UNIVERSITE D’ANTANANARIVO
DOMAINE : SCIENCES ET TECHNOLOGIE
MENTION : BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE
MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU DIPLOME DE MASTER II
PARCOURS : BIOCHIMIE, BIODIVERSITE ET SANTE
ETUDES CHIMIQUE ET TOXICOLOGIQUE
DES EXTRAITS D’ECORCES DE TIGE
D’Albizia gummifera
UNE FABACEE NATIVE DE MADAGASCAR
Présentée et soutenu publiquement par :
RAHARISON Miora Haingonirainy
Le 02 Février 2018
Devant le jury composé de :
Président : Pr RAKOTO- RANOROMALALA Danielle A. Doll Rapporteur : Pr RAJEMIARIMOELISOA Clara Fredeline Examinateurs : Pr RANDRIANARIVO Hanitra Ranjàna Dr RANDRIAMAMPIANINA Lovarintsoa Judicaël
TABLE DES MATIERES
Pages DEDICACE ……………………………………………………………………... i REMERCIEMENTS ……………………………………………………………. ii GLOSSAIRE ………………………….……………………………………….... iii LISTE DES ABREVIATIONS …………………………………………………. iv LISTE DES FIGURES ………………………………………………………….. v LISTE DES TABLEAUX ………………………………………………………. vi INTRODUCTION GENERALE……………………………………………… 1 SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE………………………………………….. 4 1. UTILISATION EN MEDECINE TRADITIONNEL………………... 4 2. STRUCTURES CHIMIQUES DES PRINCIPES CTIFS………….... 5 2.1. Chez les Albizia étrangères…………………………………………. 6 2.1. Chez les Albizia malgaches…………………………………………. 6 3. PROPRIETES BIOLOGIQUES………………………………………. 8 3.1. Chez les Albizia étrangères…………………………………………. 8 3.2. Chez les Albizia malgaches…………………………………………. 9
Première partie : ETUDE CHIMIQUE……………………………………….. 10 INTRODUCTION…………………………………………………………….... 10 MATERIELS ET METHODES……………………………………...... 10 1. MATERIELS……………………………………………………………... 10 1.1. Matériel végétal…………………………………………………….... 10 1.1.1. Classification de la plante…………………………………….….. 11 1.1.2. Description botanique……………………………………….….... 11 1.1.2.1. Description du genre Albizia………………………………...... 11 1.1.2.2. Description de l’espèce Albizia gummifera………………...... 11 1.1.3. Répartition géographique d’Albizia gummifera……………...... 12 1.1.4 Date et lieu de récolte………………………………………….….. 13 1.2. Préparation et conservation du matériel végétal…………………. 13 1.3. Les produits chimiques……………………………………………... 13 2. METHODES…………………………………………………………….... 13 2.1. Méthodes d’extraction des principes actifs……………………….. 13 2.1.1. Extraction à froid……………………………………….……...... 13 2.1.2. Extraction à chaud……………………………………….………. 14 2.2 Méthodes de purification……………………………………………. 14 2.2.1. Fractionnement par le n-butanol……………………….……….. 14 2.2.1.1. Principe …………………………………………….…………. 14 2.2.1.2. Mode opératoire…………………………………….………… 14 2.2.2. Traitement par le charbon actif……………………….………… 14 2.2.2.1. Principe…………………………………………….………….. 14 2.2.2.2. Mode opératoire…………………………………….………… 14 2.3. Méthode de concentration…………………………………..……… 15 2.4. Calcul du rendement………………………………………….…….. 15 2.5. Méthodes d’analyse………………………………………….……… 15 2.5.1. Chromatographie sur couche mince………………………..…… 15 2.5.1.1. Principe………………………………………………….…….. 15
2.5.1.2. Mode opératoire……………………………………………….. 16 2.5.1.2.1. Préparation de la cuve chromatographique………………. 16 2.5.1.2.2. Dépôt des échantillons…………………………………….. 16 2.5.1.2.3. Développement du chromatogramme……………………... 16 2.5.1.2.4. Révélation du chromatogramme………………………….. 16 2.5.2. Criblage phytochimique………………………………………….. 16 2.5.2.1. Préparation des extraits……………………………………..…. 17 2.5.2.1.1. Extrait aqueux………………………………………….….. 17 2.5.2.1.2. Extrait hydroéthanolique………………………………..…. 17 2.5.2.1.3. Extrait chloroformique………………………….……….… 17 2.5.2.1.4. Extrait acide……………………………………………….. 17 2.5.2.2. Réaction de détection des familles chimiques…………..…….. 17 2.5.2.2.1. Les alcaloïdes……………………………………………… 17 a) Test de MAYER…………………………………………………………………………... 18 b) Test de DRAGENDORFF…………………………………………………………….… 18 c) Test de WAGNER……………………………………………………………………….. 18 2.5.2.2.2. Les saponosides : Test de mousse……………………….... 18 2.5.2.2.3. Les tanins et les polyphénols……………………………… 18 2.5.2.2.4. Les désoxyoses : Test de KELLER-KILIANI………………. 19 2.5.2.2.5. Les iridoïdes……………………………...………………… 19 2.5.2.2.6. Les anthraquinones : Test de BORNTRAGER…...………... 19 2.5.2.2.7. Les flavonoïdes et leucoanthocyanes……………………... 19 a) Les flavonoïdes : test de WILLSTATTER………...... 19 b) Les leucoanthocyanes : test de BATE-SMITH…………………...... 19 2.5.2.2.8. Les stéroïdes et les triterpènes…………………………….. 20 a) Test de LIEBERMANN-BURCHARD………………………………………….…… 20 b) Test de SALKOWSKI……………………………………………………………….…… 20 RESULTATS…………………………………………………………………… 20 1. EXTRAITS OBTENUS………………………………………………….. 20 1.1. Extraits obtenus à froid……………………………………………... 20 1.1.1. Extrait aqueux ………...………………………………………… 20 1.1.2. Extrait hydroéthanolique………………………………………... 21 1.2. Extrait aqueux à chaud…………………………………………….. 21 2. EXTRAITS PURIFIES…………………………………………………... 21 2.1. Extrait butanolique…………………………………………………. 22 2.2. Extrait charbon actif ………………………………………………. 22 3. RENDEMENTS………………………………………………………….. 22 4. DEGRE D’HOMOGENEITE DES EXTRAITS………………………. 22 5. CARACTERISATION CHIMIQUE…………………………………… 24 5.1. Propriétés physico-chimiques……………………………………… 24 5.2. Nature chimique…………………………………………………….. 25 DISCUSSION ET CONCLUSIONS…………………………………………... 26
Deuxième partie : ETUDE TOXICOLOGIQUE…………………………….. 29
INTRODUCTION……………………………………………………………… 29 MATERIELS ET METHODES………………...... 29 1. MATERIELS……………………………………………………………... 29 1.1. Les animaux d’expérimentation : animaux à sang chaud………... 29 1.2. Les matériels de microbiologie……………………………………... 29 1.2.1. Les souches microbiennes………………………………………... 29 1.2.2. Les milieux de culture……………………………………………. 29 1.2.3. Les disques d’antibiogramme…………………………………..... 30 2. METHODES……………………………………………………………… 30 2.1. Méthodes d’étude des effets sur souris…………………………….. 30 2.1.1. Voies d’administration des extraits …………………………….... 30 2.1.1.1. Par voie orale (gavage)………………………………………... 30 2.1.1.2. Par voie intrapéritonéale (ip)………………………………….. 31 2.1.2. Détermination de la DL 50 (24 h) par voie ip…………………….. 31 2.1.2.1. Méthode de REED et MUENCH (1938)………………………... 31 2.1.2.2. Méthode graphique de BOYD (1966)…………………………... 31 2.2. Méthodes d’étude des effets in vitro sur les microorganismes...... 32 2.2.1. Stérilisation……………………………………………………….. 32 2.2.2. Détermination de l’activité antimicrobienne des extraits………… 32 2.2.2.1. Principe………………………………………………………... 32 2.2.2.2. Mode opératoire……………………………………………….. 32 2.2.3. Détermination de la CMI……………………………………….... 33 2.2.3.1. Méthode de dilution en milieu liquide sur microplaque………. 33 2.2.4. Détermination de la CMB………………………………………... 35 2.3 .Etude de l’activité antioxydante.…...…………………..…………... 35 2.3.1. Principe………………………………………………………..... 35 2.3.2. Mode opératoire……………………………………………….... 35 RESULTATS………………………………………………………………..…… 36 1 EFFET DE L’EXTRAIT BRUT SUR LES ANIMAUX A SANG CHAUD……………………………...... 36 1.1.Description des symptômes d’intoxication…………………………. 36 1.2.Détermination de la DL 50 (24 h) ……………...…………………..... 36 2. EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMES………. 38 2.1. Activité antimicrobienne des différents extraits bruts et purifiés. 38 2.2. Détermination de la CMI et la CMF……………………………...... 39 2.2.1 Détermination de la CMI……………………………………….... 40 2.2.2 Détermination de la CMF……………………………………….... 40 3. ACTIVITE ANTIOXYDANTE…………………………………………. 41 DISCUSSION - CONCLUSIONS……………………………………………... 42 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES……...... 46 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES……………………………………...... 47 REFERENCES WEBOGRAPHIQUES…………………………………………. 58 ANNEXES RESUME
DEDICACE
Ce mémoire est dédié :
A la gloire du Seigneur qui, chaque matin, me renouvelle sa bonté et me fortifie ;
A la mémoire de mon père, repose en paix ;
A ma mère, pour ses soutiens moral et financier, ses conseils qui n’ont pas été vains, qu’elle trouve ici le fruit de ses sacrifices et sa patience ;
A mon frère et mes sœurs, pour que vous sachiez qu’à cœur vaillant rien n’est impossible. Je vous souhaite succès, réussite et plénitude dans tout ce que vous entreprendrez et que ce travail vous donne l’exemple ;
A toute ma famille, que ce mémoire témoigne les efforts que vous avez consentis pendant toute ma vie estudiantine ;
A tous mes camarades de promotion, pour votre collaboration et vos conseils qui m’ont été chers, que ce mémoire garde ces souvenirs inoubliables ;
Et à tous ceux qui me sont chers.
i
REMERCIEMENTS
Notre stage a été réalisé au sein du laboratoire de LABASM (LAboratoire de Biochimie Appliquée aux Sciences Médicales) du Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée (DBFA) de la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo. Ce travail ne serait jamais parvenu à terme sans le concours de nombreuses personnes. Je voudrais adresser mes sincères remerciements :
A Madame le Professeur RAKOTO-RANOROMALALA Danielle. A. Doll, pour m’avoir fait l’honneur de présider le jury de ce mémoire malgré ses nombreuses tâches. Qu’elle trouve par le présent mémoire l’expression de ma profonde gratitude.
A Madame le Professeur RAJEMIARIMOELISOA Clara Fredeline encadreur et rapporteur de ce stage pour ses nombreux conseils avisés, son écoute, ainsi que sa bienveillance lors de la réalisation du manuscrit.
A Monsieur le Professeur RANDRIANARIVO Hanitra Ranjàna et Monsieur le Docteur RANDRIAMAMPIANINA Lovarintsoa Judicaël, qui ont eu l’amabilité d’apporter leur compétence dans le jugement de ce travail, malgré leurs emplois du temps bien remplis.
A tous mes camarades de promotion, pour l’entraide qui n’a pas été vaine.
