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Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” Centro de Energia Nuclear na Agricultura

Reconhecimento de irmãos e coespecíficos em girinos de icterica e R. ornata (Anura: Bufonidae)

Alexandre Polettini Neto

Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Ecologia Aplicada

Piracicaba 2018 2

Alexandre Polettini Neto Bacharel em Ciências Biológicas

Reconhecimento de irmãos e coespecíficos em girinos de e R. ornata (Anura: Bufonidae)

Orientador: Prof. Dr. JAIME BERTOLUCI

Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Ecologia Aplicada

Piracicaba 2018 2

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação DIVISÃO DE BIBLIOTECA – DIBD/ESALQ/USP

Polettini Neto, Alexandre Reconhecimento de irmãos e coespecíficos em girinos de Rhinella icterica e R. ornata (Anura: Bufonidae) / Alexandre Polettini Neto. - - Piracicaba, 2018. 45 p.

Dissertação (Mestrado) - - USP / Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”. Centro de Energia Nuclear na Agricultura.

1. Comportamentos 2. Formação de cardumes 3. Comunicação 4. Evolução I. Título

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AGRADECIMENTOS

Agradeço à CAPES pela bolsa concedida; ao ICMBio pela licença de coleta; ao MZUSP pelo acesso e estadia na Estação Biológica de Boracéia; ao professor Jaime Bertoluci pela orientação, ideias, conversas e ensinamentos; a todos que me auxiliaram nos trabalhos de campo – Denise, Gerson, Chico, Edmar e Larissa; aos professores Fernando Rodrigues da

Silva e Karl Mokross pela avaliação e sugestões no exame de qualificação; a todos do

Laboratório de Zoologia de Vertebrados da ESALQ; e a todos os professores, colegas e funcionários que fizeram parte desse grande aprendizado durante o período do Mestrado.

Agradeço à Gabriela Santos pela parceria e amizade em todas as mudanças e adaptações à vida nova piracicabana; aos amigos Franciele de Souza, Nayara Toscano,

Rodolfo Anderson e Denise Petroni pelo compartilhamento de experiências em Herpetologia e da vida acadêmica; aos amigos – Renan Hohendorff, Ana Correia, Rodofo Anderson, Tales

Barbosa e Otávio Bartelega, pela hospitalidade em Rio Claro durante as disciplinas cursadas na UNESP.

Agradeço à Larissa Pedrozo pela essencial ajuda em todo o trabalho e pela união e compreensão durante todo esse processo. Agradeço aos meus pais, Angela e Luiz, pelo apoio incondicional e por tornar possível toda a minha trajetória de estudos.

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SUMÁRIO

RESUMO…………………………………………………………………………………………………..…..………………………5 ABSTRACT……………………………………………………………………………………………………………………...... 6 1 INTRODUÇÃO…………………………………………………………………………………………………….………………7 2 MATERIAL E MÉTODOS………………………………………………………………………………….…………………13 2.1 COLETA DE OVOS……………………………………………………………………………………………….…………………….………..…13 2.2 REGIMES DE DESENVOLVIMENTO…………………………………………………………………………………………….………..…14 2.3 TESTES DE ASSOCIAÇÃO E RECONHECIMENTO……………………………………………………………………...…………..…15 2.4 ANÁLISE DOS DADOS……………………………………………………………………………………………………………….………..….18 3 RESULTADOS………………………………………………………………………………………………………….………..21 4 DISCUSSÃO……………………….……………………………………………………………………………….…………….31 REFERÊNCIAS...... ……………………………………………………………………………….…..………37

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RESUMO

Reconhecimento de irmãos e coespecíficos em girinos de Rhinella icterica e R. ornata (Anura: Bufonidae)

