Universidade Federal Do Tocantins

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS

Aspectos reprodutivos do híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer

JANAINA CARLOTTO PORTALETE

ARAGUAÍNA 2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS

Aspectos reprodutivos do híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer

Janaina Carlotto Portalete

Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre, junto ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal Tropical, da Universidade Federal do Tocantins.

Área de concentração: Patologia Animal

Orientadora: Profª. Drª. Tânia Cavalcante

ARAGUAÍNA 2012

Dados Internacionais de Catalogação

Biblioteca UFT – EMZV

B862a Portalete, Janaina Carlotto Aspectos reprodutivos do híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer-- Araguaína: [s.n.], 2012. 61 f.

Orientador: Profa. Dra. Tânia Cavalcante

Dissertação (Mestrado em Ciência Animal Tropical) - Universidade Federal do Tocantins, 2012.

1. Gametas. 2.Gônadas. 3. Histologia. 4. Reprodução - indução I. Título

CDD 636.082

DEDICO

A Deus Ao meu marido Gervázio Aos meus pais Aos meus irmãos Aos meus sogros

OFEREÇO

A todos que contribuíram para este trabalho ser finalizado.

AGRADECIMENTOS

A Deus pelas oportunidades.

Aos meus pais João Carlos e Roseleine, pelo amor dedicado, preocupações e apoio sempre.

A minha irmã Mirella, João Paulo, João Lucas e Victor Hugo, família linda. “Mi” me salvando com o inglês varias vezes.

Ao meu irmão Leonardo, que com muita paciência ensinou truques dos programas de computador.

Ao meu sogro Gervazio, em especial a minha sogra Sulamita, que com suas sábias palavras me confortou nos momentos de angústia.

Ao programa de Pós-graduação em Ciência Animal Tropical da Universidade Federal do Tocantins por ter possibilitado a realização do Curso de Mestrado.

A CAPES, pelo auxilio através da bolsa de estudo.

Aos professores do programa de Pós-graduação.

A Tânia Cavalcante, nos colocando em novos caminhos.

Ao professor Sandro Moron, pela dedicação, conselhos e ensinamentos.

Agradeço aos amigos da turma de mestrado.

A Liana técnica do Laboratório, que se tornou uma amiga, de tanto que a incomodei, ela caiu na tentação da amizade. Ensinou-me muitas coisas preciosas, além de ser uma “super ajudante”.

Por fim, ao meu namorado, amigo, companheiro e marido Gervazio, sem esta pessoa não estaria aqui concluído esta tarefa, pois foi com seu incentivo, dedicação, paciência muita paciência, que permaneci firme e forte. Algumas noites mal dormidas valeram a pena, pois aprendemos coisas que talvez nunca mais vamos ter a oportunidade de presenciar.

Epígrafe

“Iniciativa é fazermos o que está certo sem ser preciso que alguém nos diga para fazermos tal”.

“Nada é tão poderoso no mundo como uma ideia cuja oportunidade chegou.”

Victor Hugo

SUMÁRIO

RESUMO...... 11 ABSTRACT...... 12 LISTA DE TABELAS...... 13 LISTA DE FIGURAS...... 14 CAPÍTULO 1...... 16 1 INTRODUÇÃO ...... 16 2 REVISÃO DE LITERATURA ...... 18 2.1 Espécies progenitoras...... 18 2.1.1 Leiarius marmoratus (macho)...... 18 2.1.2 Pseudoplatystoma punctifer (fêmea) ...... 19 2.2 Taxonomia dos parentais...... 20 2.3 Hibridização...... 21 2. 4 Estratégias reprodutivas aplicadas à aquicultura...... 22 2.5 Desenvolvimento celular de ovários e testículos dos parentais...... 23 2.5.1 Ovários...... 23 2.5.2 Testículos...... 23 REFERÊNCIAS...... 25 CAPÍTULO 2 Morfo-histologia de gônadas de híbridos de leiarius marmoratus x pseudoplatystoma punctifer...... 28 RESUMO ...... 28 ABSTRACT ...... 29 INTRODUÇÃO ...... 30 MATERIAIS E MÉTODOS ...... 32 RESULTADO E DISCUSSÃO ...... 34 CONCLUSÃO...... 45 REFERÊNCIAS ...... 46 CAPÍTULO 3 Extrusão de ovócitos dos híbridos de leiarius marmoratus x pseudoplatystoma punctifer...... 49 RESUMO ...... 49 10

ABSTRACT ...... 50 INTRODUÇÃO ...... 51 MATERIAIS E MÉTODOS ...... 53 RESULTADO E DISCUSSÃO ...... 55 CONCLUSÃO...... 58 REFERÊNCIAS ...... 59 CONSIDERAÇÕES FINAIS...... 59

ASPECTOS REPRODUTIVOS DO HÍBRIDO DE LEIARIUS MARMORATUS X PSEUDOPLATYSTOMA PUNCTIFER

RESUMO

Devido à intensiva produção e uso de híbridos na piscicultura, o estudo em relação a alguns aspectos reprodutivos seja de importância ecológica, pois os híbridos sendo férteis podem concorrer com espécies selvagens e linhagens de seus parentais e provavelmente ocorrer desequilíbrio ecológico. Com a existência deste problema objetivou-se analisar aspectos reprodutivos de híbridos de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer, fornecendo subsidio para reprodução e criação. O primeiro experimento foi realizado para estudar a morfologia e histologia das gônadas, identificando sexo, características morfológicas, a presença e desenvolvimento das células germinativas. As gônadas em todos os exemplares apresentaram estruturas pares, alongadas e posicionadas na cavidade abdominal, revestido pela túnica albugínea. Os juvenis machos e fêmeas apresentaram coloração pálida, característico de gônadas em repouso, pouca irrigação sanguínea. Já as fêmeas adultas apresentaram coloração avermelhada, aumento das gônadas. Dentre as características histológicas observaram nas fêmeas células germinativas em diferentes fases variando de acordo com a idade como ovócitos cromatina- nucléolo, perinucleares, alvéolo cortical e os vitelogênicos, nos machos juvenis encontraram o desenvolvimento até espermatócitos primários. O segundo experimento, procedeu-se a indução para extrusão de gametas, para observação de uma possível produção destes, sendo analisados quanto a sua viabilidade ou não. Não foi possível a identificação de sexo entre os híbridos externamente, sendo aplicada uma única dose de 0.2 mg EBHC/kg em dois peixes, e duas doses os outros 4 peixes sendo uma aplicação de 0.5 mg EBHC/kg de peixe, e após 10 horas de intervalo, 5.0 mg EBHC/kg de peixe. Com a técnica de indução hormonal para extrusão dos ovócitos, observou a produção destes, porém em quantidade mínima (20 g em média), em relação aos parentais (400 g em média), e o mesmo apresentou sangue em seu conteúdo, não foram encontrados machos adultos para fazer a fertilização dos ovócitos. Devido à presença de células germinativas em diferentes fases, verificados pelos cortes histológicos, os híbridos de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer, demonstram ser aptos à reprodução, e observou-se a produção de ovócitos ao fazer a extrusão induzida, porém são necessários mais estudos relacionados.

Palavras-chave: gametas; gônadas; histologia; reprodução; indução.