A tous ceux qui, de près ou de loin, ont contribué à la finalisation de ce travail et tous ceux qui ont souhaité me voir arriver à ce stade.
ii
GLOSSAIRE Anthelminthique : qui permet à l’organisme humain ou animal de se débarrasser des vers intestinaux dits helminthes Antibiogramme : test qui permet de tester la réaction des bactéries à l’antibiotique Anti-infectieuse : qui permet de soigner les infections Antimitotique : qui bloque les mitoses Anti-inflammatoire : qui diminue l’inflammation Antioxydant : qui empêche l’oxydation d’autres substances chimiques Antipyrétique : qui fait baisser la fièvre Antiseptique : qui permet d’interrompre ou prévenir le développement des microorganismes
Bactéricide : capable de tuer ou détruire les bactéries Bactériostatique : capable d’inhiber la croissance bactérienne sans tuer Conjonctivite : inflammation de la conjonctive de l’œil
Contorsion abdominale : étirement de l’animal avec des torsions du corps
Convulsion clonique : alternance de contractions et de relâchements des muscles Décoction : préparation obtenue en faisant bouillir de manière prolongée une ou des substances végétales pour en extraire les principes actifs Dysenterie : maladie infectieuse et contagieuse caractérisée par l’évacuation de selles fréquentes, souvent sanguinolentes
Enophtalmie : enfoncement anormal du globe oculaire dans l’orbite Hallucination : trouble sensoriel qui donne l’impression de percevoir quelque chose qui n’existe pas
Lombalgie : douleur dans le bas du dos au niveau des vertèbres lombaires
Otite : inflammation de la membrane muqueuse de l’oreille Prostration : abattement physique extrême Sédatif : qui agit contre la douleur Tachycardie : augmentation du rythme cardiaque Tonifiant : qui stimule ou renforce la résistance musculaire Ulcère : plaie ouverte de la peau, des yeux ou d’une muqueuse accompagnée d’une désintégration de tissu
iii
LISTE DES ABREVIATIONS
BAE : Butanol/Acide acétique/Eau distillée
CCM : Chromatographie sur Couche Mince
CMI : Concentration Minimale Inhibitrice
CMB : Concentration Minimale Bactéricide
DL0 : Dose Létale 0%
DL50 : Dose Létale 50%
DL100 : Dose Létale 100% EB : Extrait brut ip : Intrapéritonéale
IPM : Institut Pasteur de Madagascar
LABASM : LAboratoire de Biochimie Appliquée aux Sciences Médicales min : minutes p/p/p : poids/poids/poids p/v : poids/volume v/v : volume par volume
iv
LISTE DES FIGURES
Pages
Figure 1 : Albizia gummifera………………………………………………. 12 Figure 2 : Répartition géographique d’Albizia gummifera………………...… 12 Figure 3 : Schéma récapitulatif de l’extraction et de la purification des 23 principes actifs d’écorces de tige d’Albizia gummifera………… Figure 4 : Chromatogramme dans le système BAE des extraits de tige 24 d’Albizia gummifera…………………………………………..... Figure 5 : Réaction de réduction du DPPH………………………………... 35
Figure 6 : Détermination graphique de la DL50 (24 h) par la méthode de 37 REED et MUENCH…………………………………………...... Figure 7 : Illustration des effets des extraits obtenus sur la croissance de 39 Candida albicans……………………………………………………... Figure 8 : Résultats de la détermination de la CMI de l’E1 sur Candida 40 albicans……………………………………………………………...... Figure 9 : Résultat de la détermination de l’activité antioxydante………… 41
v
LISTE DES TABLEAUX
Pages
Tableau 1 : Famille chimique des Albizia malgaches étudiées au LABASM…... 7
Tableau 2 : DL50 (24 h) des extraits d’Albizia sur souris par voie intrapéritonéale…………………………………………………...... 9 Tableau 3 : Caractéristiques des différents extraits bruts obtenus…………….. 21 Tableau 4 : Résultats du criblage phytochimique des extraits EB, E1 et E2…... 25
Tableau 5 : Souches microbiennes utilisées…………………………………….. 30 Tableau 6 : Normes utilisées pour l’expression des résultats obtenus par la méthode des disques………………………………………………... 33 Tableau 7 : Composition des milieux utilisés pour la détermination de la CMI... 34
Tableau 8 : Résultats expérimentaux de la détermination de la DL50 (24 h)……. 36
Tableau 9 : Valeurs utilisées pour la détermination graphique de la DL50 (24h)…………...…………………………………………………..... 37
Tableau 10 : Données utilisées pour la détermination de la DL50 (24 h) par la méthode de BOYD…………………………………………………. 38 Tableau 11 : Activités des différents extraits sur la croissance des souches testées……………………………………………………………..... 38 Tableau 12 : Valeurs de la CMI estimées sur Candida albicans…………………… 40 Tableau 13 : Effets de différentes concentrations de l’E1 sur Candida albicans… 40
Tableau 14 : Valeurs des CMF des extraits testés sur Candida albicans………… 41 Tableau 15 : Valeurs des rapports CMF/CMI des extraits sur Candida albicans…………………………………………………………….. 41
Tableau 16 : DL50 (24 h) d’espèces d’Albizia déjà étudiées au LABASM……… 43
vi
INTRODUCTION GENERALE
Introduction générale
INTRODUCTION GENERALE
Les plantes ont un impact important sur la santé des individus. Cet impact évident est souvent bénéfique mais peut être aussi dangereux, voire mortel. En effet, les plantes constituent une source de nourriture, de vêtement et de médicament (RAZAFINDRAKOTO, 2010). Elles peuvent aussi être toxiques ou médicinales.
Les plantes toxiques contiennent des poisons appelés toxines végétales dans certaines parties ou tous les organes. Ces toxines peuvent provoquer des lésions internes ou externes, à l’organisme humain ou animal en cas de contact ou d’ingestion.
La quantité de toxine d’un végétal varie selon l’emplacement, la saison, les conditions climatiques et l’âge de la plante. En outre, l’intoxication dépend de différents facteurs comme la partie de la plante incriminée, les voies d’administration de la toxine dans l’organisme ainsi que la dose toxique ingérée par celui-ci.
Les toxines peuvent également présenter des usages thérapeutiques. A titre d’exemples :
L’aconitine est un alcaloïde diterpénique des feuilles ou des racines de l’aconit nap (Aconitum napellus, Ranunculaceae). Toute la plante est vénéneuse. L’aconitine provoque chez l’homme des sensations de brûlure, des picotements, des vomissements, des sueurs, une mydriase avec hypersalivation et des convulsions. Elle entraine la mort par paralysie des systèmes vitaux (respiratoire et circulatoire). Cependant, elle constitue un antidote au venin des scorpions (web1 ; web 2) L’atropine est un alcaloïde extrait essentiellement des feuilles de la belladone (Atropa belladonna L., Solanaceae). L’intoxication par cette plante se manifeste par des troubles digestifs (nausée, vomissements), des troubles neuro-végétatifs (tachycardie, sécheresse cutanée et des muqueuses, gêne respiratoire) et des troubles neurologiques (hallucinations, convulsions, prostration, coma). La mort est provoquée par une paralysie cardio-respiratoire. En thérapeutique, l’atropine présente une action parasympatholytique (web 3 ; web 2). La colchicine est un alcaloïde d’une plante entière : le colchique (Colchicum, Colchicaceae). L’ingestion de la plante engendre des nausées, des diarrhées
1
Introduction générale
hémorragiques avec des douleurs abdominales, une paralysie voire un coma. La colchicine comporte des propriétés mutagènes et antimitotiques. Elle est utilisée dans le traitement des crises aiguës de goutte et des douleurs articulaires (web 4 ; web 2) La digitaline est un alcaloïde contenu dans les feuilles de la digitale pourpre (Digitalis purpurea, Scrophulariaceae). L’ingestion de ces feuilles provoque chez l’homme des nausées, des vomissements, des diarrhées, des troubles cardiaques importants responsables de la mort. La digitaline est un cardiotonique (web 5 ; web 2).
Le Laboratoire de Biochimie Appliquée aux Sciences Médicales (LABASM) de la Mention Biochimie Fondamentale et Appliquée (MBFA) de la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo s’est intéressé particulièrement à l’étude chimique et biologique ainsi que la valorisation des principes actifs des plantes toxiques malgaches. A titre d’illustration, on peut citer quelques exemples de plantes déjà étudiées :
Des représentants d’Albizia (RANDRIANARIVO, 1996 ; RAJEMIARIMOELISOA, 2000 ; RAONIHARISOA, 2003 ; RAKOTO et coll., 2012 ; JAOFENO, 2016) ; Deinbollia boinensis, SAPINDACEAE (RAKOTOBE, 2003); Olax lanceolala, OLACACEAE (RAHELINIAINAMANDIMBY, 2003); Conchopetalum madagascariensis, SAPOTACEAE (RASOATAHINA, 2005) ; Cucumis sativus L., CUCURBITACEAE (RANAIVONIARIVO, 2006) ; Anacardium occidentale, ANACARDIACEAE (ABOUBACAR, 2007); Schefflera longipedicellata, ARALIACEAE (RASOLOHARIJAONA, 2008). Dilobeai thouarsii, PROTEACEAE (ANDRIAMASINORO, 2009) ; Ravenala madagascariensis Sonn., STRELITZIACEAE (RAKOTONANDRASANA, 2010) ; Podocarpus madagascariensis, PODOCARPACEAE (RATSIMIEBO, 2012) ; Cnestis glabra, CONNARACEAE (RAZANATSEHENO, 2017) ;
Pour notre part, nous avons choisi de travailler sur l’écorce de tige d’Albizia gummifera, une FABACEAE native de Madagascar pour les raisons suivantes :
la plante est très répandue à Madagascar ;
2
Introduction générale
elle possède des propriétés biologiques et chimiques intéressantes (voir Synthèse bibliographique), mais plusieurs tests pharmacologiques restent à réaliser.
Le présent mémoire est composé de deux parties :
l’étude chimique comprenant l’extraction, la purification et la caractérisation physico-chimique des principes toxiques ; l’étude biologique basée sur des tests de toxicité effectués sur divers organismes vivants.
L’introduction générale précède les deux parties et la conclusion générale ainsi que les perspectives terminent le document.
3
SYNTHESE
BIBLIOGRAPHIQUE
Synthèse bibliographique
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Le genre Albizia appartient à la famille des Fabaceae, sous-famille des Mimosoideae. La famille des Fabaceae (ex-Légumineuses) est composée de 650 genres et 18 000 espèces (web 6). Elle est constituée de plantes herbacées, d’arbustes, d’arbres ou de lianes. Elle est subdivisée en 3 sous-familles :
les Papilionoideae ou Faboideae (Papilionaceae) avec des fleurs en forme de papillon ; les Caesalpinioideae (Caesalpinaceae) avec des fleurs pseudo-papilionacées ; les Mimosoideae (Mimosaceae) avec des fleurs régulières. (web 7)
Le genre Albizia comprend environ 150 espèces largement distribuées dans les régions tropicales d’Asie, d’Afrique, de Madagascar, d’Amérique centrale et du sud, d’Australie (DU PUY et coll., 2002).
1. UTILISATIONS EN MEDECINE TRADITIONNELLE
Les Albizia sont des plantes connues et utilisées comme bois de construction et de chauffage, d’ornementation et d’ombrage (RANDRIANARIVO, 2015).
Ces plantes sont exploitées traditionnellement pour traiter plusieurs maladies dans les différents pays où elles poussent. Pour une même plante, les vertus thérapeutiques sont différentes d’un pays à un autre (RAJEMIARIMOELISOA, 2016). Les exemples sont nombreux. A titre d’illustration, on peut citer :
En Afrique :
- A. anthelmintica : les écorces de tige et de racine de cette espèce sont utilisées au Kenya et au Soudan, comme anthelminthique, anti-nématode et antipaludique (GATHUMA et coll., 2004 ; MUTHEE et coll., 2011) ;
- A. ferruginea : au Gabon et au Ghana, la décoction d’écorces de tige est administrée pour traiter la dysenterie, les affections bronchiales et les douleurs causées par la fièvre. En application externe elle sert à soigner les plaies, les boutons et autres affections de la peau (web 8) ;
4
Synthèse bibliographique
- A. gummifera : au Kenya, l’absorption d’une infusion d’écorces de tige sert à traiter le paludisme et les maux de tête. En Ouganda, elle sert à hâter l’accouchement et en Tanzanie, en application externe elle est utilisée pour traiter la gale. Le jus des racines trempées dans l’eau pendant 10 min est bu pour soulager la douleur causée par les entorses. Au Malawi, l’ajout des racines pilées dans un bain permet de traiter les maladies de la peau et au Kenya, l’extrait de gousses écrasées sert à traiter les maux d’estomac. En Ouganda, les racines sont employées pour traiter la maladie du sommeil (web 9).
