小麦间的体细胞杂 成, 本研究利用AFLP技术系统研究了体细胞杂交 种染色体片段的丢失率要高于粳稻和籼稻间的体 过程引起的体细胞杂种DNA序列的变异, 发现体 细胞杂种的染色体丢失率, 认为融合亲本间的亲 细胞杂交过程引起了体细胞杂种大量基因组DNA 缘关系越远, 获得的杂种的染色体片段越容易丢 序列变异。体细胞杂种XL1的基因组DNA由来源 失。Xia (2009)认为在体细胞杂交中, 由于受到两 于双亲的条带(48.82%, 表3)和一些变异的条带组 种“基因组冲击” (genomic shock), 部分同源染色体 成(51.18%, 表3)。XL1中遗传条带多来自‘徐薯18’ 间重组导致的大量错配, 超过了植物核基因组错 (25.05%, 表3), 而丢失条带多来自I. lacunosa (32.99%, 配修复系统的修复能力, 从而使体细胞杂种后代 表3)。体细胞杂交引起了甘薯组种间体细胞杂种 核基因组保存大量重组体, 导致核基因组序列发 基因组DNA的剧烈变异, 包括大量染色体的丢失 生变化。 846 植物生理学报

DNA胞嘧啶甲基化修饰是在很多真核生物中 细胞质中存在控制遗传性状的基因。对细胞 都存在的表观遗传修饰, 是DNA碱基编码上的又 质遗传组成的鉴定也能直观揭示杂种中细胞质的 一层可遗传的生物信息(Zilberman等2006)。DNA 杂合与否, 明晰胞质基因与性状的相关性。许多 胞嘧啶甲基化修饰参与多种重要的生物过程, 影 研究表明, 原生质体融合的体细胞杂种中叶绿体 响植物的转座子沉默、基因表达调控等(Kashkush 表现出偏亲现象, 很少发生重组; 与叶绿体遗传组 等2002; Dong等2005)。DNA甲基化状态是植物在 成相比, 体细胞杂种中线粒体的遗传组成研究结 长期进化过程中形成的一个相对平衡的调控模式, 果较为一致, 通常包含双亲的特异条带或者不同 体细胞杂交过程中这种平衡的状态被打破, 在基 于双亲的新条带, 即一般为双亲共存, 或发生复杂 因组防御和基因表达调控两方面必然出现改变, 的重组或重排(Cardi等1999; Zubko等2003; Yu等 从而协调两套遗传物质间的平衡(Yang等2011)。 2012; Chen等2013)。本研究发现体细胞杂种XL1 许多研究表明远缘杂交可以引起巨大的表观遗传 的叶绿体基因组与栽培种‘徐薯18’一致(图7), 这与 变异, Xu等(2009)报道, 在新形成的甘蓝型油菜 前人的研究一致。线粒体基因组的遗传分析显示, (Brassica napus)异源多倍体中, 幼苗阶段叶片中甲 XL1的线粒体来自‘徐薯18’, 并没有出现共存或重 基化变异的比率为7.29%, 而成熟植株叶片的甲基 组(图8)。尽管目前对核基因组与细胞质基因组之 化比率为7.04%。Sheng等(2013)获得了一个甘蓝 间相互作用的机制还不十分清楚, 但在许多远缘 (B. oleracea var. italica, 2n=16)和黑芥(B. nigra, 2n= 杂交研究过程中所发现的一些现象确实显示核基 18)间的异源四倍体体细胞杂种(no. 38, 2n=34)中 因组与细胞质基因组有一定联系(Veitia 2005)。我 甲基化变异的比例为4.07%。我们的研究显示, 在 们的研究发现, 在XL1中, 体细胞杂交引起的基因 体细胞杂种XL1中胞嘧啶甲基化变异的比例为 组遗传变异是非随机、有亲本倾向性的, 表现出 45.92% (表4), 远高于上述报道的比例。我们分析 偏栽培种遗传的现象, 使得XL1中其栽培种亲本 发现, XL1虽为通过对称融合的方式得到, 理论上 ‘徐薯18’的遗传背景占据主导地位。我们推测这 会遗传双亲的所有遗传物质, 但其在形成过程中 种基因组结构和表观遗传上的非随机、有亲本倾 发生了大量染色体的丢失, 这也导致了遗传表观 向的改变使得‘徐薯18’的核质基因组间的互作在 上的巨大改变。对XL1中由于体细胞杂交过程引 XL1中表现得更加显著, I. lacunosa的细胞质基因组 起的胞嘧啶甲基化水平的改变进行的分析显示, 被不断排斥而丢失。Chen和Ni (2006)发现远缘杂 与基因组DNA的变异特点类似, XL1保留了较多的 交引起的多倍体化过程中, 两个原本相互分离、 栽培种亲本的甲基化位点(34.54%, 表4)和双亲共 具有不同程度差异的核基因组被组合到同一个核 有的位点(14.75%, 表4), 而丢失了较多的野生种的 中, 并处在由单一亲本所提供的细胞质环境中, 因 位点(24.64%, 表4), 这说明非对称体细胞杂交过程 此在控制性状表达过程中, 不仅两个核基因组之 中DNA甲基化修饰状态的变异不是随机发生的, 间要重新相互调整, 在核基因组与细胞质基因组 而是呈现出偏亲的遗传或改变, 即倾向于保留栽 之间也必须通过某种形式相互作用, 调整核质作 培种的甲基化位点, 而倾向于丢失野生种的甲基 用方式, 在新的基础上重建核质之间平衡的相互 化位点, 这可能是由于体细胞杂种XL1的两个亲本 关系, 提高相容性水平。 间的亲缘关系较远造成的。相比 序列上的改 DNA 参考文献 变, XL1中45.92% (表4)的甲基化位点发生改变, 这 Belarmino MM, Abe T, Sasahara T (1993). Shoot formation from pro- 一比例大于基因组DNA序列上改变的比例 toplast-derived calli of sweetpotato and its wild relatives and the (45.06%, 表3)。同时, 我们发现新产生的甲基化 initiation of somatic hybrid. Jpn J Breed, 43: 15–19 位点比例(14.29%, 表4)高于新产生的基因组DNA Cao QH, Zhang A, Ma DF, Li HM, Li Q, Li P (2009). Novel inter- 序列的比例(6.12%, 表3), 这说明体细胞杂交引起 specific hybridization between sweetpotato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) and its two diploid wild relatives. Euphytica, 169: 的DNA胞嘧啶甲基化的改变不依赖于DNA序列的 345–352 改变。 Cardi T, Bastia T, Monti L, Earle ED (1999). Organelle DNA and 贾礼聪等: 甘薯及其近缘野生种Ipomoea lacunosa种间体细胞杂种的特性鉴定和遗传组成分析 847