REPRODUCTIVE ASPECTS HYBRID OF LEIARIUS MARMORATUS X PSEUDOPLATYSTOMA PUNCTIFER

ABSTRACT

Due to the intensive production and use of hybrids in fish farming, the study in relation to some reproductive aspects of ecological importance, because hybrids being fertile can compete with wild species and strains of their parental leave and probably occur ecological imbalance. With the existence of this problem was to analyze the reproductive aspects of hybrid Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer, providing subsidy for breeding and rearing. The first experiment was conducted to study the morphology and histology of the gonads, identifying sex, morphological characteristics, the presence and development of germ cells. The gonads in all specimens showed paired structures, elongated and positioned into the abdominal cavity, covered by tunica albuginea. The young males and females have pale coloring, characteristic of gonads in home, little blood supply. The females have reddish, increase of the gonads. One of the histological characteristics observed in females germ cells at different stages varying according to the age as oocytes chromatin-nucleolus, cortical alveolus and the perinuclear, vitellogenic, juvenile males found the development up to primary spermatocytes. The second experiment was conducted for induction, gamete extrusion for observation of a possible production of these, being analyzed for its viability or not. It has not been possible to identify sex between hybrids externally, being applied to a single dose of 0.2 mg EBHCkg in two fish, and two doses of the other 4 being a fish 0.5 mg EBHCkg fish, and after 10:0 5.0 mg range, EBHCkg of fish. With the hormonal Induction technique for extrusion of oocytes, noted the production of these, however in minimum quantity (20 g on average), in relation to parental leave (400 g on average), and the same presented blood in your content, not adult males were found to make fertilization of oocytes. Due to the presence of germ cells in different phases, verified by histological hybrid of Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer, demonstrate be able to playback, and noted the production of oocytes by induced extrusion, but further studies are needed.

Keywords: gametes; gonads; histology; reproduction; induction

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 2 - Morfo-histologia de gônadas de híbridos de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer Tabela 1 – Médias dos pesos e tamanhos dos peixes e gônadas de híbridos de Leiarius marmoratus (macho) x Pseudoplatystoma punctifer (fêmea) ...... 36 Tabela 2 – Média do número de ovócitos, nos diferentes estágios de desenvolvimento analisados histologicamente em ovários de híbridos de Leiarius marmoratus (macho) x Pseudoplatystoma punctifer (fêmea) ...... 44 Tabela 3 – Média do índice gonadossomático de machos e fêmeas de híbridos de Leiarius marmoratus (macho) x Pseudoplatystoma punctifer (fêmeas)...... 44

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 1 Figura 1- Leiarius marmoratus (macho)...... 19 Figura 2- Pseudoplatystoma punctifer (fêmea) ...... 20

CAPÍTULO 2 - Morfo-histologia de gônadas de híbridos de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer Figura 1– Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer...... 32 Figura 2- cortes histológicos de gônadas de alevinos Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 7 dias: Vista geral contendo: células somáticas (CS), células volumosas (CV) e células germinativas primordiais (CGP), vasos sanguíneos (VS). Coloração hematoxilina/eosina, obj: 20x...... 34 Figura 3 - cortes histológicos de gônadas de alevinos Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 7 dias: células volumosas (CV), células somáticas (CS); vasos sanguíneos (VS). Coloração hematoxilina/eosina, obj: 40x...... 35 Figura 4 - cortes histológicos de gônadas de alevinos Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 14 dias: células volumosas (CV), células somáticas (CS), células germinativas primordiais, (CGP). Coloração hematoxilina/eosina, obj: 40x...... 35 Figura 5 - Cortes histológicos de testículos de Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 9 meses: túbulos seminíferos (TB), túnica albugínea (TA). Coloração hematoxilina/eosina, obj: 20x...... 38 Figura 6 - Cortes histológicos de testículos de Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 9 meses: espermatogônias primárias (SGP) espermatogônias secundárias (SGS), espermatócitos primários (SCP) espaço intersticial (INT), vasos sanguíneos (VS).Coloração hematoxilina/eosina, obj: 40x..38 Figura 7 - Cortes histológicos de testículos de Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 9 meses: espermatogônias primárias (SGP), espermatogônias secundárias (SGS), espermatócitos primários (SCP), célula de Sertoli (SE), túbulos seminíferos (TB), espaço intersticial (INT). Coloração hematoxilina/eosina, obj: 40x...... 39 15

Figura 8 - Cortes histológicos de ovários de Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de juvenis: vista geral do ovário; Túnica albugínea (TB), lamelas ovulígeras (LO). Coloração azul de toluidina, obj: 20x...... 40 Figura 9 - Cortes histológicos de ovários de Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer 9 meses: Ovócitos cromatina-nucléolo (OCN), lúmen

(LM), vasos sanguíneos (VS). Coloração hematoxilina/eosina, obj: 40x...... 41 Figura 10 - Cortes histológicos de ovários de Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 16 meses: ovócitos perinucleares (OP), ovócitos alvéolo cortical, em inicio de formação (OAC), n=núcleo, N= nucléolo. Coloração hematoxilina/eosina, obj: 40x...... 41 Figura 11 - Cortes histológicos de ovários de Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 3 anos: vista geral do ovário. Ovócitos perinucleares (OP), ovócitos alvéolo cortical, ovócito maduro (OM). Coloração hematoxilina/eosina, obj: 20x...... 42 Figura 12 - Cortes histológicos de ovários de Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 3 anos: Ovócitos alvéolo cortical (OAC), ovócito maduro (OM). Coloração hematoxilina/eosina, obj: 40x...... 42 Figura 13 - Cortes histológicos de ovários de Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 3 anos: Ovócitos maduros (OM). Coloração hematoxilina/eosina, obj: 20x...... 43 Figura 14 - Cortes histológicos de ovários de Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 3 anos: Ovócito maduro (OM), micrópila (MC). Coloração hematoxilina/eosina, obj: 100x...... 43 CAPÍTULO 3 - Extrusão de ovócitos dos híbridos de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer Figura 1 – Canulação - técnica utilizada para verificar a presença de ovócitos antes da aplicação hormonal ...... 53 Figura 2 - Extrusão de ovócitos de Pseudoplatystoma punctifer ...... 55 Figura 3 - Extrusão de ovócitos de híbridos de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer, com presença de sangue em seu conteúdo ...... 56

1 INTRODUÇÃO

A cadeia produtiva aquícola, na última década, teve um crescimento superior ao da bovinocultura, avicultura e suinocultura, superando todas as expectativas traçadas pelos especialistas. No Brasil, segundo dados da FAO (2012), em 2000 a produção de peixes de água doce foi de 317,756 t, passando em 2010 para 630,828 t. O consumo per capita, em 2000 foi de 6,71 kg/hab/ano, em 2010 foi 9,75 kg/hab/ano (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística- IBGE, 2009), sendo que as estimativas para 2015 são de 19 kg/hab/ano (FAO, 2012). Mesmo com este ritmo de crescimento na produção e no consumo, a piscicultura, apresentou alguns pontos negativos, como na sua manutenção, a qual é critica, pois à medida que a criação vem se desenvolvendo, é preciso ter um nível mínimo de técnicas de aprimoramento, tanto para escala familiar como para alta produtividade. E esta deve ser acompanhada de uma estrutura comercial adequada para que o escoamento da produção seja eficiente (RESENDE, 2007). Os países tropicais e subtropicais, os quais apresentam condições ecológicas favoráveis para esta criação, são de suma importância para a expansão. Com isto o Brasil e outros países poderão predominar futuramente, na produção mundial dentro da aquicultura. Sendo que hoje esta predominância é por parte dos países asiáticos, sendo a sua produção dos peixes de água doce de 38.024 574 t (FAO, 2012). Tendo em vista este crescimento previsto, devemos nos ater as alterações ambientais do habitat natural, como variações climáticas, desmatamento de matas ciliares, assoreamento, poluição das águas entre outras, pois estas podem ser responsáveis pela extinção de muitas espécies e em consequência reduzir a biodiversidade. Os efeitos observados em rios e lagos podem ser resultados de tais atividades antrópicas. Entre estas, a de maior impacto, é a construção de barragens, pois estas impedem a reprodução dos peixes migradores, e modificam o ambiente drasticamente. Todas estas resultam em modificações estruturais do ecossistema aquático afetando a disponibilidade de recursos como abrigo, alimento e locais de reprodução (MARQUES et al., 2006). Considerando-se a grande diversidade das espécies de peixes e consequente diferenciação morfofisiológica, a reprodução apresenta-se, como uma relevante área de estudo, devido a suas particularidades. 17