Os benefícios conferidos a organismos que vivem em grupo podem ser maiores em grupos formados por parentes, que em grupos formados por não-parentes, pois, quando um individuo coopera com parentes, está aumentando a probabilidade de cópias de seus próprios genes serem passados aos descendentes do seu parente (sucesso reprodutivo inclusivo). Agregações não-sociais formam-se em resposta a características ambientais atraentes aos indivíduos, enquanto agregações sociais formam-se a partir da atração entre os indivíduos. A atração ou repulsão entre indivíduos é possibilitada por mecanismos de reconhecimento (de parentes, coespecíficos, parceiros sexuais, vizinhos, rivais, presas ou predadores), que são essenciais ao sucesso reprodutivo de organismos de diversos táxons, pois estão envolvidos em importantes processos ecológicos e comportamentais, como formação de agregação, territorialidade, reprodução, detecção de alarmes de predação, discriminação de alimentos e micro-hábitats, cooperação e competição. Em algumas espécies de anfíbios anuros, o reconhecimento de parentes e de coespecíficos é desenvolvido na fase embrionária ou larvária, podendo permanecer após a metamorfose e, na fase reprodutiva, contribuir para evitar endogamia e hibridação. O presente estudo buscou analisar, por meio de experimentos em laboratório, a presença ou ausência do reconhecimento de irmãos e coespecíficos em girinos de Rhinella icterica e R. ornata, duas espécies simpátricas que apresentam comportamento de formação de cardumes. Coletamos ovos das duas espécies em campo e os cultivamos em laboratório, segundo diferentes regimes. Os girinos foram submetidos a experimentos de escolha entre grupos de irmãos e não-irmãos, criados juntos ou separados, e entre grupos de coespecíficos e heteroespecíficos. Os girinos das duas espécies não apresentaram discriminação entre irmãos e não-irmãos, independentemente dos regimes de criação. Os girinos de R. icterica preferiram associar-se com coespecíficos a girinos de R. ornata e pudemos constatar que esse comportamento de discriminação é inato. Os girinos de R. ornata falharam na discriminação entre coespecíficos e girinos de R. icterica. Quando submetidos à escolha entre um grupo de girinos da outra espécie e um compartimento vazio, os girinos de R. icterica apresentaram distribuição aleatória, enquanto que os girinos de R. ornata preferiram associar-se com os girinos heteroespecíficos. Os resultados indicam que girinos de R. icterica podem usar a habilidade de reconhecimento para associar-se com girinos da mesma espécie, enquanto girinos de R. ornata devem agregar-se indiscriminadamente. A diferença entre os resultados obtidos com duas espécies estreitamente relacionadas, ecológica e geneticamente, indica que não pode haver generalizações quanto à presença e à expressão desses comportamentos em larvas de anuros. Este trabalho proporcionará bases para um maior entendimento sobre a ecologia comportamental da fase larvária dessas espécies e contribuirá para o estudo dos processos evolutivos relacionados aos mecanismos de reconhecimento.

Palavras-chave: Comportamento animal; Formação de cardumes; Comunicação; Evolução

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ABSTRACT

Kin and conspecific recognition in tadpoles of Rhinella icterica and R. ornata (Anura: Bufonidae)

Benefits conferred to living in groups may be greater in groups formed by relatives than in groups formed by non-relatives, because cooperating with relatives increases the probability of their own genes being passed on to their parent's offspring (inclusive fitness). Non-social aggregations are formed in response to attractive environmental characteristics, while social aggregations are formed from the attraction among individuals. The attraction or repulsion between individuals is mediated by recognition mechanisms (of relatives, conspecifics, mate partners, neighbors, rivals, prey or predators), which are essential to the fitness of animals of several taxa, since they are involved in important ecological processes and behaviors such as schooling, territoriality, breeding, detection of alarm cues, food and microhabitat discrimination, cooperation and competition. In some anurans, kin and conspecific recognition develops during embryonic or larval stage, and may be retained after metamorphosis, contributing to avoid inbreeding and hybridization during the breeding season. The goal of the present study was to investigate, by laboratory experiments, the presence or absence of sibling and conspecific recognition in tadpoles of Rhinella icterica and R. ornata, two sympatric species that show schooling behavior. We collected eggs of these two species in the field and cultivated them in the laboratory according to different regimes. Tadpoles were submitted to experiments of choice between groups of siblings and non-siblings, raised together or separately, and between conspecific and heterospecific groups. Tadpoles of both species did not discriminate between siblings and non-siblings, regardless of breeding regimes. Rhinella icterica tadpoles preferred to associate with conspecifics rather than to R. ornate tadpoles, and we verified this is an innate behavior. Rhinella ornata tadpoles failed to discriminate between conspecifics and R. icterica tadpoles. When submitted to a choice between a group of tadpoles of the other species and an empty compartment, R. icterica tadpoles presented random distribution, while R. ornata tadpoles preferred to associate with heterospecific tadpoles. The results indicate R. icterica tadpoles may use the recognition ability to associate with tadpoles of the same species, while R. ornata tadpoles may school indiscriminately. The difference between the results obtained with two ecologically and genetically close related species indicates that generalizations regarding the presence and expression of these behaviors in anuran larvae should not be made. This work provides basis for better understanding of larval behavioral ecology in these species and contributes to studies of the evolutionary processes related to recognition mechanisms.