- A. schimperiana : la plante entière est utilisée au Kenya, pour traiter le paludisme (MUTHAURA et coll., 2007) ;
- A .julibrissin : les écorces de tige sont utilisées au Japon pour leur activité anxiolytique et anti-inflammatoire et dans le traitement des douleurs des poumons, des ulcères de la peau et des blessures (KIM et coll., 2004 ; ZHENG et coll., 2006) ; - A. adianthifolia : les écorces de tige sont employées pour soigner les douleurs abdominales, la fièvre typhoïde, les infections urinaires (TAMOKOU et coll., 2012) ; En Asie :
- A. myriophylla : les tiges sont utilisées en Thaïlande pour traiter les mycoses cutanées (RUKAYADI et coll., 2008) ;
- A. lebbeck : en Inde, les écorces de racines servent à traiter les inflammations bronchiques. Les écorces de tige sont utilisées pour traiter l’eczéma, l’urticaire, les rhinites et les sinusites ainsi que la fièvre du paludisme (VIDHU et coll., 2011 et 2012). Les écorces de tige servent à soigner les patients atteints d’asthme, de diarrhée, de maux de poumons et d’yeux, de furoncles et de dysenterie (KUMAR et coll., 2010 ; CHULET et coll., 2010 ; BALEKAR et coll., 2012) ;
A Madagascar : A. gummifera, une espèce native, est bien connue par les guérisseurs et utilisée en médecine traditionnelle (RAJEMIARIMOELISOA, 2016). Les racines et les feuilles sont purgatives et elles sont utilisées pour traiter la diarrhée et les affections oculaires. La décoction de feuilles est réputée avoir des vertus antitussive et antiasthmatique. Les feuilles sont appliquées sur les plaies et les fractures (web 9).
2. STRUCTURES CHIMIQUES DES PRINCIPES ACTIFS
Des alcaloïdes, des stéroïdes, des triterpènes, des saponosides, des hétérosides et des flavonoïdes ont été isolés de différentes espèces d’Albizia.
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Synthèse bibliographique
2.1. Chez les Albizia étrangères
Quelques exemples de principes actifs isolés des Albizia étrangères sont cités ci- dessous :
des alcaloïdes de type spermine obtenus à partir d’A. schimperana, A. adinocephala et A. gummifera (OVENDEN et coll., 2002 ; RUKUNGA, 2007 ; SAMOYLENKO et coll., 2009) ; des saponines triterpénoides isolés de l’extrait méthanolique de l’écorce de tige d’A. procera (MELEK et coll., 2007) ; des saponosides triterpeniques nommés julibrosides présents dans l’écorce du tronc d’A. julibrissin (LIANG et coll., 2005 ; ZHENG et coll., 2006 ; ZOU et coll., 2006) ; des saponines triterpenoides et sapogenines lactones trouvées dans l’écorce de tige d’A. gummifera (DEBELLA et coll., 2000 ; RUKUNGA et coll., 2001) ; des glycosides phénoliques ou triterpéniques extraits à partir des écorces d’A. julibrissin et A. procera (JUNG et coll., 2004 ; MIYASE et coll., 2010) ; des flavonoïdes isolés des tiges d’A. zygia et des feuilles d’A. chinensis (ABDALLA et LAATSCH ; 2012 ; GHALY et coll., 2010) ; des tannins isolés de l’extrait méthanolique de l’écorce de tige d’A. chevalieri (KWAJI et JAPARU, 2015) ; des acides triterpéniques de l’extrait méthanolique issus des racines d’A. lebbeck Benth. (HUSSAIN et coll., 2012) ; - des saponines triterpéniques (Albizosides D et E) de l’extrait n-butanolique provenant de l’écorce de tige d’A. chinensis (LIU et coll., 2010) ;
2.2. Chez les Albizia malgaches
Plusieurs familles chimiques (Tableau n° 1, p. 7) ont été trouvées chez 17 espèces d’Albizia malgaches étudiées au LABASM depuis 1983.
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Synthèse bibliographique
Tableau n° 1 : Familles chimiques des Albizia malgaches étudiées au LABASM.
Espèce Organe utilisé Principe actif Référence désoxyoses et RANDRIANARIVO et coll. (2014) ; A. androyensis graines stéroïdes RASOLOFOMANANA (2015) graines (amande) saponosides RANDRIANARIVO (1996) MOUNIDATI (2009) ; A. arenicola graines (tégument) saponosides RAKOTO et coll. (2012) feuilles saponosides RAKOTOMALALA (2012) RANDRIANARIVO et coll. (2014) ; A. aurisparsa graines alcaloïdes ANDRIAMIARINJO (2014) RAHARISOA (1999) ; RAKOTO et coll. (2012) ;
A. bernieri RANDRIAMAMPIANINA et coll. graines saponosides (2012 et 2016) ; RANDRIANARIVO et coll. (2014) A. boinensis feuilles flavonoïdes AHMED (2009) graines saponosides RAHERINIAINA (1999) ARISOA (2000) ; cosse saponosides A. boivini RAKOTO et coll. (2012) saponosides,
feuilles leucoanthocyanes et RATSIMIEBO (2016) stéroïdes saponosides,stéroïdes RANDRIANARIVO et coll. (2014) ; A. divaricata graines et triterpènes RAKOTOMALALA (2015) désoxyoses et RAHELIARISATA (2014) A. greveana graines triterpènes RANDRIANARIVO et coll. (2014) A. lebbeck graines hétérosides ANDRIANTSOA (1983) A. mahalao graines saponosides RAKOTOARIVONY (2012) alcaloïdes et A. masikororum graines RANDRIANARIVO et coll. (2014) saponosides RAJEMIARIMOELISOA (2000) ; A. odorata graines saponosides RAJEMIARIMOELISOA (2015) graines saponosides RAJEMIARIMOELISOA (1996) alcaloïdes, RAKOTONDRASOA (2000) ; feuilles A. polyphylla flavonoïdes RAKOTO et coll. (2012) alcaloïdes,désoxyoses
écorces de tige , leucoanthocyanes, JAOFENO (2016) stéroïdes, saponosides A. sp graines alcaloïdes RAMAMONJISON (1998) RAONIHARISOA (2003) ; A. tulearensis graines saponosides RAKOTO et coll. (2012) alcaloïdes, A.viridis graines RANDRIANARIVO et coll. (2014) saponosides
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Synthèse bibliographique
3. PROPRIETES BIOLOGIQUES
Les plantes du genre Albizia sont connues pour leurs nombreuses activités biologiques. 3.1. Chez les Albizia étrangères :
Plusieurs propriétés thérapeutiques des Albizia étrangères ont été révélées lors des études approfondies. A titre d’illustration, on peut citer : A. zygia : l’extrait hydroéthanolique présente des propriétés anti-inflammatoire, antipyrétique et analgésique (ABOTSI et coll., 2016) ; A. lebbeck Benth. présente une activité antidiarrhéique dans ses graines et une activité anti-convulsivante dans ses feuilles (KASTURE et coll., 1996 ; BESRA et coll., 2002) ; A. julibrissin : les écorces de tige ont des activités antioxydante, anti-tumorale, anti-inflammatoire, cytotoxique et sédative (KANG et coll., 2000 ; JUNG et coll., 2003 ; ZHENG et coll., 2006 ; ZOU et coll., 2006 ;) A. adinocephala : l’extrait méthanolique de l’écorce de tige inhibe l’enzyme plasmepsine II de la malaria (OVENDEN et coll., 2002) A. anthelmintica : l’extrait de l’écorce de ses racines présente une activité antimicrobienne vis-à-vis de Candida albicans (RUNYODO et coll., 2006) A. myriophylla : présente une propriété antibactérienne contre Streptococcus mutans ATCCC 25775 et l’extrait éthanolique, les différentes fractions et les composés issus du bois de cette plante présentent une activité inhibitrice de l’alpha- glucosidase (JOYCHARAT, 2013 ; JOYCHARAT et coll., 2017) A. schimperiana : possède une activité antimicrobienne contre Staphyloccocus aureus et Escherichia coli, une activité cytotoxique vis-à-vis des lignées cellulaires et du cancer des reins (SAMOYLENKO et coll., 2009) A. odoratissima Benth : l’extrait méthanolique de l’écorce de cette plante présente une activité antidiabétique (KUMAR et coll., 2011). A. gummifera : l’extrait aqueux de l’écorce de tige est dotée d’une activité antioxydante et anti-infectieuse contre Salmonella (ATSAFACK et coll., 2016). L’extrait hydroéthanolique des graines d’A. gummifera possède une activité toxique (EVALYN, 2012 ; DEBEBE et coll., 2017). L’extrait dichlorométhane, méthanol et
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Synthèse bibliographique
acétone des feuilles exercent une activité antimicrobienne sur quatre sérovars de Salmonella (MAHLANGU et coll., 2017). 3.2. Chez les Albizia malgaches Au LABASM, les espèces d’Albizia étudiées ont présenté une activité toxique sur les souris. Le tableau n° 2 résume les DL50 (24 h) sur souris des extraits étudiés.
Tableau n° 2 : DL50 (24 h) des extraits d’Albizia sur souris par voie intrapéritonéale. DL 50 (24 h) sur souris Espèces Extrait utilisé (par voie ip) en mg/kg A. androyensis EM de graines Entre 41,33 et 43,23 A. arenicola EB de feuilles Entre 41,4 et 41,44 A. aurisparsa EB de graines Entre 38,76 et 39,71 A. bernieri EP de graines Entre 53 et 55 A. boinensis EB des feuilles Entre 51,2 et 51,6 EP de graines 11 A. boivini EP de cosses Entre 57 et 60 EB de feuilles Entre 976 et 1030 A. divaricata EM de graines Entre 4,78 et 7,72 A. greveana EP de graines Entre 1,3 et 1,87 A. mahalao EM de graines Entre 22,22-24,4 A. mainaea EB de Feuilles Entre 426,75 et 466,29 A. masikororum EB de graines Entre 16,5 et 17,42 A. odorata EP de graines 9 EB de feuilles Entre 63,14 et 63,49 A. polyphylla EB de graines Entre 73 et 76 EM d’écorces de tige Entre 740 et 870 A. sp EP de graines 8,7 A. tulearensis EP de graines Entre 2,9 et 3,2 A. viridis EB de graines Entre 6,72 et 8,04 EM : extrait méthanolique, EB : extrait brut, EP : extrait purifié
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Première partie :
ETUDE CHIMIQUE
Etude chimique ETUDE CHIMIQUE
INTRODUCTION
Une étude chimique approfondie a déjà été entreprise sur les feuilles (THUO et coll, 2017), les graines (DEBEBE et coll., 2017) et l’écorce de tiges (EVALYN, 2012) d’Albizia gummifera. Elle a permis de mettre en évidence la présence de saponosides, d’alcaloïdes, de flavonoïdes et de triterpènes (voir Synthèse bibliographique).
Des études préliminaires effectuées sur souris ont révélé la présence de toxines dans l’écorce de tige d’Albizia gummifera. Ceci nous a alors amenée à :
effectuer plusieurs techniques d’extraction à partir de la poudre des écorces de tige d’Albizia gummifera ; mettre au point des techniques de purification afin d’obtenir des extraits partiellement purifiés ; étudier les propriétés physico-chimiques du ou des principe(s) toxique(s) et essayer de déterminer sa (leur) nature(s) chimique(s).
MATERIELS ET METHODES
1. MATERIELS
1.1. Matériel végétal
1.1.1. Classification de la plante
(DU PUYet coll, 2002)
Albizia gummifera est classée comme suit :
Règne : PLANTAE Embranchement : TRACHEOPHYTA Ordre : MAGNOLIOPSIDA Classe : FABALES Famille : FABACEAE Genre : Albizia Espèce : gummifera Noms vernaculaires : Sambalahy, Volomborona, Alboza, Sambalahe
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Etude chimique 1.1.2 Description botanique (DUPUY et coll., 2002 ; TERA, 2011 ; web 10)
1.1.2.1. Description du genre Albizia
Trente espèces d’Albizia sont présentes à Madagascar dont 24 sont endémiques, 3 pantropicales et 3 introduites. Albizia est un arbre ou arbuste à stipules variables, souvent caducifolié (à feuilles caduques) précoce et à croissance rapide. Les feuilles sont bipennées et les pétioles présentent généralement une glande. Il se caractérise aussi par une inflorescence sphérique à tête hémisphérique, axillaire, solitaire, combinée en une panicule terminale de tête. La plupart des fleurs sont hermaphrodites. La fleur mâle centrale, rarement bisexuée, voire manquante est généralement plus grande que les fleurs bisexuées et présente un long tube staminal plus long et plus large qui forme une tasse pour contenir les grandes quantités de nectar que ces fleurs produisent. La présence de nombreuses étamines, avec plus de deux fois le nombre de pièces de la corolle, est aussi l’un des caractères du genre Albizia. Les cosses sont plates, épaisses et boisées, parfois fortement rétrécies entre les graines et se divisant en deux vannes plates ou indéhiscentes.
