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Caracterización de la Diversidad Microbiana de Suelos Destinados a Cultivos de Ananas comosus (piña), Tratados con Distintos Plaguicidas en el Municipio de Lebrija, Santander

Bravo Granados Natalia Andrea

Universidad de Santander Facultad de Ciencias Exactas, Naturales y Agropecuarias Microbiología Industrial Bucaramanga 2021 CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 2

Caracterización de la Diversidad Microbiana de Suelos Destinados a Cultivos de Ananas comosus (piña), Tratados con Distintos Plaguicidas en el Municipio de Lebrija, Santander

Bravo Granados Natalia Andrea 15332006

Trabajo de Grado para Optar por el Título de Microbióloga Industrial

Director Rueda Forero Nohora Juliana Ph. D (c) Codirector Suárez Barrera Miguel Orlando Ph. D (c)

Universidad de Santander Facultad de Ciencias Exactas, Naturales y Agropecuarias Microbiología Industrial Bucaramanga 2021 CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 3

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL COMITÉ DE TRABAJO DE GRADO

ACTAS SUSTENTACIÓN TRABAJO DE GRADO Versión: 00 MIIFT001BUC

No. de Acta: Fecha: 6 de mayo de 2021 0022021A

Hora Inicio: Lugar: Aula Virtual Teams Hora Final: 10:00am 11:10am

Cumpliendo con el acuerdo 010 de 2014 emanado por el Consejo Académico, se llevo a cabo la evaluación del trabajo de grado titulado “Caracterización de la diversidad microbiana de suelos destinados a cultivos de Ananas comosus (piña), tratados con distintos plaguicidas en el municipio de Lebrija, Santander” desarrollado en la modalidad de Investigación – Emprendimiento por el estudiante:

Código Primer apellido Segundo Apellido Nombre(s) 15332006 Bravo Granados Natalia Andrea

Este trabajo estuvo dirigido por la M.Sc Nohora Juliana Rueda Forera y codirigido por el M.Sc Miguel Orlando Suárez Barrera.

Y cumpliendo lo dispuesto por el acuerdo 031 de 2014 por el cual se modifica el Reglamento Académico y Estudiantil, capítulo 5, artículos 80 y 85, parágrafo 1; el jurado evaluador estuvo conformado por el Ph.D Juan Carlos Caicedo Cepeda y el M.Sc Wilfredo Valdivieso Quintero, el trabajo de grado en mención recibe el concepto de Aprobado con una calificación de cuatro coma cinco (4,5).

En constancia firman:

Nohora Juliana Rueda Forera Juan Carlos Caicedo Cepeda Director de Trabajo de Grado Evaluador

Miguel Orlando Suárez Barrera Wilfredo Valdivieso Quintero Co-director Evaluador

Andrea Juliana Mantilla Paredes Directora Programa de Microbiología Industrial

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Agradecimientos

A Dios por la persistencia y a mis padres por la dedicación, paciencia y amor durante esta etapa de mi vida y por ser los principales promotores de mis aspiraciones.

A Nohora Rueda, PhD (c), por ser mi guía en este proceso, compartir sus conocimientos y hacer de este proyecto una experiencia enriquecedora.

A Miguel Suárez, PhD (c), por permitir demostrar mis destrezas como tesista en el

Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología, y por su apoyo a lo largo del desarrollo del proyecto.

A mis amigos y compañeros de carrera, por las experiencias vividas y por los logros obtenidos.

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Dedicatoria

A Dios, a mis padres, tutores y amigos.

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Tabla de Contenido

Introducción ...... 15 Marco Teórico ...... 18 El Suelo ...... 18 Aspectos Físicos del Suelo ...... 19 Aspectos Químicos del Suelo ...... 21 Materia Orgánica ...... 23 La Agricultura ...... 24 Microbiota del Suelo ...... 25 Microorganismos de la Rizosfera ...... 25 Funciones de los Microorganismos ...... 26 Secuenciación de Nueva Generación ...... 28 NGS en la Agricultura ...... 32 Illumina ...... 33 Análisis Bioinformático de Secuencias ...... 39 MG-RAST como Herramienta Bioinformática ...... 41 Análisis Estadístico...... 43 Past Software ...... 44 Estado del Arte ...... 46 Marco Legal ...... 50 Planteamiento y Justificación del Problema ...... 51 Pregunta de investigación ...... 52 Hipótesis ...... 53 Objetivos ...... 54 Objetivo General ...... 54 Objetivos Específicos ...... 54 Metodología ...... 55 Especificaciones del Cultivo de Piña ...... 55 Muestreo ...... 56 Extracción de ADN Genómico ...... 57 Amplificación y Secuenciación del Gen Ribosomal 16S...... 58 Análisis Bioinformáticos ...... 58 Análisis Estadísticos ...... 59 CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 7

Análisis Físico-Químicos (realizados por los estudiantes de la UPB, sede Bucaramanga) ....59 Resultados y Análisis de Resultados ...... 60 Extracción y Cuantificación de ADN Metagenómico ...... 60 Análisis Bioinformático de Secuencias ...... 61 Clasificación por Dominios ...... 61 Clasificación por filo ...... 63 Clasificación por Género ...... 65 Diversidad α ...... 67 Abundancia Relativa de Géneros Dominantes ...... 68 Géneros Únicos y Comunes en los Tratamientos ...... 69 Géneros predominantes ...... 71 Análisis Estadísticos ...... 73 Análisis de Componentes Principales (ACP) ...... 73 Diversidad β ...... 77 Discusión ...... 78 Análisis Fisicoquímicos ...... 78 Propiedades Físicas del Suelo ...... 78 Propiedades Químicas del Suelo ...... 78 Extracción de ADN ...... 81 Análisis Bioinformático de Secuencias ...... 83 Clasificación por Dominio ...... 84 Clasificación por filo ...... 85 Clasificación por Género ...... 91 Diversidad α ...... 101 Abundancia Relativa y Efecto del Plaguicida (Lorsban) y Bioplaguicida (Nicotina y Capsaicina)...... 102 Géneros Únicos y Comunes en los Tratamientos ...... 104 Análisis de Componentes Principales (ACP) ...... 106 Diversidad β ...... 107 Conclusiones ...... 109 Recomendaciones ...... 111 Referencias Bibliográficas ...... 112 Apéndices ...... 149 Apendice A. Protocolo de Extracción de ADN Estandarizado: Kit E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (OMEGA) ...... 149 CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 8

Apéndice B. Concentración de ADN Genómico Total de Suelos ...... 151 Apéndice C. Calidad del ADN Extraído ...... 152 Apéndice D. Secuencias Obtenidas por Muestra ...... 153 Apéndice E. Curva de Rarefacción de los Suelos Analizados ...... 154 Apéndice F. Prueba de Kruskal Wallis – Composición microbiana sin diferencia significativa ...... 156 Apéndice G. Propiedades físicoquímicas de los suelos estudiados, realizados por los estudiantes de la Universidad Pontificia Bolivariana sede Bucaramanga ...... 157 Cálculo de Nitrógeno de mg NTK/Kg a %...... 159

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Lista de Tablas

Tabla 1...... 27 Tabla 2...... 37 Tabla 3...... 37 Tabla 4...... 39 Tabla 5...... 57 Tabla 6...... 60 Tabla 7...... 71 Tabla 8...... 77 Tabla 9...... 153 Tabla 10...... 156 Tabla 11...... 157 Tabla 12...... 157 Tabla 13...... 158

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Lista de Figuras

Figura 1...... 19 Figura 2...... 30 Figura 3...... 35 Figura 4...... 35 Figura 5...... 36 Figura 6...... 36 Figura 7...... 56 Figura 8...... 62 Figura 9...... 63 Figura 10...... 66 Figura 11...... 67 Figura 12...... 69 Figura 13...... 70 Figura 14...... 75 Figura 15...... 76 Figura 16...... 152 Figura 17...... 154 Figura 18...... 154 Figura 19...... 155 Figura 20...... 155

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Resumen

Tìtulo

Caracterización de la Diversidad Microbiana de Suelos Destinados a Cultivos de Ananas comosus (piña), Tratados con Distintos Plaguicidas en el Municipio de Lebrija, Santander.

Autor

Bravo Granados Natalia Andrea

Palabras Claves

Metagenómica, Piña, ADN, Secuenciación, IlluminaMiSeq.

Contenido

El suelo es un hábitat diverso, su composición varía dependiendo del uso, condiciones climáticas y actividades antropogénicas; y conocer los microorganismos presentes requiere la implementación de herramientas de secuenciación de nueva generación. Ananás comosus es un cultivo de gran importancia para Santander, sin embargo, los estudios referentes a la caracterización biológica del suelo asociado, son escasas en la región y en el país. En ese sentido, este trabajo se centró en la caracterización microbiana del suelo destinado a un cultivo de piña. Para lograrlo, las muestras se tomaron aleatoriamente de cuatro lotes a 20 cm de profundidad, obteniendo un total de 14 muestras.

Se estandarizó el protocolo de extracción de ADN genómico total de suelo y la cantidad de ADN de cada muestra fue >60 ng/µl. Posteriormente se enviaron a secuenciar a MacroGen mediante la plataforma Illumina MiSeq (2x300 pb), obteniéndose un total de 1’518.101 secuencias de las muestras analizadas. El empleo de herramientas metagenómicas como el

FASTQC y el MG-RAST, permitieron establecer la calidad de las secuencias obtenidas y la clasificación desde dominio hasta género de los microorganismos presentes en los suelos estudiados. Filo como Actinobacteria (>50%), Acidobacteria (>18%), Firmicutes (>16%) y CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 12

Verrumicrobia (>10%), se encontraron con mayor predominancia entre las 14 muestras estudiadas.

A nivel de género se encontraron en abundancia Candidatus Koribacter, Streptomyces,

Isosphaera, Bacillus, Candidatus Solibacter y Actinomadura. Con respecto a la diversidad α, esta varía por las condiciones nutricionales del suelo, es por esto que en la muestra del suelo

Blanco los valores de esta diversidad son los más bajos. Finalmente, se evidenció elevada similitud entre la composición de las comunidades microbianas de los cuatro suelos en estudio, indicando que el plaguicida y el bioplaguicida, no tienen un efecto significativo en la composición de la población microbiana presentes en la rizosfera del cultivo de piña.

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Abstract

Title

Characterization of the Microbial Diversity of Soils Destined to Ananas comosus

(Pineapple) Crops, Treated with Different Pesticides in the Municipality of Lebrija, Santander.

Author

Bravo Granados Natalia Bravo

Keywords

Metagenomics, Pineapple, DNA, Sequencing, IlluminaMiSeq.

Contents

The soil is a diverse habitat, its composition varies depending on the use, climatic conditions and anthropogenic activities; and knowing the groups of microorganisms present requires the implementation of next-generation sequencing tools. Ananas comosus is a crop of great importance for Santander, however, studies referring to the biological characterization of the associated soil are scarce in the region and the country.

In this sense, this work focused on the microbial characterization of the soil destined for a pineapple crop. The samples were randomly taken from four batches at a depth of 20 cm, obtaining a total of 14 samples. The total genomic soil DNA extraction protocol was standardized and the amount of DNA in each sample was> 60 ng / µl. Subsequently, they were sent to be sequenced to MacroGen using the Illumina MiSeq platform, obtaining a total of

1,518,101 sequences of the analyzed samples.

The use of metagenomic tools such as FASTQC and MG-RAST made it possible to establish the quality of the sequences obtained and the classification from domain to the gender of the microorganisms present in the soils studied. Phylum such as Actinobacteria (> 50%),

Acidobacteria (> 18%), Firmicutes (> 16%) and Verrumicrobia (> 10%), were found to be more CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 14

prevalent among the 14 samples studied. At the genus level, Candidatus Koribacter,

Streptomyces, Isosphaera, Bacillus, Candidatus Solibacter and Actinomadura were found in abundance.

Concerning the diversity α, this varies by the nutritional conditions of the soil, which is why in the sample of the White soil, the values of this diversity are the lowest. Finally, the high similarity between the compositions of the microbial communities of the four soils analyzed was evidenced, indicating that the pesticide and the biopesticide do not have a significant effect on the microorganisms present in the rhizosphere of the pineapple plant.

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Introducción

El cultivo de piña (Ananas comosus) es común en áreas de climas tropicales y subtropicales, encontrándose en el tercer lugar de producción de frutas tropicales (Paul &

Duarte, 2011). Esta fruta es fuente de bromelina, enzima empleada como ablandadora de carne y fibra de alta calidad (Coppens d’Eeckenbrugge et al., 2011).

Ananas comosus var. Comosus, es la piña más cultivada en el mundo. Es una planta diploide (2n=50), de fácil propagación por medio de retoños (tallo), resbalones (pedúnculo) y la corona de la fruta. Su tallo es corto, hojas rígidas, produce un coenocarpio (fruta múltiple derivada de ovarios) y cada uno posee pequeñas semillas desnudas, aladas o plumosas (Paul y Duarte, 2011). Puede ser cultiva en diversos tipos de suelos, incluyendo los que carecen de nutrientes. Los suelos ligeros garantizan un excelente sabor y mejor calidad; sin embargo, los suelos con características arenosas y francos con alto contenido de humus son los más adecuados para su cultivo. Esta planta es sensible a la saturación, por ende, su riego debe ser controlado y contar con buenos drenajes. El pH óptimo para su crecimiento es de 5.0 – 6.0 y la temperatura de 15º a 32ºC. Para su crecimiento es necesario altas cantidades de abono que contengan N, P2O5 y K2O (Okihiro, 2009).

La principal plaga que afecta este cultivo es la del insecto harinoso (Dysmicoccus brevipes), que al succionar la savia de las hojas inyectan sustancias tóxicas, transfiriendo en el mayor de los casos el Virus del Marchitamiento de la Piña (PMWaV por sus siglas en inglés)

(Hernández y Peña, 2009). Se evidencia el marchitamiento de las hojas y las frutas son de tamaño insuficiente. Para lograr el control de esta plaga, se lleva a cabo el uso de plaguicidas hechos con base en organometales, como el Lorsban, siendo este, un insecticida organofosforado de amplio espectro, con alta estabilidad e insolubilidad en agua (Joseph,

2018), aumentando su efecto tóxico para diversos organismos y con un alto potencial para CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 16

deteriorar suelos, alterando así las condiciones normales del suelo y las comunidades microbianas allí presentes (Alcaraz, 2016).

Debido a la acumulación de plaguicidas de origen químico, se vuelven recalcitrantes, afectando directamente a los microorganismos benéficos presentes en este hábitat. Por lo general causan alteraciones bioquímicas, haciendo que su actividad como biofertilizante disminuya al igual que su efecto promotor del crecimiento de las plantas (Hussain et al., 2009).

Estos agroquímicos son esencial fuente de carbono y nitrógeno y su degradación se debe a la actividad microbiana; pero la aplicación continua de estos compuestos en el suelo interviene en este tipo de actividades, ocasionando la modificación de procesos biológicos esenciales para la fertilidad y la productividad de los cultivos (Cycon et al., 2010). Los bioplaguicidas se emplean para contrarrestar los efectos de los químicos empleados en la agricultura a lo largo de la historia (Nava et al., 2012). Gracias a que son biodegradables y permiten el desarrollo adecuado de los cultivos (Aguirre, 2010). Por ser fabricados con extractos naturales es necesario replantear la concentración y la continuidad de aplicación.

El uso constante de compuestos orgánicos e inorgánicos en el suelo, podrían causar o no una variación en la estructura de las comunidades microbianas presentes en este hábitat, puesto que algunos de estos microorganismos tendrán mayor afinidad con estos agregados que otros. Debido a esto, es necesario establecer si existen cambios en la composición y la diversidad microbiana. El empleo de la secuenciación de nueva generación ha tomado gran relevancia, esto gracias a su capacidad de abarcar todos los microorganismos presentes en una muestra ambiental (Thomas et al., 2012). La secuenciación de los genomas presentes en una muestra con alguna de las tecnologías NGS, permiten una gran cantidad de secuencias de alta calidad, dando como resultado clasificación desde dominio hasta especie (Yuan et al.,

2015). Una de las plataformas más empleadas para la identificación de microorganismos en una muestra de tipo ambiental es Illmina MiSeq. Esta emplea dNTPs que realizan una función CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 17

de terminador reversible, detectando las bases individuales que están incorporadas en las secuencias originales; cada base va a tener su propia longitud de onda e intensidad para su identificación (Fallows, 2014).

La carencia de investigación con respecto a la incidencia de plaguicidas de origen químico y biológico en las comunidades microbianas de suelos cultivados con piña, ha llevado a la realización de este estudio. El cual, por medio del empleo de tecnologías de secuenciación de la nueva generación estableció la composición de la microbiota de una muestra de suelo con un total de 482 géneros bacterianos. Al encontrarse un mayor número de géneros únicos en los suelos con tratamiento Biológico y Químico, se dedujo que la aplicación del plaguicida de origen químico y el bioplaguicida permiten el desarrollo de bacterias esenciales en los diversos procesos manteniendo el equilibrio entre el ecosistema y la planta.

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Marco Teórico

El Suelo

Conocido como la capa superficial de la tierra, compuesto de material orgánico y minerales no consolidados, el suelo, se considera como el hábitat más diverso y complejo, con mayores recursos naturales esenciales para los organismos vivos (Jaramillo, 2002). En la formación del suelo se evidencia el desarrollo de capas horizontales que varían en su espesor y en su composición. Las capas más altas son las más alteradas por los diferentes factores del entorno, mientras que las más profundas son similares al material original (León, 2000). El proceso conlleva tres etapas, la primera es la descomposición de la materia orgánica y la acumulación de humus de color oscuro (a estos horizontes se les denomina A); siguiendo con el transporte por medio de agua de compuestos orgánicos e inorgánicos solubles desde la superficie hasta las profundidades del perfil; y, por último, se presentará una acumulación de precipitados inorgánicos y orgánicos en capas subsuperficiales (se denominan horizonte B)

(Jaramillo, 2002) (Ver Figura 1).

El suelo contiene más de un tercio de los organismos totales de la biósfera, regula la actividad de estos, permitiendo el funcionamiento y la evolución del ecosistema. Lovelock y

Margulis (1970) con su hipótesis “Gaia”, determinaron que las propiedades físicoquímicas de la tierra van de la mano con la actividad de los organismos presentes (Lovelock y Margulis, 1970).

El suelo es considerado como un hábitat mega diverso por la presencia de plantas, animales y microorganismos, además de su entorno abiótico. Su naturaleza va a depender de factores extrínsecos e intrínsecos, de las interacciones que se lleven a cabo (planta-microorganismo) y la cantidad de materia orgánica disponible. Al contener gran parte de la diversidad genética de la tierra, se dice que tan solo un gramo de suelo contiene kilómetros de hifas fúngicas, más de

10 especies distintas de bacterias, arqueas y organismos pertenecientes a decenas de miles de especies. El desarrollo de microorganismos se presenta en zonas donde la aireación es buena CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 19

y donde la materia orgánica disponible y otros nutrientes accesibles sean suficientes para garantizar todo proceso microbiológico. Otros factores como la temperatura, el contenido de agua y el pH determinaran las comunidades microbianas, destacando su funcionalidad (Ramos y Zúñiga, 2008).

Figura 1.

Horizontes del Suelo

Nota: Los horizontes A y B del suelo son importantes para la degradación de materia orgánica,

útil para la diversidad microbiana. Tomado de Lujan et al., 2016.

Aspectos Físicos del Suelo

Los minerales presentes en el suelo se dividen en tres tipos, arenas, arcillas y limos, los cuales determinan la textura del suelo. Las partículas de arcilla son denominadas la fracción fina de tierra, mientras que las de arena son visibles fácilmente y sintiéndose ásperas al tacto, y las del limo, son microscópicas, se sienten suaves y resbaladizas. En la composición de los CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 20

suelos estos minerales varían en su proporción, estableciendo términos como franco arenoso, arcilla limosa y franco arcilloso, todo esto con el fin de identificar la textura del suelo. Estas partículas tienen la capacidad de unirse con la materia orgánica en descomposición, formando así grupos espaciales denominados agregados. La disposición de estos grupos es de suma importancia para regular las actividades bióticas, influyendo directamente en el contenido de agua y en la aireación. Los suelos arcillosos se encuentran fuertemente agregados, esto se debe a su gran área de superficie y su carga electroestática negativa; y los arenosos y limosos se encuentran poco agregados (Jaramillo, 2002). Existen tres conjuntos de agregados, se conocen como microagregados, mesoagregados y macroagregados. Los microagregados se forman por la actividad biológica entre los microorganismos descomponedores de materia orgánica y los minerales presentes en el suelo. Por lo general, actúan como núcleos para la formación de agregados más grandes, como los mesoagregados, cuya característica principal es que se conforman por hifas de hongos micorrízicos arbusculares. Estos dos agregados dan origen a los macroagregados, donde se vinculan químicamente todos los elementos ya mencionados por medio de una red de raíces de plantas, hifas fúngicas y materia orgánica fibrosa. Esta jerarquía de agregados, es una característica única de suelos no perturbados. A nivel de descomposición, los micro y mesoagregados son resistentes ante el impacto de la lluvia, la congelación y descongelación; esto se debe a su tamaño de poros restringidos, el cual protege a los microorganismos allí presentes. Los macroagregados permanecen intactos siempre y cuando no exista ninguna perturbación en el medio como la lluvia intensa o el uso de maquinaria de labranza; los poros de este tipo de agregados permiten la aireación adecuada del suelo, y la retención de agua para el crecimiento de las plantas. Al mantener un equilibrio en el suelo, la macroagregación se encarga del control de la actividad biótica y la rotación de materia orgánica en los suelos superficiales, permitiendo el intercambio de oxígeno y otros gases con la atmósfera (Ball, 2013). CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 21

Aspectos Químicos del Suelo

Para proporcionar un ambiente óptimo para los organismos de suelo, es necesario conocer los componentes químicos, su naturaleza y su cantidad. Siendo el agua, materia orgánica, componentes inorgánicos, O2 y CO2, componentes esenciales regidos por las reacciones ácidobase y redox, definen el ambiente químico que controla la actividad biótica

(Céspedes, 2005).

Las reacciones químicas entre fuentes atmosféricas y orgánicas con los carbonatos y otros componentes minerales y húmicos, definen el pH del suelo. La medición de este factor determinará el tipo de reacciones microbianas que se llevan a cabo y la actividad enzimática del suelo; dependiendo de la capacidad de hidrolisis del suelo, se determina las comunidades microbianas allí presentes. Por otra parte, la cantidad de materia orgánica en descomposición presente en los suelos, verifica la oxidación realizada por los organismos, quienes emplean el

O2 como aceptor de electrones. La tasa de consumo de O2 es elevada debido al suministro constante de Carbono orgánico, y junto a las constantes obstaculizaciones por la saturación de agua o por los poros restringidos, esta concentración va disminuyendo causando así una anaerobiosis en el medio, donde la actividad microbiana será controlada por aceptores de electrones alternativos. Este tipo de condiciones permitirá un cambio en la composición de las poblaciones microbianas, debido al cambio de actividades metabólicas que van a llevarse a cabo. Por lo tanto, la actividad de los organismos aerobios y facultativos se va a ver restringidas, causando un aumento de la población de organismos anaerobios obligados y fermentativos. Gracias a la presencia de estos microorganismos, la reducción de elementos como el Nitrógeno, Magnesio, Hierro y Azufre, va a ser constante, volviéndolos asimilables para las plantas y para el ambiente (Céspedes, 2005).