Keywords: Animal behavior; Schooling; Communication; Evolution 7

1. INTRODUÇÃO

A comunicação entre animais ocorre quando um sinal proveniente de um ou mais indivíduos influencia o padrão comportamental de outro indivíduo (Wilson, 1970). A história evolutiva de cada espécie possibilitou o desenvolvimento de diferentes mecanismos sinalizadores (acústicos, elétricos, mecânicos, químicos e visuais), bem como dos sistemas sensoriais necessários para a percepção e interpretação desses sinais, permitindo a comunicação inter e intraespecífica em contextos como forrageamento, interações agonísticas, territorialidade, seleção de parceiros e sinais de alarme (Cardé & Baker, 1984; Dusenbery, 1992; Belanger & Corkun, 2009). A comunicação consiste basicamente em um emissor, um sinal e um receptor (Smith, 1977). Um indivíduo é capaz de identificar e memorizar sinais provindos de outro individuo, do ambiente ou de si mesmo e registrá-los como um padrão (Sherman & Holmes, 1985). Quando um sinal detectado por um receptor corresponde a um padrão registrado (inato ou aprendido), ocorre o reconhecimento (Sherman & Holmes, 1985). A decisão do receptor, uma vez estabelecido o reconhecimento, de qual ação tomar é, muitas vezes, dependente do contexto. Em geral, espera-se que só ocorra uma ação (atração ou repulsão pela fonte do sinal, por exemplo) se o seu custo não exceder os benefícios (Waldman, 1987, 1988, 1991; Reeve, 1989). Mecanismos de reconhecimento (de parentes, coespecíficos, parceiros sexuais, vizinhos, rivais, presas ou predadores) são essenciais para a sobrevivência, reprodução e interações sociais entre os organismos (Sherman et al., 1997). Muitos processos de reconhecimento e interações sociais em anfíbios são mediados por sinais químicos. Entre as salamandras, a comunicação química pode atuar no reconhecimento de si-mesmo (Simon & Madison, 1984; Horne & Jaeger, 1988; Gillette, 2002), de ovos (Forester et al., 1983), de coespecíficos (Jaeger & Gergits, 1979; Ovaska & Davis, 1992) e de diferentes populações de uma mesma espécie (Evans et al., 1997). Além disso, dentro desse grupo, sinais químicos podem conter informações como o sexo, o tamanho corporal e o estado reprodutivo de um indivíduo (Jaeger & Gergits, 1979; Houck & Regan, 1990), contribuindo para comportamentos territoriais e reprodutivos (Horne & Jaeger, 1988; Walls et al., 1989; Ovaska & Davis, 1992). As cecílias também são capazes de assimilar informações sobre sexo, estado reprodutivo, território e parceiros reprodutivos por meio de sinais químicos (Warbeck et al., 1996; Warbeck & Parzefall, 2001). 8