1.1.2.2. Description de l’espèce Albizia gummifera
Albizia gummifera (figure 1, p. 12) est un arbre caducifolié qui peut atteindre 30 m de hauteur et jusqu’à 75 à 100 cm de diamètre. Le bois, tendre est de couleur blanche légèrement rosée. L’écorce est généralement fibreuse, lisse de couleur jaunâtre à grise. Les feuilles sont alternes, composées bipennées puis paripennées asymétriques. Les folioles sont obliques et souvent auriculées au côté proximal de la base. L’inflorescence est axillaire sur un pédoncule de 2,5 – 5 cm de long. Les fleurs sont bisexuées avec des étamines nombreuses et de 2,5 – 3,5 de long et un ovaire supère et ellipsoïde de 1,5 – 2,5 mm de long. Elles sont régulières, pentamères et de couleur blanc-rougeâtre. Les fruits sont généralement des gousses aplaties, oblongues, ligneuses, pouvant renfermer 9-12 graines.
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Etude chimique
b) feuilles c) fruit a) pied Figure 1 : Albizia gummifera.
1.1.1. Répartition géographique d’Albizia gummifera Albizia gummifera native de Madagascar y est largement répandue, en particulier à l’Est, sauf dans les zones les plus sèches.
Figure 2 : Répartition géographique d’Albizia gummifera. Source : Tropicos 2018 (consulté le 15 janvier 2018).
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Etude chimique 1.1.2. Date et lieu de récolte
La plante a été récoltée en Novembre 2016 dans le Parc de Tampolo, région d’Alaotra Mangoro (partie Est de Madagascar : Fenerive-Est). Elle était au stade de fructification
1.2. Préparation et conservation du matériel végétal
Après la récolte, les écorces de tige d’Albizia gummifera sont séchées pendant environ 1mois dans un endroit propre et aéré à l’abri du soleil. Ensuite, les écorces séchées sont découpées en petits morceaux puis broyées à l’aide d’un mini-broyeur de marque IKA (MF10) jusqu’à pulvérisation. La poudre fine obtenue est conservée dans un bocal bien fermé et placé dans un endroit sec à la température ambiante. Elle constitue notre matériel d’étude.
1.3. Les produis chimiques
Les produits chimiques utilisés durant les expériences sont de marque Merck et Prolabo, de qualité pure ou « pour analyse ».
Le support prêt à l’emploi utilisé pour la chromatographie sur couche mince (CCM) est le gel de silice 60F254 de marque Merck, muni d’un indicateur de fluorescence, étalé sur des plaques en plastique de 20 x 20 cm de dimensions (épaisseur de la couche : 0,2 mm).
2. METHODES
2.1. Méthodes d’extraction des principes actifs
2.1.1. Extraction à froid
La poudre d’écorces de tige est mise en suspension dans le solvant d’extraction (éthanol 75%) suivant le rapport 1/10 (p/v), c'est-à-dire 1 g de poudre dans 10 ml de solvant. Le mélange est agité pendant 3 h à la température ambiante sur un agitateur magnétique. Il est ensuite laissé macérer pendant une nuit à + 4°C. Après macération, la suspension est de nouveau agitée pendant 30 min puis filtrée sur 4 épaisseurs de gaze pour écarter le marc. Le filtrat est ensuite centrifugé à 10 000 tours/min pendant 15min à l’aide d’une centrifugeuse de marque Hettich (Universal II). Le culot obtenu est éliminé. Le surnageant est concentré à l’aide d’un évaporateur rotatif de marque Büchi (Rotavapor R110) jusqu’à ce que son volume atteigne le rapport 1/1 (p/v) c’est-à-dire 1 ml d’extrait pour 1 g de poudre (voir méthode au paragraphe 2.3, p. 15). Une deuxième centrifugation à 10 000 tours/min pendant 5 min s’avère nécessaire pour éliminer le trouble apparu lors de la concentration. Le second surnageant constitue l’extrait brut.
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Etude chimique 2.1.2. Extraction à chaud
La poudre végétale est délayée dans l’eau distillée suivant le rapport 1/10 (p/v). Le mélange est ensuite chauffé à reflux sous agitation magnétique (décoction) pendant 3 h. Le mélange refroidi est laissé macérer à +4°C pendant une nuit. La suite de l’opération est identique à celle de la méthode d’extraction à froid (voir paragraphe 2.1.1, p. 13).
2.2. Méthodes de purification
2.2.1. Fractionnement par le n-butanol (MAHUZIER et HAMON, 1990 ; BRUNETON, 1993)
2.2.1.1. Principe
Cette méthode de purification consiste à séparer les molécules d’un extrait par partition entre deux solvants différents non miscibles : l’eau et le n-butanol.
2.2.1.2. Mode opératoire
Dans une ampoule à décanter, l’extrait à purifier est mélangé volume à volume avec le n-butanol. Après une forte agitation, le mélange est laissé décanter jusqu’à la séparation nette de deux phases : une phase supérieure butanolique et une phase inférieure aqueuse. La phase butanolique est recueillie alors que la phase aqueuse est soumise à 4 autres traitements identiques au premier. Les 5 phases butanoliques rassemblées sont filtrées sur papier filtre pour éliminer les éléments insolubles, puis évaporées pour éliminer le butanol après addition d’un grand volume d’eau distillée. Le butanol résiduel de la phase aqueuse est aussi évaporé.
2.2.2. Traitement par le charbon actif (JEANNODA, 1986)
2.2.2.1. Principe
Le charbon actif est un support chromatographique permettant d’adsorber un grand nombre de composés, notamment ceux à structure aromatique. Cette technique est utilisée pour dépigmenter les extraits végétaux.
2.2.2.2. Mode opératoire
Une couche de charbon actif est déposée dans un entonnoir bouché avec des fibres de verre et adapté à une fiole reliée à une pompe à vide.
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Etude chimique La solution à traiter est déposée minutieusement sur la couche de charbon actif imprégné d’eau distillée, puis filtrée sous pression réduite. Le filtrat obtenu est ensuite filtré sur papier Whatman pour éliminer les fines particules de charbon actif.
2.3. Méthode de concentration
Toutes les opérations d’évaporation de solvant et de réduction de volume d’extraits sont réalisées à l’aide d’un évaporateur rotatif de marque Büchi (Rotavapor R110), à la température de 45°C – 50°C. La pression est réduite à l’aide d’une pompe à vide.
2.4. Calcul du rendement
Les extraits obtenus lors de l’extraction et des différentes étapes de purification sont évaporés à sec. Les résidus secs obtenus sont ensuite pesés afin de déterminer le rendement à partir de la formule suivante :
Rendement(%) =
Cette formule permet de calculer 3 types de rendement :
le rendement d’extraction au niveau de l’extrait brut par rapport au matériel de départ ; le rendement de purification au niveau de l’extrait purifié par rapport à l’extrait brut ; le rendement en toxines au niveau de l’extrait purifié par rapport au matériel de départ.
2.5. Méthodes d’analyse
2.5.1. Chromatographie sur couche mince (AUDIGIE et coll., 1989 ; MAHUZIER et HAMON, 1990 ; HAHN-DEINSTROP, 2007).
2.5.1.1. Principe
La CCM est une méthode d’analyse basée sur les phénomènes de partage et d’adsorption. La vitesse de déplacement des substances dépend de leur affinité pour la phase mobile organique d'une part, et des forces d’adsorption dues au support d'autre part.
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Etude chimique 2.5.1.2. Mode opératoire
2.5.1.2.1. Préparation de la cuve chromatographique Cette première étape consiste à saturer l’enceinte de la cuve avec les vapeurs du solvant de chromatographie. Pour ce faire, celui-ci est introduit dans la cuve et son niveau est ajusté à 5 mm du fond. Les faces internes de la cuve sont tapissées de papier filtre et il est hermétiquement fermé. 2.5.1.2.2. Dépôt des échantillons
Sur une plaque de gel de silice découpée aux dimensions voulues, les extraits à analyser sont déposés à l’aide d’un capillaire en traits fins horizontaux de 7 mm de long, espacés de 6mm. Les traits sont placés à 1,5 cm du bord inférieur et à 1,5 cm des bords latéraux de la plaque. Chaque extrait est déposé 3 fois, chaque dépôt étant immédiatement séché à l’aide d’un séchoir à main.
2.5.1.2.3. Développement du chromatogramme
La plaque chromatographique préparée est placée dans la cuve préparée précédemment. Le développement est laissé s’effectuer jusqu’à ce que le front du solvant arrive à 0,5 cm du bord supérieur de la plaque. Cette dernière est alors retirée de la cuve puis séchée au moyen d’un séchoir à main.
2.5.1.2.4. Révélation du chromatogramme
La pulvérisation du réactif à la vanille sulfurique (composition en ANNEXE II) sur la plaque permet de révéler les composants sous forme de taches roses qui sont rendues noires après chauffage à 120°C pendant 5 min.
2.5.2. Criblage phytochimique (BEKRO et coll., 2007 ; BADIAGA, 2011 ; ZEGHOUANE, 2014)
Le criblage phytochimique (ou screening) est l’ensemble des tests permettant de détecter les familles chimiques présentes dans un échantillon végétal en mettant en œuvre des réactions de coloration et de précipitation. Pour cela, à partir de la poudre végétale ou du résidu d’évaporation à sec de la solution à analyser, 4 extraits sont préparés (extrait aqueux, extrait chloroformique, extrait hydroéthanolique et extrait acide).
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Etude chimique 2.5.2.1. Préparation des extraits à tester
2.5.2.1.1. Extrait aqueux
Dans un tube à essai, 1 g de poudre végétale ou de résidu d’évaporation à sec est délayé dans 10 ml d’eau distillée bouillante. Après une légère agitation, le mélange est laissé macérer à +4°C pendant une nuit. Le macérat est ensuite filtré. Le filtrat obtenu constitue l’extrait aqueux utilisé pour détecter les saponosides, les tanins, les polyphénols, les désoxyoses, les anthraquinones et les iridoides.
2.5.2.1.2. Extrait hydroéthanolique
Un gramme de poudre ou de résidu sec est mis en suspension dans 10 ml de mélange hydroéthanolique 75%. Le mélange est laissé macérer pendant une nuit à +4°C, puis filtré. Le filtrat obtenu correspond à l’extrait hydroéthanolique utilisé pour la détection des flavonoïdes et des leucoanthocyanes.
2.5.2.1.3. Extrait chloroformique
Un gramme de poudre ou de résidu sec est délayé dans 10 ml de chloroforme. Le mélange est laissé macérer pendant une nuit à +4°C. Le macérat est ensuite filtré sur du coton hydrophile. Le filtrat obtenu constitue l’extrait chloroformique utilisé pour détecter les stéroïdes et les triterpènes.
2.5.2.1.4. Extrait acide
La poudre ou le résidu sec pesant 1 g est laissé macérer dans 10 ml d’acide chlorhydrique (HCl) l2 N, pendant une nuit à +4°C. La solution obtenue après filtration correspond à l’extrait acide, utilisé pour la détection des alcaloïdes.
2.5.2.2. Réactions de détection des familles chimiques (BRUNETON, 1993)
2.5.2.2.1. Les alcaloïdes
Quatre tubes à essai contenant chacun 1 ml d’extrait acide sont nécessaires pour la manipulation. Les trois premiers tubes sont utilisés respectivement pour les tests de MAYER, de DRAGENDORFF et de WAGNER. Le 4ème tube sert de témoin. La composition des réactifs est donnée en ANNEXE I.
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Etude chimique a)Test de MAYER : L’extrait acide du premier tube à essai reçoit cinq gouttes de réactif de MAYER. La formation d’un précipité indique la présence d’alcaloïdes dans l’extrait testé.
b)Test de DRAGENDORFF : Cinq gouttes de réactif de DRAGENDORFF sont versées dans l’extrait du tube 3. L’apparition d’un précipité blanc révèle la présence d’alcaloïdes.
c)Test de WAGNER : Cinq gouttes de réactif de WAGNER sont versées dans le deuxième tube à essai. L’apparition d’un précipité démontre la présence d’alcaloïdes dans l’extrait testé.
Un test de confirmation est réalisé pour les résultats positifs : après addition de 5 gouttes d’éthanol 80% dans chaque tube, les précipités disparaissent, ce qui confirme la présence des alcaloïdes dans l’extrait à tester.
2.5.2.2.2. Les saponosides : Test de mousse
L’extrait aqueux (1 ml) est agité énergiquement pendant 30 s. L’apparition d’une mousse de 3 cm de hauteur, persistant pendant 30 min au moins, indique la présence de saponosides.
