Die Suche nach neuen bioaktiven Sekundärmetaboliten aus Actinomyceten
INAUGURALDISSERTATION
Zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
vorgelegt von Anja Greule aus Calw
2016
Vorsitzender des Promotionsausschusses: Prof. Dr. Stefan Weber Dekan: Prof. Dr. Manfred Jung Referent: Prof. Dr. Andreas Bechthold Korreferent: Prof. Dr. Oliver Einsle
Datum der mündlichen Prüfung: 29. November 2016
In liebevoller Erinnerung an Flo
Phantasie ist wichtiger als Wissen, denn Wissen ist begrenzt. Albert Einstein (1879-1955) „Der Dank ist das edle Eingeständnis unserer Grenzen. Wir alle sind aufeinander angewiesen – und dies äußert sich im Geben und Nehmen, im Bitten und Danken.“ (Georg Moser)
Nach einer solchen Zeit im Labor kommt man doch mit vielen verschiedenen Menschen in Kontakt und nicht alle Versuche kann man selbst durchführen. Darum möchte ich mich unbedingt bei denen bedanken, die mir direkt oder indirekt bei dieser Arbeit geholfen haben.
Zuallererst bedanke ich mich herzlich bei meinem Doktorvater Prof. Dr. Andreas Bechthold für die Möglichkeit meine Dissertation an seinem Lehrstuhl zu machen, der mir diese tollen Themen über- lassen hat, mir aber auch alle Freiheiten gab, in Richtungen zu forschen, die mich am meisten inter- essiert haben.
Ich danke meinem Zweitprüfer Prof. Dr. Oliver Einsle für die Übernahme des Koreferats und meinem Drittprüfer Prof. Dr. Stefan Günther.
Danke, Prof. Dr. Watanalai und Dr. Bungonsiri Intra von der Mahidol Universität in Bangkok, Thailand. Bungonsiri war sechs Monate mit mir im Labor und wir untersuchten zusammen Actino- kineospora bangkokensis. Nachdem sie zurück in Thailand war durfte ich weiter an unserem Projekt arbeiten. Ein großer Dank gilt Dr. Thomas Paululat der Universität Siegen für die Struktur- aufklärung von Thailandin A und B, sowie von Foxicin A. Danke an Andreas Kulik von der Universität Tübingen für die HPLC-Unterstützung. Vielen Dank an Dr. Stephan Flemming für die tollen Circos-Bilder und die endlosen Telefonate, bis ich endlich zufrieden war…, sowie Hilfe bei Computer-Problemchen.
Bezüglich meiner Foxicin-Untersuchungen bedanke ich mich zuerst bei Dr. Iris Peintner für die Ent- deckung von Foxicin A (früher IP1). Dann bedanke ich mich bei Songya Zhang für die Auf- reinigungen von anderen Foxicin-Derivate und NMR-Analysen, herzlichen Dank an Sascha Ferlaino (Pharm. und Med. Chemie) für die vielen NMR-Vermessungen sowie Marija Marolt und Dr. Steffen Lüdeke für die VCD- und IR-Messungen. Ein Dankeschön gilt auch Dr. Claudia Jessen-Trefzer.
Während den Untersuchungen der Foxicin-Aktivität musste ich verschiedene Versuche in unter- schiedlichen Laboren durchführen – danke an alle! Der Hemmhoftest der Cyanobakterien bei Dr. Ekaterina Kuchmina, AG Wilde (Biologie), der Atmungskettenversuch bei Sabrina Burschel der AG Friedrich (Biochemie), der MTA Assay sowie das in silico Docking mit Cytbc1 wurde von Christian de Ford von der AG Merfort (Pharm. Biologie und Biotechnologie) durchgeführt. Foxicin A wurde von Dr. Matthias Rottmann von der AG Bruns (Swiss Tropical and Public Health Institute, Basel, Schweiz) gegen Plasmodium falciparum getestet. Daniel Álvarez von der AG Beyer (Biologie) testete Foxicin gegen Arabidopsis thaliana. Ich danke Denise Deubel, dass sie mein Thema weiterführt!
Bei dem Versuch der heterologen Expression des Foxicin-Genclusters danke ich Prof. Dr. Francis Stewart, TU Dresden für die rekombinations-freudigen E. coli-Stämme, der pCAP01-Vektor wurde von Prof. Dr. Bradley Moore vom Scripps Institution of Oceanography, Universität von San Diego zu Verfügung gestellt, sowie von Dr. Vladimir Larionov der Hefestamm S. cerevisiae VL6-48N für die TAR-Klonierung.
Ich danke Prof. Dr. Max Cryle für die tolle Diskussion über A-Domänen, das Zukommenlassen des Protokol zum in vitro Assay und die Möglichkeit nun in seinem Labor am anderen Ende der Welt meine Postdoc-Zeit zu verbringen.
Für die Unterstützung bei allen Fragen zur Aufreinigung von Sekundärmetaboliten und sonstigen Problemen tausend Dank an die gute Seele der Arbeitsgruppe - Elisabeth Welle - und sonstigen Dingen danke an Marcus Essing, sowie Sandra Groß, Sandra Cabrera und Tanja Herbstritt.
Für die tolle Atmosphäre im Arbeitskreis, beim Mittagessen, in den Kuchenzeiten und sonstigem netten Gespräch – schön war‘s: Irene Santillana, Suzan Samra, Denise Deubel, Yvonne Schmidt- Bohli, Philipp Schwarzer, Olya Tsypik, Roman Makitrynskyy, Astrid Erber, Stefanie Hackl, Julia Wunsch-Palasis, Tanja Heitzler, Jasmin Kröger, Songya Zhang, Jing Zhu, ChiJian Zuo, Miaomiao Li, sowie der AG Merfort! Ein herzliches Dankschön auch Dr. Gabriele Weitnauer!
Ich danke auch meinen vielen Studenten, die mir während meiner Zeit hier zur Seite gestellt wurden, ob Wahlpflichtpraktikant, Bachelor, Master oder Diplom: Vor allem aber Marcel Rommel, Linda Zambolin, und auch vielen anderen, die nicht direkt mit mir arbeiteten, aber mit ihnen eine tolle Zeit hatte: Maxie Schmitt, Jannis Brehm, Veronika Brinschwitz, Nils Gummerlich, Fabienne Gut- acker und Michael Keppler.
Danke den fleißigen Korrekturlesern: Denise Deubel, Philipp Schwarzer, Yvonne Schmidt-Bohli, Tina Strobel, Suzan Samra, Stephan Flemming und Anton Ippendorf.
Zum Schluss möchte ich mich noch einmal speziell bei meinen einzigartigen Freunden bedanken:
Irene Santillana - allerliebste Guapa - meine andere „Orangen-Hälfte“… ich habe unsere gemeinsame Zeit in 01018 so sehr genossen! Danke für alle Gespräche innerhalb und außerhalb des Labors, deine positive Art, dem Unterschlupf, … und dass du immer für mich da warst!
Tina Strobel - die leider erst nach ihrer Laborzeit eine teure Freundin geworden ist. Danke für die Frauenabende, den Kochsessions, dem Feiern und faul auf dem Sofa liegen, dem kommenden Urlaub und so vieles mehr…
Stephan Flemming - es ist auch mir eine große Freude! =)
Suzan Samra – für mich bist du einer der tollsten und stärksten Menschen, die ich kenne! Danke für die gemeinsame (Labor)Zeit, die „Oh nein“- und „Aussteigen“-Momente mit Leo, das leckere Essen und und und… Wir sehen uns wieder in unserer Heimat!
… danke, dass es euch gibt!!!
Daniel – danke, du hast mir geholfen, meinen Weg zu finden.
Zu guter Letzt danke ich natürlich meiner Familie: Meinen Eltern Claudia und Alfred, meinen Brüdern Michael und Peter sowie meinen Großeltern und dem restlichen Greule-Klan. Publikationen
Medema M.H., Kottmann R., Yilmaz P., Cummings M., Biggins J.B., Blin K., Bruijn I. de, Chooi Y.H., Claesen J., Coates R.C., Cruz-Morales P., Duddela S., Düsterhus S., Edwards D.J., Fewer D.P., Garg N., Geiger C., Gomez-Escribano J.P., Greule A., Hadjithomas M., Haines A.S., Helfrich E.J.N., Hillwig M.L., Ishida K., Jones A.C., Jones C.S., Jungmann K., Kegler C., Kim H.U., Kötter P., Krug D., Masschelein J., Melnik A.V., Mantovani S.M., Monroe E.A., Moore M., Moss N., Nützmann H.- W., Pan G., Pati A., Petras D., Reen F.J., Rosconi F., Rui Z., Tian Z., Tobias N.J., Tsunematsu Y., Wiemann P., Wyckoff E., Yan X., Yim G., Yu F., Xie Y., Aigle B., Apel A.K., Balibar C.J., Balskus E.P., Barona-Gómez F., Bechthold A., Bode H.B., Borriss R., Brady S.F., Brakhage A.A., Caffrey P., Cheng Y.-Q., Clardy J., Cox R.J., Mot R. de, Donadio S., Donia M.S., van der Donk W.A., Dorrestein P.C., Doyle S., Driessen A.J.M., Ehling-Schulz M., Entian K.-D., Fischbach M.A., Gerwick L., Gerwick W.H., Gross H., Gust B., Hertweck C., Höfte M., Jensen S.E., Ju J., Katz L., Kaysser L., Klassen J.L., Keller N.P., Kormanec J., Kuipers O.P., Kuzuyama T., Kyrpides N.C., Kwon H.-J., Lautru S., Lavigne R., Lee C.Y., Linquan B., Liu X., Liu W., Luzhetskyy A., Mahmud T., Mast Y., Méndez C., Metsä-Ketelä M., Micklefield J., Mitchell D.A., Moore B.S., Moreira L.M., Müller R., Neilan B.A., Nett M., Nielsen J., O'Gara F., Oikawa H., Osbourn A., Osburne M.S., Ostash B., Payne S.M., Pernodet J.-L., Petricek M., Piel J., Ploux O., Raaijmakers J.M., Salas J.A., Schmitt E.K., Scott B., Seipke R.F., Shen B., Sherman D.H., Sivonen K., Smanski M.J., Sosio M., Stegmann E., Süssmuth R.D., Tahlan K., Thomas C.M., Tang Y., Truman A.W., Viaud M., Walton J.D., Walsh C.T., Weber T., van Wezel G.P., Wilkinson B., Willey J.M., Wohlleben W., Wright G.D., Ziemert N., Zhang C., Zotchev S.B., Breitling R., Takano E. & Glöckner F.O., (2015), Minimum Information about a Biosynthetic Gene Cluster, Nat Chem Biol 11: 625–631.
Intra B., Greule A., Bechthold A., Euanorasetr J., Paululat T. & Panbangred W., (2016), Thailandins A and B, the New Pentaene Polyene Compounds with Antifungal Activity against Anthracnose Fungi and Pathogenic Yeasts produced by Actinokineospora bangkokensis strain 44EHWT, J. Agric. Food Chem., 64 (25): 5171–5179.
Greule A., Zhang S., Paululat T. & Bechthold A., (2016), From a Natural Product to its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration using Polyketomycin from Streptomyces diastato- chromogenes Tü6028, J Vis Exp. (), e54952, Video unter http://www.jove.com/video/54952.
Greule A., Peintner I., Zhang S., Marolt M., Jessen-Trefzer C., Deubel D., De Ford C., Burschel S., Li S.-M., Friedrich T., Merfort I., Lüdeke S., Bisel P., Müller M., Paululat T. & Bechthold A., (2016), The Foxicin Biosynthesis Gene Cluster: widely distributed – but silent, eingereicht.
Greule A., Intra B., Flemming S., Rommel M., Panbangred W. & Bechthold A., (2016), The Draft Genome Sequence of Actinokineospora bangkokensis 44EHWT reveals the biosynthetic pathway of Antifungal Compound Thailandins with Unusual Extender Unit Butylmalonyl-CoA, eingereicht.
Greule A., Flemming S. & Bechthold A., (2016), Draft-Genome Sequence of Streptomyces diastatochromogenes Tü6028, Producer of Polyketomycin and Foxicin, in Vorbereitung.
Posterbeiträge bei Tagungen:
Anja Greule, Intra Bungonsiri, Paululat Thomas, Panbangred Watanalai & Andreas Bechthold Characterization of Antibiotic Potential of Actinokineospora bangkokensis, a Novel Strain of Order Actinomycetales, DPHG Jahrestagung, Freiburg im Breisgau, 08.-11.10.2013
Anja Greule, Songya Zhang & Andreas Bechthold Foxicins: Ortho-Quinone Derivates produced by Polyketomycin Producer Streptomyces diastato- chromogenes Tü6028, XVII. International Symposium on the Biology of Actinomycetes, Kuşadasi – Türkei, 08.-12.10.2014
Anja Greule & Andreas Bechthold Foxicin: Unusual Ortho-Quinone Derivates of Streptomyces diastatochromogenes Tü6028, Workshop "Biology of natural product producing microorganisms", Frankfurt am Main, 04.-06.09.2015
Anja Greule & Andreas Bechthold Foxicin: Unusual Ortho-Quinone Derivates of Streptomyces diastatochromogenes Tü6028, 2nd European Conference on Natural Products, Frankfurt am Main, 06.-09.09.2015
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
ZUSAMMENFASSUNG...... 1
SUMMARY ...... 2
I EINLEITUNG ...... 3 I.1 Die Biosynthese von Sekundärmetaboliten ...... 4 I.1.1 Die Polyketidsynthasen ...... 5 I.1.2 Die Nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen ...... 8 I.2 Actinomyceten – die Hauptproduzenten von Antibiotika ...... 10 I.2.1 Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 ...... 12 I.2.2 Streptomyces viridochromogenes Tü57 ...... 14 I.2.3 Actinokineospora bangkokensis 44EHWT ...... 15 I.3 Die Wege zu neuen aktiven Stoffen ...... 17 I.3.1 Isolierung und Charakterisierung neuer Stämme ...... 17 I.3.2 Aktivierung stiller Sekundärmetabolitgencluster ...... 17 I.3.3 Metagenomische Untersuchungen ...... 18 I.3.4 Kombinatorische Biosynthese ...... 18 I.3.5 Chemische Synthese nach Computer-basierten Docking-Studien ...... 19 I.4 Das MIBiG-Projekt ...... 20 I.5 Ziel dieser Arbeit ...... 22
II MATERIALIEN UND METHODEN ...... 23 II.1 Materialien ...... 24 II.1.1 Chemikalien und weitere Reagenzien...... 24 II.1.2 Enzyme ...... 26 II.1.3 Molekulargewichtsmarker ...... 26 II.1.4 Molekularbiologische Kits ...... 26 II.1.5 Bakterienstämme ...... 27 II.1.6 Hefe- und Pilzstämme ...... 29 II.1.7 Plasmide, Cosmide und YAC ...... 30 II.1.8 Synthetisierte Oligonukleotide ...... 32 II.1.9 Nährmedien ...... 34 II.1.10 Puffer und Lösungen ...... 36 II.1.11 Verbrauchsmaterialien ...... 39 II.1.12 Geräte ...... 39 II.1.13 Säulen ...... 41 II.1.14 Computerprogramme und Internetdienste ...... 42 II.2 Methoden ...... 43 II.2.1 Kultivierung von Bakterien- / und Pilzstämmen ...... 43 II.2.1.1 Kultivierung und Stammhaltung von E. coli-Stämmen ...... 43 Inhaltsverzeichnis
II.2.1.2 Kultivierung, Stammhaltung und Sporenisolation von Actinomyceten-Stämmen ...... 43 II.2.1.3 Kultivierung von Cyanobakterien ...... 44 II.2.1.4 Kultivierung von Hefen und Pilzen ...... 44 II.2.2 Isolierung und Reinigung von DNA aus Bakterien und Hefen ...... 45 II.2.2.1 Isolierung chromosomaler DNA aus Actinomyceten ...... 45 II.2.2.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli ...... 46 II.2.2.3 Isolierung YAC aus der Hefe ...... 47 II.2.2.4 Umpufferung und Aufkonzentrierung von DNA mittels alkoholischer Fällung ...... 48 II.2.3 Charakterisierung von DNA-Molekülen ...... 48 II.2.3.1 Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA ...... 48 II.2.3.2 Agarose-Gelelektrophorese von DNA-Molekülen ...... 48 II.2.3.3 Sequenzierung von kurzen DNA-Bereichen ...... 49 II.2.4 Klonierungsexperimente ...... 49 II.2.4.1 Amplifikation von DNA durch Polymerase-Kettenreaktion ...... 49 II.2.4.2 Restriktionsverdau ...... 51 II.2.4.3 Aufreinigung von DNA aus PCR-Mischungen, enzymatischen Reaktionen oder präpara- tiven Gelen ...... 51 II.2.4.4 Ligation von DNA-Fragmenten ...... 52 II.2.4.5 DNA-Übertragung in Bakterien ...... 53 II.2.4.6 Klonierung von kompletten Biosynthesegenclustern ...... 55 II.2.4.7 Geninaktivierung in Actinomyceten ...... 57 II.2.4.8 (Über)expression und heterologe Expression von Genen ...... 59 II.2.4.9 Klonierungsarbeiten dieser Arbeit ...... 61 II.2.5 Aufreinigung und Analytik von Proteinen...... 70 II.2.5.1 Zellaufschluss ...... 70
II.2.5.2 Aufreinigung von His6-getaggten Proteinen mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie ...... 70 II.2.5.3 Charakterisierung von Proteinen ...... 72 II.2.6 Produktion, Isolierung und Analytik von Sekundärmetaboliten ...... 75 II.2.6.1 Produktion von Sekundärmetaboliten ...... 75 II.2.6.2 Extraktion von Sekundärmetaboliten ...... 75 II.2.6.3 Aufreinigung von Sekundärmetaboliten ...... 76 II.2.6.4 Sekundärstoffanalytik mittels HPLC/MS ...... 77 II.2.6.5 Strukturaufklärung von Sekundärmetaboliten ...... 79 II.2.7 Aktivitätsbestimmung von Sekundärmetaboliten ...... 80 II.2.7.1 Agardiffusionstest...... 80 II.2.7.2 Untersuchung der inhibitorischen Wirkung von Foxicin A gegen Arabidopsis thaliana ...... 81 II.2.7.3 MTT-Zellviabilitäts-Test ...... 81 II.2.7.4 Untersuchung der in vitro Atmungskettenhemmung von E. coli ...... 82 II.2.7.5 Interaktion von Foxicin A mit Fe-Ionen ...... 82 II.2.8 Genomsequenzierung und Computer-basierte Auswertung ...... 83
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II.2.8.1 Genomsequenzierung ...... 83 II.2.8.2 Analyse von offenen Leserahmen ...... 83 II.2.8.3 Analyse von Sekundärmetaboligenclustern ...... 83 II.2.8.4 Graphische Darstellung von Genomen mittels Circos ...... 83 II.2.8.5 Eingabe von Geninformationen in die NCBI-Datenbank ...... 84 II.2.8.6 Sequenzalignment und Phylogenie ...... 84 II.2.9 Eingabe von Sekundärmetabolitgencluster-Informationen in die MIBiG-Datenbank ...... 84
III ERGEBNISSE ...... 85 III.1 Sequenzierung von fünf Actinomyceten-Genomen ...... 87 III.1.1 Das Draft-Genom von Actinokineospora bangkokensis 44EHWT ...... 88 III.1.2 Das Draft-Genom von S. diastatochromogenes Tü6028 ...... 90 III.2 Thailandin A und B – zwei neue Polyene aus Actinokineospora bangkokensis 44EHWT ...... 92 III.2.1 Produktionsanalyse von A. bangkokensis 44EHWT...... 92 III.2.2 Aufreinigung und Strukturaufklärung der Polyene Thailandin A und B ...... 94 III.2.3 Identifikation des Thailandin-Biosynthesegenclusters in A. bangkokensis ...... 945 III.2.3.1 PKS I - Sekundärmetabolitgencluster in A. bangkokenesis ...... 95 III.2.3.2 Verifizierung des PKS-Clusters #11 durch einen Single-Crossover ...... 95 III.2.3.3 Das Thailandin-Biosynthesegencluster ...... 96 III.3 Kombinatorische Biosynthese von Polyketomycin und Avilamycin ...... 99 III.3.1 Deletion der 6MSAS in Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 und Streptomyces viridochromogenes Tü57 ...... 99 III.3.1.1 Deletion von pokM1, pokM2, pokM3 und pokMT1 in S. diastatochromogenes Tü6028 ...... 99 III.3.1.2 Deletion von aviN und aviM in S. viridochromogenes Tü57 ...... 102 III.3.2 Komplementierung von S. diastatochromogenes ΔpokMs pUWL_pokS34U12 und S. viridochromogenes ΔaviNM ...... 103 III.3.3 Heterologe Expression von pokMs und aviNM in Streptomyces albus ...... 104 III.4 Untersuchungen von Foxicin aus Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 ...... 105 III.4.1 Aufreinigung von Foxicin A und Foxicin B ...... 105 III.4.2 Strukturuntersuchungen von Foxicin A und B ...... 106 III.4.2.1 Hochauflösende Massenspektrometrie von Foxicin A und Foxicin B ...... 106 III.4.2.2 NMR-Analyse von Foxicin A und Foxicin B ...... 106 III.4.2.3 VCD- und IR-Spektrometrie von Foxicin A und Foxicin B ...... 107 III.4.3 Aktivitätsbestimmung von Foxicin ...... 108 III.4.3.1 Bestimmung der antibiotischen Wirkung von Foxicin ...... 108 III.4.3.2 Foxicin hemmt in vitro die Atmungskette von E. coli ...... 109 III.4.3.3 Foxicin als Antioxidans ...... 110 III.4.3.4 Foxicin interagiert mit Fe-Ionen ...... 111 III.4.3.5 Foxicin hat keinen Einfluss auf die Polyketomycinproduktion ...... 112 III.4.4 Das Foxicin-Biosynthesegencluster ...... 113
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III.4.4.1 Die Identifizierung und Verifizierung des Foxicin-Biosynthesegenclusters ...... 113 III.4.4.2 Die Organisation des Foxicin-Biosynthesegenclusters ...... 114 III.4.4.3 Ähnliche Foxicin-Biosynthesegencluster in anderen Streptomyceten-Stämmen ...... 116 III.4.4.4 Heterologe Expression des Foxicin-Biosynthesegenclusters ...... 116 III.4.5 Untersuchung einzelner Gene des Foxicin-Biosynthesegenclusters ...... 118 III.4.5.1 Die Acetyltransferase FoxA ...... 118 III.4.5.2 Die Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase FoxGI ...... 119 III.4.5.3 Der PKS I / NRPS Enzymkomplex FoxBII / FoxBIII ...... 119 III.4.5.4 Die A-Domäne FoxBI ...... 120 III.4.5.5 Die Esterasen FoxEI und FoxEII ...... 121 III.5 Das MIBiG Projekt ...... 122
IV DISKUSSION ...... 123 IV.1 Die Genomsequenzierung gibt einen guten Einblick in das Potenzial zur Sekundärmetabolit- Biosynthese von Actinomyceten und eröffnet neue Möglichkeiten ...... 124 IV.2 Actinokineospora bangkokensis 44EHWT produziert die zwei neuen Polyene Thailandin A und B mit antifungaler Wirkung, in die die ungewöhnliche Extendereinheit Butylmalonyl- CoA eingebaut wird ...... 129 IV.3 Generierung neuer Substanzen durch kombinatorische Biosynthese von Avilamycin und Polyketomycin ...... 136 IV.4 Foxicin, ein ungewöhliches Quinon aus S. diastatochromogenes Tü6028 ...... 139 IV.5 Die Minimale Information eines Biosynthesegenclusters ...... 152
V LITERATUR ...... 155
VI ANHANG ...... 175
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ...... 207
LEBENSLAUF ...... 209
Tabellen- und Diagrammverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Bekannte Stämme der Gattung Actinokineospora ...... 16 Tab. 2: Schematischer Überblick der MIBiG-Standard ...... 21 Tab. 3: Verwendete Chemikalien ...... 24 Tab. 4: Organische Lösungsmittel und Säuren ...... 25 Tab. 5: Verwendete Antibiotika ...... 25 Tab. 6: Sonstige verwendete Biochemikalien ...... 25 Tab. 7: Verwendete Aminosäuren ...... 25 Tab. 8: Verwendete Enzyme ...... 26 Tab. 9: Verwendete Molekulargewichtsmarker ...... 26 Tab. 10: Verwendete molekularbiologische Kits ...... 26 Tab. 11: Verwendete E. coli - Stämme ...... 27 Tab. 12: Verwendete Actinomyceten - Stämme ...... 28 Tab. 13: Bakterienstämme für Antibiotikum-Diffusionstest ...... 29 Tab. 14: Verwendete Hefen und Pilze ...... 29 Tab. 15: Verwendete Plasmide ...... 30 Tab. 16: Verwendete Cosmide ...... 30 Tab. 17: Verwendetes Yeast-Artificial Chromosom ...... 31 Tab. 18: In dieser Arbeit erstellte Plasmide und Vektoren ...... 31 Tab. 19: In dieser Arbeit synthetisierte Oligonukleotide ...... 32 Tab. 20: Nährmedien für E. coli und Actinomyceten ...... 34 Tab. 21: Weitere Nährmedien ...... 35 Tab. 22: Puffer und Lösungen und ihre Bestandteile ...... 36 Tab. 23: Verbrauchsmaterialien und deren Bezugsquelle ...... 39 Tab. 24: Geräte und deren Bezugsquelle ...... 39 Tab. 25: Verwendete Säulen und deren Bezugsquelle...... 41 Tab. 26: Computerprogramme...... 42 Tab. 27: Internetdienste ...... 42 Tab. 28: Verwendete Polymerasen und PCR-Ansätze ...... 50 Tab. 29: Restriktionsverdau ...... 51 Tab. 30: Methode für präparative HPLC ...... 77 Tab. 31: Parameter der ESI-Ionisierungsquelle ...... 78 Tab. 32: Methoden für HPLC ...... 78 Tab. 33: Parameter der APCI/ESI-MS ...... 79 Tab. 34: Übersicht der Genomsequenzierung ...... 87 Tab. 35: Hemmhoftest der Rohextrakte aus A. bangkokensis gegenüber verschiedenen Bakterien und Pilze ...... 92 Tab. 36: Postulierte Strukturen der PKS-Biosynthesegencluster aus A. bangkokensis ...... 95 Tab. 37: Postulierte Funktionen der ORFs des Thailandin-Biosynthesegenclusters in Actinokineospora bangkokensis 44EHWT ...... 98 Tab. 38: Beeinflussung des Wachstums von verschiedenen Bakterien, Pilzen und Arabidopsis durch Foxicin.. 108 Tabellen- und Diagrammverzeichnis
Tab. 39: Einfluss von Foxicin A auf den Cytbc1 Komplex ...... 110 Tab. 40: Postulierte Funktionen der ORFs des Foxicin-Biosynthesegenclusters in S. diastatochromogenes Tü6028 ...... 115 Tab. 41: Übersicht der Sekundärmetabolite, die in die MIBiG-Datenbank eingefügt wurden ...... 122 Tab. 42: Sekundärmetabolitgencluster in Actinokineospora bangkokensis 44EHWT ...... 176 Tab. 43: Sekundärmetabolitgencluster in Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 ...... 177 Tab. 44: NMR-Daten von Thailandin A und Thailandin B ...... 178
Tab. 45: NMR-Daten von Foxicin A (CDCl3, 25 °C) ...... 182
Tab. 46: NMR-Daten von Foxicin A (DMSO-d6, 35 °C) ...... 183
Tab. 47: NMR-Daten von Foxicin B (CDCl3, 25 °C) ...... 184 Tab. 48: Wachstumshemmung von S. diastatochromogenes und Mutanten durch Wasserstoffperoxid ...... 196 Tab. 49: Vergleich Enzyme des Desoxystreptamin- und Aminoshikimat-Biosynthesewegs mit ORFs in S. dia- statochromogenes Tü6028 ...... 197 Tab. 50: Streptomyces-Stämme mit ähnlichen fox-Biosynthesegencluster...... 198 Tab. 51: Dehydratase-Sequenzen mit HxxxGxxxxS-Motiv in Modul I der fox-ähnlichen Cluster in verschied- enen Streptomyceten ...... 198
Diagrammverzeichnis
Diagr. 1: Zellviabilität von drei verschiedenen humanen Zelllinien und PBMC in Anwesenheit von Foxicin .. 108 Diagr. 2: in vitro Hemmung der E. coli-Atmungskette in Anwesenheit von Foxicin A ...... 109 Diagr. 3: Hemmung des Wachstums von S. diastatochromogenes-Stämmen durch Wasserstoffperoxid ...... 111 Diagr. 4: Foxicin-Produktion in Abhängigkeit von Eisen im Produktionsmedium ...... 111
Diagr. 5: Shift des UV/vis-Spektrums von Foxicin A bei Zugabe von FeCl3 ...... 112 Diagr. 6: NADH/NAD+-gekoppelter A-Domänen-Aktivierungsassay ...... 121 Diagr. 7: Verteilung GC-Gehalt im Genom von A. bangkokensis 44EHWT und S. diastatochromogenes Tü6028 ...... 124 Diagr. 8: Anzahl Genomsequenzen ausgewählter Actinomyceten bei NCBI nach Jahr der Veröffentlichung ... 126
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Schematischer Ablauf der Polyketidbiosynthese ...... 6 Abb. 2: Beispiele für Produkte von Polyketidsynthasen vom Typ I, II und III ...... 8 Abb. 3: Schematischer Ablauf der Nicht-ribosomalen Peptidsynthese ...... 9 Abb. 4: Beispiele für Produkte von Nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen ...... 9 Abb. 5: Phylogenetischer Baum ausgewählter Gattungen der Ordnung Actinomycetales mit bekannten Vertretern ...... 10 Abb. 6: Polyketomycin und Foxicin A aus Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 ...... 12 Abb. 7: HPLC/MS-Analyse der Rohextrakte aus S. diastatochromogenes Tü60β8 Wildtyp und der ΔpokOIV- Mutante ...... 13 Abb. 8: Avilamycin aus Streptomyces viridochromogenes Tü57 ...... 14 Abb. 9: HPLC/MS-Analyse des Rohextraktes aus S. viridochromogenes Tü57 Wildtyp ...... 15 Abb. 10: Kulturplatte von Actinokineospora bangkokensis 44EHWT ...... 15 Abb. 11: Evolution der Aminocumarin-Biosynthesegene von Simocyclinon, Novobiocin und Coumermycin ...... 19 Abb. 12: Plasmidkarte von Zwischenvektor pUC19 ...... 52 Abb. 13: Plasmidkarte von Zwischenvektor pBSK- ...... 52 Abb. 14: Klonierung ganzer Gencluster mittels LLHR und TAR ...... 57 Abb. 15: Plasmidkarte von pKCLP2_gusA_PKS11 und Durchführung der Inaktivierung des tha-Biosynthese- genclusters in A. bangkokensis ...... 61 Abb. 16: Plasmidkarte pKC1132-DC-pokMs und Durchführung der Deletion von pokM1,2,3,MT1 in S. diastatochromogenes Tü6028 ...... 62 Abb. 17: Plasmidkarte pKC1132_DC_aviNM und Durchführung der Deletion von aviN und aviM in S. viridochromogenes Tü57 ...... 63 Abb. 18: Plasmidkarte von pTESb_pokM123 ...... 63 Abb. 19: Plasmidkarte von pTESb_aviNM ...... 64 Abb. 20: Plasmidkarte von pUWL-T-pokS34U12 ...... 64 Abb. 21: Plasmidkarte von pKC1132_SC_foxBII und Durchführung der Inaktivierung des fox- Biosynthesegenclusters in S. diastatochromogenes ...... 65 Abb. 22: Plasmidkarte von pKC1132_SC_foxA und Durchführung der Inaktivierung von foxA in S. diastatochromogenes ...... 65 Abb. 23: Plasmidkarte von pCRISPR-foxBI ...... 66 Abb. 24: Plasmidkarte von pCRISPR-foxEI ...... 67 Abb. 25: Plasmidkarte von pCRISPR-foxEII ...... 67 Abb. 26: Plasmidkarte von pOJ436_Up_Down_fox ...... 68 Abb. 27: Plasmidkarte von pCAP_Up_Down_fox ...... 68 Abb. 28: Plasmidkarte von pET28a_foxBI ...... 69 Abb. 29: in vitro Aktivitätsassays von A-Domänen ...... 74 Abb. 30: Graphische Darstellung des Genoms von Actinokineospora bangkokensis 44EHWT ...... 89 Abb. 31: Graphische Darstellung des Genoms und des Plasmids von Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 ...... 91 Abb. 32: Produktionsanalyse von A. bangkokensis in HA-Medium ...... 93 Abb. 33: Struktur von Thailandin A und Thailandin B ...... 94 Abbildungsverzeichnis
Abb. 34: HPLC-Chromatogramme der Rohextrakte aus A. bangkokensis WT und der Mutante mit unterbrochenem PKS-Gen aus Cluster 11 ...... 96 Abb. 35: Das Thailandin-Biosynthesegencluster in Actinokineospora bangkokensis ...... 97 Abb. 36: Gelelektrophoresebild der Kontroll-PCR zur Überprüfung der Deletion von pokM1, pokM2, pokM3 und pokMT1 in S. diastatochromogenes Tü6028 ...... 100 Abb. 37: HPLC-Analyse von Rohextrakten aus S. diastatochromogenes Tü60β8 Wildtyp, der ΔpokMs- Mutanten und der Mutanten ΔpokMs pUWL_pokSγ4U1β ...... 101 Abb. 38: Gelelektrophoresebild der Kontroll-PCR zur Überprüfung der Deletion von aviNM in S. virido- chromogenes Tü57 ...... 102 Abb. 39: HPLC-Chromatogramme von Rohextrakten aus S. viridochromogenes Tü57 Wildtyp und der ΔaviNM-Mutante ...... 103 Abb. 40: HPLC-Chromatogramme der einzelnen Aufreinigungsschritte von Foxicin A und Foxicin B ...... 105 Abb. 41: Wichtige 2D NMR-Korrelationen von Foxicin A ...... 107 Abb. 42: VCD-, IR-Spektren und Strukturen von Foxicin A und Foxicin B ...... 107
Abb. 43: Docking von Foxicin A, Atovaquon und Stigmatellin an der Q0-Stelle des Cytbc1 Komplexes ...... 110 Abb. 44: Einfluss von Eisen auf den Phänotypen von S. diastatochromogenes WT und der ΔpokOIV-Mutante 112 Abb. 45: Bestätigung der foxBII-Unterbrechung in S. diastatochromogenes Tü6028 ...... 113 Abb. 46: HPLC-Chromatogramme von Rohextrakten aus S. diastatochromogenes ΔpokOIV und der ΔpokOIV/foxBII::pKC11γβ Mutante ...... 114 Abb. 47: Das Foxicin-Biosynthesegencluster in S. diastatochromogenes Tü6028 ...... 114 Abb. 48: Homologe fox-Biosynthesegencluster in anderen Streptomyceten und phylogenetischer Baum ...... 117 Abb. 49: Die "Kern"-Gene der Foxicin-Biosynthese ...... 118 Abb. 50: HPLC-Chromatogramme von Rohextrakten aus S. diastatochromogenes ∆pokOIV und zwei Mutanten mit unterbrochenem foxA-Gen ...... 119 Abb. 51: Strukturen von verschiedenen Polyen-Macrolactonen ...... 131 Abb. 52: Putatives Thailandin-Biosynthesemodell ...... 133 Abb. 53: Beispiele für Naturstoffe mit ungewöhnlichen Extenderunits ...... 135 Abb. 54: 6MSAS der Polyketomycin- und Avilamycin-Biosynthese ...... 136 Abb. 55: Beispiele für Naturstoffe mit einer 6-Methylsalicylsäure-Einheit ...... 138 Abb. 56: Foxicin A - Struktur mit ungewöhnlichen Eigenschaften ...... 139 Abb. 57: Einteilung von Quinonen ...... 140 Abb. 58: Redoxstadien von Quinonen ...... 140 Abb. 59: Beispiele für Quinone mit lipophiler Seitenkette ...... 141 Abb. 60: Beispiele für Naturstoffe mit , -Doppelbindungen ...... 141 Abb. 61: Beispiele für Quinone mit Aminogruppen oder ähnliche Strukturen ...... 142 Abb. 62: Biosynthese von 2-Desoxystreptamin, AHBA und PQQ ...... 143 Abb. 63: Putatives Foxicin-Biosynthesemodell ...... 144 Abb. 64: Sequenzalignment der FoxBII-DH-Domänen mit anderen DH-Domänen ...... 145 Abb. 65: Siderophor-Typen und Beispiele für Siderophore ...... 149 Abb. 66: Chemische Strukturen der in die MIBiG-Datenbank eingegebenen Naturstoffe ...... 152 Abb. 67: 1H NMR Spektrum von Thailandin A ...... 179 Abb. 68: 13C NMR Spektrum von Thailandin A ...... 179
Abbildungsverzeichnis
Abb. 69: 1H NMR Spektrum von Thailandin B ...... 180 Abb. 70: 13C NMR Spektrum von Thailandin B ...... 180 1 Abb. 71: H NMR of Foxicin A (CDCl3) ...... 185 13 Abb. 72: C NMR of Foxicin A (CDCl3) ...... 185
Abb. 73: COSY of Foxicin A (CDCl3) ...... 186 1 13 Abb. 74: H, C-HSQC of Foxicin A (CDCl3) ...... 186 1 13 Abb. 75: H, C-HMBC of Foxicin A (CDCl3) ...... 187 1 13 Abb. 76: H, C-H2BC of Foxicin A (CDCl3) ...... 187 1 15 Abb. 77: H, N-HSQC of Foxicin A (CDCl3) ...... 188 1 15 Abb. 78: H, N-HMBC of Foxicin A (CDCl3) ...... 188 1 Abb. 79: H NMR of Foxicin A (DMSO-d6) ...... 189 13 Abb. 80: C NMR of Foxicin A (DMSO-d6) ...... 189
Abb. 81: COSY of Foxicin A (DMSO-d6) ...... 190 1 13 Abb. 82: H, C-HSQC of Foxicin A (DMSO-d6) ...... 190 1 13 Abb. 83: H, C-HMBC of Foxicin A (DMSO-d6) ...... 191 Abb. 84: 1H-NMR von Foxicin B ...... 192 Abb. 85: 13C-NMR von Foxicin B ...... 192 Abb. 86: COSY von Foxicin B ...... 193 Abb. 87: HMBC von Foxicin B ...... 193 Abb. 88: HSQC von Foxicin B ...... 194 Abb. 89: Hochauflösendes Massenspektrum von Foxicin A ...... 195 Abb. 90: Hochauflösendes Massenspektrum von Foxicin B ...... 195 Abb. 91: in vitro Hemmung der Atmungskette von isolierten E. coli-Membranen durch Foxicin A ...... 196 Abb. 92: Einfluss von Foxicin auf das Wachstum von Arabidopsis thaliana ...... 196 Abb. 93: Aufreinigung der A-Domäne FoxBI ...... 200
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Im Rahmen dieser Arbeit wurde an Sekundärmetaboliten aus verschiedenen Actinomyceten geforscht.
Der Stamm Actinokineospora bangkokensis 44EHWT gehört zur Gattung der Actinokineospora. Da von dieser Gattung bislang nur sechszehn verschiedene Stämme isoliert wurden, zählen sie zu den seltenen Actinomyceten. Die Untersuchung seltener Gattungen ist beim Screening nach neuen Natur- stoffen eine vielversprechende Quelle. Aus A. bangkokensis konnten die neuen Polyen-Antimykotika Thailandin A und B isoliert und deren Struktur aufgeklärt werden. Das Thailandin-Biosynthese- gencluster wurde identifiziert und mittels Geninaktivierung bestätigt.
Durch kombinatorische Biosynthese lassen sich neue Naturstoffe mit verbesserten Eigenschaften generieren. In den Stämmen Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 und Streptomyces virido- chromogenes Tü57 konnten die Gene für die Methylsalicylsäure-Biosynthese von Polyketomycin und Avilamycin erfolgreich deletiert werden. Die Gendefekte konnten jedoch in beiden Stämmen weder mit den pokMs- noch mit den aviNM-Genen komplementiert werden, sodass trotz Neukombination von Genen keine neuen Derivate gebildet wurden. Weiter konnte S. viridochromogenes Tü57 durch die Supplementierung von CaCl2 im Medium effizient durch Konjugation manipuliert werden.
In Folge der pokOIV-Deletion der Polyketomycin-Biosynthese wird das fast stille Foxicin- Biosynthesegencluster in S. diastatochromogenes Tü6028 nun stärker exprimiert (Peintner, 2008), sodass weitere Untersuchungen an Foxicin möglich waren. Nach Aufreinigung und verschiedenen spektroskopischen Versuchen konnten die Strukturen und Konfigurationen von Foxicin A und B geklärt werden. Das Foxicin-Biosynthesegencluster wurde erfolgreich identifiziert und mittels Geninaktivierung bestätigt. Nach in silico Analyse des Genclusters wurde ein Biosynthesemodell auf- gestellt. Die Adenylierungs-Domäne FoxBI wurde heterolog in E. coli produziert, aufgereinigt und die Spezifität in einem in vitro Assay untersucht. Foxicin A fungiert durch Eisenkomplexierung als Siderophor, kann wie andere Quinone Elektronen aufnehmen und zeigt zusätzlich antibiotische Aktivität gegenüber anderen Bakterienstämmen. Weitere Aktivitätsassays wurden durchgeführt. Das Foxicin-Biosynthesegencluster konnte mittels Genome Mining in weiteren Streptomyceten identi- fiziert werden. In diesen Stämmen scheint das Cluster jedoch still zu sein. Ein phylogenetischer Baum wurde infolge von Sequenzvergleichen des PKS/NRPS-Hybridgens foxBII aufgestellt.
Weiterhin wurden die Informationen der Naturstoffe Aranciamycin, Avilamycin, Landomycin, Mensa- carcin, Polyketomycin, Rishirilid, Simocyclinon und Urdamycin in die MIBiG-Datenbank (Medema et al., 2015) eingegeben.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Genome der fünf Actinomyceten S. diastatochromogenes Tü6028, S. diastatochromogenes 1628, S. calvus, S. glomeroaurantiacus und A. bangkokensis 44EHWT sequenzieren lassen. Die Draft-Genome von A. bangkokensis 44EHWT und S. diastato- chromogenes Tü6028 wurde dabei genauer analysiert.
1 Summary
Summary
In this work studies on secondary metabolites of different actinomycetes were performed.
The strain Actinokineospora bangkokensis 44EHWT belongs to the genus of Actinokineospora. Until now, only sixteen Actinokineospora strains were isolated, thus the genus is one of the rare actino- mycetes. The studies on rare actinomycetes are very promising in order to identify novel secondary metabolites. The new polyene antimycotika thailandin A and B were isolated from A. bangkokensis and their structures were elucidated. The strain was genetically modified. Thereby, the biosynthetic gene cluster of thailandin was identified and verified by targeted gene inactivation.
Novel natural products with better features can be generated through combinatorial biosynthesis. In the strains Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 and Streptomyces viridochromogenes Tü57, the genes for methylsalicylic acid biosynthesis of polyketomycin and avilamycin were successfully deleted, respectively. The following complementation with neither pokMs- nor aviNM-genes did not lead to novel compounds in both strains despite of the new combination of genes. In addition, the strain S. viridochromogenes Tü57 was efficiently manipulated by conjugation through supplement- ation of CaCl2 into the media.
After deletion of the pokOIV gene of polyketomycin biosynthesis, the almost silent foxicin biosynthetic gene cluster is highly expressed in the strain S. diastatochromogenes Tü6028 (Peintner, 2008), allowing further studies on foxicin. The structure and absolute configuration of foxicin A and B were elucidated as result of purification and various spectroscopic experiments. The foxicin biosynthetic gene cluster was successfully identified and verified by gene inactivation experiments. In silico analysis of the gene cluster led to a biosynthetic model. The adenylation domain FoxBI was heterologously produced in E. coli, purified and its specificity was analyzed in an in vitro assay. Foxicin A acts as a siderophor through chelating ferric iron, is able to accept electrons and shows antibiotic properties against other bacterial strains. Further activity assays were conducted. The foxicin biosynthetic gene cluster was also identified in various other Streptomyces strains by genome mining. However, the gene clusters seem to be silent. A phylogenetic tree was constructed by comparison of the PKS/NRPS hybrid FoxBII sequences.
Furthermore, information about aranciamycin, avilamycin, landomycin, mensacarcin, polyketomycin, rishirilide, simocyclinone and urdamycin natural products were added to MIBiG database (Medema et al., 2015).
Additionally, the genomes of the five actinomycetes S. diastatochromogenes Tü6028, S. diastato- chromogenes 1628, S. calvus, S. glomeroaurantiacus and A. bangkokensis 44EHWT were sequenced. The draft genomes sequences of A. bangkokensis 44EHWT and S. diastatochromogenes Tü6028 were further analyzed.
2 Einleitung
I Einleitung
3 Einleitung
In den letzten Jahrhunderten waren bakterielle Infektionen die häufigste Todesursache. Einen bedeutenden Umschwung brachte die Entdeckung des ersten Antibiotikums Penicillin durch Alexander Fleming im Jahre 1928 (Fleming, 1929), das aufgrund der starken antibakteriellen Wirkung in den frühen 1940er Jahren klinisch eingeführt wurde. Schnell fanden neben den -Lactam- Antibiotika auch viele weitere Antibiotika wie Glycopeptide, Aminoglycoside, Makrolide, Quinolone und Tetracycline mit unterschiedlichen Angriffsorten in den Bakterienzellen klinische Anwendung. Damals glaubte man, das Problem pathogener Organismen überwunden zu haben. Neben der thera- peutischen Anwendung werden Antibiotika aber auch in der Prophylaxe, in der Veterinärmedizin bzw. Tierhaltung, in der Lebensmittelkonservierung und in der Landwirtschaft verwendet. Der weitere Gebrauch verursachte jedoch die Entwicklung, Selektion und Verbreitung resistenter Stämme. Die Resistenzen beruhen auf einer reduzierten Permeabilität der Antibiotika in die Bakterienzelle, auf dem Efflux der Stoffe aus der Zelle, auf der enzymatischen Inaktivierung des Antibiotikums, auf der Veränderung der Zielstruktur oder auf der Evolution eines alternativen Stoffwechselwegs (Überblick siehe Neu, 1989; Travis, 1994). Die Zunahme an multiresistenten Bakterien stellt heute ein weltweites, ernstzunehmendes Gesundheitsproblem dar. Bakterielle Resistenzen gegen derzeit fast alle ver- wendeten Antibiotika wurden bereits beobachtet und treten vor allem in Krankenhäusern auf. Rice bezeichnet die nosokomialen Haupterreger als die „ESKAPE“-Pathogene Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa und verschiedene Enterobacter-Stämme, vor denen wir nicht "flüchten" (engl. escape) können (Rice, 2008). Aber auch Infektionen mit Viren, Pilzen und Protozoen wie HIV (AIDS) oder Plasmodium falciparium (Malaria) sind problematisch (Überblick siehe Morens et al., 2004; White et al., 2014; Maartens et al., 2014). Auch in der Landwirtschaft treten gehäuft resistente Pflanzenpathogene auf, die zu gewaltigen Ernteeinbußen führen (Überblick siehe Anderson et al., 2004).
Aufgrund der zunehmenden Resistenzausbreitung von Bakterien, Pilzen, Protozoen und Viren ist es notwendig, neue antibiotische Wirkstoffe zu finden, die existierenden Antibiotika weiter zu ent- wickeln oder neue Targets für Arzneistoffe zu finden. Die Natur stellt dafür eine reichhaltige Quelle neuer Substanzen dar.
I.1 Die Biosynthese von Sekundärmetaboliten
Mikroorganismen, Pilze, Pflanzen und Tiere produzieren eine Vielzahl von Stoffen mit unter- schiedlichen Aufgaben in der Zelle. Während Primärmetabolite essentielle Aufgaben bei der Energie- gewinnung, dem Aufbau von Zellmaterial oder bei der Vermehrung besitzen, sind Sekundärmetabolite für diese Aufgaben nicht notwendig. Sie sind demnach von sekundärer Bedeutung, bieten dem Produzenten aber unter bestimmten Bedingungen Vorteile. Zu den Sekundärmetaboliten zählen auch Pigmente, Alkaloide, Geruchsstoffe und Antibiotika. Bei der Biosynthese von Sekundärmetaboliten werden häufig Stoffe des Primärmetabolismus ver- wendet, die über verschiedene enzymatische Systeme zusammengebaut und oftmals weiter modifiziert
4 Einleitung werden. Darüber hinaus können auch Stoffe eingebaut werden, die nicht zum Primärmetabolismus gehören, sondern durch spezielle Biosynthesewege gebildet werden. Dies führt zu einer gewaltigen Diversität sekundärer Stoffe. Aufgrund ihrer unterschiedlichen Aktivitäten haben sie als Antibiotika, Immunsuppressiva, Cholesterinsenker oder Chemotherapeutika klinische Anwendung gefunden.
Die Bedeutung der Sekundärmetabolite für den eigentlichen Produzenten ist häufig nicht ganz klar. Durch solche Substanzen können Nahrungskonkurrenten inhibiert werden, die Stoffe können als Reservestoffe dienen, die unter ungünstigen Bedingungen wieder metabolisiert werden oder deren Synthese kann zum Abbau und Ausschleusen von Metaboliten dienen, die durch partielle Substrat- limitation angestaut werden. Weiterhin konnte auch gezeigt werden, dass viele Sekundärmetabolite als endogene Signalstoffe fungieren können, die Stadien der Differenzierung regulieren oder auch zur artübergreifenden Kommunikation genutzt werden (Überblick siehe Demain und Fang, 2000).
Sekundärmetabolite werden meistens nach ihrer zugrundeliegenden Biosynthese kategorisiert. Man unterscheidet zwischen Alkaloiden, Terpenoiden, Glykosiden, Phenolen, Phenazinen, Fettsäuren, Polyphenolen, Polyketiden, sowie ribosomalen und nicht-ribosomalen Peptiden. Im Folgenden wird die Synthese der Polyketide und nicht-ribosomaler Peptide genauer beschrieben.
I.1.1 Die Polyketidsynthasen
Polyketide gehören zu einer der größten und wichtigsten Gruppe der Naturstoffe. Unter anderem sind sie als Toxine, Virulenzfaktoren, Pigmente und Antibiotika in Pflanzen, Pilzen und Bakterien sehr weit verbreitet. Obwohl ihr grundlegender Biosynthesemechanismus ähnlich ist, zeigen Polyketide hinsichtlich Größe, Struktur und biologischer Wirkung große Unterschiede (siehe Abb. 2). Daher sind sie für die Entwicklung von neuen Arzneistoffen eine reichhaltige Quelle.
Die Polyketidsynthese ähnelt der Fettsäuresynthese. Dabei werden kleine, aktivierte Carbonsäure- Startereinheiten mit einer Malonyl-CoA-abgeleiteten Erweiterungseinheit (Extender) durch repetitive Claisen-Kondensationsreaktion miteinander verbunden. Während die Auswahl an möglichen Starter- einheiten relativ groß ist, gibt es bei den Erweiterungseinheiten weniger Variationen. Meist werden Malonat oder Methylmalonat verwendet, selten auch Ethylmalonat oder Methoxymalonat.
Aufgrund der Enzymanordnung und des Reaktionsmechanismus werden die Polyketidsynthasen (PKS) in drei Gruppen unterteilt: die komplexen Polyketidsynthasen (Typ I, PKS I), die man weiter in modular- und iterativ-arbeitende trennt, die aromatischen Polyketidsynthasen (Typ II, PKS II) und die einfachen Polyketidsynthasen (Typ III, PKS III) (siehe Abb. 1) (Überblick siehe Staunton et al., 2001; Shen, 2003).
5 Einleitung
a) modulare PKS vom Typ I
Lademodul Modul 1 Modul 2 terminales Modul(n) KR DH ER KR DH
AT ACP KS AT CoA ACP KS AT ACP KS AT ACP TE
R n-1
CO2
b) iterative PKS vom Typ I c) iterative PKS vom Typ II
AT ACP KS KSα KSβ ACP KSα KSβ ACP x y x y
CoA
R z
CO2 CO2
d) iterative PKS vom Typ III
CoA CoA KS KS ()n () n
m essentielle Domäne
nicht-essentielle Domäne CO2
Abb. 1: Schematischer Ablauf der Polyketidbiosynthese e a) modulare PKS von Typ I, b) iterative PKS vom Typ I, c) iterative PKS vom Typ II und d) iterative PKS vom Typ III; essentielle Domänen sind in blau, nicht-essentielle Domänen in violett und die Thioesterase ist in grau dargestellt; Biosynthesen sind vereinfacht dargestellt mit möglichen Produkten (Makrolid-Backbone (a); einfacher Ring (b); Tetracyclin-Vorstufe (c); Doppelring (d)); ACP: Acylcarrier-Protein; AT: Acyltransferase, DH: Dehydratase, ER: Enoylreduktase, KR: Ketoreduktase, KS: Ketosynthase, R: Rest; TE: Thioesterase; n, x, y, z, Anzahl Wiederholungen.
a) Die Polyketidsynthasen I
Die modularen Polyketidsynthasen vom Typ I sind sehr große, multifunktionale Enzyme, in denen mehrere katalytische Domänen kovalent miteinander verbunden sind. Funktionell sind sie ähnlich zum Typ I der Fettsäuresynthasen der Vertebraten. Dabei gibt es drei Enzyme, welche essentiell für die Synthese sind: Die Acyltransferase (AT) bindet eine mit Coenzym A-aktivierte Carbonsäure und lädt diese auf den Phosphopantetheinyl-Arm des Acyl-Carrier Proteins (ACP). Die Ketosynthase (KS) überträgt anschließend die wachsende Carbonkette auf die an einer weiteren ACP-gebundenen Verlängerungseinheit. Dies geschieht unter Abspaltung der endständigen Carboxylgruppe. Bei der Kondensationsreaktion entsteht eine Ketogruppe, die durch eine Ketoreduktase (KR), Dehydratase (DH) und Enoylreduktase (ER) unterschiedlich weit reduziert werden kann. Diese Enzyme sind optional und gewöhnlich als enzymatische Domänen in der PKS integriert. Die Thioesterase (TE) spaltet die fertige Carbonkette vom Enzymkomplex ab und das Produkt kann anschließend weiter modifiziert werden (siehe Abb. 1a). Bei den modularen PKS vom Typ I ergibt sich eine lineare Korrelation zwischen der Abfolge der PKS-Domänen und der schrittweisen Erweiterung der Polyketidkette. Sie kommen sehr häufig in Bakterien vor, in einzelnen Fällen wurden die Systeme auch in Protozoen und Dinoflagellaten gefunden. Diese Enzymklasse bildet als Produkte Makrolide 6 Einleitung
(z. B. Erythromycin (Cortes et al., 1990; Donadio et al., 1991)), Polyene (z. B. Amphotericin (Caffrey et al., 2001)), Ansamycine (z. B. Rifamycin (August et al., 1998)) und Polyether (z. B. Monensin (Oliynyk et al., 2003)) (siehe Abb. 2 blau, links).