El transporte de gases se realiza a través de los poros por medio de la difusión, manteniendo un intercambio gaseoso con la atmósfera, a esto se le denomina aireación. Por CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 22

otra parte, la temperatura del suelo va a influir en su composición, los procesos químicos, físicos y biológicos que ocurren en el allí son influenciados directamente por la temperatura.

Cabe resaltar que los factores externos o ambientales deben considerarse, ya que puede cambiar la estructura del suelo, afectando la variabilidad de especies (Jaramillo, 2002).

Un factor determinante en la composición física, química y biológica del suelo es el agua. Su importancia radica en la función que cumple como transportador de masa y como un medio a través del cual se difunden los elementos hacia y desde los lugares de reacción.

Debido a su actuación como disolvente y como reactivo en diversas reacciones, el agua, es el principal sistema que asegura una estabilidad entre los componentes biológicos, químico y físicos del suelo (Angella et al., 2016). La actividad de las comunidades de organismos va a depender de los potenciales de agua que se encuentren en el suelo, para los protozoos el potencial adecuado es con un espesor de 5 µm de películas de agua, por el contrario, para los microorganismos su potencial puede ser más bajo, debido a su tamaño y la asociación que tienen con las partículas del suelo. Se considera que los hongos son más tolerantes a potenciales de agua bajos que las bacterias, esto se debe a que las bacterias por lo general permanecen inmóviles y dependen más de la difusión de nutrientes, además la estructura que posee el hongo, le permite acceder a fuentes de aguas más fácil que las bacterias (Fernández,

2006). Cuando se presenta una demanda de agua más alta de la disponible, se conoce como estrés hídrico. Existen microorganismos que son más tolerantes que otros a este tipo de estrés; los oxidantes de azufre (Nitrosomas) y amonio (Thiobacillus) por lo general son menos tolerantes que los amonificantes (Clostridium, Penicillium) (Fernández, 2006).

Factores como la humedad y la temperatura se ven directamente influenciadas por el clima que regula la actividad biológica del suelo. Estos cambios se evidencian en las reacciones catalizadas por enzimas y en la cantidad de sustratos orgánicos e inorgánicos presentes en el medio (Fernández, 2006). Cuando el agua no es limitante, la actividad de los CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 23

organismos presentes se va a regir por la temperatura. Cabe la posibilidad, que estas dos influencias ambientales no repercutan en la actividad de los microorganismos, por el contrario, pueden mostrar interacciones complejas que van a determinar su capacidad enzimática y su adaptabilidad (Jaramillo, 2002).

Materia Orgánica

La estructura física y química del suelo depende de la concentración de materia orgánica y de la composición de la misma, la formación de complejos entre minerales va a determinar la disposición y estabilidad de los agregados del suelo. Los agregados de materia orgánica tienen diversos tamaños y grado de degradación, por ejemplo, la fracción orgánica cuenta con partículas grandes ya que se compone por residuos vegetales; la fracción mineral, compuesta por partículas más densas y las fracciones organomineral, que se dividen en microagregados y en una fracción recalcitrante, así como la arcilla (Plaza et al., 2014).

La fracción de materia orgánica en el suelo se ve afectada por el tipo de uso y las prácticas de manejo que se les dé (Lee et al., 2009). Los tipos de labranza y los tratamientos aplicados a los cultivos causan alteraciones, siendo visibles en el secuestro temprano de C en el suelo; por ejemplo, las partículas pequeñas más descompuestas indican que el carbono del suelo se encuentra en una etapa recalcitrante (Plaza et al., 2014).

El estudio de la composición de la materia orgánica, y la concentración de cada uno de sus agregados, permite determinar y comprender la dinámica del funcionamiento del ecosistema. También es importante establecer la composición microbiológica del suelo, su metabolismo y la forma en que compiten por los nutrientes; esto con el fin de establecer la relación entre la diversidad microbiana, y el consumo de compuestos orgánico por parte de estos, además de conocer las reservas de minerales creadas por las plantas (Gardner et al.,

2013). CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 24

La Agricultura

La base fundamental de la agricultura es el suelo, siendo el medio que proporciona los nutrientes necesarios para el crecimiento de las plantas (Muller et al., 2010). La fertilidad del suelo, determinada por la capacidad de proporcionar cantidades esenciales de nutrientes, va a establecer la producción o rendimiento de los cultivos, dando como resultado el beneficio económico y la degradación ambiental mínima (Hatfield, 2006).

En el sistema agrícola, la administración de estiércol, fertilizantes orgánicos e inorgánicos y otros tipos de materiales orgánicos, garantizan el equilibrio y la fertilidad del suelo; si esta disminuye, el rendimiento de los cultivos va a ser muy bajo. Mantener este equilibro en el suelo garantiza una agricultura sostenible, lo que abarca las reacciones químicas, la cantidad y disponibilidad de nutrientes, así como las comunidades microbianas existentes (Muller et al., 2010). Stockdale y colaboradores en el 2013 asegura que el 73% de los agricultores a nivel mundial emplean fertilizantes y pesticidas de origen químico, el 26% emplean tanto químicos como biológicos, y las técnicas de labranza tradicionales cada vez son más comunes. Logrando así un desarrollo óptimo del cultivo, pero sin conocer las condiciones finales del suelo (Stockdale et al., 2003).

Los factores más comunes en la degradación del suelo son la deforestación, el manejo inadecuado de las tierras (aplicación de compuestos químicos y métodos de labranza) y el desarrollo de infraestructura, así como el tipo de cultivo que se emplee (Nunes et al., 2011). La labranza continua, el pastoreo intenso y dejar las tierras sin cultivos vegetales de protección, aumenta la pérdida de materia orgánica haciendo compactas y vulnerables las tierras a la erosión (Don et al., 2010). Tsiafouli y colaboradores (2016), evidenciaron que las prácticas agrícolas intensivas reducen la diversidad microbiana del suelo, causando un desequilibrio tanto biológico como químico, trayendo consecuencias en la capacidad de responder ante eventos de cambios climáticos extremos (De Vries et al., 2012). CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 25

Microbiota del Suelo

Las comunidades microbianas presentes en el suelo establecen la salud y la producción del cultivo, además son responsables de transformar los nutrientes en forma asimilable para la planta, permitiéndole así aprovechar todos los recursos existentes en el ecosistema (Philippot et al., 2013).

La relación existente entre la productividad y la diversidad de especies de plantas se ve influenciada por las interacciones dadas entre las especies de plantas y los microorganismos propios de la rizósfera. En algunos casos se evidencia la disminución de riesgo de enfermedades por la diversidad microbiana, esto se debe a que actúan como controladores biológicos reduciendo o inhibiendo los efectos que causan los patógenos transmitidos por cultivos rotativos (Kulmatiski et al., 2012).

Microorganismos de la Rizosfera

La rizosfera es la zona del suelo que rodea y se ve influenciada por las raíces de las plantas, en ella se encuentra un gran número de microorganismos e invertebrados, los cuales participan activamente en el crecimiento, salud y nutrición de las plantas (Berendsen et al.,

2012). En los sistemas de producción agrícola se emplean insumos que proporcionan al suelo minerales, protección (plaguicidas) y combustibles fósiles; estos a su vez, pueden intervenir en la estructura de las comunidades microbianas presentes en el suelo. Causando una disminución en la diversidad microbiana y en el tipo de función original de cada microorganismo

(Ayres et al., 2009). Cualquier microorganismo presente en la rizosfera, tiene la capacidad de alimentares de los rizo-depósitos que provee la planta, proporcionándole nutrientes, exudados, mucílago, y células que les permite su óptimo desarrollo y adaptabilidad (Teixeira et al., 2010).

La composición microbiana y su abundancia van a depender del tipo de plantas cultivadas. De Angelis y colaboradores (2009) y Uroz y colaboradores (2010), determinaron por medio de métodos moleculares que el filo con mayor prevalencia en las muestras de suelo CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 26

analizadas es Proteobacteria. Esto se debe a la fácil adaptabilidad de estos microrganismos y a su amplia capacidad de emplear diversos sustratos derivados de la raíz (De Angelis et al.,

2009; Uroz et al., 2010). Estudios realizados por Bulgarelli y colaboradores (2012), mostraron que la diversidad y composición del microbioma de la rizosfera de Arabidopsis thaliana estaba fuertemente influenciada por el tipo de suelo y de exudados que secretaba la planta (Bulgarelli et al., 2012). Por otra parte, estudios metagenómicos realizados en suelos cultivados con plantas de fresa arrojaron que la composición microbiana era liderada por comunidades actinobacterianas (Costa et al., 2006). Esto indica que el tipo de planta, y la composición del suelo determinan la microbiota presente en el suelo.

Los exudados liberados por las raíces de las plantas van a generar diferentes respuestas de diversos microorganismos. Cuando se encuentra un alto contenido de flavonoides atraen simbiontes como Rhizobiales y patógenos como Phytophthora. Estos metabolitos secundarios cumplen la función de estimular la germinación de esporas microrrícicas, influyendo en la detección del Quorum Sensing (Callaway et al., 2008). Otros metabolitos como los alcaloides de pirrolizidina, tienden a disminuir la concentración de microorganismos benéficos, permitiendo la aparición de organismos tolerantes o incluso de algunos con capacidad de metabolizar estos compuestos (Pérez-Montano et al., 2011).

Funciones de los Microorganismos

Al ser el suelo el hábitat más complejo y diverso, la presencia de microorganismos benéficos para las plantas es mayor. En la tabla 1 se evidencian diferentes roles que cumplen estos microorganismos en el suelo, su riqueza va a depender de los factores bióticos y abióticos presentes en el cultivo.

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Tabla 1.

Roles de Microorganismos en el Suelo

Función Descripción Microorganismos involucrados

Soporte físico Los microorganismos contribuyen al ciclado de nutrientes y a la Actinobacteria; Bacillus; descomposición y producción de Pseudomonas; Rhizobium; la materia orgánica. Los Cianobacterias; Nitrosomas; productos secretados por estos Nitrobacter. ayudan a la formación estructural del suelo, haciéndolo más habitable para las plantas. Fuente de Producción de metabolitos materias primas primarios y secundarios Pseudomonas; Bacillus; empleados en la biotecnología. Xanthomonas. Medio de Movilizan nutrientes asimilables Clostridium; Rhizobium; Nitrobacter. crecimiento para para la planta, permitiendo su las plantas óptimo crecimiento. Ciclado de Permiten la meteorización de Rhizobium; Nitrobacter; nutrientes minerales, haciéndolos Nitrosomas; Nitrococcus; asimilables para la planta. Cianobacterias; Agrobacterium; Arthrobacter; Corynebacterium; Thiobacillus; Bacillus.

Reciclaje de Se da por medio de la Rhizobium; Azotobacter; residuos y inmovilización y la mineralización Flavobacterium; Bacillus; desintoxicación realizada por los Pseudomonas; Aerobacter. microorganismos. Esto va a depender de la disponibilidad de nutrientes como carbono, nitrógeno o fósforo.

Filtro de Los productos secretados por los Pseudomonas; Bacillus; contaminantes microorganismos vuelven el suelo Clostridium; Leptothrix; más hidrófobo, volviendo capaz al Streptomyces. suelo de filtrar los contaminantes. Esta función va a depender de la cantidad de arcilla y de materia orgánica presente.

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Tabla 1 (Continuación) Función Descripción Microorganismos involucrados Diversidad Las bacterias, hongos y arqueas Acinobacter, Agrobacterium, del suelo, son la base de la Bacillus, Brevibacterium, cadena alimentaria, permitiendo Clostridium, Corynebacterium, la diversidad en los niveles Flavobacterium, Micrococcus, tróficos superiores. En algunos Mycobacterium, Pseudomonas. casos las interacciones entre plantas y microorganismos determinan la biodiversidad de las plantas. Control biológico Diferentes especies de bacterias, Agrobacterium; Bacillus. de plagas, hongos y arqueas benéficas, patógenos y permiten el crecimiento de la malas hierbas planta haciendo asimilable los minerales y eliminando patógenos invasores. Almacenamiento Los microorganismos determinan Actinomycetes; Pseudomonas; de carbono y la capacidad de almacenar el Mycobacterium; Clostridium. regulación de las carbono en el suelo por medio de emisiones de la mineralización. Las bacterias y gases invernadero hongos regulan las emisiones de óxido nitroso y de metano en los suelos.

Nota: Funciones de los microorganismos y descripción de cada proceso en el suelo. Adaptado de Dominati et al., 2010; Aislabie y Deslippe, 2013.

Secuenciación de Nueva Generación

Conocer la estructura de las poblaciones microbianas, junto a sus funciones y dinámicas específicas, requiere el empleo de herramientas de diferentes áreas del conocimiento, representando así un gran reto para la comunidad científica. Para el estudio de los microbiomas presentes en diversos ecosistemas, se emplea un método sólido y bien establecido, basado en la secuenciación de amplicones del gen 16S ARNr (Koboldt et al.,

2013). Con base en las diferencias encontradas entre las secuencias de ARN ribosomal de la subunidad pequeña, se pudo obtener la clasificación biológica de los tres dominios que predominan la vida, estableciéndose así, como una macromolécula que serviría como un CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 29

marcador taxonómico evolutivo, especificando desde reino, hasta género o especie

(Kamalakaran et al., 2013). Una de las primeras estimaciones en la composición microbiana de muestras ambientales, fue realizada por Pace y colaboradores en 1986, mediante el empleo de clonación y posterior secuenciación por el método Sanger; este trabajo impuso la independencia de la necesidad de realizar cultivos, y la implementación de la reacción en cadena de la polimerasa (Pace et al., 1986). Esto permitió la construcción de librerías genómicas o genotecas de secuencias completas del gen 16S ARNr. Debido a que las secuencias de este gen son altamente conservadas, posee alta precisión para los niveles taxonómicos más profundos, como género y especie; pero su función como marcador taxonómico se le atribuye a que es ubicuo, ya que se puede encontrar en procariotas y arqueobacterias, teniendo su homólogo en eucariotas; también a su tamaño de 1.500 pb y su alto grado de conservación, que permite definir las mutaciones durante el desarrollo de los microorganismos; por último, al poseer nueves regiones variables conservadas (Figura 2), se vuelve útil para el diseño de cebadores. Permitiendo así, la distinción entre taxones, incluyendo lo más específicos (Clarridge, 2004).

El uso de las tecnologías NGS en el campo de la investigación de ecosistemas ha tomado relevancia con el paso del tiempo y con las mejoras en las técnicas. Los primeros estudios de microbiomas permitieron establecer un control de calidad en la técnica empleada, y en la reducción del error en la secuenciación mediante herramientas bioinformáticas (Di Bella et al., 2013). Por estos estudios, se pudo determinar la poca viabilidad que tiene el método descrito por Sanger. Al solo permitir el uso de secuencias individuales y purificadas, restringe el conocimiento de la población y diversidad “total” del ecosistema. A pesar de esto, este método fue empleado por décadas con el fin de amplificar, clonar y secuenciar el gen 16S

ARNr y lograr una previa identificación y clasificación taxonómica de muestras ambientales sin necesidad de emplear los métodos de cultivo básicos (Klindworth et al., 2003). Con los datos CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 30

recolectados con el paso del tiempo, las secuencias obtenidas se han depositado en bases de datos públicas, permitiendo su uso por los científicos como referencia para la correcta identificación y clasificación taxonómica microbiana (Bowman et al., 2015).

Figura 2.

Gen 16S ARNr

Nota: Existen 10 regiones conservadas entre las 9 regiones variables. Las posiciones corresponden a la secuencia del ARNr de E. coli.

En el inicio de la NGS, las secuencias que se obtenían eran muy cortas y se llevaban a cabo en la secuenciación de genomas completos; pero gracias a su velocidad y capacidad de dar los resultados, tuvo un impacto en la genómica (Koboldt et al., 2013), en la medicina

(Kamalakaran et al., 2013) y la microbiología (Padmanabhan et al., 2013). Cuando se lograron obtener secuencias más largas y más confiables, el impulso de la metagenómica se hizo más evidente. Siendo una disciplina encargada del estudio de genomas en ambientes como suelo, agua y aire, sin necesidad del empleo de medios de cultivo, permitiendo describir la composición de la muestra por medio de la identificación y clasificación taxonómica de poblaciones microbianas y las capacidades funcionales de las comunidades presentes, explicando así, su papel en los ciclos biogeoquímicos y su efecto en el medio ambiente

(Thomas et al., 2012).

La metagenómica necesita ser complementada por la bioinformática, esto con el fin de facilitar el análisis de secuencias y la realización de proyectos a gran escala, como el microbioma humano o el microbioma de la tierra (Gilbert et al., 2014). El análisis metagenómico se realiza por medio de la secuenciación de genomas presentes en una muestra ambiental con CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 31

alguna de las tecnologías de NGS, dando como resultado gran cantidad de secuencias, pero en un tamaño reducido. La secuenciación se realiza en ambas direcciones a fragmentos de hasta 300 nucleótidos, y su ensamblaje no es tan fácil, ya que poseen altas similitudes entre ellas (Miller et al., 2011; Yuan et al., 2015).

Algunos resultados obtenidos a lo largo de la historia, muestran ciertas limitaciones que posee esta tecnología de secuenciación. Esto se basa en las diferencias que posee cada región variable, debido a que cada una posee su propia tasa de mutación, teniendo así diferente grado de identificación en los distintos grupos bacterianos (Mizhrahi-Man et al., 2013).

De este grado de identificación va a depender el índice de diversidad, el cual permite evidenciar la utilidad de la región amplificada en la descripción de las comunidades microbianas presentes en la muestra analizada. En un estudio realizado por Miller y colaboradores (2013), se observó que al emplear solo la región conservada V3, la diversidad era menor que la cantidad de OTUS

(Unidades taxonómicas operacionales) obtenidos, aumentando el número de secuencias sin clasificar (Miller et al., 2013). Por el contrario, Yarza y colaboradores (2014), puso en evidencia, que el empleo de las secuencias completas o muy cercanas al total de pares de bases del gen

16s permiten una precisión casi del 100% en la identificación microbiana (Yarza et al., 2014).

El empleo de metagenómica se basa en 5 pasos esenciales. La recolección de muestras ambientales es el primero, para esto es necesario conocer las propiedades físicoquímicas del suelo, el método de muestreo que se va a usar, las condiciones óptimas para su transporte y almacenamiento, garantizando la calidad de ADN presente en la muestra. La obtención de ADN de alta calidad a partir de las muestras, es el siguiente paso. Durante la extracción de ADN pueden existir dificultades que van a limitar la concentración y la calidad que se requiere. Las propiedades del suelo, como su composición, características físicas y químicas (sustancias húmicas o compuestos fenólicos), y la diversidad microbiana que presenten, reducen e interfieren en la eficiencia del proceso de extracción (Soni y Goel, 2010). CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 32

La clasificación de las librerías metagenómicas va a depender del tamaño del fragmento del vector clonado (inserción grande o pequeño). Por medio de vectores plasmídicos se construyen bibliotecas de inserción pequeña (≈10kb), las cuales son adecuadas para determinación taxonómica y funcional. Vectores cósmidos o fosmid o cromosomas bacterianos artificiales permiten la construcción de bibliotecas de inserción grande. Alojan fragmentos de 25 – 200 kb.

Por la gran magnitud de sus fragmentos, se emplea para la identificación de funciones codificadas por múltiples genes, permitiendo determinar los vínculos taxonómicos que puedan existir (Surmann y Effert, 2014). Escherichia coli es un microorganismo modelo de laboratorio, que al poseer una replicación estable de los vectores y bajas tasas de recombinación y restricción lo hacen un organismo idóneo para la clonación y expresión de ADN extraño.

Además de E. coli, existen host de selección como Streptomyces lividans, Bacillus subtilis y

Saccharomyces cerevisiae. Por lo general, la librería se construye y se mantiene en E. coli, para luego ser transformada en los huéspedes de selección (Craig et al., 2010). Por último, se debe dar la selección de la librería. Esta va a depender de la secuencia de nucleótidos o de la actividad funcional. Para secuencias provenientes de suelo, se utiliza sondas específicas, permitiendo la identificación de marcadores filogenéticos y otros genes con dominios conservados (Soni y Goel, 2011).

NGS en la Agricultura

La gestión integrada de nutrientes y un sistema de biodiversidad en el suelo van a depender de la microbiota presente en este y de las características físicoquímicas propias, permitiendo el crecimiento de las plantas y el desarrollo integral. Debido a las prácticas agropecuarias industrializadas, el empleo de fertilizantes químicos y pesticidas, la diversidad microbiana en los agroecosistemas se encuentra perjudicada, causando un gran impacto ambiental y económico. Es necesaria su restauración para lograr la mitigación de impactos negativos, manteniendo el equilibrio en el ecosistema y garantizando la seguridad alimentaria CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 33

(Lucero et al., 2014). La mayor información obtenida de la composición microbiana de estos ecosistemas, se logró mediante técnicas de cultivo e identificación por la morfología que presentaban (Wooley et al., 2010). Estos métodos dejaban a un lado a los microorganismos considerados no cultivables. Por esto, se desarrollaron diversas técnicas que permitirían la identificación de estos microorganismos incultivables; se basaban en la amplificación por PCR del gen 16s, 18s o 23s con el fin de obtener información taxonómica y filogenética. Esto se logra, gracias a la presencia de regiones altamente conservadas, que garantizan la identificación de los microorganismos presentes en el ecosistema analizado (Wooley et al.,

2010). Conocer la diversidad microbiana presente en los microambientes es relevante, su uso y manipulación aseguran mejoras en las condiciones del cultivo, por ende, un aumento en la producción.

La información obtenida de la composición microbiológica de la rizosfera, permite conocer la estructura de las comunidades asociadas, su dinámica y las actividades funcionales, estableciendo la coordinación entre especies y la competencia por nutrientes (Premalatha et al., 2010).

Illumina

Balasubramanin y Klenerman (1998) fundaron la compañía Solexa, comercializando su método de secuenciación “secuenciación por síntesis”. En el 2007, Illumina compró a Solexa, mejorando y desarrollando la tecnología original (Balasubramanin y Klenerman, 1998).