2.5.2.2.3. Les tanins et les polyphénols
Quatre tubes à essai reçoivent chacun 1 ml d’extrait aqueux. Le 4ème tube sert de témoin.
a)Test à la gélatine : Quelques gouttes de gélatine 1% (p/v) sont ajoutées à l’extrait aqueux dans le 1ertube. L’apparition d’un précipité blanc révèle la présence de tanins hydrolysables de type catéchique.
b)Test à la gélatine salée : Dans le 2ème tube, quelques gouttes de gélatine salée (gélatine aqueuse 1% mélangée à du chlorure de sodium 10%) sont versées dans 0,5 ml d’extrait aqueux. La formation de précipité indique la présence de tanins condensés de type pyrogallique.
c)Test au chlorure ferrique : L’extrait aqueux du 3ème tube reçoit 1 ml de solution méthanolique de chlorure ferrique (FeCl3) 10%. Le virage de la solution au bleu vert ou au vert noir signifie la présence des tanins condensés alors qu’un virage de la solution au noir bleuâtre révèle la présence des tanins hydrolysables.
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Etude chimique Si le test à la gélatine salée est négatif alors que le test au chlorure ferrique est positif, l’extrait contient d’autres composés phénoliques.
2.5.2.2.4. Les désoxyoses : Test de KELLER-KILIANI
Dans un tube à essai, à 0,5 ml d’extrait aqueux sont ajoutés successivement 0,5 ml de solution méthanolique de chlorure ferrique 10% et 0,5 ml d’acide acétique glacial. Après agitation, 0,5 ml de H2SO4 36 N est versé dans le tube à essai le long de la paroi. La formation d’un anneau pourpre à l’interface indique la présence de désoxyoses dans l’extrait à tester.
2.5.2.2.5. Les iridoïdes
Un volume de 0,5 ml d’extrait aqueux est ajouté à 0,5 ml d’acide chlorhydrique 12 N. Le mélange est porté au bain-marie bouillant pendant 30 min. Le virage de la coloration au vert foncé traduit la présence d’iridoïdes dans l’extrait à analyser.
2.5.2.2.6. Les anthraquinones : Test de BORNTRAGER
L’extrait aqueux (0,5 ml) est mélangé volume à volume avec du benzène. La solution obtenue est agitée énergiquement puis laissée au repos. Après décantation, 2 phases sont observées : une phase aqueuse et une phase benzénique. La phase benzénique (phase supérieure) est recueillie et ajoutée de 0,5 ml d’ammoniaque (NH4OH) 25%. Après agitation du mélange, le virage de la phase alcaline (phase inférieure) au rouge indique la présence d’anthraquinones dans l’extrait.
2.5.2.2.7. Flavonoïdes et leucoanthocyanes
L’extrait hydroéthanolique est réparti dans 4 tubes à essai à raison de 1 ml par tube. Le 4èmetube sert de témoin.
a)Les flavonoïdes : TEST DE WILLSTÄTTER
Dans le 1er tube, 0,5 ml d’HCl 12 N et 2 tournures de magnésium sont ajoutés. La présence de flavonoïdes est indiquée par le changement de la coloration de la solution en : rouge pour les flavones ; rouge pourpre pour les flavonols et rouge violacé pour les flavonones et les flavonols.
Dans le 2ème tube, la même opération est répétée mais le mélange est additionné de 1 ml d’eau distillée et de 1 ml d’alcool isoamylique. Une coloration rouge à rouge violacé de la phase supérieure indique la présence de flavones et une coloration verte celle des flavonols.
b) Les leucoanthocyanes : Test de BATE-SMITH
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Etude chimique Dans le 3ème tube, 0,5 ml d’HCl 12 N est additionné à 1 ml d’extrait hydroéthanolique. La solution acidifiée est portée au bain-marie bouillant pendant 30 min. Après refroidissement, l’apparition d’une coloration rouge traduit la présence de leucoanthocyanes.
2.5.2.2.8. Les stéroïdes et les triterpènes
L’extrait chloroformique est distribué dans 3 tubes à essai à raison de 1 ml par tube. Le 3ème tube sert de témoin.
a)Test de LIEBERMANN-BUCHARD
Dans le 1er tube, 4 gouttes d’anhydride acétique sont ajoutées à 1 ml d’extrait chloroformique. Après agitation, quelques gouttes d’acide sulfurique (H2SO4) 36 N sont ajoutées le long de la paroi du tube incliné contenant le mélange. La formation d’un anneau rouge violet ou rose à l’interface des deux liquides révèle la présence de triterpènes alors qu’une coloration bleue verdâtre de la phase supérieure aqueuse traduit la présence de stéroïdes.
b)Test de SALKOWSKI
ème Le 2 tube contient un mélange de 1 ml d’extrait à traiter et 1 ml de H2SO4 36 N. Le mélange est agité puis laissé décanter. L’apparition d’un anneau de séparation rouge pourpre entre les 2 liquides non miscibles révèle la présence de stérols insaturés.
RESULTATS
1. EXTRAITS OBTENUS
Les principes actifs de la poudre d’écorces de tige d’Albizia gummifera ont été extraits par deux méthodes : une extraction à froid, aqueuse d’une part et hydroéthanolique 75% d’autre part et une extraction aqueuse à chaud (voir paragraphe 2.1.1, p. 13 ; 2.1.2, p. 14).
Les extraits bruts obtenus ont été testés sur souris selon la méthode décrite au paragraphe 2.1.1 (p. 30).
1.1 Extrait obtenus à froid 1.1.1 Extrait aqueux Dix grammes de poudre d’écorces de tige ont été délayés dans 100 ml d’eau distillée. Un extrait brut limpide (noté Eb1, de volume 10 ml), de couleur jaune orangé et de goût fade a été obtenu. Il était toxique sur souris.
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Etude chimique 1.1.2 Extrait hydroéthanolique Un mélange hydroéthanolique 75% a été utilisé pour l’extraction de 10 g de poudre d’écorces de tige selon la méthode décrite au paragraphe 2.1.1 (p. 13). Un extrait brut limpide (noté Eb2, de volume 10 ml), de couleur brunâtre, de goût fade et toxique sur souris a été obtenu. 1.2 Extrait aqueux à chaud L’extraction aqueuse à chaud a été effectuée en délayant 10 g de poudre d’écorces de tige dans 100 ml d’eau distillée, selon la méthode décrite au paragraphe 2.1.2 (p. 14). Un extrait brut limpide dénommé EB (10 ml), de couleur marron clair et de goût fade, a été obtenu. Il était toxique sur souris. Les caractéristiques des différents extraits bruts obtenus à partir des écorces de tige d’Albizia gummifera sont montrées dans le tableau n° 3 ci-dessous.
Tableau n° 3 : Caractéristiques des différents extraits bruts obtenus.
Hydroéthanolique Extraction Aqueuse à froid Aqueuse à chaud 75% à froid Aspect limpide limpide limpide Couleur jaune orangé brunâtre brunâtre pH 5,2 5,6 5 Toxicité < 20 h < 10 h < 18 h Goût fade fade fade Rendement 4% 3,4% 6,8%
D’après ce tableau, les extraits bruts obtenus se sont tous montrés toxiques sur souris. Cependant, l’extrait brut aqueux à chaud dénommé EB a été choisi pour la suite de nos travaux car les grosses molécules ont été éliminées par la chaleur, par conséquent l’extrait devrait être facile à purifier. De plus, l’eau distillée est moins coûteuse que l’éthanol. En outre, il présente un rendement élevé par rapport aux extraits à froid (aqueux et hydroéthanolique).
2. LES EXTRAITS PURIFIES
A partir de l’EB, deux méthodes de purification, basées sur des différences de solubilité et d’adsorption, ont été réalisées afin d’isoler le(s) principe(s) toxique(s). La purification a été guidée par des tests de toxicité sur souris et d’homogénéité sur CCM.
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Etude chimique 2.1. Extrait butanolique
L’EB (15 ml) a subi 5 fractionnements par le n–butanol selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.1 (p. 14), donnant 2 phases bien séparées :
une phase organique, d’aspect limpide, de couleur jaune, toxique sur souris, dénommée E1; une phase aqueuse, d’aspect trouble, de couleur marron foncé, non toxique sur souris, notée AQ.
Nos principes actifs étaient donc présents dans la phase organique. Ainsi celle-ci a constitué l’extrait E1 et a été choisie pour l’étape de la purification suivante.
2.2. Extrait charbon actif
L’extrait E1 (15 ml) a été filtré sur une couche de charbon actif, à raison de 33,33 mg par ml d’extrait, suivant la méthode décrite au paragraphe 2.2.2 (p. 14). Un filtrat d’aspect limpide, incolore, de goût fade et toxique sur souris, a été obtenu. Ce filtrat a été nommé extrait E2. Les procédés d’extraction et de purification sont récapitulés sur la figure 3 (p. 23).
3. RENDEMENTS
A partir de 10 g de poudre d’écorces de tige d’Albizia gummifera, le résidu d’évaporation à sec de l’extrait brut aqueux à chaud (EB) pèse 0,650 g. Le poids du résidu sec de l’extrait purifié E2 est de 0,033 g. Selon la méthode de calcul de rendement décrite au paragraphe 2.4 (p. 15), le rendement d’extraction par rapport à la poudre d’écorces de tige est estimé à 6,5%. Le rendement de purification par rapport à l’EB est évalué à 5,07% et le rendement en toxines par rapport à la poudre d’écorces de tiges équivaut à 0,33%.
4. DEGRE D’HOMOGENEITE DES EXTRAITS
Le chromatogramme de la figure 4 (p. 24) montre l’évolution de l’homogénéité des différents extraits obtenus au cours de la purification. Le solvant utilisé est le système butanol/acide acétique/eau (BAE 60/20/20, p/p/p). Le chromatogramme a été révélé par le réactif à la vanilline sulfurique (voir paragraphe 2.5.1.2.4, p. 16). Les différents constituants apparaissent sous forme de taches fluorescentes avec la vanilline sulfurique.
Ainsi l’EB comporte 7 bandes majeures alors que l’extrait E2 n’en présente que 2. La purification a donc permis d’éliminer 5 bandes majeures.
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Etude chimique
Poudre d’écorces de tige
pesant 10 g
Extraction aqueuse à chaud
Extrait brut : EB
0,650 g
Fractionnement par le n-butanol Phase aqueuse écartée
Phase organique : E1
0,100 g
Filtration sur charbon actif
Filtrat : E2
0,033 g
Figure 3 : Schéma récapitulatif de l’extraction et de la purification des principes actifs d’écorces de tige d’Albizia gummifera.
Les chiffres indiquent les poids des résidus d’évaporation à sec.
23
Etude chimique
Figure 4 : Chromatogramme dans le système BAE (60/20/20, p/p/p) des extraits
d’écorces de tige d’Albizia gummifera. Révélation à la vanilline sulfurique. E
EB : extrait brut aqueux à chaud ;
E1 : extrait organique butanolique; AQ : phase aqueuse butanolique; E2 : extrait charbon actif.
5. CARACTERISATION CHIMIQUE
5.1. Propriétés physico-chimiques
Les différentes méthodes d’extraction et de purification ont apporté des informations sur les propriétés physico-chimiques des principes toxiques d’écorces de tige d’Albizia gummifera. Ainsi :
les principes toxiques sont solubles dans l’eau et le n-butanol ; ils sont thermostables ; ils ont un goût fade ils ne sont pas adsorbés sur le charbon actif. Cela confirme qu’ils ont un faible poids moléculaire et n’ont pas de structure aromatique.
24
Etude chimique 5.2. Nature chimique
Un criblage phytochimique de l’EB et des extraits partiellement purifiés (E1 et E2) a été effectué, afin d’identifier la nature des principes toxiques. Les résultats sont présentés dans le tableau n° 4 ci-dessous.
Tableau n° 4 : Résultats du criblage phytochimique de la poudre végétale et des différents extraits EB, E1 et E2.
Résultats Famille chimique Test Poudre EB E1 E2 MAYER ------Alcaloïdes WAGNER - -
- - - - DRAGENDORFF
Leucoanthocyanes BATE-SMITH + + + +
Flavonoïdes WILLSTATTER - - - -
Gélatine - - - - Tanins et polyphénols Gélatine salée - - - - Chlorure ferrique - - - -
Iridoïdes HCl à chaud - - - -
Saponosides Indice de mousse + + + +
Désoxyoses KELLER-KILIANI - - - -
Anthraquinones BORNTRAGER - - - -
Stéroïdes + - - - LIEBERMAN-BURCHARD Triterpènes + + + +
Stérols insaturés SALKOWSKI + + + -
+ : test positif - : test négatif EB = extrait brut aqueux à chaud E1 = extrait organique butanolique E2 = extrait charbon actif
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Etude chimique Les résultats montrent que les extraits EB et E1 renferment des leucoanthocyanes, des saponosides, des triterpènes ainsi que des stérols insaturés. L’extrait E2 comprend des leucoanthocyanes, des saponosides et des triterpènes.