Bei den iterativen PKS I werden die Enzyme wie in der Fettsäurebiosynthese wiederholt verwendet, sodass diese PKS nur aus einem Modul bestehen (siehe Abb. 1b). Iterative PKS I findet man haupt- sächlich in Pilzen und einzelnen Bakterien. Hierbei werden kleine Moleküle, bestehend aus einem bis zwei Ringen wie das Antibiotikum Methylsalicylsäure (Beck et al., 1990) und das Antimykotikum Aflatoxin (Yu et al., 2004) (siehe Abb. 2 blau, rechts) von einem solchen Enzymsystem synthetisiert.
b) Die Polyketidsynthasen II
Bakterielle Polyketidsynthasen vom Typ II (auch aromatische PKS) (siehe Abb. 1c) bilden einen Komplex aus monofunktionalen Enzymen, welche die Synthese von aromatischen Polyketiden katalysieren (Übersicht siehe Hertweck et al., 2007). Wie bei den iterativen PKS I werden wieder- holende Reaktionen vom selben Enzym durchgeführt. Diese Enzyme sind den Fettsäuresynthasen aus
Pflanzen und Bakterien ähnlich. Eine "minimale PKS II" besteht aus den zwei Ketosynthasen KSα und
KS sowie einem Acyl-Carrier Protein. Das ACP wird meist von einer aus dem Primärmetabolismus rekrutierten Malonyl-CoA:ACP-Transacylase der Fettsäuresynthese mit dem Extender beladen. Über das Zusammenspiel von KSα und KS kommt es zur Kettenerweiterung. Optional können auch Keto- reduktasen, Cyclasen und Aromatasen, die den Ringschluss katalysieren, sowie weitere modifizieren- de Enzyme vorhanden sein. Polyketidsynthasen vom Typ II gibt es ausschließlich in Bakterien. Bei den Produkten handelt es sich um polyphenolische Ringsysteme, die weiter unterteilt werden in Anthracycline (z. B. Daunorubicin (Otten et al., 1990)), Angucycline (z. B. Urdamycin (Decker und Haag, 1995)), Aureolsäuren (z. B. Mithramycin (Lombó et al., 1999)), Tetracycline (Übersicht siehe Mitscher, 1968), Tetracenomycine (Bibb et al., 1989), Pradimicin-ähnliche Polyphenole (z. B. Heda- mycin (Bililign et al., 2004)) und Benzoisochromanquinone (z. B. Actinorhodin (Fernández-Moreno et al., 1992)) (siehe Abb. 2 violett).
c) Die Polyketidsynthasen III
Bei Polyketidsynthasen vom Typ III handelt es sich um relativ kleine (ca. 40 kDa) (Kreuzaler et al., 1979), multifunktionale Enzyme, die als Homodimer die Synthese von kleinen aromatischen Poly- ketiden katalysieren (siehe Abb. 1d). Hauptsächlich findet man dieses Enzymsystem in Pflanzen. Dort werden sie als Chalcon- oder Stilbensynthasen bezeichnet und synthetisieren die Grundgerüste von Flavonoiden und Phytoalexinen (Überblick siehe Jez et al., 2001). Die Polyketidbiosynthese zeigt keine Ähnlichkeit zur Fettsäurebiosynthese und unterscheidet sich sehr von denen der PKS I und II. Polyketidsynthasen III haben einen ACP-unabhängigen Mechanismus. Auch die typischen enzym- atischen Domänen Ketosynthase und Acyltransferase fehlen. Die Kondensation der Acyl-CoA- Extendereinheit mit der vorherigen Vorstufe findet hier an der Thiogruppe (-SH) eines Cysteins im aktiven Zentrum des Enzyms statt (Tropf et al., 1995). In der Regel wird hier die Startereinheit mit nur
7 Einleitung zwei bis drei Malonyl-CoA-Einheiten erweitert und schlussendlich zu einer zyklischen Struktur verknüpft. Beispiele hierfür sind Acetylphloroglucinol (Achkar et al., 2005), Tetrahydroxynaphthalin (Izumikawa et al., 2003), sowie Vorstufen für ungewöhnliche Aminosäuren wie beispielsweise Dihydroxyphenylglycin (Pfeifer et al., 2001) (siehe Abb. 2 grün).
modulare PKS Typ I iterative PKS Typ I
Monensin Polyether Methyl- salicylsäure
Amphotericin B Polyen Aflatoxin Rifamycin S Ansamycin Erythromycin Makrolid PKS Typ II PKS Typ III
Actinorhodin Acetylphloro- Benzoisochromanquinon glucinol Tetracyclin Tetracenomycin Tetracyclin Tetracenomycin Daunorubicin Anthracyclin Tetra- hydroxy- naphthalin
Mithramycin Aureolsäuren Dihydroxy- phenyl- Hedamycin Urdamycin essigsäure Polyphenol Angucyclin
Abb. 2: Beispiele für Produkte von Polyketidsynthasen vom Typ I, II und III Dargestellt sind einige Beispiele von Produkten, die von Polyketidsynthasen vom Typ I (modulare, links; iterative rechts; blau), vom Typ II (violett) und vom Typ III (grün) synthetisiert werden; Gruppenzuordnung unter den jeweiligen Molekülnamen, fett; PKS: Polyketidsynthase.
Die große strukturelle Diversität der Polyketide kommt daher, dass während der Biosynthese verschiedene Carbonsäuren eingebaut werden, die wiederum unterschiedlich weit reduziert werden können. Je nach Anzahl der eingebauten Carbonsäuren kann die Länge der Carbonkette variieren. Ab- schließend kann diese vollständig oder teilweise zyklisieren und die Produkte können durch Enzyme wie Reduktasen, Oxygenasen, Methyl-, Acetyl- oder Glycosyltransferasen weiter modifiziert werden.
I.1.2 Die Nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen
Neben den Polyketiden zeigen auch viele bakterielle Peptide eine antibiotische Wirkung. Während Colicine und Lantibiotika ribosomal synthetisiert werden, werden andere Peptidantibiotika nicht- ribosomal durch Multienzymkomplexe hergestellt. Auch hier gibt es eine große strukturelle Diversität. Während bei Polyketiden nur wenige verschiedene Extender eingebaut werden, können bei nicht- ribosomalen Peptiden neben den zwanzig proteinogenen Aminosäuren (AS) auch nicht-proteinogene,
D-, Hydroxy- oder N-methylierte AS eingebaut werden. Die gebildete Peptidkette kann linear ver-
8 Einleitung bleiben, zyklisieren oder verzweigen, sowie weitere Modifikationen wie Acylierung oder Glycosyl- ierung erhalten.
Lademodul Modul 1 terminales Modul(n)
KR MT E
A PCP CA PCP C A PCP TE
Abb. 3: Schematischer Ablauf der Nicht-
R R ribosomalen Peptidsynthese R1 2 C R A: Adenylierungsdomäne, C: Kondensationsdo- n-2 AMP mäne, E: Epimerasedomäne, KR: Ketoredukt- R2 n-2 R R R 1 R asedomäne, MT: Methyltransferasedomäne, 2 A AMP PCP: Peptidyl-Carrier Protein, PPi: Pyro-
ATP PPi phosphat; R: Rest; TE: Thioesterasedomäne; n-2
R 1 Anzahl an Modulen; essentielle Domänen sind essentielle Domäne nicht-essentielle Domäne in rot, nicht-essentielle Domänen sind in violett und die Thioesterase ist in grau dargestellt.
Der Aufbau dieser Nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) ist ähnlich zu dem der modularen PKS I. Auch hier werden die einzelnen Einheiten, hier die AS, von einem modularen Megaenzym- komplex schrittweise zusammengesetzt, indem jedes Modul für den Einbau einer spezifischen AS verantwortlich ist (siehe Abb. 3) (Überblick siehe Schwarzer et al., 2003; Finking und Marahiel, 2004). Der Synthesemechanismus wird durch das sogenannte "Thiotemplate Modell" (Laland und Zimmer, 1973) beschrieben. Die neu einzubauende AS wird von der Adenylierungs-Domäne (A- Domäne) unter ATP-Hydrolyse als Aminoacyl-Adenylat aktiviert. Daraufhin wird die AS als Thio- ester über eine Phosphopantetheinyl-Gruppe kovalent an die Peptidyl-Carrier Protein (PCP)-Domäne gebunden. Die Kondensationsdomäne (C-Domäne) überträgt die PCP-gebundene AS von einem Modul zur nächsten PCP-gebundenen AS im nachliegenden Modul. So kommt es zu einer Verlänger- ung des Peptids um eine AS pro Modul. Die fertige Peptidkette wird durch Hydrolyse (auch hier meist durch eine Thioesterase-Domäne), Zyklisierung oder durch den spezifischen Transfer auf eine funktionelle Gruppe vom Enzymsystem freigesetzt. Ebenso wie bei den modularen PKS I zeigt sich eine Korrelation zwischen der Modulanordnung und dem Einbau der entsprechenden AS-Einheiten in die Peptidkette. Durch zusätzliche Domänen wie z.B. eine Epimerisierungs- (E), Methylierungs- (MT) oder reduzierende Domänen kann die Peptidkette während der Synthese weiter modifiziert werden. Beispiele für nicht-ribosomal synthetisierte Peptide sind Actinomycin (Keller et al., 2010), Bacitracin (Konz et al., 1997), Cyclosporin (Lawen und Zocher, 1990) und Vancomycin (van Wageningen et al., 1998)(siehe Abb. 4).
Cyclosporin A
Vancomycin Actinomycin Bacitracin
Abb. 4: Beispiele für Produkte von Nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen Bespiele gezeigt an Actinomycin, Bacitracin, Cyclosporin A und Vancomycin. 9 Einleitung
I.2 Actinomyceten – die Hauptproduzenten von Antibiotika
Actinomyceten (Actinomycetales) sind Gram-positive Bakterien mit einem hohen GC-Gehalt (>70 %) und gehören zur Klasse der Actinobacteria. Die Ordnung lässt sich weiter unterteilen in mehrere Unterordnungen und über 120 verschiedene Gattungen. Ein phylogenetischer Baum mit ausgewählten Gattungen ist in Abbildung 5 dargestellt.
Gattung Unterordnung bekannter Vertreter (Antibiotikum) Saccharopolyspora Saccharopolyspora erythraea (Erythromycin) Amycolatopsis Amycolatopsis orientalis (Vancomycin) Saccharomonospora Pseudonocardiales Saccharothrix Actinokineospora * Pseudonocardia Actinomyces Actinomycetales Propionibacterium Propionibacteriales Tropheryma Arthrobacter Micrococcales Micrococcus Streptomyces * Streptomyces griseus (Streptomycin) Streptomycetales Kitasatospora Actinomycetales Streptosporangium Streptosporangiales Salinispora Micromonosporales Actinoplanes Actinoplanes teichomyceticus (Teicoplanin) Frankia Frankiales Corynebacterium Mycobacterium Corynebacteriales Nocardia Gordonia
Abb. 5: Phylogenetischer Baum ausgewählter Gattungen der Ordnung Actinomycetales mit bekannten Vertretern (produziertes Antibiotikum) * in dieser Arbeit verwendete Gattungen
Vertreter der Actinomyceten kommen hauptsächlich im Boden, in der Rhizosphäre und in marinen Sedimenten vor. Als Saphrophyten produzieren sie eine Vielzahl degradierender Enzyme wie Amidasen (Seo et al., 2001), Cellulasen (Crawford und McCoy, 1972), Chitinasen (Reynolds, 1954), Lipasen (Sommer et al., 1997) und Xylanasen (Li et al., 2008). Diese werden verwendet, um abge- storbene Pflanzenreste, Arthropoden und die Zellwände verschiedener Mikroorganismen als Nähr- stoffe verfügbar zu machen. Dadurch spielen sie zusammen mit Pilzen und anderen Bakterien eine entscheidende Rolle bei der Kompostierung. Zusätzlich bilden viele Actinomyceten die Terpenoide Geosmin und Methylisoborneol sowie viele weitere Duftstoffe, die für den charakterisischen Geruch von Erde verantwortlich sind, aber auch Einfluss auf z. B. den Geschmack von Beeren und Wein haben (Gerber und Lechevalier, 1965; Gerber, 1979; Darriet et al., 2000).
Eine bedeutende Familie der Actinomyceten ist die der Streptomyceten. Der Name Streptomyces weist auf das oft charakteristisch gewundene (griech. streptós = gedreht, geflochten), pilzartige Aussehen (griech. mykes = Pilz) hin. Im Gegensatz zu anderen Bakterien zeigen Streptomyceten einen komplexen Lebenszyklus (Übersicht siehe Flärdh und Buttner, 2009). Zur Verbreitung und Über-
10 Einleitung dauerung von ungünstigen Umweltbedingungen dienen Sporen (Ensign, 1978). Diese können unter günstigen Bedingungen auskeimen, wobei lange Hyphen entstehen, die tief ins Substrat hinein- wachsen und sich zu einem verzweigten Mycel (= Substratmycel) differenzieren. Bei Stress wie Nähr- stofflimitation kommt es zu einer Umstrukturierung der Zellwand und Streptomyceten beginnen, ein Luftmycel zu bilden (Kelemen und Buttner, 1998). Bei anhaltender Limitation differenzieren sich die apikalen Hyphenzellen zu langen Sporenketten, die fertigen Sporen werden abgeschnürt und in die Natur freigelassen.
Das Genom von Actinomyceten ist mit ca. 8-9 Mb größer als das vieler anderer Bakterien. Auch die Tatsache, dass die DNA häufig linear ist, unterscheidet sich von den üblichen zirkulären prokary- otischen Genomen (Übersicht siehe Chen et al., 2002; Hopwood, 2006). Durch Deletionen, Amplifi- kationen und Umlagerungen von DNA-Bereichen kommt es häufig zu genomischen Veränderungen und somit zu einer großen Variabilität zwischen den einzelnen Stämmen. Während die essentiellen Gene des Primärmetabolismus vor allem im zentralen Bereich des Chromosoms liegen, sind die nicht essentiellen Gene des Sekundärmetabolismus oft an den Chromosomenenden lokalisiert (Hopwood, 2006). Dabei liegen die Gene, die für die Biosynthese, Synthese von Vorstufen, Regulation, Transport und Resistenz eines Sekundärmetaboliten verantwortlich sind, häufig nebeneinander in einem sogenannten Gencluster (Martín und Liras, 1989). Actinomyceten besitzen häufig 25-35 verschiedene Sekundärmetabolitgencluster auf ihrem Genom, produzieren unter Laborbedingungen aber meist nur ein oder zwei bioaktive Substanzen. Trotzdem werden von den derzeit verwendeten Antibiotika etwa 70 % von Actinomyceten, 20 % von Pilzen, 10 % von anderen Bakterien und nur wenige von anderen Organismen produziert. Vor etwa 15 Jahren schätzte man die Anzahl entdeckter Antibiotika aus Actinomyceten auf über 8700 Substanzen. Im Vergleich dazu wurden nur 2900 Antibiotika von anderen Bakterien und 4900 von Pilzen charakterisiert (Übersicht siehe Bérdy, 2005).
Beispiele für therapeutisch verwendete Antibiotika aus Actinomyceten sind Erythromycin (McGuire et al., 1952), Vancomycin (Brigham und Pittenger, 1956), Streptomycin (Schatz et al., 1944) und Teicoplanin (Somma et al., 1984) (siehe Abb. 4). Neben antibiotisch wirksamen Stoffen produzieren Actinomyceten aber auch eine Vielzahl weiterer wichtiger Substanzen wie das Immunsuppressivum Rapamycin (Vézina et al., 1975), den Lipase-Inhibitior Lipstatin (Weibel et al., 1987), Aminosäuren und Vitamine (Hermann, 2003; Kalinowski et al., 2003). Bis 2015 wurden über 4000 verschiedene Naturprodukte aus Streptomyceten beschrieben (Klementz et al., 2016). Für die Entdeckung von antibiotischen Substanzen aus Streptomyceten wurde bislang zweimal ein Nobelpreis vergeben: Im Jahre 1952 erhielt Selman Waksman des Nobelpreis für die Entdeckung von Streptomycin aus Streptomyces griseus für die Tuberkulose-Therapie (Schatz et al., 1944). Im Jahr 2015 teilte sich Satoshi Omura den Nobelpreis für Medizin für die Erforschung des Antiparasitikums Ivermectin aus Streptomyces avermitilis (Burg at al., 1979; Übersicht siehe Omura, 2008).
11 Einleitung
In dieser Arbeit wurde mit drei verschiedenen Actinomyceten-Stämmen gearbeitet: Streptomyces diastatochromogenes Tü6028, Streptomyces viridochromogenes Tü57 und Actinokineospora bang- kokensis 44EHWT.
I.2.1 Streptomyces diastatochromogenes Tü6028
Der Stamm Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 (siehe Abb. 6A) wurde aus einer Bodenprobe bei den Iguaçu Wasserfällen in Argentinien isoliert. S. diastatochromogenes Tü6028 produziert das Antibiotikum Polyketomycin (Paululat et al., 1999), das unabhängig davon zuvor aus dem Stamm Streptomyces sp. MK277-AF1 isoliert wurde (Momose et al., 1998a, 1998b). Das Antibiotikum hemmt das Wachstum Gram-positiver Bakterien, inklusive Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA). Darüber hinaus wird die Teilung von einigen Tumorzelltypen gehemmt (Momose et al., 1998a), wobei der genaue Wirkmechanismus noch unbekannt ist.
A WT ∆pokOIV B
C
D
10000 20000 30000 40000 50000 bp
minimale PKS II Zuckersynthese + Glycosyltransfer Regulation
Cyclasen Modifikation andere Funktion
Dimethylsalicylsäure-Synthese (PKS I) Transport unbekannte Funktion
Abb. 6: Polyketomycin und Foxicin A aus Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 (A) Kulturplatte von S. diastatochromogenes Tü6028 Wildtyp (links) und der ∆pokOIV-Mutante (rechts); (B) Struktur von Polyketomycin; (C) Struktur von Foxicin A (frühere Bezeichnung IP1); (D) Polyketomycin-Biosynthesegencluster in S. diastatochromogenes Tü6028, Funktionen der Genprodukte sind farblich markiert.
Das Antibiotikum setzt sich aus drei Einheiten zusammen: Ein decaketides Polyketomycinon (gebildet durch aromatische PKS II), eine 3,6-Dimethylsalicylsäure (gebildet durch iterative PKS I) und eine
Disaccharidkette aus -D-Amicetose und α-L-Axenose (siehe Abb. 6B). Das entsprechende Biosynthesegencluster setzt sich voraussichtlich aus 41 Genen zusammen und hat eine Größe von 52 kb (Daum et al., 2009) (siehe Abb. 6D).
In der Dissertation von Iris Peintner wurden die Monooxygenasen, die an der Polyketomycin- Biosynthese beteiligt sind, deletiert (Peintner, 2008). Der Stamm S. diastatochromogenes ΔpokOIV produziert kein Polyketomycin mehr, stattdessen werden hier größere Mengen weiterer Sekundär-
12 Einleitung metabolite detektiert (siehe Abb. 7A). Diese wurden IP1, IP2 und IP4 benannt. Bei genauerer Analyse konnten die Substanzen auch im S. diastatochromogenes Wildtyp detektiert werden, jedoch in weit niedrigeren Konzentrationen und vor der Produktion von Polyketomycin. IP1 zeigt eine schwach hemmende Wirkung gegen S. viridochromogenes Tü57. Die Struktur von IP1 wurde als 4-(Acetyl- Amino)-3-Hydroxy-6-(2,4,6-Trimethylhepta-2,5-Dienoylamino)-1,2-Benzoquinon aufgeklärt (siehe Abb. 6C). IP1 und IP2 zeigen das gleiche Absorptionsspektrum sowie eine Masse von 345,2 [M-H]- im negativen Modus des Massenspektrums (siehe Abb. 7B/C). In dieser Arbeit wurden die Metabolite in Foxicin A (IP1) und Foxicin B (IP2) umbenannt. Weiterhin konnten nach dem UV/vis-Spektrum noch zwei weitere Derivate, Foxicin C und D mit je einer Masse von 359,2 [M-H]- im negativen Modus, identifiziert werden (siehe Abb. 7).
S. diastatochromogenes Tü6028 1750 Wildtyp 1500 Polyketomycin 1250
1000
750
500 Absorption [mAU] Absorption 250
0
0 5 10 15 20 25 30 min
S. diastatochromogenes 1600 Foxicin A Tü6028 1400 ∆pokOIV 1200
1000
800
600 Foxicin B Foxicin C Absorption [mAU] Absorption 400
200 Foxicin D
0
A 0 5 10 15 20 25 30 Zeit [min]
2500 1400 2000 1000 160 1750 1200 2000 140 800 1500 1000 120 1500 1250 600 800 100 1000 80 1000 600 750 400 60 400 500 500 40 200 Absorption [mAU] Absorption 250 200 20 0 0 0 0 0 200 300 400 500 300 400 500 300 400 500 300 400 500 300 400 500 B Wellenlänge [nm] Wellenlänge [nm] Wellenlänge [nm] Wellenlänge [nm] Wellenlänge [nm]
863.2 345.2 345.2 359.2 359.2 100 100 100 100 100
80 80 80 80 80
60 60 60 60 60
40 40 40 40 40
20 20 20 20 20 rel. Absorption rel.[%] Absorption
0 0 0 0 0 250 500 750 250 500 750 250 500 750 250 500 750 250 500 750 C Masse [m/z] Masse [m/z] Masse [m/z] Masse [m/z] Masse [m/z]
Abb. 7: HPLC/MS-Analyse der Rohextrakte aus S. diastatochromogenes Tü6028 Wildtyp und der ΔpokOIV-Mutante (A) HPLC-Chromatogramm von Rohextrakten aus S. diastatochromogenes Tü60β8 Wildtyp ( =254 nm)(oben) und der ∆pokOIV-Mutante ( =320 nm)(unten); (B) UV/vis-Spektren von Polyketomycin, Foxicin A, B, C und D (v.l.n.r); (C) Massenspektren im negativen Modus [M-H]- von Polyketomycin, Foxicin A, B, C und D (v.l.n.r).
13 Einleitung
I.2.2 Streptomyces viridochromogenes Tü57
Der Stamm Streptomyces viridochromogenes Tü57 (siehe Abb. 8A) wurde Anfang der 60er Jahre aus einer Bodenprobe aus Venezuela isoliert (Hütter, 1962). Er produziert mehrere verschiedene Avilamycin-Derivate (Buzzetti et al., 1968), die zu den Orthomycin-Antibiotika gehören (Wright, 1979). Diese Antibiotikaklasse wird von verschiedenen Actinomyceten gebildet und hemmt das Wachstum Gram-positiver Bakterien inklusive Vancomycin-resistenten Enterokokken, MRSA und Penicillin-resistenten Streptokokken. Sie blockieren die Zusammenlagerung von 50S Ribosomen- Untereinheiten und somit die Translation (McNicholas et al., 2000; Champney und Tober, 2000). Avilamycin wird in der EU als Wachstumsförderer in der Tiermast eingesetzt, wodurch eine zu- nehmende Resistenzentwicklung von Enterococcus faecium beobachtet wird (Aarestrup et al., 1998a/b, 2000).
Avilamycin setzt sich aus einer Kette von sieben Zuckermolekülen zusammen (Methyleurekant, 2-O-
Isoutyryl-L-Lyxose, 2,6-di-O-Methyl-D-Mannose, 4-O-Methyl-D-Fucose, 2-Desoxy-D-Evalose, zwei
D-Olivosen), die mit dem Polyketid Orsellinsäure (Dichloroisoeverninsäure) kondensiert werden (siehe Abb. 8B). Die Zuckerkette bildet dabei eine Ringstruktur, die das Molekül hydrophob werden lassen. Wahrscheinlich sorgen die terminale Dichloroisoeverninsäure und die zwei Orthoester- verknüpfungen zwischen D-Olivose und 2-Desoxy-D-Evalose sowie zwischen L-Lyxose und Methyl- eurekant für die antimikrobielle Wirkung.
AB
C
10000 20000 30000 40000 50000 bp
Zuckersynthese Halogenase Regulation
Glycosyl-Transfer Modifikation Resistenz
Orsellinsäure-Synthese (PKS I) Transport unbekannte Funktion
Abb. 8: Avilamycin aus Streptomyces viridochromogenes Tü57 (A) Kulturplatte von S. viridochromogenes Tü57; (B) Struktur von Avilamycin A; (C) Avilamycin-Biosynthesegencluster in S. virido- chromogenes Tü57, Funktionen der Genprodukte sind farblich markiert.
14 Einleitung
Die verschiedenen Avilamycin-Derivate unterscheiden sich in ihrem Methylierungsmuster. Bei der HPLC/MS-Analyse lassen sich die Avilamycine trotz der geringen Absorptionsintensität aufgrund des charakteristischen Massenprofils der Halogenierung gut detektieren (siehe Abb. 9 F-I). Das Avila- mycin-Biosynthesegencluster in S. viridochromogenes Tü57 hat eine Größe von 60 kb mit 54 ORFs (Gaisser et al., 1997; Weitnauer et al., 2001) (siehe Abb. 8C).
1600 1400
[mAU] 1200 1000 245nm 800 600 400 Absorption Absorption 200 0 0 5 10 15 20 25 30 A Zeit [min]
3.6 min 10.4 min 16.0 min 21.1 min 2000 1200 1200 1600 1800 1400 1000 1600 1000 1200 1400 800 800 1000 1200 600 600 1000 800 600 800 400 400 Absorption [mAU] Absorption 600 400 200 200 400 200 200 0 0 0 200 220 240 260 280 300 320 340 200 220 240 260 280 300 320 340 200 220 240 260 280 300 320 340 200 220 240 260 280 300 320 340 B Wellenlänge nm C Wellenlänge nm D Wellenlänge nm E Wellenlänge nm 3.6 min 10.4 min 16.0 min 21.1 min 100 100 100 100 1421.4 1401.4 1403.4 1405.4 1403.4 1405.4 1419.4 80 80 80 80 1402.4 1404.4 1404.4 1420.4 60 60 1422.4 60 60 1404.4 1406.4 1406.4 1423.4 40 40 40 40 1407.4 1405.4 1407.4
20 20 1424.4 20 20 1421.4 relative[%] Absorption 1408.4 1406.4 1419.4 1425.4 1422.4 1435.4 1423.4 1420.4 1371.5 1375.4 1421.4 1390.4 1409.4 1438.4 1409.4 0 0 0 0 1380 1400 1420 1440 1420 1425 1405 1410 1415 1420 1425 1402 1404 1406 1408 F Masse / Ladung [m/z] G Masse / Ladung [m/z] H Masse / Ladung [m/z] I Masse / Ladung [m/z] Abb. 9: HPLC/MS-Analyse des Rohextraktes aus S. viridochromogenes Tü57 Wildtyp (A) HPLC-Chromatogramm vom Rohextrakt aus S. viridochromogenes Tü57 Wildtyp ( = β54 nm), Pfeile zeigen verschiedene Avilamycin- Derivate; (B-E) UV/vis-Spektren von verschiedenen Avilamycin-Derivaten; (F-I) Massenspektren im negativen Modus [M-H]- von verschiedenen Avilamycin-Derivaten.
I.2.3 Actinokineospora bangkokensis 44EHWT
Der Stamm Actinokineospora bangkokensis 44EHWT (A. bangkokensis) wurde aus der Rhizosphäre einer Elefantenohrenpflanze (Colocasia esculenta) in Bangkok, Thailand isoliert (Intra et al., 2013). Wie Streptomyceten produziert A. bang- kokensis ein verzweigtes Mycel und Stäbchen-förmige Sporen. Auf Agar- platten und in Flüssigmedium wächst die Kultur orangefarbig an (siehe Abb. 10).
Abb. 10: Kulturplatte von Actinokineospora bangkokensis 44EHWT
15 Einleitung
Die Gattung Actinokineospora wurde von Hasegawa eingeführt und gehört zur Familie der Pseudo- nocardiaceae (Hasegawa, 1988). Actinokineospora-Stämme sind charakterisiert durch meso-Diamino- pimelinsäure in der Zellwand, sowie MK-9 (H4) als vorwiegendes Menaquinone, Phospholipide vom
Typ II und iso-C16:0 als hauptsächliche Fettsäure in der Membran. Diese Untersuchungen wurden mit dem neu isolierten Stamm durchgeführt, welcher daraufhin den Actinokineospora zugeordnet wurde (Intra et al., 2013).
Tab. 1: Bekannte Stämme der Gattung Actinokineospora
Stamm Isoliert aus Produziert Literatur Blatt auf Waldboden, A. auranticolor IFO 16518 ? Otoguro et al., 2001 Levelland, Texas Rhizosphäre einer Magnolie, A. baliensis ID03-0561 ? Lisdiyanti et al., 2010 Bali, Indonesien Rhizosphäre Elefantenohren- A. bangkokensis 44EHWT ? Intra et al., 2013 baum, Bangkok, Thailand A. cianjurensis BTCC B-558 Blatt, Java, Indonesien ? Lisdiyanti et al., 2010 A. cibodasensis NBRC 104212 Blatt, Java, Indonesien ? Lisdiyanti et al., 2010 Rhizospäre Dattelpflaumen, A. diospyrosa NRRL B-24047 ? Tamura et al., 1995 Japan Waldboden, Levelland, A. enzanensis IFO 16517 (*) ? Otoguro et al., 2001 Texas Macrobizyklisches Celmer et al., 1977; A. fastidiosa NRRL B-16697 Bodenprobe, Ägypten Peptidantibiotium gegen Henssen et al., 1987; Gram-positive Bakterien Labeda et al., 2010 A. globicatena NRRL B-24048 Sediment See Inaga, Japan ? Tamura et al., 1995 A. guangxiensis GK-6T Bodenprobe, Guangxi, China ? Wu und Liu, 2015 A. inagensis NRRL B-24050 (*) Blatt auf See Inaga, Japan ? Tamura et al., 1995 A. mzabensis PAL84 Sahara, Algerien ? Aouiche et al., 2015 A. riparia IFO 14541 Sediment, Fluss Ado, Japan anti-mycoplasmal Aktivität Hasegawa, 1991 A. soli YIM 75948T Bodenprobe, Yunnan, China ? Tang et al., 2012 Abdelmohsen et al., 2010, 2014; Mariner Schwamm anti-trypanosomal Harjes et al., 2014; A. spheciospongiae EG49 (*) Spheciospongia vagabunda Actinosporins A-D; Dashti et al., 2014; im roten Meer Ko-Kultivierungsprodukte Grkovic et al., 2014; Kämpfer et al., 2015 A. terrae IFO 15668 Sediment eines Teichs, Japan ? Tamura et al., 1995 Stand Oktober 2016; (*) Draft-Genom-Sequenz vorhanden
Bislang wurden nur fünfzehn weitere Stämme der Gattung Actinokineospora beschrieben. Dabei lag der Schwerpunkt der Forschung hauptsächlich auf der Gattungszuordnung, über das Potential zur Sekundärmetabolit-Produktion ist bislang nicht viel bekannt. Aus A. fastidiosa konnte ein gegen Gram-positive Bakterien wirksames, makrobicyclisches Peptidantibiotikum (Celmer et al., 1977), aus A. riparia eine Substanz gegen Mycoplasmen (Hasegawa, 1991) und aus A. spheciospongiae die anti- trypanosomalen Actinosporine A-D (Abdelmohsen et al., 2014; Grkovic et al., 2014) isoliert werden. Bis dato wurden die Genome von drei Actinokineospora-Stämmen teilweise sequenziert, das von A. enzanensis, A. inagensis und A. spheciospongiae (Kämpfer et al., 2015).
16 Einleitung
I.3 Die Wege zu neuen aktiven Stoffen
Aufgrund der zunehmenden Resistenzentwicklung und Ausbreitung von multiresistenten Pathogenen ist es notwenig neue Antibiotika und andere aktive Stoffe zu identifizieren, zu analysieren und weiter zu verbessern. Dies lässt sich auf verschiedene Weise verwirklichen.
I.3.1 Isolierung und Charakterisierung neuer Stämme
Wie zuvor beschrieben sind im Boden lebende Actinomyceten, vor allem Streptomyceten, und Pilze eine reichhaltige Quelle diverser Metabolite mit unterschiedlichen Aktivitäten. Viele dieser Meta- bolite haben eine antibiotische Wirkung. In den letzten Jahrzehnten wurden zahlreiche neue Stämme auf der ganzen Welt isoliert und charakterisiert. Die weitere Isolierung noch unbekannter Sekundär- metabolitproduzenten, insbesondere auch seltenerer Stämme (Lazzarini et al., 2000), sowie von Stämmen aus extremen Habitaten, bietet eine gute Chance, neue Wirkstoffe zu finden.
Derzeitig werden vermehrt neue Actinomyceten aus marinen Systemen wie z. B. aus Schwämmen, Tunikaten und Korallen untersucht. Dabei wurden einige neue Gattungen wie die der Salinispora oder Marinispora entdeckt, die zahlreiche unbekannte und auch einzigartige Moleküle synthetisieren (Übersicht siehe Lam, 2006; Fenical und Jensen, 2006; Zotchev, 2012).
I.3.2 Aktivierung stiller Sekundärmetabolitgencluster
Neben dem Ansatz nach noch-unentdeckten Stämmen mit eventuell neuen Sekundärmetaboliten zu screenen, kann man den Fokus auch auf eine geringere Anzahl an Stämmen legen und diese im Detail untersuchen. Actinomyceten und Pilze haben in ihrem Genom häufig über 30 verschiedene Sekundär- metabolitgencluster, wobei unter Laborbedingungen häufig nur ein oder zwei Sekundärmetabolite synthetisiert werden. Die anderen Cluster sind "still" und die entsprechenden Metabolite werden nicht produziert. Die Aktivierung solch stiller Cluster bietet eine reichliche Quelle neuer Substanzen.
Die Expression stiller Gencluster lassen sich durch verschiedene Herangehensweisen induzieren (Übersicht siehe Rutledge und Challis, 2015). Beispielsweise konnten durch die Veränderung von Kultivierungsbedingungen (z. B. Medienzusammensetzung, Belüftung, Zugabe von Enzyminhibitoren, pH-Wert, Temperatur) in vielen Fällen stille Cluster aktiviert und neue Substanzen identifiziert werden. Diese Methode wird als OSMAC-Ansatz (One Strain – Many Compounds) bezeichnet (Bode et al., 2002). Nach Ko-Kultivierung von verschiedenen Bakterien oder Pilzen konnten in zahlreichen Versuchen neue Metabolite detektiert werden (Schroeckh et al., 2009). Das Einbringen von aktivierenden (Kalan et al., 2013; Makitrynskyy et al., 2013; Gessner et al., 2015) bzw. die Deletion von reprimierenden Regulatoren (Matsuno et al., 2004) kann zur Aktivierung stiller Sekundär- metabolitgencluster führen (Überblick siehe Bibb, 2005). Weiter sind die Klonierung ganzer Gen-
17 Einleitung cluster und Expression in einem heterologen Wirt eine erfolgreiche Methode zur Produktion neuer Substanzen (Fu et al., 2012; Yamanaka et al., 2014).
I.3.3 Metagenomische Untersuchungen
Ein großes Problem bei der Isolierung von Stämmen ist, dass nur etwa 1 % aller Bakterienarten im Labor kultivierbar sind, während die Information von 99 % verloren gehen (Amann et al., 1990; Über- blick siehe Riesenfeld et al., 2004). Durch neue Methoden der Next-Generation Sequenzierung von Metagenomen, also die Gesamtheit der genomischen Information von Mikroorganismen einer bestimmten Lebensgemeinschaft oder eines Habitats, kann man einen Teil dieser Informationen wiedergewinnen und sich zunutze machen. Dabei können neue und bessere Enzyme bis hin zu ganzen Genclustern identifiziert werden (Überblick siehe Lorenz et al., 2002; Daniel, 2004, 2005; Uchiyama und Miyazaki, 2009). In mehreren metagenomischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass nicht-kultivierbare, bakterielle Symbionten für die Produktion von bestimmen Metaboliten verant- wortlich sind, bei denen man zuvor dachte, dass sie von einem anderen Organismus, u.a. marinen Schwämmen oder Insekten, synthetisiert werden (Piel, 2002; Fisch et al., 2009; Überblick siehe Piel, 2009).
I.3.4 Kombinatorische Biosynthese
Sekundärmetabolite können nach ihrem grundlegenden Biosynthesemechanismus kategorisiert werden. Während der Synthese werden häufig die einzelnen, meist einfachen Grundbausteine schrittweise zusammengesetzt. Dabei können Monosaccharide, proteinogene und nicht-proteinogene Aminosäuren sowie Carbonsäuren kondensiert werden.
Durch die steigende Anzahl an Genomsequenzierungen und der Analyse von Genclustern fand man heraus, dass während der Evolution ein Austausch von Genen, Clusterabschnitten bis hin zu ganzen Clustern stattgefunden haben muss, auch über Speziesgrenzen hinweg (Walton, 2000; Khaldi et al., 2008; Osbourn, 2010; Ziemert et al., 2012). Infolgedessen haben sich häufig riesige Gencluster (bis >100 kb) gebildet, die Gene aus verschiedenen Klassen beinhalten, sodass sich das entsprechende Produkt aus mehreren Untereinheiten zusammensetzt. Ein anschauliches Beispiel ist das Antibiotikum Simocyclinon, das von Streptomyces antibioticus Tü6040 produziert wird. Das Molekül setzt sich aus einem Angucyclinon-Ring (von PKS II), einer D-Olivose, einer Tetraen-Kette (von PKS I) und einem Aminocumarin-Ring zusammen (Schimana et al., 2000). In den Antibiotika Novobiocin und Coumer- mycin bildet der Aminocumarin-Ring auch eine Untereinheit, wohingegen die anderen Struktur- elemente keine Ähnlichkeiten aufweisen. Dennoch sind die Cumarin-Biosynthesegene in den drei Stämmen homolog zueinander und zeigen hohe Sequenzübereinstimmungen, wobei die Abfolge der Gene in S. antibioticus abweicht (Galm et al., 2002)(siehe Abb. 11).
18 Einleitung
S. antibioticus Tü6040 Simocyclinone D8
S. sphaeroides
Novobiocin
S. rishiriensis
Coumermycin
bp 2000 4000 6000 8000
Abb. 11: Evolution der Aminocumarin-Biosynthesegene von Simocyclinon, Novobiocin und Coumermycin Gene für Aminocumarin-Biosynthese in S. antibioticus Tü6040, S. shaeroides und S. rishiriensis (links), homologe Gene sind farblich markiert; Struktur von Simocyclinon D8, Novobiocin und Coumermycin (rechts), Aminocumarin-Untereinheit ist in blau markiert. Modifiziert nach Galm et al. 2002
Um neue Stoffe zu entwickeln, können diese natürlichen Prozesse des Genaustauschs im Labor durch gezielte Inaktivierung und/oder heterologen Expression von nativen oder gentechnisch modifizierten Genen, Clustern oder Clusterabschnitten beschleunigt werden. Diese Methode nennt man "Kombinatorische Biosynthese" (Tsoi und Khosla, 1995). Durch die gezielte Modifizierung von Substanzen konnten deren Eigenschaften in mehreren Studien verbessert werden (Übersicht siehe Khosla und Zawada, 1996; Walsh, 2002; Floss, 2006; Sun et al., 2015).
I.3.5 Chemische Synthese nach Computer-basierten Docking-Studien
Effektive Antibiotika mit wenigen Nebenwirkungen sind hauptsächlich diejenigen, die die mensch- liche Zelle nicht angreifen können, sondern nur spezifische Zielstrukturen (Targets) des Pathogenen binden und dabei blockieren. Dazu zählen essentielle Biomoleküle oder auch Enzyme für deren Bio- synthese. Bedeutende Zielstrukturen sind demnach z. B. Ergosterole/Hopanoide, die Chitin/Peptido- glycan-Zellwand oder 30S/50S-Ribosomen, da diese in der menschlichen Zelle nicht vorkommen (Übersicht siehe Projan, 2002).
Durch Röntgenstrahlexperimente konnte man die Konformation vieler Zielstrukturen aufklären, die katalytischen Zentren bestimmen, sowie die spezifischen Interaktionen eines Antibiotikums mit seinem Target aufklären. Mittels Computersimulation kann man nun eine Vielzahl von Molekülen gezielt darauf testen, ob sie ein bestimmtes Target blockieren bzw. welche Modifizierungen zu einer verbesserten Hemmung führen könnten. Nach chemischer Synthese der theoretisch effizientesten Blocker muss anschließend in vivo getestet werden, ob die Moleküle tatsächlich die vorhergesagte Wirkung zeigen. Mithilfe dieses Ansatzes konnte schon eine große Menge neuer Liganden gescreent
19 Einleitung werden (Bressi et al., 2001; Foloppe et al., 2004; Barbault et al., 2008; Lucas et al., 2013; Sahner et al., 2013; D’Antonio et al., 2015). Dabei konnten auch Moleküle spezifisch gegen Viren wie Influenza, HIV und Enteroviren designt werden (Wang et al., 2013; De Colibus et al., 2014; Frey et al., 2015; Yokokawa et al., 2016).
I.4 Das MIBiG-Projekt
Aufgrund neuer Entwicklungen bei der Genomsequenzierung, der Bioinformatik, der analytischen Chemie und der synthetischen Biologie hat sich die Sekundärmetabolit-Forschung in den letzten Jahren signifikant verändert. Durch die Identifizierung von Genclustern in Genomsequenzen ist es nun möglich, die Cluster gezielt zu untersuchen und weitere Experimente durchzuführen.
Die Informationen der einzelnen Biosynthesewege von bekannten Naturstoffen sind in hunderten wissenschaftlichen Artikeln in verschiedenen Journals verteilt. Erst durch das Lesen vieler Artikel wird ersichtlich, welche Schritte bereits experimentell bewiesen und welche Biosynthesen bislang nur postuliert wurden.
Das Genomic Standards Consortium entwickelte das Programmiergerüst für die Minimale Information jeglicher Sequenzen (MIxS Minimum Information about any Sequence). Als Erweiterung von GSC MIxS wurde das Projekt "Minimale Informationen eines Biosynthese-Genclusters" (MIBiG Minimum Information about a Biosynthetic Gene Cluster) von Marnix Medema, Rainer Breitling, Eriko Takano und Frank Glöckner initiert und koordiniert. In dieser Datenbank (http://mibig.secondarymetabolite. org) sind neben den Biosynthese-Genclustern, der Strukturen und Aktivitäten auch die experimentell bestätigten Funktionen einzelner Gene sowie relevante Artikel zusammengefasst (siehe Tab. 2). Die Kombination von allgemeinen und molekülspezifischen MIBiG-Parametern gibt eine umfangreiche Beschreibung der chemischen und genetischen Eigenschaften eines Biosynthesewegs.
Das MIBiG-Projekt ist eine Zusammenarbeit vieler Wissenschaftler: 61 Forschungsleiter aus sechs- zehn verschiedenen Ländern und deren Mitarbeiter nahmen an diesem Projekt teil. Von ihnen wurden die Informationen von Biosynthesewegen aus Bakterien, Archaeen, Pilzen und Pflanzen verarbeitet.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollten die Informationen von Aranciamycin, Avilamycin, Lando- mycin, Mensacarcin, Polyketomycin, Rishirilid, Simocyclinon und Urdamycin in die Datenbank eingetragen werden.
20 Einleitung
Tab. 2: Schematischer Überblick der MIBiG-Standard
Allgemeine Parameter
Biosynthese-Klasse(n) Funktionale Kategorie jedes Gens ID in chemischen Datenbanken
Relevante Artikel Modifizierende Enzyme/Reaktionen Struktur des Moleküls
Anzahl der Loci Phänotyp der KO-Mutante Strukturformel
Komplette/partielle Cluster Architektur eines Operons Exakte Molekülmasse
Nukleotid Accession Nummer Funktionale Sub-Cluster Aktivität
MIxS Metadata Name des Moleküls Molekulares Ziel
Namen der Gene Synonym des Moleküls Chemische Untereinheiten
Substanz-spezifische Parameter
Polyketide Nicht-ribosomale Peptide RiPPs
Polyketid-Unterklasse NRP-Unterklasse RiPP-Unterklasse
Polyketidsynthase-Typ Linear/cyclisch Linear/cyclisch
Linear/cyclisch NRPS-Gene Precursor-kodierende Gen(e) Sequenz des Core-Peptids Startereinheit Thioesterase-Typ Länge des Leader-Peptids Polyketidlänge Release/Cyclisierungs-Typ Länge des eigentlichen Peptids PKS-Gene Modulare NRPS Architektur Sequenz der Abspaltungsstelle Anzahl der Iterationen Modul-Skipping/Iteration Erkennungsmotiv des Leader-Peptids Modifizierende Domänen Iterative PKS-Unterklasse + Cyclisierung Peptidasen bei der Abspaltung Kondensationsdomäne-Unterklasse Trans-Acyltransferase-Gene Crosslink/Crosslink-Typ A-Domänen Substratspezifitäten Cylasen/Aromatasen Epimerisierung von Aminosäuren Thioesterase-Typ Saccharide Saccharid-Unterklasse Release/Cyclisierungs-Typ Terpenoide Glykosyltransferase-Gene Modulare PKS Architektur Terpen-Unterklasse Glykosyltransferase-Spezifität Reduktive Domänen Terpengerüst-Größe Sub-Cluster der Zuckerbiosynthese nicht-reduktive, modifizierende Domänen Finaler Isoprenoid-Precursor
Ketoreduktase-Stereochemie Terpen-Synthasen/Cyclasen Alkaloide
AT/CAL-Domänen Substratspezifitäten Prenyltransferasen Alkaloid-Unterklasse
AT: Acyltransferase; CAL: Substrat-aussuchende Domäne; MIxS: Minimale Information einer Sequenz; NRP: nicht-ribosomal- synthetisiertes Peptid; NRPS: Nicht-ribosomale Peptidsynthetase; PKS: Polyketidsynthase; RiPP: Ribosomal-synthetisierte Polypeptide. Modifiziert nach Medema et al., 2015
21 Einleitung
I.5 Ziel dieser Arbeit
Der Fokus dieser Arbeit liegt auf der Untersuchung neuer Sekundärmetabolite aus verschiedenen Actinomyceten. Dabei wurden drei größere Themenberiche bearbeitet:
Der Stamm Actinokineospora bangkokensis 44EHWT wurde 2012 aus einer Bodenprobe in Thailand isoliert. Bislang wurden nur Zellwandzusammensetzung, Wachstumsbedingungen sowie Morphologie des Stammes charakterisiert (Intra et al., 2013). In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob A. bang- kokensis interessante Sekundärmetabolite produziert. Da von der Gattung der Actinokineospora nur wenig bekannt ist, sollte auch das komplette Genom sequenziert und analysiert werden. Zusätzlich galt es herauszufinden, ob der Stamm genetisch manipulierbar ist.
Durch kombinatorische Biosynthese von Polyketomycin und Avilamycin sollten neue Substanzen in den Stämmen Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 und Streptomyces viridochromogenes Tü57 generiert werden. Dabei sollten die Gene für die Methylsalicylsäure-Biosynthese ausgetauscht werden.
Als Folge der pokOIV-Deletion der Polyketomycin-Biosynthese konnte die Produktion der Foxicine in S. diastatochromogenes Tü6028 gesteigert werden (Peintner, 2008). Die exakten Strukturen von Foxicin A und Foxicin B sollten geklärt werden. Weiterhin sollte die Aktivität von Foxicin A unter- sucht, sowie die Biosynthese aufklärt werden. Zusätzlich sollte das Genom von S. diastatochromo- genes Tü6028 analysiert werden.
Außerdem sollten die minimalen Informationen von acht verschiedenen Sekundärmetaboliten aus unterschiedlichen Actinomyceten in die MIBiG-Datenbank eingetragen werden.
22 Materialien und Methoden
II Materialien und Methoden
23 Materialien und Methoden
II.1 Materialien Im Folgenden werden die in dieser Arbeit verwendeten Materialien, deren Bezugsquelle, relevante Literatur und weitere Informationen aufgelistet.
II.1.1 Chemikalien und weitere Reagenzien
Tab. 3: Verwendete Chemikalien
Chemikalien Bezugsquelle
Acrylamid/Bisacrylamid Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Agar-Agar Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Agarose Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Ammoniumchlorid Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Ammoniumhydrogencarbonat Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Ammoniumperoxodisulfat (APS) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Bromphenolblau Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Calciumcarbonat Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Calciumchlorid Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe CASO Bouillon Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Coomassie Brilliant Blue R250 Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Dithiothreitol (DTT) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Eisen(II)sulfat Heptahydrat Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Eisen(III)chlorid Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe D(+)-Glucose Monohydrat Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Glycerin Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Hefeextrakt Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Kaliumacetat Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Kaliumchlorid Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Kaliumsulfat Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe di-Kaliumhydrogenphosphat Trihydrat Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Kaliumdihydrogenphosphat Merck KGaA, Darmstadt Lactose Monohydrat Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe L-Arabinose Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München LB-Medium (Lennox) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Magnesiumchlorid Hexahydrat Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Magnesiumsulfat Heptahydrat Merck KGaA, Darmstadt D(+) Maltose Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Malzextrakt Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe D-Mannitol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Mercaptoethanol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Methylenblau Merck KGaA, Darmstadt Middlebrook 7H9 Broth Base Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Natriumacetat Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Natriumchlorid Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Natriumdodecylsulfat (SDS) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Natriumhydrogencarbonat Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Natriumhydroxid Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Natriumsulfat Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Ni-NTA Agarose QIAGEN, Hilden N-Lauroylsarcosine Natriumsalz Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Pepton aus Soja Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Polyethylenglykol 8000 Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Saccharose (Feinzucker) Gut & Günstig, EDEKA Sojamehl vollfett W. Schoenenberger GmbH & Co KG D-Sorbitol 97 % Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Tris (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Tris-Hydrochlorid (Tris/HCl) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Trypton/Pepton aus Casein Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Yeast synthetic Drop-out Medium supplements Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Yeast-Nitrogen Base ohne Aminosäuren Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
24 Materialien und Methoden
Tab. 4: Organische Lösungsmittel und Säuren
Organische Lösungsmittel und Säuren Bezugsquelle
Aceton Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Acetonitril (ACN) J.T. Baker, Avantor Performance Materials, PA, USA Ameisensäure Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Chloroform VWR International GmbH, Darmstadt Dichlormethan Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe N,N-Dimethylformamid (DMF) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Dimethylsufoxid (DMSO) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Ethylacetat (EtAc) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Ethanol (EtOH) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Essigsäure (HAc) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Isopropanol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Methanol (MeOH) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Salzsäure 25 % Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Tab. 5: Verwendete Antibiotika
Antibiotikum Lösungsmittel Selektionskonzentration [µg/mL] Bezugsquelle
Apramycin (Apra) H2Obidest. 50 AppliChem GmbH, Darmstadt Carbenicillin (Carb) H2Obidest. 100 Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Chloramphenicol (Cm) EtOH 30 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Fosfomycin (Fosfo) H2Obidest. 200 Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Kanamycin (Kan) H2Obidest. 50 Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Hygromycin (Hygro) H2Obidest. 100 Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Spectinomycin (Spec) H20bidest. 50 AppliChem GmbH, Darmstadt Thiostrepton (Thio) DMSO 25 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Tab. 6: Sonstige verwendete Biochemikalien
Sonstige Biochemikalien Stammlösung Bezugsquelle
Adenin Hemisulfatsalz Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Adenosintriphosphate (ATP) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe D-Fructose-6-phosphate Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München dNTP-Stammlösung (Desoxynukleotide) 100 mM Promega GmbH, Mannheim Ethidiumbromid 0,001 % Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe GelRedTM 0,03 % Biotium, Inc., Hayward, Kanada Imidazol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe IPTG (Isopropyl-ß-D-Thiogalactopyranosid) 0,2 mM Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe NADH (Nicotinamidadenindinukleotid) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-glucuronsäure) 1 % Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
Tab. 7: Verwendete Aminosäuren
Aminosäuren Bezugsquelle
Alanin Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Arginin Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe DL-2,4-Diaminobutyratdihydrochlorid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Ornithin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Serin Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
25 Materialien und Methoden
II.1.2 Enzyme
Tab. 8: Verwendete Enzyme
Enzyme Bezugsquelle
Aldolase Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München DNase I New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main
Fructose-6-phosphate Kinase, PPi-abhängig Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Glycerophosphatdehydrogenase Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Lysozym (aus Hühnereiweiß) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Lyticase aus Arthrobacter luteus Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Pfu DNA-Polymerase eigene Herstellung Phusion DNA-Polymerase eigene Herstellung Proteinase K Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Restriktionsendonukleasen New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main RNase A QIAGEN GmbH, Hilden T4-DNA Ligase New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main Taq-Polymerase eigene Herstellung Triosephosphatisomerase Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Velocity DNA-Polymerase Bioline GmbH, Luckenwalde
II.1.3 Molekulargewichtsmarker
Tab. 9: Verwendete Molekulargewichtsmarker
Molekulargewichtsmarker Bezugsquelle
1 kb DNA Ladder #N3232 New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main 100 bp DNA Ladder #N3231 New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main 50 bp Ladder #N3236 New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main Protein Ladder #P7703 New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main Protein Marker VI (10-245) prestained AppliChem GmbH, Darmstadt
II.1.4 Molekularbiologische Kits
Tab. 10: Verwendete molekularbiologische Kits
Molekularbiologisches Kit Bezugsquelle
Pure Yield™ Plasmid Midiprep System Promega Corporation, Madison, USA Malachite Green Assay Kit Echelon Biosciences Inc., Salt Lake City, USA Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System Promega Corporation, Madison, USA Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Promega Corporation, Madison, USA
26 Materialien und Methoden
II.1.5 Bakterienstämme
Tab. 11: Verwendete E. coli - Stämme
Stamm- Genotyp Beschreibung Referenz bezeichnung
- - - BL21 (DE3) F , ompT, hsdSB (rB mB ) Überexpression von heterologen Genen Invitrogen AG, StarTM gal, dcm, rne131, (DE3) in E. coli, T7-Expressionssystem, verbes- Carlsbad, USA serte mRNA-Stabilität, Deletion OmpT- Transporter
DH5α F-, φ80lacZΔM15 Methylierungs-defizienter E. coli- Invitrogen AG, Δ(lacZYA-argF),U169 Stamm Carlsbad, USA recA1, endA1, hsdR17, (rk-, mk+) phoA, supE44, thi-1, gyrA96, relA1 -
GB05 ∆recET, ∆ybcC E. coli-Stamm für LLHR, recET-Lokus Fu et al., 2012 pSC101-PBAD-EtgA und ybcC (putative Prophage-Exonuklease) bzw. deletiert; mit pSC101-Plasmid mit Rekombinasen, R pSC101-PRHA-EtgA Arabinose-/ bzw. Rhamnose-induzierbar, [Tet ]
GB05-dir GB05, PBAD-ETgA E. coli-Stamm für LLHR, Fu et al., 2012 ybcC ausgetauscht gegen recE, recT, gam, recA hinter Arabinose-induzierbaren Promotor
GB08-red GB05, ∆lacZ, PBADα A E. coli-Stamm für LLHR, Fu et al., 2012 ybcC ausgetauscht gegen gam, red- , red-α und recA hinter Arabinose-induzierbaren Promotor
ET12567/ F-, dam-, 13::Tn9, dcm-6, Methylierungs-defizienter E. coli-Stamm MacNeil et al., 1992 pUZ8002 hsdM, hsdR, lacY1, tra+ [CmR] mit Vektor pUZ8002, pUZ8002 ist ein RK2-Derivat mit einem defekten oriT, tra-Region, [KanR] genutzt für intergenerische Konjugation ET12567/ F-, dam-, 13::Tn9, dcm-6, Methylierungs-defizienter E. coli-Stamm MacNeil et al., 1992 pUB307 hsdM, hsdR, lacY1, tra+ [CmR] mit Vektor pUB307, Flett et al., 1997 pUB307 ist ein RP1-Derivat mit einem defekten oriT, tra-Region [KanR, TetR] genutzt für intergenerische Konjugation
XL1-Blue recA1, endA1, gyrA96, effektiv transformierbar Stratagene Europe, thi-1, hsdR17, supE44, für Zwischenklonierung Amsterdam, NL relA1, lac[F', proAB, lacIq, lacZΔM15, Tn10]
27 Materialien und Methoden
Tab. 12: Verwendete Actinomyceten - Stämme
Stammbezeichnung Beschreibung Referenz
Actinokineospora bangkokensis 44EHWT isoliert unter Elefantenohrenpflanze Intra et al., 2013 in Bangkok, Thailand
Actinokineospora bangkokensis A. bangkokensis mit unterbrochenem diese Arbeit PKS11::pKCLP2 PKS-Gen thaBI aus Cluster #11 [HygroR]
S. albus J1074 Wirt für heterologe Genexpression Chater und Wilde, 1976
S. albus pTESb S. albus mit leerem pTESb-Vektor [ApraR] diese Arbeit
S. albus pTESb_pokM123 S. albus mit pTESb_pokM123 [ApraR] diese Arbeit
S. albus pTESb_aviNM S. albus mit pTESb_aviNM [ApraR] diese Arbeit
S. diastatochromogenes Tü6028 Wildtyp – Polyketomycinproduzent Paululat et al., 1999
S. diastatochromogenes S. diastatochromogenes diese Arbeit foxBII::pKC1132 mit unterbrochenem foxBII [ApraR]
S. diastatochromogenes ΔpokOIV deletierte pokOIV Monooxygenase der Peintner, 2008 Polyketomycin-Biosynthese
S. diastatochromogenes ΔpokOIV S. diastatochromogenes ΔpokOIV diese Arbeit foxBII::pKC1132 mit unterbrochenem foxBII [ApraR]
S. diastatochromogenes ΔpokOIV S. diastatochromogenes ΔpokOIV Zambolin, 2015 foxA::pKC1132 mit unterbrochenem foxA [ApraR]
S. diastatochromogenes mit deletiertem diese Arbeit S. diastatochromogenes ΔpokMs pokM1,M2,M3,MT1 der Polyketomycin- Biosynthese [SpecR]
S. diastatochromogenes ΔpokMs S. diastatochromogenes ΔpokMs diese Arbeit pUWL_pokS34U12 mit pUWL_pokS34U12 [SpecR, ThioR]
S. diastatochromogenes ΔpokMs S. diastatochromogenes ΔpokMs diese Arbeit pUWL_pokS34U12 pTESb mit pUWL_pokS34U12 und leerem pTESb [SpecR, ThioR, ApraR]
S. diastatochromogenes ΔpokMs diese Arbeit S. diastatochromogenes ΔpokMs mit pUWL_pokS34U12 und pUWL_pokS34U12 pTESb_pokM123 pTESb_pokM123 zur Komplementierung [SpecR, ThioR, ApraR]
S. diastatochromogenes ΔpokMs diese Arbeit S. diastatochromogenes ΔpokMs mit pUWL_pokS34U12 und pUWL_pokS34U12 pTESb_aviNM pTESb_aviNM zur kombinatorischen Biosynthese [SpecR, ThioR, ApraR]
S. diastatochromogenes Tü6028 S. diastatochromogenes mit leerem pTESb diese Arbeit pTESb [ApraR]
S. diastatochromogenes Tü6028 S. diastatochromogenes mit diese Arbeit pTESb_pokM123 pTESb_pokM123, [ApraR]
S. viridochromogenes Tü57 Wildtyp – Avilamycinproduzent Hütter, 1962
28 Materialien und Methoden
Fortsetzung Tab. 12: Verwendete Actinomyceten – Stämme
Stammbezeichnung Beschreibung Referenz
S. viridochromogenes mit deletiertem diese Arbeit S. viridochromogenes ∆aviNM aviN und aviM der Avilamycin- Biosynthese [SpecR]
S. viridochromogenes ∆aviNM S. viridochromogenes ∆aviNM diese Arbeit pTESb mit leerem pTESb [SpecR, ApraR]
S. viridochromogenes ∆aviNM S. viridochromogenes ∆aviNM diese Arbeit pTESb_aviNM mit pTESb_aviNM zur Komplemtierung [SpecR, ApraR]
S. viridochromogenes ∆aviNM S. viridochromogenes ∆aviNM mit diese Arbeit pTESb_pokM123 pTESb_pokM123 zur kombinatorischen Biosynthese [SpecR, ApraR]
S. viridochromogenes Tü57 S. viridochromogenes mit leerem pTESb diese Arbeit pTESb [ApraR]
S. viridochromogenes Tü57 S. viridochromogenes mit pTESb_aviNM diese Arbeit pTESb_aviNM [ApraR]
Tab. 13: Bakterienstämme für Antibiotikum-Diffusionstest
Stammbezeichnung Beschreibung Referenz
Bacillus subtilis Gram-positiver Teststamm COHN ATCC6051 E. coli XL1-Blue Gram-negativer Teststamm Stratagen Mycobacterium smegmatis mc2155 dicke Zellwand Saccharothrix espanaensis Actinomycet Streptomyces albus Actinomycet Chater und Wilde, 1976 Synechococcus sp. Cyanobakterium PCC7002 Synechocystis sp. Cyanobakterium PCC6803
II.1.6 Hefe- und Pilzstämme
Tab. 14: Verwendete Hefen und Pilze
Stammbezeichnung Beschreibung Referenz
Candida parapsilosis DSM 5784 Pilz Fusarium verticillioides DSM 62264 Pilz Saccharomyces cerevisiae VL6-48N Hefestamm für TAR Kouprina et al., 1999 MATα, trp1-Δ1, ura3-Δ1, ade2-101, his3-Δβ00, lys2, met14, cir
29 Materialien und Methoden
II.1.7 Plasmide, Cosmide und YAC
Die in dieser Arbeit verwendeten Plasmide, Cosmide und YAC, sowie selbst klonierte Konstrukte, sind im Folgenden aufgelistet.