Mesmo com o aprimoramento das técnicas de reprodução, alimentação e manejo na piscicultura, muitos problemas relacionados à alimentação, qualidade da água, doenças infecciosas e parasitárias acarretam significativos prejuízos econômicos e precisam ainda ser resolvidos, principalmente com relação às fases iniciais do cultivo de espécies nativas, que acarreta altas taxas de mortalidade (MACIEL, 2006). Como exemplo, temos as inovações tecnológicas mal empregadas, como a hibridização, cruzamentos entre linhagens dentro de uma mesma espécie quanto entre indivíduos de espécies diferentes, técnica esta que traz riscos para a biodiversidade em longo prazo. Nos últimos anos vem ocorrendo um aumento na prática de cruzamentos entre espécies de peixes neotropicais nas pisciculturas, dando a origem dos “híbridos” como o cruzamento entre Leiarius marmoratus (macho) x Pseudoplatystoma punctifer (fêmea), sendo o descendente objeto deste estudo e analisado no trabalho. A aplicação da hibridização é utilizada no sistema de manejo visando produzir animais que possam obter melhor desempenho que as espécies parentais, como o aumento da taxa de crescimento, melhor qualidade da carne, resistência a doenças e capacidade de tolerar variações ambientais, além do aperfeiçoamento de diversas outras características a fim de produzir peixes mais proveitosos para o cultivo (QUAGGIO et al., 2009). Existem algumas questões ainda não respondidas em relação aos híbridos produzidos a partir de espécies nativas, por exemplo, é uma espécie na qual, machos e fêmeas são capazes de se reproduzir? Deve-se, também, considerar a importância de pesquisar as características mais abrangentes que possa fornecer conhecimento sobre os híbridos, como a histomorfologia do aparelho reprodutor de machos e fêmeas definindo questões reprodutivas, resaltando a fertilidade, característica esta que causa impacto ambiental, assim como corroborar com pesquisas de impacto ambiental, que podem ser causados pela exploração dos híbridos e pelo seu escape para o meio ambiente. Esses fatos e a falta de dados morfológicos das gônadas traçam o objetivo deste estudo, que por meio de análises morfológicas, histológicas e análise de fertilização dos gametas, corroborarão para elucidar aos produtores, pesquisadores e ambientalistas sobre essa espécie que vem ganhando destaques nas pisciculturas, principalmente no Estado do Tocantins.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Espécies progenitoras

2.1.1 Leiarius marmoratus (macho)

Leiarius marmoratus (Figura 1) conhecido popularmente no Brasil por Jundiá do Norte, e na Colômbia por Yaque, é encontrado na América do Sul: no Brasil no Amazonas e no Rio Orinoco localizado na Colômbia. Seu comprimento máximo é de 100 cm, podendo pesar até 12,0 kg, com tempo de vida desconhecido. É um peixe de couro, habita leitos, lagos e poços profundos. Jovem e adultos juntos formam grandes cardumes. Preferem se posicionar sobre as rochas e troncos de árvores que se encontram nos leitos dos rios, durante o dia, sendo mais ativos ao amanhecer, entardecer e noite. Vive em clima tropical com temperatura que varia entre 24°C – 26°C (FISHBASE, 2012). Em peixes jovens, os barbilhões maxilares são muito longos e formam anéis pretos e brancos. Quando crescem, sua barbela encurtará em proporção ao seu tamanho, e os lobos da nadadeira caudal, que são arredondados nos jovens, tornam-se muito mais aguçados. Ao envelhecer, escurece e suas manchas escuras se desenvolvem a um padrão de mármore, possuem uma grande barbatana dorsal, como uma vela. Não apresentam diferenças sexuais externas (FISHBASE, 2012). Animais considerados onívoros, por sua preferência alimentícia, o que acarreta em benefícios no cruzamento com animais carnívoros como os do gênero Pseudoplatystoma, como a diminuição do canibalismo nas fases iniciais de crescimento (MATEO, 2008). Estudos relatam que o Leiarius marmoratus tem uma adaptação ao confinamento e ao consumo de dietas secas, com resultados preliminares de um bom crescimento nos primeiros estágios de vida, quando submetidos a processos de adaptação à dieta úmida tornando-o um animal de interesse econômico (CASALLAS et al., 2008). Estes apresentam características que são apreciadas na piscicultura, tem uma excelente qualidade de carne branca, poucos espinhos, sabor e textura apreciáveis, aumentando o valor gastronômico (SÁNCHEZ, 2009). 19

Figura 1- Leiarius marmoratus (macho). Fonte: http://www.planetcatfish.com

2.1.2 Pseudoplatystoma punctifer (fêmea)

Os surubins são peixes considerados de grande valor econômico no Brasil, pois também possuem carne com qualidades apreciadas como baixo teor de gordura e ausência de espinhos. Os Pseudoplatystoma sp, são popularmente conhecidos como surubim ou cachara (ROMAGOSA et al., 2003). Estes são encontrados nas principais bacias hidrográficas Sul Americanas (CREPALDI et al., 2006). O Pseudoplatystoma punctifer (Figura 2), mais precisamente na bacia amazônica, nos estados do Pará, Acre, Rondônia, Mato Grosso, Maranhão e Piauí (LUCA, 2010). É um peixe que possui hábito noturno e estritamente piscívoro, este pode chegar a 100 kg, as fêmeas podem crescer mais que os machos (CREPALDI et al., 2006). Possuem o corpo com pigmentação escura acinzentada, podendo variar em algumas regiões do corpo em esbranquiçada a amarelada, as manchas podem variar entre listras e circulos dependendo da espécie. Sua alimentação em ambiente natural é constituída de peixes, a migração entre rios, e profundidades é motivada pela alimentação e reprodução. Sua reprodução é nos leitos dos rios e em época chuvosa (ROMAGOSA et al., 2003). 20

A diminuição dos estoques naturais vem impulsionando sua produção em cativeiro. As principais limitações para a criação em sistema intensivo (tanques rede) e semi-intensivo (tanque escavado) estão relacionadas com a sua reprodução, e a nutrição principalmente de fases jovens. Estes passaram a merecer mais atenção de piscicultores, pois estão despertando o interesse dos consumidores e de instituições privadas para a produção (LUCA, 2010).

Figura 2 - Pseudoplatystoma punctifer (fêmea).

2.2 Taxonomia dos parentais (FISHBASE, 2012)

 Reino Animália Filo Chordata Classe Actinopterygii Ordem Siluriforme Família Pimelodidae Gênero Leiarius Espécie Leiarius marmoratus

 Reino Animália Filo Chordata Classe Actinopterygii Ordem Siluriforme Família Pimelodidae Gênero Pseudoplatystoma Espécie Pseudoplatystoma punctifer 21

2.3 Hibridização

De acordo com Quaggio et al. (2009), hibridização é considerada uma fusão de dois patrimônios genéticos diferentes, cujos produtos podem apresentar caracteres taxonômicos intermediários. A hibridação natural é considerada um fenômeno que tem um importante papel para a evolução dos organismos, podendo produzir genótipos que estabeleçam novas linhagens evolutivas. Hibridização é diferenciada, de acordo com os animais que estão sendo cruzados, podendo ser intraespecífica: indivíduos da mesma espécie, mas de variedades diferentes; a interespecífica: entre espécies diferentes, mas do mesmo gênero; intergenérica: entre espécies de gêneros diferentes, como entre surubins do gênero Pseudoplatystoma e o jundiá amazônico Leiarius marmoratus (FERNANDES, 2010). Porém, a desvantagem está relacionada com os riscos genéticos em estoques cultivados, como a contaminação genética, nos estoques selvagens. O impacto genético varia de intensidade, conforme os produtos híbridos sejam estéreis, parcial ou totalmente férteis, ou ainda, caso sejam provenientes de parentais nativos ou exóticos. O impacto genético mais sério pode ocorrer quando híbridos artificiais totalmente férteis são introduzidos em ambientes naturais onde já existam os parentais selvagens; ou quando são produzidos híbridos férteis naturais, em decorrência da introdução já estabelecida historicamente. Também podem competir de diversas formas com as linhagens parentais (GUAGGIO et al., 2009). As diversas formas de competição com os parentais vão desde, concorrer por alimentos e espaço, como também com práticas de cópulas mal sucedidas com perda de gametas dos parentais ou pela inviabilidade de gametas dos híbridos e até mesmo produzindo descendentes viáveis que em longo prazo, poderá interferir na reprodução dos parentais (TOLEDO-FILHO et al., 1996). Assim, torna-se necessário estudo sobre a biologia reprodutiva dos peixes híbridos e do impacto ambiental que estes podem causar (FAUSTINO et al., 2007 ). Esta técnica está sendo utilizada no sistema de manejo das grandes pisciculturas, pois visam produzir animais que possam obter melhor desempenho que as espécies parentais (vigor híbrido), como o aumento da taxa de crescimento, melhor qualidade da carne, resistência a doenças e capacidade de tolerar variações 22