DISCUSSION ET CONCLUSIONS
L’étude chimique effectué sur l’écorce de tige d’Albizia gummifera a permis de mettre en évidence la présence de principes toxiques dans ses extraits.
Trois méthodes d’extraction ont été réalisées pour extraire ces principes toxiques mais la méthode d’extraction aqueuse à chaud a été adoptée pour la suite des travaux car l’extrait brut obtenu, limpide, de couleur brunâtre est déjà clarifié. De plus, la technique est moins coûteuse que l’extraction hydroéthanolique.
A partir de l’EB, un procédé de purification comportant un fractionnement par le n- butanol suivi d’une filtration sur charbon actif, a permis d’obtenir un extrait partiellement purifié avec un rendement de purification de 5,07%. Celui-ci est nettement inférieur à celui des écorces de tige d’Albizia polyphylla (11,5%) (JAOFENO, 2016). Le rendement en toxines est de 0,33%. Cette valeur est supérieure à celle de l’extrait de graines d’Albizia androyensis (0,14%) (RASOLOFOMANANA, 2015), de feuilles d’Albizia boivinii (0,18%) (RATSIMIEBO, 2016) et d’écorces de tige d’Albizia polyphylla (0,2%) (JAOFENO, 2016), mais nettement inférieure à celle des feuilles d’Albizia arenicola (1,004%) (RAKOTOMALALA, 2012).
Les principes toxiques de l’écorce de tige d’Albizia gummifera sont thermostables, solubles dans l’eau, l’éthanol et le n-butanol. Ils ne sont pas adsorbés sur le charbon actif et ne renferment pas de substances à structure aromatique.
D’après le criblage phytochimique, les principes toxiques pourraient être des leucoanthocyanes, des triterpènes et des saponosides.
Ces familles chimiques présentes dans les écorces de tige d’A. gummifera ont été rencontrées dans d’autres espèces malgaches et étrangères. A titre d’exemples, on peut citer :
les saponosides des : feuilles d’A. arenicola et A. boivini (RAKOTOMALALA, 2012 et RATSIMIEBO, 2016) ; des graines d’A. lebbeck, A. boivini, A. mahalao, et A. divaricata (ANDRIANTSOA, 1983, RAHERINIAINA, 1999 ; RAKOTOARIVONY, 2012 ; RAKOTOMALALA, 2015) ; des écorces de tiges d’A. gummifera, A. chinensis et A. julibrissin, (DEBELLA et coll., 2000 ; LIU et
26
Etude chimique coll., 2009 ; CAI et coll., 2015) ; des tiges d’A. lebbeck et A. procera (PAL et coll., 1995 ; MELEK et coll., 2007), des racines d’A. boromoensis (NOTE et coll., 2015) ; les triterpènes des graines d’A. arenicola, A. greveana et A. divaricata (MOUNIDATI, 2009 ; RAHELIARISATA, 2014 ; RAKOTOMALALA, 2015) ; les leucoanthocyanes des feuilles d’A. boivinii (RATSIMIEBO, 2016) ;
Comme Albizia gummifera est ubiquitaire, les familles chimiques varient selon les organes étudiés de la plante et la localisation géographique. Ainsi :
A Madagascar, les leucoanthocyanes, les triterpènes et les saponosides sont présents dans les extraits d’Albizia gummifera (auteur). En Afrique, - des alcaloïdes ont été trouvés dans l’extrait méthanolique (RUKUNGA, 2007) ; - des saponines, terpènes, flavonoïdes et composés phénoliques ont été mis en évidence dans les graines (NIGUSSIE et coll, 2015) ; - des glycosides oléanane, des saponines triterpénoïdes et sapogénines lactones ont été trouvés dans l’écorce de tige (DEBELLA et coll., 2000 ; RUKUNGA et coll., 2001) ; - des flavonoïdes, saponines et tanins ont été détectés dans l’extrait acétone des feuilles (MAKGATHO et coll., 2015).
En conclusion, les écorces de tige d’Albizia gummifera comportent des principes actifs toxiques sur souris qui pourraient être des saponosides à génine triterpénique ou des leucoanthocyanes.
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ETUDE TOXICOLOGIQUE
Etude toxicologique
INTRODUCTION
L’étude chimique effectuée sur l’écorce de tige d’Albizia gummifera a permis d’extraire et de purifier des principes actifs toxiques sur souris.
Dans la présente partie, les propriétés toxiques des différents extraits obtenus ont été explorées sur les souris et les microorganismes.
Ainsi, nous avons étudié : la toxicité aiguë de l’extrait brut aqueux à chaud (EB) sur les souris ; les effets de tous les extraits obtenus sur la croissance des microorganismes ; l’activité antioxydante de l’EB.
MATERIELS ET METHODES
1. MATERIELS
1.1 Les animaux d’expérimentation : animaux à sang chaud (souris)
Les souris Mus musculus de race OF1 ont été fournies par l’Institut Pasteur de Madagascar (IPM) puis élevées à l’animalerie de la Mention Biochimie Fondamentale et Appliquée (MBFA) de la Faculté des Sciences.
1.2 Matériels de microbiologie
1.2.1. Les souches microbiennes
Les souches utilisées sont celles disponibles au Laboratoire de Microbiologie de la MFBA. Les informations sur ces souches microbiennes sont résumées dans le tableau n° 5 (p. 30)
1.2.2. Les milieux de culture
Des milieux de culture solides et liquides ont été utilisés. Ce sont :
le milieu de Mueller-Hinton qui est un milieu solide utilisé pour l’étude de la sensibilité des bactéries et de la levure ; le milieu Nutrient Broth qui est un milieu liquide employé pour la détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI).
La composition de ces milieux est donnée en ANNEXE III.
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Etude toxicologique
Tableau n° 5 : Souches microbiennes utilisées.
Nom de la souche Gram Morphologie Référence Enterobacter aerogenes - Bacille ATCC 13048 Enterobacter cloaceae - Bacille ATCC 13047 Yersinia enterocolitica - Bacille ATCC 23715 Bacillus cereus + Bacille ATCC 14579 Clostridium perfringens + Bacille ATCC 13124 Staphylococcus aureus + Coque ATCC 25923 Streptococcus pneumoniae + Coque ATCC 6305 Candida albicans Levure unicellulaire ATCC 10231 ATCC = American Type Culture Collection
1.2.3. Les disques d’antibiogramme
Les extraits à tester sont déposés sur des disques de 6 mm de diamètre découpés dans du papier buvard autoclavable.
2. METHODES
2.1. Méthodes d’étude des effets sur souris
(NENEBI et coll., 2008 ; GOME et coll., 2011)
2.1.1. Voies d’administration des extraits
Deux voies d’administration ont été utilisées pour évaluer la toxicité des extraits sur souris : la voie orale (gavage ou per os) et la voie intrapéritonéale (ip).
Pour chaque voie d’administration, deux lots de trois souris de même sexe pesant 25± 2 g sont utilisés. Le premier lot sert de témoin, le deuxième est employé pour le test.
2.1.1.1. Voie orale (gavage)
L’extrait à tester est administré lentement à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de gavage à bout arrondit et recourbé. L’aiguille est enfoncée jusqu’au fond de l’estomac, puis retirée rapidement pour éviter un reflux. Le volume administré est de 0,5ml pour 25 g de souris. Les souris du lot témoin reçoivent du chlorure de sodium (NaCl 9‰) (0,5 ml).
30
Etude toxicologique
2.1.1.2. Voie intrapéritonéale (ip)
L’extrait à tester est injecté avec une seringue dans la cavité abdominale, à raison de 0,3 ml par 25 ± 2 g de poids de souris. Les observations durent 24 h.
2.1.2. Détermination de la DL50 (24 h) par voie ip
La dose létale 50% (24 h) ou DL50 (24 h) est la dose qui provoque la mort de 50% des animaux testés pendant 24 h. Elle est estimée selon deux méthodes.
2.1.2.1. Méthode de REED et MUENCH (1938)
Selon cette méthode, la DL50 (24 h) peut être déterminée :
soit à partir de la formule suivante :
log DL50= log B + log r
Où:
B = dose immédiatement inférieure à la DL50 ; N = mortalité provoquée par la dose B ;
M = mortalité provoquée par la dose immédiatement supérieure à la DL50 ; r = raison de progression algébrique.
soit par la méthode graphique, pour laquelle la valeur de la DL50 (24 h) est déterminée à partir de l’intersection de la courbe des totaux cumulatifs des
survivants et celle des morts en fonction des doses injectées par voie ip. La DL50 (24 h) correspond à la projection sur l’axe des abscisses du point d’intersection des deux courbes des totaux cumulatifs.
Pour ces deux méthodes, 6 doses d’extrait à tester en progression géométrique de raison r sont injectées à 6 lots de 5 souris de même sexe pesant 30 ± 2 g. Elles se situent entre la plus faible dose entraînant la mort de 100% des animaux testés (DL100) et la plus forte dose donnant 0% de décès (DL0)
2.1.2.2. Méthode graphique de BOYD (1966)
D’après cette méthode, la DL50 (24 h) est calculée à partir de la droite de régression linéaire de la relation suivante:
% mortalité = f (dose)
L’équation de cette droite de régression est : Y = A+BX
31
Etude toxicologique
Où :
Y = pourcentage de mortalité A = constante B = coefficient de régression X = log (dose)
2.2. Méthode d’étude des effets in vitro sur les microorganismes
2.2.1. Stérilisation
Les matériels utilisés, comme les milieux de culture, les disques d’antibiogramme, les solutions physiologiques (NaCl 9‰) ainsi que les cônes de micropipette sont stérilisés à l’autoclave, à 121°C pendant 1 h sous une pression de 2 bars.
La verrerie et les pinces sont stérilisées à l’étuve à 180°C pendant 30 min.
Les mains du manipulateur et la paillasse sont lavées à l’alcool 70°C et toutes les manipulations sont effectuées entre deux flammes de becs Bunsen.
2.2.2. Détermination de l’activité antimicrobienne des extraits (LECLERC et coll., 1992 ; AJAM et coll., 2012)
2.2.2.1. Principe
L’activité antimicrobienne des extraits est évaluée par la méthode des disques ou méthode de diffusion en milieu gélosé. La sensibilité microbienne vis-à-vis de l’extrait à tester est déterminée par la mesure du diamètre de la zone d’inhibition ou halo d’inhibition, formé après diffusion des composés.
2.2.2.2. Mode opératoire
Le test se déroule en 3 étapes :
Pré-culture
Les souches à tester sont ensemencées chacune en stries serrées sur du milieu solide coulé dans une boite de Petri. Elles sont incubées pendant 24 h à 37°C pour les bactéries et à 25°C pour la levure.
Ensemencement et dépôt des disques
A partir de la pré-culture, une petite colonie est prélevée à l’aide d’une anse stérile. Pour chaque souche, ce prélèvement est mis en suspension dans 10 ml de NaCl 9‰ afin
32
Etude toxicologique d’avoir une concentration cellulaire correspondant à un étalon 0,5 Mac Farland (106UFC/ml). L’inoculum est ensuite ensemencé par inondation dans des boites de Petri contenant le milieu de Mueller-Hinton et l’excès est aspiré à l’aide d’une micropipette. Une courte incubation de 15 min à l’étuve est nécessaire pour permettre l’adhésion des germes sur le support. Les disques sont imprégnés chacun de 10 μl d’extrait à tester de concentration 100 mg/ml et déposés ensuite à la surface du milieu ensemencé.
Incubation L’incubation dure 24 h à 37°C pour les bactéries et à 25°C pour la levure. Les résultats sont exprimés suivant les normes de PONCE et coll. (2003) (tableau n°6).
Tableau n° 6 : Normes utilisées pour l’expression des résultats obtenus par la méthode des disques.
Diamètre du halo Degré de la sensibilité Résultat d’inhibition (X) des germes X ≤ 8mm Insensible - 9mm ≤ X ≤ 14mm Sensible + 15mm ≤ X ≤ 19mm Très sensible ++ X ≥ 20mm Extrêmement sensible +++
2.2.3. Détermination de la concentration minimale inhibitrice ou CMI
(KUETE et coll., 2009 ; ATSAFACK et coll., 2016)
La CMI est la plus faible concentration d’antibiotique pour laquelle aucune croissance bactérienne n’est observée. Elle est déterminée par la méthode de dilution en milieu liquide.