Nas larvas dos anuros a comunicação química desempenha papel essencial em muitos comportamentos, como a comunicação entre a fêmea e sua prole (Kam & Yang, 2002; Stynoski & Noble, 2012), a detecção de alarmes em contextos de presa-predador (Hews, 1988; Hokit & Blaustein, 1995; Summey & Mathis, 1998; Kiesecker et al., 1996, 1999), a competição intraespecífica (Glennemeier & Denver, 2002), a discriminação de alimentos e micro-hábitats (Gamboa et al., 1990; Pfening, 1990, Hall et al., 1995; Sontag et al., 2006) e o reconhecimento de predadores (Petranka, 1987; Lawler, 1989; Kiesecker et al., 1996), de coespecíficos (Leu et al. 2013; Chapman et al., 2014; Raven et al., 2017) e de parentes (Blaustein & O’Hara, 1982; Waldman, 1986; Hokit & Blaustein, 1997; Halverson, 2006; Rajput et al. 2014; Pizzato et al., 2016; Raven et al., 2017). Em anfíbios anuros adultos, o meio de comunicação mais amplamente estudado é o acústico, usado principalmente na atração de fêmeas pelos machos e em comportamentos territoriais (Gerhardt & Huber, 2002; Wells & Schwartz, 2006; Guerra et al., 2018). No entanto, as formas de comunicação visual, mecânica e química também têm sido consideradas importantes entre anuros adultos em diferentes contextos comportamentais (e.g., Lewis & Narins, 1985; Heying, 2001; Hödl & Amézquita, 2001; Waldman & Bishop, 2004; Byrne & Keogh, 2007; Schulte et al., 2011; Furtado & Nomura, 2014; de Sá et al. 2018). Em anuros adultos, o reconhecimento de coespecíficos, mediado por sinais químicos, está presente em processos de escolha de parceiros sexuais (Pearl et al., 2000; Byrne & Keogh, 2007), territorialidade (King et al., 2005) e escolha do local de desova (Spieler & Linsenmair, 1997; Dillon & Fiaño, 2000). Em girinos, as habilidades de reconhecimento baseadas em sinais químicos são desenvolvidas durante a fase embrionária ou logo após a eclosão (Waldman, 1981, 1882; Blaustein & O’Hara, 1982; Hepper & Waldman, 1992) e podem persistir durante o processo de metamorfose e em recém-metamorfoseados (Blaustein et al., 1984; Waldman, 1989; Graves et al., 1993; Flowers & Graves, 1997). Devido à vulnerabilidade a predadores nessa fase, algumas espécies desenvolveram estratégias como sincronização de metamorfose e formação de agregações (Pulliam & Caraco, 1984; Hews, 1988). Nesse caso, a agregação espacial pode estar baseada principalmente na atração por coespecíficos, em vez de mediada por fatores ambientais (Graves et al., 1993). Agrupamentos não-sociais formam-se em resposta a características ambientais atraentes aos indivíduos (e.g., micro-hábitats de alimentação e gradientes de temperatura), 9

enquanto grupos sociais formam-se a partir da atração entre os indivíduos (Wassersug, 1973; Hoff et al., 1999). Desse modo, a comunicação caracteriza um comportamento social (Townsend et al., 2003). Algumas espécies de girinos apresentam comportamento de agregação (e.g., Beiswenger, 1975, 1977; Wassersug et al., 1981; Eterovick, 2000; Izecksohn & Carvalho-e-Silva, 2001; Heursel & Haddad, 2002). As funções e benefícios atribuídos a esse comportamento incluem a diminuição da taxa de predação, devido à confusão causada ao predador e ao reforço do aposematismo, o aumento da taxa de forrageio e uma maior eficiência na termorregulação (Watt et al., 1997; Hoff et al., 1999; Eterovick, 2000; Hero et al., 2001). No entanto, quando os recursos são limitados, alguns custos da formação de grupos podem ficar evidentes, como o aumento da competição, do canibalismo e da predação, bem como uma maior suscetibilidade a doenças e à endogamia (Hamilton & May, 1977; Bateson, 1983; Shykoff & Schmid-Hempel, 1991; Pfening et al., 1993; Goater et al., 1994) Uma agregação pode ser formada por indivíduos geneticamente relacionados ou não-relacionados (Waldman, 1982; Glos et al., 2007). Um indivíduo pode memorizar o padrão de sinais (marcador fenotípico; e.g., odor) de animais com quem compartilhou um mesmo espaço e tempo, identificá-los como familiares e associar-se com estes (Waldman, 1982; Blaustein & O’Hara, 1987). Entretanto, o sucesso reprodutivo (fitness) de um indivíduo que vive em grupo pode ser maior em grupos compostos por parentes do que em grupos compostos por indivíduos pouco relacionados geneticamente (Blaustein, 1981, Blaustein & O’Hara, 1987, Waldman, 1988). Quanto maior o grau de parentesco, maior o número de genes compartilhados entre dois indivíduos; então, quando um indivíduo coopera com um parente próximo, mesmo se seu comportamento não gerar benefícios diretos a si mesmo (comportamento altruísta), está aumentando a probabilidade de copias de seus próprios genes serem passados aos descendentes de seu parente (sucesso reprodutivo inclusivo; Hamilton, 1964). O benefício indireto obtido por um indivíduo que direciona um comportamento altruísta a um indivíduo geneticamente aparentado foi formulado por Hamilton (1964) em sua teoria denominada Seleção de Parentes (Kin Selection): rb – c > 0, onde r é o coeficiente de relação genética entre o altruísta e o receptor da ajuda, b é o benefício conferido ao receptor (maior probabilidade de sobrevivência e sucesso reprodutivo possibilitado pela ajuda) e c é o custo conferido ao altruísta (menor probabilidade de sobrevivência e sucesso 10