Tab. 15: Verwendete Plasmide
Plasmid Größe Beschreibung Referenz pBSK- 3,0 kb High Copy Vektor zur Zwischenklonierung von PCR- Agilent Technologies, Produkten zur Amplifikation und Erhalt bestimmter Santa Clara, USA Schnittstellen, Blau-Weiß-Screening, lacZα, größere (früher: Stratagene) MCS als pUC19, blunt end-Klonierung über EcoRV oder SmaI, [AmpR] pCRISPR-Cas9 11,3 kb Vektor zur gezielten Deletion von Genen in Strepto- Tong et al., 2015 myces, cas9 Endonuklease, sgRNA Kernsequenz hinter
Thiostrepton-ind. Promotor, oriE.coli, Temperatur-sensitiver R R oriStreptomyces, [Apra , Thio ] pET28a(+) 5,4 kb Expressionsvektor mit N- und C-terminalen His6-Tag Novagen Thrombinschnittstelle (N-terminal), T7-Expressionssystem, [KanR] pKC1132 3,4 kb pMB1-origin, oriT RK2, lacZ'α, Shuttlevektor, Bierman et al., 1992 Integrationsvektor in Strepomyceten, [ApraR] pKCLP2_gusA 5,9 kb pMB1-origin, oriT RK2, lacZ'α, gusA, Shuttlevektor, Petzke, 2010 Integrationsvektor in Strepomyceten, abgeleitet von pKC1132, [HygroR] pUC19 2,7 kb High Copy Vektor zur Zwischenklonierung von PCR- Yanisch-Perron et al., 1985 Produkten zur Amplifikation und Erhalt bestimmter Schnittstellen, Blau-Weiß-Screening, lacZα, blunt end- Klonierung über SmaI, [AmpR] pUWL-T 7,4 kb replikativer Shuttlevektor von E. coli in Streptomyces Doumith et al., 2000 R R oriT, oriE.coli, oriStrepto, ermE-Promotor, [Amp , Thio ] Luzhetskyy et al., 2005 pTESb 6,5 kb integratives Plasmid für Expression in Streptomyces Siegl, 2013 Bakteriophage ФC31 int und attP, ermEp* Promoter, mit künstl. RBS, [ApraR]
Tab. 16: Verwendete Cosmide
Cosmid Beschreibung Referenz
CB30-6D20 Cosmidvektor mit einem Genomfragment des Polyketomycin- Daum et al., 2009 Produzenten S. diastatochromogenes Tü6028, Teil des Polyketo- Combinature AG mycinbiosynthesegencluster (pokS5-pokS9)
P2 Cosmidvektor mit einem Genomfragment des Avilamycin- Weitnauer et al., 2001 produzenten S. viridochromogenes Tü57, Teil des Avilamycin- biosynthesegencluster pOJ436 integrativer Cosmidvektor, oriE.coli, oriT, Bierman et al., 1992 Bakteriophage int und attP, 9,6 kb, ApraR
30 Materialien und Methoden
Tab. 17: Verwendetes Yeast-Artificial Chromosom
Cosmid Größe Beschreibung Referenz pCAP01 9,0 kb Shuttle-Vektor E. coli/Hefe/Streptomyces Yamanaka et al., 2014 E. coli-Elemente: pBR origin, KanR; Hefe-Elemente: cen6_ars4, trp1; Streptomyces-Elemente: oriT, Bakteriophage ФCγ1 int und attP, [KanR]
Tab. 18: In dieser Arbeit erstellte Plasmide und Vektoren
Konstrukt Größe Beschreibung Kapitel pKCLP2_gusA_PKS11 9,0 kb Singlecross-Vektor zur Unterbrechung des PKS-Gens thaBI II.2.4.9.1 im Cluster 11 von Actinokineospora bangkokensis mit homologem, internen 3 kb - Fragment, [HygroR] pKC1132_DC_pokMs 8,1 kb Deletionsvektor für die Gene pokM1-M3 und pokMT1 in S. diastato- II.2.4.9.2 chromogenes Tü6028, 1 kb homologe Fragmente, upstream und downstream, wurden in den Vektor pKC1132 kloniert, dazwischen eine SpecR, [ApraR, SpecR] pKC1132_DC_aviNM 8,6 kb Deletionsvektor für Gene aviN und aviM in S. viridochromogenes II.2.4.9.3 Tü57, 1 kb homologe Fragmente, upstream und downstream, wurden in den Vektor pKC1132 kloniert, dazwischen eine SpecR, [ApraR, SpecR] pTESb_pokM123 14,4 kb Komplementierungsvektor; die Gene pokM1-3 wurden hinter den II.2.4.9.4 starken ermE-Promotor kloniert, integrativ, [ApraR] pTESb_aviNM 11,5 kb Komplementierungsvektor; die Gene aviNM wurden hinter den II.2.4.9.5 starken ermE-Promotor kloniert, integrativ, [ApraR] pUWL_pokS34U12 11,5 kb Komplementierungsvektor; die Gene pokS3, pokS4, pokU1 und II.2.4.9.6 pokU2 wurden hinter den starken ermE-Promotor in pUWL-T kloniert, replikativ, [ThioR] pKC1132_SC_foxBII 5,4 kb Singlecross-Vektor zur Unterbrechung des PKS-Gens foxBII im II.2.4.9.7 fox-Cluster von S. diastatochromogenes Tü6028 mit homologem, internen 2 kb - Fragment, [ApraR] pKC1132_SC_foxA 4,3 kb Singlecross-Vektor zur Unterbrechung des PKS-Gens foxA im II.2.4.9.8 fox-Cluster von S. diastatochromogenes Tü6028 mit homologem, internen 1 kb - Fragment, [ApraR] pCRISPR-foxBI 13,4 kb CRISPR-Vektor für die Deletion von foxBI in S. diastatochromogenes 0 Tü6028, 1 kb homologe Fragmente, upstream und downstream, wurden in den Vektor pCRISPR-Cas9 kloniert, zusätzlich homologer sgRNA-Bereich, [ApraR, ThioR] pCRISPR-foxEI 13,4 kb CRISPR-Vektor für die Deletion von foxEI in S. diastatochromogenes II.2.4.9.10 Tü6028, 1 kb homologe Fragmente, upstream und downstream, wurden in den Vektor pCRISPR-Cas9 kloniert, zusätzlich homologer sgRNA-Bereich, [ApraR, ThioR] pCRISPR-foxEII 13,5 kb CRISPR-Vektor für die Deletion von foxEII in S. diastatochromogenes II.2.4.9.11 Tü6028, 1 kb homologe Fragmente, upstream und downstream, wurden in den Vektor pCRISPR-Cas9 kloniert, zusätzlich homologer sgRNA-Bereich, [ApraR, ThioR]
31 Materialien und Methoden pOJ436_Up_Down_fox 12,9 kb pOJ436-Cosmidbackbone mit je 1 kb homologen Fragmenten, II.2.4.9.12 upstream und downstream des fox-Genclusters, [ApraR] pCAP01_Up_Down_fox 12,4 kb pCAP01-Backbone mit je 1 kb homologen Fragmenten, upstream II.2.4.9.13 und downstream des fox-Genclusters, [ApraR] pET28a_foxBI 7,3 kb Expressionsvektor für die heterologe Produktion der A-Domäne II.2.4.9.14
FoxBI in E. coli, N-terminaler His6-Tag, T7-Expressionssystem, [KanR]
II.1.8 Synthetisierte Oligonukleotide
Die in dieser Arbeit verwendeten Primer wurden von der Firma Eurofins Genomics GmbH, Ebersberg, synthetisiert und sind im Folgenden aufgeführt.
Tab. 19: In dieser Arbeit synthetisierte Oligonukleotide
Primer Schnittstelle DNA-Sequenz (mit integrierter Schnittstelle) Verwendung
Lac-for CACAGGAAACAGCTATGAC Lac-Primer zur Kontrollsequenzierung Lac-rev GCGATTAAGTTGGGTAACG
PKS11' for PstI TTATACTGCAGACCGAGGACGAGGTCATC Single-Crossover von thaBI PKS11' rev ATCGGGAGAACTAGACGAACAG
Gap_11_for TGCCGCTGATGCCCGTCGAG Lückenschluss PKS-Cluster 11 Gap_11_rev GGTGGCGCCGGTGAGCATGTAG
5' Up-pokM HindIII GGTAAGCTTGTGACGCGCAGCGTGTAGAC Upstreamfragment für Doppel- 3' Up-pokM PstI GTTCTGCAGTCGGCAAGCCCGACAAGAAG crossover pokMs-Gene
5' Down-pokM PstI GTTCTGCAGCCGTCGCAAGGGCCTCTAGC Downstreamfragment für Doppel- 3' Down-pokM EcoRI CACGAATTCAACGGCCGGTACGCGAGAGC crossover pokMs-Gene
R 5' Spec SmaI GTTCCCGGGTGCCGTTGATCGTGCTATG Spec -Kassette für Austausch 3' Spec GCTAGCTACGTACTGCAGATAAC bei pokMs-Doppelcrossover
Up-aviNM-for CGAGCACCTGGACTACTACG Upstreamfragment für Doppel- Up-aviNM-rev GCGCACGGATCTGCATTC crossover aviNM-Gene
Down-aviNM-for CGCACTGACTCCGTAACTC Downstreamfragment für Doppel- Down-aviNM-rev AGGGCGTCCAGCAGTTGTTG crossover aviNM-Gene
R Spec-for BamHI ATAGGATCCACGGCCAGTGAATTCG Spec -Kassette für Austausch Spec-rev TATGCTTCCGGCTCGTATG bei aviNM-Doppelcrossover
DMSA-Komp-for TCACAGTGTGCGCTCGGTGGTC pokM1,2,3 zur Komplementierung DMSA-Komp-rev GTCCATGGCCAGCGGCACCATC /kombinatorischen Biosynthese
AviNM-for GTGGGTTGGTGCAGATAG aviNM zur Komplementierung
AviNM-rev SpeI GCACTAGTCCCTGCTGACATGAGTTAC /kombinatorischen Biosynthese
S34U12-for TCTGCTGGACGGGACGAG Fragment mit pokS3,S4,U1,U2 S34U12-rev GCCGGGACCGTGTCATTC
32 Materialien und Methoden
Fortsetzung Tab. 19: Synthetisierte Oligonukleotide
Primer Schnittstelle DNA-Sequenz (mit integrierter Schnittstelle) Verwendung
5' foxA' CCGTGTTACGCCAACCCGTTCC Single-Crossover von foxA 3' foxA' ATGCGCCAGGACCGTGTTGC
5' foxBII' HindIII GCCGGGAAGCTTGTCCTCTTCGCCTC Single-Crossover von foxBII 3' foxBII' BamHI GTCGTCGGATCCTGCGCCGCCTCGG sgRNA-rev SnaBI ACGCCTACGTAAAAAAAGCACCGACTC reverse Primer sgRNA GGTGCC (Tong et al., 2015) sgRNA-foxBI NcoI CATGCCATGGGCGGATCATCACGGAGC sgRNA mit Kernsequenz für GGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC Deletion foxBI sgRNA-foxEI NcoI CATGCCATGGGCACAACTCAGCATGGG sgRNA mit Kernsequenz für GCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC Deletion foxEI sgRNA-foxEII NcoI CATGCCATGGGGTCTTCGTGCACGGCT sgRNA mit Kernsequenz für GGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC Deletion foxEII
Up-foxBI-forCRISPR ATCTGAAGGCCATGGACGACGAG Upstreamfragment foxBI für
Up-foxBI-revCRISPR GGAATCGGGACCGGGTGACG Deletion durch CRISPR-Cas9
Down-foxBI-forCRISPR TGACGTGGTGGGCCCGAGG Downstreamfragment foxBI für
Down-foxBI-revCRISPREcoRV GATATCCGTCGAGCAGGCCCAGTTGG Deletion durch CRISPR-Cas9
Up-foxEI-forCRISPR ATATCCTTCCGGCACCTGAACGC Upstreamfragment foxEI für
Up-foxEI-revCRISPR GAGCCGGTCGTCCTGAAG Deletion durch CRISPR-Cas9
Down-foxEI-forCRISPR CTACCGTACTCGCCAGTAACC Downstreamfragment foxEI für
Down-foxEI-revCRISPREcoRV ATGATATCGAATCGCCGTGGAACTGAC Deletion durch CRISPR-Cas9
Up-foxEII-for ATATCGCCGTCGAGGAGATCCC Upstreamfragment foxEII für Up-foxEII-rev GGAGTGAGGTCCGGTTACTG Deletion durch CRISPR-Cas9
Down-foxEII-for TTCCCGTGACCTCCGTGTCC Downstreamfragment foxEII für
Down-foxEII-revEcoRV ATGATATCCGGCCGCTGCCCTC Deletion durch CRISPR-Cas9
Up-fox-for CGTACATCACCCAGCGGCTCACTCG Upstreamfragment fox-Cluster
Up-fox-rev SpeI AAACTAGTAGTGGGCTGAGCCCGAAACTG für heterologe Expression
Down-fox-for CGACGTTCTTCGACTTCTTG Downstreamfragment fox-Cluster
Down-fox-rev XbaI ATCTAGACGGTGTTGTAGCTCTTGTG für heterologe Expression foxBI-for NdeI AACATATGATCCGAACAGGTGAG Fragment mit foxBI für heterologe foxBI-rev AGGTGTCCTCGTGAACTCGG Expression in E. coli
33 Materialien und Methoden
II.1.9 Nährmedien
Alle Nährmedien werden (falls nicht anders angegeben) mit H2Odest. angesetzt und 20 min bei 121 °C und 2 bar autoklaviert. Zur Herstellung von Agar-Platten wird 2 % Agar-Agar vor dem Autoklavieren dem Medium zugegeben. Nach Abkühlen der autoklavierten Medien (auf ca. 40 °C) kann Antibiotika zugesetzt werden. Flüssigmedien werden bei RT gelagert, Agarplatten bei 2 °C bis 8 °C.
Tab. 20: Nährmedien für E. coli und Actinomyceten
Medium Bestandteile Menge pro 1 L H20 Referenz
HA-Medium Malzextrakt 10 g (Hefe-Malz-Medium) Hefeextrakt 4 g (Produktionsmedium für Glukose 4 g Actinomyceten) pH 7,2
LB-Medium Trypton 10 g modifiziert nach (Luria-Broth Medium) Hefeextrakt 5 g Sambrook und Russell, 2001 NaCl 5 g
MS-Medium Mannitol 20 g modifiziert nach (Medium für Konjugation und Sojamehl 20 g Wang und Jin, 2014
Sporulation von Actinomyceten) MgCl2 bzw. CaCl2 10 mM
NL5-Medium NaCl 1 g
K2HPO4 1 g MgSO4 0,5 g Spurenelemente 2 mL Glycerin 25 g L-Glutamin 5,84 g
SG-Medium Glucose 15 g modifiziert nach Günther, 2010 (Produktionsmedium für Lactose 5 g S. viridochromogenes Tü57) Sojamehl 10 g
CaCO3 2 g L-Valin 2,34 g NaCl 90 mM
CoCl2 1 mg
TSB-Medium TSB-Pulver 30 g BactoTM Tryptic Soy Broth (Kultivierung von Actinomyceten) Soybean-Casein Digest Medium, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg
ZYM-5052-Medium Trypton/Pepton aus Casein 10g Studier, 2005 (Autoinduktionsmedium Hefe-Extrakt 5 g für heterologe Expression Na2HPO4 25 mM in E. coli) KH2PO4 25 mM NH4Cl 50 mM Na2SO4 5 mM MgSO4 2 mM Spurenelemente 2 mL Glycerin 5 g Glucose 0,5 g Lactose 2 g pH 7,4
34 Materialien und Methoden
Tab. 21: Weitere Nährmedien
Medium Bestandteile Menge pro l H20 Referenz
BG11-Medium NaNO3 1,5 g Stanier et al., 1971 (Kultivierung von Cyanobakterien) K2HPO4 0,04 g MgSO4 x 7H2O 0,075 g CaCl2 x 2H2O 0,036 g Zitronensäure 0,006 g Ammoniumeisen(III)-citrat 0,006 g EDTA 0,001 g
Na2CO3 0,02 g Spurenelemente 1 mL
MS(A)-Medium Murashige-Skoog-Medium 4,33 g Murashige und Skoog, 1962 (Kultivierung von Arabidopsis) Saccharose 10 g MES/KOH pH 5,7 0,5 g Phytagel 4 g B5 Vitamine
PDA-Medium Kartoffeldextrose 26,5 g (Kultivierung von Fusarium)
Hefe(-Leu)-Medium Sorbitol 1 M
(Kultivierung von Saccharo- (NH4)2SO4 10 g myces cerevisiae mit pCAP) Leucin 780 mg
in 900 mL H2O lösen, bei Platten Zugabe von 3 % Agar
Nach Autoklavieren mischen mit: Glucose 20 g Difco Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren 13,6 g Aminosäure-Mix -Leu/-Trp 3 g in 100 mL lösen, steril-filtrieren
Middlebrook 7H9 Broth 7H9 broth base 5,2 g (Kultivierung von Mycobacterium) Glycerol 40 % 0,2 mL
SORB(-Leu)-Medium Hefe(-Leu)-Medium 1 L (Regenerierung von Spheroplasten) Sorbitol 180 g
TOP-Agar-Leu Hefe(-Leu)-Medium 1 L (Top-Agar Spheroplasten) Sorbitol 180 g Agar 1,5 %
YPD-Medium Hefeextrakt 10 g (Kultivierung von Hefen) Bacto-Peptone 20 g Glucose 20 g
35 Materialien und Methoden
II.1.10 Puffer und Lösungen
Im Folgenden sind Puffer und Lösungen nach Anwendung aufgelistet. Puffer werden, soweit nicht anderes angegeben, autoklaviert. Anschließend werden Enzyme dazu gegeben und bei 8 °C gelagert. Kleine Mengen werden steril-filtriert.
Tab. 22: Puffer und Lösungen und ihre Bestandteile
Anwendung Puffer Bestandteil Menge pro l H20bidest.
Lagerung von Dauerkulturen Glycerin-Lösung Glycerin 30 %
Saccharose-Lösung Saccharose 25 %
Lösungen für PCR dNTPs-Mischung dATP, dTTP, dGTP, dCTP je 10 mM
Pfu-Puffer Tris/HCl (pH 8,8) 200 mM KCl 100 mM
(NH4)2SO4 100 mM MgSO4 20 mM Triton X-100 1 % BSA 0,1 %
Taq-Puffer Tris/HCl (pH 9,0) 100 mM KCl 500 mM
MgCl2 15 mM Triton X-100 1 %
Auftrennung von DNA- DNA-Probenpuffer Bromphenolblau 0,25 % Fragmenten durch Gel- (Probenbande bei ~ 1 kb) Saccharose 40 % Elektrophorese pH 7,6 - in TE-Puffer
DNA-Probenpuffer Xylenblau 0,25 % (Probenbande bei ~ 8 kb) Saccharose 40 % pH 7,6 - in TE-Puffer
Ethidumbromid-Lösung Ethidiumbromid 0,001 %
GelRed-Lösung GelRed 0,03 %
Methylenblau-Lösung Methylenblau 0,02 %
TAE-Puffer Tris/HCl (pH 7,8) 40 mM Natriumacetat 10 mM EDTA 1 mM
Lösen und Langzeitlagerung TE-Puffer Tris/HCl (pH 7,8) 10 mM von DNA-Molekülen EDTA 1 mM
Lösungen für IPTG (pro Platte 25 µL) 1 M Blau-Weiß-Screening X-Gal (pro Platte 25 µL) 100 mg / mL
Mini-DNA-Präparation Puffer P1 Tris/HCl (pH 8,0) 25 mM aus E. coli EDTA 10 mM RNaseA (Zugabe nach Autoklavieren) 100 µg/mL Lagerung bei 4 °C
Puffer P2 NaOH 0,2 M SDS 1 %
36 Materialien und Methoden
Fortsetzung Tab. 22: Puffer und Lösungen und ihre Bestandteile
Anwendung Puffer Bestandteil Menge pro l H20bidest.
Puffer P3 Kaliumacetat 3 M pH 4,8
Isolierung genomischer DNA SET-Puffer Tris/HCl (pH 8,0) 20 mM aus Actinomyceten NaCl 75 mM EDTA 25 mM
Lysozym-Lösung Lysozym in SET-Puffer 5 % Lagerung bei -20 °C
Proteinase K-Lösung Proteinase K in SET-Puffer 2 % Lagerung bei -20 °C
RNase-Lösung RNase A 1 µg / mL Lagerung bei -20 °C
NaOAc NaOAc 5 M
SDS-Lösung SDS 10 %
Isolierung YAC aus Hefe EDTA-Mix EDTA 10 mM
KAc-Lösung KAc 2 M
Herstellung CaCl2-komp. CaCl2-Lösung CaCl2 50 mM E. coli - Zellen
Lösungen für TAR Sorbitol-Lösung Sorbitol 1 M
SPE-Puffer Sorbitol 1 M EDTA 1 mM Tris/HCl (pH 7,5) 10 mM
STC-Lösung Sorbitol 1 M Tris/HCl (pH 7,5) 10 mM
CaCl2 10 mM
PEG-Lösung PEG8000 20 % Tris/HCl (pH 7,5) 10 mM
CaCl2 10 mM
SOS-Lösung Sorbitol 1 M YPD-Medium 0,3 x
CaCl2 10 mM
Aufreinigung von Lysepuffer Tris/HCl (pH 7,8) 50 mM His-tag Fusionsproteinen NaCl 500 mM mittels Ni-NTA-Säule Glyerin 20 %
Waschpuffer Tris/HCl (pH 7,8) 50 mM NaCl 500 mM Imidazol 20 mM
Elutionspuffer Tris/HCl (pH 7,8) 50 mM NaCl 500 mM Imidazol 300 mM
Aufreiningung von Puffer A Tris/HCl (pH 7,8) 50 mM His-tag Fusionsproteinen NaCl 300 mM mit ÄKTA-FPLC Imidazol 10 mM
37 Materialien und Methoden
Fortsetzung Tab. 22: Puffer und Lösungen und ihre Bestandteile
Anwendung Puffer Bestandteil Menge pro l H20bidest.
Puffer B Tris/HCl (pH 7,8) 50 mM NaCl 300 mM Imidazol 250 mM
Stripping-Puffer Sodiumphosphat 20 mM NaCl 500 mM EDTA 50 mM pH 7,4
Lösungen für SDS-PAGE 10 x Laufpuffer Tris/HCl (pH 8,6) 0,25 M von Proteinen Glycin 1,92 M SDS 1 %
2 x Loading-Puffer Tris/HCl 0,125 M SDS 4 % Glycerin 20 % EDTA 2 mM Bromphenolblau 0,02 % DTT (frisch dazugeben) 3 %
Trenngel (12%) (50 ml) H20 16,5 mL 30 % Acrylamidmix 20,0 mL 1,5 M Tris/HCl (pH 8,8) 12,5 mL 10 % SDS 0,5 mL 10 % Ammoniumpersulfat 0,5 mL TEMED 0,02 mL
Sammelgel (5%) (16 ml) H20 11 mL 30 % Acrylamidmix 2,6 mL 0,5 M Tris/HCl (pH 6,8) 2 mL 10 % SDS 0,16 mL 10 % Ammoniumpersulfat 0,16 mL TEMED 0,016 mL
Coomassieblau-Färbung Brilliant Blue R 3,04 g Essigsäure 10 % Ethanol 70 %
Entfärbelösung Ethanol 10 % Essigsäure 20 %
NADH/NAD+ in vitro assay Assay Puffer Tris/HCl (pH 7,4) 100 mM
MgCl2 1 mM EDTA 0,1 mM
Detektionslösung D-Fructose-6P 3 mM in Assay Puffer lösen Fructose-6P-Kinase 0,1 U/mL Aldolase 1 U/mL Triose-P-Isomerase 5 U/mL Glycerophosphat-Dehydrogenase 5 U/mL NADH 0,5 mM
Atmungskettentest Puffer 1 MES/NaOH pH 6,0 50 mM PMSF 0,1 mM DNase I
Puffer 2 MES/NaOH pH 6,0 50 mM NaCl 50 mM
MgCl2 5 mM
38 Materialien und Methoden
Fortsetzung Tab. 22: Puffer und Lösungen und ihre Bestandteile
Anwendung Puffer Bestandteil Menge pro l H20bidest.
Spurenelemente-Lösung 20x Lösung (auf 50 mL) MgSO4 100 mg ZnSO4x7H2O 100 mg FeSO4x7H2O 100 mg MnCl2x4H2O 100 mg CaCl2x6H2O 100 mg NaCl 100 mg
CuCl2x2H2O 20 mg B(OH)3 20 mg Na2MoO4 10 mg CoCl2 10 mg Na3-Citrat-2H2O 110 mg
II.1.11 Verbrauchsmaterialien
Tab. 23: Verbrauchsmaterialien und deren Bezugsquelle
Verbrauchsmaterial Bezugsquelle
Bördelkappe: 11 mm für HPLC-MS Lab Logistics Group GmbH, Meckenheim
DC-Fertigplatte ADAMANT UV254 Macherey-Nagel GmbH + Co. KG, Düren Elektroporationsküvette: mit 0,1 cm gap Biozym Scientific GmbH, Oldendorf Filter: Chromafil PVDF-45/15MS Macherey-Nagel GmbH + Co. KG, Düren Rotilabo® Spritzenfilter, 0,22 m Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Insert für Vial: mit 9 mm (0,15 mL) Lab Logistics Group GmbH, Meckenheim Konzentrator: Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorius AG, Göttingen Küvette: Rotilabo® Einmal-Küvetten Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Pasteurpipette: 230 mm Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Petrischalen: Rotilabo® Petrischalen, Ø 90 mm, Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Reaktionsgefäße: Rotilabo® Safe Lock Gefäße™ 0,2 mL Simport® Scientific, Beloeil, Kanada PCR Plastics Nippon Genetics Europe GmbH, Düren Eppendorfgefäße 1,5 mL und 2,0 mL Eppendorf AG, Hamburg; Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Falcon 15 mL und 50 mL Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Pipettenspitzen Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe
II.1.12 Geräte
Tab. 24: Geräte und deren Bezugsquelle
Gerät Bezugsquelle
Agarosegel-Elektrophoresekammer, Zubehör und Amersham Bioscience, Freiburg Spannungsgerät Electrophoresis Power Supply EPS301 Äkta-FPLC: Amersham Bioscience, Freiburg Mixer: M925 Valve: INV907 Pumpe: P950 Monitor: UPC-900 Fraktion Collector: Frac 900
39 Materialien und Methoden
Autoklav: Systec 5075 ELV Tuttnauer Europe B.V., Breva, NL Eismaschine: Ice Maker FM-251AFE Hoshizaki Europe B.V, Amsterdam, NL Elektroporation: E. coli Pulser™ Bio-Rad Laboratories GmbH, München French press: French® pressure cell press Thermo Spectronic, Rochester, USA Gefrierschrank: Comfort Nofrost CN 3613 (-20 °C) Liebherr, Ochsenhausen Hera freeze (-80 °C) Thermo Scientific, Waltham, USA HPLC-Anlage (präparativ): Waters Corporation, Milford, USA Probengeber: 717 plus Autosampler Säulenofen: Column Thermostat Jetstream 2 plus Pump 1 und 2: 515 HPLC Pump Detektor: 2998 Photodiode Array HPLC-MS-Anlage (1100 Series): Agilent Technologies, Waldbronn Probengeber: G1313A Säulenofen: G1316A Degaser: G1322A Quaternäre Pumpe: G1311A Detektoren: Diodenarray (DAD) G1315B Quadrupol Massendetektor (MSD) G1946D Impfbank BDK Luft- und Reinraumtechnik GmbH, Sonnenbühl Inkubationsschüttler: Multiton Infors AG, Bottmingen, Schweiz Inkubator: 28 °C Binder GmbH, Tuttlingen 37 °C Memmert, Schwallbach Lichtmikroskop: AXIO LAB A.1 Carl Zeiss, Jena Magnetrührer: MR 3002 Heidolph Instruments GmbH & Co KG, Schwabach PCR-Gerät: Mastercycler epgradient Eppendorf AG, Hamburg 2720 Thermal Cycler Applied Biosystem, Darmstadt pH-Meter: CG 842 Schott Instruments GmbH, Mainz Photometer: NanoDrop 2000 Thermo Scientific, Waltham, USA Ultrospec 2100 pro Amersham Bioscience, Uppsala, Schweden Pipette: 1 L, 20 L, 200 L und 1000 L Gilson, Middleton, USA Protein-Elektrophoresekammer und Zubehör Bio-Rad Laboratories GmbH, München Reinstwassersystem: TKA GenPure mit Dispenser; Thermo Scientific, Waltham, USA Rotationsverdampfer: Laborota 4000 Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach Waterbath B-480 Büchi Labortechnik GmbH, Essen SDS-Kammer Mini PROTEAN® Tetra System Bio-Rad Laboratories, Inc., Kalifornien, USA Thermomixer compact Eppendorf AG, Hamburg Tischschüttler: Rotamax 120 Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach Tecan Reader Infinite® 200 Pro Tecan Group Ltd., Männedorf, Schweiz Trockenschrank: 65 °C Binder GmbH, Tuttlingen Vacuum-Concentrator: BA-VC300H H. Saur Laborbedarf, Reutlingen Ultraschall-Homogenisator Sonopuls BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin UV-Transilluminator: Image Master VDS Amersham Pharmacia, Oldendorf
40 Materialien und Methoden
Vortexer: Reax top Heidolph Instruments GmbH + Co. KG, Schwabach Waagen: PK 4801 Denver Instrument GmbH, Göttingen A210P Sartorius AG, Göttingen Wasserbad Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach Zentrifuge: 5417R, 5414R und 5418 Eppendorf AG, Hamburg (für 1,5 und 2 mL Eppendorfgefäße) Avanti J-20 XP mit JA10 und JA25.50 Beckman Coulter, Krefeld (für 50 mL Gefäße bzw. 500 mL Becher) Rotina 35 R und Rotina 380 R Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen (für 15 und 50 mL Gefäße)
II.1.13 Säulen
Tab. 25: Verwendete Säulen und deren Bezugsquelle
Säule Verwendung Quelle
Eclipse XDB-C8 Hauptsäule: 4,6 x 150 mm Agilent Technologies, Santa Clara, USA Partikelgröße: 5 µm mit Vorsäue HisTrap™ FF 5 mL Säule für ÄKTA-FPLC GE Healthcare GmbH, Solingen Oasis HLB 35cc LP SPE-Säule Waters GmbH, Eschborn Sephadex™ LHβ0 Säulenmaterial SephadexTM LH20 GE Healthcare GmbH, Solingen VivaSpin 20 Auskonzentrierung Proteine Sartorius AG, Göttingen XBridge® C18 Hauptsäule: 4,6 x 200 mm Agilent Technologies, Santa Clara, USA Partikelgröße: 3,5 µm mit Vorsäule Zorbax SB-C18 Vorsäule: 9,4 x 20 mm; Agilent Technologies, Santa Clara, USA Partikelgröße 5 m Hauptsäule: 9,4 x 150 mm; Partikelgröße 5 m
41 Materialien und Methoden
II.1.14 Computerprogramme und Internetdienste
Tab. 26: Computerprogramme
Computerprogramm Verwendung Bezugsquelle/Quelle
Accelrys Draw 4.1 Malen von chemischen Strukturen Accelrys. Inc Kalkulation Molekülmasse
ChemStation Steuerung Agilent HPLC Agilent Technologies, Santa Clara, USA Rev.B.04.03 Clone Manager 7 Analyse von DNA und Peptiden Scientific & Educational Software Primerdesign, Simulation Klonierung, Herstellung graphischer Vektor-Karten CIRCOS, R-circlize Darstellung vergleichender Genome Krzywinski et al., 2009, Gu et al., 2014 Empower® 3 Steuerung Waters HPLC Waters Corporation, USA GOLD 5.2 Docking von Molekülen CCDC, Cambridge, UK Jalview 2.9.0b2 Alignment von Sequenzen, Waterhouse et al., 2009 Phylogenetischer Baum Mendeley 1.16 Verwalten von Literatur Mendeley Ltd. Microsoft Office Word, Excel, PowerPoint Microsoft Office UNICORN 4.11 Steuerung ÄKTA FPLC Amersham Bioscience
Tab. 27: Internetdienste
Internetdienst Verwendung Quelle antiSMASH Identifizierung, Annotierung und Analyse http://antismash.secondarymetabolites.org/ antibiotics & Secondary von Sekundärmetabolitgencluster (Weber et al., 2015) Metabolite Analysis Shell Blast Datenbankrecherche nach Sequenzhomologien http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Basic Local Alignment auf Nukleotid- oder Aminosäurenebene (Altschul et al., 1990) Search Tool CHOPCHOP v2 Design von sgRNA http://chopchop.cbu.uib.no/ (Labun et al., 2016) Clustal Omega Multiple Sequenz-Alignment http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalo/ (Sievers et al., 2011) ExPASy Datenbank mit verschiedenen Programmen https://www.expasy.org/ Expert Protein Analysis für Protein-Analyse System Galaxy Datenbank mit vielen Programmen für Daten- http://galaxy.uni-freiburg.de/root Analyse (Afgan et al., 2016) MIBiG Datenbank Sekundärmetabolitgencluster http://mibig.secondarymetabolites.org/ Minimum Information (Medema et al., 2015) about a Biosynthetic Gene Cluster Prokaryotic Genome Annotation von DNA-Sequenzen und ganzen https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/ Annotation Pipeline Genomen annotation_prok/ (Tatusova et al., 2016) Pubmed Datenbank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed Rast Annotation von DNA-Sequenzen und ganzen http://rast.nmpdr.org/ Rapid Annotation using Genomen (Aziz et al., 2008) Subsystem Technology
42 Materialien und Methoden
II.2 Methoden II.2.1 Kultivierung von Bakterien- / und Pilzstämmen
Eine Übersicht der in dieser Arbeit verwendeten Bakterien- und Pilzstämmen ist in Tab. 11-14 auf- gelistet.
II.2.1.1 Kultivierung und Stammhaltung von E. coli-Stämmen
Alle verwendeten E. coli - Stämme werden, soweit nicht anders angegeben, in LB-Medium bei 37 °C (gegebenenfalls unter selektiven Bedingungen mit Antibiotikum) und 180 Upm in einem Erlenmeyer- kolben auf dem Rundschüttler kultiviert. Kleine Kulturmengen können in Reagenzgläsern oder in 2 mL Reagenzgefäßen angezogen werden. Die Trennung von Bakterienzellen vom Kulturüberstand erfolgt durch Zentrifugation für 10-15 min bei 5000 Upm und 4 °C.
E. coli XL1-Blue wird als allgemeiner Klonierungsstamm verwendet und E. coli ET12567 zur Über- tragung von Plasmid-DNA in Actinomyceten durch Konjugation. Zur heterologen Überproduktion von Proteinen wird E. coli BL21 (DE3) StarTM benutzt (siehe Tab. 11).
Transformierte E. coli - Stämme werden auf Antibiotika-haltigen LB-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Anschließend können die Platten für einige Tage bei 4 °C gelagert werden. Für die langfristige Sicherung werden von den E. coli - Stämmen 1,5 mL einer Übernachtkultur für 1 min bei 12000 Upm abzentrifugiert, der Überstand verworfen, die Zellen in 300-600 mL 70 %igem Glycerin resuspendiert und bei -20 °C oder -80 °C gelagert.
Die Kontrolle auf Reinheit erfolgt durch Verdünnungsausstriche und durch Mikroskopieren.
Über die Messung der optischen Dichte (OD) bei 578 nm kann das Wachstum von E. coli verfolgt 8 werden, wobei eine OD578nm = 0,5 in etwa 5 x 10 Zellen pro mL Kultur entspricht. Dazu wird frisches
Medium mit einer Übernachtkultur 1:100 angeimpft. Die optische Dichte OD578nm des frischen Mediums dient als Referenz und wird auf "0" gesetzt. Die neu angesetzte Bakterienkultur wird unter bestimmten Bedingungen inkubiert. In regelmäßigen Zeitabständen wird der Kultur 1 mL entnommen und diese zur Bestimmung der OD578nm-Messung verwendet. Bei Erreichen der gewünschten OD wird mit den Zellen nach Protokoll weiter vorgegangen.
II.2.1.2 Kultivierung, Stammhaltung und Sporenisolation von Actinomyceten-Stämmen Alle verwendeten Bakterienstämme von Streptomyces diastatochromogenes Tü6028, S. albus und Actinokineospora bangkokensis sowie deren abgeleiteten Mutanten (siehe Tab. 12) werden für 3-5 Tage bei 28 °C und 180 Upm in entsprechendem Medium (gegebenenfalls unter selektiven Bedingungen) kultiviert. Streptomyces viridochromogenes Tü57 und dessen Mutanten werden bei 37 °C für 1-2 Tage kultiviert.
43 Materialien und Methoden
Zur Isolierung genomischer DNA oder zur Vorkulturnahme wird gewöhnlich TSB-Medium verwendet. Aufgrund des Sauerstoffbedürfnisses und des kompakten Wachstums der Actinomyceten werden Erlenmeyerkolben mit Schikane und Metallspirale benutzt. Das entsprechende Wachstums- medium wird mit 10-50 µL Sporensuspension oder 0,5-5 mL einer Glycerinkultur beimpft. Zur Sicherung des Mycels wird von einer gut angewachsenen Actinomyceten-Kultur 8 mL abgenommen und mit 2 mL Glycerin versetzt oder die abzentrifugierte Kultur in 25 % Saccharoselösung bei -20 °C gelagert. Kulturen von A. bangkokensis lassen sich nicht in Saccharose lagern, stattdessen ist die Langzeitlagerung in PEG1000 (3 %), Glycerin (1 %) und Saccharose (0,65 %) bei -80 °C möglich.
Da Actinomyceten kompakt in Mycelien wachsen, ist bei ihnen die Überprüfung des Zellwachstums mittels OD-Messung nicht möglich. Hier muss über genaues Betrachten der Kultur sowie durch Mikroskopieren beurteilt werden, ob sich die Bakterien im Wachstum befinden oder schon lysieren. Bei gutem Wachstum bilden Actinomyceten in Kultur kleine Klümpchen, während das Medium klar bleibt. Unter dem Mikroskop sind viele strahlenförmige Mycelien zu sehen. Bei Zelllyse wird das Kulturmedium leicht trübe und die Bakterienklümpchen lösen sich langsam auf. Unter dem Mikroskop sind dann viele einzelne, fragmentierte, tote Zellen sowie Sporen zu sehen.
Zur Sporenisolation werden die Stämme mit der Impföse flächig auf MS-Platten ausgestrichen und solange inkubiert, bis die Bildung von Luftmycel und anschließend Sporen zu beobachten ist. Die Sporen werden mit etwa 2 mL Glycerin-Lösung (10 %) abgeschwemmt. Die Verwendung von steriler Watte vereinfacht das Abtragen der Sporen. Sie können zur Konjugation eingesetzt oder bei -20 °C gelagert werden.
Zur Konjugation und späteren Selektion von Exkonjuganten werden MS-Platten verwendet, auf denen das Wachstum von E. coli nicht optimal ist.
II.2.1.3 Kultivierung von Cyanobakterien In dieser Arbeit wurden die Cyanobakterien-Stämme Synechococcus sp. PCC7002 und Synechocystis sp. PCC6803 für einen Agardiffusionstest verwendet. Dazu werden 100 µL einer Vorkultur auf BG11- Agarplatten ausplattiert und für 3-10 Tage bei RT bei Licht inkubiert.
II.2.1.4 Kultivierung von Hefen und Pilzen Der Hefestamm Sacchromyces cerevisiae VL48 wird zur Kultivierung in YPD-Medium ü.N. bei 30 °C inkubiert. Zur Regenerierung von Spheroplasten wird das SORB-Medium verwendet. Zur Selektion von Trp-prototrophen Klonen wird das Minimalmedium SORB(-Trp)-Medium verwendet. Die Pilzstämme Candida parapsilosis DSM 5784 und Fusarium verticilloides DSM 62264 wurden für Agardiffusionstests verwendet. C. parapsilosis wird in YPD-Medium bei 37 °C und F. verticillioides in PDA-Medium bei 30 °C inkubiert.
44 Materialien und Methoden
II.2.2 Isolierung und Reinigung von DNA aus Bakterien und Hefen
Alle Lösungen für die Arbeit mit Nukleinsäuren werden mit Reinstchemikalien und MilliQ-Wasser angesetzt. Die isolierte DNA wird bei -20 °C gelagert. Für die Langzeitlagerung wird die DNA in TE- Puffer gelöst.
II.2.2.1 Isolierung chromosomaler DNA aus Actinomyceten a) Isolierung geringer Mengen an chromosomaler DNA Um genomische DNA aus Actinomyceten zu isolieren, werden 2 mL einer gut angewachsenen Kultur
2 min bei 14000 Upm abzentrifugiert, in 1 mL H2O gewaschen und anschließend in 500 µL SET- Puffer resuspendiert. Durch die Zugabe von 10 µL Lysozym-Lösung und 30-minütige Inkubation bei 37 °C wird die Zellwand der Gram-positiven Actinomyceten abgebaut. Daraufhin werden 14 µL Proteinase K-Lösung und 50 µL SDS (10 %) zugegeben und für eine Stunde bei 55 °C inkubiert, um Proteine zu denaturieren. Durch die Zugabe von 200 µL NaCl (5 M) und 500 µL Chloroform werden die Zelltrümmer in die organische Phase versetzt, während die genomische DNA in der wässrigen Phase verbleibt. Nach kräftigem Schütteln werden die Reaktionsgefäße 10 min bei 14000 Upm zentrifugiert und die wässrige Phase mit 500 µL eiskaltem Isopropanol (100 %) gemischt, um die DNA zu präzipitieren. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 14000 Upm wird das DNA-Pellet zweimal mit 1 mL eiskaltem Ethanol (70 %) gewaschen, 10 min bei 60 °C getrocknet und in 100 µL
H2O gelöst. Die DNA kann anschließend als Template für die PCR verwendet werden. b) Isolierung großer Mengen an reiner chromosomaler DNA Um genomische DNA für z. B. die Genomsequenzierung zu erhalten, soll die Fragmentierung der DNA vermieden werden. Aus diesem Grund wird besonders schonend vorgegangen. Dazu werden 15 mL einer gut angewachsenen Actinomyeten-Kultur abzentrifugiert (5000 Upm, 10 min), einmal in SET-Puffer gewaschen und das Pellet in 15 mL SET-Puffer mit 100 µg/mL Lysozym resuspendiert. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 °C wird 100 µg/mL RNase A dazugegeben. Es werden weitere 2 h bei 37 °C inkubiert, um die Zellwand und die RNA abzubauen. Die anschließende Zugabe von Proteinase K (100 µg/mL) und SDS (0,5 %), sowie die Inkubation bei 50 °C über Nacht sorgen für den Abbau von Proteinen, sodass die Degradation der DNA durch mögliche Nukleasen verhindert wird. Am nächsten Tag wird die DNA mit dem gleichen Volumen an Phenol/Chloroform/Iso- amylalkohol (25:24:1) extrahiert. Während der 10-minütigen Inkubation bei RT wird das Falcongefäß vorsichtig invertiert, die Lösung wird milchig. Bei anschließender Zentrifugation (4000 Upm, 20 min, 4 °C) wird die DNA-haltige wässrige Phase von der organischen Phase getrennt. Die obere Phase wird in ein neues Falcon überführt. Die Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktion wird zwei weitere Male durchgeführt. Danach wird die wässrige Phase mit NaOAc (0,2 M; pH 8) und zwei Volumen Isopropanol (70 %) versetzt. Die genomische DNA wird mit einer sterilen Pasteurpipette aufgewickelt, in EtOH (100 %) gewaschen und in 500 - 1000 µL TE-Puffer gelöst.
45 Materialien und Methoden
II.2.2.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli Die Plasmid-DNA wird nach dem Prinzip der alkalischen Lyse (Bimboim und Doly, 1979) isoliert. Nach Zelllyse kommt es durch das Absinken des pH-Werts zur Einzelstrangbildung der DNA. Da Plasmide in der Zelle in einer supercoiled Konformation vorliegen, bleiben hier die komplementären Stränge in räumlicher Nähe. Nach Neutralisation können sich wieder Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen ausbilden. Die chromosomale DNA paart sich aufgrund ihrer Größe und heterogenen Verteilung im Gefäß nur unspezifisch. Es entsteht ein Komplex, der mit den ebenfalls denaturierten Proteinen und Zelltrümmern abzentrifugiert werden kann. Die einzelsträngige Plasmid- DNA kann sich wieder erfolgreich basenpaaren und bleibt in Lösung. Nach Zentrifugation befindet sich diese also im Überstand. Durch anschließende Ethanolfällung oder Bindung an eine Silika-Matrix kann die Plasmid-DNA von niedermolekularen Stoffen weiter aufgereinigt werden. Bei Ersterem kommt es durch hohe Alkoholkonzentrationen und einwertige Kationen zur Präzipitation der DNA.
II.2.2.2.1 Minipräparation von Plasmid-DNA aus Escherichia coli Geringe Mengen an Plasmid-DNA werden mittels Minipräparation gewonnen. Dazu werden 1,5 mL einer E. coli ÜN-Kultur abzentrifugiert (14000 Upm, 2 min, RT). Das Pellet wird in 300 µL P1-Puffer resuspendiert und 10 min bei RT inkubiert. Die Zelllyse erfolgt durch Zugabe von 300 µL P2-Puffer. Nach 5 min wird mit 300 µL P3-Puffer neutralisert und für weitere 10 min auf Eis inkubiert. Nach Zentrifugation (14000 Upm, 10 min, 4 °C) wird der Überstand in ein neues Eppi überführt. Anschließend wird der Überstand mit 700 µL Isopropanol (100 %) gemischt und die dabei gefällte Plasmid-DNA abzentrifugiert (14000 Upm, 40-60 min, 4 °C). Das Pellet wird in 300 µL eiskaltem EtOH (70 %) gewaschen und daraufhin bei 60 °C (5-10 min) getrocknet. Die Plasmid-DNA wird in
10-20 µL H2Obidest. gelöst und über Restriktionsverdau (II.2.4.2) analysiert.
II.2.2.2.2 Minipräparation von Plasmid-DNA aus Escherichia coli mit dem Wizard® Plus SV Miniprep System Größere DNA-Mengen zum Klonieren oder Sequenzieren werden mit Hilfe des Wizard® Plus SV Miniprep Systems (Promega Corporation, Madison, USA) gewonnen. Dabei wird die DNA mittels alkalischer Lyse mit anschließender Reinigung über eine Silikamembran gewonnen. Dazu wird die Plasmid-DNA aus 1-10 mL E. coli-Kultur verwendet. Es wird analog zum Protokoll vorgegangen. Abweichend davon wird zum Schluss das DNA-Eluat ein zweites Mal auf die Säule geladen, um eventuell noch gebundene DNA zu lösen.
II.2.2.2.3 Midipräparation von Plasmid-DNA aus Escherichia coli mit dem Pure YieldTM Plasmid Midiprep System Große Mengen an DNA werden mit dem PureYieldTM Plasmid Midiprep System (Promega Corporation, Madison, USA) isoliert. Das Prinzip entspricht II.2.2.2.2. Das Anlegen von Vakuum beschleunigt den Prozess. Dafür werden 50-100 mL E. coli-Kultur verwendet. Es wird analog zum
46 Materialien und Methoden
Protokoll vorgegangen. Abweichend davon wird zum Schluss das DNA-Eluat ein zweites Mal auf die Säule geladen, um eventuell noch gebundene DNA zu lösen.
II.2.2.2.4 Isolierung BAC/YAC aus E. coli Um große DNA-Moleküle wie BAC (Bacterial -) oder YAC (Yeast Artifical Chromosom) aus E. coli zu isolieren, wurde analog dem Protokoll von Villalobos et al., 2004 vorgegangen. Dazu wird ein E. coli - Klon in 10 mL LB-Medium über Nacht bei 37 °C inkubiert und abzentrifugiert (14000 Upm, 5 min, 4 °C). Das Pellet wird in 400 µL EDTA (10 mM, pH 8) resuspendiert und 5 min auf Eis inkubiert. Anschließend werden 800 µL frisches NaOH (0.2 M) mit N-Laurylsarcosine (1 %) zugegeben, invertiert und weitere 5 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 600 µL KAc (2 M) wird das Reaktionsgefäß invertiert, nochmals 5 min auf Eis inkubiert und die Zelltrümmer abzentrifugiert (14000 Upm, 15 min, 4 °C). Der Überstand wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt und gleiches Volumen an Isopropanol (100 %) hinzupipettiert. Nach Zentrifugation (5000 Upm, 15 min, 4 °C) wird der Überstand verworfen und das Pellet in 180 µL TE-Puffer gelöst. Dazu werden 90 µL KAc (7,5 M) zugegeben und für 30 min bei -80 °C inkubiert. Nach Auftauen der Probe wird erneut zentrifugiert (5000 Upm, 10 min, 4 °C), die Probe in ein neues Reaktionsgefäß überführt und 2.5 Vol EtOH (95 %) hinzugegeben. Nach weiterer Inkubation bei -20 °C für 30 min und Zentrifugation (14000 Upm, 5 min, 4 °C) wird der Überstand verworfen und das Pellet in 100 µL TE-Puffer mit RNase (0,2 mg/mL) gelöst. Während einer Inkubation von 30 min bei 37 °C wird die RNA abgebaut. Anschließend wird 1 Vol Phenol-Chloroform dazugegeben und der Ansatz für 5 min invertiert. Nach Zentrifugation (5000 Upm, 5 min, RT) wird die obere Phase in ein neues Reaktionsgefäß überführt und nochmals 1 Vol Chloroform hinzupipettiert. Der Ansatz wird durch Pipettieren gemischt und abermals zentrifugiert (5000 Upm, 5 min, RT). Die obere Phase wird mit 1 Vol Isopropanol gemischt, zentrifugiert (5000 Upm, 5 min, RT) und der Pellet mit 500 µL EtOH (70 %) gewaschen. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt (5000 Upm, 5 min, RT) wird der Überstand abgenommen, das Pellet bei 60 °C getrocknet und in 20 µL TE-Puffer ü.N. bei 4 °C gelöst.