2.2.3.1. Méthode de dilution en milieu liquide sur microplaque
Préparation des solutions à tester :
Les extraits sont dilués au demi en cascade à partir d’une solution-mère de concentration 100 mg/ml afin d’obtenir une gamme de 10 concentrations.
Préparation de la pré-culture :
Sur une boîte de Petri contenant de la gélose, la souche pure est repiquée selon la méthode des stries puis le tout est laissé incuber à 37°C pendant 24 h.
33
Etude toxicologique
Préparation de l’inoculum :
Une ansée de germe est prélevée à partir de la pré-culture ci-dessus et mise en suspension dans 2 ml d’NaCl 9‰ puis 1ml de cette suspension est ensuite dilué dans 9 ml de NaCl 9‰. La suspension obtenue sert d’inoculum.
Inoculation :
Le test est réalisé dans les puits ou cupules d’une microplaque à 96 puits à fond en U. Deux puits servent de témoins, à savoir :
Témoin négatif (T-) : 200 μl de milieu liquide : absence de croissance des germes.
Témoin positif (+) : 5 μl d’inoculum et 195 μl de milieu liquide : croissance normale des germes.
Dans les puits restants, 5 μl d’inoculum, 95 μl de milieu liquide et 100 μl de l’extrait dilué sont introduits à l’aide d’une micropipette. Tous les tests sont réalisés en double.
Après 24 h d’incubation de la plaque à la température adéquate, 40 μl d’un indicateur coloré appelé chlorure de para-iodonitrotétrazolium (INT) de concentration 0,2 mg/ml sont ajoutés pour révéler la croissance microbienne, c’est-à-dire qu’en cas de croissance microbienne, la coloration jaune de l’INT vire au violet. Ainsi, la CMI correspond à la concentration du premier puits non coloré.
Les compositions des différents milieux sont présentées dans le tableau n° 7.
Tableau n° 7 : Composition des milieux utilisés pour la détermination de la CMI.
Puits n° 1(T-) 2(T+) 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Concentration de l’extrait à 0 0 0,19 0,39 0,78 1,56 3,125 6,25 12,5 25 50 100 tester (mg/ml) Volume de 0 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 l’extrait (µl) Volume de 0 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 l’inoculum (µl) Volume du milieu de 200 195 95 95 95 95 95 95 95 95 95 95 culture (µl) Concentration finale de 0 0 0,09 0,19 0,39 0,78 1,56 3,125 6,25 12,5 25 50 l’extrait (mg/ml)
34
Etude toxicologique
2.2.4. Détermination de la Concentration Minimale Bactéricide
La Concentration Minimale Bactéricide (CMB) est la plus faible concentration d’antibiotique capable de provoquer la mort ou la destruction des microbes (bactéries, levures).
Sur une boîte de Petri contenant le milieu gélosé de Mueller-Hinton, les suspensions bactériennes des puits qui ne présentent pas de croissance (non coloré par INT) sont ensemencées à l’aide d’une anse stérile. Après 24 h d’incubation à 37°C, la CMB ou la CMF correspond à la plus faible concentration de l’extrait où aucune colonie n’a pu se développer.
2.3. Etude de l’activité antioxydante (BRILLANT et coll., 2006)
2.3.1. Principe
La détermination de l’activité antioxydante est réalisée en utilisant le 2,2- diphényl- 1-picrylhydrazyl (DPPH), un radical libre qui présente une coloration violet sombre. Le DPPH de couleur violette est réduit en DPPHH de couleur jaune quand il est piégé par des substances antioxydantes. Ce virage de coloration dépend de la nature et la concentration de la substance antiradicalaire.
Figure 5 : Réaction de réduction du DPPH. Figure 5 :Réaction de réduction du DPPH 2.3.2. Mode opératoire
L’extrait à analyser et l’acide ascorbique (servant de témoin) sont déposés sur une plaque de silice préalablement préparée (voir paragraphe 2.5.1.2.2, p. 16). Cette plaque est ensuite placée dans une cuve chromatographique contenant le solvant de migration qui est le système n-butanol/acide acétique/eau distillée, 60/20/20 (p/p/p).
Une solution méthanolique de DPPH à 2 mg/ml est ensuite pulvérisée sur la plaque séchée et le virage de coloration est observé après 5 min. L’apparition d’une coloration
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Etude toxicologique
jaune sur la plaque traduit la présence dans l’extrait testé, de molécules ayant une activité antioxydante.
RESULTATS
1. EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT SUR SOURIS
1.1. Description des symptômes d’intoxication
L’administration de l’EB per os (gavage ou voie orale), à une dose égale à
279,72mg/kg (DL100 par voie ip fois 3), n’a provoqué aucun symptôme d’intoxication.
Après l’injection de l’EB par voie ip à la dose létale de 93,24 mg/kg (voir méthode 2.1.1.2 (p. 30), des symptômes d’intoxication sont apparus, constitués par :
une contorsion abdominale observée immédiatement après l’injection, une enophtalmie, un regroupement des souris dans un coin de la cage, une augmentation du rythme cardiaque suivie d’une difficulté de déplacement, une convulsion clonique précédant la mort au bout de 6 h à 18 h.
1.2. Détermination de la DL50 (24 h)
La DL50 de l’EB a été évaluée par voie ip. Les méthodes utilisées sont décrites dans le paragraphe 2.1.2 (p. 31)
Six doses situées entre 37,44 mg/kg (DL0) et 93,24 mg/kg (DL100), en progression géométrique de raison 1,2 ont été utilisées. Les résultats expérimentaux sont résumés dans le tableau n° 8.
Tableau n° 8 : Résultats expérimentaux de la détermination de la DL50 (24 h).
Dose Nombre de décès après Total Total des Taux de en des survivants mortalité mg/kg 12 h 14 h 16 h 17 h 18 h 19 h 20 h 24 h décès 37,44 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0% 45 0 0 1 0 0 0 0 0 1 4 20% 54 1 0 0 1 1 0 0 0 2 3 40% 64,8 0 0 1 0 1 1 0 0 3 2 60% 77,76 2 1 0 1 0 0 0 0 4 1 80% 93,24 0 0 5 0 0 0 0 0 5 0 100%
36
Etude toxicologique
D’après la formule de REED et MUECH (1938) donnée au paragraphe 2.1.2.1
(p.31), B = 54 ; N = 0,4 ; M = 0,6 et r = 1,2. La valeur de la DL50 (24 h) est ainsi estimée à 59,15 mg/kg.
Par la méthode graphique des totaux cumulatifs des mêmes auteurs, la valeur de la
DL50 (24 h) est de l’ordre de 60 mg/kg (tableau n° 9, figure 6)
Tableau n° 9 : Valeurs utilisées pour la détermination graphique de la DL50 (24 h).
Dose Nombre de Nombre de souris Totaux cumulatifs (mg/kg de souris souris) testées survivantes mortes survivantes mortes 37,44 5 5 0 15 0 45 5 4 1 10 1 54 5 3 2 6 3 64,8 5 2 3 3 6 77,76 5 1 4 1 10 93,24 5 0 5 0 15
16
14 12 10 8 6 4 2
Totaux cumulatifs des souris des cumulatifs Totaux 0 Dose en mg/kg 0 20 40 60 80 100 DL 50 (24 h)
Totaux cumulatifs des survivantes Totaux cumulatifs des mortes
Figure 6 : Détermination graphique de la DL50 (24 h).
D’après la méthode de BOYD (1966), les données expérimentales utilisées pour la détermination de la DL50 (24 h) sont présentées dans le tableau n° 10 (p. 38). L’équation de la droite de régression est : Y= -59,96 + 1,77 log (dose), avec un coefficient de corrélation r égal à 0,97. La DL50 (24 h) est de 60,03 mg/kg.
D’après les 2 méthodes (REED et MUENCH, 1938 ; BOYD, 1966), la DL50 (24 h) de l’EB serait donc comprise entre 59,15 mg/kg et 60,03 mg/kg de souris.
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Etude toxicologique
Tableau n° 10 : Données utilisées pour la détermination de la DL50 par la méthode de BOYD.
Dose en mg/kg log de la dose Souris mortes Taux de mortalité 37,44 1,57 0 0% 45 1,65 1 20% 54 1,73 2 40% 64,8 1,81 3 60% 77,76 1,89 4 80% 93,24 1,97 5 100%
2. EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMES
2.1. Activité antimicrobienne des différents extraits bruts et purifiés
L’activité des différents extraits obtenus lors de l’extraction et de la purification a été réalisée sur 8 souches microbiennes. La concentration utilisée pour chaque extrait est de 100 mg/ml. Le tableau n° 11 montre les diamètres du halo d’inhibition des souches testées avec ces extraits.
Tableau n° 11 : Activité des différents extraits sur la croissance des souches testées (diamètre des halos d’inhibition en mm).
Nom des souches EB Eb1 Eb2 AQ E1 E2 Bacillus cereus - - 12 - 10 - Staphylococcus aureus - - 13 - - -
Streptococcus pneumoniae - - 14 - 12 -
Clostridium perfrigens ------Enterobacter cloaceae - - 11 - - -
Enterobacter aerogenes ------Yersinia enterocolitica - - 10 - 8 -
Candida albicans 14 13 17 10 15 8
- : diamètre de halo inférieur à 8 mm (souche insensible), EB = extrait brut aqueux à chaud ; Eb1 = extrait brut aqueux à froid ; Eb2 = extrait brut hydroéthanolique 75% à froid ; AQ = extrait aqueux butanolique ; E1 = extrait organique butanolique ; E2 = extrait charbon actif.
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Etude toxicologique
D’après ce tableau, les extraits EB, Eb1, Eb2, AQ et E2 ne possèdent aucune activité sur les bactéries testées.
L’extrait Eb2 est actif sur les bactéries : Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Enterobacter cloaceae, Yersinia enterocolitica qui se sont toutes montrées sensibles.
L’extrait E1 est inactif sur Yersinia enterocolitica mais actif sur 2 bactéries : Bacillus cereus et Streptococcus pneumoniae (sensibles).
Candida albicans est insensible à l’extrait E2, sensible aux extraits AQ, Eb1 et EB et très sensible aux extraits E1 et Eb2.
La figure 7 ci-après illustre à titre d’exemple les effets des extraits obtenus (EB, Eb1, Eb2, AQ, E1 et E2) sur la croissance de Candida albicans .
Halo d’inhibition
EB
Eb1 E2
Disque imbibé d’extrait
Eb2 AQ
E1
Figure 7 : Illustration des effets des extraits sur Candida albicans.
2.2. Détermination de la CMI et la CMF
Les extraits (EB, E1, AQ, E2 et Eb2) ont été utilisés pour la détermination de la CMI et de la CMF sur Candida albicans (souche la plus sensible).
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Etude toxicologique
2.2.1. Détermination de la CMI
Les CMI en mg/ml des extraits utilisés sont présentées dans le tableau n° 12.
Tableau n° 12 : Valeurs de la CMI estimées sur Candida albicans.
Extraits EB E1 AQ E2 Eb2 Souches
Candida albicans 3,12 mg/ml 1,56 mg/ml 12,5 mg/ml 25 mg/ml 0,78 mg/ml
A titre d’exemple, les effets de l’extrait E1 sur Candida albicans sont présentés dans le tableau n° 13 et sur la figure 8.
Tableau n° 13 : Effets de différentes concentrations de l’extrait E1 sur Candida albicans.
Tube n° T+ T - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Concentration de l’extrait 0 0 0,09 0,19 0,39 0,78 1,56 3,125 6,25 12,5 25 50 (mg/ml)
Résultat + - + + + + ------
T + T - 1 2 3 4 5 6 7 + = croissance de Candida albicans; - = absence de croissance de Candida albicans T+ T- 0 0,19 0,39 0,78 1,56 3,125 6,25 12,5 25 50
Figure 8 : Résultats de la détermination de la CMI de l’extrait E1 sur Candida albicans.
2.2.2. Détermination de la CMF
Déterminées selon la méthode décrite au paragraphe 2.2.4 (p. 35), les CMF des extraits testés sont récapitulées dans le tableau 14 (p. 41).
40
Etude toxicologique
Tableau n° 14: Valeurs des CMF des extraits testés sur Candida albicans.