La técnica consiste en el empleo de dNTP modificados que al contener un terminador va a bloquear la polimerización adicional, por lo cual la enzima polimerasa solo agrega una

única base a cada hebra de ADN. El terminador contiene una etiqueta fluorescente, al emplearse solo uno, cada una de las cuatro bases se agregan en diferente ciclo. Cuando se adicionan las cuatro, las imágenes se graban y los terminadores se eliminan (Van Dijk et al.,

2014). El proceso de amplificación por PCR se realiza dentro de la plantilla sólida, a lo que se CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 34

le denomina amplificación de puente. Aproximadamente genera un millón de copias de cada plantilla en la superficie de la celda de flujo (Kircher et al., 2012). Realiza ejecuciones de extremo único y emparejado con longitudes de lectura ajustables desde 1 × 36 pares de bases hasta 2 × 300 pares de bases. Una sola ejecución puede producir datos de salida de hasta 15

Gb en tan solo 4 h de tiempo de ejecución y puede generar hasta 25 M de lecturas individuales y 50 M de lecturas de extremo emparejado. Por lo tanto, MiSeq proporciona una plataforma ideal para un tiempo de respuesta rápido. Por estas razones, MiSeq se ha convertido en una de las plataformas de secuenciación de próxima generación más utilizadas.

La plataforma Illumina se centra en cuatro pasos básicos. Primero se realiza la preparación de la biblioteca, donde la secuenciación se da por la fragmentación aleatoria del

ADN, seguida de la adaptación de los primers por medio de la ligación (Figura 3).

Posteriormente los fragmentos se amplían por medio de PCR.

En la generación de clusters (Figura 4), la biblioteca se coloca sobre una celda de flujo, en la cual los fragmentos se anclan en una capa de oligocomplementarios; allí se amplifican y se agrupan los clones mediante la amplificación de puente. Cuando se completa esta fase, las plantillas están listas para su secuenciación. Illumina emplea un método de secuenciación denominado “terminador reversible” (dNTP), donde se detectan las bases individuales que están incorporadas en las plantillas (Figura 5).

Como resultado se obtiene una secuenciación base por base, garantizando alta precisión eliminando regiones repetitivas y homopolímeros. Por último, se realiza un análisis, y una alineación de los datos con genomas de referencia (Figura 6) (Fallows, 2014; Ross et al.,

2013; Nakazato et al., 2013).

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 35

Figura 3.

Fragmentación de ADN

Nota: Al fragmentarse el ADN, se da inicio a la unión de primers o adaptadores para la obtención de la librería de secuenciación.

Figura 4.

Amplificación de ADN

Nota: La biblioteca se carga en una celda de flujo y los fragmentos se hibridan. Cada fragmento unido se amplifica en un grupo clonal.

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 36

Figura 5.

Secuenciación de ADN

Nota: Proceso de secuenciación. Se añaden los nucleótidos y se toma la imagen de la celda de flujo. Cada base tiene su propia longitud de onda e intensidad para su identificación.

Figura 6.

Alineación de Secuencias

Nota: La alineación de secuencias se realiza con una secuencia de referencia con un software bioinformático. CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 37

MiSeq o HiSeq. Estos dos tipos de Illumina emplean la misma química de terminador reversible. En lo único que se diferencian es en la velocidad de la obtención de resultados y en el área de superficie que tiene la celda de flujo, además de su costo. En general, HiSeq es empleado para la secuenciación de genomas completos, esto se debe a su gran capacidad de lecturas (˜ 600k lecturas) en 40 horas. Por el contrario, MiSeq es específico para genomas pequeños o dirigidos (Illumina, 2014).

Tabla 2.

Illumina MiSeq

Longitud de Tiempo Resultado Puntuación de Lecturas lectura total calidad únicas >75% de bases 2 x 250 pb 39 horas 7,5 – 8,5 Gb superior a Q30 12 – 15 M >70% de bases 2 x 300 pb 56 horas 13,2 – 15 Gb superior a Q30 22 -25 M

Nota: Parámetros de rendimiento de Illumina MiSeq. Tomado de Illumina, 2014.

Tabla 3.

Illumina HiSeq

Longitud de Tiempo Resultado Puntuación de Lecturas lectura total calidad únicas >85% de bases 2 x 50 pb 5 días 135 – 150 Gb superior a Q30 1,5 T >85% de bases 2 x 100 pb 9 días 270 – 300 Gb superior a Q30 1,5 T

Nota: Parámetros de rendimiento de Illumina HiSeq. Tomado de Illumina, 2014.

En las tablas 2 y 3, se evidencian los parámetros de rendimiento de cada sistema. Se puede concluir que, aunque la longitud de lectura del MiSeq es mayor, los resultados que se van a obtener en el HiSeq van a ser más y su puntuación de calidad es mayor. Al tener mayor capacidad de obtención de secuencias, el sistema HiSeq es especializado para la CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 38

secuenciación de genomas completos. Cabe resaltar que el sistema HiSeq permite la incorporación de dos celdas de flujo, aumentando el área de superficie, por ende, la cantidad de lecturas (Illumina, 2014).

Primers Empleados en la Secuenciación. El diseño y empleo de los primers depende del objetivo del estudio, estos pueden se específicos para una comunidad en particular o para un gen o grupo ortólogo. Para proyectos cuyo objetivo es determinar la composición y la estructura de la población microbiana, se recomienda el uso de primers universales en su capacidad de unión y que produzcan amplicones distinguibles para los taxones de interés (Methé et al.,

2012). Los cebadores universales presentan ciertas limitaciones, esto se debe a que, al ser específicos o sesgados, no son compatibles con las especies nuevas. Llevando a la creación de cebadores específicos de taxón, mejorando la complementariedad de la mayoría de los cebadores universales (Sim et al., 2012). Durante el proceso de PCR, los cebadores directos e inversos se hibridan en ubicaciones específicas en el ADN diana, permitiendo la amplificación del fragmento. Para que este proceso sea eficiente y efectivo, los cebadores deben cumplir ciertas condiciones, como el rango de temperatura de fusión, especificidad del cebador, anclaje

GC, tipo de interacción cebador-cebador, degeneración limitada y longitud del amplicón. Al tener mayor contenido de GC, el anclaje es más fuerte siendo esencial para el momento de la secuenciación. Al mantenerse una temperatura alta, la unión del cebador con la plantilla es más específica e inhibe que los adaptadores formen estructuras secundarias (Schloss et al., 2011).

Cole y colaboradores (2009), determinaron que los cebadores Bakt_341F posee una buena puntación de calidad y que Bakt_805R se combina perfectamente, obteniendo una puntuación de calidad buena en la comparación de secuencias bacterianas, todo esto verificado con RDP

(Cole et al., 2009).

Coeficiente de Calidad. El puntaje de calidad de Phred (puntuación Q), se encarga de evaluar la precisión de un método de secuenciación. Proporciona información sobre cada paso de la CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 39

secuenciación, incluyendo la preparación de las bibliotecas, las llamadas de base y la alineación de las lecturas (Morgan et al., 2010). Esta puntuación se relaciona logarítmicamente son las probabilidades de error en la llamada de bases. Si durante la secuenciación de asigna una puntuación Q de 20 (Q20), esto es equivalente a que la probabilidad de que un llamado de base sea incorrecto se encuentra 1 en 100 veces; lo cual indica que la precisión de la base llamada es del 99%. Al tener un Q30 se puede deducir que prácticamente todas las lecturas son perfectas, sin errores ni ambigüedades. En la tabla 4 se evidencian los valores de Q más comunes (Fujimoto et al., 2010).

Tabla 4.

Puntaje de Calidad de Phred

Puntaje de calidad de Probabilidad de un llamado Precisión de llamada de Phred de base incorrecto base 10 1 en 10 90% 20 1 en 100 99% 30 1 en 1000 99,9% 40 1 en 10000 99,99% 50 1 en 100000 99,999%

Nota: Con estos valores se puede saber la probabilidad de que un llamado de base durante la secuenciación sea incorrecto. Tomado de Fujimoto et al., 2010.

Análisis Bioinformático de Secuencias

La bioinformática se ha convertido en una gran disciplina científica, apoyando el desarrollo de la biología molecular, la genómica comparativa, la biotecnología y las aplicaciones de genomas bacterianos (Goujon et al., 2010). Por medio del análisis de secuencias de ADN se ha descubierto similitudes estructurales y funcionales entre cada microorganismo que conforma una población microbiana (Takaku et al., 2006). Para lograrlo se debe realizar una alineación de secuencia, comparación en bases de datos, reconstrucción de patrones evolutivos y por último la formación o comparación del genoma. Durante este análisis CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 40

se debe tener en cuenta la existencia de secuencias similares pero que son de diferentes organismos, a lo que se le llama “Secuencias homólogas”; su similitud se debe a su descendencia, ya que pueden provenir de un origen evolutivo común (Jena y Rabindra, 2009).

Otro termino, es “Similitud de secuencias”, este hace referencia a las similitudes en las propiedades físico-químicas tales como el tamaño y la hidrofobicidad de la secuencia (Phobe y

Yi-Ping, 2005).

Existen tres tipos de bases de datos biológicas con base en su contenido:

 Bases de datos primarias: Los datos presentes son originales, se le consideran archivos de secuencias en bruto o datos estructurales. Por ejemplo, el GenBank y EMBL, empleados para la gestión de datos biológicos para alineamiento por pares de secuencias.

 Bases de datos secundarias: Su contenido se basa en información ya procesada computacionalmente, teniendo como referencia los datos de las bases primarias. Un ejemplo es

Swiss-Prot o PIR.

 Bases de datos especializadas: Estas bases se centran en un interés particular de investigación, son especializadas es determinado organismo o en un tipo de datos específicos.

Como ejemplo se tiene RDP, VIH, MG-RAST.

(Meneses et al., 2011).

Herramientas de recuperación de datos como Entrez (desarrollado por el NCBI), permite el acceso al investigador a una amplia gama de dominios de datos, incluyendo genomas completos y estructuras en 3D. Para la realización de comparación de secuencias y alineación, se recomienda el uso de BLAST, cuyo análisis se realiza en el menor tiempo posible en una base de datos específica (Jena y Rabindra, 2009). CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 41

MG-RAST como Herramienta Bioinformática

Meyer y colaboradores (2008), describen a MG-RAST como un recurso público, que permite la anotación y el análisis de secuencias metagenómicas, albergando más de 150.000 conjuntos de datos (Meyer et al., 2008). MG-RAST facilita al investigador evaluar la calidad de las secuencias, evitando la presencia de adaptadores que causan contaminación, removiendo secuencias quiméricas y reduciendo los altos índices de error (Wilkening et al., 2009). Para subir los datos a la plataforma, es necesario que la longitud mínima de lectura sea de 75pb y el tamaño del conjunto de los datos debe ser mínimo de 1 megabase.

El flujo de trabajo del análisis para MG-RAST se describe a continuación; las muestras secuenciadas por medio de la plataforma Illumina se someten a una serie de pasos para así evaluar la calidad de los datos obtenidos antes de la anotación (Meyer et al., 2008). Cabe resaltar que durante este proceso se descartan lecturas de baja calidad por medio de SOLEXA

QA, el cual realiza un corte en las regiones no viables para la identificación (Cox et al., 2010).

Al subir los datos en la plataforma y realizar la eliminación de lecturas, se inicia el proceso de desreplicación, el cual consiste en la identificación de secuencias idénticas para así eliminar aquellas que se encuentren duplicadas artificialmente (Gomez-Alvarez et al., 2009). La estimación de error de secuenciación inferida de lectura duplicada (DRISEE), permite analizar los conjuntos de lecturas duplicadas artificiales y determinar el grado de variación entre las secuencias idénticas (Keegan et al., 2012). Este, permite el cribado, donde las secuencias casi exactas a organismos eucariotas se descartan, esto con el fin de evitar el análisis y el almacenamiento de este tipo de secuencias (Langmead et al., 2009). El llamado de genes realizado automáticamente por FragGeneScan, predice regiones de codificación en las secuencias de ADN de 75 o más pb; esta herramienta es solo para procariotas, las proteínas eucarióticas se identifican, pero no se tienen en cuenta para el análisis de agrupamiento

(Trimble et al., 2012). El agrupamiento por aminoácidos se da con un nivel de identidad del CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 42

97% por medio del Uclust; esto reduce la carga computacional al descartar las secuencias cortas y aquellas que no cumplan con el porcentaje de identidad; se trabaja con este porcentaje ya que conserva suficientes señales biológicas para la previa identificación (Caporaso et al.,

2010). Al obtener la secuencia más larga de cada grupo, se somete a un análisis de similitud por medio de SBLAT, reconstruyendo la composición de especies dependiendo del origen filogenético de las secuencias analizadas con las secuencias de bases de datos; para posteriormente realizar un mapeo de anotación, donde las secuencias obtenidas son comparadas con las secuencias encontradas en las bases de datos del programa. Estas permiten conocer la abundancia relativa y establecen la taxonomía desde Domino hasta

Género (Edgar, 2010).

Esta herramienta bioinformática permite el procesamiento uniforme y automatizado a gran escala, al igual que la comparación del compendio de datos y la reconstrucción de comunidades, a nivel taxonómico y funcional.

Unidad Taxonómica Operacional. El concepto de Unidad Taxonómica Operacional fue introducido por Snealth y Sokal en 1973, con el fin de clasificar cuantitativamente los organismos basados en caracteres de similitud e identidad. El umbral de identidad para esta clasificación es del 97% (Snealth y Sokal, 1973). Las herramientas bioinformáticas permiten la creación de tablas de OTU’s dependiendo de la identidad de las secuencias. Si alguna de las secuencias no se encuentra en la tabla puede deberse a tres razones, la principal es porque la lectura no coincide con una OTU al 97%; otra es la presencia de falsos negativos en algunas coincidencias; y la última por un error en el flujo de trabajo, lo cual hace que la lectura sea excluida de la tabla (Brooksband et al., 2014).

Ecología de Comunidades: Diversidad α y β. Tradicionalmente se conocen tres tipos de diversidades, α o diversidad local, β, que hace referencia a la diferencia en la composición de especies entre dos o más lugares de una misma región, y γ o regional, encargada de la CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 43

diversidad a grandes escalas, es aquella que combina componentes de las dos primeras diversidades (Whittaker, 1972; Koleff et al., 2003). La diversidad α se considera como la biodiversidad de un lugar o hábitat especifico, es una variable independiente al igual que la diversidad β. La forma más sencilla de estimar esta diversidad es conociendo el número de especies que la componen. Hay que tener en cuenta que existen especies con un alto grado de dominancia y otras con abundancia baja. Si se mantiene una uniformidad alta, se obtiene una comunidad mucho más diversa, ya que posee un número alto de especies y además su abundancia es similar (Blackburn y Gaston, 2003). Para el estudio de la heterogeneidad de un lugar se emplea la diversidad β. Permite la comparación de comunidades microbianas entre sitios de una misma región. Whittaker (1972) expresó que esta diversidad de mide como la proporción por la cual la riqueza de especies de una región excede la riqueza promedio de una sola localidad dentro de esa región. Por medio de la aplicación de la diversidad β se puede evidenciar si existe algún cambio en la composición de especies, si existe un grado de asociación o similitud entre muestras y si los limites biogeográficos y los factores externos a los que se expone el suelo intervienen en la composición microbiana (Whittaker, 1972; Tuomisto,

2010).

Análisis Estadístico

El empleo de softwares estadísticos en metagenómica permite al investigador correlacionar los datos obtenidos de la secuenciación de ADN entre las muestras analizadas.

Por medio del cálculo de la diversidad α y diversidad β se estiman las diferencias en la composición de especies dentro (α) o entre (β) hábitats o ecosistemas. Además, el uso del análisis de componentes principales (método no paramétrico) reduce el conjunto de datos obtenidos en dos variables o componentes más importantes, permitiendo explicar la varianza en los datos y si existe correlaciones con las demás variables (Ilin y Raiko, 2010). CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 44

Past Software

Este software es esencial para el análisis de datos científicos, permitiendo la manipulación de datos obtenidos, estadísticas univariadas o multivariadas, análisis ecológico o determinación de diversidad α y β (Hammer y Harper, 2006). Contiene una interfaz de tipo hoja de cálculo y algoritmos capaces de producir automáticamente gráficas y tablas (Hammer et al.

2001).

Los datos obtenidos en metagenómica no poseen una distribución normal y contienen diversas variables, por ende, se emplean análisis multivariables o métodos estadísticos no paramétricos que permiten estimar las relaciones que existen entre dos o más variables

(Johnson y Wichern, 1998). En los métodos ofrecidos por el Software PAST se encuentra el análisis de componentes principales (PCA), análisis de coordenadas principales (PCO), análisis de correspondencia (CA) y análisis de correspondencia desvinculada (DCA). En estudios realizados por Kumar y colaboradores (2018) y Chen Hong y colaboradores (2015), emplearon el Análisis de Componentes principales para determinar si las condiciones de los suelos estudiados influían en la composición y diversidad de las comunidades microbianas del suelo

(Kumar et al., 2018; Chen Hong et al., 2015).

Análisis de Componentes Principales. ACP es una técnica ampliamente utilizada para conjuntos de datos multidimensionales, como los resultantes de estudios de secuenciación de alto rendimiento. Permite reducir los datos proyectándolos de forma geométrica en dimensiones inferiores denominados componentes principales (CP), además se basa en las variaciones y correlaciones en los datos. Cada CP es ortogonal a los demás CP, por lo tanto, cada una exhibe diferente información. Cada una de estas tiende a explicar la máxima variación que existen entre ellas (Lever et al., 2017). El Software PAST realiza este análisis con el fin de encontrar variables que puedan explicar la mayor cantidad posible de varianza es sus datos de alta dimensión, esto lo realiza reduciendo los datos a dos dimensiones (X, Y) ayudando así a CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 45

su visualización. Las variables que se obtienen son la combinación lineal de las variables originales, por lo general destacan dos variables (los dos componentes más importantes) con el fin de permitir el trazado y agrupamiento de datos. El primer PC se elige para minimizar la distancia entre los datos, es el que mayor varianza tiene. Si más del 50% de varianza se encuentra en el primer PC, el análisis de componentes principales habrá sido un éxito. Las variantes más pequeñas pueden ignorarse o suprimirse, ya que podrían ser fuente de errores.

Como resultado de la conversión de los datos a componentes principales, se obtiene una gráfica de puntajes, donde cada punto representa un espectro único. Si estos puntos se encuentran cerca uno del otro tendrían perfiles similares, pero se encuentran distanciados va a existir una disimilitud elevada (Stegle et al., 2015).

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 46

Estado del Arte

Putrie y colaboradores (2020) realizaron el primer estudio de la diversidad bacteriana endófita y de la rizosfera de una planta de piña en un ecosistema semiárido. Mediante el uso de metagenómica de nueva generación reportaron un total de 911 OTU’s bacterianos en la rizosfera del cultivo de piña, 191 de estos se encontraban presentes tanto en la en la rizosfera como endófitos en la planta y 667 OTU’s fueron únicos para la rizosfera de la planta.

Proteobacteria y Cyanobacteria se encontraron en mayor proporción en las plantas de piña, mientras que Actinobacteria, Proteobacteria, Firmicutes y Acidobacteria fueron predominantes en el suelo del cultivo. Ellos concluyeron que la diversidad microbiana de plantas en ecosistemas semiáridos como la piña, depende de la variedad de la planta, las condiciones climáticas y la disposición de nutrientes que permitan el desarrollo adecuado de la planta

(Putrie et al., 2020).

El estudio realizado por Hemmat-Jou y colaboradores (2018) por medio de análisis metagenómicos estableció el efecto de la minería en las comunidades microbianas presentes en suelos contaminados con Plomo y Zinc. Como resultado de la secuenciación, se obtuvo

40.000±85 secuencias bacterianas (85%), 8.000±34 secuencias de Arquea (15%) y 13% de secuencias sin clasificar. El 87% de las secuencias correspondían a los filos Proteobacteria

(siendo el más dominante), Actinobacteria, Acidobacteria, Bacteroidetes, Gemmatimonadetes y

Chloroflexi. Encontrándose en menos abundancia Firmicutes y Verrumicrobia. Se encontró que

Proteobateria, Chloroflexi, Gemmatimonadetes y Verrumicrobia tenían mayor presencia en el suelo con mayor contaminación de metales pesados, indicando su capacidad de adaptación a las condiciones del medio. Los géneros con mayor incidencia fueron Solirubrobacter,

Geobacter y Pseudomonas. Estos se encontraban en mayor concentración en los suelos con alta contaminación, lo que determina su resistencia al Pb y al Zn, así como su capacidad de transformar los metales pesados. Determinaron que, a mayores concentraciones de metales CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 47

pesados, la diversidad microbiana sería más limitada pero no la abundancia de cada género.

En el suelo que tenía mayor concentración de metales se evidenció la presencia de más bacterias tolerantes o resistentes a estos metales, permitiendo establecer la capacidad de adaptación de estos microorganismos (Hemmat-Jou et al., 2018).

La predominancia del filo Proteobacteria en suelos sin contaminación con cadmio y sembrados con hortalizas se evidenció en el estudio realizado por Feng y colaboradores

(2018). Esto se estableció por medio del empleo de herramientas metagenómicas con Illumina

MiSeq. Se tenían dos suelos, uno contaminado con cadmio y otro sin contaminación.

Acidobacteria se encontró en mayor concentración en S1, así como Gemmatimonadetes y

Thaomarchaeota. Estos filos correspondían al 75% de la población total. Se encontraron un total de 1736 géneros de bacterias. En S1 (sin contaminación por cadmio) predominó

Cadidatus Koribacter, Candidatus Solibacter y Bradyrhizobium. En S2 (contaminación por cadmio) se encontró mayor presencia de Nitrosphaera, Nitrosospira y Sulforicella. La abundancia microbiana fue mayor en S1 que en S2. La presencia de cadmio disminuye la diversidad, pero aumenta la concentración de los microorganismos presentes (Feng et al.,

2018).

Uno de los factores limitantes a la hora de la obtención de secuencias de alta calidad, es la extracción de ADN. Soliman y colaboradores (2017), evaluaron la influencia de dos kits de aislamiento en seis suelos destinados a la agricultura en Okinawa, Japón. Las asignaciones taxonómicas de OTU bacterianas a nivel de filo estaban dominadas por Proteobacteria (32.2%),

Acidobacteria (18.9%), Actinobacteria (13.7%), Planctomycetes (8.6%), Bacteroidetes (7.3%),

Verrucomicrobia (6.8%) y Chloroflexi (6.0%) en todas las muestras. Los resultados del análisis de las comunidades microbianas se ven influenciados por los tipos de kits que se empleen para la extracción de ADN y del manejo que se les dé a las muestras analizadas (Soliman et al.,

2017). CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 48

Nielsen y colaboradores (2014), analizaron las comunidades microbianas en un ensayo de campo controlado comparando el efecto de los Biochars mejorados con la práctica agrícola de fertilización tradicional en el cultivo de maíz dulce. Por medio de la plataforma Illumina

HiSeq encontraron que los filos observados en todos los tratamientos fueron Proteobacteria,

Firmicutes, Verrumicrobia, Acidobacteria y Actinobacteria. Géneros como Pseudomonas,

Bacillus, Acidobacteria y Nitrospira se encontraban en mayor proporción en el tratamiento con

Biochar. El empleo del Biochar favorece a unos cuantos grupos de microorganismos como

Acidobacteria, Verrucomicrobia, Actinobacteria y Cenarchaeota. El uso de Biochar permite conocer las comunidades microbianas complejas que pueden llevar a cabo funcionalidad del suelo, ciclo de nutrientes, el almacenamiento de carbono y la productividad agrícola (Nielsen et al., 2014).