II.2.2.3 Isolierung YAC aus der Hefe Zur Isolierung von YAC aus Hefestämmen wird ein Hefe-Klon in 10 mL Hefe(-Trp)-Medium ü.N. bei 30 °C inkubiert und am nächsten Tag abzentrifugiert (2000 Upm, 5 min, 4 °C). Das Pellet wird in 1 mL Sorbitol-Lösung gewaschen und nach erneuter Zentrifugation (5000 Upm, 30 sek, 4 °C) in 0,5 mL SPE-Puffer mit 1 µL Mercaptoethanol und 20 µL Lyticase resuspendiert. Die Zellwand wird bei der Inkubation für 2 h bei 30 °C abgebaut. Nach Zentrifugation (5000 Upm, 5 min, 4 °C) wird das Pellet in 0,5 mL EDTA-Lösung mit 1 µL RNase resuspendiert und für 5 min auf Eis gelagert, dann anschließend für 15 min bei 70 °C inkubiert. Daraufhin werden 50 µL KAc-Lösung zugegeben und weitere 30 min auf Eis inkubiert. Der Ansatz wird abzentrifugiert (14000 Upm, 15 min, 4 °C) und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Dazu werden 1 mL Isopropanol gegeben und die
47 Materialien und Methoden präzipierte DNA abzentrifugiert (14000 Upm, 5 min, 4 °C). Anschließend wird die DNA in 500 µL
EtOH (70 %) gewaschen, getrocknet (10 min, 60 °C) und in 20 µL H2O gelöst.
II.2.2.4 Umpufferung und Aufkonzentrierung von DNA mittels alkoholischer Fällung Die alkoholische Fällung kann auch zur Aufkonzentrierung oder Umpufferung von DNA verwendet werden. In Gegenwart von einwertigen Leichtmetall-Kationen und Isopropanol oder Ethanol wird der DNA die Hydrathülle entzogen und fällt aus. In dieser Arbeit wurde das Verfahren vor allem verwendet, um nach dem Verdau von genomischer DNA diese wieder auszufällen und anschließend in einem geringeren Volumen ohne Enzyme oder Salze zu lösen. Natriumacetat wird zur DNA-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 0,3-0,35 M zugegeben und anschließend die 3-fache Menge an Isopropanol (100 %) dazu pipettiert. Nach Zentrifugation (14000 Upm, 15 min, 4 °C) wird der Überstand verworfen und das Pellet zweimal mit 1,5 mL EtOH
(70 %) gewaschen. Das DNA-Pellet wird getrocknet und in TE-Puffer oder H2O resuspendiert. Das Lösen von genomische DNA benötigt mindestens 2-3 Tage bei 8 °C.
II.2.3 Charakterisierung von DNA-Molekülen
II.2.3.1 Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA Die Konzentrationsbestimmung der DNA wird mithilfe des Nanodrop-Spektrophotometers 2000 durchgeführt. Aufgrund der aromatischen Ringe der Basen in Nukleinsäuren haben diese ein Absorptionsmaximum bei 260 nm. Für die Messung werden 1-2 µL DNA verwendet. Als Standard dient der Puffer, in dem die DNA gelöst wurde (Wasser oder TE-Puffer). Neben der Konzentrations- messung gibt das Gerät durch das Verhältnis der Absorption von 260 nm zu 280 nm auch Auskunft über die Reinheit der Probe. Liegt dieser Wert unter 1,8 spricht dies für eine Verunreinigung mit Proteinen, Phenolen und anderen Komponenten. Liegt der Wert gleich oder über 1,8 gilt die DNA- Probe als rein. Weiterhin sollte das Verhältnis der Absorption 260 nm / 230 nm höher sein als der Absorptionsquotient von 260 nm / 280 nm.
II.2.3.2 Agarose-Gelelektrophorese von DNA-Molekülen Zur Überprüfung der erfolgreichen DNA-Isolierung, Restriktion, sowie zur Größenbestimmung von DNA-Molekülen wird eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt. Aufgrund der negativen Ladung von DNA lässt sich diese in einer Agarose-Matrix im elektrischen Feld auftrennen. Neben der angelegten Spannung und der Agarosekonzentration hängt die Wandergeschwindigkeit vor allem von der Größe und Konformation (circular, linear, open circular, covalently closed circular) der DNA- Moleküle ab. Die Wandergeschwindigkeit ist dabei umgekehrt proportional zum Logarithmus der DNA-Größe (bp). Dazu werden die DNA-Proben vor dem Gelauftrag mit 1/6 Vol von 6 x DNA-Ladepuffer versetzt. Bei analytischen Gelen werden pro Ansatz 5-15 µL und bei präparativen Gelen 40-100 µL aufgetragen.
48 Materialien und Methoden
Zur DNA-Größenbestimmung dienen 6 µL des DNA-Ladders (NEB). Meistens werden 0,7 %ige Agarose-Gele verwendet. Bei hochmolekularer DNA wie z.B. genomischer DNA werden 0,3 %ige und bei kleinen DNA-Fragmenten wie z.B. PCR der sgRNAs werden 1,8 %ige Agarose-Gele benutzt. Die Elektrophorese trennt DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe bei 80-100 V. Der Farbstoff des Ladepuffers gibt dabei Auskunft, wie weit die Auftrennung bislang erfolgt ist. Analytische Gele werden 15 min in einer Ethidiumbromidlösung (0,001 %) bzw. GelRed (0,03 %) gefärbt und die DNA mittels UV-Licht (312 nm) detektiert. Präparative Gele werden für 10 min in einer Methylenblau- lösung (0,1 %) gefärbt und 1 h in H2Obidest. entfärbt. Die gewünschten Fragmente werden bei Weißlicht mit dem Skalpell ausgeschnitten.
Fragmentlängen des 50 bp DNA Ladder (#N3236 von NEB) in bp: 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 766, 916, 1350
Fragmentlängen des 100 bp DNA Ladder (#N3231 von NEB) in bp: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1517
Fragmentlängen des 1 kb DNA Ladder (#N3232 von NEB) in bp: 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000
II.2.3.3 Sequenzierung von kurzen DNA-Bereichen Um PCR-Produkte bzw. DNA-Bereiche zu überprüfen (z. B. DNA-Sequenz, Mutationen, Vorhanden- sein bestimmter Restriktionsschnittstellen), werden deren Basenabfolgen durch Sequenzierung ermittelt. Dazu wurden hauptsächlich die Lac-Primer (siehe Tab. 19) verwendet, die das lacZ-Gen binden, das auf den meisten Vektoren wie pUC19, pBSK-, pKC1132 vorliegt. Die Sequenzierung erfolgt bei GATC (Köln oder Konstanz) und Eurofins Genomics (Ebersberg). Die erhaltenen Sequenz- daten können u.a. mit der Software CloneManager 7.0 analysiert werden.
II.2.4 Klonierungsexperimente
Unter Klonierung versteht man die Neukombination von DNA-Molekülen, üblicherweise die Ligation von einem bestimmten DNA-Fragment mit einem Plasmid. Grundsätzlich umfasst es die Vorgänge von Amplifikation eines bestimmten Genombereichs, Restriktion, Ligation und Transformation mit anschließender Selektion der gewünschten Klone.
II.2.4.1 Amplifikation von DNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR)(Mullis et al., 1986) dient der gezielten in vitro Amplifikation von definierten DNA-Fragmenten. Die DNA mit der zu ampli- fizierenden Sequenz wird durch Hitze in zwei Einzelstränge denaturiert. Zwei spezifische Primer, die komplementär zu den Enden der gewünschten Sequenz sind, hybridisieren an die Einzelstränge (Primer-Annealing). Die DNA-Polymerase bildet neue Doppelstränge, indem sie von den Primern
49 Materialien und Methoden ausgehend Desoxyribonukleotide einbaut (Polymerisation). Die Schritte Denaturierung, Primer- Annealing und Polymerisation bilden einen Zyklus. Durch das mehrmalige Durchlaufen der Zyklen wird das gewünschte DNA-Fragment exponentiell amplifiziert. Bei der Konstruktion der Primer (z.B. mithilfe CloneManager) kann man an den 5'Enden zusätzliche, zum Template nicht komplementäre Basen anfügen, um geeignete Restriktionsschnittstellen, Start- bzw. Stopcodons oder Überhänge für die anschließende Klonierung zu erhalten.
Tab. 28: Verwendete Polymerasen und PCR-Ansätze
Polymerase Komponenten Menge Geschwindigkeit Anwendung
Pfu-Pol DNA-Template 1 µL Primer je 1 µL dNTPs 0,5 – 2 µL PCR von DNA-Fragmenten DMSO 0 – 5 µL 500 bp / min bis max. 4 kb 10x Pfu-Puffer 5 µL Pfu-Pol 0,5 – 1 µL
H2O ad 50 µL
Phusion-Pol DNA-Template 1 µL Primer je 1 µL dNTPs 0,5 – 2 µL PCR von DNA-Fragmenten DMSO 0 – 5 µL 2 kb / min bis etwa 7 kb 10x Taq-Puffer 5 µL Phusion-Pol 0,5 – 1 µL
H2O ad 50 µL
Taq-Pol DNA-Template 1 µL Primer je 1 µL dNTPs 0,5 – 2 µL Kontroll-PCR DMSO 0 – 5 µL 1 kb / min Anfügen von AAA 10x Taq-Puffer 5 µL kein Proofreading Taq-Pol 0,5 – 1 µL
H2O ad 50 µL
Velocity-Pol DNA-Template 1 µL Primer je 1 µL dNTPs 0,5 – 2 µL PCR von DNA-Fragmenten DMSO 0 – 5 µL 4 kb / min bis max. 10 kb 5x HiFi GC-Puffer 5 µL Vel-Pol 0,5 – 1 µL
H2O ad 50 µL
Da Actinomyceten einen hohen GC-Gehalt haben, erweist sich die Amplifikation bestimmter Genom- regionen häufig als schwierig: Durch die drei Wasserstoffbrücken sind die Bindungen zwischen G und C stärker als zwischen A und T und führt bei Einzelstrangbildung häufig zu Sekundärstrukturen der DNA. Der Zusatz von DMSO (2-10 %) unterbindet die Ausbildung der Sekundärstrukturen der Template-DNA und erleichtert damit besonders die Amplifikation von GC-reicher Template-DNA.
50 Materialien und Methoden
Die verwendeten Polymerasen, der jeweilige Reaktionsansatz sowie weitere Informationen sind in Tab. 28 zusammengefasst.
II.2.4.2 Restriktionsverdau Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die DNA-Moleküle an einer spezifischen Erkennungs- sequenz spalten können. Dabei können je nach verwendetem Enzym glatte (blunt) oder überstehende (sticky) DNA-Enden entstehen, die man anschließend durch Ligation (II.2.4.4) mit einem anderen Fragment kombinieren kann. Zur Überprüfung des Inserts in einem Vektor wird das ligierte Konstrukt von bestimmten Restriktionsenzymen geschnitten und anschließend das Bandenmuster nach einer Agarose-Gelelektrophorese beurteilt. Zur Restriktion der DNA werden Restriktionsenzyme von NEB verwendet. In Tab. 29 sind Zusammensetzungen und Inkubationszeiten angegeben.
Tab. 29: Restriktionsverdau
Anwendung Komponenten Menge Inkubationszeit
Kontrollverdau DNA 2-8,75 µL 0,5 - 3 h Enzym je 0,25 µL 10xPuffer 1 µL
H2O ad 10 µL
Präparativer Verdau DNA 40 µL 2 - 6 h Enzym je 2 µL 10xPuffer 5 µL
H2O ad 50 µL
BfuCI-Partialverdau gen. DNA 2 µL 20 - 40 min, 37 °C BfuCI (Verdünnung 1:100) 1 µL BSA 10 µL anschließende Hitzeinaktiv- 10xPuffer NEB4 10 µL ierung 80 °C, 20 min
H2O ad 100 µL
II.2.4.3 Aufreinigung von DNA aus PCR-Mischungen, enzymatischen Reaktionen oder präparativen Gelen Zur Aufreinigung von DNA aus PCR-Ansätzen, enzymatischen Reaktionen oder präparativen Gelen wird das Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System von Promega Corporation verwendet. Es wird nach dessen Arbeitsanleitung vorgegangen. Dabei extrahieren chaotrophe Substanzen DNA aus Lösungen oder aufgelöster Agarose (Vogelstein und Gillespie, 1979) und denaturiert weiterhin die enthaltenen Proteine. Die DNA bindet anschließend an eine Silikamembran (Marko et al., 1982). Nach zwei Waschschritten kann die DNA eluiert werden.
51 Materialien und Methoden
II.2.4.4 Ligation von DNA-Fragmenten Während der Ligationsreaktion katalysiert eine T4-DNA-Ligase die Bildung kovalenter Phospho- diesterbindungen zwischen 5'-Phosphatenden und 3'-Hydroxylresten von DNA-Molekülen. Zur Ver- knüpfung der DNA-Moleküle müssen diese sich in räumlicher Nähe befinden. Durch die Ausbildung von Wasserstoffbrücken von komplementären Einzelsträngen der sticky-ends erfolgt diese Ligations- reaktion effektiver als im Vergleich zu einer Ligation mit blunt-ends. Es wird die T4-DNA-Ligase von NEB verwendet.
II.2.4.4.1 Ligation von PCR-Produkten in Zwischenvektoren
Die Ligation der PCR-Fragmente in geeignete Zwischenvektoren und die Transformation in E. coli XL1-Blue dienen der weiteren Anreicherung und der Herstellung von kompatiblen Enden der gewünschten Fragmente. Hier werden die aufgereinigten PCR-Produkte in den pUC19 (siehe Abb. 12) oder pBSK-Zwischenvektor (siehe Abb. 13) kloniert. Der Vektor pBSK- kann mit den Restriktions- schnittstellen EcoRV oder SmaI, der Vektor pUC19 nur mit SmaI blunt end aufgeschnitten werden.
MCS MCS EcoRI Acc65I SacI KpnI KpnI f1 origin ApaI SmaI EcoO109I BamHI PspOMI lacZa XbaI PspXI AccI XhoI HindII AccI SalI HincII 2500 PstI SalI SphI bla ClaI HindIII 2500 500 HindIII bla 500 EcoRV lacZa EcoRI 2000 pUC19 pBSK PstI SmaI 2686 bps 2958 bps XmaI 2000 1000 BamHI 1000 SpeI XbaI 1500 1500 NotI EagI BstXI AleI BtgI SacII EcoICRI ori pBR322 origin SacI
Abb. 12: Plasmidkarte von Zwischenvektor pUC19 Abb. 13: Plasmidkarte von Zwischenvektor pBSK- bla -Lactamase-Resistenz; pBR322 origin: origin of replication, f1 blaμ -Lactamase-Resistenz; ori: origin of replication; lacZa: μ origin: f1-Phagenfragment zur Isolierung von ssDNA; lacZa - α-Untereinheit der -Galaktosidase-Untereinheit; MCS: μ α Multiple Cloning Site. Untereinheit der -Galaktosidase-Untereinheit; MCS: Multiple Cloning Site.
Für die Ligation werden folgende Komponenten zusammen pipettiert:
PCR-Produkt 7 µL Inkubation bei 16 °C für 15 min bis 6 h Zwischenvektor (blunt) 1 µL (bzw. ü.N. bei 8 °C) 10x Ligase-Puffer 1 µL T4 DNA-Ligase 1 µL 10 µL
Nach der Inkubationszeit wird der Ligationsansatz in CaCl2-kompetente E. coli XL1-Blue transferiert (II.2.4.5.1) und die Zellen auf LB-Platten (Carb 100 µg/mL, X-Gal 100 µg/mL, IPTG 0,2 µM) 52 Materialien und Methoden ausgestrichen. Transformierte Zellen mit religiertem Plasmid wachsen aufgrund der funktionellen -Galactosidase-Untereinheit α, die zusammen mit der chromosomal-kodierten σ-Untereinheit ein funktionelles Protein bilden und X-Gal spalten, zu blauen Kolonien an. Die Bakterienzellen, die einen Vektor mit Insert aufgenommen haben, wachsen weiß, da die Expression der -Galactosidase-Unter- einheit unterbrochen wird (Blau-Weiß-Screening).
II.2.4.4.2 Ligation in den Zielvektor Nach der Zwischenklonierung und dem Kontrollverdau sowie der Sequenzierung des gewünschten DNA-Fragments wird ein Klon mit dem richtigen Vektor in einem größeren Kulturvolumen (5-20 mL) unter Selektion angezogen, um anschließend größere Mengen des Plasmids zu erhalten (II.2.2.2.2). Daraufhin wird in einem präparativen Verdau (II.2.4.2) das zuvor klonierte DNA-Fragment wieder ausgeschnitten, aufgereinigt (II.2.4.3) und in den Endvektor kloniert. Aufgrund von kompatiblen Enden erfolgt die Ligation effizienter, aber häufig liegt in dem Zielvektor kein lacZ-Gen vor, sodass kein Blau-Weiß-Screening stattfinden kann und dadurch mehrere Klone durch Plasmidisolation und Kontrollverdau überprüft werden müssen.
II.2.4.5 DNA-Übertragung in Bakterien DNA kann durch verschiedene Mechanismen in eine Bakterienzelle gelagen: Die Aufnahme freier DNA aus der Umgebung wird Transformation bezeichnet. Die Konjugation ist die DNA-Weitergabe von einem Donor-Bakterium in einen Rezipienten über einen stabilen Zellkontakt (Sexpilus). Bei der Transduktion wird die DNA über Phagen in die Bakterien eingeschleust.
II.2.4.5.1 Transformation von CaCl2-kompetenten E. coli Zellen
Es wird ein verändertes Protokoll der CaCl2-Methode nach Cohen et al., 1972, Dagert und Ehrlich, 1979 verwendet. Der genaue Mechanismus ist noch nicht vollständig verstanden. Man vermutet, dass die Ca2+-Ionen mit den Mg2+-Ionen um Bindungsplätze an den Lipopolysacchariden konkurrieren. Dabei ändert sich die Struktur der äußeren Zellmembran, da die Ca2+-Ionen einen anderen Ionenradius besitzen und so die Quervernetzungsfunktion nicht in gleicher Weise erfüllen. Bei dem Temperatur- übergang von 4 °C auf 42 °C kommt es wahrscheinlich durch Schollenbildung zu Rissen in der Membran, die die Aufnahme der DNA gestatten. Nach sofortiger Zugabe von LB-Medium und Inkubation bei 37 °C für eine Stunde, können sich die Zellen wieder regenerieren und sich teilen. Nach mindestens einer Zellteilung können die Bakterien auf Selektivagar (Agar mit Antibiotikum) ausgestrichen werden, um nur das Wachstum der erfolgreich transformierten Zellen zu gewährleisten.
Herstellung CaCl2-kompetenter E. coli Zellen
Zur Herstellung der CaCl2-kompetenten E. coli Zellen werden 100 mL LB-Medium mit einer E. coli Übernachtkultur 1:500 angeimpft (gegebenfalls unter selektiven Bedingungen). Die Kultur wird bis zu einer OD578nm von 0,4 bei 37 °C und 180 Upm inkubiert. Danach werden die Zellen 10 min auf Eis
53 Materialien und Methoden gelagert, um das Wachstum zu stoppen. Nach Zentrifugation (5000 Upm, 10 min, 4 °C) wird das
Zellpellet zweimal mit 10 mL eiskalter CaCl2-Lösung und zweimal mit 20 mL eiskalter CaCl2-Lösung gewaschen. Anschließend wird das Pellet in 10 mL eiskalter CaCl2-Lösung resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert. Den Zellen werden 2 mL eiskaltes Glycerin zugegeben und nach vorsichtigem Mischen in 200 µL Ansätzen in eiskalte Eppendorftubes aliquotiert. Die kompetenten Zellen werden bei -80 °C gelagert.
Durchführung der Transformation Die kompetenten E. coli Zellen werden langsam auf Eis aufgetaut. Es werden 5-10 µL Plasmid-DNA (entspricht ca. 0,2-1 µg DNA) dazugegeben und vorsichtig gemischt. Der Transformationsansatz wird für 15-30 min auf Eis inkubiert und anschließend ein Hitzeschock bei 42 °C für 2 min durchgeführt. Sofort werden 700 µl LB-Medium zugegeben und vorsichtig gemischt. Die Zellen werden für mind. 1 h bei 37 °C inkubiert. Davon werden 100 µL Zellen direkt auf LB-Platten gegeben, der restliche Ansatz nach Zentrifugation (14000 Upm, 1 min, RT) im Rücklauf resuspendiert und ausplattiert. Die Platten werden über Nacht bei 37 °C inkubiert.
II.2.4.5.2 Intergenerische Konjugation von E. coli und Actinomyceten Konjugation ist die häufigste Ursache für horizontalen Gentransfer, die auch über die Art-, Spezies- und Reichgrenze hinweg erfolgen kann. Der Austausch geschieht über einen physikalisch stabilen Zell-Zell-Kontakt, einem Pilus, der die Donor- und Rezipientenzelle verbindet. Lederberg und Tatum haben diesen Vorgang erstmals in E. coli K12 beschrieben (Lederberg und Tatum, 1946). Die Methode erfordert konjugative oder mobilisierbare genetische Elemente, die üblicherweise auf Plasmiden oder Transposons vorkommen. In dieser Arbeit diente der E. coli Stamm ET12567 als Donor, bei dem aufgrund seines fehlenden Restriktionssystems das zu transferierende Plasmid nicht abgebaut wird. Mithilfe des Transferapparats des konjugativen Hilfsplasmids pUZ8002 oder pUB308 (MacNeil et al., 1992; Flett et al., 1997) kann das mobilisierbare Plasmid mit dem gewünschten Gen in den Actinomyceten-Rezipienten transloziert werden (Thoma und Muth, 2015). Da das Hilfsplasmid pUZ8002 / pUB308 keinen origin of transfer (oriT) besitzt, werden diese Plasmide nicht in die Nachbarzelle übertragen. Die Plasmide pKC1132 und pKCLP2_gusA integrieren über homologe Bereiche, das Plasmid pTESb durch die auf dem Plasmid kodierte Integrase an der Attachmentsite ins Genom der Actinomyceten. Das Plasmid pUWL-T integriert nicht in das Genom, sondern bleibt extrachromosomal.
Vorbereitung des E. coli - Donors: R CaCl2-kompetente E. coli ET12567 mit konjugativen Plasmid pUZ8002 bzw. pUB308 (Kan ) werden mit dem gewünschten, zu mobilisierenden Plasmid transformiert. Angewachsene Klone werden flächig auf einer LB-Platte (mit entsprechenden Antibiotika) ausgestrichen, über Nacht bei 37 °C inkubiert und zur Konjugation mit der Impföse wieder von der Platte gekratzt. Alternativ wird ein Transformationsansatz in 100 mL LB-Medium (mit entsprechenden Antibiotika) bei 37 °C, 180 Upm,
54 Materialien und Methoden
ü.N. inkubiert. Die verwendeten Antibiotika (Kanamycin und AB des zu mobilisierenden Plasmids) werden durch zweimaliges Zentrifugieren der Bakterienkultur (5000 Upm, 10 min, 4 °C) ausge- waschen.
Vorbereitung des Actinomyceten - Rezipienten: Von einer gut angewachsenen Actinomyceten-Kultur (1-3 Tage in TSB-Medium) werden 0,5 - 1 mL abgenommen, in TSB-Medium gewaschen und direkt zur Konjugation eingesetzt. Alternativ können von einer alten MS-Kulturplatte Sporen abgekratzt bzw. abgeschwemmt werden und diese nach einem 10-minütigem Hitzeschock bei 60 °C verwendet werden.
Durchführung der Konjugation: Zur Konjugation werden E. coli Donor-Zellen von einer 50 mL Kultur mit 0,5 - 1 mL Actinomycten-
Rezipienten gemischt und auf einer MS-Platte (+ 10 mM MgCl2 bzw. CaCl2) ausgestrichen. Die
Platten werden bei 28 °C für 6-20 h inkubiert und anschließend mit 1 mL H2O mit Fosfomycin (Endkonzentration auf Platte 200 µg/mL) und dem zweiten entsprechenden Antibiotikum über- schichtet. Die Platten werden 3-14 Tage bei 28 °C inkubiert, bis Exkonjuganten sichtbar sind. Diese werden auf einer neuen MS-Platte unter Selektionsdruck ausgestrichen.
II.2.4.6 Klonierung von kompletten Biosynthesegenclustern Da viele Actinomyceten sich nur schwer genetisch manipulieren lassen, bzw. um stille Cluster zu aktivieren oder die Menge eines Sekundärmetaboliten zu steigern, können komplette Gencluster kloniert und in einem heterologen Wirt exprimiert werden. Während dazu früher eine Cosmidbank angelegt und intensiv gescreent werden musste, nutzt man heute Rekombinationsereignisse. Dabei unterscheidet man zwischen der Rekombination in E. coli (linear-linear homologe Rekombination) und in der Hefe (Transformations-assoziierte Rekombination) (siehe Abb. 14). In dieser Arbeit sollte das Foxicin-Gencluster kloniert werden.
II.2.4.6.1 Linear-linear homologe Rekombination in E. coli Für die linear-linear homologen Rekombination (LLHR) wurde das Protokol von Fu et al., 2012 verwendet. Die E. coli-Stämme GB05-dir, GB05 pSC101-PBAD-EtgA und GB05red pSC101_PRHA- EtgA wurden von Prof. Francis Stewart der Technischen Universität, Dresden zur Verfügung gestellt. Die E. coli-Stämme werden über Nacht in LB-Medium bei 37 °C schüttelnd inkubiert. In einem 2 mL Reaktionsgefäß wurden 1,4 mL frisches LB-Medium (+Antibiotikum) mit 40 µL der Vorkultur gemischt und für 2 h bei 30 °C und 100 Upm inkubiert. Die Expression der Rekombinasen wird durch die Zugabe von L-(+)-Arabinose bzw. L-Rhamnose (Endkonzentration 2,5 mg/mL) induziert. Nach Inkubation bei 37 °C für 45 min und 100 Upm wird die Kultur abzentrifugiert (9500 Upm, 30 sek, 4 °C), der Überstand verworfen und das Pellet zweimal in 1 mL eiskaltem Wasser gewaschen. Anschließend wird das Pellet in 30 µL eiskaltem Wasser resuspendiert und 0,5 µg lineares Plasmid
55 Materialien und Methoden pOJ436_Up_Down_fox (siehe Abb. 26) mit 5 µg partial-verdauter genomischer DNA hinzugegeben. Die Zellen werden in vorgekühlte Elektroporationsküvetten überführt. Nach dem Stromimpuls (1350 V, 1 sek) werden sofort 1 mL LB-Medium dazupipettiert und der Ansatz für 70 min bei 37 °C inkubiert. Danach werden die Zellen auf LB-Platten ausplattiert und ü.N. bei 37 °C inkubiert. Die angewachsenen Klone werden gepickt, in Flüssigmedium inkubiert, die Plasmide isoliert und mittels PCR (II.2.4.1) und Restriktionsverdau (II.2.4.2) überprüft.
II.2.4.6.2 Transformations-assoziierte Rekombination in der Hefe Für die Transformations-assoziierte Rekombination (TAR) wurde ein verändertes Protokoll nach Yamanaka et al., 2014 verwendet. Der Vektor pCAP01 wurde von Prof. Bradley Moore der Universiät von Kalifornien, San Diego (USA) und der hochtransformierbare Hefestamm Saccharomyces cerevisiae VL6-48N wurde von Dr. Vladimir Larionov des Center of Cancer Research, Maryland (USA) zur Verfügung gestellt. Das veränderte Protokol wurde in der Arbeitsgruppe von Prof. Andriy Luzhetskyy (Pharmazeutische Biotechnologie, Universität Saarland) optimiert.
Der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae VL6-48N wird in 100 mL YPD-Medium (+ 100 µg/mL
Adenin) ü.N. bei 30 °C schüttelnd inkubiert. Am nächsten Tag sollte die OD600nm zwischen 4,3 und 4,6 (0,43 und 0,46 für die 1:10-Verdünnung) liegen. Die Kultur wird zentrifugiert (3500 Upm, 5 min, 4 °C), das Zellpellet in 30 mL Wasser gewaschen und anschließend in 20 mL frisch zubereiteter Sorbitol-Lösung mit EDTA (25 mM, pH 8) und DTT (50 mM) resuspendiert. Sofort im Anschluss werden die Zellen wieder zentrifugiert (3000 Upm, 5 min, 4 °C) und nochmals mit 20 mL Sorbitol- Lösung gewaschen. Das Pellet wird in 20 mL SPE-Puffer resuspendiert und 7 µL Lyticase (2000 U/mL) werden dazugegeben. Der Ansatz wird für 45-60 min bei 30 °C inkubiert. Zur Kontrolle der Spheroplastierung werden 100 µL Zellen vor (X) und nach (Y) der Lyticase-Behandlung mit SDS
(2 %) gemischt und die OD600nm gemessen. Bei einem Wert von Y/X*100 = 30-40 sind etwa 60-70 % der Zellen protoplastiert und der Zellwandverdau wird durch die Zugabe von 30 mL Sorbitol-Lösung gestoppt. Nach Zentrifugation (1200 Upm, 10 min, 4 °C) werden die Zellen zweimal vorsichtig mit 50 mL Sorbitol-Lösung gewaschen (invertieren, nicht schütteln) und anschließend in 2 mL STC- Lösung resuspendiert. Die Spheroplasten werden zu je 200 µL aliquotiert und mit je >10 µg verdauter, genomischer DNA und 1-2 µg linearisiertem Vektor pCAP01 langsam gemischt. Der Trans- formationsansatz wird für 10 min bei RT inkubiert. Anschließend werden 800 µL PEG8000-Lösung zugegeben, vorsichtig invertiert und für weitere 10 min bei RT inkubiert. Der Ansatz wird zentrifugiert (2000 Upm, 5 min, 4 °C), das Pellet vorsichtig in 800 µL SOS-Lösung gelöst und für 40 min bei 30 °C ohne Schütteln inkubiert. Die transformierten Spheroplasten werden mit 7 mL lauwarmen Top-Agar gemischt und auf SORB-Leu Platten gekippt. Die Platten werden für 4-6 Tage bei 30 °C inkubiert. Die angewachsenen Hefeklone werden gepickt, in Flüssigmedium inkubiert, die YAC isoliert (II.2.2.3) und mittels PCR (II.2.4.1) und Restriktionsverdau (II.2.4.2) überprüft.
56 Materialien und Methoden
Down Cen6/ARS4 (1.) Klonierung von homologen Regionen geeigneten Vektor Down TRP1
(2.) Partialverdau von genomischer DNA (3.) ori ori Up Up pOJ436 Linearisierung pCAP01 mit homologen Fragmenten des Vektors mit homologen Fragmenten
(4b.) ɸCγ1 oriT Transformation in ɸCγ1 Integrase Transformation Integrase (4a.) Hefe-Spheroplasten KanR ApraR in E. coli ɸCγ1 attP site KanR-Promotor ɸCγ1 attP site oriT
(5.) Linear-linear Transformations- Rekombination der homologe homologen Bereichen assoziierte E. coli Rekombination Rekombination Saccharomyces cerevisiae (6.) Isolierung des rekombinanten Vektors
Tranfer in (7.) E. coli ET12567 (10.) Heterologe Expression Konjugation in heterologen (8.) Streptomyces Wirt
(9.) Integration ins Streptomyces- Genom Cluster für heterologe Expression Abb. 14: Klonierung ganzer Gencluster mittels LLHR und TAR Die Klonierung ganzer Gencluster umfasst: (1.) Klonierung von homologen Fragmenten, upstream und downstream des Clusters, in einen geeigneten Vektor; (2.) Partialverdau von genomischer DNA des Actinomyceten mit dem Cluster, das heterolog exprimiert werden soll; (3.) Linearisierung des Vektors; (4a.) Transformation in E. coli-Stamm mit Rekombinasen; (4b.) Transformation in Hefe-Spheroplasten; (5.) Rekombination der homologen Bereichen; (6.) Selektion und Isolierung des rekombinanten Vektors; (7.) Transfer des Vektors in E. coli ET12567; (8.) Konjugation von E. coli in Streptomyces-Wirt; (9.) Integration des Vektors mit Cluster in das Genom; (10.) Heterologe Expression des Clusters.
II.2.4.7 Geninaktivierung in Actinomyceten Um die Funktion von einzelnen Genen zu bestimmen, bzw. ein Cluster zu bestätigen, müssen einzelne Gene gezielt inaktiviert werden und der daraus folgende Verlust für die Mutante untersucht werden. Dabei unterscheidet man zwischen einem Single- und einem Doppel-Crossover. Durch die Ver- wendung der Cas9-Nuklease kann dieses Verfahren beschleunigt werden.
II.2.4.7.1 Geninaktivierung durch Single- und Doppel-Crossover
Bei einem Single-Crossover wird ein homologes internes Fragment (etwa 0,5 - 3 kb) des zu unterbrechenden Gens per PCR vervielfältigt und in einen Vektor kloniert, der in Actinomyceten nicht repliziert werden kann (Suizid-Vektor). In dieser Arbeit wurden die Vektoren pKC1132 und pKCLP2_gusA verwendet. Durch Konjugation von E. coli in den Actinomyceten mit anschließender Selektion des Markers auf dem Vektor können nur die Klone anwachsen, bei denen eine homologe Rekombination zwischen dem Fragment auf dem Vektor und dem Gen des Genoms stattgefunden hat. Dabei integriert der komplette Vektor in das Genom und unterbricht dadurch das Gen. Jedoch wird so nur das Gen unterbrochen, sodass einzelne katalytische Proteindomänen immernoch aktiv sein
57 Materialien und Methoden können. Da das entsprechende Fragment jedoch nun zweimal im Genom vorliegt, kann durch eine zweite Rekombination das DNA-Stück wieder herausgeschnitten werden. Daher ist der Single- Crossover eine schnelle, aber nicht stabile Methode der Geninaktivierung.
Bei einem Doppel-Crossover wird das komplette Gen deletiert. Dabei müssen zwei Fragmente, je eins upstream und downstream (etwa 1 kb), des zu deletierenden Gens per PCR amplifiziert werden. Diese werden in einen nicht in Actinomyceten replizierbaren Vektor kloniert. Zur Deletion der pokM-Gene und aviNM-Gene wurde in dieser Arbeit der Vektor pKC1132 verwendet. Dazwischen wird eine Resistenzkassette (hier: Spectinomycin-Resistenz) kloniert. Nach dem Transfer des Vektors in den Actinomyceten können nur Klone anwachsen, bei denen eine homologe Rekombination zwischen Vektor und Chromosomen stattgefunden hat. Durch diesen Single-Crossover sind die erhaltenen Klone gegen zwei Antibiotika resistent: gegen Apramycin (auf dem Vektor) und gegen Spectinomycin (zwischen den homologen Fragmenten). Dieser Single-Crossover sollte zu keiner Beeinträchtigung des Stammes führen, da alle Gene noch intakt sind. Der Klon, bei dem eine homologe Rekombination stattgefunden hat, wird 15-20x mit Spectinomycin in TSB-Medium passagiert und in Verdünnungs- stufen auf Spectinomycin-haltigen TSB-Platten ausplattiert. Die angewachsenen Einzelkolonien werden je auf Spectinomycin- und Apramycin-haltigen TSB-Platten ausgestrichen. Klone, die Spectinomycin resistent aber Apramycin sensitiv sind, haben eine zweite homologe Rekombination durchgeführt. Dabei wurde das zu deletierende Gen gegen die Spectinomycin-Resistenzkassette ausgetauscht. Die Rekombinationsergebnisse müssen mittels PCR überprüft werden.
II.2.4.7.2 Geninaktivierung durch CRISPR-Cas9
Durch die Verwendung der Cas9-Endonuklease können Rekombinationsereignisse beschleunigt werden. Dazu muss eine 120 Basen lange sgRNA (single guide RNA) kloniert werden. Davon müssen die ersten 20 Basen homolog zu einem internen Bereich des zu deletierenden Gens sein, die mit einer PAM-Sequenz von GCC endet. Wird die sgRNA in einer Zelle gebildet und bindet an den homologen Bereich, erkennt die Cas9-Endonuklease die spezifische Tertiärstruktur des sgRNA-Kernbereichs und macht einen Doppelstrangbruch. Die Zelle versucht den Doppelstrangbruch wieder zu reparieren. Werden zusätzlich Fragmente (je etwa 1 kb), upstream und downstream des zu deletierenden Gens, in einen Vektor kloniert, kann sich die Zelle mithilfe eines Doppel-Crossovers retten. Liegen keine homologen Bereiche vor, werden weitere Basen abgeschnitten und die DNA wird wieder ligiert (non- homologous end-joining). Dabei können einzelne bis mehrere kb ausgeschnitten werden.
In dieser Arbeit wurde nach dem Protokol nach Tong et al., 2015 vorgegangen. Die Gene foxBI, foxEI und foxEII sollten in S. diastatochromogenes deletiert werden. Dazu wurden die 20 Basen-sgRNA- Bereiche mithilfe des Programms CHOPCHOP bestimmt und geeignete Primer abgeleitet. Dabei wurde 5'terminal eine NcoI-Schnittstelle eingefügt, gefolgt von den 20 b homologen Bereich, der auf GCC endet, und die Kernsequenz angefügt. Die sgRNA wurde mittels PCR amplifiziert und in den
58 Materialien und Methoden
Vektor pCRISPR-Cas9 (geschnitten mit NcoI / SnaBI) kloniert. Die homologen Bereiche werden über die StuI-Schnittstelle eingefügt. Die fertige Vektoren pCRISPR-foxBI (Abb. 23), pCRISPR-foxEI (Abb. 24) und pCRISPR-foxEII (Abb. 25) mit je Upstream, Downstream und sgRNA können nun mittels Konjugation in den Streptomyceten-Stamm ∆pokOIV transferiert und positive Exkonjugaten mittels Kanamycin selektiert werden. Die Exkonjugaten werden anschließend in 100 mL TSB-Medium inkubiert und die Expression der Cas9-Nuklease mittels Zugabe von Thiostrepton induziert.
II.2.4.8 (Über)expression und heterologe Expression von Genen
II.2.4.8.1 Komplementierung von Geninaktivierungen in Actinomyceten
Nach einer Geninaktivierung sollte man durch anschließende Komplementierung sicherstellen, dass es neben der Deletion eines bestimmten Gens zu keiner weiteren Beeinflussung in der Zelle gekommen ist. Solche polaren Effekte können auftreten, wenn sich das Gen zum Beispiel in einem Operon befindet und mit anderen Genen kotranskribiert wird. Um das auszuschließen, sollte man den Gendefekt anschließend wieder mit einer zusätzlichen Kopie des Gens komplementieren. Die komplementierte Mutante sollte wieder die ursprüngliche Fähigkeit des Wildtyps aufweisen. Zur Komplementierung wurden in dieser Arbeit die Vektoren pTESb und pUWL-T verwendet.
II.2.4.8.2 Heterologe Expression von Genen zur kombinatorischen Biosynthese in Strepto- myceten
Um neue aktive Substanzen durch kombinatorische Biosynthese zu erhalten, wurden in dieser Arbeit artfremde Gene in den Vektor pTESb kloniert und mittels Konjugation in den Streptomyceten transferiert. Die Mutante könnte durch die Expression der Gene neue Fähigkeiten erlangen, wie die Produktion neuer/veränderter Sekundärmetabolite.
II.2.4.8.3 Heterologe Expression von Genen in E. coli
Zur gezielten Untersuchung von einzelnen Genen können diese in speziellen E. coli-Stämme exprimiert und nach der Aufreinigung weiter untersucht werden. Dazu muss das Gen in einen geeigneten Vektor kloniert werden. Die Anwesenheit eines Tags erleichtert die anschließende Aufreinigung mit kommerziellen Systemen. Der fertige Vektor wird mittels Transformation in den Produktionsstamm gebracht. In dieser Arbeit wurde das A-Domäne-kodierende Gen foxBI der Foxicin-Biosynthese in den Vektor pET28a kloniert und in verschiedenen E. coli-Stämmen über- exprimiert.
II.2.4.8.3.1 Testexpression
Die Testexpression dient der Analyse geeigneter E. coli - Produktionsstämmen sowie zur Überprüfung der optimalen Kultivierungsbedingungen. Dabei werden neben unterschiedlichen Stämmen auch
59 Materialien und Methoden verschiedene Inkubationszeiten (6-72 h), -Temperaturen (18 °C, 28 °C oder 37 °C), IPTG- Konzentration (0,1 - 0,5 mM) und Medienzusammensetzung (LB, Autoinduktionsmedium) ausge- testet.
Der Vektor mit dem zu exprimierenden Gen wird in den E. coli - Produktionsstamm transferiert und die Vorkultur in 10 mL LB-Medium ü.N. bei 37 °C, schüttelnd inkubiert. Am nächsten Tag werden 100 mL Produktionsmedium mit 1 mL Vorkultur angeimpft. In LB-Medium wird die Hauptkultur bei
37 °C bis zu einer OD578nm von 0,6 inkubiert und die Expression durch Zugabe von IPTG induziert. Die Kultur wird unter verschiedenen Bedingungen (Temperatur und Dauer) inkubiert. Bei 37 °C lässt man die Kultur gewöhnlich 4-8 h, bei 28 °C für 10-16 h und bei 18 °C für 16-40 h inkubieren. In Autoinduktionsmedium muss die Expression durch Anwesenheit von Glucose und Lactose nicht induziert werden. Nach Metabolisierung der Glucose für hauptsächlich Zellaufbau und -teilung, wird bei nachfolgender Metabolisierung der Lactose die Expression gestartet. Im Autoinduktionsmedium konnen aufgrund der hohen Zucker-Konzentration eine höhere Zelldichte erreicht werden. Bei 18 °C Temperatur kann man die Zellen bis zu 72 h inkubieren. Von der Hauptkultur werden nach unter- schiedlichen Zeiten jeweils 1 mL Kultur entnommen, abzentrifugiert, das Pellet in H2O und SDS- Ladepuffer gelöst und mittels SDS-PAGE analysiert. Nach Analyse der SDS-Gele können die optimalen Bedingungen bestimmt werden.
II.2.4.8.3.2 Expression im großen Maßstab
Nach Bestimmung der optimalen Bedingungen wird der Expressionsvektor in den bestimmten E. coli - Produktionsstamm transferiert und die 100 mL LB-Vorkultur ü.N. bei 37 °C, schüttelnd inkubiert. Am nächsten Tag werden 1 – 5 L Medium 1:100 mit der Vorkultur angeimpft und entsprechend inkubiert.
60 Materialien und Methoden
II.2.4.9 Klonierungsarbeiten dieser Arbeit Im Folgenden werden die Klonierungsarbeiten, die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurden, beschrieben.
II.2.4.9.1 Klonierung vom Single-Crossover-Vektor pKCLP2_gusA_PKS11 zur Unter- brechung des Cluster 11 in Actinokineospora bangkokensis 44EHWT
Zur Bestätigung, dass das Cluster 11 aus Actinokineospora bangkokensis für die Biosynthese von Thailandin verantwortlich ist, sollte das PKS-Gen thaBI durch einen Single-Crossover unterbrochen werden. Dafür wurde ein 3059 bp großes, homologes Fragment mit den Primern PKS11'-for / PKS11'- rev mittels PCR [Pfu-Pol; 98 °C – 2 min; (98 °C – 30 sek; 60 °C – 30 sek; 72 °C – 6 min) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C] amplifiziert und in den Vektor pUC19 zwischenkloniert. Von einem richtigen Klon wurde Plasmid-DNA isoliert und zur weiteren Kontrolle wurde das Insert sequenziert. Nach Bestätigung der richtigen Sequenz wurde das homologe Fragment mit dem Restriktionsenzym PstI im größeren Maßstab herausgeschnitten und in den Endvektor pKCLP2_gusA kloniert. Der Single- Crossover-Vektor pKCLP2_gusA_PKS11 (siehe Abb. 15) wurde in E. coli ET12567 pUB308 transferiert und mittels Konjugation in A. bangkokensis gebracht.
oriT HygroR
gusA
rep pUC pKCLP2_gusA_PKS11 8969 bps Abb. 15: Plasmidkarte von pKCLP2_gusA_PKS11 und tipA Durchführung der Inaktivierung des tha-Biosynthesegen- lacZa' PstI ‘lacZa clusters in A. bangkokensis R PstI Rep pUC: Replikationsursprung; Hygro : Hygromycin- Homologes Fragment thaBI’ Resistenz; oriT: origin of transfer; gusA: -Glukuronidase; tip A: Thiostrepton-induzierbarer Promotor; lacZa: α-Untereinheit der -Galaktosidase; gelbes Fragment: homologer Bereich zu PKS-Gen thaBI wurde über PstI-Schnittstellen eingebracht; Single-Crossover mit Thailandin-Gencluster (unten) dargestellt.
II.2.4.9.2 Klonierung vom Doppel-Cross-Vektor pKC1132_DC_pokMs zur Deletion von pokM1, pokM2, pokM3 und pokMT1 in S. diastatochromogenes Tü6028
Um die vier Gene pokM1, pokM2, pokM3 und pokMT1 im Genom von S. diastatochromogenes Tü6028 zu deletieren, sollten sie durch einen Double-Crossover mit einer Spectinomycin- Resistenzkassette ausgetauscht werden. Dazu wurde das Up-Fragment (2075 bp) mit den Primern 5'Up-pokM/ 3'Up-pokM [Vel-Pol; 98 °C – 2 min; (98 °C – 30 sek; 66 °C – 30 sek; 72 °C – 1 min) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C], das Down-Fragment (2099 bp) mit den Primern 5'Down-pokM / 3'Down- pokM [Vel-Pol; 98 °C – 2 min; (98 °C – 30 sek; 68 °C – 30 sek; 72 °C – 1 min) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C] und die SpecR-Kassette (791 bp) mit 5' Spec / 3' Spec [Phusion-Pol; 98 °C – 2 min; (98 °C – 30 sek; 60 °C – 30 sek; 72 °C – 1 min) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C] mittels PCR amplifiziert. Um
61 Materialien und Methoden ausreichende Mengen und eindeutig geschnittene Fragmente zu bekommen, wurden die PCR-Produkte in den kommerziellen Vektor pUC19 (geschnitten mit SmaI) zwischenkloniert. Das Up-Fragment wurde mit HindIII und PstI geschnitten und in pKC1132 kloniert. Nach Plasmid-Isolation durch Minipräparation und Testverdau konnte die Ligation des Up-Fragments als richtig bestätigt werden. Anschließend wurde das Down-Fragment, geschnitten mit XbaI und EcoRI, in den Vektor pKC1132_Up ligiert. Ein Testverdau mit verschiedenen Restiktionsenzymkombinationen, sowie die anschließende Sequenzierung bestätigten die korrekte Klonierung des Up- und Down-Fragments in den pKC1132-Vektor. Als letzten Schritt wurde die Spectinomycin-Resistenzkassette nach Verdau mit PstI und EcoRV zwischen das Up- und Down-Fragment kloniert. Der fertige Vektor pKC1132_DC_pokMs (siehe Abb. 16) wurde mittels Konjugation in S. diastatochromogenes Tü6028 transferiert.
ApraR
Abb. 16: Plasmidkarte pKC1132-DC- HindIII ‚lacZ pokMs und Durchführung der Deletion von pokM1,2,3,MT1 in S. diastatochromo- lacZ EcoRI pokS4' genes Tü6028 pKC1132-DC-pokMs oriT: origin of transfer; ApraR: Apramycin- pokP2' 8050 bps Resistenz; lacZ: α-Untereinheit der - Up- Down- Galaktosidase; Down-Fragment (blau): Fragment Fragment DNA-Bereich downstream von den pokM- Genen mit pokP1 und Teil von pokP2; pokS3 SpecR: Spectinomycin-Resistenz; Up- PstI XbaI Fragment (gelb): DNA-Bereich upstream EcoRV von den pokM-Genen mit pokS3 und Teil 'pokM3 von pokS4; Doppel-Crossover der pokM- SpecR Gene des Polyketomycin-Genclusters (unten) dargestellt.
II.2.4.9.3 Klonierung vom Doppel-Cross-Vektor pKC1132_DC_aviNM zur Deletion von aviN und aviM in S. viridochromogenes Tü57
Um die zwei Gene aviN und aviM im Genom von S. viridochromogenes Tü57 zu deletieren, sollten sie durch einen Double-Crossover mit einer Spectinomycin-Resistenzkassette ausgetauscht werden. Dazu wurde das Up-Fragment (2114 bp) mit den Primern Up-aviNM-for/-rev [Phusion-Pol; 98 °C – 2 min; (98 °C – 30 sek; 60 °C – 45 sek; 72 °C – 1 min) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C], das Down-Fragment (2103 bp) mit den Primern Down-aviNM-for/-rev [Phusion-Pol; 98 °C – 5 min; (98 °C – 30 sek; 60 °C – 30 sek; 72 °C – 30 sek) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C] und die SpecR-Kassette (1071 bp) mit Spec-for/- rev [Phusion-Pol; 98 °C – 5 min; (98 °C – 30 sek; 60 °C – 30 sek; 72 °C – 30 sek) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C] mittels PCR amplifiziert. Um ausreichende Mengen und eindeutig geschnittene Fragmente zu bekommen, wurden die PCR-Produkte in den kommerziellen Vektor pBSK- zwischenkloniert. Das Down-Fragment wurde mit XbaI und HindIII geschnitten und in den Endvektor pKC1132 kloniert. Nach Plasmid-Isolation durch Minipräparation und Testverdau konnte die Ligation des Down-
62 Materialien und Methoden
Fragments als richtig bestätigt werden. Anschließend wurde das Up-Fragment, geschnitten mit EcoRV und BamHI in den Vektor pKC1132_Down kloniert. Ein Testverdau mit verschiedenen Restiktionsenzymkombinationen und die anschließende Sequenzierung bestätigten die korrekte Ligation des Up- und Down-Fragments in den pKC1132-Vektor. Als letzten Schritt wurde die Spectinomycin-Resistenzkassette nach Verdau mit BamHI zwischen Up- und Down-Fragment kloniert. Der fertige Vektor pKC1132_DC_aviNM (siehe Abb. 17) wurde mittels Konjugation in S. viridochromogenes Tü57 transferiert.
ApraR
rep pUC oriT
EcoRV lacZa' ‘lacZa 'aviG1 HindIII Abb. 17: Plasmidkarte pKC1132_DC_aviNM und Durchführung der Deletion von aviN und aviM in pKC1132_DC_aviNM aviE1' S. viridochromogenes Tü57 8619 bps rep pUC: Replikationsursprung; ApraR: Apramycin- Up- Down- Resistenz; oriT: origin of transfer; lacZa: α-Untereinheit Fragment Fragment der -Untereinheit der -Galaktosidase; Down-Fragment (blau): DNA-Bereich downstream von den aviNM-Genen aviJ R aviD mit aviD und Teil von aviE1; Spec : Spectinomycin- SpecR Resistenz; Up-Fragment (gelb): DNA-Bereich upstream von den aviNM-Genen mit aviJ und Teil von aviG1; BamHI BamHI Doppel-Crossover der aviNM-Gene des Avilamycin- XbaI Genclusters (unten) ist dargestellt.
II.2.4.9.4 Klonierung von pTESb_pokM123
Zur Komplementierung von S. diastatochromogenes ∆pokMs, sowie zur kombinatorischen Biosyn- these von S. viridochromogenes ∆aviNM, sollten die Gene pokM1, pokM2 und pokM3 in die jeweiligen Stämme eingebracht werden. Dazu wurden die Gene (7942 bp) mit den Primern DMSA- Komp-for/-rev mittels PCR [Phusion-Pol; 98 °C – 5 min; (98 °C – 30 sek; 69,5 °C – 45 sek; 72 °C – 5 min) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C] amplifiziert und in den Vektor pUC19 zwischenkloniert. Nach Plasmid-Isolation durch Minipräparation und Testverdau konnte die Klonierung bestätigt werden. Das Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen XbaI/EcoRI herausgeschnitten und in den Endvektor pTESb kloniert. Der fertige Vektor pTESb_pokM123 (siehe Terminator loxP EcoRI Abb. 18) wurde über Konjugation in S. diastatochromogenes phiC31-Integrase 'lacZa ∆pokMs und S. viridochromogenes ∆aviNM transferiert. intp oriT pokM3
pTESb_pokM123 ApraR 14438 bps Abb. 18: Plasmidkarte von pTESb_pokM123 ColE1ori: Replikationsursprung; ApraR: Apramycin-Resistenz; oriT: origin of transfer; ColE1ori phiC31-Integrase: integriert Vektor an Attachmentsites in das Genom eines Strepto- pokM1 myceten; loxP: Erkennungssequenzen für Cre-Rekombinase; lacZa: -Untereinheit der attp α loxP ermEp1 -Galaktosidase, ermEp1: starker konstitutiver Promotor; Terminator: terminiert Terminator ‘lacZ' Transkription von vorigen Genen; rot: pokM2, pokM1 und pokM3, kloniert über XbaI pokM2 XbaI und EcoRI.