Extraits EB E1 AQ E2 Eb2 Souches
Candida albicans 50 mg/ml 25 mg/ml 105 mg/ml 110 mg/ml 50 mg/ml
D’après ce tableau, les CMF varient de25 à 110 mg/ml.
Les rapports CMF/CMI des extraits testés sur Candida albicans sont récapitulés dans le tableau n° 15 (p. 41).
Tableau n° 15 : Valeurs des rapports CMF/CMI des extraits sur Candida albicans.
Extraits
EB E1 AQ E2 Eb2
Paramètres CMF (mg/ml) 50 25 105 110 50
CMI (mg/ml) 3,12 1,56 12,5 25 0,78
CMF/CMI 16,02 16,02 8,4 4,4 64,10
D’après ces résultats, tous les extraits (EB, E1, AQ, E2 et Eb2) étaient fongistatiques.
3. ACTIVITE ANTIOXYDANTE
L’activité antioxydante se traduit par la capacité de réduction des radicaux libres. Cette activité pour l’EB de l’écorce de tige d’Albizia gummifera a été évaluée selon la méthode au DPPH donnée au paragraphe 2.3 (p. 35).
Le résultat est montré sur la figure 9.
T EB
Figure 9 : Résultat de la mise en évidence de l’activité antioxydante.
41
Etude toxicologique
L’apparition de la couleur jaune sur la plaque de gel de silice montre la présence de molécules ayant une activité antioxydante dans l’EB.
DISCUSSION ET CONCLUSIONS
Les extraits d’écorce de tige d’Albizia gummifera se sont avérés toxiques sur les souris et les microorganismes.
Effets sur les souris :
La toxicité aiguë a été déterminée selon deux voies. Par voie ip, l’EB à 93,24 mg/kg a provoqué principalement, une enophtalmie, un regroupement des souris dans un coin et une augmentation de rythme cardiaque suivie d’une convulsion clonique. L’ensemble de ces symptômes suggère que l’EB agit au niveau des systèmes nerveux, cardiovasculaire et respiratoire.
Par contre, l’absence de signe d’intoxication de l’EB par voie orale, à la dose de 279,72 mg/kg, pourrait être due à une détoxification des principes toxiques au niveau du tube digestif (RATSIMIEBO, 2012)
La valeur de la DL50 (24 h) de l’EB est estimée entre 58,68 et 62,03 mg/kg. D’après
NENE BI et coll. (2008), une substance possédant une DL50 (24 h) comprise entre 50mg/kg et 500 mg/kg, est considérée comme très toxique. Par conséquent, l’EB peut être classé parmi les substances très toxiques.
En comparant les indices de toxicité d’Albizia gummifera avec les Albizia déjà
étudiées au LABASM, la DL50 (24 h) de l’EB est inférieure à celles des graines d’A. greveana, d’A. tulearensis, d’A. divaricata, d’A. mahalao et d’A. arenicola. Elle est plus ou moins égale à celle des cosses d’A. boivinii, mais elle est supérieure à celle des écorces de tige d’A. polyphylla et des feuilles d’A. boivinii.
Le tableau n° 16 (p. 43) récapitule les DL50 (24 h) de quelques espèces d’Albizia malgaches déjà étudiées au LABASM.
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Etude toxicologique
Tableau n° 16 : DL50 (24 h) d’espèces d’Albizia déjà étudiées au LABASM.
Partie Espèce DL (mg/kg) Référence utilisée 50 A. greveana Graines Entre 1,13 et 1,87 RAHELIARISATA (2014) A. tulearensis Graines Entre 2,9 et 3,2 RAONIHARISOA (2003) A. divaricata Graines Entre 4,78 et 7,72 RAKOTOMALALA (2015) A. mahalao Graines Entre 22,23 et 24,40 RAKOTOARIVONY (2012) A. arenicola Feuilles Entre 41,40 et 41,44 RAKOTOMALALA (2012) A. bernieri Graines Entre 52,23 et 55 RANDRIAMAMPIANINA (2016) A. boivini Cosses Entre 57 et 60 ARISOA (2001) Ecorces de A. gummifera Entre 59,15 et 60,03 Auteur tige A.mainaea Feuilles Entre 426,75 et 466,29 RANAIVOSON (2017) Ecorces de A. polyphylla Entre 740 et 870 JAOFENO (2016) tige A. boivinii Feuilles Entre 978,66 et 1032,218 RATSIMIEBO (2016)
L’écorce de tige d’Albizia gummifera a donc une toxicité moyenne. Effets sur les microorganismes
Tous les extraits obtenus ont été testés sur des microorganismes. Parmi eux, EB, Eb1, AQ et E2 étaient inactifs sur toutes les souches microbiennes testées. Cette absence d’activité pourrait être due à l’élimination de certaines substances antibactériennes lors de l’extraction ou lors des étapes de purification. Par contre, Eb2 et E1 étaient actifs sur des bactéries et la levure.
La valeur de la CMI de l’E1 (phase organique lors du fractionnement par n-butanol) vis-à-vis Candida albicans est de 1,56 mg/ml. Ainsi, E1est plus actif que l’extrait purifié de l’écorce de tige d’A. polyphylla qui est aussi une phase butanolique (JAOFENO, 2016) (CMI entre 3,125 et 6,25 mg/ml), mais moins actif que le produit pur arenicoline I isolée des graines d’A. arenicola (RANDRIANARIVO, 2003) (6,25 µg/ml)
Les valeurs des CMF des extraits testés sur Candida albicans ont été évaluées entre 25 à 110 mg/ml. Et les rapports CMF/CMI étaient de l’ordre de 4,4 à 64,10.
Comme les valeurs de ces rapports étaient supérieures à 4, les extraits testés ont donc manifesté une activité fongistatique sur Candida albicans (MARMONIER, 1990).
En conclusion, l’évaluation de l’activité toxicologique de écorces de tiges d’Albizia gummifera a permis de montrer que l’EB est toxique sur les souris et ont une activité antioxydante. Les extraits testés ont manifesté une activité fongistatique sur Candida
43
Etude toxicologique albicans. Comme les candidoses touchent des milliers des personnes (75% des maladies dues à Candida albicans), nos résultats sont très intéressants à exploiter (web 11).
44
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
En conclusion, les résultats des travaux réalisés sur les écorces de tige d’Albizia gummifera, une Fabacée native de Madagascar, bien qu’ils soient préliminaires, nous ont permis de :
mettre au point une technique d’extraction et de purification des principes toxiques ; déterminer les propriétés physico-chimiques des principes toxiques ainsi que leurs natures chimiques ; mettre en évidence la toxicité de ces organes sur les souris et les microorganismes ;
Dans l’avenir, nous envisageons :
d’améliorer les techniques d’extraction et de purification afin d’obtenir des principes toxique à l’état pur avec un meilleur rendement ; d’approfondir l’étude toxicologique sur d’autres animaux et microorganismes ; de tester la toxicité des extraits sur d’autres animaux et les végétaux ; d’approfondir les travaux sur l’activité antioxydante ; d’étudier les mécanismes d’action des principes actifs des écorces de tige d’Albizia gummifera.
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ANNEXES
ANNEXES
ANNEXE I: COMPOSITION DES REACTIFS GENERAUX DES ALCALOIDES
Réactifs de Mayer
Chlorure de mercure :……………………1,36 g Iodure de potassium : …………………..5 g Eau-distillée………………………………qsp 100 ml
Réactif de WAGNER
Iodure de potassium :…………………...2 g Iode :…………………………………...... 1,27 g Eau-distillée :…………………………….qsp100 ml
Réactif de DRAGENDORFF
Il s’agit d’une mélange (v/v) de 2 solutions A et B
Solution A :
Nitrate de bismuth :…………………….1, 7 g Acide tartrique concentré :……………..20 g Eau-distillée :…………………………...30 ml
Solution B :
Iodure de potassium :…………………10 g Eau-distillée :…………………………..40 ml
Le mélange est ensuite additionné de 10 g d’acide tartrique et son volume est ramené à 100 ml avec de l’eau distillée.
ANNEXE II : COMPOSITION DU REACTIF A LA VANILLINE SULFURIQUE
Vanilline :………………………………0,5 g
Acide sulfurique (H2SO4) 36N: ……..100 ml
ANNEXE III : COMPOSITION DES DIFFERENTS MILIEUX DE CULTURE
Milieu gélosé de MUELLER – HINTON (formule type g/l)
Extrait de viande………………………………....3 g Peptone……………………………………………5 g Peptone trypsique……………………………….10 g Chlorure de sodium………………………………5 g Glucose…………………………………………... 2 g Agar………………………………………………10g
Milieu liquide Nutrient Broth (formule-type g/ml) : Peptone ………………………………………….. 5 g Chlorure de sodium ……………………………… 5 g Extrait de viande ……………………………….… 1 g Extrait de levure ………………………………… 2 g
Last name : RAHARISON
First name : Miora Haingonirainy
Title : Chemical and toxicological study of stem bark extracts of Albizia gummifera, a native FABACEAE from Madagascar.
ABSTRACT
Toxic activity has been demonstrated in extracts of the stem bark of Albizia gummifera, a native Fabaceae from Madagascar. The crude extract obtained by hot aqueous extraction was purified by fractionation with n-butanol followed by filtration on activated charcoal to afford two partially purified extracts E1 and E2, which are toxic to mice. The extraction yield is 6.5%, the purification yield 5.07% and the toxin yield 0.33%. The active principles are thermostable, soluble in water, alcohol and n-butanol, and do not adsorb on the activated charcoal. Phytochemical screening of EB, E1 and E2 revealed the presence of saponins, leucoanthocyanins, triterpenes and unsaturated sterols. The steroids in the vegetable powder were removed during extraction and purification. In mice, oral administration of EB, at a dose of 279.72 mg/ml, caused no symptoms. On the contrary, intraperitoneal injection of 93.24 mg/ml of EB indicated signs that EB could affect the nervous, cardio-vascular and respiratory systems. The
LD50 (24 h) upon mice was estimated between 59.15 mg/kg and 60.03 mg/kg body weight. The EB, Eb2, E1, E2, AQ extracts exerted a fungistatic activity on Candida albicans with MICs ranging from 0.78 to 25 mg/ml and MFCs from 25 to 110mg/ml. Finally, according to the DPPH test, EB possess antioxidant activity.
Key words: Albizia gummifera, Fabaceae, stem bark, toxic, LD50 (24 h), microbial susceptibility, MIC, MFC. Advisor : Professor RAJEMIARIMOELISOA Clara Fredeline
Nom: RAHARISON
Prènoms: Miora Haingonirainy
Titre : Etude chimique et toxicologique des extraits d’écorces de tige d’Albizia gummifera, une FABACEE native de Madagascar.
RESUME
Une activité toxique a été mise en évidence dans les extraits de l’écorce de tige d’Albizia gummifera, une Fabacée native de Madagascar. L’extrait brut obtenu par extraction aqueuse à chaud a subi une purification comportant un fractionnement par le n-butanol suivi d’une filtration sur charbon actif et permettant d’obtenir deux extraits E1 et E2 partiellement purifiés, toxiques sur souris. Le rendement d’extraction est de 6,5%, le rendement de purification équivaut à 5,07% et le rendement en toxines à 0,33%. Les principes actifs sont thermostables, solubles dans l’eau, l’alcool et le n- butanol, et ne sont pas adsorbés sur le charbon actif. Le criblage phytochimique effectué sur l’EB, E1 et E2 a révélé la présence des saponines, leucoanthocyanes, triterpènes et stérols insaturés. Les stéroïdes dans la poudre végétale ont été éliminés lors de l’extraction et les différentes étapes de la purification. Chez la souris, l’administration par voie orale de l’EB, à la dose de 279,72mg/ml, n’a provoqué aucun symptôme. Par contre, l’injection de 93,24mg/ml d’EB par voie intrapéritonéale a entrainé de signes suggérant que l’EB pourrait affecter les systèmes nerveux, cardio-vasculaire et respiratoire. La DL50 (24 h) par voie ipa été estimée entre 59,15 mg/kg et 60, 03 mg/kg de souris. Les extraits EB, Eb2, E1, E2, AQ ont exercé une activité fongistatique sur Candida albicans avec des CMI variant de 0,78 à 25 mg/ml et des CMF de 25 à 110mg/ml. Enfin, selon le test au DPPH, EB possède une activité antioxydante.
Mots clés : Albizia gummifera, Fabaceae, écorces de tige, toxique, DL50 (24 h), sensibilité microbienne, CMI, CMF. Encadreur : Professeur RAJEMIARIMOELISOA Clara Fredeline