Por medio del estudio realizado por Hong y colaboradores (2015), se comparó la diversidad y la estructura de tres tipos de suelo, uno con contaminación intensa, otro con una moderada (cultivado con hortalizas) y por último uno sin contaminación (campos con hortalizas). Se encontraron 35 filos, los más comunes entre las nueve muestras fueron

Proteobacteria (más abundante), Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi y

Gemmatimonadetes. En el grupo H (contaminación intensa o alta), donde la contaminación era alta, se observó que las estructuras de comunidades microbianas eran muy similares, indicando que la diversidad era poca, pero la composición era abundante. Con un total de 341 géneros, en las regiones sin contaminación (C) fueron abundantes los géneros Paracoccus,

Cianobacterias, Microcoleus, Cyanobacteria, Leptolyngbya, Thiobacillus y Peredibacter. Para H y M, los géneros más abundantes fueron Sulfuricella, Candidatus Nitrotoga, Modestobacter y

Arthromena. Microorganismos como Artrobacter, Thiobacillus Cyanobacteria y Rhodobacter tiene potencial resistente a metales pesados. Estos se encontraron en los suelos H y M, dando indicios de una posible biorremediación (Hong et al., 2015). CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 49

En los estudios anteriormente nombrados se puede evidenciar la predominancia de los filos Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria y Candidatus Solibacter, sin importar el tipo de suelo que se analice. Con estas evidencias, cabe la probabilidad de que los microorganismos pertenecientes a estos filos sean microbiota nativa del suelo, sin importar las condiciones externas e internas que se vean involucradas en el hábitat.

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 50

Marco Legal

Aunque es un trabajo de Bioprospección no aplican los lineamientos de acceso a recursos biológicos, toda vez que el análisis es descriptivo de las poblaciones, están asociadas a un cultivo domesticado y no se está haciendo secuenciación de genomas completos, sino de las regiones de interés para la descripción planeada.

El presente trabajo de investigación no involucrará trabajo con seres humanos, tampoco la manipulación de muestras humanas de ningún tipo ni pruebas diagnósticas, tratamientos e intervenciones que involucren o pongan en riesgo la salud y la vida de los seres humanos. Por lo tanto, no aplicará para este trabajo las consideraciones éticas establecidas en la Declaración de Helsinki, ni el tratado Belmont.

De acuerdo a la resolución 8430 de 1993 este trabajo se realizará en Laboratorio de

Biología Molecular y Biotecnología de la Universidad de Santander, UDES. Este laboratorio cumple los requerimientos enunciados en el Capítulo I, Artículo 63 respecto a las instalaciones y sistemas de contención. Todo material biológico será desechado, desnaturalizado, previo a su descarte y esterilización con el fin de no liberar ningún material biológico al ambiente.

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 51

Planteamiento y Justificación del Problema

El empleo de plaguicidas de origen químico a largo plazo en los sistemas de producción agrícola, tiene gran repercusión en las comunidades microbianas del suelo, afectando directamente la diversidad de microorganismos nativos de interés biológico expuestos a este tipo de sustancias. En este contexto, diversos extractos de plantas han sido empleados para bioregular los ecosistemas, es el caso del ají (Capsicum), cuyo principio activo la Capsaicina ha sido utilizada para el control de insectos, presentando acción repelente, actúa por la ingestión, causando trastornos digestivos en el insecto, lo cual hace que se deje de alimentar. Por su parte, el tabaco posee una acción fungicida, insecticida, acaricida y repelente, propiedades que se le atribuyen a su materia activa, la nicotina, sustancia tóxica de contacto e ingestión. Este escenario motiva el desarrollo de bioinsecticidas eficientes con capacidad de bioregular el ecosistema, como es el caso del plaguicida de origen biológico creado por Kopytko y colaboradores (2016) (documentos confidenciales), en proceso de patentarse, por lo cual nace la necesidad de estudiar su repercusión en las comunidades microbianas de un suelo destinado al cultivo de piña, haciendo uso de técnicas de secuenciación masiva

(metagenómica).

A su vez, el estudio de los microecosistemas que se generan en los suelos cultivados con piña no han sido ampliamente estudiados, ni las implicaciones que tienen en ellas las prácticas agrícolas. Evidenciado por la falta de información publicada, lo cual es una ventana de oportunidad para generar conocimiento de base que permita entender la diversidad microbiana asociada a este cultivo en los suelos característicos de Lebrija, Santander.

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 52

Pregunta de investigación

¿Cuál es el efecto de plaguicidas sobre la diversidad microbiana de suelos destinados al cultivo de Ananás comosus en el municipio de Lebrija, Santander?

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 53

Hipótesis

Hipótesis de investigación: El uso de un plaguicida de origen biológico no afecta la diversidad de las comunidades microbianas de un suelo destinado al cultivo de Ananás comosus en el municipio de Lebrija, Santander.

Hipótesis nula: El uso de un plaguicida de origen biológico afecta la diversidad de las comunidades microbianas de un suelo destinado al cultivo de Ananás comosus en el municipio de Lebrija, Santander.

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 54

Objetivos Objetivo General

Estudiar la diversidad microbiana del suelo de un cultivo de A. comosus tratado con plaguicidas de origen químico y biológico, utilizando herramientas metagenómicas.

Objetivos Específicos

Determinar la abundancia microbiana presente en suelos tratados con plaguicidas químicos, biológicos y sus respectivos controles.

Establecer la relación existente entre la variación poblacional y las condiciones físicoquímicas del suelo antes y después de ser tratado con plaguicidas.

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 55

Metodología

Este proyecto se realizó en convenio con la Universidad Pontificia Bolivariana sede

Bucaramanga, donde se llevó a cabo el análisis físicoquímico de los suelos evaluados. Se desarrollaron los análisis microbiológicos correspondientes en el Laboratorio de Biología

Molecular y Biotecnología de la Universidad de Santander UDES, sede Bucaramanga. El muestreo se realizó en la Finca Bellavista en Lerbija, Santander, donde se encontraban los cultivos de piña.

Especificaciones del Cultivo de Piña

En el estudio se analizaron 4 lotes de piña, Control, Blanco, Químico y Biológico. Cada lote contenía 40 plántulas de piña, excepto el Blanco y se encontraban separados 3m el uno del otro (Figura 7).

El lote denominado Control, contenía sus plántulas correspondientes y solo era abonado con fertilizantes a base de nitrógeno y fósforo. Por otra parte, el Blanco, no tenía siembra, era solo la tierra arada manualmente. El Biológico y el Químico fueron tratados con bioplaguicida, y plaguicida químico durante el tiempo que duró el estudio, cada uno contenía sus 40 plántulas correspondientes y eran abonados con el mismo fertilizante.

El bioplaguicida está compuesto por extracto de nicotina y de capsaicina, al ser biológico su duración en el cultivo es corta, es por esto que se aplicó cada 15 días. Por el contrario, el plaguicida químico empleado (Lorsban) al tener mayor durabilidad al ser un compuesto organofosforado, se aplicó mensualmente.

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 56

Figura 7.

Lotes de Piña Estudiados

Nota: Ubicación de los lotes tratados. Cada uno se encontraba separado a 3m del otro. El lote denominado como Blanco no tenía plantas de Piña.

Muestreo

Se realizó un muestreo aleatorio de forma sistemática diagonal (en X) con una profundidad de 20 cm cerca de la rizosfera de la planta. En cada muestreo se tomaron 3 submuestras para obtener una muestra compuesta al final. Se obtuvo 14 muestras en total a lo largo del estudio, en la tabla 5, se especifican los detalles de cada muestreo. Las muestras se transportaron a 4ºC al Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología de la UDES, siendo almacenadas a -80ºC para la preservación del ADN.

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 57

Tabla 5.

Muestreos Realizados

Fecha Identificación de la Descripción muestra 09/Feb/2018 Control_1 Primer muestreo 09/Feb/2018 Blanco_1 Primer muestreo 10/Feb/2018 Químico_1A Segundo muestreo luego de la aplicación del plaguicida 10/Feb/2018 Biológico_1A Segundo muestreo luego de la aplicación del bioplaguicida 09/Mar/2018 Blanco_1M Tercer muestreo después de 1 mes 09/Mar/2018 Control_1M Tercer muestreo después de 1 mes 09/Mar/2018 Químico_1M Tercer muestreo después de 1 mes 09/Mar/2018 Biológico_1M Tercer muestreo después de 1 mes 10/Mar/2018 Químico_2A Cuarto muestreo luego de la aplicación del plaguicida 10/Mar/2018 Biológico_2A Cuarto muestreo luego de la aplicación del bioplaguicida 05/Oct/2018 Control_6M Sexto muestreo después de 6 meses 05/Oct/2018 Blanco_6M Sexto muestreo después de 6 meses 05/Oct/2018 Químico_6M Sexto muestreo después de 6 meses 05/Oct/2018 Biológico_6M Sexto muestreo después de 6 meses

Nota: En total se obtuvo 14 muestras de 5 muestreos realizados. Estas se almacenaron a

-80ºC para la conservación del ADN.

Extracción de ADN Genómico

El aislamiento de ADN se llevó a cabo por la estandarización del protocolo de E.Z.N.A

Soil DNA Kit ®, debido al bajo rendimiento durante pruebas realizadas (Apéndice A). Los cambios que se realizaron en el protocolo, involucran el aumento en los tiempos de incubación, centrifugación y agitación; además del aumento en el volumen de los reactivos empleados. El

ADN se suspendió en 240 µl de Buffer de elución y se llevó a -20ºC hasta su secuenciación. La CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 58

calidad del ADN extraído se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0.8% junto a

3µl de Buffer de corrido. Esta extracción se les realizó a las 14 muestras en estudio. A las muestras Biológico y Control del muestreo después de seis meses se les realizó una concentración de ADN por su bajo contenido de ADN (Apéndice B).

Amplificación y Secuenciación del Gen Ribosomal 16S.

La amplificación de los fragmentos de ADN por PCR en puente de cada muestra se realizó dentro del MiSeq (MACROGEN, Seul, Korea). Se emplearon los cebadores universales:

Bakt_341F (CCTACGGGNGGCWGCAG), donde N y W pueden ser A, además coincide perfectamente con 1’081.974 de 1’124.456 secuencias bacterianas de puntuación de calidad

'Buena' que abarca las posiciones de Escherichia coli 300–400, y Bakt_805R

(GACTACHVGGGTATCTAATCC), donde H puede ser G y V puede ser A, también se combina perfectamente con 905.196 de 1’000.727 secuencias bacterianas de puntuación de calidad

'Buena' que abarca posiciones de 750– 850 en la versión 10.25 del Proyecto de Base de Datos

Ribosomal (RDP) (Cole et al., 2009). Posterior a la amplificación se realizó la secuenciación en una plataforma MiSeq Illumina. La longitud de las lecturas fue de 300pb. Esta amplificación y secuenciación fue realizada por MACROGEN, Seoul, Korea.

Análisis Bioinformáticos

El empleo de MG-RAST permitió la identificación de microorganismos hasta género. Se empleó un metadata donde se especificaron el tipo de muestra, el estudio realizado, la localización del lugar de toma de muestra, el tipo de librería y el gen y región secuenciado. Esta herramienta metagenómica cuenta con su propio control de calidad donde se especifica en coeficiente de calidad que se quiere tener (Q30) y la remoción de adaptadores que pueden causar contaminación. Los análisis se llevan a cabo con algoritmos basados en similaridad, lo que permitirá realizar las asignaciones taxonómicas. Esta herramienta permitió el CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 59

emparejamiento de las secuencias y la remoción de adaptadores. Por último, se realizó la predicción de la taxonomía.

Análisis Estadísticos

Con el fin de encontrar la existencia de similitud en la composición microbiana entre muestras, se realizó un análisis de componentes principales y diversidad β. El análisis de componentes principales en este estudio se llevó a cabo en el programa estadístico PAST

Software, donde las variables eran el número de secuencias encontradas por cada género en los diferentes muestreos tomados. Se trabajó con Varianza y Covarianza por tener las mismas unidades (número de secuencias encontradas). Mediante el Software PAST, se obtuvo la diversidad β entre los cuatro lotes de suelo estudiados. Esto permitió establecer la diferencia de las comunidades microbianas entre los lugares de muestreo. Las medidas se basaron en datos de presencia/ausencia de los géneros encontrados en los suelos Control, Blanco, Biológico y

Químico.

Análisis Físico-Químicos (realizados por los estudiantes de la UPB, sede Bucaramanga)

Por medio de la capacidad de permeabilidad e infiltración, la porosidad total y densidad del suelo se logró establecer la textura de las muestras analizadas. La determinación de

Nitrógeno total, Carbono orgánico y Fósforo total permitieron establecer la disponibilidad de nutrientes, por ende, la fertilidad del suelo (Apéndice C).

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 60

Resultados y Análisis de Resultados

Extracción y Cuantificación de ADN Metagenómico

Por medio de la extracción de ADN genómico de las 14 muestras se obtuvo concentraciones superiores a 60 ng/µl. Este valor era requisito para la previa secuenciación por la plataforma Illumina MiSeq. En la tabla 6 se evidencia las concentraciones obtenidas de las

14 muestras analizadas.

Tabla 6.

Concentración de ADN por Muestra

Muestra Concentración de ADN 260/280 (ng/µl) B 60 1.89 C 94 1.90 BI1A 69 1.89 Q1A 65 1.90 B1M 118 1.84 C1M 77. 4 1.89 BI1M 77.6 1.93 Q1M 172 1.88 BI2A 87.4 1.90 Q2A 149.7 1.88 B6M 102 1.93 C6M 207 1.90 BI6M 239 1.87 Q6M 157.8 1.88 B (Primer muestreo Blanco); C (Primer muestreo Control); BI1A (Segundo muestreo Biológico, primera aplicación de bioplaguicida); Q1A (Segundo muestreo Químico, primera aplicación de plaguicida); B1M (Tercer muestreo Blanco, después de un mes); C1M (Tercer muestreo Control, después de un mes); BI1M (Tercer muestreo Biológico, después de un mes); Q1M (Tercer muestreo Químico, después de un mes); BI2A (Cuarto muestreo Biológico, segunda aplicación de bioplaguicida); Q2A (Cuarto muestreo Químico, segunda aplicación de plaguicida); B6M (Quinto muestreo Blanco, después de seis meses); C6M (Quinto muestreo Control, después de seis meses); BI6M (Quinto muestreo Biológico, después de

seis meses); Q6M (Quinto muestreo Químico, después de seis meses).

.

Nota: Los valores en la tabla corresponden a la concentración de ADN extraído de cada muestra y a su relación 260/280. CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 61

Tanto en el control (207 ng/µl) como en el biológico (239 ng/µl) se obtuvo mayores concentraciones de ADN, esto se debe a que se realizó una concentración de ADN con isopropanol por los valores bajos obtenidos de ADN durante 4 extracciones realizadas. La relación 260/280 de estas muestras se encuentra en el rango establecido, permitiendo comprobar la pureza del ADN (Apéndice C).

Análisis Bioinformático de Secuencias

De las 14 muestras analizadas se obtuvo un total de 1’518.101 secuencias (Apéndice

E). En la secuenciación de los muestreos realizados después de seis meses se evidenció el menor número de secuencias obtenidas, esto se podría deber a las complicaciones durante la extracción de ADN metagenómico y a que la presencia de nutrientes esenciales era escasa

(https://www.mg- rast.org/mgmain.html?mgpage=project&project=60329fcb166d67703836333235)

(https://www.mg-rast.org/linkin.cgi?project=mgp89504).

Clasificación por Dominios

Más de 100.000 secuencias fueron predecibles, aproximadamente 800 secuencias eran desconocidas y 2 secuencias fallidas (no pasaron el control de calidad) en cada muestra.

En promedio se obtuvo 108.436 secuencias en cada muestra analizada (Apéndice D).

Cabe resaltar que la cantidad de secuencias obtenidas se redujo después de los seis meses, esto se pudo ver influenciado por las condiciones climáticas y por los cuidados del cultivo, además de la calidad del ADN extraído. En la Figura 8, se evidencia la clasificación por

Dominios, más del 98% de las secuencias obtenidas se identificaron como procariotas-bacteria; el 1% de las secuencias fueron de eucariotas, el programa tiene la capacidad de identificarlas para luego eliminarlas evitando así resultados erróneos. El 1% sobrante es para las secuencias sin identificar. Posiblemente las secuencias que se detectaron como eucariotas es por su homología, presentando así un mismo origen evolutivo; además debido a que los primers CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 62

empleados son únicos para procariotas, la posibilidad de tener esta clasificación debería ser nula.

Figura 8.

Clasificación por Dominio

Clasificación por Dominio 100%

100%

99%

99%

98%

98%

97% Q1A Q1M Q2A Q6M C C1M C6M B B1M B6M BI1A BI1M BI2A BI6M

Bacteria Eucaria Sin clasificar

Q1A (Segundo muestreo Químico, primera aplicación de plaguicida); Q1M (Tercer muestreo Químico, después de un mes); Q2A (Cuarto muestreo Químico, segunda aplicación de plaguicida); Q6M (Quinto muestreo Químico, después de seis meses); C (Primer muestreo Control); C1M (Tercer muestreo Control, después de un mes); C6M (Quinto muestreo Control, después de seis meses); B (Primer muestreo Blanco); B1M (Tercer muestreo Blanco, después de un mes); B6M (Quinto muestreo Blanco, después de seis meses); BI1A (Segundo muestreo Biológico, primera aplicación de bioplaguicida); BI1M (Tercer muestreo Biológico, después de un mes); BI2A (Cuarto muestreo Biológico, segunda aplicación de bioplaguicida); BI6M (Quinto muestreo Biológico, después de seis meses).

Nota: Es evidente que pasados los seis meses disminuyó la cantidad de secuencias por muestra, es posible que la calidad de ADN interviniera en la secuenciación. CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 63

Clasificación por Filo

Figura 9.

Clasificación por Filo

Clasificación por filo 100,00% 90,00% 80,00% 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% Abundancia Abundancia (%) 20,00% 10,00% 0,00% C B Q1A BI1A B1M C1M Q1M BI1M Q2A BI2A C6M B6M BI6M Q6M Muestras

Actinobacteria SCB SCE SCS Acidobacteria Verrucomicrobia Firmicutes Proteobacteria Chloroflexi Gemmatimonadetes Spirochaetes Ascomycota Bacteroidetes Thermotogae Streptophyta Planctomycetes Arthropoda Nematoda otros

C (Primer muestreo Control); B (Primer muestreo Blanco); Q1A (Segundo muestreo Químico, primera aplicación de plaguicida); BI1A (Segundo muestreo Biológico, primera aplicación de bioplaguicida); C1M (Tercer muestreo Control, después de un mes); B1M (Tercer muestreo Blanco, después de un mes); Q1M (Tercer muestreo Químico, después de un mes); BI1M (Tercer muestreo Biológico, después de un mes); Q2A (Cuarto muestreo Químico, segunda aplicación de plaguicida); BI2A (Cuarto muestreo Biológico, segunda aplicación de bioplaguicida); C6M (Quinto muestreo Control, después de seis meses); B6M (Quinto muestreo Blanco, después de seis meses); Q6M (Quinto muestreo Químico, después de seis meses); BI6M (Quinto muestreo Biológico, después de seis meses).

*SCB: Secuencias sin clasificar Bacteria. *SCE: Secuencias sin clasificar Eucaria. *SCS: Secuencias sin clasificar. Nota: Clasificación microbiológica por filo de las muestras tomadas de un cultivo de Ananas comosus en el municipio de Lebrija, Santander. CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 64

El filo Actinobacteria se encuentra presente en todas las muestras que se tomaron, esto se evidencia en la Figura 9 donde la presencia de estos microorganismos supera el 30%. En los diferentes muestreos realizados, se observa un patrón de aumento en las bacterias de este filo después de un mes de realizar la primera aplicación, obteniendo el mayor porcentaje de incremento la muestra del suelo tratado con insecticida químico (49.2%), pero después de seis meses el porcentaje de abundancia de este filo disminuyó (35.48%). Por otra parte, el bioplaguicida al contener extractos de nicotina y capsaicina, puede influir en el porcentaje de abundancia de estos microorganismos. Al pasar un mes posterior a la primera aplicación del bioplaguicida, los microorganismos pertenecientes a este filo aumentaron (38.7%) y pasados los seis meses se mantuvo en aumento (49.41%). Al igual que el filo Actinobacteria, las

Acidobacterias son predominantes en las muestras analizadas, superando el 6% de abundancia. Se evidencia una disminución en el porcentaje de secuencias pertenecientes a este filo en los suelos Biológico (12.1% a 9.18%) y Control (7% a 6.74%); se observa un aumento en su abundancia en los suelos Blanco (11.2% a 13.14%) y Químico (9% a 12.4%).

Otros filos como Verrucomicrobia (~6.8%), presenta microorganismos extremadamente acidófilos, coincidiendo con el pH encontrado en el suelo analizado. Y Firmicutes (~8.15%), que emplean el CO2 y participan en el ciclo del nitrógeno, suministrando nutrientes a la planta.

En la gráfica también se evidencia que, al pasar el tiempo (seis meses), los microorganismos más predominantes pertenecen al filo Actinobacteria. Un aumento significativo de este tipo de microbiota se dio en el tratamiento Control, donde supera el 50% de abundancia en la muestra; con respecto al suelo con tratamiento biológico se evidencia un aumento en este filo, al igual que en el suelo tratado con químico y el suelo denominado

Blanco. En comparación con los resultados de los muestreos anteriores, se conserva un patrón de los posibles microorganismos pertenecientes a los filos graficados. Con respecto a las CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 65

Acidobacterias, se observa un patrón aproximadamente del 9% de abundancia; este se mantiene con el paso del tiempo y de la aplicación de los distintos plaguicidas.

Clasificación por Género

El empleo de herramientas metagenómicas permite al investigador conocer en su totalidad la composición de las comunidades microbianas en cualquier tipo de muestra. Cabe resaltar que pueden existir dificultades durante la extracción de ADN de la muestra, la previa secuenciación y con el uso de bases de datos, causando una interpretación errónea de los resultados. En la Figura 10, se observa que hay un porcentaje de secuencias bacterianas sin clasificar, lo cual se debe a diversos factores, como los ya nombrados, o porque las secuencias encontradas no están presentes en ninguna base de datos.