ambientais, além do aperfeiçoamento de diversas outras características a fim produzir peixes mais proveitosos para o cultivo (TOLEDO-FILHO et al., 1994). Têm-se dificuldades em relação à hibridação artificial, devido à falta de informações básicas sobre os seus descendentes, caso estes sejam férteis, do mesmo modo ter conhecimento de quais são os benefícios que os híbridos podem gerar (TOLEDO-FILHO et al., 1994). O uso do híbrido requer alguns cuidados, que devem ser tomados para que este indivíduo em longo prazo possa fazer parte das espécies registradas no banco de dados da FAO. Entre estes, temos relatórios sobre a produção híbrida de longo prazo, informações de estoque e sexo de todas as espécies parentais, uma avaliação comparativa dos cruzamentos recíprocos, descrição básica da instalação da cultura ou meio ambiente, e uma avaliação da fertilidade dos híbridos (BARTLEY, 2001).

2. 4 Estratégias reprodutivas aplicadas à aqüicultura

Teleósteos em geral desenvolvem estratégias reprodutivas, para aproveitamento máximo do ambiente, contendo estes características que influenciam nestas, como o desenvolvimento de ovócitos e espermatozoides em sexos separados, liberação dos ovócitos no meio aquático onde serão fertilizados. Os embriões evoluem sem auxílio dos pais e contam com o suporte dos nutrientes do vitelo ovocitário para seu desenvolvimento larval o qual se completa na pós-larva após a eclosão (GODINHO, 2007). São peixes que apresentam o tipo de fertilização externa, onde os ovócitos são liberados pelas fêmeas no meio e posteriormente fecundado pelos machos, com a liberação de sêmen sobre os ovócitos. Os teleósteos são peixes que apresentam mais de uma desova e espermiação ao longo da sua vida reprodutiva (BALDISSEROTTO, 2009). Apresentam fecundidade elevada, desova total e um período curto de reprodução, o qual ocorre em épocas do ano que são favoráveis para a prole como: rio cheio, água corrente e oxigenada, onde propicia o desenvolvimento larval, transporte dos ovócitos, que não são adesivos, e das larvas para locais onde ficam protegidos e com disponibilidade alimentícia quando necessária. A reprodução 23

ocorre nos meses do ano em que o nível de chuvas aumenta, sendo mais provável nos meses de dezembro a fevereiro (REZENDE, 1995).

2.5 Desenvolvimento celular de ovários e testículos dos parentais 2.5.1 Ovários A diferenciação das células dos ovários ocorre em 4 fases, podendo observar nestas diferentes tipos de células, em repouso: ovários finos e transparentes, pequeno volume contendo apenas ovócitos cromatina nucléolo e perinuclear. Maturação inicial: ovários estão volumosos, aumento da vascularização, ovócitos alvéolo cortical, ovócitos vitelogênicos, e com alguns visíveis a olho nu. Maturação final: os ovários amarelos, volume máximo, vascularização evidente, ovócitos pós vitelogênicos, visíveis a olho nu. Na regressão ou pós-desova: Ovários hemorrágicos e flácidos, com raros ovócitos opacos, presença de ovócitos atrésicos (CREPALDI, 2008). As fases de maturação são descritas a seguir: Desenvolvimento I: O epitélio germinativo apresenta ninhos de oogônias e ovócitos e lamelas ovígeras com ovócitos cromatina nucléolo variáveis em tamanho. Desenvolvimento II: As lamelas ovígeras, com maior porcentagem de ovócitos cromatina nucléolo, ovócitos perinuclear, e oogônias em menor quantidade. Desenvolvimento III: Ovário maior, com a presença de ovócitos alvéolo cortical, este já são visíveis a olho nu, pelo tamanho que possuem. Desenvolvimento IV: Predomina a presença de ovócitos pré vitelogênicos, com poucos ovócitos alvéolo cortical e ovócitos perinuclear. Desenvolvimento V: Os ovários estão em tamanho máximo, ocupando quase que por completo a cavidade abdominal, as células predominantes são os ovócitos vitelogênicos, com seu citoplasma totalmente ocupado por grânulos de vitelo. Após a desova os ovários se tornam flácidos, com ovócitos vitelogênicos residuais (KUNKEL, 1996).

2.5.2 Testículos Nos testículos a maturação ou espermatogênese ocorre a partir do desenvolvimento das células germinativas que é sincrônico e este passa por várias etapas. 24

Ao longo do ciclo reprodutivo, as alterações do epitélio germinativo e os estágios das células germinativas presentes nos cistos determinam cinco fases reprodutivas: Regredida: O epitélio germinativo apresenta-se contínuo, formado apenas por espermatogônias e células de Sertoli. A luz tubular mantém-se dilatada e contém espermatozoides residuais. Desenvolvimento inicial: O epitélio germinativo, contínuo, é formado por cistos de espermatogônias e espermatócitos. A proliferação dos cistos, projetando- se em direção ao lúmen, torna o epitélio pseudoestratificado. Desenvolvimento intermediário: Os cistos contendo as células mais diferenciadas (espermatócitos e espermátides) posicionam-se na região apical (voltados para a luz) enquanto aqueles contendo células germinativas menos diferenciadas (espermatócitos e espermatogônias) ocupam uma posição mais basal. O epitélio germinativo é predominantemente contínuo e o interstício é reduzido. Desenvolvimento final: A luz dos túbulos, irregular e dilatada, é preenchida por espermatozoides. O epitélio germinativo torna-se descontínuo com a abertura gradual dos cistos contendo espermatozoides. Regressão: O epitélio germinativo, descontínuo, apresenta cistos remanescentes vacuolizados e o interstício mostra-se espessado. Grande quantidade de macrófagos aparece na luz tubular, irregularmente preenchida por espermatozoides (GODINHO et al., 2005). Este órgão tem a função androgênica que é importante para a diferenciação sexual, o desenvolvimento das características sexuais secundárias e comportamento sexual, e para a regulação da espermatogênese (LÓPEZ et al., 2006).

REFERÊNCIAS

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CAPÍTULO 2

MORFO-HISTOLOGIA DE GÔNADAS DE HÍBRIDOS DE LEIARIUS MARMORATUS X PSEUDOPLATYSTOMA PUNCTIFER

RESUMO

Objetivou-se analisar aspectos reprodutivos de fêmeas e machos de híbridos de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer, fornecendo subsidio para a criação. Estudaram-se características anatômicas e morfo-histológicas, utilizou-se 31 animais de diferentes idades para análises. Registrou a biometria dos animais e em seguida foram anestesiados com Benzocaína (1g de benzocaína/10 ml de álcool etílico/10 litros de água) para a coleta das gônadas. Logo após, realizou-se uma incisão ventral em cada exemplar para observação de características anatômicas. Após este procedimento, os fragmentos das gônadas passaram por rotina histológica com inclusão em parafina. Os cortes histológicos de 4µm foram corados com eosina/hematoxilina e toluidina, selecionados três lâminas aleatoriamente, e observados três campos em microscopia de luz. Nas fêmeas observaram 10 campos aleatórios para contagem dos ovócitos. As gônadas em todos os exemplares apresentaram estruturas pares, alongadas e posicionadas na cavidade abdominal, revestido pela túnica albugínea. Nos machos juvenis encontrou espermatócitos primários, nas fêmeas juvenis, ovócitos cromatina-nucléolo e nas fêmeas adultas, ovócitos cromatina-nucléolo, perinucleares, alvéolo cortical e os vitelogênicos que estavam visíveis em vários tamanhos. Devido à presença de ovócitos em diferentes fases, e espermatócitos primários, verificados pelos cortes histológicos, demonstraram que estes peixes podem ser férteis, porém necessitam-se mais estudos em relação à fertilidade.