63 Materialien und Methoden
II.2.4.9.5 Klonierung von pTESb_aviNM
Zur Komplementierung von S. viridochromogenes ∆aviNM, sowie zur kombinatorischen Biosynthese von S. diastatochromogenes ∆pokMs, sollten die Gene aviN und aviM in die jeweiligen Stämme einge- bracht werden. Dazu wurden die Gene mit den Primern aviNM-for/-rev mittels PCR [Vel-Pol; 98 °C – 2 min; (98 °C – 30 sek; 63 °C – 30 sek; 72 °C – 1 min) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C] amplifiziert (4950 bp) und in den Vektor pUC19 zwischenkloniert. Nach Plasmid-Isolation durch Minipräparation und Testverdau konnte die Klonierung bestätigt werden. Das Fragment wurde mit den Restriktions- enzymen XbaI und SpeI herausgeschnitten und in den Endvektor pTESb kloniert. Der fertige Vektor pTESb_aviNM (siehe Abb. 19) wurde über Konjugation in Terminator loxP SpeI S. viridochromogenes ∆aviNM und S. diastatochromogenes phiC31-Integrase 'lacZa ∆pokMs transferiert. intp oriT
pTESb_aviNM aviM 11457 bps
Abb. 19: Plasmidkarte von pTESb_aviNM ApraR ColE1ori: Replikationsursprung; ApraR: Apramycin-Resistenz; oriT: origin of transfer; phiC31-Integrase: Enzym integriert Vektor an Attachmentsites in das Genom eines ColE1ori Streptomyceten; loxP: Erkennungssequenzen für Cre-Rekombinase; lacZa: α-Unter- aviN einheit der -Galaktosidase, ermEp1: starker konstitutiver Promotor; Terminator: attp ‘lacZ' terminiert Transkription von vorigen Genen; rot: aviN und aviM, kloniert über XbaI loxP und SpeI. TerminatorermEp1XbaI
II.2.4.9.6 Klonierung von pUWL-T-pokS34U12 zur Komplementierung des Gendefekts in S. diastatochromogenes Tü6028
Da bei der doppelten Rekombination und daraus folgenden Deletion der pokM-Gene in S. diastato- chromogenes auch Teile von pokS3 herausrekombiniert wurden, sollte der Gendefekt komplemetiert werden. Dazu wurde pokS3 zusammen mit pokS4, pokU1 und pokU2 mittels PCR [Phusion-Pol; 98 °C – 2 min; (98 °C – 30 sek; 61 °C – 30 sek; 72 °C – 3 min) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C] unter Verwendung der Primer S34U12-for/-rev amplifiziert. Das 4140 bp große Fragment wurde in den pUC19-Vektor zwischenkloniert. Nach Kontrollverdau und -Sequenzierung wurde das Fragment mit XbaI und EcoRI geschnitten und in den Vektor pUWL-T kloniert. Das fertige Konstrukt pUWL-T-
EcoRI pokS34U12 (siehe Abb. 20) wurde über Konjugation in ermEp1
ermEp2 S. diastatochromogenes ∆pokMs transferiert. pokS3
pokS4
ori pokU1 pUWL-T-pokS34U12 11527 bps pokU2 ThioR Abb. 20: Plasmidkarte von pUWL-T-pokS34U12 ColE1ori: Replikationsursprung; 'fd ter: terminiert Transkription von vorigen Genen; R 'fd ter XbaI Thio : Thiostrepton-Resistenz; ColE1ori: Replikationsursprung; ermEp1/2: starker konstitutiver Promotor; zu komplementierende Gene: pokS3 und pokS4 (gelb), pokU1 ColE1ori oriT und pokU2 (violett); kloniert über EcoRI und XbaI; oriT: origin of transfer; blaμ - bla Lactamase.
64 Materialien und Methoden
II.2.4.9.7 Klonierung des Single-Crossover-Vektor pKC1132_SC_foxBII zur Unterbrechung des Foxicin-Biosynthese-Genclusters in S. diastatochromogenes Tü6028
Zur Bestätigung des fox-Biosynthese-Genclusters sollte das PKS/NRPS-Hybridgen foxBII durch einen Single-Crossover unterbrochen werden. Dazu wurde ein 1773 bp großes internes Fragment mittels PCR [Vel-Pol; 98 °C – 2 min; (98 °C – 30 sek; 70 °C – 45 sek; 72 °C – 1 min) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C] mit den Primern 5'foxBII/3'foxBII amplifiziert und mit oriT den Enzymen HindIII und BamHI geschnitten. Anschließend ApraR wurde das geschnittene Fragment in den Endvektor pKC1132 (geschnitten mit HindIII/BamHI) kloniert und der Vektor ‘lacZa pKC1132_SC_foxBII (siehe Abb. 21) über Konjugation in pKC1132_SC_foxBII 5374 bps S. diastatochromogenes ∆pokOIV transferiert. rep pUC
lacZa' foxBII' Abb. 21: Plasmidkarte von pKC1132_SC_foxBII und Durchführung der Inaktivierung des fox-Biosynthesegenclusters in S. diastatochromogenes rep pUC: Replikationsursprung; ApraR: Apramycin-Resistenz; oriT: origin of transfer; lacZaμ α-Untereinheit der -Galactosidase; foxBII': internes foxBII-Fragment, kloniert über HindIII und BamHI; Single-Crossover mit Foxicin-Gencluster (unten) dargestellt. foxBII
II.2.4.9.8 Klonierung des Single-Crossover-Vektor pKC1132_SC_foxA zur Unterbrechung des N-Acetyltransferasegens foxA in S. diastatochromogenes Tü6028
Um die Funktion der putativen Acetyltransferase FoxA zu untersuchen, sollte das Gen foxA in S. diastatochromogenes ΔpokOIV durch einen Single-Crossover unterbrochen werden. Dazu wurde ein 722 bp großes, internes Fragment mittels PCR [Phusion-Pol; 98 °C – 2 min; (98 °C – 30 sek; 58 °C – 45 sek; 72 °C – 1 min) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C] und den Primern 5'foxA/3'foxA amplifiziert und in den Vektor pBSK- kloniert. Nach Kontrollverdau und -Sequenzierung wurde das Fragment anschließend mit BamHI und HindIII herausgeschnitten und in den Endvektor pKC1132 kloniert. Der fertige Vektor pKC1132_SC_foxA (siehe Abb. 22) wurde mittels Konjugation in S. diastatochromo- genes ΔpokOIV gebracht. ApraR
oriT
rep pUC pKC1132_SC_foxA 4382 bps
'lacZa lacZa' HindIII BamHI foxA' Abb. 22: Plasmidkarte von pKC1132_SC_foxA und Durchführung der Inaktivierung von foxA in S. diastatochromogenes rep pUC: Replikationsursprung; ApraR: Apramycin-Resistenz; oriT: origin of transfer; lacZaμ α-Untereinheit der -Galactosidase; foxA': internes foxA-Fragment, kloniert über HindIII und BamHI; Single-Crossover mit Foxicin-Gencluster (unten) foxA dargestellt.
65 Materialien und Methoden
II.2.4.9.9 Klonierung von pCRISPR-foxBI
Das Gen foxBI sollte in S. diastatochromogenes ΔpokOIV durch einen präzisen Doppel-Crossover deletiert werden. Dazu wurde die sgRNA mit den Primern sgRNA-foxBI/sgRNA-rev mittels PCR [Pfu-Pol; 98 °C – 2 min; (98 °C – 30 sek; 72 °C – 1 min) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C] amplifiziert (123 bp) und in den Vektor pUC19 zwischenkloniert. Nach Kontrollverdau und -Sequenzierung wurde die sgRNA mit den Enzymen NcoI und SnaBI herausgeschnitten und in den Vektor pCRISPR-Cas9 kloniert. Ein 986 bp großes Upstream-Fragment und ein 1043 bp großes Downstream-Fragment von foxBI wurde jeweils mittels PCR amplifiziert: Up-Fragment mit Up-foxBI-for/-revCRISPR [Pfu-Pol; 98 °C – 2 min; (98 °C – 30 sek; 64 °C – 40 sek; 72 °C – 2 min) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C], Down-Fragment mit Down-foxBI-for/-revCRISPR [Pfu-Pol; 98 °C – 2 min; (98 °C – 30 sek; 66 °C – 40 sek; 72 °C – 2 min) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C]. Das Up-Fragment wurde in den Vektor pBSK- und das Down-Fragment in pUC19 zwischenkloniert. Nach Kontrollverdau und -Sequenzierung wurden das Down-Fragment mit EcoRI und PstI geschnitten und in pBSK-Up (geschnitten mit EcoRI/PstI) kloniert. Die zwei Fragmente wurden anschließend mit EcoRV ausgeschnitten und in den Vektor pCRISPR-Cas9- sgRNA (geschnitten mit StuI) kloniert. Der fertige
rep ApraR Vektor pCRISPR-foxBI (siehe Abb. 23) kann nun in S. diastatochromogenes ∆pokOIV mittels Konjug- ThioR ation transferiert werden. sgRNA NcoI pCRISPR-foxBI -foxBI SnaBI foxBII' 13406 bps Down
EcoRI Abb. 23: Plasmidkarte von pCRISPR-foxBI ThioR: Thiostrepton-Resistenz; rep: Replikationsursprung; ApraR: Apramycin- Up foxGI' cas9 Resistenz, sgRNA-foxBI, kloniert über NcoI/SnaBI; cas9: Endonuklease Cas9; Upstreamfragment (blau) mit Teil des foxGI-Gens, Downstreamfragment (gelb) mit Teil des foxBII-Gens.
II.2.4.9.10 Klonierung von pCRISPR-foxEI
Das Gen foxEI sollte in S. diastatochromogenes ΔpokOIV durch einen präzisen Doppel-Crossover deletiert werden. Dazu wurde die sgRNA mit den Primern sgRNA-foxEI / sgRNA-rev mittels PCR [Phusion-Pol; 98 °C – 2 min; (98 °C – 30 sek; 72 °C – 1 min) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C] amplifiziert (122 bp) und in den Vektor pUC19 zwischenkloniert. Nach Kontrollverdau und -Sequenzierung wurde die sgRNA mit den Enzymen NcoI und SnaBI herausgeschnitten und in den Vektor pCRISPR-Cas9 kloniert. Ein 1096 bp großes Upstream-Fragment und ein 970 bp großes Downstream-Fragment von foxEI wurde jeweils mittels PCR amplifiziert: Up-Fragment mit Up-foxEI-for/-revCRISPR [Phusion-Pol; 98 °C – 2 min; (98 °C – 30 sek; 63°C – 40 sek; 72 °C – 30 sek) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C], Down-
Fragment mit Down-foxEI-for/-revCRISPR [Phusion-Pol; 98 °C – 2 min; (98 °C – 30 sek; 60°C – 40 sek; 72 °C – 30 sek) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C]. Das Up-Fragment wurde in den Vektor pBSK- und das Down-Fragment in pUC19 zwischenkloniert. Nach Kontrollverdau und -Sequenzierung wurden das Down-Fragment mit EcoRI und PstI geschnitten und in pBSK-Up (geschnitten mit EcoRI/PstI)
66 Materialien und Methoden kloniert. Die zwei Fragmente wurden anschließend mit EcoRV ausgeschnitten und in den Vektor pCRISPR-Cas9-sgRNA (geschnitten mit StuI) kloniert. Der fertige Vektor pCRISPR-foxEI (siehe Abb. 24) kann nun über Konjugation in S. diastatochromogenes ΔpokOIV transferiert werden.
rep ApraR
ThioR sgRNA NcoI SnaBI pCRISPR-foxEI -foxEI
foxEII 13366 bps Down
KpnI foxBIII' Abb. 24: Plasmidkarte von pCRISPR-foxEI ThioR: Thiostrepton-Resistenz; rep: Replikationsursprung; ApraR: Apramycin- Up cas9 Resistenz, sgRNA-foxBI, kloniert über NcoI/SnaBI; cas9: Endonuklease Cas9; Upstreamfragment (blau) mit Teil des foxBIII-Gens; Downstreamfragment (gelb) mit Teil des foxEII-Gens.
II.2.4.9.11 Klonierung von pCRISPR-foxEII
Das Gen foxEII sollte in S. diastatochromogenes ΔpokOIV durch einen präzisen Doppel-Crossover deletiert werden. Dazu wurde die sgRNA mit den Primern sgRNA-foxEII / sgRNA-rev mittels PCR [Phusion-Pol; 98 °C – 2 min; (98 °C – 30 sek; 72 °C – 1 min) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C] amplifiziert (123 bp) und in den Vektor pUC19 zwischenkloniert. Nach Kontrollverdau und -Sequenzierung wurde die sgRNA mit den Enzymen NcoI und SnaBI herausgeschnitten und in den Vektor pCRISPR-Cas9 kloniert. Ein 1095 bp großes Upstream-Fragment und ein 1086 bp großes Downstream-Fragment von foxEII wurde jeweils mittels PCR amplifiziert: Up-Fragment mit Up-foxEII-for/-revCRISPR [Phusion-Pol; 98 °C – 2 min; (98 °C – 30 sek; 60 °C – 40 sek; 72 °C – 30 sek) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C], Down-
Fragment mit Down-foxEII-for/-revCRISPR [Phusion-Pol; 98 °C – 2 min; (98 °C – 30 sek; 65 °C – 40 sek; 72 °C – 30 sek) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C]. Das Up-Fragment wurde in den Vektor pBSK- und das Down-Fragment in pUC19 zwischenkloniert. Nach Kontrollverdau und -Sequenzierung wurden das Up-Fragment mit EcoRI und KpnI geschnitten und in pUC19-Down (geschnitten mit EcoRI/KpnI) kloniert. Die zwei Fragmente wurden anschließend mit EcoRV ausgeschnitten und in den Vektor pCRISPR-Cas9-sgRNA (geschnitten mit StuI) kloniert. Der fertige Vektor pCRISPR-foxEII (siehe Abb. 25) kann nun über Konjugation in S. diastato-
rep ApraR chromogenes ΔpokOIV transferiert werden.
ThioR sgRNA NcoI pCRISPR-foxEII -foxEII SnaBI 'foxTVII 13505 bps Down foxTVI Abb. 25: Plasmidkarte von pCRISPR-foxEII KpnI ThioR: Thiostrepton-Resistenz; rep: Replikationsursprung; ApraR: Apramycin- 'foxEI Resistenz, sgRNA-foxEII, kloniert über NcoI/SnaBI; cas9: Endonuklease Cas9; Up cas9 Upstreamfragment (blau) mit Teil des foxEI-Gens, Downstreamfragment (gelb) mit foxTVI und Teil des foxTVII-Gens.
67 Materialien und Methoden
II.2.4.9.12 Klonierung von pOJ436_Up_Down_fox
Um das fox-Gencluster heterolog in einem anderen Wirt zu exprimieren, sollten es über eine doppelte Rekombination mithilfe von linear-linear homologe Rekombination in den Vektor pOJ436 kloniert werden. Dazu wurde je ein homologes Fragment, upstream und downstream, des fox-Clusters mittels PCR amplifiziert. Das 953 bp große Up-Fragment wurde mit den Primer Up-fox-for/-rev [Vel-Pol; 98 °C – 2 min; (98 °C – 30 sek; 67 °C – 30 sek; 72 °C – 30 sek) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C] und das 2416 bp große Down-Fragment mit den Primern Down-fox-for/-rev [Vel-Pol; 98 °C – 2 min; (98 °C – 30 sek; 64 °C – 30 sek; 72 °C – 1 min) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C] vervielfältigt. Die Fragmente wurden je in den pUC19-Vektor zwischenkloniert. Nach Plasmid-Isolation durch Minipräparation und Testverdau konnte eine erfolgreiche Klonierung sowie die richtige Orientierung einiger Klone bestätigt werden. Nach Bestätigung der richtigen Sequenz durch Sequenzierung wurde das Up- Fragment mit KpnI/SpeI und das Down-Fragment mit BamHI/XbaI aus pUC19 herausgeschnitten und nacheinander in den Endvektor pOJ436 kloniert. Der fertige Vektor pOJ436_Up_Down_fox (siehe
Abb. 26) wurde mittels präparativen Verdau mit XbaI BamHI/SpeI linearisiert und damit die LLHR in E. coli Down (II.2.4.6.1) durchgeführt.
BamHI foxTI SpeI ori
Up foxTX pOJ_Up_Down_fox KpnI 12912 bps
Abb. 26: Plasmidkarte von pOJ436_Up_Down_fox oriT ori: Replikationsursprung; oriT: Origin of Transfer, ApraR: Apramycin-Resistenz; Integrase: C31-Integrase mit Promotor; Upstream-Fragment (blau) mit foxTX; ApraR Downstream-Fragment (gelb) mit foxTI. Integrase promoter
II.2.4.9.13 Klonierung von pCAP01_Up_Down_fox
Da das fox-Gencluster mittels LLHR nicht kloniert werden konnte, sollte die Klonierung über die Transformations-assoziierte Rekombination mithilfe der Hefe durchgeführt werden. Dazu wurde das Up- und Down-Fragment mit KpnI/XbaI aus pOJ436_Up_Down (siehe Abb. 26) herausgeschnitten
KpnI und in den Vektor pCAP01 (geschnitten mit Cen6_ARS4 Up SpeI BamHI KpnI/SpeI) kloniert. Der Endvektor pCAP_ TRP1 foxTX
foxTI Up_Down_fox (siehe Abb. 27) wurde mit Down BamHI/SpeI linearisiert und damit TAR (II.2.4.6.2) pBR322_ origin durchgeführt. pCAP_Up_Down_fox SV40_PA_ 12373 bps XbaI terminator NLS SV40_int Abb. 27: Plasmidkarte von pCAP_Up_Down_fox C31 Integrase C31-Integrase: Enzym integriert Vektor in das Genom eines Streptomyceten; oriT: origin of Transfer; KanR: Kanamycin-Resistenz mit Promotor; pBR322_origin: Replikationsursprung; TRP1: KanR Tryptophan-Synthese; Cen6_ARS4: Replikation in Hefe; Upstream- KanR-Promotor Fragment (blau); Upstreamfragment (blau) mit foxTX; Downstream- oriT Fragment (gelb) mit foxTI. 68 Materialien und Methoden
II.2.4.9.14 Klonierung von pET28a_foxBI zur Überexpression von foxBI in E. coli
Um die A-Domäne FoxBI weiter zu untersuchen, sollte das Protein in E. coli überproduziert werden. Dazu wurde das Gen foxBI (1988 bp) mit den Primern foxBI-for/-rev mittels PCR vervielfältigt [Phusion-Pol; 98 °C – 2 min; (98 °C – 30 sek; 64 °C – 30 sek; 72 °C – 90 sek) x 32; 72 °C – 10 min; 4 °C] und in den Zwischenvektor pBSK- kloniert. Nach Plasmid-Isolation durch Minipräparation und Testverdau konnte eine erfolgreiche Klonierung sowie die richtige Orientierung einiger Klone bestätigt werden. Das Fragment wurde mit NdeI und EcoRI herausgeschnitten und in den Vektor pET28a kloniert. Der fertige Vektor pET28a_foxBI (siehe Abb. 28) wurde in verschiedene E. coli- Expressionsstämme transferiert. f1 origin EcoRI KanR 7000 foxBI 1000 6000 pET28a_foxBI 2000 7313 bps 5000 ori NdeI His6-Tag 3000 4000 lac-Operator T7-Promoter Abb. 28: Plasmidkarte von pET28a_foxBI f1 origin: Replikationsursprung; KanR: Kanamycin-Resistenz; lacI: LacI- Repressor; T7-Promotor; lac-Operator; foxBI: zu exprimierendes foxBI-Gen lacI mit His6-Tag, kloniert über NdeI- und EcoRI-Schnittstellen.
69 Materialien und Methoden
II.2.5 Aufreinigung und Analytik von Proteinen
II.2.5.1 Zellaufschluss Nach heterologer Expression von Genen in einem geeigneten E. coli-Produktionsstamm müssen die Zellen aufgeschlossen werden. Meist wählt man eine Kombination von verschiedenen Vorgehens- weisen. Dazu werden die Zellen abzentrifugiert (5000 - 10000 Upm, 10 min, 4 °C) und in einem geringen Volumen an Lysepuffer resuspendiert und wie folgt weiter vorgegangen. Das Arbeiten auf Eis ist erforderlich, um die Denaturierung des Proteins zu verhindern. Zusätzlich unterbindet es die Aktivität vorhandener Proteasen, das weiterhin durch Zugabe von Protease-Inhibitoren gefordert wird. Das Dazupipettieren von DNase macht den Ansatz durch Verdau von DNA weniger viskos. Nach Zellaufschluss werden die unlöslichen Zellbestandteile abzentrifugiert (14000 - 20000 Upm, 30 min, 4 °C) und die Proteine im Überstand weiter aufgereinigt.
II.2.5.1.1 Mechanischer Zellaufschluss durch French-Pressure Cell Press Die abzentrifugierten Zellen aus 1-3 L Produktionskultur werden in 20 mL Lysepuffer resuspendiert und anschließend dreimal durch die vorgekühlte French-Press bei 1000 psi passagiert.
II.2.5.1.2 Mechanischer Zellaufschluss durch Ultraschall Die Zellen werden in 20 mL Lysepuffer auf Eis resuspendiert und 5 x 1 min mittels Bandelin Sonopuls durch Ultraschall aufgeschlossen.
II.2.5.1.3 Enzymatischer Zellaufschluss durch Lysozymverdau Kleine Kulturmengen können durch Zugabe von Lysozym (0,5 µg/mL) und anschließender Inkubation für 30 min auf Eis aufgeschlossen werden. Für größere Zellmengen wird der enzymatische Zellauf- schluss hauptsächlich in Kombination mit French-Press oder Ultraschall verwendet. Dazu werden die Zellen in Lysepuffer resuspendiert, eine Spatelspitze Lysozym dazugegeben und weiter verfahren.
II.2.5.2 Aufreinigung von His6-getaggten Proteinen mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie
Heterolog produzierte Proteine mit einem His6-Tag lassen sich über eine Ni-NTA-Affinitäts- chromatographie aufreinigen.
II.2.5.2.1 Aufreinigung kleiner Mengen an His6-getaggten Proteinen Proteine aus 100 mL E. coli - Kultur werden manuell über eine kleine Ni-NTA-Säule aufgereinigt. Dazu werden die Zellen abzentrifugiert (5000 Upm, 10 min, 4 °C) und das Pellet in 4 mL Lysepuffer resuspendiert. Nach Zugabe einer Spatelspitze Lysozym wird der Ansatz für 30 min auf Eis inkubiert. Die aufgeschlossenen Zellen werden abzentrifugiert (14000 Upm, 20 min, 4 °C) und der Überstand in ein Schnappdeckelglas überführt. Von einer Ni-NTA-Suspension (in Lysepuffer) werden 1,5 mL hinzupipettiert und für 1 h auf Eis rührend inkubiert. Der Ansatz wird in eine leere Säule überführt und der Durchlauf aufgefangen. Die Säule wird mit 2 x 4 mL Waschpuffer gewaschen und das Protein mit
70 Materialien und Methoden
4 x 1 mL Elutionspuffer eluiert. Der Durchlauf, die Wasch- und Elutionsfraktionen werden über eine SDS-PAGE (II.2.5.3.1) analysiert.
II.2.5.2.2 Aufreinigung großer Proteinmengen über ÄKTA-FPLC Proteine aus 1 - 5 L E. coli - Kultur lassen sich über die ÄKTA-FPLC (engl. fast protein liquid chromatography) aufreinigen. Dazu wird die Kultur abzentrifugiert (10000 Upm, 15 min, 4 °C) und das Pellet in 20 - γ0 mL Puffer 1 resuspendiert. Nach Zugabe einer Spatelspitze Lysozym und 10 L DNase werden die Zellen dreimal durch die French-Press bei 1000 psi passagiert. Die aufge- schlossenen Zellen werden abzentrifugiert (20000 Upm, 30 min, 4 °C) und der Überstand über die FPLC auf die HisTrap-Säule geladen.
a) Konditionierung der Säule
Die Säule wird mit 5 Säulenvolumen H2O und anschließend 5 Säulenvolumen Puffer 1 äquilibriert. Die Flussrate beträgt 0,5 - 1 mL/min.
b) Durchführung der Chromatographie Nach Zellaufschluss und Abzentrifugation der unlöslichen Bestandteile wird der Überstand über den Superloop auf die Säule mit einer Flussrate von 0,3 - 0,5 mL/min aufgetragen. Anschließend werden nicht-gebundene Proteine mit 100 % Puffer 1 von der Säule gewaschen. Die Anwesenheit der Proteine, die von der Säule verdrängt werden, lässt sich durch Detektion bei 280 nm nachvollziehen. Bei Erreichen der Baseline wird mit weiteren 5 Säulenvolumen Puffer 1 gewaschen. Durch den Anstieg von Puffer 2 werden weitere Proteine von der Säule verdrängt. Dabei kann man einen linearen Gradienten (min. 20 Säulenvolumen) oder einen schrittweisen Anstieg (Beispiel: 10 %, 30 %, 50 %, 100 %, je 5 Säulenvolumen) an Puffer 2 wählen. Die verdrängten Proteine werden in je 10 mL Fraktionen oder manuell aufgefangen und mittels SDS-PAGE (II.2.5.3.1) analysiert.
c) Waschen und Lagerung der Säule
Nach Elution aller auf der Säule gebundenen Proteine wird die Säule mit je 5 Säulenvolumen H2O und EtOH (20 %) gewaschen. Die Flussrate beträgt 0,1 - 1 mL/min. Die Säule wird in EtOH (20 %) bei 4 °C gelagert.
d) Strippen der Säule Bei einer sichtbaren Veränderung der Säule nach dem Waschen bzw. nach etwa fünf Protein- Aufreinigungen sollte die Säule gestrippt werden. Dazu wird die Säule manuell mit der Spritze mit je min. 5-10 Säulenvolumen Strippingpuffer, Puffer 1 und H2O gewaschen und anschließend mit 2,5 mL
NiSO4 (0,1 M) wieder beladen. Daraufhin wird die Säule mit je 5 Säulenvolumen H2O, Puffer 1 und schließlich mit EtOH (20 %) gewaschen und in EtOH bei 4 °C gelagert.
71 Materialien und Methoden
II.2.5.3 Charakterisierung von Proteinen
II.2.5.3.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Mit Hilfe der SDS-PAGE (Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) können Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt werden (Laemmli, 1970). Dazu wird 1/6 Vol Ladepuffer zu den einzelnen Proben gegeben. Durch das Kochen der Proben werden Wasserstoffbrücken im Protein aufgebrochen und die Disulfidbrücken durch -Mercaptoethanol bzw. DTT reduziert, sodass sekundäre, tertiäre und quartäre Strukturen der Proteine zerstört werden. Das anionische Tensid Sodiumdodecyl-sulfat (SDS) lagert sich an die kationischen Reste der Proteine an und überlagert so deren Eigenladung. Die Wandergeschwindigkeit der Proteine im elektrischen Feld ist somit nicht mehr von der Eigenladung oder Faltung abhängig, sondern proportional zu deren Molekulargewicht. Das Molekulargewicht der unbekannten Proteine kann so mit Hilfe von Markerproteinen mit bekannter Größe bestimmt werden. Unter Anwendung von Tris/Glycin-Gelen können Proteine in einem relativ engen Molekulargewichtsbereich elektrophoretisch voneinander getrennt werden.
a) Gießen der Gele Die Glasplatten für die SDS-PAGE werden gründlich von Staub und Fett befreit und die Apparatur zusammengebaut. Es werden 50 mL eines 12 %iges Trenngels, welches Proteine zwischen 3-120 kDa auftrennt und 16 mL eines Sammelgels, welches die Proteine an der Front zum Trenngel aufkonzentriert, für vier Gele gleichzeitig angesetzt. Die Polymerisierungsreaktionen werden je mit den Radikalen Ammoniumpersulfat (APS) und Tetramethylethylendiamid (TEMED) gestartet. Zuerst wird das Trenngel in die Gelkammer gegossen und mit Isopropanol überschichtet, um eine planare Oberfläche zu erhalten und Luftblasen zu entfernen. Nach der Polymerisierung wird das Sammelgel aufgebracht. Ein Kamm wird in das noch flüssige Sammelgel gesteckt. Nach der Poly- merisierung des Sammelgels können die Gele für die Elektrophorese direkt eingesetzt oder bei 4-8 °C in mit Puffer getränkten Papiertüchern gelagert werden.
b) Durchführung Das Gel wird in die Apparatur gespannt und die Kammern mit Laufpuffer gefüllt. Pro Apparatur können zwei bis vier Gele gleichzeitig verwendet werden. Vor dem Auftragen der Proben werden 1/6 Vol Ladepuffer zu den Proteinen zugesetzt und diese 10 min bei 100 °C gekocht werden. In jede Tasche des Gels werden 2-30 µL einer Proteinprobe pipettiert (Pellet 2 µL, Überstand 2 µL, Durchlauf 3 µL, Waschschritt 30 µL, Eluat 30 µL). Zur späteren Größenbestimmung der aufgetrennten Proteine werden 6 µL eines Molekulargewichtstandards auf das Gel aufgetragen. Das Einlaufen der Proteine in das Sammelgel erfolgt bei 120 V. Während der Elektrophorese im Trenngel wird die Stromstärke auf 150 V erhöht. Die Auftrennung wird gestoppt, sobald die Lauffront des Bromphenolblaus das Ende des Gels erreicht hatte. Nach der Elektrophorese wird das Gel mit Coomassie-Brilliant-Blau gefärbt.
72 Materialien und Methoden c) Coomassie-Färbung Coomassie-Brilliant-Blau ist ein Triphenylmethanfarbstoff, der sich an basische Seitenketten von Aminosäuren anlagert und so unspezifisch Proteine anfärbt. Demnach kann der Farbstoff aufgetrennte Proteine im SDS-Polyacrylamid-Gel sichtbar machen. Nach der SDS-PAGE wird das Polyacrylamid- Gel 20-60 min unter leichtem Schütteln in Coomassie-Brilliant-Blau gefärbt und anschließend in Entfärbelösung wieder entfärbt. Unter Weißlichtbestrahlung kann das aufgetrennte Proteingemisch betrachtet, fotografiert und analysiert werden.
Protein Marker VI (10 - 245) prestained (AppliChem) in kDa: 11, 17, 20, 25, 35, 48, 63, 75, 100, 135, 180, 245
Protein Ladder (P7703) (NEB) in kDa: 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 250
II.2.5.3.2 Aufkonzentrierung und Konzentrationsbestimmung von Proteinen
Für nachfolgende Aktivitätsassays muss die Proteinprobe (meist mehrere mL) aufkonzentriert und die Konzentration bestimmt werden.
II.2.5.3.2.1 Aufkonzentrierung und Umpufferung von Proteinen
Für die Aufkonzentrierung der Proteinprobe sowie der Entfernung von Imidazol wurde in dieser Arbeit der Vivaspin 20 Konzentrator verwendet. Dazu wird die Probe in den Konzentrator überführt und solange zentrifugiert (5000 Upm, 4 °C) bis sich die Flüssigkeit im unteren Teil des Gefäßes befindet (30 min - 1 h). Das Protein wird mit Tris/HCl-Puffer von der Membran gewaschen.
II.2.5.3.2.2 Konzentrationsbestimmung
Die Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen kann über die Absorption bei 280 nm durchgeführt werden. Dazu wurde der Nanodrop 2000 verwendet. Über das ExPASy-Tool ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/) lassen sich die exakte molekulare Masse sowie der Extinktions- koeffizient bestimmen, die für die Berechnung der Konzentration notwendig sind.
II.2.5.3.3 in vitro Aktivitätsassays von der A-Domäne FoxBI
In dieser Arbeit wurde die Aktivität der A-Domäne FoxBI der Foxicin-Biosynthese bestimmt. Dazu wurde der Malachite-Assay sowie ein NADH/NAD+-gekoppelter Assay verwendet. In beiden
Ansätzen wird indirekt die Freisetzung von Pyrophosphat (PPi) gemessen. Bei der Aktivierung wird
AMP von ATP auf die Aminosäure übertragen, sodass ein PPi frei wird.
73 Materialien und Methoden
A-Domäne A Aminosäure Aminosäure-AMP
ATP PPi
Fructose-6P PPi + F-6P Kinase Pi + F-1,6-bP Aldolase Alkalische Malachite Green GlyceroP- PPi Phosphatase 2 Pi Detection Reagenz Dehydrogenase 2 Glycerol-3P DHAP + GAP
2 NAD+ 2 NADH B C TrioseP-Isomerase
Abb. 29: in vitro Aktivitätsassays von A-Domänen (A) Aktivierung einer Aminosäure durch die Übertragung von AMP; (B) Malachite Green Phosphatase Assay: das Pyrophosphat wird in Phosphat gespalten, das mit dem Malachite Green Detection Reagenz einen grünen Komplex bildet; (C) NADH/NAD+-gekoppelte Assay: über mehrere Reaktionen entsteht NAD+; A-Domäne: Adenylierungsdomäne; AMP: Adenosinmonophosphat; ATP: Adenosintriphosphat; DHAP: Dihydroxyacetonphosphat; F-1,6-bP: Fructose-1,6-bisphosphat; F-6P: Fructose-6-Phosphat; GAP: Glyceraldehyd-Phosphat; NAD:
Nicotinamidadenindinukleotid; Pi: Phosphat; PPi: Pyrophosphat.
II.2.5.3.3.1 Malachite Green Phosphatase Assay Beim Malachite Green Phosphatase Assay wird das durch Aktivierung der Aminosäure freiwerdende
PPi durch die alkalische Phosphatase zu einfachem Phosphat (Pi) gespalten, welches mit dem Malachite/Molybdate Green Reagenz einen grünen Komplex binden kann (siehe Abb. 29B). Diese Reaktion kann mit dem Spektrophotometer bei 620 nm nachverfolgt werden. Es wurde das Malachite Green Assay Kit von Echelon Biosciences Inc. (Salt Lake City, USA) verwendet.
Die aufgereinigte A-Domäne (0,5 µM) wurde mit 0,5 mM ATP und 1 mM verschiedene Aminosäuren für 30 min bei RT inkubiert. Anschließend wurden 0,5 µL alkalische Phosphatase (2000 U) hinzu pipettiert und 15 min bei RT inkubiert. Daraufhin wurden 10 µL DTT-Lösung und 100 µL Malachite /Molybdate Green Reagenz hinzugegeben. Der Ansatz wurde 30 min bei RT inkubiert und die Absorption bei 620 nm gemessen.
II.2.5.3.3.2 NADH/NAD+-gekoppelte Assay Bei dem NADH/NAD+-gekoppelten Assay wurde nach dem Protokol nach Kittilä et al., 2016 vorge- gangen. Dabei wird das durch Aktivierung der Aminosäure freiwerdende PPi durch die Fructose-6P- Kinase auf Fructose-6P übertragen. Das entstehende Fructose-1,6-bisphosphat wird von der Aldolase in Glyceraldehyd-Phosphat und Dihydroxyacetonphosphat gespalten. Das Glyceraldehyd-Phosphat kann über die Triosephosphat-Isomerase in Dihydroxyacetonphosphat umgewandelt werden. Die Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase katalysiert die Umwandlung von Dihydroxyaceton- phosphat zu Glyceraldehyd-Phosphat unter Verbrauch von NADH zu NAD+ (siehe Abb. 29C). Diese Reaktion kann mit dem Spektrophotometer bei 340 nm nachverfolgt werden.
Als Blank dient die Detektionslösung. Für den Assay werden 1 mL Detektionslösung mit 5 µM A-Domäne FoxBI in eine Küvette gegeben und 1 min bei RT inkubiert, danach wird 0,5 mM ATP
74 Materialien und Methoden dazu gegeben und weiter 2 min inkubiert. Dazu werden 10 mM verschiedene Aminosäuren pipettiert und die OD340nm über 15 min mit einem Intervall von 15 sek gemessen.
II.2.6 Produktion, Isolierung und Analytik von Sekundärmetaboliten
II.2.6.1 Produktion von Sekundärmetaboliten
Zur Untersuchung der Sekundärmetabolitproduktion von S. diastatochromogenes Tü6028, S. albus und dessen abgeleiteten Mutanten sowie Actinokineospora bangkokensis werden 4 mL einer gut angewachsenen Vorkultur in TSB-Medium zur Inokulation von 100 mL HA-Medium verwendet und für 3-10 Tage bei 28 °C im Schüttler inkubiert.
Zur maximalen Produktion von Avilamycin wird von S. viridochromogenes Tü57 zunächst eine Vor- kultur in HA-Medium angeimpft und bei 37 °C schüttelnd inkubiert. Am nächsten Tag werden 100 mL SG-Medium in 500 mL-Erlenmeyerkolben mit einer Schikane angeimpft und für 3 Tage bei 28 °C schüttelnd inkubiert.
In S. diastatochromogenes Tü6028 werden die Foxicine nach 2-5 Tagen gebildet. Danach wird hauptsächlich Polyketomycin produziert und die Foxicine sind kaum detektierbar. Für die Unter- suchung der Foxicin-Biosynthese wird S. diastatochromogenes ΔpokOIV verwendet. Diese Mutante produziert kein Polyketomycin mehr, sondern größere Mengen an Foxicin. Die beste Produktion von Foxicin ist nach 6 Tagen messbar.
Zur Isolierung einer Substanz müssen größere Kulturvolumina (3 - 10 L) angesetzt werden. Dazu wurden 300 mL Medium in 1 L Erlenmeyerkolben gefüllt und mit je 10 mL Vorkultur angeimpft.
II.2.6.2 Extraktion von Sekundärmetaboliten
Zur Extraktion von Naturstoffen wird die Bakterienkultur nach Kultivierung abzentrifugiert (10000 Upm, 15 min, RT). Der Überstand wird auf pH 4 angesäuert und mit Essigsäureethylester (EtAc) (1:1 V/V) extrahiert. Dabei wird das Gemisch für 20 min in horizontaler Ebene (180 Schwingungen pro min) geschüttelt und danach die filtierte organische Phase im Rotations- verdampfer bei max. 40 °C und 240 bar eingeengt. Die pelletierten Zellen werden mit der 2-3-fachen Menge an Aceton aufgeschlossen, um die intra- zellulären Naturstoffe freizusetzen. Nach 15-minütigem Schütteln wird das Gemisch abzentrifugiert (3000 Upm, 5 min, RT) und der Überstand mittels Rotationsverdampfer bei 340 bar getrocknet. Dieser Vorgang kann je nach Ausbeute wiederholt werden. Der getrocknete Acetonextrakt wird in 5-10 mL Wasser gelöst und mit EtAc (1:1 V/V) extrahiert und einrotiert. Die Rohextrakte des Kulturüberstands und des Mycels werden filtiert und davon 20-80 µL über HPLC/MS analysiert.
75 Materialien und Methoden
II.2.6.3 Aufreinigung von Sekundärmetaboliten
Einzelne Substanzen können mittels verschiedenen chromatographischen Aufreinigungsmethoden aus Extrakten aufgereinigt werden.
II.2.6.3.1 Fraktionierung des Rohextraktes mittels Festphasenextraktion
Die Festphasenextraktion (engl. solid phase extraction, SPE) dient dazu, einen Rohextrakt in mehrere Fraktionen zu unterteilen. Der Extraktionsprozess beruht auf unterschiedliche physikalische Wechsel- wirkungen zwischen der festen Phase der Säule und den einzelnen Bestandteilen der Probe. Dazu wird die SPE-Säule Oasis zuerst mittels absteigenden Methanolkonzentrationen (100 mL je 100 %, 80 %, 60 %, 40 %) vorkonditioniert. Der Rohextrakt wird in 10 mL an vorkonditionierter Methanol- konzentration gelöst, die nicht-gelösten Bestandteile abzentrifugiert (5000 Upm, 10 min, RT) und der Überstand auf die Säule aufgetragen. Mit einem stufenweise aufsteigenden Methanol-Gradienten (100 mL in je + 10 % MeOH-Schritten) und einem geringen Unterdruck werden die einzelnen Fraktionen von der Säule eluiert. Dabei werden vor jedem neuen MeOH-Schritt die unlöslichen Bestandteile der Probe in der jeweils höheren MeOH-Konzentration gelöst und auf die Säule aufgetragen. Die einzelnen Fraktionen werden mit dem Rotationsverdampfer getrocknet und anschließend mittels HPLC analysiert. Die Säule wird zuletzt mit 50 mL Dichlormethan:Methanol (3:7) mit 0,5 mL Essigsäure, anschließend mit 200 mL Ethylacetat und mit 100 mL Methanol regeneriert. Die Säule wird mit Parafilm bedeckt und trocken gelagert.
II.2.6.3.2 Präparative Dünnschichtchromatographie
Die präparative Dünnschichtchromatographie (DC) ist eine weitere Methode zur Aufreinigung von Naturstoffen aus Gemischen. Dazu wird die Probe in einem geringen Volumen MeOH (<1 mL) gelöst.
Die Probe wird mit 1 cm Abstand auf den unteren Rand einer Kieselgelplatte ADAMANT UV254nm aufgetragen und das Lösungsmittel verdampfen lassen. Zur Aufreinigung der Foxicine wird ein
Gemisch aus HCOOH:H2O:EtAc (3:3:44) verwendet. Nach Sättigung der DC-Kammer wird die Plattte hineingestellt und die mobile Phase über 14 cm laufen lassen. Anschließend wird die Platte wieder herausgenommen und getrocknet. Farbige Substanzen lassen sich visuell als Bande erfassen, andere müssen unter der UV-Lampe oder durch Fluoreszenzlöschung detektiert werden. Die gewünschte Bande wird mithilfe eines Spatels ausgekratzt und dreimal mit 10 mL EtAc extrahiert.
II.2.6.3.3 Präparative Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
Zur Strukturauflösung der Foxicine wurde nach Extraktion, SPE und DC eine präparative Hoch- leistungsflüssigkeitschromatographie (engl. high performance liquid chromatography, HPLC) durchgeführt. Dazu wird der Extrakt in einem geringen Volumen an MeOH gelöst und über einen Rotilabo®-Spritzenfilter filtriert. Zur Aufreinigung wurde die HPLC von Agilent verwendet. Die Auf- trennung der Naturstoffe erfolgte über ein Agilent Zorbax-C18-System bestehend aus einer Vorsäule 76 Materialien und Methoden
(50 mm x 9,4 mm; Partikelgröße: 5 µm) und einer Hauptsäule (150 x 9,4 mm; Partikelgröße: 5 µm).
Als Laufmittel wurden Acetonitril (Laufmittel A) und H2Obidest (Laufmittel B), die jeweils mit 0,5 % Essigsäure versetzt wurden, verwendet. Zur Detektion wurde ein Diodenarray-Detektor eingesetzt. Die aufzureinigende Substanz wurde manuell aufgefangen und mithilfe eines Rotationsverdampfers zur Trockene einrotiert. Um verbleibende Mengen an Essigsäure zu entfernen, wurde der Extrakt mehr- fach in EtAc gelöst und wieder evaporiert.
Tab. 30: Methode für präparative HPLC
Name Zeit ACN [%]+ H2O [%]+ Fluss Anwendung [min] 0,5% HAc 0,5% HAc [mL/min]
Foxi_Präp_2 0-3 50 50 2 Aufreinigung von Foxicin A 3-10 50 auf 70 50 auf 30 2 und Foxicin B 10-14 95 5 2 14-18 50 50 2
II.2.6.3.4 Größenausschluss-Chromatographie mittels Sephadex
Bei der Größenausschluss-Chromatographie werden Stoffe unterschiedlicher Größe aufgetrennt. In dieser Arbeit wurde die Methode als letzter Aufreinigungsschritt verwendet, um noch vorhandene Unreinheiten und Lösungsmittel aus der Foxicin-Probe zu beseitigen. Dazu wird SephadexTM LH20 in reinem MeOH gelöst und auf eine Säule (Durchmesser 1,3 cm, Länge 33 cm) gepackt. Das MeOH wird bis zur Grenze des Säulenmaterials absinken gelassen und der Hahn zugedreht, bevor die Säule trocken läuft. Der aufzureinigende Extrakt wird in <500 µL MeOH gelöst und langsam auf das Säulenmaterial aufgetragen. Sobald der Extrakt aufgenommen wurde, kann MeOH nachgegeben werden. Der Durchlauf wird in 1 mL Fraktionen aufgefangen. Aufgrund der roten Farbe von Foxicin werden die farbigen Fraktionen mittels UV/vis-Spektroskopie und HPLC analysiert. Die Fraktionen, die nur Foxicin enthalten, werden vereinigt.
II.2.6.4 Sekundärstoffanalytik mittels HPLC/MS Die Charakterisierung von produzierten Sekundärmetaboliten wurde durch eine HPLC/ESI-MS (engl. High Performance Liquid Chromatographie/Elektrospray Ionization – Mass Spectrometry) durchge- führt. Dazu wurde das Chromatographiesystem Agilent 1100 System, gekoppelt mit einem thermo- statisierten Autosampler und Diodenarray-Detektor (DAD), durchgeführt. Dabei werden neben den UV/vis-Spektren auch Massenspektren gemessen. Zur Auftrennung wird entweder XBridgeTM C18- Säule (100 mm x 4,6 mm; 3,5 µm) als Hauptsäule mit der Vorsäule XBridge TM C18 (20 mm x 4,6 mm; Partikelgröße: 3,5 µm) oder die Säule Zorbax XDB-C8 (150 x 4,6 mm; 5 µm) mit einer Vorsäule Zorbax XDB-C8 (12,4 x 4,6 mm; 5 µm) verwendet. Die Detektion kann bei verschiedenen Wellenlängen erfolgen. Zur Analyse von Foxicin und Polyketomycin aus S. diastatochromogenes Tü6028 und Mutanten wurde die Methode pokESI2R verwendet. Die Methode Avila02C8 wurde zur
77 Materialien und Methoden
Analyse von Avilamycinen aus S. viridochromogenes Tü57 angewandt. Bei neuen Extrakten mit unbekannten Inhaltsstoffen wurde die Methode Tanja7 eingesetzt. Die Daten-Analyse erfolgt mit der Software ChemStation for LC3D Rev. A.09.03 (Agilent Techno- logies, Waldbronn).
Tab. 31: Parameter der ESI-Ionisierungsquelle
Parameter Einstellung Drying gas flow 12 L/min Drying gas temperature 350 °C Nebulizer 50 psig Kapillarenspannung (pos. + neg.) 3000 V
Tab. 32: Methoden für HPLC
Name Säule Zeit ACN [%]+ H2O [%]+ Fluss Anwendung [min] 0,5% HAc 0,5% HAc [mL/min]
Avila02C8 C8 0-20 40 auf 70 60 auf 30 0,5 Analyse von Avilamycinen 20-24 95 5 0,5 24-34 40 60 0,5 pokESI2R C18 0-1 20 80 0,5 Analyse von Polyketomycin 1-8 20 auf 60 80 auf 40 0,5 und Foxicin 8-24 60 auf 95 40 auf 5 0,5 24-29 95 5 0,5 29-30 95 auf 20 5 auf 80 0,5 30-35 20 80 0,5
Tanja7 C18 0-3 5 95 0,5 Analyse von unbekannten 3-27 5 auf 95 95 auf 5 0,5 Substanzen 27-32 95 5 0,5 32-38 5 95 0,5
78 Materialien und Methoden
II.2.6.5 Strukturaufklärung von Sekundärmetaboliten
Zur Strukturaufklärung von Foxicin A und B, sowie Thailandin, wurden verschiedene Messungen durchgeführt.
II.2.6.5.1 Hochauflösende Massenspektrometrie
Um die exakten Massen von Foxicin A und Foxicin B zu erhalten, wurden die aufgereinigten Substanzen über eine APCI/ESI-MS Exative (Thermo Scientific) von Christoph Warth (Chemie, Universität Freiburg) vermessen. Die Proben wurden in Dichlormethan gelöst und mittels einer Spritzenpumpe mit einer Flussrate von 5-20 µL/min über ein T-Stück in einen Fluss von 100 µL/min in Methanol eingeleitet. Die Berechnung der Elementarzusammensetzung aus der gefundenen Masse (Genauigkeit 1-2 ppm) wurde mit der Xcalibur-Software (Thermo Scientific) durchgeführt.
Tab. 33: Parameter der APCI/ESI-MS
Parameter Einstellung Hilfsgase Stickstoff Spray-voltage (ESI) 2,5-4,0 kV Spray-Current (APCI) 5 µA Ion transfer tube 250 °C (ESI) bzw. 150 °C (APCI) Vaporizer temperature 50-300 °C
II.2.6.5.2 Kernspinresonanz-Spektroskopie
Die Kernspinresonanz-Spektroskopie (engl. nuclear magnetic resonance – NMR) dient der Struktur- aufklärung von größeren Molekülen bis hin zu Proteinen. Hierbei werden durch Messung der 1H-, 13C- und 15N-NMR-Spektren die Atome im Molekül und über Kopplung zwischen den verschiedenen Elementen (1H/1H-COSY (correlation spectroscopy), 1H/13C HMBC (heteronuclear multiple bond correlation), 1H/13C HSQC (heteronuclear single quantum coherence) und 1H/13C H2BC (heteronuclear 2 bond correlation) ihre Position im Strukturgerüst bestimmt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden NMR-Spektren von Foxicin B mit einer Bruker DRX Avance 400 MHz von Herrn Sascha Ferlaino aus dem Arbeitskreis Prof. Dr. Müller (Pharmazeutische und Medizinische Chemie, Universität Freiburg,) aufgenommen. Die NMR-Spektren von Thailandin A, Thailandin B und Foxicin A wurden mit einer Bruker AV 400 bzw. Varian NMR-S600 MHz Spektrometer von Dr. Thomas Paululat (Universität Siegen) aufgenommen. Die chemische Shifts wurden in δ-Werten (ppm) angegeben, das Lösungsmittel wurde als interne Referenz verwendet
(CDCl3μ δH = 7,25; δC = 77,0 ppm bei 25 °C oder DMSO-d6μ δH = 2,50; δC = 39,5 ppm bei 35 °C).
79 Materialien und Methoden
II.2.6.5.3 IR/VCD-Spektroskopie
Die Spektren einer Substanz durch unpolarisierter Infrarot-(IR) und zirkular polarisierter IR-Strahlung (engl. vibrational circular dichroism – VCD) geben weitere Rückschlüsse über die Konfiguration einer Substanz. Bei der klassischen IR-Spektroskopie wird ein Absorptionsspektrum aufgrund von Schwingungsanregung aufgenommen. Bei der VCD-Spektroskopie wird der Unterschied zwischen rechts- und links-zirkular polarisierter IR-Strahlung optisch aktiver Verbindungen detektiert.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die IR-Spektren von Foxicin A und Foxicin B mit einem BRUKER Tensor 27 FT-IR Spectrometer mit einem BRUKER PMA 50 VCD Modul (BRUKER Optik GmbH, Ettlingen) von Marija Marolt (AG Lüdeke, Pharmazeutische und Medizinische Chemie, Universität
Freiburg) aufgenommen. Dafür wurden 100 mM Foxicin in wasserfreiem CDCl3 gelöst, in eine BaF2 Cell (110 µm) pipettiert und für 6 h vermessen. Das Hintergrundrauschen der Spektren wurde durch die Spektren des Lösungsmittels genormt. Opus 7.0 Software (BRUKER Corporation) wurde zur Analyse der Spektren verwendet.
Die möglichen Konformationen von Foxicin wurden mittels Spartan 08 (Wavefunction Inc., Irvine, CA, USA) bestimmt. Quantum Chemical Calculations auf dem DFT Level (B3LYP/6-31+G(d,p)) der Konformere wurden mittels Gaussian 09, Revision D.01 (Frisch et al., 2013) berechnet. Alle Kalkulationen wurden für die Gasphase gemacht. Die vibrationale Frequenzen wurden um den empirischen Faktor 0,975 skaliert. Die theoretischen Spektren wurden durch die Addition des Lorentzian Band Shapes (Breite 6 cm-1) zu den kalkulierten IR und VCD-Intensitäten erhalten.
II.2.7 Aktivitätsbestimmung von Sekundärmetaboliten
II.2.7.1 Agardiffusionstest Um herauszufinden, ob eine Substanz eine antibiotische Aktivität besitzt, kann ein Agardiffusions- Test durchgeführt werden. Dazu wird die Substanz in einem Lösungsmittel (z.B. MeOH, DMSO) gelöst und auf ein steriles Filterblättchen (Durchmesser 6 mm) pipettiert. Wird MeOH verwendet, muss dieses zuerst verdampft sein, bevor weitergearbeitet wird. Das Filterblättchen mit der zu testenden Substanz wird auf eine Kulturplatte gelegt, auf der zuvor der Testorganismus flächig ausgestrichen wurde. Die Kulturplatte wird bei entsprechender Temperatur und Zeit inkubiert (abhängig vom Testorganismus) und der eventuell entstandene Hemmhof ausgemessen. Das Lösungs- mittel und andere Antibiotika dienen als Kontrollen.
II.2.7.1.1 Agardiffusionstest mit Foxicin A
In dieser Arbeit wurde die antibiotische Aktivität von Foxicin A gegen Actinokineospora bangkokensis, Saccharothrix espanaensis, Streptomyces viridochromogenes Tü57, Streptomyces coelicolor, Bacillus subtilis (Ehrenberg) COHN ATCC6051, Escherichia coli XL1-Blue, Myco-
80 Materialien und Methoden bacterium smegmatis mc2 155, Fusarium verticilloides DSM 62264, Candida parapsilosis DSM 5784, Synechococcus sp. PCC7002 und Synechocystis sp. PCC6803 getestet. Dabei wurden jeweils 100 µg pro Testorganismus eingesetzt. Reines MeOH dient als Negativkontrolle, Apramycin bzw. Chlor- amphenicol als Positivkontrolle.
II.2.7.1.2 Agardiffusionstest mit Wasserstoffperoxid
Um zu testen, ob Foxicin-produzierende S. diastatochromogenes Stämme resistenter gegenüber reaktive Sauerstoffspezies sind, wurde ein Agardiffusionstest mit Wasserstoffperoxid durchgeführt.
Dazu wurden 2 µL, 5 µL und 10 µL einer 5 %igen H2O2-Lösung auf Filterblättchen pipettiert und gegen S. diastatochromogenes Tü6028 Wildtyp, die ∆pokOIV-Mutante und die ∆pokOIV-Mutante mit zusätzlich unterbrochenem foxBII-Gen getestet. Die Stämme wurden auf TSB- und MS-Platten ausplattiert und für 5 Tage bei 28 °C inkubiert.
II.2.7.2 Untersuchung der inhibitorischen Wirkung von Foxicin A gegen Arabidopsis thaliana Um den Einfluss von Foxicin auf das Wachstum von Arabidopsis thaliana zu testen, wurden 6 mg Samen in ein 2 mL Eppendorf Gefäß überführt, sowie 1 mL Natriumhypochlorid (7 %) und ein Tropfen Triton X100 hinzugefügt. Nach Vortexen wurde der Ansatz für 9 min bei RT inkubiert und anschließend abzentrifugiert (14000 Upm, 1 min, RT). Die Samen wurden dreimal mit 1 mL Wasser gewaschen. Anschließend wurden die Samen in 1 mL Agar (0,15 %) resuspendiert und auf MS(A)- Platten mit 0,1-5 µM Foxicin A oder B verteilt. Die Platten wurden für 3 h getrocknet und ü.N. im Dunkeln inkubiert, um die gleichzeitige Auskeimung zu gewährleisten. Am nächsten Tag wurden die Platten in eine Phytokammer unter Langtages-Bedingungen (16/8 h), einer Lichtintensität von 100 µE m-2 s-1 bei 25 °C für 2 Wochen inkubiert. Die Analyse erfolgte visuell. Diese Arbeiten wurden von Daniel Álvarez (AG Beyer, Biologie II, Universität Freiburg) durchgeführt.
II.2.7.3 MTT-Zellviabilitäts-Test Der Einfluss von Foxicin A auf die Viabilität von humanen Zellen wurde in einem colormetrischen Assay (Calderón et al., 2014) mit dem Tetrazoliumsalz MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl Tetrazoliumbromid) gegen die drei lymphocytischen Leukämiezelllinien CCRF-CEM, CEM- ADR5000 und Jurkat, sowie gesunden PBMC-Zellen getestet. MTT ist ein wasserlösliches Tetra- zoliumsalz, welches bei Spaltung des Tetrazoliumrings durch die Succinatdehydrogenase in den Mitochondrien als unlösliches purpurnes Formazan ausfällt. Das Formazan kann nicht durch Zell- membranen gelangen und akkumuliert dadurch in gesunden Zellen.