reprodutivo, devido aos esforços para ajudar o outro). Desse modo, o altruísta conseguirá aumentar a frequência de seus genes na população se o benefício conferido ao receptor multiplicado pelo grau de parentesco entre eles for maior que o custo proveniente de sua ação. Neste contexto, comportamentos cooperativos e adaptações que permitem o reconhecimento de parentes tendem a ser selecionados em espécies que vivem em grupos de indivíduos aparentados (Blaustein & O’Hara, 1983; Waldman, 1988). A evolução de mecanismos de reconhecimento de parentes ocorreu em diversos táxons de invertebrados e vertebrados, atuando em sistemas complexos de comportamentos sociais e cognitivos (Fletcher & Michener, 1987; Hepper, 1991). Algumas espécies de girinos discriminam entre irmãos e não-irmãos (revisões em Blaustein & Waldman, 1992; Walls & Blaustein, 1995). Essa discriminação consiste em tratamentos diferenciados entre parentes, de diferentes classes de parentesco, e não-parentes, gerando diferenças tanto no comportamento como em outras respostas ecológicas (Waldman, 1988). Por exemplo, algumas espécies de girinos apresentam um maior e mais rápido desenvolvimento quando vivem entre parentes (Jasienski, 1988; Twomei et al., 2008), enquanto outras, que exibem comportamento de canibalismo, podem evitar a predação de parentes (Pfening et al., 1993). Os mecanismos que permitem aos indivíduos reconhecerem seus irmãos podem facilitar a evolução do comportamento de formação de cardumes e também conferir-lhes outras vantagens seletivas. Os indivíduos que evitam acasalar-se com parentes próximos beneficiam-se em relação aos indivíduos da mesma espécie que se acasalam ao acaso, evitando endogamia e problemas de má-formação e garantindo uma maior diversidade genética (Waldman, 1988; Pfennig, 1990). Blaustein & O’Hara (1983) consideraram três tipos básicos de mecanismos que propiciam o reconhecimento de irmãos. Primeiro, o reconhecimento pode originar-se de mecanismos de aprendizagem social ou familiar, um processo pelo qual indivíduos de alguns grupos familiares aprendem a reconhecer os outros desde o início da vida, até mesmo se não tiver desenvolvido um mecanismo para identificar seus irmãos (Waldman, 1982). O segundo mecanismo é a conexão fenotípica, que ocorre quando um indivíduo aprende e recorda-se de uma característica específica própria ou de seus parentes (e.g., odor, cor ou marca particular), que pode ser uma característica similar ou uma diferença notável. As conexões fenotípicas são fundamentalmente diferentes do reconhecimento básico e familiar 11