Palavras–chave: adultos, desova, fertilidade, gônadas, juvenis, peixes.

MORPHO-HISTOLOGY OF GONADS OF HYBRIDS LEIARIUS MARMORATUS X PSEUDOPLATYSTOMA PUNCTIFER

ABSTRACT

Aimed to analyze aspects of reproductive females and males of hybrids of Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer, providing subsidy for the production. Studied anatomical and morpho-histological characteristics-31 used animals of different ages for analysis. Recorded the biometrics of the animals and then were anesthetized with Benzocaine (1 g benzocaína10 ml of alcohol etílico10 liters of water) for the collection of the gonads. Soon after, a ventral incision in each copy for observation of anatomical features. After this procedure, the fragments of the gonads gone through histological routine with inclusion in paraffin. The histological cuts of 4 µm were stained with toluidine, eosina/hematoxilina and selected three blades randomly, and observed three fields in light microscopy. In females observed 10 random fields for count of oocytes. The gonads in all specimens showed paired structures, elongated and positioned into the abdominal cavity, covered by tunica albuginea. Juvenile in males found primary spermatocytes, female juvenile oocytes nucleolus-chromatin, females adult oocytes nucleolus-chromatin, cortical alveolus and the perinuclear, vitellogenic that were visible in various sizes. Due to the presence of oocytes at different stages, and primary spermatocytes, verified by histological sections, have shown that these fish can be fertile, but require more studies in relation to fertility.

Keywords: adult, spawning, fertility, gonads, juveniles, fishes.

INTRODUÇÃO

As características morfológicas e histológicas de ovários e testículos de peixe indicam em qual estado reprodutivo se encontra o exemplar, podendo através destas traçar o ciclo reprodutivo, facilitando e aprimorando o uso de técnicas reprodutivas (ZANIBONI-FILHO 2007). O ovário, na maioria dos peixes teleósteos, é um órgão de estrutura dupla, em forma de saco oco com várias dobras alinhadas pelo epitélio germinal, é envolvido por uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso, a partir do qual se projetam as lamelas ovígeras, que delimitam o lúmen ovariano. O epitélio germinativo das lamelas é constituído por células da linhagem germinativa (oogônias e oócitos em diferentes fases de maturação) envolvidas por células somáticas (LÓPEZ et al., 2006). Os teleósteos apresentam dois tipos de ovários, os giminovários onde a ovulação ocorre na cavidade celomática, e o cistováriano onde a ovulação ocorre no ambiente por possuir um oviduto contínuo (McMILLAN, 2007). Os testículos das espécies parentais do híbrido estão localizados na cavidade celomática, dorsalmente ao tubo digestivo, ventralmente ao longo da bexiga natatória. Estas estruturas são pares, na maioria dos peixes, podendo estar parcial ou totalmente fundidos entre si, apresentam usualmente tamanho similar entre o direito e o esquerdo, este tamanho podendo variar de acordo com o estádio de maturação, e são frequentemente alongados (BATLOUNI et al., 2006). A estrutura histológica dos testículos de teleósteos é tubular seminífera cística, sendo que as células se desenvolvem em túbulos de forma cística, havendo nestes todos os tipos de células germinativas nas suas diferentes fases (AIRES, 2000). Externamente, o testículo é revestido por delicada cápsula de tecido conjuntivo, a túnica albugínea, da qual partem septos fibrosos em sentido radial, delimitando os túbulos seminíferos. Estes túbulos convergem para um sistema de ductos eferentes, que por sua vez desembocam no ducto espermático principal, que se unirá ao ducto espermático principal do outro testículo, formando um ducto único que desemboca na papila urogenital (BALDISSEROTTO, 2009). Com o crescente interesse na criação de híbridos de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer, há necessidade de se obter cada vez mais 31

informações, sobre sua biologia e reprodução. A determinação das fases reprodutivas nas fêmeas, baseados no estágio de desenvolvimento do ovário, e machos através das alterações dos estágios das células germinativas constitui informações para a caracterização da biologia reprodutiva dos peixes. Considerando esses fatos e a falta de dados morfológicos das gônadas traçou-se o objetivo deste estudo que foi conhecer as características histológicas e morfométricas, fornecendo subsidio para a criação.

MATERIAIS E MÉTODOS

O experimento foi conduzido no laboratório de morfologia e bioquímica da Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal do Tocantins. Os híbridos (Figura 1) descendentes do cruzamento de Leiarius marmoratus (macho) x Pseudoplatystoma punctifer (fêmea) são oriundos da fazenda São Paulo, localizada no Município de Brejinho de Nazaré – TO.

Figura 1 – Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer.

Foram utilizados 31 híbridos de diferentes idades, coletados em épocas diferentes: 5 peixes com 7 dias e 5 peixes com 14 dias, coletados em dezembro de 2011, 10 peixes com 9 meses, coletados em março de 2011, 4 peixes com 16 meses coletados em fevereiro de 2012 e 7 peixes com 3 anos, coletados em maio de 2011. Após a coleta, os peixes foram eutanaziados com Benzocaína (0,5 ml benzocaína/l água), em seguida, realizou-se uma incisão ventral longitudinal ampla em cada exemplar para observação das características morfológicas das gônadas: a sua posição anatômica em direito (D) e esquerdo (E), localização na cavidade abdominal e coloração. Em seguida, realizou a dissecação das gônadas, e a biometria, sendo esta realizada com auxílio de um paquímetro, verificando o comprimento (mm) no eixo maior, largura (mm) no eixo menor; pesados (g) 33

individualmente, e aferido o IGS (índice gonadossomático) pelo cálculo (Peso da Gônada / Peso Corporal X100). Fragmentos dos testículos e dos ovários foram retirados e processados para estudos de microscopia de luz. Devidamente identificados e colocados em Solução de Bouin por um período de 24 horas e submetidos à rotina de preparação histológica onde foram desidratados, diafanizados, incluídos em parafina e cortados a 4µm e posteriormente corados por hematoxilina-eosina e toluidina. Para análise dos cortes histológicos, observou três lâminas aleatoriamente de cada animal coletado. Para cada lâmina, foram escolhidos três campos para estudo em microscopia de luz, analisando as células existentes e o desenvolvimento das células germinativas, na presença de células germinativas, selecionou-se 10 campos aleatórios para observação e contagem de gametas. As secções foram examinadas e foto micrografadas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os híbridos de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer não apresentaram dimorfismo sexual, sendo comum esta ausência na maioria dos peixes deste gênero. As características externas que indicam maturidade ou sexo não são aparentes em alguns peixes, principalmente a estágios anteriores ao de maturação final. A diferenciação de sexo quando feita por métodos tradicionais e a análise do estágio reprodutivo são realizadas através do abaulamento e flacidez da parede celomática, abaulamento e coloração rósea intensa da papila urogenital. (CREPALDI et al., 2006a). Histologicamente, animais de 7 e 14 dias não apresentaram células reprodutivas desenvolvidas, possuindo estes somente células somáticas, volumosas e germinativas primordiais, as quais não permitem a diferenciação de sexo, que é feito através da visualização de células germinativas que já iniciaram a gametogênese (Figura 2, 3 e 4). De acordo com Silva (1996) analisando o desenvolvimento ontogenético de bagres, sob condições laboratoriais, a diferenciação das células germinativas ocorre aproximadamente aos 50 dias após se tornarem alevinos, diferenciando em oogônias e espermatogônias.

Figura 2 - cortes histológicos de gônadas de alevinos Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 7 dias: Vista geral contendo: células somáticas (CS), células volumosas (CV) e células germinativas primordiais (CGP), vasos sanguíneos (VS). Coloração hematoxilina/eosina, obj: 20x. 35

Figura 3 - cortes histológicos de gônadas de alevinos Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 7 dias: células volumosas (CV), células somáticas (CS); vasos sanguíneos (VS). Coloração hematoxilina/eosina, obj: 40x.