Die humanen Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 in RPMI 1640 Medium mit 10 % hitze- inaktiviertem fetalem Rinderserum, 100 mg/mL Streptomycin und 100 U/mL Penicillin inkubiert. Die Zellen wurden in 96-Wellplatten verteilt (4 x 104 Zellen/Well in 150 µL Medium) und mit verschiedenen Konzentrationen an Foxicin A (gelöst in DMSO) inkubiert. Doxorubicin wurde als
81 Materialien und Methoden
Positivkontrolle und DMSO als Negativkontrolle verwendet. Diese Arbeiten wurden von Christian de Ford (AG Merfort, Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie, Universität Freiburg) durchgeführt.
II.2.7.4 Untersuchung der in vitro Atmungskettenhemmung von E. coli
Um herauszufinden, ob Foxicin ähnlich wie andere Quinone Elektronen aufnehmen kann und so in die Atmungskette eingreifen kann, wurde die Plasmamembran von E. coli isoliert und mittels einer Clark- Elektrode der Sauerstoffgehalt in Anwesenheit von Foxicin A untersucht. Diese Arbeiten wurden von Sabrina Burschel (AG Friedrich, Biochemie, Universität Freiburg) durchgeführt.
Isolierung bakterielle Plasmamembran: Eine E. coli BW25113 Kultur wird in LB-Medium bei 37 °C, 180 Upm bis zur späten exponentiellen Phase inkubiert und abzentrifugiert (5700 x g, 10 min, 4 °C). Alle folgenden Schritte werden auf Eis durchgeführt. Fünf Gramm Zellen werden im vierfachen Volumen an Puffer 1 resuspendiert und zweimal durch die French-Pressure Cell Press passagiert. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation (9500 x g, 20 min, 4 °C) entfernt und der Überstand nochmals zentrifugiert (252000 x g, 60 min, 4 °C), um die Zellmembranen zu erhalten. Das Sediment wird im gleichen Volumen (1:1, W/V) Puffer 1 resuspendiert, im flüssigen Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert.
Bestimmung der NADH-Oxidase-Aktivität: Die NADH-Oxidase-Aktivität wird mit einer Clark-Typ Elektrode (RE K1-1, Oxytec) bei 30 °C gemessen. Zur Kalibrierung der Elektrode werden 2 mL Puffer 2 durch die Zugabe von Natriumdithionit deoxygeniert (Anfangswert 237 µM Sauerstoff, (Weiss, 1970)). Für die Messung werden 2 mL Puffer mit 5 µL der Membransuspension verwendet. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 1,25 mM NADH gestartet. Die zu testende Substanz (Foxicin A, 50-500 µM) wird zugegeben und eine mögliche Hemmung der Sauerstoffabnahme kann gemessen werden. Antimycin dient als Positivkontrolle.
II.2.7.5 Interaktion von Foxicin A mit Fe-Ionen
II.2.7.5.1 UV/vis-Spektroskopie von Foxicin in Anwesenheit von Fe-Ionen
Das UV/vis-Spektrum von Foxicin A wurde in Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von
FeCl3 und FeSO4 (0-100 mM) bestimmt. Dazu wurde Foxicin A in Methanol gelöst und das Spektrum mit ansteigenden Fe-Konzentrationen (in Methanol gelöst) gemessen. Die Messung wurde mit dem UV-Spektrophotometer durchgeführt.
II.2.7.5.2 Foxicin-Produktion von S. diastatochromogenes ΔpokOIV in Anwesenheit von Fe- Ionen
Der Stamm S. diastatochromogenes ΔpokOIV wurde in je 50 mL HA-Medium mit 0,01 mM, 0,1 mM und 1,0 mM FeCl3 oder FeSO4 für sechs Tage bei 28 °C im Schüttler inkubiert. Von jeder Kultur wurden 25 mL abgenommen, der Überstand auf pH 4 angesäuert und mit gleichem Volumen an
82 Materialien und Methoden
Ethylacetat extrahiert. Der Rohextrakt wurde mittels HPLC auf Foxicin untersucht, indem das Integral des entsprechenden Peaks im Chromatogramm bestimmt wurde. Von jedem Ansatz wurden jeweils drei Kulturen angesetzt.
II.2.8 Genomsequenzierung und Computer-basierte Auswertung
II.2.8.1 Genomsequenzierung
Zur Genomsequenzierung wurde genomische DNA von fünf verschiedenen Actinomyceten isoliert (II.2.2.1b). Actinokineospora bangkokensis 44EHWT wurde von Eurofins Genomics GmbH, Ebersberg und CeBiTec (Center for Biotechnology, Universität Bielefeld) sequenziert. Die Genomsequenzen von S. diastatochromogenes Tü6028, S. diastatochromogenes 1028, S. calvus und S. glomeroaurantiacus wurden von der CeBiTec unter Leitung von Prof. Dr. Jörn Kalinowski bestimmt.
II.2.8.2 Analyse von offenen Leserahmen
Die offenen Leserahmen (ORFs) wurden mit dem Programm RAST (Aziz et al., 2008; Overbeek et al., 2014) und der NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (Tatusova et al., 2013, 2016) bestimmt. Genauere Untersuchungen wurden mit BLAST durchgeführt (Madden, 2003). Zusätzlich wurde die Galaxy-Plattform (Goecks et al., 2010; Afgan et al., 2016) der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Rolf Backofen (Bioinformatik, Universität Freiburg) verwendet. Um bestimmte Gene mit den ORFs von S. diastatochromogenes Tü6028 zu vergleichen, wurde mittels der Plattform und des Programms makeblastdb (Camacho et al., 2009) eine Datenbank erstellt. Anschließend konnten einzelne Gene gegen diese Datenbank geblastet und so homologe Gene identifiziert werden.
II.2.8.3 Analyse von Sekundärmetaboligenclustern
Sekundärmetabolitgencluster werden mit antiSMASH 3.0 (Weber et al., 2015) identifiziert. Neben der Clusterzuweisung werden auch die kompletten Cluster dargestellt, Strukturen vorhergesagt sowie ähnliche Cluster in anderen Organismen gezeigt. Über den direkten BLAST-Link können einzelne Gene genauer untersucht werden.
II.2.8.4 Graphische Darstellung von Genomen mittels Circos Die Genomsequenzen von A. bangkokensis 44EHWT und S. diastatochromogenes Tü6028 wurden mittels Circos (Krzywinski et al., 2009) und dem R-Paket circlize (Gu et al., 2014) von Dr. Stephan Flemming visuell dargestellt. Dabei wurden die Scaffolds, die Gaps, der GC-Gehalt [%] in 500 bp- Schritten (alle 250 bp), die putativen Sekundärmetabolitgencluster und die annotierten ORFs nach funktioneller Gruppierung abgebildet.
83 Materialien und Methoden
II.2.8.5 Eingabe von Geninformationen in die NCBI-Datenbank
Die Clusterinformationen von Foxicin, sowie die annotierten ORFs der Genome von S. diastato- chromogenes Tü6028 und Actinokineospora bangkokensis 44EHWT wurden auf der Homepage des National Center for Biotechnology Information (NCBI) auf http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ hoch- geladen.
II.2.8.6 Sequenzalignment und Phylogenie
Um einzelne Sequenzen zu vergleichen werden sie mittels des Programms Clustal Omega (Sievers et al., 2011) alignt. Weiterhin wurde in dieser Arbeit ein phylogenetischer Baum aufhand des foxBII- Sequenzvergleichs mit der Neighbor-Joining-Methode (Saitou und Nei, 1987) aufgestellt.
II.2.9 Eingabe von Sekundärmetabolitgencluster-Informationen in die MIBiG- Datenbank
Die Informationen von Aranciamycin, Avilamycin, Landomycin, Mensacarcin, Polyketomycin, Rishirilid, Simocyclinone und Urdamycin wurden unter http://mibig.secondarymetabolites.org in die MIBiG-Datenbank (Medema et al., 2015) eingegeben. Nach Anfrage einer MIBiG-Accessionnummer kann man die einzelnen Daten direkt hochladen.
84 Ergebnisse
III Ergebnisse
85 Ergebnisse
86 Ergebnisse
III.1 Sequenzierung von fünf Actinomyceten-Genomen
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Genome von Streptomyces diastatochromogenes Tü6028, Streptomyces diastatochromogenes 1628, Streptomyces calvus, Streptomyces glomeroaurantiacus und Actinokineospora bangkokensis 44EHWT sequenzieren lassen. Dazu wurde die Stämme in TSB- Medium angeimpft und von je einer gut angewachsenen Kultur genomische DNA im großen Maßstab isoliert (II.2.2.1b). Die Konzentrationen und Reinheit der DNA-Proben wurden mit dem NanoDrop überprüft (II.2.3.1), sowie eine mögliche Degradation während der Aufreinigung über eine Gelelektrophorese ausgeschlossen (II.2.3.2). Die Sequenzierung wurde vom Centrum für Biotechnologie (CeBiTec) der Universität Bielefeld unter Leitung von Prof. Dr. Jörn Kalinowski durchgeführt. Die Ergebnisse der einzelnen Sequenzierungen sind in Tabelle 34 dargestellt.
Tab. 34: Übersicht der Genomsequenzierung
GC-Gehalt Anzahl Anzahl Stamm DNA Größe [%] Contigs Scaffolds
S. diastatochromogenes Genom 7 897 808 71,5 58 38 Tü6028 Plasmid 37 129 71,7 1 1
Genom 9 076 145 72 223 135 S. diastatochromogenes 1628 Plasmid 75 551 63,3 6 1
Genom 7 938 573 71,8 158 78 S. calvus Plasmid 162 417 50,1 18 1
S. glomeroaurantiacus Genom 9 434 972 70,0 113 49
A. bangkokensis 44EHWT Genom 7 456 018 74,1 206 105 CeBiTec A. bangkokensis 44EHWT Genom 7 400 933 74,1 247 56 Eurofins
Das Genom von S. diastatochromogenes 1628 wird von Prof. Dr. Zheng Ma der Jiliang Universität (China), S. calvus von Stefanie Hackl und S. glomeroaurantiacus von Songya Zhang der Arbeits- gruppe Bechthold (Pharmzeutische Biologie und Biotechnologie) genauer analysiert.
Die Charakterisierung des Genoms von Actinokineospora bangkokesis ist im Abschnitt III.1.1 und von S. diastatochromogenes Tü6028 in Abschnitt III.1.2 genauer beschrieben.
87 Ergebnisse
III.1.1 Das Draft-Genom von Actinokineospora bangkokensis 44EHWT
Das Genom von Actinokineospora bangkokenesis 44EHWT wurde zuerst von Eurofins MWG Operon in Ebersberg sequenziert. Mittels 454 Pyrosequenzierung und einer Long Jumping Distance Library konnte ein Genom mit einer Größe von 7 400 933 bp ermittelt werden. Da die Sequenz aber noch aus 247 Contigs bestand, die nur zu 56 Scaffolds zusammengefügt werden konnten, wurde das Genom zusätzlich noch beim Centrum für Biotechnologie (CeBiTec) der Universität Bielefeld unter Leitung von Prof. Dr. Jörn Kalinowski mittels Illumina-Technologie sequenziert. Diese erzielten ein Genom mit 206 Contigs und 105 Scaffolds. Die zwei Genome wurden manuell miteinander verglichen und dabei konnten 168 Gaps geschlossen werden. Das zusammengesetzte Genom setzt sich aus 32 Scaffolds und 79 Contigs zusammen.
Das Draft-Genom von A. bangkokensis 44EHWT hat 7 453 713 Basen mit einem durchschnittlichen GC-Gehalt von 74,1 %. Mittels der NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (Tatusova et al., 2016) konnten 6287 kodierende Sequenzen identifiziert werden. Davon wurden 6191 als putative Gene, 50 tRNAs und 4 CRISPR-Regionen annotiert. Das Genom hat eine Gendichte von 87,9 % und die durchschnittliche Gengröße beträgt 1030 bp. Das Draft-Genom wurde bei NCBI unter der Accession-Nummer MKQR01000000 hinterlegt.
Zur graphischen Darstellung wurde das Genom mittels des Programms Circos (Krzywinski et al., 2009) von Dr. Stephan Flemming dargestellt (siehe Abb. 30). Der äußere Ring (Ring A) zeigt die Scaffolds 1-32 (abwechselnd schwarz/weiß) mit den jeweiligen Gaps (grau). Ring B stellt den GC- Gehalt (%) dar, der zwischen 44,2 % - 87,4 % liegt. Ring C zeigt die putativen Sekundärmetabolit- gencluster. Das Programm antiSMASH 3.0 (Weber et al., 2015) detektierte 35 Gencluster (siehe Anhang, Tab. 42), die 22,8 % des Genoms ausmachen. Unter den Genclustern gibt es neun PKSI- Cluster (grün), drei davon sind riesige Cluster mit einer Größe über 100 kb. Diese drei Cluster zeigen allgemein einen höheren GC-Gehalt von 75,2 % - 76,9 % (siehe Abb. 30 unten). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das PKS-Cluster #11 (* gekennzeichnet, Lokalisation 3 209 873 – 3 316 080 bp) für die Thailandin-Biosynthese verantwortlich ist (III.2.3). Die einzelnen ORFs wurden aufgrund ihrer postulierten Funktionen manuell in verschiedenen Gruppen unterteilt. Dabei wurde zwischen dem generellen Stoffwechsel (Ring D), modifizierenden Genprodukten (Ring E), Produkte für den Ionen-Haushalt (Ring F), für Replikation/Transkription/Translation (Ring G), für Zellwand/ Membran/Transport (Ring H) und Abwehr/(Stress-)Antwort/Kommunikation (Ring J) unterschieden. Von den 6287 ermittelten, kodierenden Regionen konnten die Funktionen von 2439 ORFs mittels des automatischen Annotationsprogramms nicht bestimmt werden (Ring J).
88 Ergebnisse
Abb. 30: Graphische Darstellung des Genoms von Actinokineospora bangkokensis 44EHWT Das Genom von Actinokineospora bangkokenesis 44EHWT hat eine Größe von 7,4 Mb; Ring A: Die Scaffold 1-32 sind hintereinander dargestellt (abwechselnd in schwarz/weiß) mit Gaps (grau); Ring B: GC-Gehalt in 500 bp-Abschnitte, alle 250 bp, Bereich zwischen 50 % - 100 %, Durchschnittswert von 74 % als Linie dargestellt; Regionen der PKS-Cluster #11, #16 und #19 vergrößert dargestellt (unten); Ring C: Lokalisation der putativen Sekundärmetabolitgencluster, unterteilt in PKS I (grün), andere PKS (lila), NRPS/PKS I (blau), andere NRPS (pink), Terpen (orange), Siderophor (braun), Lantipeptid (gelb) und anderes Cluster (grau), * Thailandin-Biosynthesegencluster; Ring D: Lokalisation von ORFs des generellen Stoffwechsels, unterteilt in Aminosäure-Stoffwechsel (grün), Aromaten-Stoffwechsel (lila), Fettsäure-Stoffwechsel (blau), Kohlenhydrate-Stoffwechsel (pink), Sekundärmetabolit-Stoffwechsel (orange) und Stoffwechsel von Kofaktoren, Vitaminen und Pigmenten (braun); Ring E: Lokalisation von ORFs mit modifizierenden Funktionen, Carboxylasen (grün), Dehydrogenasen (lila), Esterasen (blau), Hydratasen (pink), Hydrolasen (orange), beteiligt an Redoxreaktionen (braun), Reduktasen (gelb), Transferasen (grau); Ring F: Lokalisation von ORFs des Ionen-Haushalts, Eisen-Stoffwechsel (grün), Phosphat-Stoffwechsel (lila), Schwefel-Stoffwechsel (blau), Stickstoff-Stoffwechsel (pink) und weitere Ionen-Stoffwechsel (orange); Ring G: Lokalisation von ORFs für Replikation/Transkription/Translation: Nukleotid-Stoffwechsel (grün), Protein-Turnover und Chaperone (lila), Replikation und Reparatur (blau), Transkription (pink), Translation (orange) und tRNA-Stoffwechsel (braun); Ring H: Lokalisation von ORFs von Membranproteinen (grün), für den Transport (lila), für die Zellteilung (blau) und für die Zellwand-/Membranbiosynthese (pink); Ring I: Lokalisation von ORFs für Abwehr und (Stress)antwort (grün), von (Pro-)Phagen (lila), für die Sporulation (blau) und Kommunikation (pink); Ring J: Lokalisation von ORFs mit unbekannter Funktion (grau). 89 Ergebnisse
III.1.2 Das Draft-Genom von S. diastatochromogenes Tü6028
Das Genom von Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 konnte von der CeBiTec (Universität Bielefeld) mittels Illumina-Technologie zu einer Draft-Sequenz aus 38 Scaffolds und 58 Contigs sequenziert und zusammengesetzt werden. Die Sequenz setzt sich aus 7 897 808 Basen zusammen mit einem GC-Gehalt von 71,5 %. Zusätzlich hat der Stamm ein Plasmid mit 37 129 Basen und 71,7 % GC-Gehalt. Mittels der NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (Tatusova et al., 2016) konnten auf dem Genom 6706 kodierende Sequenzen identifiziert werden. Davon wurden 6527 als putative Gene und 70 tRNAs annotiert. Das Genom hat eine Gendichte von 87,3 % und die durchschnittliche Genlänge beträgt 981 bp. Das Plasmid besitzt 34 ORFs. Das Draft-Genom wurde bei NCBI unter der Accession-Nummer MLCE01000000 hinterlegt.
Zur graphischen Darstellung wurde das Genom und das Plasmid mittels des Programms Circos (Krzywinski et al., 2009) von Dr. Stephan Flemming dargestellt (siehe Abb. 31). Der äußere Ring (Ring A) des Genoms zeigt die Scaffolds 1-38 (abwechselnd schwarz/weiß) mit den jeweiligen Gaps (grau). Ring B stellt den GC-Gehalt (%) dar, der zwischen 51,2 % - 86,2 % liegt. Ring C zeigt die putativen Sekundärmetabolitgencluster. Das Programm antiSMASH 3.0 (Weber et al., 2015) detektierte 23 Gencluster (siehe Anhang, Tab. 43), die 9,1 % des Genoms ausmachen. Unter den Genclustern gibt es vier Cluster (grün), in denen postulierte PKS I Gene liegen. Das Cluster #2 ist für die Synthese des Antibiotikums Polyketomycin verantwortlich (▲ gekennzeichnet, Lokalisation 326583-389129 bp) (Daum et al., 2009). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Cluster #3 das Foxicin-Bioynthesecluster ist (● gekennzeichnet, Lokalisation 573 458 – 629 870) (III.4.4). Die einzelnen ORFs wurden aufgrund ihrer postulierten Funktionen manuell in verschiedenen Gruppen unterteilt. Dabei wurde zwischen dem generellen Stoffwechsel (Ring D), modifizierenden Genprodukten (Ring E), Produkte für den Ionen-Haushalt (Ring F), für Replikation/Trans- kription/Translation (Ring G), für Zellwand/Membran/Transport (Ring H) und Abwehr/(Stress)- Antwort/Kommunikation (Ring J) unterschieden. Von den 6527 ermittelten, kodierenden Regionen konnten die Funktionen von 2490 ORFs mittels des automatischen Annotationsprogramms nicht bestimmt werden (Ring J).
90 Ergebnisse
Abb. 31: Graphische Darstellung des Genoms und des Plasmids von Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 Das Genom von Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 hat eine Größe von 7,9 Mb und das Plasmid (rechts unten) hat eine Größe von 37 kb; Ring A: Die Scaffold 1-38 des Genoms sind hintereinander dargestellt (abwechselnd in schwarz/weiß) mit Gaps (grau); Ring B: GC- Gehalt des Genoms in 500 bp-Abschnitte, alle 250 bp, Bereich zwischen 50 % - 100 %, Durchschnittswert von 71,5 % als Linie dargestellt; GC-Gehalt des Plasmids wurde in 100 bp-Abschnitte, alle 50 bp, dargestellt; Ring C: Lokalisation der putativen Sekundärmetabolit- gencluster, unterteilt in PKS I-Hybrid (grün), andere PKS (lila), NRPS (blau), Terpene (pink), Siderophor (orange), Lantipeptid (braun), Melanin (gelb) und anderes Cluster (grau), ▲ Polyketomycin-Cluster, ● Foxicin-Cluster; Ring D: Lokalisation von ORFs des generellen Stoffwechsels, unterteilt in Aminosäure-Stoffwechsel (grün), Aromaten-Stoffwechsel (lila), Fettsäure-Stoffwechsel (blau), Kohlenhydrate- Stoffwechsel (pink), Sekundärmetabolit-Stoffwechsel (orange) und Stoffwechsel von Kofaktoren, Vitaminen und Pigmenten (braun); Ring E: Lokalisation von ORFs mit modifizierenden Funktionen, Carboxylasen (grün), Dehydrogenasen (lila), Esterasen (blau), Hydratasen (pink), Hydrolasen (orange), beteiligt an Redoxreaktionen (braun), Reduktasen (gelb), Transferasen (grau) und andere Modifikationen (rot); Ring F: Lokalisation von ORFs des Ionen-Haushalts, Eisen-Stoffwechsel (grün), Phosphat-Stoffwechsel (lila), Schwefel-Stoffwechsel (blau), Stickstoff-Stoffwechsel (pink) und weitere Ionen-Stoffwechsel (orange); Ring G: Lokalisation von ORFs für Replikation/ Transkription/Translation: Nukleotid-Stoffwechsel (grün), Protein-Turnover und Chaperone (lila), Replikation und Reparatur (blau), Transkription (pink), Translation (orange) und tRNA-Stoffwechsel (braun); Ring H: Lokalisation von ORFs von Membranproteinen (grün), für den Transport (lila), für die Zellteilung (blau) und für die Zellwand-/Membranbiosynthese (pink); Ring I: Lokalisation von ORFs für Abwehr und (Stress)antwort (grün), von (Pro-)Phagen (lila), für die Sporulation (blau) und Kommunikation (pink); Ring J: Lokalisation von ORFs mit unbekannter Funktion (grau); die ORFs des Plasmids (innerer Ring) wurden nicht kategorisiert.
91 Ergebnisse
III.2 Thailandin A und B – zwei neue Polyene aus Actinokineospora bangkokensis 44EHWT
Der Stamm Actinokineospora bangkokensis 44EHWT wurde aus der Rhizosphäre einer Elefantenohr- pflanze (Colocasia esculenta) in Bangkok (Thailand) isoliert (Intra et al., 2013). Da über die Gattung der Actinokineospora noch nicht viel bekannt ist, sollte das Genom sequenziert werden (III.1.1). Weiterhin sollte untersucht werden, ob A. bangkokensis pharmazeutisch-relevante Sekundärmetabolite produziert und genetisch manipulierbar ist.
III.2.1 Produktionsanalyse von A. bangkokensis 44EHWT
Um zu untersuchen, ob der Stamm A. bangkokensis 44EHWT bioaktive Sekundärmetabolite produziert, wurde der Stamm für zehn Tage in SG-, MS-, HA- und NL5-Medium inkubiert. Diese Arbeiten wurden zusammen mit der Doktorandin Bungonsiri Intra der Mahidol Universität (Thailand) durchgeführt.
Der Kulturüberstand und das abzentrifugierte Mycel wurden separat extrahiert (II.2.6.2) und die antibiotische Wirkung der Rohextrakte in einem Hemmhoftest gegen die Bakterienstämme Strepto- myces albus, Bacillus subtilis und E. coli sowie gegen die Pilzstämme Candida parapsilosis und Fusarium verticillioides (II.2.7.1) getestet. Das Ergebnis des Hemmhoftests ist in Tabelle 35 dar- gestellt.
Tab. 35: Hemmhoftest der Rohextrakte aus A. bangkokensis gegenüber verschiedenen Bakterien und Pilze Streptomyces Bacillus Escherichia Candida Fusarium Medium albus subtilis coli parapsilosis verticillioides Überstand pH 4 - - - + + SG Überstand pH 7 - - - + + Mycel + - - + + Überstand pH 4 - - - + + MS Überstand pH 7 - - - + + Mycel + - - + + Überstand pH 4 - - - + + HA Überstand pH 7 + - - + + Mycel + - - + + Überstand pH 4 + + - - - NL5 Überstand pH 7 + + - - - Mycel + - - - - + antibiotisch aktiv, - nicht antibiotisch aktiv
Der Rohextrakt von A. bangkokensis aus HA-, SG- und MS-Medium zeigt im Hemmhoftest eine starke Hemmung gegen Pilze, nicht aber gegen Bakterien. Die Extrakte wurden mittels HPLC/MS über die Methode Tanja7 analysiert (II.2.6.4). Im HPLC-Chromatogramm sind drei deutliche Peaks zu sehen (siehe Abb. 32A). Die UV/vis-Spektren der drei Peaks sind identisch mit den Maxima bei 325 nm, 340 nm und 358 nm (siehe Abb. 32B). Daher handelt es sich bei den Substanzen wahrscheinlich um Derivate bzw. unterschiedliche Synthesestufen, die aufgrund des UV/vis-
Spektrums mehrere konjugierte Doppelbindungen besitzen. Substanz 1 (Peak mit tR 14.8 min) hat im 92 Ergebnisse
- Massenspektrum eine Hauptmasse von 597 [M-H] , Substanz 2 (Peak mit tR 16.3 min) von + + 755 [M+H] und Substanz 3 (Peak mit tR 17.0 min) von 609 [M+H] (siehe Abb. 32C).
2000
] ] 1750 1500 1250 1000 750 500
Absorption [mAU Absorption 250 0 0 5 10 15 20 25 30 35 A Zeit [min]
Retentionszeit 1600 Retentionszeit Retentionszeit 14.8 min 16.3 min 1600 17.0 min 1400 1400 800 1200 ] ] 1200 1000 600 1000
800 800 400 600 600
400 400
Absorption [mAU Absorption 200 200 200
0 0 0 200 250 300 350 400 450 500 550 200 250 300 350 400 450 500 550 200 250 300 350 400 450 500 550 B Wellenlänge [nm] Wellenlänge [nm] Wellenlänge [nm]
Retentionszeit Retentionszeit Retentionszeit 100 100 100 14.8 min 16.3 min 17.0 min 609.5 755.5 597.5 1196.5 1275.5
80 80 80 649.5
60 60 60 591.5 1567.8 40 40 40
Rel. Absorption [%] Rel. Absorption 20 20 20
0 0 0 500 1000 1500 500 1000 1500 500 1000 1500 C Masse [M-H]-/ Ladung [z] Masse [M+H]+/ Ladung [z] Masse [M+H]+/ Ladung [m/z]
Abb. 32: Produktionsanalyse von A. bangkokensis in HA-Medium (A) HPLC-Chromatogramm vom Rohextrakt aus A. bangkokensis kultiviert in HA-Medium bei 340 nm, Pfeile zeigen Peaks von Substanz 1
(Retentionszeit tR 14.8 min), Substanz 2 (Retentionszeit tR 16.3 min) und Substanz 3 (Retentionszeit tR 17,0 min); (B) UV/vis-Spektren von Substanz 1 (links), Substanz 2 (Mitte) und Substanz 3 (rechts); (C) Massenspektren von Substanz 1 (links), Substanz 2 (Mitte) und Substanz 3 (rechts).
In NL5- und HA-Medium produziert A. bangkokensis eine gegen Gram-positive Bakterien anti- biotisch-wirksame Substanz. Das HPLC-Chromatogramm zeigt mehrere kleine Peaks (Daten nicht gezeigt). Diese Wirkung konnte keinem Peak eindeutig zugeordnet werden. Darum wurde per präparativer HPLC (II.2.6.3.3) der Rohextrakt in sechs Fraktionen unterteilt und die antibiotische Wirkung der einzelnen Fraktionen untersucht. Dabei zeigte sich, dass für diese Wirkung wahr- scheinlich nicht nur eine Komponente verantwortlich ist, sondern das Zusammenspiel von mehreren Fraktionen. Die Substanzen scheinen auch nicht UV-aktiv zu sein. Die Arbeiten wurden nicht weiterverfolgt.
93 Ergebnisse
III.2.2 Aufreinigung und Strukturaufklärung der Polyene Thailandin A und B
Aufgrund der antifungalen Wirkung und den charakteristischen UV/vis-Spektren der produzierten Substanzen in HA-, SG- und MS-Medium wurde vermutet, dass es sich hierbei um Polyene handelt. Diese Substanzen sollten weiter aufgereinigt und die Strukturen mittels NMR bestimmt werden. Diese Arbeiten wurden von Bungonsiri Intra durchgeführt.
Der Stamm A. bangkokensis wurde zehn Tage in HA-Medium kultiviert und mit Ethylacetat extrahiert (II.2.6.2). Die Substanzen 1, 2 und 3 wurden mittels präparativer HPLC (II.2.6.3.3) aufgereinigt. In einem weiteren Hemmhoftest zeigten Substanz 2 und Substanz 3 eine deutliche Hemmung gegen Pilze, Substanz 1 jedoch nicht. Daher wurden Substanz 2 und 3 im großen Maßstab aufgereinigt. Aus 12 L Kultur konnten 11,4 mg Substanz 2 und 10,1 mg Substanz 3 aufgereinigt werden.
Die Substanzen 2 und 3 wurden zusammen mit Nystatin und Amphotericin B über die HPLC analysiert. Dabei zeigten sich eindeutige Unterschiede in den Retentionszeiten und in den Massen- spektren, wohingegen die UV/vis-Spektren sehr ähnlich waren. Weiterhin wurden die Metabolite gegen die Fiedler-Datenbank (durchgeführt von Andreas Kulik, AG Wohlleben, Universität Tübingen) getestet. Dabei konnte auch kein Treffer erzielt werden. Daher wurde vermutet, dass es sich bei den Substanzen um neue Polyene handeln könnte.
Die Strukturaufklärung von Substanz 2 und 3 wurden von Dr. Thomas Paululat der Universität Siegen durchgeführt. Die NMR-Analyse (siehe Anhang, Tab. 44) ergab, dass es sich bei den Substanzen wie erwartet um Polyene handelt. Beide Substanzen bestehen aus einem macrocyclischen Lactonring bestehend aus 27 C-Atomen mit zwei Methylgruppen, sechs Hydroxylgruppen und fünf konjugierten
Doppelbindungen. Substanz 2 ist an C15 rhamnosyliert (siehe Abb. 33). Die Substanzen wurden Thailandin A (Substanz 2) und Thailandin B (Substanz 3) genannt.
Thailandin A R =
Thailandin B R = OH
R Abb. 33: Struktur von Thailandin A und Thailandin B
94 Ergebnisse
III.2.3 Identifikation des Thailandin-Biosynthesegenclusters in A. bangkokensis
Um das Thailandin-Biosynthesegencluster in A. bangkokensis zu identifizieren sollte das Genom nach Sekundärmetabolit-Gencluster untersucht werden. Zur Bestätigung des Clusters und zur Überprüfung, ob der Stamm genetisch manipulierbar ist, sollte das Cluster mit einem Single-Crossover unterbrochen werden.
III.2.3.1 PKS I - Sekundärmetabolitgencluster in A. bangkokenesis Das Programm antiSMASH erkannte 35 Sekundärmetabolitgencluster im Genom von A. bangkokensis (siehe Anhang, Tab. 42). Bei Cluster #11, #16 und #19 handelt es sich um große Polyketidsynthasen I (>100 kb). Die Anzahl der Module, die Anwesenheit von reduktiven Domänen und die Spezifitäten der Acyltransferasen von Cluster #11 stimmen am besten mit der Thailandin-Struktur überein, obwohl in diesem Cluster keine Glycosyltransferase vorhanden ist. Cluster #16 und #19 kodieren für weit mehr PKS-Module mit Glycosyltransferasegenen. Ein Überblick über die Anzahl der PKS-Module, die jeweils postulierte Struktur und Anzahl der Glycosyltransferasegene von Cluster #11, #16 und #19 ist in Tab. 36 aufgelistet. Da Cluster #19 am Ende eines Scaffolds liegt, können in diesem Cluster noch weitere PKS- und Glycosyltransferasegene vorhanden sein.
Tab. 36: Postulierte Strukturen der PKS-Biosynthesegencluster aus A. bangkokensis Anzahl Anzahl Cluster Postulierte Struktur Glycosyl- Module transferasen
11 14 0
16 20 9
19 24+ X 2+
+ eventuell noch mehr Gene vorhanden
III.2.3.2 Verifizierung des PKS-Clusters #11 durch einen Single-Crossover Um herauszufinden, ob das PKS-Cluster #11 für die Biosynthese von Thailandin verantwortlich ist, sollte ein Single-Crossover des ersten PKS-Gens (thaBI) durchgeführt werden. Der Stamm A. bangkokensis ist resistent gegenüber den Laborgängingen Antibiotika Apramycin und Spectino- mycin (Rommel, 2014). Daher wurde der Suizid-Vektor pKCLP2_gusA mit einer Hygromycin- Resistenzkassette verwendet. Die Klonierung des Single-Crossover-Vektors wurde im Rahmen der Bachelorarbeit von Marcel Rommel (2014) durchgeführt.
Ein 3,5 kb großes, internes Fragment des ersten PKS-Gens wurde mittels PCR amplifiziert und nach Zwischenklonierung in pUC19 in den Vektor pKCLP2_gusA kloniert (II.2.4.9.1). Mittels Konjugation sollte pKCLP2_gusA_PKS11 (siehe Abb. 15) von E. coli ET12456 pUB308 in A. bangkokensis gebracht werden. Viele Konjugationsversuche auf MS-Platten mit 10 mM MgCl2 schlugen trotz
95 Ergebnisse
A. bangkokensis WT 1500
1000
[mAU] 500
nm 0
330 330
A. bangkokensis PKS11::pKCLP2 1500
1000
Absorption Absorption 500
0 0 5 10 15 20 25 30 Zeit [min]
Abb. 34: HPLC-Chromatogramme der Rohextrakte aus A. bangkokensis WT und der Mutante mit unterbrochenem PKS-Gen aus Cluster 11 HPLC-Chromatogramme der Rohextrakte aus A. bangkokensis WT (oben) und der Mutante mit unterbrochenem PKS-Gen (thaBI) aus
Cluster #11 (unten) bei einer Wellenlänge von 320 nm; Pfeile zeigen Thailandin A (tR 17.6 min) und Thailandin B (tR 18.4 min); die Mutante PKS11::pKCLP2 produziert kein Thailandin.
Variierung des Protokols fehl. Auch nach Elektroporation und Protoplastentransformation konnten keine Klone regeneriert werden. Erst die Zugabe von 10 mM CaCl2 zum MS-Medium führte zu Exkonjuganten, die Hygromycin resistent waren. Die Mutante A. bangkokensis PKS11::pKCLP2 wurde in HA-Medium kultiviert und die Sekundärmetabolite mittels extrahiert (II.2.6.2). Die HPLC/MS-Analyse zeigt, dass die generierte Mutante kein Thailandin mehr produziert (siehe Abb. 34). Das bestätigt, dass das Cluster #11 für die Biosynthese von Thailandin verantwortlich ist.
III.2.3.3 Das Thailandin-Biosynthesegencluster Das Cluster #11 konnte als das Thailandin(tha)-Biosynthesegencluster bestimmt werden. Da bei der Genomsequenzierung eine Lücke im Cluster durch Alignment nicht geschlossen werden konnte, musste diese manuell sequenziert werden. Dazu wurden geeignete Primer abgeleitet (Gap_11_for/rev), die Lücke mittels PCR amplifiziert und nach Zwischenklonierung in den pUC19-Vektor sequenziert. Dadurch konnte die Lücke mit 981 bp geschlossen werden.
Die ORFs des tha-Clusters wurden bestimmt und mittels BLAST-Analyse genauer untersucht. Das Cluster hat eine Größe von 105,8 kb mit 37 ORFs. Die vorhergesagten Funktionen der einzelnen Gene sind in Tabelle 37 aufgelistet, die genetische Organisation des tha-Clusters ist in Abbildung 35 dargestellt.
Die Polyketidsynthase I setzt sich aus vier Enzymen mit vierzehn Modulen zusammen, einem Lademodul mit dreizehn Extendermodulen, die von den Genen thaBI, thaBII, thaBIII und thaBIV kodiert werden. Diese haben folgende Domänenarchitektur: ThaBI [(KS-AT-ACP)-(KS-AT-KR- ACP)-(KS-AT-DH-KR-ACP)-(KS-AT-DH-KR-ACP)-(KS-AT-DH-KR-ACP)-Dock], ThaBII [Dock- (KS-AT-DH-KR-ACP)-(KS-AT-DH-KR-ACP)-Dock], ThaBIII [Dock-(KS-AT-DH-KR-ACP)-(KS- AT-KR-ACP)-(KS-AT-KR-ACP)-(KS-AT-KR-ACP)-(KS-AT-KR-ACP)-Dock] und ThaBIV [Dock-
96 Ergebnisse
(KS-AT-KR-ACP)-(KS-AT-KR-ACP)-TE]. Dabei liegen die Module immer komplett auf einem Enzym und werden nicht unterbrochen. An den N- und C-Termini der PKS-Enzyme konnten Docking- Domänen identifiziert werden.
20000 40000 60000 80000 100000 bp
PKS Typ I Regulation Andere Funktion
Modifikation Transport Unbekannte Funktion
Abb. 35: Das Thailandin-Biosynthesegencluster in Actinokineospora bangkokensis Das tha-Biosynthesegencluster hat eine Größe von 105,8 kb mit 37 ORFs. Die postulierten Funktionen der einzelnen Gene sind farblich dargestellt: PKS I (gelb), Modifikation (rot), Regulation (grün), Transport (blau), andere Funktion (grau), unbekannte Funktion (weiss).
Das tha-Cluster kodiert zusätzlich für eine Crotonyl-CoA-Reduktase (ThaC), acht Regulatoren (ThaRI-ThaRVIII), einen MFS-Transporter (ThaT), vier Reduktasen (ThaOI-ThaOIV) und weitere Proteine, bei denen die Enzymfunktionen durch Sequenzvergleiche postuliert werden konnten (siehe Tab. 37). Weiterhin wurden dreizehn ORFs (thaHI-thaHXIII) identifiziert, bei denen durch blasten keine Funktionen zugeordnet wurden. Kein ORF im Cluster zeigt Ähnlichkeiten zu einer Glycosyl- transferase.
Die ORFs des Thailandin-Clusters zeigen große Ähnlichkeiten zu ORFs von anderen Actinokineo- spora-Stämmen, aber auch zu Stämmen der Gattungen Streptomyces, Amycolatopsis, Nocardia, Saccharomonospora, Kibdelosporangium, Blastococcus und anderen. Die niedrigen Sequenz- Identitäten und die Tatsache, dass die ähnlichsten Gene in verschiedenen Stämmen vorkommen, lässt vermuten, dass dieses Cluster in keinem anderen, bislang identifizierten Stamm vorkommt.
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Tab. 37: Postulierte Funktionen der ORFs des Thailandin-Biosynthesegenclusters in Actinokineospora bangkokensis 44EHWT Gen- Größe Max Total Query Start Stop Strang AS Postulierte Funktion E-Wert Identität Accessionnummer annotation [bp] Score Score Cover thaAI 1 492 492 163 Histidin-Kinase [Actinokineospora inagensis] 198 198 92 % 7,00E-57 74 % WP_026422069.1
thaHI 1184 474 C 711 236 hypothetisches Protein [Actinokineospora spheciospongiae] 157 157 95 % 9,00E-43 46 % WP_052021469.1 thaRI 1204 1791 588 195 MarR-Transkriptionsfaktor [Kibdelosporangium sp. MJ126-NF4] 166 166 72 % 2,00E-49 60 % WP_052477567.1
thaHII 1797 2399 603 200 hypothetisches Protein [Kibdelosporangium phytohabitans] 234 234 99 % 3,00E-75 62 % WP_054291478.1
thaHIII 3504 2344 C 1161 386 hypothetisches Protein [Kibdelosporangium phytohabitans] 339 339 95 % 5,00E-111 54 % WP_054291480.1 thaOI 3687 4643 957 318 F420-abh.-Oxidoreduktase [Actinokineospora spheciospongiae] 510 510 99 % 0.0 78 % WP_035286137.1
thaHIV 4752 5138 387 128 hypothetisches Protein [Streptomycetaceae bacterium MP113-05] 53,5 53,5 84 % 1,00E-06 35 % WP_023532251.1
thaM 5202 5981 780 259 alpha/beta Hydrolase [Amycolatopsis sp. ATCC 39116] 348 348 96 % 5,00E-119 68 % WP_020417125.1
thaHV 6194 6931 738 245 hypothetisches Protein [Actinokineospora enzanensis] 244 244 99 % 6,00E-78 53 % WP_018687146.1
thaHVI 7583 6942 C 642 213 Protein mit CBS-Domäne [Saccharomonospora xinjiangensis] 140 140 98 % 2,00E-38 46 % WP_006240346.1 thaRII 8267 11128 2862 953 LuxR-Transkriptionsfaktor [Streptomyces himastatinicus] 724 724 98 % 0.0 47 % WP_009712643.1
thaRIII 11125 13896 2772 923 LuxR-Transkriptionsfaktor [Amycolatopsis azurea] 377 377 97 % 1,00E-112 38 % WP_005165580.1
thaRIV 13899 16664 2766 921 LuxR-Transkriptionsfaktor [Streptomyces sp. TAA204] 434 434 99 % 4,00E-134 38 % WP_028429935.1
thaRV 17641 18366 726 241 LuxR-Transkriptionsfaktor [Allokutzneria albata] 152 152 86 % 1,00E-42 41 % WP_043813579.1
thaOII 18443 19651 1209 402 P450 Monooxygenase [Streptomyces sp. LamerLS-31b] 558 558 99 % 0.0 69 % SCF99418.1
thaF 19666 19866 201 66 Ferredoxin [Streptomyces niger] 90,1 90,1 93 % 1,00E-22 73 % WP_052863176.1
thaBI 20001 42575 22575 7524 Polyketidsynthase Typ I [Streptomyces sp. MBT76] 8080 8080 99 % 0.0 60 % WP_058042044.1
thaBII 42625 53130 10506 3501 Polyketidsynthase Typ I [Streptomyces avermitilis] 3632 3632 99 % 0.0 59 % WP_010981855.1
thaBIII 53166 76223 23058 7685 Polyketidsynthase Typ I [Streptomyces sp. NRRL B-24891] 7015 23935 99 % 0.0 54 % WP_046501326.1
thaBIV 76276 86208 9933 3310 Polyketidsynthase Typ I [Streptomyces avermitilis] 3371 3371 99 % 0.0 58 % WP_010981852.1
Crotonyl-CoA Carboxylase/Reduktase thaC 86350 87606 1257 418 611 611 99 % 0.0 71 % WP_031163147.1 [Streptomyces durhamensis] thaOIII 87635 88861 1227 408 P450 Monooxygenase [Streptomyces avermitilis] 513 513 97 % 4,00E-179 65 % WP_010981850.1
thaD 88947 89834 888 295 Phosphatase [Streptomyces regensis] 326 326 86 % 3,00E-109 70 % KMS86598.1
thaHVII 89963 90856 894 297 hypothetisches Protein [Blastococcus sp. URHD0036] 359 359 88 % 4,00E-119 70 % WP_029429682.1
thaHVIII 90989 91525 537 178 hypothetisches Protein [Blastococcus sp. URHD0036] 172 172 99 % 3,00E-48 60 % WP_029429682.1
thaAII 91563 93032 1470 489 Chromosomsegregation ATPase [Kibdelosporangium aridum] 659 659 91 % 0.0 71 % WP_033388563.1
thaHIX 93245 93613 369 122 hypothetisches Protein [Lentzea sp. DHS C013] 149 149 99 % 2,00E-43 65 % WP_065921532.1
thaHX 94574 93618 C 957 318 hypothetisches Protein [Mycobacterium sp. Root135] 451 451 96 % 3,00E-157 72 % WP_056551583.1 thaOIV 95637 94744 C 894 297 Oxidoreduktase [Nocardia niigatensis] 305 305 94 % 2,00E-100 63 % WP_040853515.1 thaRVI 95653 96582 930 309 LuxR-Transkriptionsfaktor [Saccharomonospora sp. CNQ490] 244 244 100 % 4,00E-76 46 % WP_024875146.1
thaHXI 96727 97629 903 300 hypothetisches Protein [Actinokineospora spheciospongiae] 399 399 99 % 3,00E-137 69 % WP_035290342.1
thaAIII 99346 97757 C 1590 529 Serinprotease [Actinokineospora spheciospongiae] 757 757 100 % 0.0 73 % WP_035283404.1 thaRVII 99688 102615 2928 975 LuxR-Transkriptionsfaktor [Actinokineospora inagensis] 1277 1277 97 % 0.0 69 % WP_026424647.1
thaRVIII 103647 102751 897 298 LysR-Transkriptionsfaktor [Alloactinosynnema sp. L-07] 393 393 96 % 2,00E-135 70 % CRK56104.1
thaT 103720 104937 1218 405 MFS Transporter [Blastococcus saxobsidens] 471 471 97 % 2,00E-162 68 % WP_041775753.1
thaHXII 105010 105378 369 122 hypothetisches Protein [Actinokineospora inagensis] 102 102 82 % 5,00E-26 55 % WP_026422814.1
thaHXIII 105375 105764 390 129 hypothetisches Protein [Actinokineospora inagensis] 105 105 100 % 2,00E-25 50 % WP_051385722.1
Ergebnisse
III.3 Kombinatorische Biosynthese von Polyketomycin und Avilamycin
Um durch die Neukombination von Genen neue Antibiotika zu schaffen, sollten die Methylsalicyl- säure von Polyketomycin in S. diastatochromogenes Tü6028 und die Orsellinsäure von Avilamycin in S. viridochromogenes Tü57 ausgetauscht werden. Diese Derivate werden von iterativen PKS Typ I synthetisiert, sogennanten 6-Methylsalicylsäuresynthasen (6MSAS). Die entsprechenden Gene sollten zuerst deletiert und anschließend durch die jeweils homologen Gene komplemetiert werden.
Im Polyketomycin-Biosynthesegencluster von S. diastatochromogenes Tü6028 kodiert das Gen pokM1 für die Polyketidsynthase mit den Domänen KS, AT, DH, KR und ACP. Die Gene pokM2, pokM3 und pokMT1 kodieren für eine -Ketoacyl-ACP-Synthase, eine Salicyl-AMP-Ligase und eine Methyltransferase. Die vier Gene liegen in gleicher Orientierung und pokM1, pokM2 und pokM3 überlappen sich. Sie überspannen eine Länge von 8994 bp.
Im Biosynthesegencluster von Avilamycin in S. viridochromogenes Tü57 wird die iterative PKS I von dem Gen aviM kodiert. Im Gegensatz zu PokM1 hat AviM keine KR-Domäne. Das davon downstream liegende aviN ist homolog zu pokM2. Die überlappenden Gene haben zusammen eine Größe von 4909 bp. AviN/PokM2 haben eine 42,1 % und AviM/PokM1 eine 51,2 % Sequenzidentität. In Abbildung 54 (Diskussion, IV.3) ist die Organisation der pokM1, pokM2, pokM3 und pokMT (pokMs) und aviN und aviM (aviNM) sowie die Domänenorganisationen dargestellt.
III.3.1 Deletion der 6MSAS in Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 und Strepto- myces viridochromogenes Tü57
In S. diastatochromogenes Tü6028 sollten die Gene pokM1, pokM2, pokM3 und pokMT1 und in S. viridochromogenes Tü57 die Gene aviN und aviM durch einen Doppel-Crossover deletiert werden.
III.3.1.1 Deletion von pokM1, pokM2, pokM3 und pokMT1 in S. diastatochromogenes Tü6028 Zur Deletion der vier Gene pokM1, pokM2, pokM3 und pokMT1 in S. diastatochromogenes Tü6028 wurden homologe Fragmente upsteam und downstream in den Suizidvektor pKC1132 kloniert, dazwischen wurde eine Spectinomycin-Resistenzkassette ligiert (II.2.4.9.2). Der Doppel-Crossover- Vektor pKC1132_DC_pokMs (siehe Abb. 16) sollte mittels intergenerischer Konjugation von E. coli ET12456 in S. diastatochromogenes Tü6028 gebracht werden. Nach vielen Konjugationsversuchen wuchsen einzelne Kolonien auf Apramycin- und Spectinomycin-haltigen Agarplatten an. Hier konnte durch einen Single-Crossover der Vektor in das Genom integrieren. Ein Klon wurde gepickt und 20x in TSB-Medium mit Spectinomycin passagiert. Anschließend wurde die Streptomyceten-Kultur in mehreren Verdünnungsstufen ausplattiert. Angewachsene Einzelkolonien wurden je auf Apramycin- und Spectinomycin-haltigen Nährplatten ausgestrichen. Von etwa 2000 gepickten Klonen war einer Spectinomycin-resistent und Apramycin-sensitiv. Dieser Klon wurde in Flüssigmedium angeimpft.
99 Ergebnisse
Nach drei Tagen wurde genomische DNA isoliert (II.2.2.1a) und die Deletion der pokM-Gene konnte mittels PCR bestätigt werden. Mit dem Primerpaar DMSA-Komp-for/-rev konnten in der generierten Mutante (S. diastatochromogenes ∆pokMs) nur unspezifische Fragmente amplifiziert werden, während mit der WT-DNA das erwartete 8 kb Fragment nach Gelelektrophorese zu sehen war (siehe Abb. 36).
A Gelelektrophorese Teil des Polyketomycin-Genclusters B S. diastatochromogenes WT Leiter [kb] 5000 10000 15000 10 8 6 5 S. diastatochromogenes ∆pokMs 4 5000 3 Primer
2
1.5 Erwartete Größen der PCR-Produkte C 1 Primerpaar WT ∆pokMs
DMSA-Komp-for 0.5 7942 bp - DMSA-Komp-rev
Up_pokM_for (13122 bp) 4909 bp Primer- Down_pokM_rev paar
Abb. 36: Gelelektrophoresebild der Kontroll-PCR zur Überprüfung der Deletion von pokM1, pokM2, pokM3 und pokMT1 in S. diastatochromogenes Tü6028 (A) Gelelektrophoresebild der Kontroll-PCR mit Primerpaar DMSA-Komp-for x DMSA-Komp-rev (links) und Up_pokM_for x
Down_pokM_rev (rechts), Negativkontrolle (-) H2O; (B) Teilabschnitt des Polyketomycin-Genclusters in S. diastatochromogenes Wildtyp und ∆pokMs-Mutante; (C) erwartete Fragmentgrößen der PCR-Produkte.
Bei der Kontroll-PCR mit dem Primerpaar Up_pokM_for/Down_pokM_rev wurde in der ∆pokM- Mutante ein etwa 4 kb großes Fragment amplifiziert, anstatt den erwarteten 4,9 kb (siehe Abb. 36A, rechts). Weitere Kontroll-PCRs (nicht gezeigt) sowie mehrere Sequenzierungen zeigten, dass neben den gewünschten pokM-Genen auch ein Teil des pokS3-Gens deletiert wurde. Das Gen pokS3 kodiert für eine Hexose-Dehydratase und katalysiert die Umwandlung von dNTP-D-Hexose zu dNTP-D-4- keto-6-Desoxyhexose. Die Mutante S. diastatochromogenes ∆pokMs wurde sechs Tage in HA- Medium inkubiert und anschließend die produzierten Sekundärmetabolite extrahiert (II.2.6.2). Im Gegensatz zum Wildtyp produziert diese Mutante kein Polyketomycin mehr. Im HPLC- Chromatogramm sind kleine Peaks vorhanden, die Vorstufen von Polyketomycin darstellen könnten (siehe Abb. 37 Mitte). Eine Substanz mit der Masse des Viererringsystems mit den zwei
Desoxyzuckern D-Amicetose und L-Axenose konnte jedoch nicht identifiziert werden.
Um den pokS3-Gendefekt zu komplementieren, sollte eine zusätzliche Kopie des Gens eingebracht werden. Das Gen pokS3 liegt vor pokS4, pokU1 und pokU2. Das Gen pokS4 kodiert für eine Hexose- Oxidoreduktase, pokU1 für eine Flavin-Reduktase und pokU2 für eine Monooxygenase. Da die vier Gene anscheinend in einem Operon liegen, wurden sie zusammen in den Vektor pUWL-T kloniert
100 Ergebnisse
S. diastatochromogenes Tü6028 Wildtyp I
1200 1000 800 600 400 200 Absorption [mAU] Absorption 0
S. diastatochromogenes ΔpokMs
1750 II 1500 1250 1000 III 750 500 250 0
IV S. diastatochromogenes ΔpokMs pUWL_pokS34U12
1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 Absorption [mAU] Absorption 0 [mAU] Absorption 0 5 10 15 20 25 30 A Zeit [min]
1750 I 350 II 1200 III 1200 IV 1500 300 1000 1000 1250 250 800 800 1000 200 600 600 750 150 400 400 500 100 250 50 200 200 Absorption [mAU] Absorption 0 0 0 0 200 300 400 500 200 300 400 500 200 300 400 500 200 300 400 500 B Wellenlänge [nm] Wellenlänge [nm] Wellenlänge [nm] Wellenlänge [nm]
100 I 100 II 100 IIIIV 100 863.7 563.3 713.5 80 80 80 443.6 80
60 60 60 60
40 40 40 40
20 20 20 20
relative Absorption [%] relative Absorption 0 0 0 0 500 500 500 500 C Masse/Ladung [m/z] Masse/Ladung [m/z] Masse/Ladung [m/z] Masse/Ladung [m/z]
Abb. 37: HPLC-Analyse von Rohextrakten aus S. diastatochromogenes Tü6028 Wildtyp, der ΔpokMs-Mutanten und der Mutanten ΔpokMs pUWL_pokS34U12 (A) HPLC-Chromatogramme von Rohextrakten aus S. diastatochromogenes Tü6028 Wildtyp (oben), Mutante ΔpokMs (Mitte) und ΔpokMs pUWL_pokS34U12 (unten) bei β45 nm, einzelne Peaks sind durch einen Pfeil markiert und von I – IV nummeriert; (B) UV/vis-Spektren der Peaks I - IV; (C) negatives Massenspektrum [M-H]- der Peaks I – IV.
(II.2.4.9.6). Der Vektor pUWL-pokS34U12 (siehe Abb. 20) wurde mittels Konjugation in S. dia- statochromogenes ∆pokMs transferiert. Die erhaltene Mutante S. diastatochromogenes ∆pokMs pUWL_pokS34U12 wurde in HA-Medium für sechs Tage inkubiert und die Sekundärmetabolit- Produktion im Mycel und im Kulturüberstand analysiert. Im HPLC-Chromatogramm der Mycelprobe konnte ein Peak mit einer Retentionszeit von 21 min und einer Masse von 713,5 [M-H]- detektiert
101 Ergebnisse werden (siehe Abb. 37, Peak IV). Die berechnete Masse des Polyketomycin-Moleküls ohne Dimethyl- salicylsäure beträgt 716,7 g/mol. Der Unterschied von 2 Masseneinheiten könnte ein Derivat sein, bei dem zwei Ketogruppen noch nicht reduziert sind. Der pokS3-Defekt konnte demnach erfolgreich komplementiert werden und eine Mutante generiert werden, in der Polyketomycin ohne Dimethyl- salicylsäure synthetisiert wird.