Los porcentajes de abundancia del género Isosphaera, son mayores en los tratamientos con insecticida Biológico, encontrándose en promedio 5.6% de secuencias. La composición del bioplaguicida juega un papel muy importante como fuente de carbono, ya que se encuentra hecho con sustratos orgánicos. Microorganismos como Streptomyces, Mycobacterium,

Corynebacterium y Actinomadura pertenecen al filo Actinobacteria, el cual predomina en las muestras analizadas. Como se observa en la gráfica, el género Streptomyces se presenta en todos los tratamientos, en especial los tratados con insecticida químico superando el 2% de presencia. En el suelo tratado con bioplaguicida se evidencia un aumento de este género en el tiempo, llegando a 17.8% de abundancia. Después de seis meses, el género Streptomyces se mantuvo predominante en los diferentes muestreos analizados, así como Candidatus

Koribacter, Candidatus Solibacter, Mycobacterium y Bacillus.

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 66

Figura 10.

Clasificación por Género

Clasificación por Género 100,00% 90,00% 80,00% 70,00% 60,00% 50,00% 40,00%

Abundancia(%) 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% C B Q1A BI1A B1M C1M Q1M BI1M Q2A BI2A C6M B6M BI6M Q6M Muestras

SCB Isosphaera Streptomyces Candidatus Koribacter Conexibacter Mycobacterium Candidatus Solibacter Burkholderia Actinomadura Dehalogenimonas Ktedonobacter Bacillus Chthoniobacter Paenibacillus Stackebrandtia Actinobacterium Lysinibacilus Bradyrhizobium Acidobacterium Brevibacillus Otros

C (Primer muestreo Control); B (Primer muestreo Blanco); Q1A (Segundo muestreo Químico, primera aplicación de plaguicida); BI1A (Segundo muestreo Biológico, primera aplicación de bioplaguicida); C1M (Tercer muestreo Control, después de un mes); B1M (Tercer muestreo Blanco, después de un mes); Q1M (Tercer muestreo Químico, después de un mes); BI1M (Tercer muestreo Biológico, después de un mes); Q2A (Cuarto muestreo Químico, segunda aplicación de plaguicida); BI2A (Cuarto muestreo Biológico, segunda aplicación de bioplaguicida); C6M (Quinto muestreo Control, después de seis meses); B6M (Quinto muestreo Blanco, después de seis meses); Q6M (Quinto muestreo Químico, después de seis meses); BI6M

(Quinto muestreo Biológico, después de seis meses). *SCB: Secuencias sin clasificar Bacteria.

Nota: Clasificación microbiológica por Género de las muestras tomadas de un cultivo de

Ananas comosus, en Lebrija, Santander. CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 67

Diversidad α

Figura 11.

Diversidad α

Diversidad α

140

120 α 100 80 60 40 Diversidad 20 0 Blanco Control Biológico Químico Muestras

1Mu 1A 1M 2A 6M

1Mu (Primer muestreo); 1A (Segundo muestreo: Primera aplicación de los insecticidas químico y biológico); 1M (Tercer muestreo: Un mes después de la aplicación); 2A (Cuarto muestreo: Después de la segunda aplicación); 6M (Seis meses después del último muestreo).

Nota: Diversidad α de cada muestra en los diferentes tiempos del muestreo.

En la Figura 11, se observa la diversidad α de cada muestra en los diferentes tiempos de muestreo. En el Blanco, se evidencia un descenso de la diversidad alfa, iniciando con un total de 74 especies y terminando con 64, lo cual se debe a las condiciones nutricionales del suelo. Este tratamiento no posee planta cultivada y no se le realiza el procedimiento de fertilización, causando una drástica disminución de la cantidad de materia orgánica presente en el medio, dejando sin sustratos y nutrientes a los microorganismos. Por el contrario, el tratamiento Control, al estar cultivado y fertilizado tenía grandes fuentes de Nitrógeno y

Fósforo, es por esto que la diversidad α aumenta con el paso del tiempo, llegando a 92 especies. En el suelo tratado con plaguicida biológico se observa un aumento en la diversidad entre el segundo y tercer muestreo, obteniéndose 83 especies; hay que tener en cuenta que este plaguicida es de extractos naturales, por ende, un buen sustrato para el desarrollo de las CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 68

bacterias. En el tratamiento con químico la diversidad tuvo un aumento significativo en el tercer muestreo (115 especies), pero después de la segunda aplicación del plaguicida se observó una disminución (79 especies). Estos cambios en la diversidad α de cada tratamiento se pueden deber a la capacidad de adaptación que poseen los microorganismos y a la aplicación de plaguicidas, ya sea de origen químico o biológico.

Abundancia Relativa de Géneros Dominantes

En la Figura 12 se observa la abundancia relativa de los géneros dominantes (>1% de abundancia) de cada uno de los tipos de suelos analizados. Se evidencia que la mayoría de géneros dominantes pertenecen a los filos más representativos y comunes de los suelos en general, estos incluyen a Actinobacteria, Acidobacteria, Cloroflexi, Firmicutes, Proteobacteria,

Verrumicrobia y Planctomicetes. Se encontró una mayor abundancia relativa de los 12 géneros dominantes en los muestreos realizados en los suelos Control y Biológico. Debido a su predominancia en los suelos de cultivo y con alto contenido de materia orgánica, el género

Streptomyces fue el más abundante en los cuatro suelos (7%). En el suelo con plaguicida químico, se encuentra el mayor porcentaje de presencia de Streptomyces (10.55%). Cabe resaltar que esta bacteria tiene la capacidad de producir diversos antibióticos, lo cual le asegura la permanencia en el hábitat al acabar con los microorganismos que compiten con ella por nutrientes y espacio. Al realizar la comparación del suelo tratado con plaguicida químico con el suelo control, se encontró que los géneros Conexibacter, Mycobacterium, Actinomadura,

Candidatus Koribacter, Dehalogenimonas, Ktedonobacter, Isosphaera y Burkholderia disminuyeron significativamente con la aplicación del plaguicida. Por otra parte, el aumento de los géneros Streptomyces, Candidatus Solibacter, Bacillus y Chthoniobacter en el suelo con plaguicida químico, fue significativo. El género Streptomyces obtuvo un aumento del 5.39% en su abundancia relativa, lo cual indica que las condiciones y naturaleza del suelo, además de su metabolismo, favorecieron su desarrollo y permanencia. Comparando el suelo tratado con CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 69

bioplaguicida con el suelo Control, no se observaron diferencias significativas entre la abundancia de géneros dominantes, a excepción del género Burkholderia, que no tuvo presencia en el suelo Biológico. En cuanto a los suelos Biológico y Químico, de importancia en el estudio, se evidencia que los géneros Streptomyces y Chthoniobacter predominan en el suelo tratado con plaguicida químico. Los demás géneros no tuvieron una diferencia significativa entre los diferentes suelos (Apéndice G).

Figura 12.

Abundancia relativa de Géneros Dominantes

Abundancia relativa 12 10 8

6 relativa (%) relativa Abundancia 4 2 0

Géneros dominantes

Control Blanco Químico Biológico

Nota: Abundancia Relativa de géneros dominantes en los diferentes suelos analizados. Se definió como géneros dominantes aquellos cuya abundancia es >1%.

Géneros Únicos y Comunes en los Tratamientos

Mediante la realización de un diagrama de Venn en la herramienta computacional

Venny (Oliveros, 2015), se logró evidenciar las diferencias de géneros entre las comunidades de cada suelo. Con un total de 482 géneros, en la imagen 13, se observa que el suelo con mayor variedad bacteriana es el Biológico (40 géneros), seguido del Químico (37 géneros), el CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 70

Blanco (28 géneros) y Control (15 géneros). Las superposiciones entre los géneros encontrados permiten establecer las relaciones entre los microorganismos. El 49% de estos géneros son comunes entre los cuatro tratamientos. La mayor superposición se encontró entre los suelos Biológico y Químico con un total de 23 géneros. Al encontrarse el mayor número de géneros únicos en los suelos con tratamiento químico y biológico, se puede deducir que la aplicación del plaguicida y el bioplaguicida permiten que la diversidad sea mayor o aumente en los suelos.

Figura 13.

Géneros Únicos y Comunes de los Tratamientos

Nota: Diagrama de Venn construido a partir de los géneros bacterianos encontrados en cada tratamiento (C, B, BI, Q). Las superposiciones indican los géneros en común. CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 71

Géneros predominantes

Tabla 7.

Géneros Predominantes en los Tratamientos

Filo Clase Orden Familia Género

Actinobacteria Thermoleofilia Solirubrobacterales Conexibacteraceae Conexibacter

Actinobacteria Streptomycetales Streptomycetaceae Streptomyces

Glycomycetales Glycomycetaceae Stackebrandtia

Actinomicetales Mycobacteriaceae Mycobacerium

Termomonosporaceae Actinomadura

Acidobacteria Acidobacteria Solibacterales Solibacteraceae Candidatus Solibacter

Acidobacteriales Acidobacteriaceae Acidobacterium

Candidatus Koribacter

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 72

Tabla 8 (Continuación) Filo Clase Orden Familia Género

Cloroflexi Dehalococcoides Dehalococcoidales Indefinido Dehalogenimonas

Ktedonobacteria Ktedonobacterales Ktedonobacteraceae Ktedonobacter

Firmicutes Bacilli Bacillales Bacillaceae Bacillus

Planococcaceae Lysinibacillus

Planctomicetos Planctomicetia Plantomicetos Isosphaeraceae Isosphaera

Proteobacteria ß-Proteobacteria Burkholderiales Burkholderiaceae Burkholderia

Verrucomicrobia Spartobacteria Chthoniobacterales Chthoniobacteraceae Chthoniobacter

Nota: Esta tabla es un resumen de los microorganismos predominantes en cada muestra analizada. De acuerdo con los resultados obtenidos, en las comunidades microbianas existe un dominio de las bacterias pertenecientes al filo Actinobacteria, encontrándose en todos los muestreos y en una mayor proporción.

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 73

En las muestras tomadas seis meses después del último muestreo, se evidencia la presencia de microorganismos del género Ktedonobacter, Lysinibacillus y Burkholderia; estos no se encontraron en los primeros muestreos. Géneros de microorganismos como

Brevibacillus, Paenibacillus y Bradyrhizobium no se encontraron en las primeras 10 muestras analizadas, pero con el paso de los seis meses, su presencia no fue tan significativa.

En comparación con las primeras muestras analizadas, no existe diferencia significativa entre la diversidad de cada microorganismo. Es posible que la estructura microbiana de cada tratamiento sea muy similar, pero con respecto a la cantidad de cada uno de estos microorganismos va a variar.

Análisis Estadísticos

Análisis de Componentes Principales (ACP)

Cuando la mayor parte de la varianza se encuentra en el primer o segundo componente el análisis de componentes principales ha sido un éxito. En nuestro caso se evidencia que el mayor porcentaje de varianza se encuentra en el componente 1 (59.49%), siendo este el más fuerte de los componentes evaluados. Se evidencia que el número de secuencias encontradas en total para este componente es mayor que los demás, siendo el Género Isosphaera el más predominante en las muestras analizadas. En la imagen 14, se evidencia un Scree Plot o un diagrama de pantalla que permite evidenciar el porcentaje de varianza de cada uno de los componentes obtenidos, esta gráfica indica el número de componentes significativos, empleando intervalos de confianza de 95%. Los valores de los componentes que se encuentren por debajo de la línea roja, representan componentes no significativos. Lo cual indica que el componente 1 explica la variabilidad de todos los datos.

El gráfico de componentes principales o Bioplot, permitió evidenciar que el componente principal 1 (eje X), se correlaciona con los demás componentes, explicando el 59.49% de la variación. Como el producto de la cantidad de secuencias obtenidas en cada muestreo y el CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 74

vector del microrganismo correspondiente, cualquier combinación de secuencias/microorganismo, tiende a ser regulado. Como es el caso de Bacillus y

Streptomyces, que se encuentran en los valores positivos del eje X. En el Bioplot realizado en el software PAST, se evidencia que las muestras BI2A y Q1M se caracterizan por la presencia de Bacillus; mientras que B, Q1A y BI6M se identifican con el género Streptomyces. Los valores negativos de X son tomados por los vectores que representan a los géneros

Actinomadura, Candidatus Koribacter, Candidatus Solibacter e Isosphaera. En las muestras

Q1A, C6M y Q6M la presencia de microorganismos del género Actinomadura es predominante.

Los géneros Isosphaera, Candidatus Koribacter y Candidatus Solibacter son característicos de las muestras B1M, B6M, BI1A, BI1M, C y C1M. En el segundo eje (Y), se explica un 21.22% adicional de variación total donde es importante el ángulo entre cada uno de los vectores, entre más pequeños sean estos ángulos, la correlación entre cada componente va a ser mayor; pero si las variables se encuentran a 90º o más se encuentran pobremente correlacionadas. Esto nos indica que la mayor correlación se encuentra en el tercer cuadrante del Bioplot y está determinada por los vectores correspondientes a Isosphaera, Candidatus Koribacter y

Candidatus Solibacter. En esta gráfica no se evidencia agrupamiento por cada tipo de suelo, lo cual explica la variación de las comunidades microbianas en cada muestreo. Debido a esto se tienen en cuenta las propiedades del suelo y las condiciones que se le dieron al comienzo y durante el estudio. El muestreo BI2A es el que se encuentra más lejos de los demás, por ende, es el más diferente. El género con mayor predominancia en BI2A es Bacillus, microorganismo que se caracteriza por su alta fijación de Nitrógeno y solubilización de fósforo. Estos dos componentes orgánicos se encuentran en mayor porcentaje en este suelo, además, el empleo del bioplaguicida hecho con nicotina y capsaicina aportan una cantidad de Nitrógeno al suelo.

Es por esto que el predominio de estas bacterias se encuentra estrechamente relacionado con la naturaleza del lugar de muestreo. CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 75

Figura 14.

Varianza de los Componentes

Varianza(%)

Componente

Nota: Diagrama de pantalla o Scree Plot. Se representa el porcentaje de varianza de cada componente.

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 76

Figura 15.

Análisis de Componentes Principales

Componente 2

Componente 1

C (Primer muestreo Control); B (Primer muestreo Blanco); Q1A (Segundo muestreo Químico, primera aplicación de plaguicida); BI1A (Segundo muestreo Biológico, primera aplicación de bioplaguicida); C1M (Tercer muestreo Control, después de un mes); B1M (Tercer muestreo Blanco, después de un mes); Q1M (Tercer muestreo Químico, después de un mes); BI1M (Tercer muestreo Biológico, después de un mes); Q2A (Cuarto muestreo Químico, segunda aplicación de plaguicida); BI2A (Cuarto muestreo Biológico, segunda aplicación de bioplaguicida); C6M (Quinto muestreo Control, después de seis meses); B6M (Quinto muestreo Blanco, después

de seis meses); Q6M (Quinto muestreo Químico, después de seis meses); BI6M (Quinto muestreo Biológico, después de seis meses).

Nota: Análisis multivariable basado en información de género. Análisis de componentes principales (PCA). CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 77

Diversidad β

Los datos obtenidos hacen referencia a tres medidas diferentes de diversidad β pertenecientes al grupo de medidas de continuidad con variación en una escala negativa. Los valores mínimos y máximos para βW son 1 y 2; para β-1 0 y 1; y para βC son 0 y 50. Teniendo en cuenta estos valores y los obtenidos, se determinó que la diversidad entre hábitats es baja, indicando poca abundancia de especies y una alta similitud entre los suelos estudiados. La similitud en la composición de las comunidades microbianas entre sitios de estudio va a variar dependiendo de la distancia que exista entre estos; a una mayor distancia esta similitud va a disminuir. Al realizar este estudio, los lotes analizados solo se encontraban a 3 m de distancia, por ende, su similitud es alta.

Tabla 9.

Diversidad β: Presencia / Ausencia

Medida Sigla Valor Diversidad β

Whittaker βW 1.2

Harrison β-1 0.28

Cody βC 5

Nota: Valores de diversidad β arrojados por el Software PAST. Se basan en la presencia/ausencia de especies de los cuatro tipos de suelo estudiados (Blanco, Control,

Químico y Biológico).

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 78

Discusión

Análisis Fisicoquímicos

Propiedades Físicas del Suelo

Por medio del tamaño y la distribución de las partículas del suelo se pueden identificar sus propiedades físicas tales como textura, densidad y porosidad. Dependiendo de estas propiedades se determina si el suelo es apto o no para ser empleado en la agricultura. La textura es de gran importancia en este tipo de estudios, debido a que de esta depende la disponibilidad de nutrientes, la productividad, el movimiento de agua, fertilidad y el contenido de materia orgánica (Gonzales, 2014). Por medio del método de Bouyucos y el empleo del triángulo textural se estableció que la textura de los cuatros lotes de suelo eran Franco Areno

Arcilloso. Otra propiedad estudiada fue la densidad aparente, la cual se relaciona con la textura, la humedad y el contenido de materia orgánica del suelo (Thompson, 2002). La densidad aparente para suelos agrícolas varía entre 1.0 – 1.8 g/cc, su valor va a depender de la cantidad de Arena (1.55 – 1.8 g/cc), Arcilla (1.2 – 1.3 g/cc), Franco (1.35 – 1.5 g/cc), Franco

Arenoso (1.4 – 1.6 g/cc) y Compuestos Orgánicos (<1.0 g/cc) (FAO, 2013). En los cuatro lotes

Control (1.35 g/cc), Blanco (1.43 g/cc), Biológico (1.52 g/cc) y Químico (1.38 g/cc), predominan el Franco Arenoso, además de ser suelos disgregados con contenido de materia orgánica.

Cabe resaltar que, en estos suelos se evidencian un alto porcentaje de arena. Los suelos con densidades bajas no son apropiados para la agricultura, debido a que su porosidad es menor, por ende, va a existir falta de aireación y poco drenaje (FAO, 2014).

Propiedades Químicas del Suelo

Estas propiedades permiten entender la dinámica de los nutrientes y la fertilidad del suelo. El pH, Carbono Orgánico, Fósforo total y Nitrógeno total, se evaluaron con el fin de determinar la viabilidad del suelo para la producción de Piña. El pH/H2O de los cuatros lotes varió entre 3.78 – 4.63, y para Ph/KCl fue de 3.39 – 4.03. Moreno y colaboradores (2017), CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 79

realizan una clasificación del suelo según el pH en Agua y en KCl, según esta escala, el pH de nuestros lotes en agua era extremadamente ácido al igual que en KCl (Moreno et al., 2017). Se reporta que el pH en el suelo agrícola puede ir de 3.78 a 10.46, pero para el cultivo de Ananas comosus el pH óptimo oscila entre 4.5 – 5.5 (Jaramillo, 2002). Esta medida se evalúa en agua y en KCl con el fin de determinar el tipo de intercambiador que es el suelo, cuando el suelo tiene cargas negativas (∆ pH <0) es considerado como catiónico y cargas positivas (⍙pH >0), iónico

(Moreno et al., 2017). Se determinó que el suelo en estudio es un intercambiador de tipo catiónico, lo cual indica un buen aporte de cationes esenciales como Ca+, Na+, Mg2+, K+

(Apéndice C). Las propiedades físicas y químicas se relacionan con el contenido de materia orgánica (MO) del suelo. La MO es un factor clave para la fertilidad del suelo y la capacidad del desarrollo de cultivos. Su formación se da por la acumulación de la descomposición de animales y vegetales, que brindan diferentes nutrientes al suelo (Martínez, 2013). El porcentaje de materia orgánica en el suelo denominado Blanco es de 1.7, en los suelos Control, Biológico y Químico esta medida oscila entre 1.9 – 3.7%, siendo el más alto en los suelos tratados con plaguicida (3.7%) y bioplaguicida (2.7%), lo cual puede indicar que tanto el plaguicida como el bioplaguicida, aportan minerales al suelo. Castro (1998) clasificó el porcentaje de materia orgánica dependiendo del tipo de clima, el cultivo en estudio se encontraba en un clima cálido, si su % de MO es <2, se denomina Mineral Bajo, si oscila entre 2-3% Mineral medio y si es

>3% Mineral alto. En los suelos estudiados que se encontraban con siembra (Control, Biológico y Químico) la materia orgánica se encuentra en un nivel medio a excepción del suelo con tratamiento Químico, el cual contenía Mineral alto. La sustentabilidad del suelo y las propiedades del mismo se relacionan con el Carbono Orgánico (CO). Su presencia va a depender de los residuos orgánicos animales, vegetales y de microorganismos. Esta propiedad influye directamente en la calidad, sustentabilidad y capacidad productiva del suelo (Martínez et al., 2008). La FAO (2018) estimó que el carbono orgánico se almacena en mayor concentración CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 80

en los primeros 30 cm del suelo y que a menor temperatura existe una mayor concentración de

CO, una baja actividad biológica y una descomposición lenta de MO, es por esto que las muestras se toman a 20 o 30 cm de profundidad cerca de la raíz de la planta. Los valores de carbono orgánico en los suelos analizados van de 0.6 a 1.16%. Estos niveles de CO son relativamente bajos, lo cual concuerda con la cantidad de materia orgánica, cuando el suelo tiene mayor contenido de MO, los niveles de CO van a ser muy altos (Martínez et al., 2008).

Las concentraciones de fósforo en los lotes estudiados oscilan entre 104 – 142 mg/Kg, para la

FAO (2013), si el nivel de fosforo se encuentra >30 ppm, se clasifica como un nivel alto de fosforo y con una deficiencia de 0 P2O5/Ha. Por lo general estas concentraciones van a depender de la cantidad de materia orgánica que se encuentre en el suelo, debido a que los niveles de MO son muy bajos, la cantidad de fosforo debería encontrarse en pocas proporciones. Su elevada presencia se puede deber a la cantidad de fertilizante y de plaguicidas que se le adiciona al cultivo, además, al tener un alto contenido de este elemento se garantiza un óptimo desarrollo y crecimiento de la planta (Biavati y Estrada, 2016). El mayor contenido de P2O5 se encuentra en el suelo con plaguicida de origen químico (Lorsban), lo cual es consecuente debido a la composición química del mismo. Por último, la presencia de nitrógeno en el cultivo permite su adecuado desarrollo, siendo esencial en la composición de la clorofila, ácidos nucleicos y proteínas (Barranco, 2011). Los valores de NT, van desde 504 a

532 mg/Kg, lo que corresponde a 0.050% y 0.053% de Nitrógeno Total (Anexo). En la escala de clasificación de Ríos (2005), los suelos que se encuentran en un rango de (0.032% - 0.063%

NT), se denominan como suelos pobres para este parámetro.

Las condiciones físicoquímicas del suelo no son completamente óptimas para el desarrollo de la planta, de hecho, algunos de estos niveles se encuentran muy bajos. Esto puede estar conectado con la poca diversidad microbiana encontrada mediante los análisis metagenómicos realizados. Con respecto a la incidencia del plaguicida (Lorsban) y del CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 81

bioplaguicida (capsaicina y nicotina) en estas propiedades, se evidencia que los niveles más altos de MO, CO, PT y NT se encontraban en los suelos a los que se les aplicaban estos insecticidas. Gutiérrez (2010) afirma que el uso de productos biológicos permite recuperar las propiedades de los suelos como el carbono, nitrógeno y fosforo, evitando el daño al ecosistema. Los productos químicos realizan esta misma acción, pero al presentar retención constante implica una acumulación que puede llegar a ser tóxica para la planta y para los microorganismos presentes en la rizosfera.