porque proporcionam ao indivíduo o reconhecimento de indivíduos não-familiares (Blaustein & O’Hara, 1983). O terceiro mecanismo, que baseia-se no reconhecimento de genes específicos, também proporciona o reconhecimento de parentes e não-parentes; contudo, esse mecanismo de reconhecimento de parentes é inato, não está envolvido na aprendizagem e é expresso por uma característica fenotípica (e.g., odor). É importante lembrar que os diferentes tipos de mecanismos podem operar isoladamente ou em conjunto (Blaustein & O’hara, 1983). Em mecanismos com bases genéticas, o Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC, do inglês Major Histocompatibility Complex) pode estar envolvido no reconhecimento de parentes e coespecíficos, tanto em anfíbios como em outros vertebrados (Manning et al., 1992; Yamazaki et al., 2000, Piertney & Oliver, 2006; Villinger & Waldman, 2008). O MHC é específico para cada organismo e pode influenciar o odor deste, sendo assim um excelente marcador para identificar relações genéticas (Penn, 2002). O cruzamento entre indivíduos geneticamente distantes pode conferir uma maior variabilidade ao MHC dos filhotes, resultando em benefícios ao sistema imunológico da prole (Penn & Potts, 1999, Landry et al., 2001). Nesse contexto, o presente estudo buscou analisar, por meio de experimentos em laboratório, a presença ou a ausência do reconhecimento de irmãos e coespecíficos em duas espécies cogenéricas de girinos que ocorrem em simpatria e apresentam ampla distribuição na Mata Atlântica do sudeste brasileiro: os bufonídeos Rhinella icterica e R. ornata. Na fase larval, essas espécies apresentam comportamento de agregação e formação de cardumes (Eterovick, 2000; Simon, 2010; obs. pess.), que é um indicativo de sociabilidade. Ao analisar se algum mecanismo de reconhecimento ocorre nessas espécies, podemos ter indicativos se as agregações são sociais ou não-sociais. Devido à ocorrência simpátrica, à sobreposição de sítios reprodutivos e de temporadas de reprodução e ao estreito parentesco entre R. icterica e R. ornata (Bertoluci, 1992; Bertoluci & Rodrigues, 2002; Abrunhosa et al., 2006), o isolamento reprodutivo entre as duas espécies pode não ser eficaz, possibilitando amplexos interespecíficos e formação de híbridos inviáveis (Haddad et al., 1990). Desse modo, o reconhecimento de coespecíficos e a consequente discriminação entre uma espécie e outra na fase larval, tendo em vista a possibilidade da permanência de habilidades de reconhecimento após a metamorfose, pode indicar a existência de um importante mecanismo de isolamento reprodutivo. Além disso, 12

um mesmo hábitat é compartilhado por girinos das duas espécies, de diferentes graus de parentesco e estágios de desenvolvimento; desse modo, um sistema de comunicação intra e interespecífica teria um importante valor adaptativo para as duas espécies. O reconhecimento de irmãos e coespecíficos em girinos é mediado, principalmente, por sinais químicos (Waldman, 1987, 1991). A comunicação química pode estar estreitamente ligada à conservação de espécies que habitam corpos d’água, pois esses ambientes são atingidos por substâncias tóxicas provindas de centros urbanos e agrícolas (Park et al. 2001; Ward et al., 2008). Algumas substâncias presentes em agrotóxicos, até mesmo em concentrações sub-letais aos organismos, afetam negativamente aspectos importantes ligados à comunicação química em girinos, como a capacidade de reconhecimento e a fuga de predadores (Mandrillon, 2007; Moore, 2015; Polo-Cavia et al., 2016). Portanto, a análise da presença de comunicação química nas espécies do estudo pode subsidiar ações conservacionistas e servir de base para futuros estudos envolvendo poluentes nos ambientes em que os girinos se desenvolvem. Até hoje, apenas um estudo buscou analisar mecanismos de reconhecimento em girinos de espécies brasileiras (Rhinella marina; Raven et al., 2017), porém este foi feito com populações invasoras em território australiano. Desse modo, o presente estudo contribui para o preenchimento de uma lacuna importante no conhecimento do comportamento de girinos brasileiros, buscando entender melhor os processos evolutivos e ecológicos relacionados aos mecanismos de reconhecimento. Com isso, buscamos responder, para cada uma das espécies, as seguintes questões: (1) os girinos preferem associar-se com irmãos a não-irmãos (reconhecimento de irmãos)?; (2) os girinos preferem associar-se com coespecíficos a heteroespecíficos (reconhecimento coespecífico)?; (3) a experiência social prévia influencia os mecanismos de reconhecimento?