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Characterization and genetic component analysis in a somatic hybrid between Ipomoea batatas (L.) Lam. and I. lacunosa JIA Li-Cong, ZHAI Hong, HE Shao-Zhen, SUN Ya-Ping, YANG Yu-Feng, LIU Qing-Chang* Key Laboratory of Sweetpotato Biology and Biotechnology, Ministry of Agriculture / Laboratory of Crop Heterosis and Utili- zation, Ministry of Education / Beijing Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, China Agricultural University, Beijing 100193, China

Abstract: Characteristics and genetic components of a somatic hybrid, XL1, between sweetpotato (Ipomoea batatas) cv. ‘Xushu 18’ (2n=6x=90) and its wild relatives I. lacunosa (2n=2x=30) were systematically studied through morphological, cytological and esterase isozyme analyses, in-vitro assay for heavy metal stress toler- ance, amplified fragment length polymorphism (AFLP) and methylation-sensitive amplified polymorphism (MSAP) analyses. The results showed that XL1 exhibited significantly higher tolerance to heavy metal alumi- num (Al3+) and chromium (Cr6+) stresses compared to ‘Xushu 18’. Superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities were significantly increased, while malondialdehyde (MDA) content was significantly de- creased compared to ‘Xushu 18’ after exposure to various concentrations of Al3+ and Cr6+. XL1 had genomic DNA band patterns consisting of both parent specific bands and changed bands; its DNA methylation site pat- terns consisted of both parent specific sites and changed sites. Further analysis demonstrated that XL1 had the much higher proportions of ‘Xushu 18’ specific genomic DNA bands and methylation sites compared to those of I. lacunosa. XL1 had the same chloroplast and mitochondrial genomes as ‘Xushu 18’. These results show the significance of somatic hybridization techniques in the genetic improvement of sweetpotato, and will aid in ex- ploring the useful genes of I. lacunosa and understanding the evolution and phylogeny of the cultivated sweet- potato. Key words: sweetpotato; I. lacunosa; somatic hybrids; characteristics; genetic and epigenetic variations

Received 2017-02-15 Accepted 2017-05-03 This work was supported by China Agriculture Research System (Grant No. CARS-11, Sweetpotato) and National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31461143017). *Corresponding author (E-mail: [email protected]).