Extracción de ADN

Mediante el empleo de kits comerciales para la extracción de ADN, se asegura el aceleramiento y la estandarización en el procesamiento de las muestras dando como resultado un aumento en el rendimiento y en la confiabilidad del resultado (Mumy y Findlay, 2004).

Durante el proceso de extracción de ADN por medio del kit E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (OMEGA) se presentaron inconvenientes con la obtención de cantidad suficiente de ácido desoxirribonucleico, lo cual llevó a la estandarización del protocolo establecido por OMEGA.

Los suelos están compuestos por una fase sólida que contiene componentes orgánicos y minerales inorgánicos como las sustancias húmicas, y una fase acuosa con iones y moléculas orgánicas e inorgánicas. Estos componentes tienen una alta capacidad de retener moléculas de ADN en el suelo, afectando así la eficiencia de su extracción (Jia et al., 2006). Cai y colaboradores (2006) sugieren que el ADN tiene una unión más fuerte de adsorción con los componentes inorgánicos que orgánicos del suelo, pero los compuestos orgánicos son problemáticos debido a que generalmente son extraídos en conjunto con el ADN inhibiendo sus aplicaciones posteriores, como la amplificación por PCR y la secuenciación. Así como la presencia de estos compuestos, las condiciones ambientales del sitio de muestreo y las de almacenamiento de la muestra después de recolectada, influyen en la calidad y en la secuenciación de los fragmentos de ADN (Jia et al., 2006). Otro factor influyente en el proceso CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 82

de extracción es la adsorción de ADN a través de los cationes. La presencia de sales permite la unión de las moléculas de ácido desoxirribonucleico con la superficie de arcilla reduciendo el rendimiento del protocolo (Shen et al., 2011). En la composición del suelo se evidencia que contiene más del 20% de arcilla, además, se considera un suelo de intercambio catiónico, permitiendo una unión de minerales al ADN disponible o libre. Las concentraciones de ADN obtenidas en las 14 muestras estudiadas van de 60 – 239 ng/µl. Esto se logró por medio de extracciones directas, donde las células se lisan en presencia de partículas del suelo

(beadbeating) liberando el ADN intracelular y homogenizando los coloides del suelo (Gabor et al., 2003). Durante este paso se emplean perlas de cerámica, vidrio o metal; la cantidad de estas, así como la del buffer de lisis, la velocidad y temperatura de agitación, tendrán un gran efecto sobre la eficiencia de la extracción (Bûrgmann et al., 2001). En los muestreos después de 6 meses, se evidencia una alta concentración de ADN, siendo el suelo control y el biológico las más elevadas debido a su concentración con isopropanol debido a que no se obtenían los nanogramos suficientes para su previa secuenciación. Al igual que durante la obtención de

ADN, los ácidos húmicos intervienen en la amplificación por PCR al suprimir en la actividad de la ADN polimerasa (Alaeddini, 2012). Para prevenir esto se emplean floculantes como el SDS, surfactante catiónico bromuro de cetil trimetilamonio (CTAB) y polivinilpolipirrolidona (PVPP), que se introducen en el tampón de lisis durante el proceso de extracción de ADN (Thakuria et al., 2008). En el protocolo de E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (OMEGA) se encuentra una guía para resolver problemas. El bajo rendimiento de ADN o el no rendimiento se puede deber a tres factores: el primero es la mala homogenización durante el proceso de lisis, para esto el protocolo recomienda aumentar la cantidad de perlas de vidrio y el tiempo de agitación en el vortex; el segundo factor es el lavado de ADN, donde se debe asegurar que el Buffer de lavado sea diluido con etanol al 100%; el último tiene que ver con la capacidad de unión que posee la matriz de la columna, para esto se recomienda agregar 100µl de NaOH 3M a la columna, CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 83

centrifugar y descartar (OMEGA, 2016). Al seguir estos pasos adicionales no se encontraron diferencias en la cantidad de ADN obtenido, es por esto que se estandarizó el protocolo establecido por OMEGA, logrando así la concentración de ADN adecuada.

Análisis Bioinformático de Secuencias

Mediante la secuenciación por la plataforma Illumina MiSeq y el kit de librería Herculase

II fusión DNA plymerase Nextera XT Index Kit V3, se lograron 14 librerías con un total de

2’508.548 lecturas y 1’518.101 de secuencias, en promedio 108.400 por muestra. Las secuencias obtenidas contenían aproximadamente 301 ± 11 pares de bases. Más del 80% de las secuencias obtenidas tenían un puntaje de calidad de 30 (Q30), lo cual indica que durante la llamada de base en la secuenciación solo una base entre mil es errónea (Bomar et al., 2011).

La calidad de los datos obtenidos es alta, indicando que el rendimiento del proceso de secuenciación fue optimo al lograr que más del 80% de las secuencias de cada librería se encuentre en Q30, ya que lo normal es que >70% de secuencias tengan este puntaje por el kit empleado (Ravi et al., 2018). La calidad de los datos va a depender de la preparación de las bibliotecas, su cuantificación y denaturacion y dilución de las mismas, así como los parámetros de concentración de los reactivos empleados y la densidad de grupos clonales. Un puntaje bajo de calidad se puede deber a que la intensidad de llamada de base se ve afectada por la concentración de datos (Illumina, 2016). Kastanis y colaboradores (2019) estudiaron diferentes métricas indicadoras de calidad como la Densidad de Clusters (CD), %> Q30, Número total de lecturas, Número total de lecturas que pasan el filtro (Lecturas PF), rendimiento total y rendimiento Q30; con el fin de desarrollar un algoritmo predictivo que permite verificar que la cantidad/calidad de secuencias generadas se encuentran dentro de las expectativas del fabricante. Establecieron que el puntaje de calidad (Q30) es importante en la predicción de una ejecución correcta. Las secuencias se cargaron en el programa MG-RAST, donde se empleó este mismo puntaje de calidad para el análisis de las secuencias y la remoción de secuencias CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 84

quiméricas. Debido al control de calidad realizado por este programa bioinformático, la cantidad de secuencias disminuyó. Ashelford (2005) indicó que el 5% de las secuencias de una librería pueden se anómalas o sospechosas, con quimeras, siendo un problema para la calidad del análisis de comunidades microbianas. Otros estudios han demostrado que las secuencias quiméricas en librerías individuales pueden aparecer hasta en un 45% (Huber et al., 2004;

Quince et al., 2009). Su formación se puede deber a los ciclos de PCR, abundancia relativa y su identidad de secuencia por pares (Lahr y Katz, 2009).

Clasificación por Dominio

En las muestras analizadas se encontró que más del 98% de secuencias obtenidas pertenecían al dominio bacteria, lo cual concuerda con lo esperado, debido a que los primers empleados durante la PCR son exclusivos para bacterias. Binu y colaboradores (2016) emplearon los primers Bakt_341F (5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’) y Bakt_805R (5’-

GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’) con el fin de estudiar la diversidad microbiana de un bosque tropical bajo condiciones climáticas diversas, obteniendo más de 150.840 secuencias de buena calidad (Binu et al., 2016). El uso de estos primers permitió a Herlemann y colaboradores (2011) evaluar la composición de la comunidad microbiana (bacterias) por medio de la plataforma Illumina describiendo patrones de riqueza, diversidad β y composición taxonómica (Herlemann et al., 2011). En el proyecto de base de datos ribosomal (RDP) se confirmó que el primer Bakt_341F coincide con 1’081.974 de 1’124.456 secuencias bacterianas con una calidad buena, y Bakt_805R coincide con 905.196 de 1’000.727 secuencias bacterianas de puntaje de calidad buena, lo cual indica la precisión de los primers al momento de la amplificación de secuencias (Cole et al., 2009). Aunque los primers empleados son específicos para secuencias bacterianas, el 1% de estas pertenecen al domino Eucaria. Esto se puede deber a la presencia de secuencias homologas, las cuales se relacionan por tener un ancestro evolutivo en común; siendo ortólogos, los cuales provienen de un gen ancestral CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 85

común por especiación, y parálogos, cuyo genoma se encuentra relacionado por duplicación

(Hung y Weng, 2016). Al ser homólogas, comparten más similitud de lo que se podría esperar.

En general los programas de anotación de dominios permiten la eliminación de dichas secuencias, que estadísticamente no son significativas (Pearson, 2013). El porcentaje de secuencias sin clasificar se encuentra por debajo del 0,0001%.

Clasificación por filo

Mediante el análisis de secuencias por el programa MG-RAST se obtuvo que el filo más predominante en todos los muestreos fue Actinobacteria, el cual mostró más del 30% de presencia en todos los tratamientos. Se considera de interés ecológico debido a que se encuentran presentes en elevadas concentraciones en los suelos, además de ser el más diverso dentro del dominio Bacteria, y a que, gracias a su capacidad de metabolizar materia orgánica compleja, elimina compuestos xenobióticos como pesticidas y metales pesados

(Kieser et al., 2000; Polti et al., 2014). Por la alta producción de enzimas extracelulares involucradas en la degradación de polímeros complejos y metabolitos secundarios (casi el 45% de metabolitos microactivos con función biológica), se considera a estos microorganismos como herramientas de gran importancia en la industria farmacéutica y biotecnológica como la biorremediación (Manivasagan et al., 2013). La presencia de estos microorganismos en los tratamientos Biológico y Control aumentó con el paso del tiempo, mientras que en el suelo con plaguicida químico se evidenció una leve disminución, posiblemente por los componentes del plaguicida empleado. Nadal (2016) reportó una disminución abundancia en el filo Actinobacteria al aplicar enmiendas o fertilizantes orgánicas. Con esto se puede deducir que este grupo de microorganismos se asocian o tienen una mayor abundancia en ambientes pobres en nutrientes (Nadal, 2016). Esto coincide con los resultados obtenidos, debido al bajo contenido de materia orgánica en los suelos analizados. Gremion y colaboradores (2003) encontraron que las actinobacterias predominaban en muestras tanto de suelo contaminado a granel y suelo sin CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 86

contaminar ni cultivar (encontrándose en un 45-56%), indicando que estas bacterias podían ser metabólicamente activas en presencia de metales pesados y residuos de pesticidas (Gremion et al., 2003).

Por su carácter oligotrófico, los microorganismos pertenecientes al filo Acidobacteria, tienden a asociarse con suelos pobres de nutrientes al igual que los actinos (Gondim-Porto,

2012). Además, su presencia se relaciona con las variaciones edáficas, como el tipo de muestreo, la humedad del suelo y el pH (Naether et al., 2012). Estudios recientes han demostrado que el bajo pH en suelos naturales o tratados con diferentes fertilizantes y plaguicidas, se evidencia una abundancia mayor de este filo (Lauber et al., 2008; Jones et al.,

2009; Chaudhry et al., 2011). De acuerdo a las condiciones del suelo estudiado, como la poca disponibilidad de materia orgánica y el bajo pH, los resultados concuerdan con la literatura citada. Araujo y colaboradores (2012) caracterizaron las comunidades microbianas del cerrado brasilero, encontrando gran dominancia del filo Acidobacteria. En este estudio se pudo evidenciar que los microorganismos pertenecientes a este filo son capaces de tolerar condiciones extremas, como el cambio de humedad y las disminuciones de pH (Araujo et al.,

2012). En el análisis de secuencias del muestreo después de la primera aplicación del plaguicida y el bioplagucida, el porcentaje de abundancia aumento en los dos suelos (Químico y Biológico), observándose una mayor dominancia en el suelo Biológico. El muestreo después de seis meses reveló que en el suelo tratado con bioplaguicida estos microorganismos disminuyeron notablemente, mientras que en el suelo con plaguicida Químico aumentaron significativamente. Esto podría estar influenciado por los componentes de cada plaguicida, en especial, los del biológico que puede aportar ciertas cantidades de componentes orgánicos que permitan la proliferación de microbiota que compita directamente por espacio con los integrantes de este filo. Tanto las bacterias pertenecientes a los filos Actinobacteria y

Acidobacteria dependen del tipo de planta, por su aporte de carbono y de nutrientes, así como CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 87

de las propiedades edáficas. Kielak y colaboradores (2009) informaron que las proporciones de estos dos filos era menor en suelos rizosféricos con grandes cantidades de nutrientes que en suelos a granel (Kielak et al., 2009), y López-Lozano y colaboradores (2013) que fueron menos abundantes en suelos de interés agrícola con alta presencia de materia orgánica (López-

Lozano et al., 2013). Cabe resaltar que estas bacterias tienden a adoptar la estrategia K, creciendo lentamente con el fin de sobrevivir en el suelo y manteniendo su hábitat estable

(Cruz-Martínez et al., 2009).

Otro filo de gran importancia y que mantuvo su presencia en los suelos analizados es

Firmicutes. Los microorganismos que lo conforman son capaces de sobrevivir a condiciones extremas, siendo resistentes a la desecación, gracias a su producción de endosporas (Bowers et al., 2009). Brandes y colaboradores (2011) reportó que en bajas concentraciones de nutrientes se observaba una mayor esporulación de estas bacterias, además, evidenciaron su crecimiento como saprófitas con las raíces de las plantas (Brandes et al., 2011). Estos microorganismos representan el 8% del total de las secuencias analizadas, teniendo una mayor presencia en el suelo tratado con bioplaguicida y en el suelo Control. En el suelo con tratamiento Químico se mantuvo su presencia en el tiempo. Mediante el estudio de las dinámicas de poblaciones microbianas en la raíz y en el suelo, se determinó a Firmicutes como un filo dinámico y representativo (De Angelis et al., 2009). El análisis del suelo perteneciente a una plantación de Beta vulgaris (remolacha), concuerda con los resultados obtenidos por De

Angelis y colaboradores (2009), estableciendo que la mayor abundancia pertenecía a este filo.

Por el contrario, en cultivos de Jitomate, no se evidencia la presencia de este grupo de microorganismos (Kim et al., 2006). La abundancia de este filo puede depender de diversos factores, como el tipo de planta y suelo, la cantidad de materia orgánica disponible, el tipo de fertilización y riego, así como factores ambientales (Papatheodorou et al., 2008). Es importante resaltar que algunos miembros de este filo actúan como antagonistas de fitopatógenos como CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 88

Botrytis cinerea y Fusarium oxysporum (Nagórska et al., 2007) y Ralstonia solanacearum (Wei et al., 2011).

Del total de secuencias analizadas, en promedio el 6% estaba representado por el filo

Verrucomicrobia. Las bacterias pertenecientes a este filo se pueden encontrar en los suelos, pero en ocasiones se considera uno de los filos menos frecuentes. Esto se debe a su tasa de crecimiento lenta y su vida oligotrófica (Zhang y Zu, 2008). Janssen (2006) realizó un análisis de metadatos, indicando que aproximadamente el 7% de sus secuencias bacterianas de suelo pertenecían a este filo; lo que concuerda con los datos obtenidos en estudio (Janssen, 2006).

Se ha determinado que este tipo de bacterias son más abundantes en suelos de praderas o pastizales, debido a su capacidad de asociación con eucariotas, en especial con nemátodos

(Fierer et al., 2009). Su distribución en el suelo va a depender de los cambios en el ambiente, debido a su alta sensibilidad a las diferencias de humedad, factores químicos del suelo, fertilidad del suelo y el contenido de N, P y K, además de las bases, calcio y magnesio (Bruce et al., 2010; Pan et al., 2014; Navarrete et al., 2015). En los tratamientos analizados, se evidenció que el suelo denominado Biológico, contenía el mayor porcentaje de secuencias para este filo y que además se mantuvo en el tiempo; esto se puede deber a que posee las concentraciones más bajas de nutrientes. Isanapong y colaboradores (2013) demostró que los microorganismos pertenecientes a Verrucomicrobia tienen la capacidad de adaptarse a hábitats con bajas concentraciones de nitrógeno (Isanapong et al., 2013). En los suelos que se estudiaron, este elemento se encontraba en niveles bajos, lo cual pudo permitir la presencia de este filo. En otro estudio, Huang y colaboradores (2012) evidenciaron una disminución en este filo al aumentar la disponibilidad de N, P, K y materia orgánica (Huang et al., 2012). Así como

Pitombo y colaboradores (2015), que encontraron un efecto negativo en la aplicación de caña de azúcar con alto contenido de potasio, en la presencia de miembros de Verrucomicrobia

(Pitombo et al., 2015). Otro factor que influye en la abundancia de este filo es el tipo de cebador CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 89

empleado. Bergman y colaboradores (2011), Fierer y colaboradores (2013) y Shen y colaboradores (2017) determinaron que el empleo de los primers 515F/806R junto a la secuenciación de alto rendimiento (Illumina), aumenta significativamente, hasta en un 20%, el porcentaje de secuencias pertenecientes a este filo (Bergman et al., 2011; Fierer et al., 2013;

Shen et al., 2017). Diversos estudios han demostrado la importancia ecológica de este filo, dado que pueden promover procesos claves en los ciclos biogeoquímicos, así como su participación en la fijación de nitrógeno, oxidación de metano y degradación de polisacáridos

(Khadem et al., 2010; Martínez-García et al., 2012; Bergmann et al., 2011).

En promedio, un 5% de secuencias analizadas corresponden al filo Planctomycetes.

Estas bacterias representan entre el 5% y el 7% de células en los suelos destinados a la agricultura y en los suelos forestales (Buckley y Schmidt, 2003). Es común encontrarlas en ecosistemas eutróficos y en suelos altamente contaminados, su pH óptimo de crecimiento se encuentra entre 6.8 – 9.4, debido a esto el porcentaje presente en los suelos estudiados es bajo (Ward et al., 2006). Poseen un compartimiento celular unido a la membrana llamado anammoxosoma que les confiere la capacidad de oxidar amonio (Neumann et al., 2014).

Mediante este proceso, elimina el nitrógeno amoniacal de los químicos empleados en los fertilizantes agrícolas, tanto en suelos como en aguas residuales (Ward et al., 2006). Son organismos quimiorganotrofos que se reproducen por gemación o por fisión binaria (Ward,

2010; Fukunaga et al., 2009). Este género se caracteriza por descomponer lentamente la materia orgánica presente en el suelo, por ende, su crecimiento es lento (Ward, 2010). Por la ausencia de peptidoglicano en la pared celular, estas bacterias son resistentes a diversos antibióticos y a compuestos bioactivos secretados por los demás microorganismos de la comunidad microbiana (Claus et al., 2000).

Las bacterias pertenecientes a Chloroflexi se encuentran ampliamente distribuidas y en abundancia dentro de comunidades microbianas de vida libre (Thompson et al., 2017; CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 90

Mehrshad et al., 2018). Estos microorganismos poseen una alta diversidad metabólica, permitiendo su adaptación a ambientes óxicos y anóxicos, y su permanencia en nichos oligotróficos (Whitman, 2015). Estudios realizados han reportado que este filo comprende aproximadamente el 4.3% de bacterias en el suelo (Delgado et al., 2018), lo cual concuerda con nuestros resultados, debido a que su presencia es del 4.8%. Además de presentarse en suelos pobres de nutrientes, es común encontrarlos en regiones donde la vegetación es irregular (Freeman et al., 2009), en suelos de tundra (Costello y Schmidt, 2006) o en suelo del desierto polar hiperárido (Pointing et al., 2009). Al tratar recuperar este tipo de bacterias en medios de cultivo se determinó una taza de crecimiento muy lenta y una formación de colonias muy pequeñas (Davis et al., 2005; Davis et al., 2011). Fierer y colaboradores (2012) demostraron que la abundancia de este filo dependía de las concentraciones de Nitrógeno disponible en el suelo, debido a que en las parcelas con altos niveles de Nitrógeno su presencia disminuía (Fierer et al., 2012). Este filo disminuyó a través del tiempo en el suelo tratado con plaguicida de origen biológico y se mantuvo en el tratamiento químico, esto se puede deber a la adición del bioplaguicida por sus componentes activos y a que su aplicación era más constante que la del Lorsban.

Se obtuvo otros filos que se encontraron en un porcentaje menor al 1%, como es el caso de Gemmatimonadetes. De Bruyn y colaboradores (2011) determinaron que la abundancia relativa de estos microorganismos en el suelo oscila entre 0.2% y 6.5%, además, propusieron que estos microorganismos tienen la capacidad de adaptarse a ambientes secos y con pocos niveles de nitrógeno (Bruyn et al., 2011). Las bacterias pertenecientes al filo

Bacteroidetes son consideradas como excelentes degradadoras de materia orgánica y su importante función en el ciclo del carbono (Stevens et al., 2005) y su presencia en suelos agrícola va de 2% a 3% (Hartmann y Widmer, 2006). En algunos de los muestreos analizados existía una presencia >0.5% de los filos, Spirochaeta, conocido por su tolerancia al oxígeno y CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 91

su capacidad de reducir azufre y tiosulfato, así como de oxidar el sulfuro (Leschine et al., 2006);

Thermotogae, cuyos miembros son anaerobios y fermentativos, con un rango de temperatura de crecimiento de 20º a 95ºC. Además, son tolerantes a altas concentraciones de sal y su presencia se evidencia en pH neutros (Ben Hania et al., 2011). Estas bacterias se han encontrado en comunidades microbianas del suelo donde se involucran en la degradación de clorofenoles, hidrocarburos aromáticos policíclicos y organofosforados (Ben Hania et al., 2011;

Nesbo et al., 2010).

El análisis de secuencias arrojó filos del dominio Eucaria, como Ascomycota (0.3%),

Streptophyta (0.3%), Arthropoda (0.08%) y Nematoda (0.06%), estos dos últimos solo se presentaron en la muestra Control tomada después de 6 meses.

Clasificación por Género

En promedio, el 23% de secuencias de todos los tratamientos son taxones sin clasificar.

Esto sugiere que aún existe un gran porcentaje de microorganismos no caracterizados y que su estudio puede generar información sobre bioprospección y la creación de sondas para la genómica con el fin de generar otros tipos de genomas, diferentes a los ya secuenciados

(Rinke et al., 2013; Lorenz, 2005). Existen diversas herramientas computacionales como

SSUnique que permite caracterizar las secuencias no clasificadas de los conjuntos de datos del gen 16S rRNA estableciendo un contexto evolutivo para secuencias específicas (Lynch et al.,

2012).