Figura 4 - cortes histológicos de gônadas de alevinos Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 14 dias: células volumosas (CV), células somáticas (CS), células germinativas primordiais, (CGP). Coloração hematoxilina/eosina, obj: 40x. 36

Através da análise microscópica para diferenciação celular, observou-se que entre os peixes de 9 meses havia 6 fêmeas e 4 machos, os de 16 meses e 3 anos eram fêmeas. Médias de pesos e tamanhos dos peixes e gônadas estão na tabela 1. Tabela 1 – Médias de pesos e tamanhos dos peixes e gônadas de híbridos de Leiarius marmoratus (macho) x Pseudoplatystoma punctifer (fêmea). Idade 7 dias 14 dias 9 meses 16 meses 3 anos Sexo SDS¹ SDS¹ Fêmeas Machos Fêmeas Fêmeas Peso corpo (g) 1,83 20,32 1,760 1,875 2,95 4,61

Comprimento 5,2 15,32 57,5 60,5 61,5 68,85 corpo (cm)

Peso D² 0,036 D² 0,386 D² 0,388 D² 0,743 D² 4,75 D² 9,21 gônada (g) E³ 0,029 E³ 0,340 E³ 0,335 E³ 0,482 E³ 4,35 E³ 9,10

Comprimento D² 0,4 D² 0,68 D² 3,15 D² 3,75 D² 4,75 D² 5,9 gônada (cm) E³ 0,3 E³ 0,6 E³ 3,18 E³ 3,4 E³ 4,35 E³ 6,17 ¹ sem definição de sexo, ² direito, ³ esquerdo.

Medidas de peso e comprimento do corpo podem diferenciar animais em primeira e segunda maturação gonadal, as fêmeas adultas dos híbridos encontra-se em tamanho semelhante, a de fêmeas Pseudoplatystoma punctifer em primeira maturação, analisadas por Luca (2010), podendo ser consideradas fêmeas de primeira maturação. Estes resultados equiparam-se aos encontrados por Resende et al. (1995). Porém diferenciam-se dos resultados encontrados por Romagosa et al. (2003 a), analisando Pseudoplatystoma fasciatum, em cativeiro, onde encontrou fêmeas de primeira maturação com 37,65 cm. Crepaldi et al. (2006a), questiona o uso desses parâmetros, pois a maturação gonadal depende de outros fatores, como disponibilidade de alimento, ambiente, temperatura de água e clima, para que sejam alcançadas, sendo esta maturação mais tardia ou não. Exemplares machos e fêmeas de todas as idades apresentaram estruturas pares do mesmo tamanho, alongadas, posicionadas em direito e esquerdo na cavidade abdominal, presos à linha sagital mediana por um mesovário, dorsalmente ao intestino. Comparando os resultados com seus parentais, observou-se que os 37

híbridos têm características semelhantes na disposição e anatomia dos órgãos reprodutores (CREPALDI et al., 2006b; CHAVES, 2011).

- Análise histológica dos testículos

Os testículos dos 4 machos encontrados são classificados como tubulares, comum na maioria dos teleósteos (Figura 5). Os espermatócitos estão distribuídos ao longo dos testículos conforme observação de Luca (2010), em Pseudoplatystoma punctifer. Com coloração pálida, característico de gônadas imaturas, pouca irrigação sanguínea, e sem a presença de franjas, que os Siluriformes apresentam ao longo de seu comprimento, mudando as características de acordo com o ciclo em que o peixe se encontra, como encontrado por Andrade (2007) e Brito (2003) analisando Pseudoplatystoma corruscans e por Luca (2010) em Pseudoplatystoma punctifer. Os testículos dos peixes não se diferenciam consideravelmente como os ovários nas suas características, cor, tamanho, forma, volume e peso, durante as fases de reprodução (NAKAGHI, 2003). Histologicamente, os testículos estão revestidos pela túnica albugínea. Estes apresentam túbulos seminíferos com lúmen fechados (Figura 5), os quais emitem septos formando o ducto espermático que se une ao orifício urogenital. Quanto às células germinativas nos híbridos, observa-se a presença de pequena quantidade das espermatogônias e espermatócitos primários (Figura 6 e 7), não se observou espermatozoides nos híbridos, devido estes terem 9 meses e apresentarem estágio inicial de desenvolvimento dos testículos, porém evidenciou estágios celulares que antecedem à formação dos mesmos. Segundo Parra (2005), o desenvolvimento das células germinativas masculinas diferencia-se em: espermatogônias, espermatócitos, espermátides e por fim, espermatozoides. As espermátides são relativamente menores que os espermatócitos, e pelo processo de espermiogênese se transformam em espermatozoides.

Figura 5 - Cortes histológicos de testículos de Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 9 meses: túbulos seminíferos (TB), túnica albugínea (TA). Coloração hematoxilina/eosina, obj: 20x.

Figura 6- Cortes histológicos de testículos de Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 9 meses: espermatogônias primárias (SGP) espermatogônias secundárias (SGS), espermatócitos primários (SCP) espaço intersticial (INT), vasos sanguíneos (VS), túbulos seminíferos circulados.o Coloração hematoxilina/eosina, obj: 40x. 39

Figura 7 - Cortes histológicos de testículos de Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 9 meses: espermatogônias primárias (SGP), espermatogônias secundárias (SGS), espermatócitos primários (SCP), célula de Sertoli (SE), túbulos seminíferos (TB) circulados, espaço intersticial (INT). Coloração hematoxilina/eosina, obj: 40x.

- Análise histológica dos ovários

Os ovários dos peixes das diferentes idades (9 e 16 meses, 3 anos) apresentaram características semelhantes entre si, havendo diferença morfológica somente no tamanho dos mesmos. A coloração avermelhada e translúcidas dos ovários, nos peixes de 9 e 16 meses correspondem com estágio inicial de maturação. Estas características também foram analisadas em Pseudoplatystoma corruscans, no estágio inicial de maturação dos ovários (CREPALDI, 2008). Espécimes com 3 anos observaram ovários mais espessos e com coloração mais clara, indicando a presença de ovócitos como em Pseudoplatystoma corruscans (CREPALDI, 2008), e Brycon orbignyanus (GANEGO, 2001). Histologicamente os ovários são semelhantes aos encontrados na espécie Pseudoplatystoma punctifer (LUCA, 2010) revestidos por túnica albugínea, constituída de tecido conjuntivo, fibras musculares lisas e vasos sanguíneos. Essa túnica emite septos em direção ao estroma, formando lamelas ovulígeras, nas quais 40

se encontram ovócitos nas diferentes fases do desenvolvimento. São do tipo cistovariano, uma vez que o lume tem continuidade com o oviduto ou ducto ovariano, através do qual os ovócitos alcançam a papila urogenital e o meio externo. Observou-se nas fêmeas juvenis a presença de ovócitos cromatina-nucléolo, ovócitos perinucleares e ovócitos alvéolo cortical em pequena quantidade, quase irrisória (Figura 8, 9 e 10).

Figura 9 - Cortes histológicos de ovários de Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer 9 meses: Ovócitos cromatina-nucléolo (OCN), lúmen (LM), vasos sanguíneos (VS). Coloração hematoxilina/eosina, obj: 20x.

Figura 10 - Cortes histológicos de ovários de Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 16 meses: ovócitos perinucleares (OP), ovócitos alvéolo cortical, em inicio de formação (OAC), n=núcleo, N= nucléolo. Coloração hematoxilina/eosina, obj: 40x.

Nos adultos ovócitos cromatina-nucléolo, perinucleares, alvéolo cortical, vitelogênico e ovócitos maduros (Figura 11, 12 e 13).

Figura 11 - Cortes histológicos de ovários de Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 3 anos: vista geral do ovário. Ovócitos perinucleares (OP), ovócitos alvéolo cortical, ovócito maduro (OM). Coloração hematoxilina/eosina, obj: 20x.