III.3.1.2 Deletion von aviN und aviM in S. viridochromogenes Tü57 Die zwei Gene aviN und aviM sollten in S. viridochromogenes Tü57 auch durch einen Doppel- Crossover deletiert werden. Dazu wurden je ein Upstream- und Downstream-Fragment und die Spectinomycin-Resistenzkassette in den Suizidvektor pKC1132 kloniert (II.2.4.9.3). Der Doppel- Crossover-Vektor pKC1132_DC_aviNM (siehe Abb. 17) sollte in S. viridochromogenes Tü57 transferiert werden. In früheren Arbeiten konnte S. viridochromogenes Tü57 durch Konjugation nicht genetisch manipuliert werden, stattdessen wurde die aufwendigere Methode der Protoplasten-
A Gelelektrophorese Teil des Avilamycin-Genclusters B
S. viridochromogenes WT
Primer- 2000 4000 6000 8000 10000 paar aviG1 aviJ aviN aviM aviD aviE1
Leiter S. viridochromogenes ∆aviNM [kb] 2000 4000 6000 10 8 aviG1 aviJ SpecR aviD aviE1 6 5 4 3 Primer 2 1.5 1 Erwartete Größe der PCR-Produkte C 0.5
aviNM:: Primerpaar WT aviNM pKC1132 ∆
aviNM_for 4957 bp 4957 bp - aviNM_rev Leiter [kb] Up_avi_for 9163 bp 5212 bp 5212 bp Down_avi_rev 10 8 6 5 4 pKC1132_ pTESb_ Negativ- 3 Primerpaar 2 KO_aviNM aviNM kontrolle 1.5 aviNM_for - 4957 bp - 1 aviNM_rev
0.5 Up_avi_for 5212 bp -- Down_avi_rev
Abb. 38: Gelelektrophoresebild der Kontroll-PCR zur Überprüfung der Deletion von aviNM in S. viridochromogenes Tü57 (A) Gelelektrophoresebild der Kontroll-PCR mit Primerpaar aviNM_for/_rev (oben) und Up_avi_for x Down_avi_rev (unten); WT: Wildtyp; aviNM::pKC1132: Single-Crossover-Mutante; ΔaviNM: Doppel-Crossover-Mutante; pKC1132_KO_aviNM: Doppel-Crossover- vektor; pTESb_aviNM: Komplementierungsvektor; - Negativkontrolle: H2O; (B) Teilabschnitt des Avilamycin-Genclusters in S. virido- chromogenes Wildtyp und in der ∆aviNM-Mutante; (C) erwartete Fragmentgrößen der PCR-Produkte.
102 Ergebnisse
transformation durchgeführt. Die Supplementierung von 10 mM CaCl2 anstatt von MgCl2 im MS- Medium führte in dieser Arbeit aber schon nach dem ersten Konjugationsversuch zu vielen positiven Single-Crossover-Klonen. Ein Klon wurde 15x in TSB-Medium unter Spectinomycin-Selektionsdruck passagiert, anschließend wurden mehrere Verdünnungsstufen einer Kultur auf Nährplatten ausplattiert. Einzelne Klone wurden auf je Apramycin- und Spectinomycin-haltigen Nährplatten ausgestrichen. Unter etwa 500 gepickten Klonen waren mehrere Kolonien Spectinomycin-resistent und Apramycin- sensitiv. Von diesen wurde genomische DNA isoliert. In der Mutanten S. viridochromogenes ΔaviNM konnte die Deletion der zwei Gene mittels PCR bestätigt werden (siehe Abb. 38).
Der Wildtyp S. viridochromogenes und die Mutante ΔaviNM wurden wie unter II.2.1.2 beschrieben in SG-Medium mit NaCl inkubiert und anschließend mit Ethylacetat extrahiert. In der Mutante konnten wie erwartet weder im Mycel noch im Kulturüberstand Avilamycine nachgewiesen werden (siehe Abb. 39).
S. viridochromogenes Tü57 1400 Wildtyp 1200 1000 800 600 400 200 [mAU] 0
245nm 0 5 10 15 20 25 30
2500 S. viridochromogenes Tü57 ΔaviNM 2000 Absorption Absorption
1500
1000
500
0 0 5 10 15 20 25 30 Zeit [min]
Abb. 39: HPLC-Chromatogramme von Rohextrakten aus S. viridochromogenes Tü57 Wildtyp und der ΔaviNM-Mutante HPLC-Chromatogramm von Rohextrakten aus S. viridochromogenes Tü57 Wildtyp (oben) und S. viridochromogenes ΔaviNM (unten) bei β45 nm; Pfeile markieren verschiedene Avilamycin-Derivate; in der ΔaviNM-Mutante konnten keine Avilamycine detektiert werden.
III.3.2 Komplementierung von S. diastatochromogenes ΔpokMs pUWL_pokS34U12 und S. viridochromogenes ΔaviNM
Um neue Polyketomycin- und Avilamycin-Derivate zu erhalten, sollten die 6MSAS-Gene des jeweils anderen Stammes in die Mutanten eingebracht werden. Um polare Effekte auszuschließen, sollten die zwei Mutanten S. diastatochromogenes ΔpokMs und S. viridochromogenes ΔaviNM zusätzlich mit den eigenen Genen komplementiert werden. Diese Mutanten sollten wieder Polyketomycin bzw. Avila- mycin produzieren.
103 Ergebnisse
Für die Komplemetierung sollten die pokM-Gene zusammen kloniert werden. Da diese aufgrund einer Länge von 9019 bp mittels PCR trotz Verwendung verschiedener Polymerasen und Bedingungen nicht amplifiziert werden konnten, wurden nur die Gene pokM1, pokM2 und pokM3 mit einer Länge von 7942 bp vervielfältigt und nach Zwischenklonierung in den Endvektor pTESb kloniert (II.2.4.9.4). Die Methyltransferase PokMT1 sollte für die Biosynthese der Methylsalicylsäure nicht notwendig sein. Auch die Gene aviN und aviM konnten erfolgreich in den Vektor pTESb kloniert werden (II.2.4.9.5). Dort liegen die Gene jeweils hinter dem konstitutiven ermE-Promotor und sollten in Streptomyceten stark exprimiert werden.
Die Vektoren pTESb_pokMs (siehe Abb. 18) und pTESb_aviNM (siehe Abb. 19) wurden jeweils mittels Konjugation in die Mutanten S. diastatochromogenes ∆pokMs pUWL_pokS34U12 und S. viridochromogenes ΔaviNM transferiert. Die erhaltenen Klone waren zusätzlich Apramycin- resistent. Die Mutanten wurden sechs Tage in Produktionsmedium inkubiert und deren Sekundär- metabolit-Produktion nach Extraktion über HPLC/MS analysiert. Weder die Komplementierung mit den eigenen Genen, noch die mit den homologen Genen des anderen Stammes, führte zu einem veränderten Produktionsprofil (Daten nicht gezeigt). Dabei wurden bei unterschiedlichen Inkubations- zeiten und HPLC-Bedingungen (C8- und C18-Säule) gemessen. Auch der Transfer der Vektoren in den jeweiligen WT-Stamm führte zu keiner gesteigerten Polyketomycin- oder Avilamycin-Produktion (Daten nicht gezeigt).
III.3.3 Heterologe Expression von pokMs und aviNM in Streptomyces albus
Da trotz der Expression der pokMs- und aviNM-Gene in S. diastatochromogenes und S. viridochromo- genes nach HPLC/MS-Analyse keine Salicylsäure-Derivate bzw. Polyketomycin-/Avilamycin- Derivate detektiert werden konnten, wurden die Vektoren pTESb_pokMs und pTESb_aviNM in den heterologen Wirt Streptomyces albus transferiert. Die Mutanten wurden in HA-Medium für drei und sechs Tage inkubiert und anschließend das Mycel und der Kulturüberstand mit Ethylacetat extrahiert (II.2.6.2). Die Rohextrakte wurden über HPLC/MS (C8- und C18-Säule) analysiert. Auch hier konnten keine Salicylsäure-Derivate detektiert werden (Daten nicht gezeigt).
104 Ergebnisse
III.4 Untersuchungen von Foxicin aus Streptomyces diastatochromogenes Tü6028
Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 produziert neben Polyketomycin auch mehrere Foxicin- Derivate. Die Struktur von Foxicin A (vorher IP1) wurde nach NMR-Analyse von Iris Peintner als 4- (Acetylamino)-3-Hydroxy-6-(2,4,6-Trimethylhepta-2,5-Dienoylamino)-1,2-Benzoquinon identifiziert (Peintner, 2008). Um die Struktur von Foxicin A weiter aufzuklären, sowie den Unterschied zu Foxicin B zu untersuchen, sollten weitere Versuche durchgeführt werden. Außerdem sollte das Biosynthesegencluster im Genom identifiziert und experimentell bestätigt werden. Die biologische Aktivität von Foxicin sollte in verschiedenen Versuchen untersucht werden.
III.4.1 Aufreinigung von Foxicin A und Foxicin B
Zur Strukturaufklärung, sowie für die Durchführung von Aktivitätsassays, wurden größere Mengen an Foxicin A und Foxicin B aufgereinigt. Dazu wurde der Stamm S. diastatochromogenes ΔpokOIV sechs Tage in 5 L HA-Medium inkubiert und anschließend wurden die produzierten Substanzen extrahiert (II.2.6.2). Über die folgenden Schritte der Festphasenextraktion (II.2.6.3.1), Dünnschicht- chromatographie (II.2.6.3.2), präparativen HPLC (II.2.6.3.3) und Größenausschlusschromatographie (II.2.6.3.4) konnten Foxicin A und B erfolgreich aufgereinigt werden (siehe Abb. 40).
1500 A 1500 E 1000 1000
500 500
0 0
1500 B 500 F 1000 400 300 500 200 100 [mAU] 0 nm 254 254
600 C 1500 G 400 1000 200 500 0 0 Absorption Absorption
700 600 400 D 500 H 400 200 300 200 100 0
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30 Zeit [min] Zeit [min] Abb. 40: HPLC-Chromatogramme der einzelnen Aufreinigungsschritte von Foxicin A und Foxicin B
Aufreinigung von Foxicin A (links) und Foxicin B (rechts); Foxicin A (violett) mit einer tR von 15.8 min im HPLC-Chromatorgamm,
(A) Rohextrakt von S. diastatochromogenes ΔpokOIV, (B) 70 % SPE-Fraktion (C) Bande mit Rf 0,41 nach Dünnschichtchromatographie, (D) Fraktion nach präparativer HPLC; Foxicin B (grün) mit einer tR von 16.9 min, (E) Rohextrakt von S. diastatochromogenes ΔpokOIV,
(F) 80 % SPE-Fraktion, (G) Bande mit Rf 0,68 nach Dünnschichtchromatographie, (H) Fraktion nach präparativer HPLC.
Foxicin A konnte bei der Festphasenextraktion in der 65 % und in der 70 % MeOH-Fraktion von der Säule verdrängt werden, Foxicin B in der 70 % und 80 % MeOH-Fraktion. Bei der Dünnschicht- chromatographie unter Verwendung einer mobilen Phase von EtAc:HCOOH:H2O (44:3:3) zeigt
Foxicin A einen Rf-Wert von 0,41 und Foxicin B von 0,68. Während der präparativen HPLC mit dem Programm Foxi_Präp2 konnten Foxicin A mit einer Retentionszeit von 12,0 min und Foxicin B bei 12,8 min von der Säule verdrängt werden. Aus 5 L Kultur konnten 9,8 mg Foxicin A und 3,4 mg Foxicin B gewonnen werden.
105 Ergebnisse
III.4.2 Strukturuntersuchungen von Foxicin A und B
Foxicin A und Foxicin B zeigen bei der HPLC/MS-Analyse dieselben Massen- und Absorptions- spektren. Während Foxicin A violett gefärbt ist, hat Foxicin B eine eher bräunliche Farbe. Auch bei der Aufreinigung zeigen sie deutliche Unterschiede. Die Strukturen und Konfigurationen von beiden Substanzen sollten aufgeklärt werden.
III.4.2.1 Hochauflösende Massenspektrometrie von Foxicin A und Foxicin B Die aufgereinigten Substanzen Foxicin A und B wurden über die hochauflösende APCI/ESI-MS von Christoph Warth (Organische Chemie, Universität Freiburg) vermessen. Foxicin A hat eine Masse von + + 347,16034 [M+H] (kalkuliert für C18H23O5N2 347,16015) und 369,14224 [M+Na] (kalkuliert für
C18H22O5N2Na 369,14209) im positiven Massenspektrum (siehe Anhang, Abb. 89). Foxicin B zeigt dasselbe Massenspektrum mit 347,16034 [M+H]+ und 369,14227 [M+Na]+ (siehe Anhang, Abb. 90).
III.4.2.2 NMR-Analyse von Foxicin A und Foxicin B Foxicin A wurde bereits von Iris Peintner aufgereinigt und mittels NMR analysiert (Peintner, 2008). In dieser Arbeit wurde dieselbe Substanz nochmals vermessen, dieses Mal jedoch über die Varian VNMR-S600 Maschine von Dr. Thomas Paululat (Universität Siegen). Die NMR-Messung von Foxicin B wurde von Sascha Ferlaino der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Michael Müller (Pharma- zeutische und Medizinische Chemie, Universität Freiburg) mit einer Bruker DRX Avance 400 MHz durchgeführt (II.2.6.5.2).
Die NMR-Daten von Foxicin A wurden in CDCl3 und DMSO-d6 aufgenommen, Foxicin B in CDCl3. Im Anhang, Tabelle 45-47, sind die Werte der 1D NMR (1H, 13C) und 2D NMR (1H-1H-COSY, HSQC, H2BC und HMBC) Messungen zusammengefasst, die Abbildungen 71-88 zeigen die ent- sprechenden Spektren. Die 13C NMR-Spektren zeigen 18 Kohlenstoffsignale. Mittels HSQC konnten diese zu fünf Methyl-, drei Methin- und neun quartäre Kohlenstoffatomen zugeordnet werden. Das
Benzoquinon-System konnte durch den typischen Carbonyl-Shift (Foxicin A δC = 182.3 und δC =
178.6 ppm) identifiziert werden, wobei hier ein para-Quinon anstatt einem ortho-Quinon vermutet wurde. Der Quinon-Ring ist mit einer Hydroxylgruppe (Foxicin A δH = 13.0 ppm, Foxicin B δH = 13.69 ppm) und einem Aminoacetat an Position C-3 substituiert, das durch die HMBC-Korrelation C-2/6-H, C-2/1'-NH und C-4/1'-NH ermittelt wurde. Eine weitere Seitenkette befindet sich an Position C-5, die über eine Aminogruppe verknüpft ist (HMBC Signale C-4/1"-NH und C-6/1"-NH). Die Seitenkette hat zwei Doppelbindungen, die jeweils dreifach substituiert sind. Eine Doppelbindung ist mit einem Amid-Carbonyl konjugiert (HMBC Signal C-2"/4"-H) und hat eine Methylgruppe an C-3"
(HMBC Crosspeak C-2"/3"-CH3, 3"-CH3/4"-H). Das ROESY-Signal 3"-CH3/5"-H zeigt, dass diese Doppelbindung eine E-Konfiguration besitzt. Die zweite Doppelbindung liegt zwischen C-6" und C- 7", an Position C-7" sind weiterhin zwei Methylgruppen basierend auf HMBC-Korrelationen. Die zwei Doppelbindungen sind über eine C-5" Methingruppe verbunden, die ebenfalls methyliert ist
106 Ergebnisse
(COSY-Kopplung 4"-H/5"-H, 5"-H/6"-H und H2BC Signal C"-5/4"-H und C-5"/6"-H). Die wichtigen 2D Korrelationen von Foxicin A sind in Abbildung 41 gezeigt. Die Spektren von Foxicin A und B sind sehr ähnlich. Anhand dieser lassen sich die Unterschiede nicht ein- deutig klären. Abb. 41: Wichtige 2D NMR-Korrelationen von Foxicin A
III.4.2.3 VCD- und IR-Spektrometrie von Foxicin A und Foxicin B Um die absolute Konfiguration sowie die Unterschiede von Foxicin A und B zu klären, wurden die Substanzen weiter über deren VCD- und IR-Spektren analysiert. Die Messungen und Auswertungen wurden von Marija Marolt und Dr. Steffen Lüdeke (Pharmazeutische und Medizinische Chemie, Universität Freiburg) durchgeführt (II.2.6.5.3). Die Spektren von Foxicin A und B zeigen deutliche Unterschiede (siehe Abb. 42A/B). Die Auswert- ung ergab, dass es sich bei den zwei Substanzen tatsächlich um para-Quinone handelt und nicht wie vorher angenommen um ortho-Quinone (Peintner, 2008). Auch die E-Konfiguration konnte bestätigt werden. Weiter konnte durch den Vergleich der gemessenen mit den berechneten Spektren die 5"-CH3 in S-Position bestimmt werden. Der Vergleich zeigt zusätzlich, dass sich die Hydroxylgruppe von Foxicin A an C-2 und bei Foxicin B wahrscheinlich an Position C-6 des Quinon-Rings befindet. Die Übereinstimmung der Spektren ist bei Foxicin B (siehe Abb. 42B) jedoch nicht so hoch wie bei Foxicin A. Die Struktur von Foxicin A konnte schlussendlich als 2-Hydroxy-3-(Acetylamino)-5-(γʹʹ, 5ʹʹS, 7ʹʹ-trimethyl-hepta-γʹʹE, 6ʹʹ-dienoyl-amino)-1,4-Benzoquinon bestimmt werden (siehe Abb. 42C).
3' 2' 1' 3 4 5 1'' 2'' 3'' 5'' 7'' 4'' 6'' 8'' 2 6 3 3 1 x 10 x x 10 x ∆ε ∆ε Foxicin A: 2-Hydroxy-3-(Acetylamino)- 5-(γʹʹ, 5ʹʹS, 7ʹʹ-trimethyl-hepta-γʹʹE, 6ʹʹ- dienoylamino)-1,4-Benzoquinon
ε ε 3' 2' 1' 3 4 5 1'' 2'' 3'' 5'' 7'' 4'' 6'' 8'' 2 6 1
Foxicin B: 6-Hydroxy-3-(Acetylamino)- Molare Absorption, MolareAbsorption, MolareAbsorption, 5-(γʹʹ, 5ʹʹS, 7ʹʹ-trimethylhepta-γʹʹE, 6ʹʹ- dienoylamino)-1,4-Benzoquinon
ABWellenzahlen [cm-1] Wellenzahlen [cm-1] C Abb. 42: VCD-, IR-Spektren und Strukturen von Foxicin A und Foxicin B (A) VCD-Spektrum (oben) und IR-Spektrum (unten) von gemessenem Foxicin A (blau) und berechnetes Spektrum für 2-Hydroxy-3- (Acetylamino)-5-(3ʹʹ, 5ʹʹS, 7ʹʹ-trimethyl-hepta-3ʹʹE, 6ʹʹ-dienoylamino)-1,4-Benzoquinon (rot) (C, oben); (B) VCD-Spektrum (oben) und IR- Spektrum (unten) von gemessenem Foxicin B (grün) und berechnetes Spektrum für 6-Hydroxy-3-(Acetylamino)-5-(γʹʹ, 5ʹʹS, 7ʹʹ- trimethylhepta-3ʹʹE, 6ʹʹ-dienoylamino)-1,4-Benzoquinon (rot) (C, unten).
107 Ergebnisse
III.4.3 Aktivitätsbestimmung von Foxicin
III.4.3.1 Bestimmung der antibiotischen Wirkung von Foxicin
Um die antibiotische Wirkung von Foxicin A gegenüber verschiedenen Stämme zu testen, wurden mehrere Hemmhoftests durchgeführt (II.2.7.1.1). Dabei zeigten 100 µg Foxicin A eine schwache Hemmung der Actinomyceten-Stämme Streptomyces viridochromogenes Tü57 und Saccharothrix espanaensis, nicht aber von Actinokineospora bangkokensis und Mycobacterium smegmatis (siehe Tab. 38). Weiterhin gab es eine Hemmung der Cyanobakterien Synechococcus sp. PCC7002 und Synechocystis sp. PCC6803. Das Wachstum von B. subtilis, E. coli, den Pilzstämmen Candida para- psilosis und Fusarium verticilloides konnte unter gegebenen Bedingungen nicht gehemmt werden. Auch die Zugabe einer sublethalen Konzentration des -Lactam-Antibiotikums Carbenicillin erzielte bei den getesteten Bakterienstämmen keine stärkere Wachtumshemmung (Daten nicht gezeigt).
Tab. 38: Beeinflussung des Wachstums von verschiedenen Bakterien, Pilzen und Arabidopsis durch Foxicin A
ggf. weitere Reich Gram-Zuordnung Stamm Hemmung Einteilung - Mycobacterium smegmatis - Actinokineospora bangkokensis - Actinomycetales S. viridochromogenes Tü57 + (0,7 cm) Gram-positiv Saccharothrix espanaensis + (0,65 cm) Bacillus subtilis ATCC6051 - Bakterien Bakterien E. coli XL1-Blue - Gram-negativ Synechococcus sp. PCC7002 + (0,65 cm) Cyanobakterien Synechocystis sp. PCC6803 + (0,65 cm) Candida parapsilosis - Pilze Fusarium verticilloides - Pflanze Arabidopsis thaliana - getestet wurden Bakterien, Pilze und eine Pflanze; - keine Hemmung erkennbar; + Hemmung erkennbar (Hemmhofdurchmesser)
Auch die Zugabe von 5 µM Foxicin A oder Foxicin B führte zu keiner Wachstumsbeeinträchtigung der Acker-Schmalwand Arabidopsis thaliana (durchgeführt von Daniel Álvarez, AG Beyer, Biologie II, Universität Freiburg) (II.2.7.2) (siehe Anhang, Abb. 92).
Im MTT-Assay, durchgeführt von Christian de Ford (AG Merfort, Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie, Universität Freiburg), wurde der Effekt von Foxicin A auf die Zellviabilität der drei humanen Leukämie-Zelllinien Jurkat, CCRF-CEM und CEM-ADR5000, sowie von gesunden peri- phären Blut-Mononuklearen Zellen (PBMC) getestet (II.2.7.3). Die Stimulation der Zellen für 24 h mit einer Foxicin-Konzentration von 0,6-80 µM führte zu keiner signifikanten Beeinträchtigung der Zellen (siehe Diagr. 1). Foxicin A ist unter gegebenen Bedingungen 100 nicht cytotoxisch aktiv. 80 60 40 Diagr. 1: Zellviabilität von drei verschiedenen humanen Zelllinien und PBMC in Anwesenheit von Foxicin A Zellviabilität [%] 20 Zellviabilität von verschiedenen humanen Zelllinien bei einer Stimulation von 24 h mit 0 0,6-80 µM Foxicin A; Leukämie-Zelllinien: ● Jurkat, ■ CCRF-DEM, ▲ CEM- 0 0,5 1,0 1,5 2,0 ADR500; gesunde Zellen: ▼pheriphäre Blut-Mononukleare-Zellen (PBMC). log10 Foxicinkonzentration [µM]
108 Ergebnisse
III.4.3.2 Foxicin hemmt in vitro die Atmungskette von E. coli
Foxicin ähnelt durch seine Quinon-Struktur dem Elektronencarrier Coenzym Q10 der Atmungskette (Überblick siehe Sarewicz und Osyczka, 2015). Darum sollte überprüft werden, ob Foxicin A einen Einfluss auf die Atmungskette von E. coli hat. Dazu wurden von Sabrina Burschel (AG Friedrich, Biochemie, Universität Freiburg) E. coli-Membran isoliert und der Sauerstoffverbrauch in Anwesen- heit von verschiedenen Foxicin A-Konzentrationen gemessen (II.2.7.4). Die Reaktion wurde durch Zugabe von NADH gestartet. Eine Konzentration von 500 µM Foxicin A hemmt in vitro die Zell- atmung von E. coli um etwa 30 % (siehe Diagr. 2; Anhang, Abb. 91). Dabei ist Foxicin A auf-grund der hohen benötigten Konzentration nur ein schwacher Zellatmungsinhibitor.
150
125
100
75
50
25 Diagr. 2: in vitro Hemmung der E. coli-Atmungskette in
Sauerstoffverbrauch[µM/min] Anwesenheit von Foxicin A 0 Gemessen wurde der Sauerstoffverbrauch pro Zeit [µM/min] bei 0 100 200 300 400 500 verschiedenen Foxicin A-Konzentrationen [µM], Gerade zeigt Foxicin A - Konzentration [µM] Tendenz.
Die Substanzen Atovaquon und Stigmatellin hemmen den Elektronentransport der Atmungskette des
Malariaerregers Plasmodium falciparum an der Qo-Stelle des Cytbc1 Komplexes (Lancaster et al., 2007; Birth et al., 2014). Foxicin A ähnelt diesen zwei Molekülen aufgrund der Quinonstruktur mit Seitenkette. Darum wurden von Christian de Ford (AG Merfort, Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie, Universität Freiburg) mit der Software GOLD 5.2 der Docking Score, sowie eine mögliche Bindung von Foxicin A zum Cytbc1 Komplex (PDB ID 4PD4; PDB ID: 2IBZ), berechnet. Dabei wurde allerdings die ursprünglich postulierte Struktur von Foxicin A als ortho-Quinon verwendet.
Foxicin A zeigt eine starke hydrophobe Interaktion des Ringsystems mit Val146, Pro272 und Tyr279 des
Cytbc1 Komplexes (2IBZ), ähnlich der Interaktion von Stigmatellin und dem Protein (siehe Abb. 43B). Die Interaktion von Foxicin A und dem Atmungskettenkomplex ist jedoch ähnlicher der Bindung von Atovaquon mit dem Komplex (4PD4) (siehe Abb. 43A). Bei der Überlagerung von Foxicin A mit den zwei Antimalariasubstanzen hat Foxicin größere Übereinstimmungen mit Atovaquon als mit Stigmatellin (Abb. 43C). Der berechnete Docking-Score von Foxicin A beträgt zu 4PD4 33,4 und zu 2IBZ 34,1 und ist somit niedriger als die Werte von Atovaquon mit 42,2 und Stigmatellin mit 50,67. Die Ketogruppen in para-Stellung sollten eine Veränderung des Docking- Scores von Foxicin verursachen. Trotzdem könnte die Substanz mit diesem Komplex interagieren.
109 Ergebnisse
A B
Stigmatellin Foxicin A Docking 50.67 Docking score 34.1
C
Atovaquon Foxicin A Docking score: 42.2 Docking score 33.4
Abb. 43: Docking von Foxicin A, Atovaquon und Stigmatellin an der Q0-Stelle des Cytbc1 Komplexes
(A) Docking von Atovaquon (links) und Foxicin A (rechts) mit dem Cytbc1 Komplex (PDB ID: 4PD4); (B) Docking von Stigmatellin (links) und Foxicin A (rechts) mit dem Cytbc1 Komplex (PDB ID: 2IBZ); (C) Überlagerung von Foxicin (gelb) mit je Atovaquon (grün) und Stigmatellin (blau) (rechts); Foxicin in ortho-Stellung berechnet.
Zur weiteren Analyse wurde Foxicin A von Dr. Matthias Rottmann des Swiss Tropical and Public Health Institute (Basel) gegen Plasmodium falciparum getestet. Dabei konnte eine Konzentration von 5 mg/mL über eine Zeitdauer von 48 h den Malariaerreger nicht signifikant hemmen (Daten nicht gezeigt, persönliche Kommunikation).
Weiter wurde Foxicin A mit dem Cytbc1 Komplex der Hefe Saccharomyces cerevisiae inkubiert und eine mögliche Inhibierung untersucht. Diese Arbeit wurde von Dr. Wei-Chun Kao (AG Hunte, Biochemie, Universität Freiburg) durchgeführt. Auch hier zeigte sich keine signifikante Hemmung (siehe Tab. 39).
Tab. 39: Einfluss von Foxicin A auf den Cytbc1 Komplex Foxicin A 0 µM 1 µM 2 µM 4 µM Anzahl Turnover (s-1) 85,5 ± 1,7 87,8 ± 1,2 84,7 ± 1,3 83,2 ± 4,4 Hemmung (%) / 0 0,09 2,7
Cytbc1 Komplex von Saccharomyces cerevisiae mit 17 nM
III.4.3.3 Foxicin als Antioxidans Um herauszufinden, ob Foxicin aufgrund der hohen Anzahl an Ketogruppen ähnlich wie andere Quinone als Radikalfänger fungieren kann (Übersicht siehe Bentinger et al., 2007), wurde der toxische Effekt von Wasserstoffperoxid auf den S. diastatochromogenes Wildtyp (produziert wenig Foxicin und viel Polyketomycin, Melanin und Sporen), die ∆pokOIV-Mutante (produziert viel Foxicin, kein Polyketomycin und kaum Melanin und Sporen) und die ∆pokOIV-Mutante mit zusätzlich unter- brochenem foxBII-Gen (produziert kein Foxicin) (III.4.4.1) in einem Hemmhoftest untersucht
110 Ergebnisse
(II.2.7.1.2). Es wurden dabei MS- und TSB-Kulturplatten verwendet. Auf MS-Platten ist die Sekundärmetabolitproduktion höher als auf TSB-Platten.
Die Mutante ∆pokOIV / foxBII::pKC1132 zeigt keine größere Sensibilität gegenüber Wasserstoff- peroxid als die ∆pokOIV-Mutante, sondern ist fast vergleichbar mit dem Wildtyp (siehe Diagr. 3). Die ∆pokOIV-Mutante hat deutlich die größten Hemmhofdurchmesser. Erstaunlicherweise sind die Hemmhöfe auf den MS-Kulturplatten allgemein größer als diejenigen auf TSB-Platten, obwohl hier eine vermehrte Sporulation in allen Stämmen stattfindet und daher eine höhere Resistenz vermutet wurde. Der Versuch deutet darauf hin, dass Foxicin kein Wasserstoffperoxid abfangen kann.
WTWT ∆pokOIVΔpokOIV ∆pokOIVΔpokOIV / /foxBII::pKC1132 foxBII::pKC1132
4
3
2 Diagr. 3: Hemmung des Wachstums von S. diastatochromogenes- 1 Stämmen durch Wasserstoffperoxid
Verwendet wurden 2 µL, 5 µL und 10 µL von 5 %igem H2O2 auf
Hemmhofdurchmesser [cm] 0 MS- (links) und TSB-Kulturplatten (rechts) von S. diastatochromo- 2 5 10 2 5 10 genes Tü6028 WT (grün), der ΔpokOIV-Mutanten (blau) und der MS TSB Mutanten mit zusätzlichem unterbrochenen foxBII-Gen (gelb), von dieser wurden drei verschiedene Mutanten verwendet und die Volumen [µL] an 5 % H2O2 Streuung I angegeben; Hemmhofdurchmesser gemessen in cm.
III.4.3.4 Foxicin interagiert mit Fe-Ionen Da Foxicin aufgrund seiner vier Ketogruppen auch als Siderophor fungieren könnte, sollte der Einfluss von Eisen (Fe)-Ionen auf die Foxicin-Produktion überprüfen werden. Dazu wurde der Stamm
S. diastatochromogenes ΔpokOIV mit verschiedenen Konzentrationen an FeCl3 oder FeSO4 in HA- Medium kultiviert (II.2.7.5.2). 40000 / 35000 nm 30000
25000 20000 15000 Kulturüberstand Diagr. 4: Foxicin-Produktion in Abhängigkeit von Eisen im 10000 Produktionsmedium mL
25 25 5000 Foxicin-Produktion als Integral der entsprechenden Peaks im 0
HPLC-Chromatogramm bei γβ0 nm aus β5 mL Kulturüberstand; Integral Foxicinpeak bei 320 1 0.1 0.01 1 0.1 0.01 ohne S. diastatochromogenes ΔpokOIV ohne und mit 1 mM, 0,1 mM und Eisen 0,01 mM FeCl3 bzw. FeSO4; I Streuuung. FeCl3 [mM] FeSO4 [mM]
Die Kultivierung mit Fe-Ionen im Medium hat einen deutlichen Einfluss auf die Foxicin-Produktion (siehe Diagr. 4). Je mehr Eisen sich im Medium befindet, desto weniger Foxicin wird produziert. 3+ Dabei hat die Anwesendheit von Fe -Ionen (FeCl3) einen größeren Einfluss auf die Foxicin- 2+ Produktion in S. diastatochromogenes ΔpokOIV als Fe -Ionen (FeSO4). Bei Zugabe von 1 mM FeCl3 ins HA-Produktionsmedium wird kaum mehr Foxicin gebildet. Unter diesen hohen Eisen- Bedingungen wächst der Stamm zudem nur sehr schlecht.
111 Ergebnisse
In einem weiteren Versuch wurde der Phänotyp von S. diastatochromogenes bei Anwesenheit von Eisen untersucht. Dazu wurden der Wildtyp und die ΔpokOIV-Mutante auf MS-Platten ausgestrichen und Filterplättchen mit je 20 µL FeCl3 bzw. FeSO4 [1 M] aufgelegt. Das Wachstum von beiden
Stämmen wird bei Anwesenheit von FeCl3 und FeSO4 gehemmt (siehe Abb. 44). Dabei scheint der
Hemmhof um das Filterblättchen mit FeSO4 leicht größer zu sein. Bei S. diastatochromogenes WT ist deutlich zu erkennen, dass mit Eisen die Sporen- sowie die Melaninbildung stärker ist als auf der restlichen Kulturplatte.
FeSO4
_ _
Abb. 44: Einfluss von Eisen auf den Phänotypen von S. diastatochromogenes WT und FeCl3 der ΔpokOIV-Mutante Kulturplatten von S. diastatochromogenes WT (A) und ΔpokOIV-Mutante (B); Filterplätten
mit je 20 µL FeSO4 (oben) oder FeCl3 (unten) [1 M]; MeOH als Negativkontrolle (Mitte); AB ↔ Hemmhof.
Weiter wurde das UV/vis-Spektrum von Foxicin A mit unterschiedlichen Konzentrationen von FeCl3 und FeSO4 gemessen (II.2.7.5.1). Im Gegensatz zu FeSO4 gibt es bei Zugabe von FeCl3 einen deutlichen Shift des Spektrums. Je mehr FeCl3 zugegen wurde, desto mehr verschiebt sich das
Absorptionsmaximum von 320 nm hin zu höheren Wellenlängen (siehe Diagr. 5). Bei 100 mM FeCl3 zeigt Foxicin A ein Maximum bei 345 nm. Der Shift zeigt, dass Foxicin A mit FeCl3 interagiert, anscheinend aber nicht mit FeSO4 (Daten nicht gezeigt).
Shift 2
1,8 c (FeCl3) 1,6 0 mM 0.5 mM 1,4 1 mM 1,2 2 mM 1 5 mM 10 mM 0,8 15 mM
Absorption Absorption [AU] 0,6 20 mM
0,4 50 mM 75 mM 0,2 100 mM 0 Diagr. 5: Shift des UV/vis-Spektrums von Foxicin A bei Zugabe 250 275 300 325 350 375 400 von FeCl Wellenlänge [nm] 3 Zugabe von 0,5-100 mM FeCl3
III.4.3.5 Foxicin hat keinen Einfluss auf die Polyketomycinproduktion In der ΔpokOIV-Mutante wird kein Polyketomycin mehr produziert, stattdessen jedoch größere Mengen an Foxicin (Peintner, 2008). Die in dieser Arbeit generierte Mutante S. diastatochromogenes ΔpokOIV / foxBII::pKC1132 (III.4.4.1) produziert weder Polyketomycin noch Foxicin. Um einen
112 Ergebnisse möglichen Einfluss von Foxicin auf die Polyketomycin-Produktion zu untersuchen, wurde das Gen foxBII auch im WT-Stamm über einen Single-Crossover unterbrochen. Diese Mutante produziert kein Foxicin, aber weiterhin Polyketomycin (Daten nicht gezeigt). Der Stamm bildet vergleichsweise wie der WT große Mengen an Sporen und Melanin auf Kulturplatte und in Flüssigmedium. Demnach hat Foxicin anscheinend keinen Einfluss auf die Polyketomycin-Produktion.
III.4.4 Das Foxicin-Biosynthesegencluster
III.4.4.1 Die Identifizierung und Verifizierung des Foxicin-Biosynthesegenclusters Um das Foxicin-Biosynthesegencluster in S. diastatochromogenes Tü6028 zu identifizieren, wurde das Genom mittels antiSMASH 3.0 untersucht. Das Programm konnte 23 Gencluster identifizieren. Cluster #2 ist für die Synthese von Polyketomycin verantwortlich. Die Struktur von Foxicin lässt vermuten, dass es von einer Polyketidsynthase I und einer Nicht-ribosomalen Peptidsynthetase gebildet wird. Das Programm identifiziert nur ein Cluster mit PKSI- und NRPS-Genen (Cluster #3).
In der ∆pokOIV-Mutante, die kein Polyketomycin aber größere Mengen an Foxicin produziert, wurde das 14,4 kb PKS I / NRPS-Hybridgen foxBII in der Mitte des Clusters mittels Single-Crossover durch den Vektor pKC1132_SC_foxBII (siehe Abb. 21) unterbrochen (II.2.4.7.1). Die Klonierung des Vektors ist in II.2.4.9.7 beschrieben. Die Integration des Vektors in das foxBII-Gen wurde mittels PCR bestätigt. Während man nach Gelelektrophorese im WT die erwartete Bande von etwas mehr als 2 kb erkennt, wurde dieser Bereich in der generierten Mutante mitsamt dem Vektor amplifiziert. Die erwartete Bande von fast 8 kb ist deutlich im Gelbild zu sehen (siehe Abb. 45).
A Gelelektrophorese foxBII-Gen im fox-Cluster B S. diastatochromogenes WT
Primer- 5000 10000 paar foxBII Primer S. diastatochromogenes foxBII::pKC1132 pKC1132 Leiter 5000 10000 15000 [kb] foxBII SC-Fragment SC-Fragment 10 8 6 5 4 3 Erwartete Größe der PCR-Produkte C 2 1.5 foxBII:: 1 Primerpaar WT pKC1132 0.5 Test_foxBII_for 2285 bp 7659 bp Test_foxBII_rev
Abb. 45: Bestätigung der foxBII-Unterbrechung in S. diastatochromogenes Tü6028 (A) Gelelektrophorese der Kontroll-PCR mit den Primern Test_foxBII_for und Test_foxBII_rev; (B) Darstellung des foxBII-Gens im fox- Cluster von S. diastatochromogenes; (C) erwartete Größen der Kontroll-PCR.
113 Ergebnisse
Die Mutante ∆pokOIV / foxBII::pKC1132 wurde sechs Tage in HA-Medium inkubiert, extrahiert und die Sekundärmetabolitproduktion mittels HPLC/MS analysiert. Im Gegensatz zur ΔpokOIV-Mutante werden hier keine Foxicine mehr gebildet. Die entsprechenden Peaks sowie die Massen der Foxicin- Derivate konnten nicht detektiert werden (siehe Abb. 46). Die Unterbrechung des Gens mit dem anschließenden Verlust der Foxicin-Produktion zeigt, dass dieses Gen und damit auch das Cluster für die Biosynthese von Foxicin verantwortlich ist.
Foxicin A 2000 S. diastatochromogenes ∆pokOIV 1500 Foxicin B 1000 Foxicin C
[mAU] 500
0
245nm
2000 S. diastatochromogenes 1500 ∆pokOIV / foxBII::pKC1132 1000
Absorption Absorption 500
0 0 5 10 15 20 25 30 Zeit [min] Abb. 46: HPLC-Chromatogramme von Rohextrakten aus S. diastatochromogenes ΔpokOIV und der ΔpokOIV/foxBII::pKC1132 Mutante HPLC-Chromatogramme von Rohextrakten aus S. diastatochromogenes ΔpokOIV (oben) und S. diastatochromogenes ΔpokOIV/ foxBII::pKC1132 (unten); Peak von Foxicin A, B und C sind mit Pfeilen markiert; die Foxicine werden in der Mutante S diastatochromogenes ΔpokOIV/foxBII::pKC1132 nicht detektiert.
III.4.4.2 Die Organisation des Foxicin-Biosynthesegenclusters Das Foxicin (fox) - Biosynthesegencluster in S. diastatochromogenes Tü6028 besitzt eine Größe von etwa 57 kb mit einem durchschnittlichen GC-Gehalt von 72,4 %. Die Annotationsanalyse identifizierte 41 ORFs, die wahrscheinlich an der Foxicin-Biosynthese beteiligt sind. Die Funktionen der abgeleiteten ORFs wurden mittels verschiedener Datenbanken vorhergesagt (siehe Tab. 40). Die genetische Organisation des Foxicin-Biosynthesegenclusters ist in Abbildung 47 dargestellt.
10000 20000 30000 40000 50000 bp
PKS I / NRPS Zuckerstoffwechsel Regulation andere Funktion
Esterase Transferase Transport unbekannte Funktion
Abb. 47: Das Foxicin-Biosynthesegencluster in S. diastatochromogenes Tü6028 Das fox-Cluster hat eine Größe von 57 kb mit 41 putativen Genen. Die postulierten Funktionen der einzelnen Gene sind farblich dargestellt: PKS I /NRPS (gelb), Esterasen (dunkelgrau), Zuckerstoffwechsel (grün), Transferase (rot), Regulatoren (blau), Transporter (violett), andere Funktion (hellgrau), unbekannte Funktion (weiß).
Für die Biosynthese sind vermutlich die Gene foxBI, foxBII und foxBIII verantwortlich. Das Gen foxBI kodiert für eine A-Domäne einer NRPS. FoxBII ist ein Hybrid aus PKS I und NRPS mit einer Domänenanordnung von (ACP)-(KS-AT-DH-KR-ACP)-(KS-AT-DH-KR-ACP)-C-FkbH. FoxBIII hat
114 Ergebnisse eine PCP- und eine TE-Domäne. Weiterhin liegen drei Gene des Zuckerstoffwechsels, eine Glycer- aldehyde-3-Phosphat-Dehydrogenase (foxGI), eine Zuckerisomerase (foxGII) und eine Aldolase (foxGIII), im Cluster. Bei der Biosynthese bzw. für Modifikationen sind darüber hinaus wahrscheinlich drei Esterasen (foxEI, foxEII, foxEIII), eine Acetyltransferase (foxA), eine Dipeptidase (foxD) und zwei Reduktasen (foxOI, foxOII) beteiligt. Das fox-Cluster hat des Weiteren je zehn putative Regulatoren (foxRI-foxRX) und Gene, die beim Transport (foxTI-foxTX) involviert sind. Außerdem konnten acht ORFs (foxHI-foxHVIII) identifiziert werden, bei denen mittels BLAST- Analyse keine Funktion zugeordnet werden konnte.
Das Cluster wurde unter der Genbank-Accession Nummer KT440882 bei NCBI hinterlegt.
Tab. 40: Postulierte Funktionen der ORFs des Foxicin-Biosynthesegenclusters in S. diastatochromogenes Tü6028
ORF Start Stop AS postulierte Funktion foxTI 1 1266 422 ABC Transporter, Substratbindeprotein foxTII 1289 2203 304 ABC Transporter, Permease foxTIII 2200 3129 309 ABC Transporter, Permease foxHI 4009 3809 66 hypothetisches Protein foxHII 4201 4398 65 hypothetisches Protein foxC 4532 5572 346 ATP/GTP-Bindeprotein foxD 7088 5733 451 Dipeptidase foxOI 7272 8501 409 Hydrogenase foxHIII 9341 8880 153 hypothetisches Protein foxRI 9579 10292 237 TetR Transkriptionsregulator foxRII 10414 11667 417 Zwei-Komponenten-System Sensorkinase foxRIII 11664 12329 221 Zwei-Komponenten-System Response-Regulator foxHIV 12535 12290 81 hypothetisches Protein foxTIV 14235 12754 493 transmembranes Effluxprotein foxRIV 14321 14734 137 MarR Transkriptionsregulator foxHV 15554 14814 246 hypothetisches Protein foxTV 16875 15676 399 integrales Membran-Transportprotein foxA 17541 18656 371 Acetyltransferase foxGI 19160 20605 481 Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase foxBI 21174 22925 583 Nicht-ribosomale Peptidsynthetase (A-Domäne) Modulare Polyketidsynthase (ACP-KS-AT-DH-KR-ACP-KS-AT-DH-KR-ACP); foxBII 23163 37586 4807 nicht-ribosomale Peptidsynthetase (C-domain); FkbH Nicht-ribosomale Peptidsynthetase foxBIII 37663 40500 945 (PCP-TE-Domänen) foxEI 40497 41633 378 Esterase/Lipase foxEII 41698 42477 259 Carboxylesterase foxTVI 42618 43013 131 Drugresistenz-Transporter foxTVII 42986 43747 253 Drugresistenz-Transporter foxRV 44571 43786 261 Regulator foxGII 44659 45579 306 Zuckerisomerase foxGIII 45612 46463 283 Zuckerbisphosphate-Aldolase foxHVI 46765 46466 99 hypothetisches Protein foxOII 47541 46762 259 Dioxygenase foxRVI 47667 48440 257 AraC-Familie Transkriptionsregulator foxRVII 49572 48430 380 rRNA Methyltransferase foxRVIII 49623 50348 241 Alkyliertes DNA Reparatur-Protein foxRIX 50488 51603 371 ROK-Familie Transkriptionsregulator foxEIII 52596 51664 310 Phosphotriesterase foxHVII 53174 52590 194 hypothetisches Protein foxRX 53806 53231 191 TetR-Familie Transkriptionsregulator foxTVIII 53978 54283 101 Membranprotein foxTIX 54280 55038 252 ABC-Transporter, ATP-Bindeprotein foxTX 55035 57596 853 ABC-Transporter, Substratbindeprotein
115 Ergebnisse
III.4.4.3 Ähnliche Foxicin-Biosynthesegencluster in anderen Streptomyceten-Stämmen
In 21 anderen Streptomyces-Stämmen konnten homologe fox-Cluster mittels antiSMASH- und BLAST-Analyse identifiziert werden (Stand Juni 2016). Diese sind: S. aureus NRRL B-1λ41 (Doroghazi et al., β014), S. avermitilis MA4680 (Ikeda et al., β00γ), S. bicolor NRRL B-5γ48 (Doroghazi et al., β014), S. bingchenggensis BCW-1 (Wang et al., β010), S. bungoensis DSM 41781, S. caeruleatus NRRL B-β480β, S. cellostaticus DSM 4018λ, S. collinus Tüγ65 (Rückert et al., β01γ), S. curacoi DSM 40107, S. incarnatus NRRL 808λ (Oshima et al., β015), S. mangrovisoli DSM 100438, S. olivochromogenes DSM 40451, S. puniciscabiei NRRL B-β4456, S. regalis NRRL γ151, S. viridochromogenes NRRL γ414, S. viridochromogenes NRRL γ416, S. viridochromogenes NRRL_γ41γ, S. viridochromogenes Tü57 (Grüning et al., β01γ), Streptomyces sp. 14βMFColγ.1, Streptomyces sp. JHA1λ (Matsunaga et al., β015) und Streptomyces sp. OK006 (Klingeman et al., β015).
In diesen Stämmen liegen die zu foxBI, foxBII, foxBIII, foxEI und foxEII homologen Gene ebenfalls nebeneinander und in gleicher Orientierung im Genom vor. Die prozentualen Identitäten liegen zwischen 7γ % - λ6 % (siehe Anhang, Tab. 50). Das ähnlichste Cluster besitzt Streptomyces sp. 14βMFColγ.1. Dort hat das Cluster dieselbe Organisation, außer die Transportergene foxTVI und foxTVII sind nicht vorhanden. Ein phylogenetischer Baum basierend auf foxBII-Sequenzvergleichen und der Neighbor-Joining-Methode sowie die homologen Cluster sind in Abbildung 48 dargestellt.
In allen Stämmen hat der PKS/NRPS Hybrid-Enzymkomplex (foxBI - foxBIII) auch dieselbe Abfolge an katalytischen Domänen ([A] – [(ACP)-(KS-AT-DH-KR-ACP)-(KS-AT-DH-KR-ACP)-C-FkbH] – [PCP-TE]). Die Stämme Streptomyces sp. JHA19, S. curacoi und S. regalis haben ein zusätzliches PKS/NRPS-Hybridgen upstream von foxBII mit der Domänenstruktur [(A-PCP)-(KS-AT-KR-ACP)- (C-A-PCP)-C]. Die Gene foxEI und foxEII sind in allen Stämmen außer in S. incarnatus und S. puniciscabiei vorhanden. In den meisten Clustern liegen auch Gene des Zucker- und Aminosäuren- metabolismus vor, sowie Acetyl- oder Methyltransferasegene.
III.4.4.4 Heterologe Expression des Foxicin-Biosynthesegenclusters
Da der Stamm S. diastatochromogenes sich nicht leicht genetisch manipulieren lässt, sollte das fox- Biosynthesegencluster in einem heterologen Wirt exprimiert werden. Eine Expression in einem heterologen Wirt wie S. albus vereinfacht die Deletion bzw. Überexpression einzelner Gene und erleichtert so die Charakterisierung dieser Gene, sowie die Bestimmung ihrer Aufgabe bei der Foxicin- Biosynthese.
Das Cluster sollte mittels linear-linear homologer Rekombination (LLHR) in E. coli kloniert werden (II.2.4.6.1). Die dazu verwendeten Stämme GB05, GB08-red und GB05-dir wurde von Prof. Dr. Francis Stewart (Biotechnologie, Universität Dresden) zur Verfügung gestellt. Homologe Bereiche des
116
A Phylogenetischer Baum B Homologe fox Biosynthesegencluster C Genfunktion bp 10000 20000 30000 40000 50000 PKS I / NRPS Esterase S. diastatochromogenes Tü6028 Zuckerstoffwechsel Streptomyces sp. 142MFCol3.1 Aminosäurestoffwechsel S. puniciscabiei NRRL B-24456 Transferase Regulation S. incarnatus NRRL8089 Transport Streptomyces. sp. JHA19 andere Funktion S. viridochromogenes Tü57 unbekannte Funktion S. curacoi DSM 40107 S. viridochromogenes NRRL 3414 S. viridochromogenes NRRL 3413 S. viridochromogenes NRRL 3416 Domänenfunktion S. caeruleatus NRRL B-24802 E
S. regalis NRRL 3151 PCP Peptidyl-Carrierprotein S. bicolor NRRL B-5348 A Adenylation S. mangrovisoli DSM 100438 C Konsation ACP Acyl-Carrierprotein S. cellostaticus DSM 40189 AT Acyltransferase S. bungoensis DSM 41781 KS Ketosynthase S. collinus Tü365 DH Dehydratase S. aureus NRRL B-1941 KR Ketoreducatse S. avermitilis MA4680 FkbH FkbH-ähnlich
Streptomyces sp. OK006 Est Esterase
S. olivochromogenes DSM 40451 CEst Carboxylesterase S. bingchenggensis BCW-1
Domänen- A PCP KS AT KR ACP C A ACP KS AT DH KR FkbH D anordnung A PCP C ACP KS AT DH KR ACP C PCP TE Est CEst
Abb. 48: Homologe fox-Biosynthesegencluster in anderen Streptomyceten und phylogenetischer Baum (A) Phylogenetischer Baum basierend auf foxBII-Genvergleich mittels der Neighbor-Joining Methode (ohne Distanzkorrelation); (B) Darstellung der homologen fox-Biosynthesegencluster in anderen Streptomyceten- Stämmen; (C) postulierte Funktionen der Genprodukte; (D) Domänenanordnung der PKS / NRPS-Hybridgene; (E) postulierte Funktionen der katalytischen Domänen.
117 Ergebnisse fox-Clusters, je upstream und downstream, wurden in den Vektor pOJ436 kloniert (II.2.4.9.12). Der Vektor pOJ436_Up_Down_fox (siehe Abb. 26) wurde mittels SpeI/BamHI-Restriktionsverdau linearisiert und zusammen mit BfuCI-partialverdauter, genomischer DNA aus S. diastatochromogenes mittels Elektroporation in die spezialisierten Stämme transferiert (II.2.4.6.1). Trotz mehrerer Durch- führungen konnte kein positiver Klon mit dem fox-Cluster identifiziert werden. Zwar zeigten der Kontrollverdau sowie Test-PCRs, dass eine Rekombination stattgefunden hat und DNA in den Vektor aufgenommen wurde, jedoch nicht das gewünschte fox-Cluster (Daten nicht gezeigt).
Da die Rekombination zur Klonierung des fox-Clusters in E. coli nicht erfolgreich war, sollte anschließend eine Rekombination in der Hefe versucht werden. Diese Methode nennt man Trans- formations-assoziierte Rekombination (TAR) (II.2.4.6.2). Der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae VL6-48N wurde von Dr. Vladimir Larionov (National Cancer Institute, Bethesda, USA) und der pCAP01-Vektor von Prof. Dr. Bradley Moore (Scripps Institution of Oceanography, San Diego, USA) zur Verfügung gestellt. Dazu wurden die homologen Bereiche der Enden des fox-Clusters in den Vektor pCAP01 kloniert (siehe Abb. 27, II.2.4.9.13) und anschließend durch SpeI/BamHI-Verdau linearisiert. Der Vektor wurde mit EcoRV-geschnittener, genomischer DNA gemischt und Sphero- plasten des Hefestamms wurden damit transformiert. Nach Optimierung des Protokolls konnten mehrere Hefeklone auf den Medienplatten ohne Tryptophan anwachsen (II.2.4.6.2). Von den Klonen wurden die Plasmide isoliert (II.2.2.3) und mittels Kontrollverdau und -PCR analysiert. Zwar hatte auch hier in den Klonen eine Rekombination stattgefunden, jedoch konnte kein Klon mit dem fox- Cluster identifziert werden.
III.4.5 Untersuchung einzelner Gene des Foxicin-Biosynthesegenclusters
Die "Kern"-Gene foxBI, foxBII, foxBIII, foxEI und foxEII sind in den homologen fox-Clustern der anderen Streptomyceten ebenfalls vorhanden und sind vermutlich für die Biosynthese des Foxicin- Moleküls ausreichend. Zusammen mit der postulierten Acetyltransferase foxA und der Glyceraldehyd- 3-Phosphat-Dehydrogenase foxGI liegen sie in gleicher Orientierung hintereinander (siehe Abb. 49), inmitten des fox-Clusters. Diese Gene wurden genauer untersucht.
Abb. 49: Die "Kern"-Gene der Foxicin-Biosynthese Die Gene foxA, foxGI, foxBI, foxBII, foxBIII, foxEI und foxEII bilden den Kern des Foxicin-Biosynthesegenclusters. Postulierte Funktion sind farblich markiert: rot, Acetyltransferase; grün, Zuckermetabol- 10000 20000 bp ismus; gelb, PKS / NRPS; grau, Esterase; Größe in Basenpaare [bp].
III.4.5.1 Die Acetyltransferase FoxA Die postulierte Acetyltransferase FoxA besteht aus 371 Aminosäuren und sollte dem Biosynthese- modell (siehe Diskussion, Abb. 63) nach eine Acetylgruppe auf die Aminogruppe des Quinonrings von Foxicin übertragen. Um diese Funktion zu bestätigen, sollte das Gen durch einen Single-
118 Ergebnisse
Crossover unterbrochen werden. Es wurde erwartet, dass die Mutante deacetyliertes Foxicin produziert. Diese Arbeiten wurden im Rahmen der Masterarbeit von Linda Zambolin (Universität Padova, Italien) durchgeführt (Zambolin, 2015).