Aproximadamente, el 51% de las secuencias fueron clasificadas con un género específico. El más predominante en todos los tratamientos fue el género Streptomyces. Estas bacterias filamentosas pertenecientes al filo Actinobacteria, se caracterizan por su capacidad de producir una elevada diversidad de compuestos antimicrobianos, y su presencia en hábitats ubicuos como suelos y sedimentos acuáticos (Gontang et al., 2007; Watve et al., 2001). Los compuestos bioactivos producidos por estos microorganismos son muy importantes en la CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 92

historia de vida del suelo y en asociaciones simbióticas benéficas para las plantas, donde estos antibióticos o moléculas de señalización proporcionan una gran ventaja competitiva por lugar y sustrato. Además de ser considerados como saprófitos y jugar un papel muy importante en los ciclos biogeoquímicos, se pueden encontrar como endófitos y patógenos para las plantas

(Kaltenpoth et al., 2009; Khan et al., 2010; Hulcr et al., 2011). Streptomyces posee un gran potencial para la supresión de bacterias, hongos, oomicetos y nemátodos que puedan perjudicar a la planta; este potencial se ve influenciado por los altos niveles de carbono y nitrógeno en el suelo, esto debido a su cualidad de metabolizar diversas fuentes de nutrientes

(Schlatter et al., 2009). Este género aumento durante el tiempo de muestreo en el tratamiento

Biológico, al poseer fuentes adicionales de carbono y nitrógeno del bioplaguicida, se favoreció su desarrollo en el suelo. Al ser unos microorganismos biológicamente activos y tener un metabolismo tan amplio, son capaces de degradar ciertos compuestos, incluyendo los pesticidas de origen químico. Briceño y colaboradores (2013) aisló una cepa de Streptomyces sp. con capacidad de degradar hasta en un 90% un pesticida organofosforado (diazinón) de una muestra de suelo expuesto a constantes aplicaciones de clorpirifos en Chile (Briceño et al.,

2013). Otro género perteneciente a este filo es Conexibacter. De las secuencias analizadas, el

4.4% pertenecían a este género. Son microorganismos estrictamente aerobios, que desempeñan un papel importante en el ciclo del nitrógeno, debido a que tienen la capacidad de reducir el nitrato. Al tener esta capacidad, se vuelven más interesantes a nivel industrial para mejorar los procesos de biorremediación; además contribuyen en el proceso del ciclo del carbono, al ser sacarolíticos (Pukall et al., 2010). Su crecimiento es lento, pero es tolerante a cualquier ambiente por su alto contenido de G+C. En un estudio metagenómico del suelo de tundra en Alaska, este género de bacterias fue el más dominante, con lo cual se puede comprobar lo dicho anteriormente (Deng et al., 2015). En los tratamientos biológico y químico disminuyó su presencia en el tiempo, por el contrario, en el suelo control aumentó y en el CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 93

blanco se mantuvo. Con esto se puede evidenciar la capacidad de este género de desarrollarse en condiciones límites. Junto con el género Streptomyces, las bacterias pertenecientes al género Actinomadura es considerado como un objetivo importante en la producción de metabolitos bioactivos (Zakharova et al., 2003). Sus miembros producen micelios y generan hifas aéreas (Zhao et al., 2015). Su presencia en las comunidades microbianas del suelo es menor al 5% y es mayor en suelos podsol, de clima frio y húmedo (Zakharova et al., 2003). Su presencia en bosques, praderas, suelos agrícolas y suelos semiáridos es muy baja (Zenova et al., 2001). En los cuatro tratamientos analizados, se evidenció una disminución de la presencia de este género, es necesario resaltar que durante la realización de los muestreos no era época de lluvias, por ende, el suelo en la mayoría del tiempo permanecía caliente, lo cual puede ser un factor que influye en la abundancia de estos microorganismos. La presencia de

Mycobacterium en los suelos de estudio, es de gran importancia por su capacidad de degradar hidrocarburos aromáticos policíclicos y de desarrollarse en ecosistemas oligotróficos (Kanaly y

Harayama, 2000). Algunas especies tienen un gran potencial como patógenos y se pueden encontrar distribuidas en ambientes terrestres como acuáticos (Hruska y Kaevska, 2013). Su abundancia relativa en las comunidades microbianas varía entre 0.5% y 3% (Karimi et al.,

2018; Delgado-Baquerizo et al., 2018), en promedio las secuencias clasificadas para este género en el estudio fueron de 4%, en los cuatros tratamientos se observa una disminución de este género. Estas se encuentran en mayor proporción en bosques boreales de alta latitud

(Niva et al., 2006; Nieminen et al., 2006) y su desarrollo es mejor en suelos con pH ácidos

(Kopecky et al., 2011; Norby et al., 2007). A pesar de que los suelos analizados poseían un pH

ácido no se evidencia una presencia constante con el paso del tiempo. El ultimo género representativo encontrado para el filo Actinobacteria fue Stackebrandtia. En suelos con niveles de sales elevados su abundancia va de 4-9% dentro de la comunidad microbiana (Labeda y

Kroppenstedt, 2005), en este análisis se encontraron solo en el muestreo del suelo Biológico CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 94

1A (primera aplicación del bioplaguicida) y en el muestreo Control 6M (seis meses después).

Son conocidas por su capacidad de hidrolizar alantoína, almidón y caseína; su capacidad de reducir nitratos es alta y puede emplear acetato y malato como sustrato para su desarrollo

(Munk et al., 2009).

Candidatus Koribacter es el género más dominante del filo Acidobacteria encontrado en el estudio, se considera como importante contribuyente a los ecosistemas debido a su elevada presencia en suelos agrícolas fertilizados. Este grupo se encuentra ampliamente distribuido en los suelos constituyendo hasta un 14% de las comunidades bacterianas (Eichorst et al., 2006;

Sait et al., 2002). Es común encontrar estas bacterias en suelos con altos niveles de contaminación, además, poseen una función altamente significativa en el ciclo del carbono, degradando polímeros complejos y oxidando el CO, teniendo la capacidad de regular la producción de monóxido de oxígeno (Ward et al., 2009). También tienen participación en el ciclo del Nitrógeno reduciendo el nitrato y el nitrito, así como en las reacciones redox del hierro, debido a su dominancia en suelos mineros ricos en hierro (Champbell, 2014). La presencia de celulasas y β-glocosidasas en su genoma les permiten la degradación de celulosa, superando así a otras especies que no son capaces de emplear los sustratos complejos de la celulosa

(Ward et al., 2009; Schoenborn et al., 2004). Su presencia es mayor en suelos con altas concentraciones de Nitrógeno, Fósforo y Potasio (Chen et al., 2017). En el estudio se evidenció que estos microorganismos aumentaron en el tiempo en los tratamientos Químico y Biológico.

En promedio, el 6% de las secuencias pertenecen a este género, cabe resaltar que estas bacterias son de crecimiento lento y los niveles de nutrientes no eran los más adecuados para su desarrollo. Candidatus Solibacter al igual que Candidatus Koribacter, persiste en el hábitat donde se encuentre y evoluciona con el tiempo, gracias a la magnitud que posee su genoma, lo que le confiere una ventaja competitiva permitiéndole una adecuada adaptación (Challacombe et al., 2001). Participa en la descomposición del carbono orgánico, en la reducción de nitratos a CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 95

nitritos y su metabolismo es lento, al igual que su crecimiento (Pearce et al., 2012). La formación de biopelículas por parte de este género permite la reducción de la humedad y las fluctuaciones de nutrientes en el suelo expuesto a condiciones ambientales estresantes

(Pearce et al., 2012). Comparte diversas similitudes con Candidatus Koribacter, juegan un papel importante en adsorción del hierro, así como su capacidad de descomponer compuestos vegetales, como la celulosa (King y Weber, 2007; Pearce et al., 2012). En los tratamientos químico y biológico se evidencia un aumento en el tiempo de estos microorganismos. El 4% de las secuencias analizadas corresponden a este género. Se puede evidenciar que la adición tanto de plaguicida y bioplaguicida le permite a este filo de bacterias una permanencia y un desarrollo óptimo en el suelo. La presencia de Acidobacterium solo se evidenció en 3 tratamientos, en el suelo Control (1M y 6M), Blanco (1M y 6M) y Químico (1M y 6M). Estos microorganismos son comunes en suelos con altas concentraciones de materia orgánica y participan activamente en los ciclos biogeoquímicos, incluyendo el del hierro (Kleinsteuber et al., 2008). Durante el desarrollo de la planta, estas bacterias son abundantes y dominantes, beneficiándose de los exudados de las plántulas (Chaparro et al., 2013). Además, permite una eficiencia en la absorción de agua y nutrientes y la formación de agregados en el suelo (Kielak et al., 2016). Actúa como agente de biocontrol y modula las hormonas producidas por las plantas, permitiendo una mejor adquisición de recursos (Hayat et al., 2010).

Dentro de las secuencias analizadas, se encontraron 4 géneros correspondientes al filo

Firmicutes. El más dominante y que estuvo presente en todos los muestreos realizados fue

Bacillus. Su capacidad de formar endosporas les confiere una alta resistencia a cambios extremos de temperatura, radiación, desecación y a productos químicos por un periodo largo en estado latente (Garbeva et al., 2003; Mandic-Mulec et al., 2016). Se pueden encontrar en diversos hábitats, como suelos, aguas dulces y saladas, plantas, animales y en el aire. Son componentes importantes de las comunidades microbianas del suelo, se detectan con mayor CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 96

frecuencia en suelos ácidos, salinos y desérticos (Gardener, 2004; Liszka et al., 2012; Felske et al., 2003). Poseen una amplia gama de aplicaciones industriales por su producción de bioenzimas y biocombustibles, su participación de la biorremediación de compuestos tóxicos, su empleo como biofertilizante y biocontrol (Porwal et al., 2008; Li et al., 2019). Al ser microorganismos metabólicamente activos y diversos pueden colonizar exitosamente cualquier ecosistema. Se consideran como promotoras de crecimiento vegetal, facilitando la solubilización de fosfatos a las plantas (Chatli et al., 2008), realizando la síntesis de fitohormonas (Vessey, 2003) y controlando el crecimiento microbiano de patógenos, además induce sistemas de defensas contra las plagas (Garcia-Fraile et al., 2015; Kang et al., 2015). La baja humedad del suelo en épocas de sequía crea un ambiente de estrés para las plantas; al estar presente los bacilos se regula el transporte de agua y nutrientes, estimulando la exudación de las raíces que permite un óptimo crecimiento de la planta y un buen desarrollo del microorganismo (Boomsma y Vyn, 2008; Sandhya et al., 2011). La abundancia de este género en los suelos analizados es del 5%, se evidenció un aumento en el suelo biológico posterior a la segunda aplicación del bioplaguicida; por el contrario, en los demás tratamientos se observó una disminución de estas bacterias. A pesar de su capacidad de adaptarse a ecosistemas con diversos climas o temperaturas, la cantidad de nutrientes necesarios para su desarrollo no eran suficientes. Algunos géneros se encontraron por debajo del 1% de presencia en alguno de los tratamientos, por eso no se tomaron en cuenta, como es el caso de Lysinibacillus, que solo se encontró en el muestreo Químico 1M (2.64%), Paenibacillus en el muestreo realizado al

Biológico después de seis meses (3.03%) y Brevibacillus en el tratamiento biológico en el muestreo tomado después de 6 meses (3.21%). Los microorganismos pertenecientes a

Lysinibacillus son considerados como alternativas para el control biológico de insectos, por su producción de toxinas insecticidas y por su capacidad de biorremediación de suelos y aguas afectados por derrame de petróleo (Iftikhar et al., 2007). Algunas especies de este género CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 97

actúan como promotores del crecimiento vegetal, Naureen y colaboradores (2017), indicaron que L. sphaericus produce niveles elevados de fitohormonas, en especial de AIA, y posee la capacidad de solubilizar silicatos, fosfatos y potasio, que le permite aumentar la germinación de semillas y promover el crecimiento de las plantas. Paenibacillus tiene una gran participación en la fijación biológica de Nitrógeno, proporcionándoles este elemento a las plantas de una forma soluble y obteniendo carbono por los exudados de las raíces de las plantas (Berge et al., 2002).

Por lo general el suelo no contiene grandes reservorios de fósforo, y en algunos casos limitan el crecimiento de las plantas, estas bacterias son capaces de solubilizar este elemento para una adsorción eficaz (Buenemann et al., 2004; Khan y Joergensen, 2009). Al igual que los anteriores géneros del filo Firmicutes, Brevibacillus puede adaptarse a ambientes diversos, debido a que induce su esporulación sin importan las condiciones en que se encuentre, en especial cuando se encuentra bajo estrés osmótico. También se ve involucrado en el crecimiento de las plantas por medio de la síntesis de hormonas (Vivas et al., 2005). Estos cuatro microorganismos permiten a los sistemas agrícolas un mejoramiento en el desarrollo de los cultivos, su permanencia y adaptación varían de los factores externos, como el clima, la concentración de nutrientes, el sistema de fertilización y de fumigación, y del método de labranza, así como el tipo de planta. El hecho de que Paenibacillus y Brevibacillus estuviesen presentes en el muestreo realizado después de seis meses en los tratamientos Químico y

Biológico se puede deber a que, transcurrido el tiempo, tanto el plaguicida como el bioplaguicida, aumentan los niveles de nutrientes esenciales para el desarrollo de estos microorganismos. Las utilidades que pueden tener los microorganismos pertenecientes al filo

Firmicutes, son ampliamente estudiadas, permitiendo a los investigadores crear junto a los agricultores una agricultura ecológica, que vaya de mano con el medio ambiente y la salud de quienes labran la tierra. CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 98

La diversidad de especies en el género Chthoniobacter es poca, al igual que su presencia en las comunidades microbianas del suelo. Estas bacterias pertenecientes al filo

Verrucomicrobia son de naturaleza oligotrófica, que tienen la capacidad de sintetizar polisacáridos vegetales y son útiles en la obtención de propionato mediante la fermentación de estos polímeros (Kant et al., 2011; Van Passel et al., 2011). Navarrete y colaboradores (2015) encontraron una disminución en la abundancia de este género al aumentar la fertilización del suelo en un cultivo de caña. Esto sugiere, que son microorganismos con tasas de crecimiento lentas, que al encontrarse con niveles de nitrógeno y fosforo bajos se desarrollan y aumentan su abundancia (Navarrete et al., 2015). En promedio, su presencia fue del 5.6%, se evidenció que en los suelos químico y biológico se mantuvo su abundancia durante el tiempo, mientras que en suelo Control y Blanco, disminuyó. Es importante resaltar que dentro de las comunidades existe competencia por espacio y por nutrientes, además que algunas de las bacterias presentes tienen mayor afinidad con la planta cultivada y que existen otros factores, como los hongos, que impiden la permanencia de ciertas especies en el ecosistema.

Los géneros del filo Planctomycetes no han sido ampliamente estudiados; en el estudio se evidenció la presencia de Isosphaera con un 5% de secuencias. Estas bacterias son aerobias obligadas y su presencia se puede relacionar con los microorganismos del género

Cyanobacteria, debido a sus condiciones de crecimiento, que pueden ser neutras o alcalinas y a que estas bacterias proporcionan la fuente de energía a Isosphaera (Wang et al., 2002). Se presentan en ambientes óxicos con temperaturas de 40 – 50ºC y pH entre 7.8 y 8.8 (Pentecost,

2005).

Con un porcentaje menor de secuencias se encontraron los géneros Dehalogenimonas y Ktedonobacter pertenecientes al filo Chloroflexi. Las bacterias pertenecientes a

Dehalogenimonas se caracterizan por su capacidad de deshalogenar alcanos clorados (Moe et al., 2009). La presencia de estos compuestos se puede dar por acciones antropogénicas o por CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 99

la existencia de pequeñas trazas naturales en los suelos (Keppler et al., 2002). Krzmarzick y colaboradores (2012), evidenciaron que el crecimiento de estos microorganismos en suelos libres de contaminantes era abundante, indicando que existían organoclorados de forma natural en el suelo; también comprobaron que, al aplicar estos compuestos en otros suelos, la abundancia era muy elevada afirmando que estas bacterias emplean estos halógenos como sustrato de crecimiento (Krzmarzick et al., 2012). La razón por la cual estas bacterias emplean como aceptor de electrones a compuestos halogenados podría ser, porque tienden a ser termodinámicamente favorables, o sea, le proporciona mayor liberación de energía; también puede ser, porque responde ante el estrés que causa la contaminación existente en el ecosistema, eliminando así el compuesto más tóxico que exista (Dillehay et al., 2014). Por su limitado rango de donantes de electrones, se considera que este género puede crecer en asociaciones sintróficas con otras bacterias (por lo general, productoras de hidrógeno y fermentativas) del medio que habitan (Rao et al., 2012). Que se encuentre presente en el suelo estudiado indica que existe la presencia de este tipo de compuestos orgánicos, ya sea por parte del tipo de fertilizante que se ha empleado o por la formación de estos de forma natural.

Por otra parte, Ktedonobacter se distingue por su morfología similar a la de los actinos. Es común encontrarlas en ambientes altamente contaminados, Epelde y colaboradores (2015) confirman la capacidad de este género de vivir en ecosistemas con alto contenido de plomo y de zinc (Epelde et al., 2015). Se consideran oligotróficos y pueden emplear el CO como fuente de energía. Es por esto que se pueden encontrar en la tefra volcánica, debido a que emplea los gases volcánicos y atmosféricos para su metabolismo (King y Kong, 2014). Después de seis meses del primer muestreo, el porcentaje de secuencias para estos dos géneros fue menor al

1%, por lo cual estos valores no se tomaron en cuenta para el análisis.

Por último, se obtuvo dos géneros del filo Proteobacteria que se encontraron significantes (≥1%) en algunos muestreos. Algunos géneros de las α-proteobacteria como CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 100

Bradyrhizobium y de las β-proteobacteria como Burkholderia forman nódulos funcionales que les confiere a las plantas una mayor capacidad de fijar Nitrógeno, lo cual es una ventaja cuando existen niveles bajos de este elemento (Andrews et al., 2011; Ardley et al., 2012). Las especies de Burkholderia además de participar en el ciclo del nitrógeno, se han identificado como microorganismos biocontroladores de patógenos en cultivos como el maíz, el algodón, tomate y pimientos (Ait Barka et al., 2002; Li et al., 2002). La forma de suprimir las enfermedades no ha sido muy estudiada, pero se conoce que estas especies producen antibióticos como la

Fenazina y la Pirrolnitrina (Heungens y Prke, 2000). Son organismos versátiles, que comúnmente se encuentran asociados a las plantas, brindándoles tolerancia a la escasez de agua del suelo y que se emplean en los procesos de biorremediación (Master et al., 2002; Trân

Van et al., 2000; Mayak et al., 2004). Estas bacterias se encontraron en el suelo Control en el primer muestreo y después de un mes; en el suelo Químico después de un mes y posterior a la segunda aplicación del bioplaguicida, en el cual se evidenció un aumento significativo; y en el suelo Biológico no se observó significancia de estos microorganismos. Los miembros de

Bradyrhizobium se encuentran ampliamente distribuidos en el suelo gracias a su capacidad de fijar Nitrógeno. Han sido estudiados por un largo periodo de tiempo por su simbiosis con la rizosfera de leguminosas y otras plantas, reconociéndolos como organismos de importancia ecológica y económica (Uroz et al., 2010; Delmont et al., 2012; Hartman et al., 2012). Mejora el suministro de nutrientes a las plantas, incluyendo el fosforo, y la calidad del suelo se presenta

óptima para el cultivo (Taiwo y Adegbite, 2001). Estos microorganismos solo se presentaron por encima del 1% en el tratamiento Químico después de seis meses del primer muestreo. Es importante destacar, que estos microorganismos no forman nódulos en un suelo con pH ácidos ni con un clima de temperaturas bajas (Taylor et al., 1991); lo más probable es que su abundancia en los suelos estudiados haya disminuido debido a la acidez que presentaba el suelo. CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 101

La composición de las comunidades microbianas va a depender de los factores bióticos y abióticos que se presenten en el cultivo. Estos van a jugar un rol muy importante en diversos procesos como la regulación de nutrientes y la descomposición de la materia orgánica, permitiendo así mantener un equilibrio entre el ecosistema, la planta y los microorganismos. El empleo de herramientas metagenómicas permite abarcar la composición de estas, pero se debe tener en cuenta que esta riqueza es difícil de evaluar debido a que varias poblaciones se encuentran u ocurren a baja abundancia (Hong et al., 2006). Es importante resaltar, que además de las propiedades del suelo, el clima y el tipo de planta a cultivar, las actividades antropogénicas, como la labranza, la fertilización y la fumigación, afectan directamente a estas comunidades y a sus funciones esenciales dentro del ecosistema.

Diversidad α

Mediante la diversidad alfa se resume la diversidad de microorganismos en una muestra con un solo valor. MG-RAST estima este valor a partir de la distribución de las anotaciones a nivel de especie. Estas anotaciones provienen de todas las bases de datos que son fuentes de anotaciones empleadas por el programa.

El estudio de la diversidad de especies ha tomado relevancia, debido a que le permite al investigador conocer a fondo el funcionamiento de los ecosistemas y observar si existe algún cambio con las acciones antropogénicas (Maclaurin y Sterelny, 2008). En el presente estudio se pudo evidenciar que el número de especies encontradas en cada suelo fue variando con el paso del tiempo, teniendo una gran influencia la aplicación del plaguicida y del bioplaguicida.

Aunque la cantidad de especies fue mayor en los suelos que tenían tratamientos, existió una disminución de especies al momento de aplicarlos; esto no sucedió en el suelo Control; este, aunque con menor número de especies, logró un aumento después de la siembra y el primer muestreo y se mantuvo en el tiempo. Además de asociarse con las acciones del hombre, se debe tomar en cuenta los factores ambientales locales, que influyen también con las CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 102

interacciones de la población microbiana. Esto va a dar como resultado una recolonización o la extinción de especies específicas (Moreno, 2001).

Abundancia Relativa y Efecto del Plaguicida (Lorsban) y Bioplaguicida (Nicotina y

Capsaicina).

A través de la abundancia relativa se puede conocer la proporción de una especie con respecto a todos los taxones existentes en la comunidad microbiana estudiada. Permite inferir que tan rara o común puede ser una especie en comparación a las demás (Hubell, 2001). Es ampliamente empleada por los investigadores para deducir el modo de interacción y la relación que existe entre diferentes especies de una comunidad especifica (Ferrier y Guisan, 2006). La abundancia relativa en el estudio determino que algunos géneros son más afines con las condiciones específicas que se le dieron a cada tratamiento. En el suelo control se encontraron en mayor proporción los géneros Actinomadura, Dehalogenimonas y Burkholderia. En el suelo

Blanco predominó Candidatus Koribacter. En el lote denominado Biológico, los géneros

Conexibacter, Candidatus Solibacter y Chthoniobacter. Y en el Químico, Streptomyces,

Candidatus Koribacter e Isosphaera. Que la afinidad de estos microorganismos sea mayor a un tratamiento específico se puede explicar por la capacidad de adaptación que posee la mayoría de estos. Esto les permite la supervivencia de su especie en ambientes que son sometidos a cambios, como es el caso de los suelos de estudio. Otro factor que influye en esta correlación son las asociaciones simbióticas que puedan existir entre microorganismos o entre estos y las plantas (Bradford y Schwab, 2013). Esto puede constituir una evolución de las comunidades microbianas presentes en los suelos agrícolas, en este caso, en los cultivados con Piña.