Figura 12 - Cortes histológicos de ovários de Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 3 anos: Ovócitos alvéolo cortical (OAC), ovócito maduro (OM). Coloração hematoxilina/eosina, obj: 100x.

Figura 13 - Cortes histológicos de ovários de Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 3 anos: Ovócitos maduros (OM). Coloração hematoxilina/eosina, obj: 40x.

Em alguns ovócitos maduros observou-se a presença de micrópila, (Figura 14). Região com baixa quantidade de alvéolos, que se modifica de acordo com a maturação dos ovócitos, este estando totalmente maduro o núcleo se direciona até a micrópila, por onde ocorrerá a fecundação, devido o espermatozoide não possuir acrossoma na cabeça (BRASIL, 2001).

Figura 14 - Cortes histológicos de ovários de Híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer de 3 anos: Ovócito maduro (OM), micrópila (MC). Coloração hematoxilina/eosina, obj: 100x. 44

O número de ovócitos em diferentes fases está apresentado na tabela 2. Os ovócitos correspondem aos encontrados por Rodrigues (2005), avaliando o número de ovócitos em diferentes fases em Acestrorhynchus pantaneiro.

Tabela 2 – Média do número de ovócitos, nos diferentes estádios de desenvolvimento analisados histologicamente em ovários de híbridos de Leiarius marmoratus (macho) x Pseudoplatystoma punctifer (fêmea). Fase dos Alevinos 7 Alevinos 14 9 meses 16 meses 3 anos ovócitos dias dias Jovens ou Jovens ou Adultos imaturos imaturos 1° - - 10,5 9,6 18,44 2° - - 1,12 2,6 2,69 3° - - 0,09 1,8 1,89 4° - - - - 0,69 5° - - - - 0,28 6° - - - - - 1°- ovogônia; 2° - ovócito cromatina nucléolo; 3° - ovócito perinuclear; 4°- ovócito alvéolo cortical; 5°- ovócito maduro; 6°- ovócito atrésico.

O índice gonadossomático (IGS) apresentou médias baixas em todas as idades e não teve diferença entre machos e fêmeas e nas diferentes idades (Tabela 3). Médias de (IGS) variam de acordo com o estado de maturação, podendo estar entre 15% e 19%, no grau de maturação mais avançado, como encontrado em Pseudoplatystoma fasciatum (ROMAGOSA et al., 2003 a).

Tabela 3 – Média do índice gonadossomático de machos e fêmeas de híbridos de Leiarius marmoratus (macho) x Pseudoplatystoma punctifer (fêmea). Idade 7dias 14 dias 9 meses 16 meses 3 anos Sexo SDS¹ SDS¹ Fêmeas Machos Fêmeas Fêmeas IGS² % 0,0014 0,041 0,039 0,064 0,135 0,345 ¹ sem definição de sexo ² índice gonadossomático

De acordo com Romagosa et al. (2003a), as médias apresentadas dos juvenis e adultos indicam que estes peixes estão em período de repouso reprodutivo. O IGS auxilia na definição de escala de maturação das gônadas, mede o grau de desenvolvimento, onde valores altos indicam atividade reprodutiva alta (ROMAGOSA et al., 2003 b).

CONCLUSÃO

Machos e fêmeas de híbridos de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer, juvenis (9 e 16 meses), estão em estágio inicial de desenvolvimento e maturação dos ovários e testículos, contendo nestes diferentes tipos de células de linhagem germinativa, como ovócitos cromatina-nucléolo, ovócitos perinucleares, e ovócitos alvéolo cortical nas fêmeas e espermatogônias primárias, secundárias e espermatócitos primários nos machos. As fêmeas adultas (3 anos) analisadas apresentaram células em vários estágios de desenvolvimento, sendo elas ovócitos cromatina-nucléolo, ovócitos perinucleares, ovócitos alvéolo cortical, ovócitos vitelogênico e ovócitos maduros. No entanto, devido o período que foi coletado e pela estrutura macroscópica que foi analisada, conclui-se que estas estão em repouso, sendo que havia resquícios de ovos maduros. Devido à presença de células germinativas femininas e masculinas em diferentes fases, verificadas pelos cortes histológicos, demonstraram que estes peixes provavelmente podem ser férteis, porém necessitam mais estudos para completar as análises do desenvolvimento das gônadas e características seminais e espermáticas.

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CAPITULO 3

EXTRUSÃO DE OVÓCITOS DOS HÍBRIDOS DE LEIARIUS MARMORATUS X PSEUDOPLATYSTOMA PUNCTIFER

RESUMO

O presente experimento teve como objetivo analisar a capacidade reprodutiva de peixes híbridos, definindo questões reprodutivas e comparando-os com seus parentais. Para tal estudo utilizou-se 6 animais híbridos de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer, 6 fêmeas de Pseudoplatystoma punctifer. Os animais foram selecionados em uma piscicultura na região de Brejinho de Nazaré- TO, onde se procedeu também o experimento, utilizando a estrutura local. Realizou-se a indução hormonal para extrusão de gametas, dos híbridos e parentais, para observação de uma possível produção destes, sendo analisados quanto a sua viabilidade. Aplicou-se uma única dose de 0,2 mg EBHC (extrato bruto de hipófise de carpa)/kg de peixe em 2 fêmeas e outras 4 fêmeas, receberam uma dose de 0,5 mg EBHC/kg de peixe, e após 10 horas de intervalo, 5,0 mg EBHC/kg de peixe, esta mesma dosagem foi usada nos parentais. A indução hormonal para extrusão dos gametas possibilitou observar a produção de ovócitos nas fêmeas, como não foi encontrado macho, não foi possível fazer análise de fertilização de ovócitos dos híbridos. Ao fazer a extrusão induzida dos ovócitos, verificou a presença de sangue, o que pode torná-los inviáveis.

Palavras chave: gametas; hormônio; parentais; sangue; viabilidade;

EXTRUSION OF OOCYTES OF HYBRIDS OF LEIARIUS MARMORATUS X PSEUDOPLATYSTOMA PUNCTIFER

ABSTRACT

This experiment aimed to analyze the reproductive capacity of fish hybrids, defining reproductive issues and comparing them with their parents. For this study we used 6 animals hybrid leiarius marmoratus x pseudoplatystoma punctifer, and 6 females of pseudoplatystoma punctifer. The animals were picked from a fish farm in the region of Brejinho de Nazaré, where also the experiment, using the local structure. Hormonal induction was held for extrusion of gametes, hybrids and parental leave, for observation of a possible production of these, being analyzed for its viability. Applied to a single dose of 0.2 mg EBHC/kg of fish in 2 females and 4 females received a dose of 0.5 mg EBHC/kg of fish, and after 10:0 5.0 mg range, EBHC/kg of fish, this same dosage was used in parental leave. Hormonal induction to gamete extrusion allowed to observe the production of oocytes in females, as it has not been found, we can do analysis of fertilization of oocytes of hybrids. To make the extrusion of oocytes, the induced presence of blood, which can make them unfeasible.

Keywords: gametes; hormone; parental leave; blood; viability;

INTRODUÇÃO

A introdução de espécies não nativas em meios aquáticos é de grande importância, pois pode causar danos ao ecossistema, como perda de material genético, alterações genéticas de populações, prejuízos econômicos entre outros, sendo importante estudar estas espécies que podem ser introduzidos no meio através de escape das criações como os tanques rede, causando prejuízos irreparáveis (ZANATTA, 2011). O híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer, vem sendo utilizado nas pisciculturas, e se tem o interesse de criá-lo em tanques rede, é um animal o qual não se sabe sobre sua fertilidade, sendo necessários estudos para cria-los em tanques rede sem preocupação com as alterações advindas da criação deste peixe, se o mesmo for um animal fértil. A utilização da hibridação com o cruzamento dessas espécies já é aceita por muitas pisciculturas no país, isto se deve a facilidade de emprego da metodologia de cruzamento artificial, que pode ser usada em cultivos do tipo extensivo, e até mesmo pelos produtos oriundos deste cruzamento, apresentar maiores vantagens que seus parentais (GODINHO, 2007). Contudo, devido à falta do emprego de tecnologias para a identificação das espécies, fiscalização e manejo adequado destes híbridos, os mesmos podem estar sendo utilizados de maneira errônea como se fossem seus parentais, poderão estar sendo introduzidos e concorrendo com seus parentais em ambientes naturais (TOLEDO-FILHO et al., 1994). As implicações da introdução destes no meio ambiente são de complexa previsão, pois depende de diferentes características como grau de viabilidade, desempenho e capacidade reprodutiva natural (TOLEDO-FILHO et al., 1996). Uma vez que a hibridação for iniciada, é difícil parar, principalmente se os híbridos são férteis e concorram com seus parentais. Com a falta de controle, todos os indivíduos futuros poderão ser de origem híbrida, ocorrendo de forma progressiva à extinção de indivíduos parentais (ALLENDORF et al., 2001).