Die Klonierung des Single-Crossover-Vektors pKC1132_foxA' (siehe Abb. 22) ist in Kapitel II.2.4.9.8 beschrieben. Dieser Vektor wurde mittels Konjugation in S. diastatochromogenes ΔpokOIV trans- feriert. Die generierten Mutanten ΔpokOIV / foxA::pKC1132 wurden für sechs Tage in HA-Medium kultiviert, extrahiert und die Sekundärmetabolit-Produktion mittels HPLC/MS analysiert. Trotz Unter- brechung von foxA kann die Mutante immernoch Foxicin produzieren, jedoch in deutlich geringeren Mengen (siehe Abb. 50).
S. diastatochromogenes ΔpokOIV S. diastatochromogenes ΔpokOIV / foxA::pKC1132 Klon 1 2000 S. diastatochromogenes ΔpokOIV / foxA::pKC1132 Klon 2
[mAU]
nm 1500
254 254 1000
500
0
Absorption Absorption 0 5 10 15 20 25 30 Zeit [min]
Abb. 50: HPLC-Chromatogramme von Rohextrakten aus S. diastatochromogenes ∆pokOIV und zwei Mutanten mit unterbrochenem foxA-Gen HPLC-Chromatogramme von Rohextrakten aus S. diastatochromogenes ∆pokOIV (blau) und der Mutante ∆pokOIV/foxA::pKC1132 Klon 1 (grün) und Klon β (rot) bei einer Absorption von β54 nm; Pfeile zeigen Foxicin A (tR 16.0 min) und Foxicin B (tR 16.8 min).
III.4.5.2 Die Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase FoxGI Das Gen foxGI kodiert wahrscheinlich für eine 481 AS große Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydro- genase. Als essentielles Enzym der Glykolyse katalysiert sie die Umsetzung von Glyceraldehyd-3- Phosphat zu 1,3-Bisphosphoglycerat. Weitere Arbeiten werden im Rahmen der Doktorarbeit von Denise Deubel durchgeführt.
III.4.5.3 Der PKS I / NRPS Enzymkomplex FoxBII / FoxBIII Die Gene foxBII und foxBIII kodieren für ein PKS I / NRPS-Hybridenzymsystem. Das 14,4 kb große foxBII kodiert für mehrere katalytische Domänen. Das Lademodul der PKS besteht nur aus einem ACP. Die zwei nachfolgenden PKS-Module bestehen jeweils aus KS-AT-DH-KR-ACP. Die bio- informatische Analyse ergab, dass beide AT-Domänen eine Methylmalonyl-CoA-Spezifität besitzen. Die Dehydratase-Domäne im ersten Modul hat ein HxxxGxxxxS-Motiv, das vom hochkonservierten HxxxGxxxP-Dehydratasen-Motiv abweicht. Das letzte Modul wird aus einer C- und einer FkbH- Domäne gebildet, dass in FoxBIII mit einem Carrierprotein und einer Thioesterase fortgesetzt wird. Die Unterbrechung des foxBII-Gens durch einen Single-Crossover führte zu einer Mutante, die kein Foxicin mehr bildet (III.4.4.1).
119 Ergebnisse
III.4.5.4 Die A-Domäne FoxBI Die antiSMASH-Analyse identifizierte FoxBI als CAL-Domäne einer Nicht-Ribosomalen Peptid- synthetase. Weitere Sequenzvergleiche mittels BLAST und der 'NCBI`s conserved domain database' (Marchler-Bauer et al., 2015) zeigten, dass das 574 AS große Protein AMP binden und übertragen kann. Mittels antiSMASH und dem NRPSpredictor (Röttig et al., 2011) konnte jedoch keine Substrat- spezifität vorhergesagt werden. Dem Biosynthesemodell zufolge sollte das Enzym eine Aminosäure, wahrscheinlich eine nicht-proteinogene Aminosäure mit zwei Aminogruppen ähnlich zu Diamino- butyrat, durch die Übertragung von AMP aktivieren (siehe Diskussion, Abb. 63).
III.4.5.4.1 Die Deletion von foxBI Um die essentielle Funktion von FoxBI in der Foxicin-Biosynthese nachzuweisen, sollte das Gen inaktiviert werden. Im Rahmen der Masterarbeit von Linda Zambolin konnte das Gen mittels Single- Crossover zwar unterbrochen werden, jedoch produziert die Mutante weiterhin Foxicin (Zambolin, 2015). Da ein Single-Crossover nur das Gen unterbricht, sodass katalytische Domänen intakt bleiben können und die Rekombination auch nicht stabil ist, sollte das Gen foxBI anschließend mittels der Cas9-Endonuklease geschnitten und mithilfe eines Doppel-Crossovers repariert werden. Dazu wurden 1 kb große homologe, upstream und downstream von foxBI gelegene Bereiche in den Vektor pCRISPR-Cas9 kloniert. Zusätzlich wurde noch ein 20 bp großer Bereich inmitten von foxBI durch verlängerte Primer, PCR und Klonierung in den sgRNA-kodierenden Teilabschnitt des Vektors eingebracht (II.2.4.7.2). Der Vektor pCRISPR-foxBI (siehe Abb. 23) kann nun in E. coli ET12567 transferiert und anschließend über Konjugation in S. diastatochromogenes ΔpokOIV gebracht werden.
III.4.5.4.2 Überproduktion und Aktivitätsbestimmung von FoxBI Das Protein FoxBI sollte in E. coli heterolog überproduziert und die Aktivität in einem in vitro Adenylierungs-Assay untersucht werden. Teile dieser Arbeiten wurden zusammen mit der Master- studentin Linda Zambolin durchgeführt. Linda Zambolin klonierte das foxBI-Gen in den pET28a- Vektor (siehe Abb. 28; II.2.4.9.14) und untersuchte die Expression in verschiedenen E. coli- Produktionsstämmen, bei unterschiedlichen Temperaturen und Inkubationszeiten (Zambolin, 2015). Die beste Produktion gab es dabei in E. coli BL21(DE3)Star bei einer Inkubation von 20 h bei 28 °C. Bei der anschließenden Aufreinigung zeigte sich jedoch, dass das Protein nicht löslich produziert wurde und nach dem Zellaufschluss in der unlöslichen Fraktion vorlag. Durch die Verwendung von 5 M Urea konnte FoxBI zwar anschließend gelöst und mittels Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt werden, jedoch zeigte das Protein in dem nachfolgenden Malachit-Molybdän-Assay (II.2.5.3.3.1) kaum eine Adenylierungs-Aktivität. Die größte Aktivität konnte mit der Aminosäure Serin gemessen werden (Zambolin, 2015). Bei Inkubation des Stammes E. coli BL21(DE3)Star im Autoinduktionsmedium bei 18 °C über 72 h konnte ein Teil von FoxBI löslich produziert und mittels FPLC durch Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt werden (siehe Anhang, Abb. 93).
120 Ergebnisse
Aufgrund der Sensibilität von A-Domänen wurde auf eine weitere Aufreinigung durch Größen- ausschlusschromatographie verzichtet. Eine mögliche Aktivierung der fünf Aminosäuren Alanin, Arginin, Diaminobutyrat, Ornithin und Serin durch das aufkonzentrierte Protein wurde in einem NADH/NAD+-gekoppelten Assay (II.2.5.3.3.2) untersucht. Ein geringer Absorptionsabfall mit den Aminosäuren Alanin, Arginin, Ornithin und Serin (siehe Diagr. 6B) deutet auf eine geringe Aktivierung aller Substrate hin, wobei hier kein größerer Abfall mit Serin gemessen werden konnte. Dem Biosynthesemodell zufolge sollte eine Aminosäure ähnlich zu Diaminobutyrat in Foxicin eingebaut werden. Der Ansatz mit dieser nicht-proteinogenen Aminosäure zeigte einen enormen Absorptionsabfall, jedoch auch in der Negativkontrolle ohne FoxBI (siehe Diagr. 6C). Demnach interagiert die Aminosäure wahrscheinlich mit einem anderen Reaktionspartner und eine mögliche Aktivierung kann durch diesen Assay nicht bestimmt werden. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die essentielle Funktion von FoxBI und dessen Spezifität zu bestimmen.
+ ATP + ATP + PPi + AS 0,1 0,2 0,5 Arginin Diaminobutyrat + ATP 0 0 0,15 Serin + PP -0,5 Diaminobutyrat -0,1 i Alanin 0,1 + AS ohne FoxBI Ornithin -1 -0,2 0,05 -1,5 -0,3 0 -2 -0,4 -2,5
Absorption Absorption [340nm] Absorption [340nm] -0,05 Absorption [340nm] -0,5 -3
-0,6 -0,1 -3,5
-0,7 -0,15 -4 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 ABC Zeit [min] Zeit [min] Zeit [min]
Diagr. 6: NADH/NAD+-gekoppelter A-Domänen-Adenylierungsassay
Absorption bei 340 nm über den Zeitraum von 10 – 15 min; (A) Positivkontrolle: Zugabe von ATP und Pyrophosphat PPi, ohne Aminosäure; (B) Absorptionsmessung mit den Aminosäuren (AS) Arginin, Serin, Alanin und Ornithin; (C) Absorptionsmessung mit der nicht- proteinogenen Aminosäure Diaminobutyrat mit und ohne A-Domäne FoxBI.
III.4.5.5 Die Esterasen FoxEI und FoxEII Nach dem postulierten Foxicin-Biosynthesemodell (siehe Diskussion, Abb. 63) sind FoxBI, FoxBII und FoxBIII für die Synthese des Foxicin-Gerüsts verantwortlich. Die Acetyltransferase FoxA kondensiert die Acetylgruppe. Im Modell wird der Quinonring aus einer Aminosäure und einer C2- Einheit aus Glycerin zusammengesetzt, wobei die Ringbindung durch die Esterase FoxEI oder FoxEII katalysiert werden könnte. Die Gene foxEI und foxEII liegen hinter foxBIII in gleicher Orientierung und sind auch in den anderen Streptomyceten-Stämmen mit homologen fox-Clustern konserviert.
Um zu untersuchen, ob die Gene foxEI und foxEII an der Foxicin-Biosynthese beteiligt sind, sollten sie einzeln durch das CRISPR-Cas9-System deletiert werden. Dazu wurden die Deletionsvektoren pCRISPR_Cas9_foxEI (siehe Abb. 24) und pCRISPR_Cas9_foxEII (siehe Abb. 25) kloniert (II.2.4.9.10-11) und können nun in den Stamm S. diastatochromogenes ΔpokOIV transferiert werden.
121 Ergebnisse
III.5 Das MIBiG Projekt
Im Rahmen des MIBiG Projekts unter Koordination von Prof. Dr. Marnix Medema sollten die Informationen folgender Sekundärmetabolite mittels Literaturrecherche herausgesucht und in die MIBiG-Datenbank eingefügt werden: Aranciamycin, Avilamycin A/C, Landomycin A, Mensacarcin, Polyketomycin, Rishirilid A/B, Simocyclinon D8 und Urdamycin. Eine Übersicht ist in Tabelle 41 dargestellt.
Der vollständige Eintrag der einzelnen Substanzen ist im Anhang unter VI.4 angefügt.
Tab. 41: Übersicht der Sekundärmetabolite, die in die MIBiG-Datenbank eingefügt wurden
MIBiG Substanzen Produzierender Stamm Biosynthese-Klasse Accession Nr.
Aranciamycin Streptomyces echinatus PKS Typ II / Saccharid BGC0000197
Avilamycin A / C Streptomyces viridochromogenes Tü57 iterative PKS Typ I / Oligosaccharid BGC0000026
Landomycin A Streptomyces cyanogenus S136 PKS Typ II / Oligosaccharid BGC0000239
Mensacarcin Streptomyces bottropensis PKS Typ II BGC0001177
Streptomyces diastatochromogenes PKS Typ II / PKS Typ I / Polyketomycin BGC0001061 Tü6028 Disaccharid
Rishirilid A / B Streptomyces bottropensis PKS Typ II BGC0001179
Simocyclinon D8 Streptomyces antibioticus Tü6040 PKS Typ II / Saccharid / anderes BGC0001072
Urdamycin Streptomyces fradiae Tü 2717 PKS Typ II / Oligosaccharid BGC0000276
Dabei wurde jeweils der produzierende Stamm, Struktureigenschaften und Wirkung des Sekundär- metabolits, die Gene im Biosynthesegencluster, durchgeführte Experimente, Details über die einzelnen katalytischen Enzymdomänen der Strukturgene, relevante Literatur und ein Ansprechpartner ange- geben.
122 Diskussion
IV Diskussion
123 Diskussion
IV.1 Die Genomsequenzierung gibt einen guten Einblick in das Potenzial zur Sekundärmetabolit-Biosynthese von Actinomyceten und eröffnet neue Möglichkeiten
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Genome der fünf verschiedenen Actinomyceten Actino- kineospora bangkokensis, Streptomyces glomeroaurantiacus, Streptomyces calvus, Streptomyces diastatochromogenes Tü1062 und Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 sequenziert. Dabei wurden die Sequenzen von Actinokineospora bangkokensis 44EHWT (III.1.1) und Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 (III.1.2) genauer untersucht.
Durch die kreisförmige Circos-Darstellung der Genome von Actinokineospora bangkokensis 44EHWT (siehe Abb. 30) und Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 (siehe Abb. 31) lassen sich zwar keine Einzelheiten genau erkennen, aber man bekommt einen guten Gesamtüberblick. Zudem lassen sich die Genome dadurch gut unterscheiden. Beide Genome haben eine Größe zwischen 7-8 Mb und einen erwarteten hohen GC-Gehalt von 74,1 % (A. bangkokensis) und 71,6 % (S. diastatochromo- genes). Auffallend ist, dass während der GC-Gehalt (in 500 bp-Bereichen) in S. diastatochromogenes zwischen 51,2 % und 86,2 % etwa gleichmäßig schwankt, ist er in A. bangkokensis allgemein breiter verteilt (siehe Diagr. 7), zwischen 44,2 % und 87,4 % und es gibt größere Bereiche, in denen der GC- Gehalt deutlich höher bzw. niedriger als der Durchschnittswert ist. In A. bangkokensis gibt es auch mehrere Bereiche, in denen der GC-Gehalt unter 50 % liegt. Im Gegensatz dazu haben die drei identifizierten PKS I-Cluster #11 (75,4 %), #16 (75,2 %) und #19 (76,9 %) einen allgemein höheren GC-Gehalt. Der schwankende GC-Gehalt in A. bangkokensis lässt darauf schließen, dass viele DNA- Bereiche während der Evolution durch horizontalen Gentransfer aufgenommen wurden.
Ø71,6 % ø74,1 % 3500
3000
2500
- Bereiche 2000 bp 1500 Diagr. 7: Verteilung GC-Gehalt 1000 im Genom von A. bangkokensis 44EHWT und S. diastatochromo- Anzahl 500 500 Anzahl 500 genes Tü6028 Anzahl 500 bp-Bereiche mit GC- 0 Gehalt [%]/100; im Genom von A. bangkokensis (gelb) und S. dia- 0.40 0.42 0.44 0.46 0.48 0.50 0.52 0.54 0.56 0.58 0.60 0.62 0.64 0.66 0.68 0.70 0.72 0.74 0.76 0.78 0.80 0.82 0.84 0.86 0.88 0.90 statochromogenes (blau), Durch- GC-Gehalt [%]/100 schnittswert dargestellt.
Im Genom von A. bangkokensis 44EHWT konnten durch antiSMASH-Analyse 35 Sekundär- metabolitgencluster und in S. diastatochromogenes Tü6028 nur 23 Cluster identifiziert werden. In A. bangkokensis gibt es fünf Cluster, die eine Größe über 100 kb besitzen. Zusammen nehmen die Sekundärmetabolitgencluster in A. bangkokensis 22,8 % des Genoms ein, während sie in S. diastatochromogenes nur 9,1 % ausmachen.
124 Diskussion
Mittels weiterer in silico Untersuchungen konnten das Foxicin- und das Thailandin-Biosynthese- gencluster identifiziert und später auch bestätigt werden. Auch das Polyketomycin-Cluster konnte schnell in S. diastatochromogenes Tü6028 lokalisiert werden. Durch die genaue Clusteranalyse konnte für Foxicin und Thailandin je ein Biosynthesemodell aufgestellt werden. Beide Actinomyceten- Stämme zeigen zusätzliche Gencluster, was auf die Fähigkeit zur Produktion weiterer bioaktiver Substanzen schließen lässt. A. bangkokensis produziert in NL5-Medium ein weiteres Antibiotikum. Durch Aufreinigung und Strukturaufklärung könnte man voraussichtlich auch dieses Cluster finden.
Die Genomsequenzierung ist ein neuer Meilenstein in der Biologie und eröffnet neue Wege in verschiedenen Forschungsrichtungen. In den letzten Jahren konnten durch die Sequenzierung neue Einblicke in Krankheiten wie Krebs oder neurologische Erkrankungen gewonnen und neue Therapie- ansätze untersucht werden (Übersicht siehe Meyerson et al., 2010; Bras et al., 2012; Gagan und Van Allen, 2015). In der Pflanzenzucht können Pflanzen gezielt verändert werden (Varshney et al., 2009), durch neue Genomsequenzen lassen sich Rückschüsse über die Evolution ziehen (McCormack et al., 2013), die neuen Sequenziertechniken sind in der Forensik hilfreich (Børsting und Morling, 2015) und das genetische Potential von nicht-kultivierbaren Organismen ist nun auch zugänglich (Schloss und Handelsman, 2005).
Im Hinblick auf die Biotechnologie stehen Actinomyceten im Zentrum der Naturstoffforschung. Dabei sind es vor allem die Corynebakterien, die verschiedene Aminosäuren und Vitamine synthetisieren, und die Sekundärmetabolit-Produzenten. Durch das große Genom von Actinomyceten mit meist über 8 Mb Länge, vielen repetitiven Sequenzen und hohem GC-Gehalt (>70 %) gibt es bei der Assembl- ierung der einzelnen Reads häufig Probleme. Darum müssen meist noch zusätzlich manuelle Sequenz- ierungen von Lücken durchgeführt werden, um eine zusammenhängende Genomsequenz zu erhalten.
Die Genomsequenzierung von Actinomyceten begann 2002/2003 mit der Sequenzierung von Strepto- myces coelicolor (Bentley et al., 2002) und Streptomyces avermitilis (Ikeda et al., 2003), sowie von dem Aminosäure-Hochproduzenten Corynebacterium glutamicum (Kalinowski et al., 2003). Bis Juli 2016 wurden Genomdaten von insgesamt 736 Streptomyceten bei NCBI hinterlegt. Im Diagramm 8 ist die Anzahl an Genomdaten ausgewählter Actinomyceten dargestellt, die bei NCBI (Stand Juli 2016) hochgeladen wurden.
Corynebakterien werden in der industriellen Biotechnologie verwendet. Sie produzieren jedes Jahr mehrere Millionen Tonnen Aminosäuren, vor allem den Geschmacksverstärker L-Glutamat und den
Nahrungsmittelzusatz L-Lysin, aber auch organische Säuren, Diamine, Alkohole als alternative Kraftstoffe und weitere Aminosäuren. Durch das Wissen von Stoffwechselwegen und den involvierten Genen lassen sich die Erträge deutlich steigern. Dabei werden konkurrierende Wege durch die Deletion einzelner Gene inhibiert, die Katalyse von limiterenden Reaktionen durch die Überexpression von Genen gesteigert oder der Umsatz durch erhöhte Transporterzahl gesteigert.
125 Diskussion
350 40 Contig Scaffold komplettes Genom Contig Scaffold komplettes Genom 300 35 30 250 25 200 20 150 15
Anzahl Sequenzen Anzahl 100 Sequenzen Anzahl 10
50 5
0 0 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 A Jahr der Veröffentlichung B Jahr der Veröffentlichung
140 90 Contig Scaffold komplettes Genom Contig Scaffold komplettes Genom 80 120 70 100 60
80 50
60 40 30
Anzahl Sequenzen Anzahl 40 Sequenzen Anzahl 20 20 10
0 0 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 C Jahr der Veröffentlichung D Jahr der Veröffentlichung Diagr. 8: Anzahl Genomsequenzen ausgewählter Actinomyceten bei NCBI nach Jahr der Veröffentlichung Genomsequenzen von (A) Streptomyceten, (B) anderen Antibiotika-Produzenten, (C) biotechnologisch verwendete Actinomyceten- Gattungen und (D) weitere Actinomyceten; Genomsequenzen hinterlegt als Contigs (grün), Scaffolds (blau) und komplettes Genom (gelb), Anzahl und Veröffentlichungsjahr von 2003 bis Juli 2016; zu anderen Antibiotika-Produzenten zählen Stämme der Gattung Actinomyces, Amycolatopsis, Micromonospora, Saccharopolyspora und Saccharothrix; biotechnologisch verwendete Actinomyceten sind Stämme der Gattung Corynebacterium, Rhodococcus und Brevibacterium; weitere Gattungen: Frankia, Gordonia, Micrococcus, Nocarida und Propionibacterium.
Im Hinblick auf die Naturstoffforschung werden immer mehr Stämme der Gattungen Streptomyces, Actinomyces, Amycolatopsis, Micromonospora, Saccharopolyspora, Saccharothrix und von anderen sequenziert. Ein entscheidender Vorteil ist hierbei, dass die Gene für die Biosynthese eines Sekundär- metaboliten meistens in Genclustern nebeneinanderliegen. Wenn man ein beteiligtes Gen identifiziert hat, muss man häufig nur upstream und downstream überprüfen, welche Gene dort zu finden sind. Während man früher aufwendig eine Cosmidbank klonieren und anschließend intensiv nach einem richtigen Klon screenen musste, vereinfacht die Genomsequenzierung diesen Prozess erheblich. Das Programm antiSMASH wurde bei der Identifizierung von Sekundärmetabolit-Genclustern zu einem Standardprogramm. Während antiSMASH 1.0 (Medema et al., 2011) noch eine zusammenhängende Genomsequenz benötigte, konnte die verbesserte Version 2.0 (Blin et al., 2013) schon mehrere Einzelsequenzen bearbeiten, sodass man heute (3.0) (Weber et al., 2015) auch Draft-Sequenzen sehr gut untersuchen kann. Innerhalb weniger Stunden lassen sich somit Cluster identifizieren und man bekommt einen Einblick in das genetische Potential eines Stammes. Mit dem Wissen der Gencluster und den einzelnen Genen lassen sich Stämme gezielt verändern, weiter untersuchen und die Produktion optimieren.
Bei der Sequenzierung der ersten Streptomyceten war man überrascht, dass sie weit mehr Sekundärmetabolit-Gencluster besitzen, als Substanzen nachgewiesen wurden. Sie besitzen häufig mehr als 20 Gencluster, obwohl sie unter Laborbedingungen meist nur ein oder zwei Substanzen
126 Diskussion produzieren. Die anderen Cluster scheinen "still" zu sein. Das Aufwecken dieser Cluster bietet ein enormes Potential zur Entdeckung neuer Sekundärmetabolite. Das kann beispielsweise durch die Überexpression bzw. Repression von Regulatoren (Gessner et al., 2015), die Veränderung von Kultivierungsbedingungen (Bode et al., 2002), die Koinkubation mit anderen Organismen (Schroeckh et al., 2009) oder die heterologe Expression ganzer Cluster (Yamanaka et al., 2014) gelingen.
Heutzutage werden von vielen Stämmen nur Draft-Sequenzen generiert, da das Lückenschließen aufwendig ist und manuell durchgeführt werden muss. Bei den Contig-Genomen (Diagr. 8 grün) werden die Daten als Puzzleteile hochgeladen, während man bei den Scaffolds (Diagr. 8 blau) noch die Anordnung und Orientierung der Contigs mit angibt. Trotzdem gibt eine Draft-Genomsequenz vor allem bei den Sekundärmetabolit-Produzenten schon gute Einblicke in die genetischen Fähigkeiten eines Stammes. Seit 2009/2010 gibt es einen enormen Anstieg neuer Genomsequenzen, da neue Sequenziertechniken etabliert wurden und die Kosten für Sequenzierungen deutlich gefallen sind. Im Jahr 2014 wurden über 300 Streptomyceten sequenziert (siehe Diagr. 8A). Obwohl auch andere Actinomyceten Naturstoffe produzieren, wurden bislang nicht viele Genome solcher Stämme sequenziert (siehe Diagr. 8B). Bei den biotechnologisch verwendeten Stämmen versucht man das komplette Genom zu entschlüsseln, um die Gesamtheit der Gene zu bekommen. Darum werden hier noch etwa ein Drittel der Stämme komplett sequenziert und assembliert (siehe Diagr. 8C, gelb).
In den letzten Jahren wurden mit dem Wissen der Genomsequenz viele Streptomyceten zu sogenannten Superhosts verändert, indem mehrere Gencluster und weitere Genombereiche deletiert wurden. In diesen Stämmen können nun andere Cluster effektiv heterolog exprimiert werden. Beispiele hierfür sind der Stamm S. avermitilis (Deletion von 1,4 Mb, entspricht 16,9 % des Genoms) (Komatsu et al., 2010) und S. coelicolor (Deletion von 1,2 Mb, entspricht 14 % des Genoms) (Zhou et al., 2012), bei denen keine Effekte auf Wachstum und Sporulation nachzuweisen waren und erfolg- reich andere Metabolite heterolog produziert werden konnten.
Durch die heterologe Expression von Clustern kann der Ertrag von Naturstoffen gesteigert werden, bzw. kryptische Cluster können aufgeweckt werden. Während man kleinere Cluster bis ~12 kb über PCR klonieren kann bzw. mehrere Fragmente nacheinander kloniert werden können, erscheinen größere Cluster als schwierig. Die neuen Methoden der Rekombination von ganzen Clustern in E. coli (linear-linear homologe Rekombination) (Fu et al., 2012) oder in der Hefe (Transformations- assoziierte Rekombination) (Yamanaka et al., 2014) werden angepriesen. Jedoch scheinen beide Methoden nicht völlig etabliert zu sein, da in den letzten Jahren kaum neue Publikationen über die heterologe Expression von Clustern veröffentlicht wurden. Auch das Foxicin-Cluster konnte weder durch LLHR noch durch TAR kloniert werden (III.4.4.4).
Mittels bioinformatischen Analysen lassen sich die Funktionen der einzelnen Gene in einem Cluster zwar vorhersagen, müssen aber experimentell bewiesen werden. Dazu können einzelne Gene deletiert werden und der jeweilige Einfluss auf den Naturstoff untersucht werden. Auch mithilfe von
127 Diskussion
Rekombinationsereignissen können Gene gezielt inaktiviert werden. Der Single-Crossover ist eine schnelle Methode dafür, ist aber genetisch nicht stabil und durch die Integration eines Vektors in ein Gen können katalytische Domänen aktiv bleiben. Stabiler, aber auch zeitintensiver, ist die Deletion eines Gens durch einen Doppel-Crossover. Eine weit verbreitete Methode ist die Inaktivierung eines Gens durch die Cas9-Endonuklease. Alternativ lassen sich auch einzelne Gene heterolog exprimieren und die Funktion in diversen in vitro Assays bestimmen.
Durch die hohe Anzahl neuer Genome, deren Genfunktionen mittels automatisierten Programmen vorhergesagt werden, kam es in den letzten Jahren zu einer Explosion an Genannotationen, auch ohne dass weitere Experimente durchgeführt worden waren. Folglich ist die BLAST-Analyse nun deutlich unübersichtlicher. Zwar bekommt man durch eine BLAST-Analyse einen guten ersten Eindruck, trotzdem sollten die Gene genauer betrachten werden, indem zum Beispiel auch gegen die Swiss-Prot- Datenbank (UniProt Consortium, 2015) oder PDB (Berman et al., 2000) gesucht wird, bzw. die einzelnen konservierten Bereiche mit anderen Proteinen der CDD-Datenbank (Marchler-Bauer et al., 2015) verglichen werden.
128 Diskussion
IV.2 Actinokineospora bangkokensis 44EHWT produziert die zwei neuen Polyene Thailandin A und B mit antifungaler Wirkung, in die die ungewöhnliche Extendereinheit Butylmalonyl-CoA eingebaut wird
Aus dem Stamm Actinokineospora bangkokensis konnten die zwei neuen Polyene Thailandin A und B identifiziert, aufgereinigt und deren Strukturen aufgeklärt werden (III.2.2). Dabei handelt es sich jeweils um einen aus 27 C-Atome bestehenden Macrolacton-Ring, Thailandin A ist zusätzlich an C15 rhamnosyliert. Die Strukturen sind in Abbildung 33 dargestellt. Sie zeigen wie andere typische Macro- lacton-Antibiotika auf einer Seite des Rings mehrere, konjugierte Doppelbindungen (5x) und auf der anderen Seite mehrere Hydroxylgruppen (3x). Polyen-Macrolide binden eine große Gruppe an Natur- stoffen, von denen viele klinisch angewendet werden.
Aufgrund der charakteristischen UV/vis-Spektren der zwei Substanzen wurde schon vor der Strukturbestimmung vermutet, dass die Substanzen mehrere konjugierte Doppelbindungen besitzen. Zusammen mit der antifungalen Wirkung wurde angenommen, dass es sich hierbei um ein Polyen ähnlich zu Nystatin oder Amphotericin handelt, der Unterschied in der Retentionszeit und der Shift im UV/vis-Spektrum ließen jedoch neue Substanzen erahnen. Aus diesem Grund wurden die zwei Moleküle aufgereinigt, die Struktur mittels NMR bestimmt, mit verschiedenen Datenbanken verglichen und tatsächlich als zwei neue Substanzen identifiziert. Daraus wird ersichtlich, dass eine genaue Analyse von UV/vis-Spektren zusammen mit weiteren Untersuchungen nützlich sein kann um abzuwägen, ob es sich bei einer neu detektierten Substanz um ein noch unbekanntes Molekül handeln kann und ob es sich lohnt dieses im großen Maßstab aufzureinigen.
Bungonsiri Intra machte an der Mahidol Universität in Thailand noch weitere Versuche und konnte zeigen, dass Thailandin A und B auch das Wachstum weiterer Pilze hemmen kann. Dabei stellte sich heraus, dass die Substanzen auch gegen verschiedene humanpathogene Pilze (Candida albicans MT 2013/1, Candida parasilopsis DKMU 434 und Cryptococcus neoformans MT 2013/2), sowie gegen Colletotrichum-Stämme (C. gloeosporioides DoA d0762, C. gloeosporiodes DoA c1060 und C. capsici DoA c1511) wirken (Intra et al., 2016). Vertreter der Colletotrichum-Gattung verursachen die Pflanzenkrankheit Antraknose, die weltweit zu deutlichen Ernteeinbußen führt. Dabei parasitieren diese filamentösen Pilze auf verschiedenen Getreide-, Gemüse- und Obstsorten (Swinburne, 1993; Freeman et al., 1998). Thailandin A und B zeigen gegen die untersuchten Stämme eine MIC von 16- 32 µg/mL. Dabei ist es weit wirkungsvoller als das strukturähnliche Fungichromin mit einer MIC von 72 µg/mL (Shih et al., 2003).
Polyene und deren Derivate interagieren mit den Ergosterolen der Pilzmembran (Lampen, 1966) oder Episterolen mancher parasitiärer Protozoen. Dabei bilden sich Poren (Hammond et al., 1974; De Kruijff und Demel, 1974), sodass wichtige Ionen (K+, Na+, H+ und Cl-) verloren gehen und so zum Zelltod führen. Zusätzlich wird die Interaktion von Sterolen mit Membranproteinen gestört. Es konnte gezeigt werden, dass Polyene den Aminosäure- und Zuckertransport über die Plasmamembran durch
129 Diskussion die Ergosterolblockierung inhibieren können (Opekarová und Tanner, 1994; te Welscher et al., 2012). Weiterhin verursachen diese Substanzen in den Zellen oxidativen Stress (Sokol-Anderson et al., 1988). Polyen-Antibiotika sind die einzig bislang bekannten, antifungalen Substanzen, die direkt auf die Plasmamembran über eine spezifische Interaktion mit pilzlichen Sterolen zielen. Da diese Sterole nicht in menschlichen Zellen vorkommen, sind Polyen-Antibiotika für den Menschen meist nicht toxisch. Jedoch haben einige von ihnen auch antivirale, antibakterielle, antiparasitäre und auch immun- stimulierende Eigenschaften, wobei der genaue Wirkmechanismus noch ungeklärt ist. Die klinische Anwendung von Polyenen ist durch deren schweren Löslichkeit und dosis-abhängigen Neben- wirkungen (hauptsächlich Nephrotoxizität) aufgrund unterschiedlicher Interaktionen mit der Zelle jedoch limitiert (Überblick siehe Lemke et al., 2005). Daher ist die Weiterentwicklung von bereits bekannten Polyenen eine gute Lösung, um Nebeneffekte zu reduzieren und die Selektivität zu verbessern. Aus diesem Grund wurden viele Strukturuntersuchungen durchgeführt. Im Folgenden werden Modifikationen erläutert, die bei der Aktivität eine entscheidende Rolle spielen. Eine Über- sicht von bekannten Polyen-Macrolactonen, sowie Interaktionen der funktionellen Gruppen ist in Abbildung 51 dargestellt.
Die Polyketidsynthasen der Macrolactone gehören zu den größten ihrer Klasse. Während viele Naturstoffe aus mehreren Untereinheiten bestehen und nach der Synthese des Polyketid-Grundgerüsts weiter modifiziert werden, haben Polyene überwiegend nur wenige weitere Modifikationen. Die meisten von ihnen werden nur glycosyliert, wobei hauptsächlich das Aminoglycosid D-Mycosamin eingebaut wird. In deren Biosynthesegencluster liegen auch die Gene für die Aminoglycosid- Biosynthese, sowie eine entsprechende Glycosyltransferase vor. Die Deletion der Glycosyltransferase fscMI der Candicidin-Biosynthese führte zur Produktion des nicht-glycosylierten Aglycons, das eine geringe antifungale Wirkung auf Saccharomyces cerevisiae Y029 zeigt (Chen et al., 2003). Weiterhin wurde die Transaminase FscMII, die GDP-3-keto-6-deoxy-D-Mannose zu GDP-Mycosamin um- wandelt, inaktiviert. Stattdessen wurde hier die nicht-aminierte Mannose-Vorstufe auf das Aglycon übertragen. Das veränderte Produkt zeigt eine schwächere Inhibierung von Saccharomyces (Chen et al., 2003). Die Entfernung von Mycosamin führte am Beispiel von Amphotericin zum kompletten Verlust der antifungalen Wirkung (Palacios et al., 2011; Gray et al., 2012). Daher ist die Glycosylierung, sowie die Art des übertragenen Zuckers, für die Aktivität von Polyenen entscheidend.
Weitere Modifikationen sind eine aromatische, heptaene Seitenkette, wie bei Vacidin oder Candicin, die zu einer hämolytischen Aktivität führen (Cybulska et al., 1995). Daher scheinen aromatische und nicht-aromatischen Polyene unterschiedlich mit biologischen Membranen zu interagieren.
Die externe Carboxylgruppe ist auch eine einzigartige Eigenschaft in Polyenen. Dabei wird eine Methylgruppe in eine Carboxylgruppe umgewandelt. Diese Carboxylgruppe erhöht die Porenbildungs- fähigkeit bei Membranen mit Ergosterolen und Cholesterolen (Gary-Bobo, 1989). Der Verlust der Carboxylgruppe in aromatischen Polyenen senkt die Fähigkeit zur Hämolyse (<100x) deutlich,
130 Diskussion während die antifungale Wirkung erhalten bleibt (Cybulska et al., 1989, 1995). Auch die externe Hydroxylgruppe hat einen entscheidenden Einfluss auf die Porenbildung.
Hydroxylgruppen bilden die Amphotericin B Innenseite der Membranporen Streptomyces nodosum Thailandin A Thailandin B Antimykotikum
Rolle bei Bildung von dimeren Poren freie Carboxylgruppe interagiert mit Sterolen konjugierende Doppelbildungen interagieren mit Actinokineospora bangkokensis Ergosterolen und Redoxprozessen antifungal
wichtig für antifungale Wirkung Interaktion auch mit anderen Sterolen hämolytische Aktivität
OH
OH O
OH OH OH OH O OH OH
OH Filipin Chainin Nystatin Candicidin Streptomyces filipinensis Streptomyces sclerotialus Streptomyces noursei Streptomyces griseus antifungal antifungal Antimykotikum Antimykotikum
OH
OH O
OH OH OH OH O OH OH OH OH
OH
OH Antifungalmycin Fungichromin Natamycin Vacidin Streptomyces padanus Streptomyces padanus Streptomyces natalensis Streptomyces aureofaciens antifungal antifungal + antiprotozotisch Konservierungsmittel antifungal + hämolytisch
Abb. 51: Strukturen von verschiedenen Polyen-Macrolactonen sowie Interaktionen der funktionellen Gruppen Name, produzierender Stamm, sowie Anwendung bzw. Aktivität ist angegeben; Interaktionen der funktionellen Gruppen dargestellt an Amphotericin B (oben) und Candicin (Mitte rechts); Strukturen von Thailandin A, Thailandin B, Filipin, Chainin, Antifungalmycin, Fungichromin, Amphotericin, Nystatin, Natamycin, Candicin und Vacidin.
Vergleicht man Thailandin A und B mit den erwähnten Strukturmerkmalen wird deutlich, dass diese Strukturen außergewöhnlich sind. Im Gegensatz zu den meisten Polyen-Macrolactonen besitzen diese
Substanzen nicht das Aminoglycosid D-Mycosamin. Thailandin A ist rhamnosyliert und Thailandin B hat gar keine Zuckermodifikation. Trotzdem zeigen beide Polyene eine antifungale Wirkung, wobei das nicht-glycosylierte Thailandin B sogar eine niedrigere MIC als die A-Form gegen verschiedenen Pilze zeigt (Intra et al., 2016). Weiterhin haben beide Substanzen wie auch Filipin (Ceder und Ryhage, 1964), Chainin (Gopalkrishnan et al., 1968; In et al., 2003), Antifungalmycin (Wang et al., 2012) und Fungichromin (Shih et al., 2003) keine aromatische Seitenkette und die freistehende
Carboxylgruppe fehlt, stattdessen besitzen sie eine kurze C2-Seitenkette. Zusätzlich ist der Macro- lacton-Ring bei Thailandin A und B vergleichsweise klein, während er bei den zuvor genannten Polyenen nicht vorkommt. Natamycin, das auch nur einen kleinen Macrolacton-Ring besitzt, wirkt zwar auch gegen Pilze und Protozoen, kann aber keine Poren in Membranen bilden (te Welscher et al., 2008). Deshalb wird es als Konservierungsmittel und gegen topische Infektionen verwendet. Thailandin A und B, sowie Antifungalmycin, Chainin, Filipin und Fungichromin, scheinen auf eine andere Weise mit Pilzen zu interagieren, wobei weitere Studien erforderlich sind. Eventuell hat die kurze Seitenkette an C2 einen zusätzlichen Einfluss auf die antifungale Wirkung.
Derzeit sind nur fünfzehn weitere Actinokineospora-Stämme bekannt, sodass diese Gattung zu den seltenen Actinomyceten zählt. Dabei sind viele von ihnen nur dürftig beschrieben. Hauptsächlich
131 Diskussion wurden sie bei Untersuchungen von bestimmten Habitaten identifiziert. Durch Analyse der Zellwand, der Menaquinone, Phospholipide und Fettsäuren der Zellmembran wurden sie der Gattung der Actinokineospora zugeordnet (Hasegawa, 1988). Weitere Beschreibungen wie produzierte Metabolite fehlen häufig. Nur aus den Stämmen A. fastidiosa (Celmer et al., 1977), A. riparia (Hasegawa, 1991) und A. spheciospongiae (Abdelmohsen et al., 2014; Grkovis et al., 2014) wurden bislang bioaktive Substanzen isoliert (siehe Tab. 1). Viele dieser Arbeiten liegen schon mehrere Jahre zurück. Derzeit wird an A. spheciospongiae, isoliert aus dem marinen Schwamm Spheciospongia vagabunda im Roten Meer, intensiv geforscht. Die Co-Kultivierung von diesem Stamm mit Nocardiopsis sp. RV163 induzierte die Synthese von drei neuen Naturstoffen, die in den Einzelkulturen zuvor nicht detektiert wurden (Dashti et al., 2014).
Von den bekannten Actinokineospora-Stämmen wurden bislang nur die drei Genome von A. enzan- ensis, A. inagensis und A. spheciospongiae (Harjes et al., 2014) sequenziert. Von A. enzanensis (8,1 Mb; 70,8 % GC) und A. inagensis (7,3 Mb; 70,2 % GC) wurden die Draft-Genomsequenzen ohne weitere Beschreibung bei NCBI hochgeladen. Das beschriebene Draft-Genom von A. spheciospongiae hat 7,5 Mb, einen GC-Gehalt von 72,8 % und 36 Sekundärmetabolitgencluster. Aufgrund der geringen Anzahl an sequenzierten Actinokineospora-Genomen wurde im Rahmen dieser Arbeit das Genom von A. bangkokensis sequenziert. Vergleichbar zu den anderen Actinokineospora-Stämmen besitzt A. bangkokensis ein 7,5 Mb großes Genom mit 35 putativen Sekundärmetabolitgenclustern, jedoch ist der GC-Gehalt mit durchschnittlich 74,1 % deutlich höher als in den anderen Stämmen.
Um das Thailandin-Biosynthesegencluster zu identifizieren, wurde das Genom auf PKS I-Gene untersucht. Dabei zeigen Cluster #11, #16 und #19 deutlich die typische PKS I-Architektur. Die genaue Analyse der Thailandin-Struktur und der vorhergesagten Spezifitäten der Acyltransferasen, Anzahl an Modulen und Anwesenheit reduktiver Domänen zeigt deutlich, dass das Cluster #11 für die Biosynthese von Thailandin verantwortlich sein muss. Zur Bestätigung des Clusters sollte ein Single- Crossover eines PKS-Gens durchgeführt werden. Um zu untersuchen, ob A. bangkokensis genetisch manipulierbar ist, sollte zuerst der Vektor pUWL-T in den Stamm gebracht werden. Weder Konjugation, Protoplastentransformation, noch Elektroporation unter Verwendung verschiedener Bedingungen führte zur Aufnahme und Replikation des Plasmids (Rommel, 2014). Es könnte sein, dass der Replikationsursprung in Actinokineospora nicht erkannt wurde und das Plasmid dadurch in dieser Gattung nicht replizieren kann. Der Single-Crossover sollte mit dem Suizid-Vektor pKCLP2 durchgeführt werden, der in dem Stamm nicht replizieren muss, sondern über einen homologen Bereich in das zu inaktivierende Gen integriert. Auch hier konnten durch mehrfache Konjugation, Elektroporation und Protoplastentransformation keine resistenten Klone selektiert werden. Erst die
Zugabe von 10 mM CaCl2 anstatt MgCl2 zum MS-Medium der Konjugation führte schlussendlich zu mehreren Exkonjuganten, die nicht mehr in der Lage waren, Thailandin zu produzieren (III.2.3.2). Das bestätigt, dass das Cluster für die Thailandin-Synthese verantwortlich ist. Bei verschiedenen Strepto- myceten konnte gezeigt werden, dass die Supplementierung von CaCl2 die Konjugationseffizienz 132 Diskussion deutlich steigern kann (Wang und Jin, 2014). Auch S. viridochromogenes Tü57 konnten durch die
Supplementierung von CaCl2 anstatt von MgCl2 zum MS-Medium erfolgreich konjugiert werden. In früheren Arbeiten mit diesem Stamm mussten Protoplasten aufwendig hergestellt und regeneriert werden.
Eine detailierte Analyse des Clusters wurde durchgeführt. Auffallend ist, dass in dem Cluster kein Gen vorhanden ist, dass für eine Glycosyltransferase kodiert. In anderen Polyen-Genclustern liegen die Glycosyltransferasen in den entsprechenden Clustern vor, sowie die Gene zur Aminoglycosid- Biosynthese. Im Genom von A. bangkokensis konnten insgesamt 45 Glycosyltransferasen identifiziert werden. Davon liegen neun Glycosyltransferasen im PKS-Cluster #16 (20 Module) und zwei Glycosyltransferasen im PKS-Cluster #19 (24 Module). Eine dieser Glycosyltransferasen sollte die Übertragung der Rhamnose auf das Thailandin-Aglykon katalysieren. Das Biosynthesemodell von Thailandin ist in Abbildung 52 dargestellt.
thaBI thaBII thaBIII thaBIV thaC
Lade 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
X
Ketosynthase Acyltransferase Acylcarrier-Protein Ketoreduktase Dehydratase Thioesterase Docking
Thailandin A
Rhamnosylierung
2x Zyklisierung 2x Hydroxylierung Abspaltung
Thailandin B Substanz 1
Abb. 52: Putatives Thailandin-Biosynthesemodell Die Polyketidsynthase wird von den vier Enzymen ThaBI-ThaBIV gebildet und setzt sich aus einem Lademodul und dreizehn Extendermodulen zusammen. Das Polyketid wird schrittweise verlängert und wird im letzten Modul durch die Thioesterase vom Multi- enzymkomplex abgespalten. In allen Modulen wird Malonyl-CoA als Extendereinheit verwendet, außer in Modul 6 wird voraussichtlich Methylmalonyl-CoA und in Modul 13 Butylmalonyl-CoA eingebaut. Das Polyketidbackbone durchläuft zwei Zyklisierungsreaktionen und wird zweimal hydroxyliert. Das entstandene Thailandin B wird weiter zu Thailandin A rhamnosyliert. Katalytische Domänen sind links dargestellt. Die DH-Domäne in Modul 7 (X) ist wahrscheinlich inaktiv.
Die Polyketidsynthase wird von vier Multienzymkomplexen gebildet, die von thaBI, thaBII, thaBIII und thaBIV kodiert werden. Sie setzt sich aus einem Lademodul und 13 Erweiterungsmodulen zusammen. Das letzte Modul kodiert für eine Thioesterase, die die Polyketidkette von ThaBIV abspaltet. Auf allen vier Strukturgenen konnten Docking-Domänen identifiziert werden, die für die
133 Diskussion
Zusammenlagerung der Enzymkomplexe verantwortlich sind. Die bioinformatische Vorhersage der einzubauenden Extendereinheiten basierend auf der Acyltransferase-Signatur stimmt fast vollständig mit der tatsächlichen Molekülstruktur überein. Alle Acyltransferasen zeigen das typische GHSxG- Motiv (Yadav et al., 2003) und ausgenommen von Modul 6 und 13 haben alle eine Malonyl-CoA- Spezifität (x=LVIFAM). Die AT-Domäne des Lademoduls besitzt auch eine Malonyl-CoA-Spezifität, obwohl der Struktur zufolge eine C2-Einheit eingebaut wird. Wahrscheinlich wird die Starter- einheiten, wie auch in der Amphotericin- und Nystatin-Biosynthese postuliert, von der KSS decarboxy- liert (Bisang et al., 1999) und dann erst auf die Extenderunit des ersten Moduls übertragen. Die Acyl- transferase in Modul 6 zeigt eine Methylmalonyl-CoA-Spezifität (x=Q), das auch mit der Thailandin- Struktur übereinstimmt. Das Programm antiSMASH sagt den Einbau von Ethylmalonyl-CoA in Modul 13 voraus. Anhand der Strukturanalyse würde man eher die Extendereinheit Butylmalonyl- CoA vermuten. Dabei handelt es sich um eine ungewöhliche Extenderunit. Die hohe Diversität von Polyketiden kommt durch die variierende Anzahl an Modulen, die Anwesenheit von reduktiven Domänen und weiteren modifizierenden Enzymen zustande, während hauptsächlich Malonyl-, Methylmalonyl- oder Ethylmalonyl-CoA eingebaut werden. Der Einbau von Butylmalonyl-CoA wird auch in anderen Biosynthesen postuliert, wobei hier häufig nicht nur ein spezifischer Extender eingebaut wird, sondern die Acyltransferasen weniger spezifisch zu sein scheinen. Die Acyltransferase von RevA der Reveromycin-Biosynthese baut dem Modell zufolge Butylmalonyl-CoA, Isopentyl- malonyl-CoA, Pentylmalonyl-CoA oder Hexylmalonyl-CoA ein (Takahashi et al., 2011). In der Biosynthese von Neoansamycin A-C wird Pentylmalonyl-CoA oder Butylmalonyl-CoA eingebaut (Li et al., 2015). Bei Antimycin (Seipke et al., 2014) und Nemadectin (Carter et al., 1988) werden aufgrund der verschiedenen Derivate auch mehrere verschiedene Acylmalonyl-CoA vorhergesagt, während in Polyoxypeptin nur Methyl-Butylmalonyl-CoA eingebaut wird (Du et al., 2014). Die er- wähnten Naturstoffe mit den ungewöhnlichen Extenderunits sind in Abbildung 53 zu sehen. Sequenz- vergleiche zeigen, dass ein späteres Motiv wahrscheinlich für diese Spezifitäten verantwortlich ist. Dieses Motiv ist in allen erwähnten Acyltransferasen unterschiedlich, während es in Malonyl-CoA- ATs ein HAFH ist. Die AT des Moduls 13 der Thailandin-Biosynthese zeigt das GHSQH- und ein AAGH-Motiv. Im Anhang ist das Alignment der erwähnten Acyltransferasen, sowie der ersten zwei ATs der Thailandin-Biosynthese mit Malonyl-CoA-Signatur dargestellt (siehe Anhang VI.2.2).
Es konnte gezeigt werden, dass Crotonyl-CoA Reduktasen/Carboxylasen an der Biosynthese von einer Vielzahl substituierter Malonyl-CoA-Einheiten beteiligt sind (Überblick siehe Wilson et al., 2012). Im Thailandin-Biosynthesegencluster ist downstream der PKS-Gene das Gen foxC, das nach Sequenz- vergleich für eine solche Crotonyl-CoA-Reduktase kodiert. Dieses Enzym ist demnach voraussichtlich an der Biosynthese von Butylmalonyl-CoA beteiligt.
In Modul 7 liegt eine Dehydratase-Domäne mit dem konservierten HxxxGxxxxP-Motiv. Da im
Thailandin-Molekül an dieser Position eine Hydroxylgruppe (C15) anstatt einer Doppelbindung ist, scheint diese Domäne inaktiv zu sein. 134 Diskussion
Polyoxypeptin Methyl-Propanylmalonyl-CoA Dimethyl-Butylmalonyl-CoA
Methyl-Butylmalonyl-CoA α: R1= H; R2=CH(CH3)2 A: 3 (oben) : R1= H; R2=CH3 B: 3 (unten) 3 : R1= CH3; R2=CH3 C: 4 (unten) λ: R1= CH3; R2=CH(CH3)2 Nemadectin Neoansamycin Butylmalonyl-CoA Isopentylmalonyl-CoA Pentylmalonyl-CoA A1: R=C6H13 Hexylmalonyl-CoA A2: R=C5H11 3-4 A3: R=C4H9
A4: R=C3H7 Propanylmalonyl-CoA Reveromycin RM-A: R1=H, R2=H Butylmalonyl-CoA RM-C: R1=H, R2=CH3 Pentylmalonyl-CoA RM-E: R1=CH2CH3, R2=H Hexylmalonyl-CoA Butylmalonyl-CoA Antimycin Pentylmalonyl-CoA Abb. 53: Beispiele für Naturstoffe mit ungewöhnlichen Extenderunits Beispiele gezeigt an Polyoxypeptin, Antimycin, Nemadectin, Reveromycin und Neoansamycin; ungewöhnliche Extenderunits in kursiv, im Molekül blau dargestellt.
Bei der Analyse des Rohextrakts aus A. bangkokensis konnte noch ein weiteres Derivat aufgrund des ähnlichen UV/vis-Spektrums identifiziert werden (Substanz 1, siehe Abb. 32). Im Massenspektrum konnte eine Masse von 597.5 [M-H]- detektiert werden. Dabei handelt es sich voraussichtlich um das abgespaltene Polyketid-Backbone, das noch nicht weiter modifiziert wurde (kalkulierte Masse 597.8 g/mol). Diese Vorstufe zeigte unter eingesetzten Konzentrationen keine antifungale Wirkung (III.2.2).
Ausgehend von der Thailandin-Struktur müssen nach der Biosynthese und Abspaltung des Polyketids zwei Zyklisierungen und zwei Hydroxylierungen stattfinden, sowie bei Thailandin A eine Rhamnosyl- ierung. Im Cluster liegen drei P450 Monooxygenasen (thaOI-thaOIII) und eine weitere Oxido- reduktase (thaOIV) vor, die die späteren Modifizierungen wahrscheinlich katalysieren. Die acht Regulatoren (thaRI-thaRVIII) lassen auf eine komplexe Regulation schließen. Das Gen thaT kodiert für einen MFS-Transporter. Außerdem liegen elf ORFs im Cluster, denen man trotz Sequenz- vergleiche keine Funktionen zuordnen konnte. Weitere Studien sind notwendig um die Thailandin- Biosynthese, insbesondere die Modifizierungen des Polyketidbackbones, aufzuklären.
Bei der Suche nach neuen Naturstoffen ist die Erforschung seltener Actinomyceten wie zum Beispiel Stämme der Gattung Actinokineospora vielversprechend. Zwar werden auch oft neue Stämme der Gattung Streptomyces isoliert, dabei produzieren sie aber häufig schon bekannte Metabolite. Aus A. bangkokensis 44EHWT konnten die effektiven Polyen-Antimykotika Thailandin A und B isoliert werden. Zusätzlich produziert der Stamm ein Antibiotikum in NL5-Medium und hat voraussichtlich 34 weitere Sekundärmetabolitgencluster. Das PKS-Cluster #16 mit den 20 Modulen und neun Glycosyltransferasen scheint eine außergewöhlich große Substanz zu synthetisieren. Durch nach- folgende Arbeiten mit diesem Stamm könnten weitere neue Naturstoffe identifiziert werden. Interessant ist auch, dass der Stamm gegen die im Labor häufig verwendeten Antibiotika Apramycin und Spectinomycin resistent ist. Es könnte sein, dass A. bangkokensis auch ähnliche Aminoglycosid- Antibiotika produzieren kann und demnach veränderte 30S-Ribosomenuntereinheiten bildet, sodass der Stamm resistent gegenüber solchen Antibiotika ist.
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IV.3 Generierung neuer Substanzen durch kombinatorische Biosynthese von Avilamycin und Polyketomycin
In dieser Arbeit sollte durch kombinatorische Biosynthese von Polyketomycin und Avilamycin neue Sekundärmetabolite generiert werden. Dabei sollten jeweils die Gene der 6-Methylsalicylsäure- synthase (6MSAS) ausgetauscht werden. In Polyketomycin von S. diastatochromogenes Tü6028 wird eine 3,6-Dimethylsalicylsäure (DMSA) und in den Avilamycinen von S. viridochromogenes Tü57 eine Dichloroisoeverninsäure ausgehend von Orsellinsäure an den jeweiligen Metaboliten angeknüpft.
Die iterativen PKS I werden von PokM1 und AviM gebildet, die eine Domänenabfolge von KS-AT- DH-KR-ACP bzw. KS-AT-DH-ACP besitzen. Bei PokM2 und AviN handelt es sich um -Ketoacyl- ACP-Synthasen, die wahrscheinlich die Startereinheit Acetyl-CoA erkennen und als initiale Keto- synthasen fungieren. Das Gen pokM3 kodiert für eine putative Methylsalicylsäure-AMP-Ligase und sollte die DMSA durch AMP-Übertragung aktivieren, die dann weiter auf die Disaccharidkette aus