En este punto es importante resaltar la acción que tienen los sistemas agrícolas sobre las comunidades microbianas y el medio ambiente. En ocasiones prácticas como la labranza, la fertilización y la fumigación tienden a afectar la variedad y diversidad de microorganismos, desequilibrando los procesos ecológicos (Cardinale et al., 2012). Para poder obtener un cultivo CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 103

viable, es necesario tener un suelo sano, libre de compuestos o sustancias recalcitrantes que causen la erosión del suelo. La fertilización mineral y orgánica, aumenta el nivel de fertilidad, pero también influye en las propiedades químicas, físicas y biológicas, afectando la diversidad y funcionalidad de poblaciones microbianas, y por ende la disponibilidad y reciclaje de nutrientes

(Jangid et al., 2008; Gu et al., 2009). Mikanová y colaboradores (2015) determinaron la influencia de diferentes tratamientos de fertilización sobre la diversidad microbiana llegando a la conclusión que tanto la abundancia como la funcionalidad de los microorganismos era mayor en suelos tratados con una combinación de fertilizante mineral y estiércol. Así como la fertilización es importante e influye en las comunidades microbianas, el empleo de plaguicidas para el control de plagas tiene un gran impacto en estas. El uso de plaguicidas químicos se convierte en contaminación que va escalando a medida que se emplea, volviéndose recalcitrante y perjudicial para algunos microorganismos, pero a su vez favorece a cierto grupo de organismos capaces de degradar estos compuestos. Se han planteado alternativas como el uso de bioplaguicidas, empleando nicotina y capsaicina. Actualmente el empleo de nicotina como pesticida en la agricultura ecológica de Estados Unidos se encuentra prohibida. Esto se debe a que su toxicidad puede igualarse a la de los pesticidas sintéticos, ya que al ser menos eficientes se deben aplicar en grandes cantidades y más seguido que los convencionales (Ray,

1991; IFOAM, 2013). Es permitido el uso de té de tabaco por su baja concentración de nicotina y su capacidad de degradarse en un tiempo más corto. Aun así, esta sustancia puede llegar a ser altamente perjudicial para la salud del agricultor (IFOAM, 2013). La capsaicina ha sido empleada desde la antigüedad como repelente de insectos y de diversos invertebrados (Koleva et al., 2012). El insecticida biológico empleado en este estudio se compone de estos dos extractos naturales. El producto se encuentra registrado para ser patentado (Kopytko y Mujica,

2016); mediante esta investigación se puedo evidenciar que no causa variación en la estructura de las comunidades microbianas. CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 104

Géneros Únicos y Comunes en los Tratamientos

Al relacionar la abundancia relativa y las agrupaciones dadas por el diagrama de Venn, se evidencia que los géneros dominantes pertenecían al grupo de los géneros compartidos por los cuatro suelos. Varios géneros diferentes a los ya nombrados aparecieron en los suelos biológico y químico. A pesar de que su abundancia relativa fue <1%, géneros como Weissella,

Pseudoxanthomonas y Sulfobacillus, estaban presentes en estos dos tratamientos. Las especies pertenecientes al género Weissella poseen requerimientos nutricionales muy complejos y en abundancia (Björkroth et al., 2014), lo cual no fue una característica de los suelos analizados. Por otra parte, el género Pseudoxanthomonas es de gran importancia ecológica por su capacidad de reducir nitratos y nitrito, y por su empleo en la degradación de hidrocarburos; pero su hábitat natural son las aguas subterráneas por lo general contaminadas con Arsénico (Xu et al., 2014; Nayak et al., 2011). Sulfobacillus posee tolerancia a diversos metales, así como a los cambios de temperatura extrema; es capaz de emplear diferentes compuestos de carbono y participa en la oxidación del hierro (Bogdanova et al., 2006; Tsaplina et al., 2010; Watling et al., 2008). Estos microorganismos se consideran de importancia ambiental y biotecnológica, pero debido a las condiciones nutricionales y factores externos su desarrollo no fue el adecuado en los suelos estudiados.

Es importante resaltar que las condiciones del suelo tratado con bioplaguicida permitió el desarrollo de más géneros únicos en comparación con los demás suelos. Se encontraron 40 géneros en total, uno de estos es Janthinobacterium, se encuentra en abundancia en suelos forestales y en glaciares árticos. Son bacterias pigmentadas de color morado como resultado del compuesto violaceína. Este compuesto se presenta cuando el microorganismo está en estrés ambiental y le permite su supervivencia. La violaceína posee compuestos antibacteriales, antifúngicas y antivirales (Schloss et al., 2010; Pantanella et al., 2007).

Además, necesitan altas concentraciones de sodio para poder crecer y mantenerse en el CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 105

ecosistema (Valdes et al., 2015). Varios géneros solo contaban con una secuencia de referencia, entre estos se encontró a Nitratiruptor, su abundancia casi nula se debe a que se encuentra generalmente en las profundidades acuáticas, creciendo sin luz ni oxígeno

(Nakagawa et al., 2005). También se encontraron especies del género Enterobacter, las cuales son descomponedoras de materia orgánica y patógenas para el ser humano (Mezzatesta et al.,

2012).

En total, 37 géneros únicos pertenecían al suelo tratado con Lorsban. Los más importantes a nivel ecológico fueron Serratia, por su capacidad de producir quitinasas esenciales en el biocontrol de las enfermedades producidas por hongos en las plantas (Wang et al., 2013; Kamensky et al., 2003); Anaerobacillus, cuyas especies son alcalófilas y halotolerantes, participando activamente en la degradación de halógenos (Zavarzina et al.,

2009); Phyllobacterium, que al encontrarse en una gran diversidad de hábitats, se le atribuye una gran capacidad de adaptación, interviniendo en la formación de nódulos en las plantas, con el fin de facilitar la asimilación de los nutrientes (Oger et al., 2004); por último se encontró presencia de Aromatoleum, que poseen versatilidad degradante aromática (tolueno y etilbenceno), no son capaces de fijar nitrógeno, pero viven en asociación constante con las plantas (Rabus et al., 2016).

Las comunidades microbianas del suelo se ven afectadas no solo por las perturbaciones ambientales, el uso de insecticidas también puede causar un estrés fuerte para los microorganismos (Rota et al., 2014). En el estudio se empleó un pesticida organofosforado, los cuales son los más empleados en la industria agrícola por su alta eficiencia y su actividad de inhibir la acetilcolinesterasa (da Silva et al., 2013). Algunos estudios previos informan que los miembros de los géneros Burkholderia, Pseudomonas, Cupriavidus, Corynebacterium,

Arthrobacter y Sphingomonas son capaces de degradar los compuestos activos de estos insecticidas químicos, empleándolos como fuente única de carbono (Tago et al., 2006; Kim et CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 106

al., 2009). Arbeli y Fuentes (2007) confirmaron que en el suelo donde se aplicaba el mismo pesticida continuamente, los microorganismos capaces de degradarlo crecen al asimilarlo, causando una biodegradación exitosa (Arbeli y Fuentes, 2007). A pesar de que existen microorganismos que toleran este tipo de compuestos, otros importantes a nivel ecológico no tienen condiciones óptimas para su desarrollo ya que, al estar compuestos por materiales sintéticos, no son específicos e influyen tanto en la vegetación como en la micorbiota normal del suelo y en organismos benéficos para el cultivo. Por el contrario, los bioplaguicidas son altamente específicos, tienen un riesgo bajo de contaminación y no son un gran peligro para las personas. Es importante resaltar que el modo de acción de un insecticida biológico es totalmente diferente a uno sintético, los plaguicidas botánicos tienden a repeler y a evitar la oviposición más no a matar a una especie, solo evita que esta llegue a afectar a la planta. Esto se evidencia en la investigación, donde el mayor número de géneros se encontró en el suelo tratado con bioplaguicida. A pesar de esto, la diferencia entre el numero total de géneros entre los tratamientos Biológico y Químico no es significativa, permitiendo establecer que el plaguicida ni el bioplaguicida causan efectos en la composición de las comunidades microbianas

Análisis de Componentes Principales (ACP)

Mediante el Análisis de componentes principales se logró identificar las diferencias en la estructura de la comunidad microbiana a nivel de género, teniendo en cuenta los tratamientos aplicados a dos de los lotes estudiados. En la gráfica no se evidencia agrupamiento de las muestras, indicando una variación dentro de las comunidades en cada muestreo de los diferentes tratamientos. A pesar de esta variación, existe una correlación entre las muestras de los suelos Blanco, Biológico y Control, lo cual indica que existen un mayor número de estructuras comunes muy similares en estas áreas y que tanto el plaguicida como el bioplaguicida no afectan la composición de las comunidades microbianas. Hong y CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 107

colaboradores (2015) evaluaron la estructura de las comunidades microbianas de tres regiones con diferentes grados de hierro; al realizar un PCA lograron identificar que las comunidades en la mayoría de lugares compartían una diversidad de género similar, pero existían dos que no se lograron agrupar, indicando que poseían una variación en su diversidad (Hong et al., 2015). Es importante tener en cuenta la naturaleza del suelo y a lo que encuentra expuesto en esta diferencia de comunidades. Este análisis permitió reducir la dimensionalidad de los datos de secuencias obtenidas, lo cual indica que existe correlación entre las variables de estudio, esto se puede comprobar por el % de varianza obtenido en el primer componente (59.49%).

Diversidad β

Esta diversidad permite abordar diferentes factores como cambios en la composición de especies en un periodo de tiempo, el grado de similitud o de asociación entre los sitios de muestra y la identificación de limites biogeográficos (Gaston et al., 2001). En el estudio, la diversidad entre cada tratamiento es baja, con una alta similitud y poca abundancia de especies. Con lo que se puede deducir que la aplicación del plaguicida y del bioplaguicida no causan efectos significativos en la estructura de las comunidades microbianas presentes en cada tratamiento. Esto concuerda con la correlación existente entre algunos muestreos en el análisis de componentes principales. Por el contrario, Carbonetto (2015) determinó por medio de la diversidad β que el uso de la tierra para la agricultura tiene efecto en las comunidades microbianas, evidenciando diferentes diversidades en cada uno de los suelos estudiados

(Carbonetto, 2015). Existe una hipótesis que responsabiliza a los factores ambientales de la variación observada en las comunidades; Becking en 1934, dijo: - “Todo está en todos lados, pero el ambiente lo selecciona”. Lo que supone que existen microorganismos que no alcanzan el límite de detección, pero estos siempre tienen su lugar en el universo. Además de existir pequeñas trazas de microorganismos, las variaciones en nutrientes, materia orgánica, en el pH CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 108

y en la textura del suelo, se relacionan con la abundancia de géneros que puede existir en una comunidad (Becking, 1934; De Wit y Bouvier, 2006).

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 109

Conclusiones

Se logró caracterizar molecularmente la diversidad microbiana en un cultivo de Ananas comosus tratado con distintos plaguicidas. De 1’518.101 secuencias, en total se lograron identificar 482 géneros, siendo Streptomyces, Candidatus Solibacter, Candidatus Koribacter,

Isosphaera, Actinomadura, Conexibacter, Bacillus y Dehalogenimonas, los más abundantes en las 14 muestras analizadas. El porcentaje de abundancia de cada uno de estos microorganismos depende de las condiciones que poseía cada lote. Con este estudio se pudo demostrar que tanto el plaguicida químico como el bioplaguicida, no causan un efecto negativo en la composición de las comunidades microbianas, por el contrario, existe un mayor número de géneros únicos en estos dos tratamientos; lo que garantiza un equilibrio en las comunidades y en la relación planta-microorganismo.

El efecto de plaguicidas biológicos en las comunidades microbianas no ha sido estudiado a fondo, con este estudio se pudo demostrar que, aunque algunos microorganismos se encontraban con mayor abundancia en el suelo tratado con plaguicida de origen químico, se evidenció una mayor riqueza de microorganismos en el suelo biológico, obteniendo una diversidad mayor. Los compuestos orgánicos del bioplaguicida permitieron el desarrollo de géneros esenciales en los ciclos biogeoquímicos y en la degradación de diferentes compuestos. Esto garantiza un efecto positivo en las propiedades del suelo y en las comunidades microbianas allí presentes.

Aunque algunos tratamientos presentaron un mayor número de géneros únicos, mediante la diversidad entre hábitats se comprobó que los cuatro lotes analizados tenían una alta similitud y poca abundancia de especies. Cabe resaltar que existen microorganismos cuyas trazas son muy pequeñas y que en algunas ocasiones no son detectados por las técnicas de secuenciación, además, la concentración de nutrientes, el porcentaje de materia orgánica y el CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 110

pH, pueden verse relacionados con la abundancia de microorganismos dentro de las comunidades.

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 111

Recomendaciones

Para la realización de estudios futuros relacionados con la caracterización microbiana de muestras ambientales, es necesario la implementación de otras técnicas de secuenciación de próxima generación que permitan abarcar un mayor número de pares de bases y lograr una identificación taxonómica más profunda; así como la implementación de diferentes bases de datos. Se podría complementar con el empleo de metagenómica funcional, permitiendo así al investigador conocer las relaciones entre la planta y el microorganismo.

Un estudio a mayor escala del suelo debería considerar un tiempo de muestreo más amplio y así, poder evaluar a mayor profundidad el efecto de plaguicidas o bioplaguicidas dentro de las comunidades microbianas.

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 112

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CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 149

Apéndices

Apendice A. Protocolo de Extracción de ADN Estandarizado: Kit E.Z.N.A.® Soil DNA Kit

(OMEGA)

1. Pesar 0.7 g de suelo previamente macerado.

2. Adicionar las perlas de vidrio a un tubo de 15 ml, junto con el suelo macerado.

3. Añadir 1 ml de Buffer SLX-Mlus, llevar a vortex por 10 minutos.

4. Agregar 150 µl de Buffer DS, agitar por unos segundos en el vortex.

5. Incubar a 70ºC por 15 minutos (a los 5 y 10 minutos retirar las muestras y llevarlas a agitación en vortex).

6. Centrifugar a 3000 g por 5 minutos a temperatura ambiente.

7. Transferir el sobrenadante a un tubo Eppendorf.

8. Adicionar 270 µl de Buffer P2 (el buffer debe estar a -20ºC), agitar en vortex por unos segundos.

9. Incubar en hielo por 10 minutos.

10. Centrifugar a 35000 g por 10 minutos.

11. Transferir el sobrenadante a un tubo Eppendorf.

12. Agregar 800 µl de isopropanol, agitar por inversión y llevar a -20ºC por 1 hora.

13. Centrifugar a 35000 g por 15 minutos a 4ºC.

14. Descartar el sobrenadante.

15. Dejar secar el pellet por 3 minutos.

16. Añadir 250 µl de Buffer de Elución, llevar al vortex hasta que la mezcla sea homogénea.

17. Incubar a 70ºC por 25 minutos (agitar en vortex a los 15 y 25 minutos).

18. Añadir 150 µl de cHTR, agitar en vortex.

19. Dejar a temperatura ambiente por 5 minutos. CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 150

20. Centrifugar a 35000 g por 5 minutos.

21. Transferir el sobrenadante a un tubo Eppendorf.

22. Adicionar 400 µl de Buffer XP1, agitar en vortex.

23. Insertar una minicolumna de ADN HiBind® en un tubo de recolección de 2 ml.

24. Transferir la muestra del paso 22 a la Mini Columna de ADN HiBind®.

25. Centrifugar a 10000 g por 1 minuto a temperatura ambiente.

26. Descartar el filtrado y reutilizar el tubo de recolección.

27. Agregar 500 µl de Buffer HBC.

28. Centrifugar a 10000 g por un minuto a temperatura ambiente.

29. Descartar el filtrado.

30. Realizar 2 lavados con el Buffer de lavado de ADN (el primero con 750 µl y el segundo con 250 µl). centrifugar a 10000 g por minuto.

31. Centrifugar a 35000 g por 2 minutos para eliminar trazas de etanol.

32. Transferir la columna a un tubo Eppendorf limpio.

33. Adicionar 40 µl de Buffer de elución.

34. Dejar a temperatura ambiente por 2 minutos.

35. Incubar a 70ºC por 2 minutos.

36. Dejar a temperatura ambiente por 2 minutos.

37. Filtrar de nuevo la mezcla de ADN con el buffer de elución en la columna.

Centrifugar a 35000 g por un minuto.

38. Conservar el ADN a -20ºC.

Nota: debido a la baja carga bacteriana presente en el suelo estudiado, por cada muestra se emplearon 6 tubos de 15 ml, a los cuales se les realizó el anterior procedimiento. Al final, se obtuvo aproximadamente 240 µl de cada muestra. CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 151

Apéndice B. Concentración de ADN Genómico Total de Suelos

1. Adicionar 2.5 volumenes de Isopropanol (-20ºC) a la muestra a concentrar.

2. Dejar “overnight” a 20ºC.

3. Centrifugar por 30 minutos a 13000 rpm y 4ºC.

4. Descartar el sobrenadante.

5. Lavar con 500 µl de etanol al 70% (realizar 3 lavados).

6. Centrifugar por 10 minutos a temperatura ambiente.

7. Resuspender el pellet en el volumen deseado de buffer de elución.

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 152

Apéndice C. Calidad del ADN Extraído

Figura 16.

Calidad del ADN extraído de los tratamientos analizados.

A B C D E

F G H I J

Electroforesis en gel de Agarosa para confirmar Integridad del ADN metagenómico. A) Muestra control, B) Muestra blanco del primer muestreo. C) Muestra químico y D) Muestra biológico del segundo muestreo. E) blanco, F) control, G) químico y H) biológico del tercer muestreo. I) químico y J) biológico del cuarto muestreo.

Nota: Se evidencias bandas correspondientes al ADN genómico total de los suelos analizados.

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 153

Apéndice D. Secuencias Obtenidas por Muestra

Tabla 10.

Número de Secuencias y Secuencias Fallidas Obtenidas por cada Muestra.

Muestra # Secuencias # Secuencias fallidas

BI1A 111.382 1

BI1M 115.132 0

BI2A 116.706 0

BI6M 93.472 0

Q1A 120.732 6

Q1M 109.295 0

Q2A 122.642 2

Q6M 91.404 0

B 114.058 0

B1M 114.560 0

B6M 91.218 0

C 130.198 23

C1M 110353 5

C6M 76.949 0

Nota: el número de secuencias fallidas se obtuvo del control de calidad del programa MG-

RAST.

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 154

Apéndice E. Curva de Rarefacción de los Suelos Analizados

Figura 17.

Curva de Rarefacción del Suelo Tratado con Bioplaguicida.

Nota: La siguiente gráfica muestra la curva de rarefacción de la riqueza de especies anotada.

Esta curva es un gráfico del número total de anotaciones de especies distintas en función del número de secuencias muestreadas.

Figura 18.

Curva de Rarefacción del Suelo Tratado con Plaguicida.

Nota: Estas curvas de rarefacción se calculan a partir de la tabla de abundancia de especies. CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 155

Figura 19.

Curva de Rarefacción del Suelo Control.

Nota: Las curvas representan el número promedio de anotaciones de especies diferentes para submuestras del conjunto de datos completo.

Figura 20.

Curva de Rarefacción del Suelo Blanco.

Nota: Las curvas de muestreo generalmente aumentan muy rápidamente al principio y luego se estabilizan. CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 156

Apéndice F. Prueba de Kruskal Wallis – Composición microbiana sin diferencia significativa

Tabla 11.

Prueba de Kruskal Wallis.

Parámetro Candidatus Dehalogenimonas Ktedonobacter Bacillus Isosphaera Burkholderia Conexibacter Streptomyces Mycobacterium Koribacter Chi- 3,000 3,000 3,000 3,000 3,000 3,000 3,000 3,000 3,000 cuadrado Gl 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Sig. 0.392 0.392 0.392 0.392 0.392 0.392 0.392 0.392 0.392 asintónica

Nota: Se concluye que con un nivel de significancia del 5%, la composición microbiana es similar entre los cuatro tratamientos, esto por tener un valor de p>0.05 (p=0.392).

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 157

Apéndice G. Propiedades físicoquímicas de los suelos estudiados, realizados por los

estudiantes de la Universidad Pontificia Bolivariana sede Bucaramanga

Tabla 12. Textura del Suelo

Muestra %Arena %Arcilla %Limo Tipo de suelo Blanco 68,72 26 5,28 Franco Areno Arcilloso Control 68,72 25 5,28 Franco Areno Arcilloso Biológico 68,72 24 7,28 Franco Areno Arcilloso Químico 71,24 21,28 5,28 Franco Areno Arcilloso

Nota: Resultados de las mediciones de textura del suelo. Definición del tipo de suelo donde se realizó el muestreo. Tomado de Zambrano, 2019.

Tabla 13. Características Físicas y Químicas del Suelo

Muestra pH Densidad N total C P total Materia aparente (mg/kg) orgánico (mg/kg) Orgánica (g/cc) (%) (%) Blanco 4.38 1.43 504 0.60 141 1.7 Control 3.78 1.35 532 0.72 104 1.9 Biológico 3.87 1.52 504 0.74 136 2.7 Químico 4.63 1.38 532 1.16 142 3.7

Nota: Composición química (N, P y C) y características físicas (pH y Densidad aparente) de los suelos analizados. Tomado de Zambrano, 2019.

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 158

Tabla 14. pH de los Suelos Estudiados

Muestras pH agua pH KCl ∆퐩퐇 Tipo de Intercambiador Blanco Muestreo 1 4,65 3,78 -0,87 Catiónico Muestreo 3 4,40 3,56 -0,84 Catiónico Muestreo 5 4,38 3,53 -0,85 Catiónico Control Muestreo 1 4,25 3,70 -0,55 Catiónico Muestreo 3 3,96 3,32 -0,64 Catiónico Muestreo 5 3,78 3,39 -0,39 Catiónico Biológico Muestreo1 4,41 3,73 -0,68 Catiónico Muestreo 2 4,50 3,73 -0,77 Catiónico Muestreo 3 4,26 3,45 -0,81 Catiónico Muestreo 4 4,45 3,65 -0,80 Catiónico Muestreo 5 3,87 3,51 -0,36 Catiónico Químico Muestreo1 4,50 3,75 -0,75 Catiónico Muestreo 2 4,63 3,80 -0,83 Catiónico Muestreo 3 4,32 3,67 -0,65 Catiónico Muestreo 4 4,35 3,56 -0,79 Catiónico Muestreo 5 4,63 4,03 -0,60 Catiónico

Nota: En la tabla se evidencia el pH de cada uno de los muestreos realizados a los diferentes suelos estudiados y el tipo de intercambiador que es cada uno de estos. Tomado de Zambrano,

2019.

CARACTERIZACIÓN MICROBIANA DE UN CULTIVO DE PIÑA 159

Cálculo de Nitrógeno de mg NTK/Kg a %.

420 mg NTK/Kg

0,42 푚푔 1000푔 푠푢푒푙표  = 푋 % 100 푔 푠푢푒푙표  x= 0,042%

560 mg NTK/Kg

0,56 푚푔 1000푔 푠푢푒푙표  = 푋 % 100 푔 푠푢푒푙표  x= 0,056%