Estudos mostram que vários híbridos de peixes podem ser férteis, causando extinção dos parentais. Isto depende do cruzamento que se faz devido à grande diferença de número de cromossomos que existe de espécie para espécie. Como esta característica de fertilidade é desconhecida, deve-se assegurar que não exista para não causar ameaças ao meio ambiente. A avaliação desta é de suma importância (BARTLEY, 2001). Atualmente não se tem grandes informações sobre os híbridos nem a respeito de suas características genéticas, reprodutivas, alimentares, e sobre os impactos ambientais concisos, que estes podem causar em relação a suas espécies parentais, trazendo dúvidas a serem respondidas. Objetivou-se neste estudo, evidenciar a capacidade reprodutiva deste híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer, com a reprodução induzida através da aplicação de hormônios para coleta dos gametas, e fazer a comparação da produção de ovócitos viáveis, com seus parentais.

MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi conduzido na piscicultura São Paulo – Brejinho de Nazaré, Estado do Tocantins. Para o desenvolvimento deste trabalho, em dezembro de 2011, foram disponibilizados 6 fêmeas de híbridos de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer, provenientes de reprodução induzida, criados em cativeiro, encontravam-se com 3 anos de idade, pesando em média 4,600 kg. Os exemplares foram mantidos em viveiros escavados de terra. Os peixes foram alimentados com ração balanceada (38 % PB), oferecida três vezes ao dia, manhã, tarde e noite. Os animais foram selecionados no viveiro, observando-se aspectos externos, tais como ventre distendido ou abaulado e presença ou não de papila urogenital saliente e, se havia ou não a existência de gametas pela técnica de inserir uma cânula plástica na papila urogenital (sonda uretral humana de aproximadamente 1 mm), técnica também utilizada para identificação sexual dos exemplares (Figura 1).

Figura 1 - Canulação - técnica utilizada para verificar a presença de ovócitos antes da aplicação hormonal.

Os peixes selecionados foram mantidos em laboratório, em caixas d’água com capacidade de 500 litros. Após período de repouso, os animais foram induzidos a reprodução através do método de hipofisação. Para liberação dos gametas usou 54

extrato bruto de hipófise de carpa administrado na base da nadadeira peitoral, 4 fêmeas receberam uma dose de 0,5 mg EBHC (extrato bruto de hipófise de carpa) /kg de peixe, e após 10 horas de intervalo, 5,0 mg EBHC/kg de peixe, outras 2 fêmeas receberam uma única dose de 0,2 mg EBHC/kg. Realizou-se a extrusão manualmente. Para a comparação da produção de óvulos, utilizou-se 6 fêmeas Pseudoplatystoma punctifer com a média de peso de 3,700kg, considerados animais adultos, tendo em média 4 anos de idade, estes são os parentais do híbrido Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer. Os peixes foram selecionados no mesmo viveiro, observando-se aspectos externos, e mantidos em laboratório, em caixas d’água com capacidade de 500 litros. Após período de repouso, os animais foram induzidos através do método de hipofisação. Para liberação dos gametas, usou-se extrato bruto de hipófise de carpa administrado na base da nadadeira peitoral. As fêmeas receberam uma dose de 0,5 mg EBHC/kg de peixe, e após 10 horas de intervalo, 5,0 mg EBHC/kg de peixe. Após a extrusão foi aferido o peso dos óvulos tanto dos híbridos quanto dos parentais.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A desova das fêmeas híbridas e das fêmeas de Pseudoplatystoma punctifer ocorreu em média 10 horas após a segunda aplicação do hormônio. Este tempo de desova pode ser de 10 a 14 horas, o processo de desova depende da temperatura da água a qual a fêmea se encontra (ANDRADE, 2003). A temperatura da água estava em média de 23 C° ± 1,9 C°, na qual também foi encontrada na avaliação de maturação final e tempo de desova em Pseudoplatystoma fasciatum (LEONARDO, 2003). Fêmeas de híbrido de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer, que receberam duas doses hormonais, apresentaram a produção de ovócitos, porém em quantidade relativamente baixas quando comparadas com seus parentais. Sua produção média foi de 20 g de ovócitos por peixe, as fêmeas que receberam uma única dose hormonal, apresentaram quantidades menores de ovócitos, sendo a produção média de 3 g, enquanto que Bombardelli et al. (2006) analisando doses inseminantes para fertilização artificial de ovócitos de jundiá cinza (Rhamdia quelen), encontraram uma produção de 169 g de ovócitos em média, nas fêmeas que receberam o mesmo hormônio e na mesma dosagem (0,5 mg EBHC/kg de peixe, e após 10 horas de intervalo, 5,0 mg EBHC/kg de peixe) aplicada nos híbridos do experimento. Já as fêmeas de Pseudoplatystoma punctifer tiveram a produção média de 400 g de ovócitos por peixe (Figura 2).

Figura 2 - Extrusão de ovócitos de Pseudoplatystoma punctifer. 56

Com a técnica de extrusão dos ovócitos aplicada nos híbridos, pôde-se observar a presença de sangue em seu conteúdo (Figura 3). Gonçalves (2010), após indução hormonal, e extrusão de ovócitos em fêmeas de suruvi (Steindachneridion scriptum), família Pimelodidae, observou a presença de sangue em seu conteúdo, porém não fez objeção quanto à perda de qualidade dos ovócitos, levando em consideração a coagulação do sangue após a mistura com a água. Luz et al. (2001), analisaram amostra de sêmen com sangue e verificou que o mesmo não afetou a motilidade do sêmen de suruvi (Steindachneridion scripta). Porém, segundo Marques (2001); Casallas et al. ( 2006); Shimoda et al. (2007); e Souza (2010) a presença de sangue contamina o sêmen, diminuindo a qualidade do mesmo, assim todas as amostras que são contaminadas por sangue, água ou urina são descartadas. Há escassez de dados, relacionados com a análise da qualidade de gametas e fertilização, quando se discute a presença de sangue em seu conteúdo.

Figura 3 - Extrusão de ovócitos de híbridos de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer, com presença de sangue em seu conteúdo.

Durante o período do experimento (2 anos), não foram encontrados machos adultos, não sendo possível fazer a coleta de sêmen e fertilização dos gametas dos híbridos. 57

Após este período de pesquisas, entramos em discussão, relacionadas à pergunta: Será que existem mais machos ou mais fêmeas, na produção dos híbridos de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer? Sendo necessários outros tipos de estudos para sanar estas dúvidas.

CONCLUSÃO

As fêmeas de híbridos de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer, produziram ovócitos maduros, através da aplicação hormonal, porém ao fazer a extrusão dos ovócitos, observou-se uma baixa quantidade na produção dos mesmos e a presença de sangue juntamente com os ovócitos, o que pode torná-los inviáveis, sendo necessários mais estudos em relação à reprodução deste híbrido. As análises para machos não foram realizadas, pois durante o período da pesquisa não foram encontrados machos adultos na piscicultura.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os estudos dos híbridos de Leiarius marmoratus x Pseudoplatystoma punctifer demonstram que se deve ocorrer maiores cuidados na produção de peixes híbridos, uma prática que vem sendo amplamente utilizada, podendo ocorrer impacto ambiental provocado pela inclusão destes exemplares na natureza.

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