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2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Coleta de ovos A coleta de ovos ocorreu nos meses de julho e agosto de 2017. Os ovos foram coletados na Estação Biológica de Boracéia (EBB) (23˚38’ S, 45˚52’ W), uma reserva de Mata Atlântica bem-preservada que faz parte da Serra do Mar no estado de São Paulo. A EBB possui área de 16450 ha, situa-se em altitudes em torno de 900 m, apresenta como vegetação dominante a Floresta Ombrófila Densa, com presença comum de palmeiras, samambaiaçus e bambus-gigantes (Travassos & Camargo, 1958; Heyer et al. 1990; Bertoluci & Rodrigues, 2002). A estação chuvosa estende-se de setembro a março, e a temperatura pode atingir 24˚C nos meses mais quentes (setembro a março) e 5˚C nos meses mais frios (abril a agosto) (Bertoluci & Rodrigues, 2002). A EBB apresenta uma das maiores diversidades de anuros do planeta (69 espécies), sendo certamente a localidade melhor conhecida da Mata Atlântica (Heyer et al., 1990, Bertoluci & Rodrigues, 2002; Bertoluci et al., 2005), porém declínios populacionais foram registrados para a anurofauna local (Heyer et al., 1988, 1990; Bertoluci & Heyer, 2005; Verdade et al., 2011). Coletamos cerca de 600 ovos de cada desova encontrada. Identificamos a qual espécie a desova pertencia com base no tamanho e na disposição dos ovos dentro dos cordões gelatinosos: fileira única e ovos menores – Rhinella ornata; fileira dupla e ovos maiores – R. icterica (Simon, 2010; obs. pess.). No dia 24 de julho de 2017, coletamos ovos de uma desova de R. icterica, localizada em uma poça de água transparente e substrato rochoso (cerca de 20 cm de profundidade), às margens de uma queda d’água do Rio Claro (23˚38’56’’ S, 45˚52’47’’ W). No dia 14 de agosto do mesmo ano, coletamos ovos de uma desova de R. icterica, localizada em uma poça de água transparente e substrato de concreto (cerca de 10 cm de profundidade), abaixo de uma barragem construída para represar águas do Ribeirão do Campo (23˚38’15’’ S, 45˚50’04’’ W). Nesse mesmo dia, coletamos ovos de duas desovas de R. ornata: uma estava localizada no Charco da Pedreira, um charco de água clara e substrato arenoso, com profundidades entre 20 e 50 cm (23˚38’15’’ S, 45˚50’23’’ W; ver Heyer et al., 1990 e Bertoluci & Rodrigues, 2002, para uma descrição desse corpo d’água), e a outra desova estava localizada na mesma poça em que coletamos os ovos de R. icterica no mês anterior. Os ovos foram transportados até o laboratório em potes plásticos contendo água do local. 14

2.2. Regimes de desenvolvimento

No laboratório, duas desovas de cada espécie (Desovas A e B) foram acondicionadas segundo três diferentes regimes de desenvolvimento (Figura 1). Os embriões estavam entre os Estágios 16 e 18 (sensu Gosner, 1960) quando foram separados do resto da desova. 1º regime (desenvolvimento somente com irmãos): 300 ovos de cada desova acondicionados em dois recipientes opacos de 50L. 2º regime (desenvolvimento com irmãos e não-irmãos): 150 ovos de cada desova acondicionados em um recipiente opaco de 50L e separados por uma tela plástica com malha de 0,5 mm, deixando a água fluir livremente entre os dois grupos e permitindo o contato químico e visual entre as larvas. 3º regime (desenvolvimento em total isolamento): 120 ovos da desova B cultivados isoladamente, cada um em um recipiente opaco de 0,5L.

Figura 1. Ilustração esquemática dos três diferentes regimes de criação. Os retângulos representam os recipientes nos quais os ovos foram alocados e os girinos se desenvolveram. A linha tracejada representa a tela que separa em duas partes um mesmo recipiente. O 3º Regime foi replicado 120 vezes para cada desova.

Os ovos e os girinos foram mantidos à temperatura ambiente e ao fotoperíodo natural. Os girinos foram alimentados uma vez por dia com ração para peixes ornamentais em grandes quantidades, para que o alimento estivesse sempre disponível. A oxigenação foi feita por bombas de aeração para aquários. A água de cada recipiente foi trocada duas vezes por semana. Após a metamorfose, os juvenis foram soltos nos locais de coleta dos ovos. 15

2.3. Testes de associação e reconhecimento

Os testes foram feitos entre 25 de agosto e 27 de setembro de 2017, no período diurno, entre 08:00h e 18:00h. Os girinos foram testados após terem atingido o Estágio 25 de Gosner (1960). Os testes foram realizados em quatro recipientes plásticos de 100×15×10 cm, preenchidos por água com baixo teor de cloro (Figura 2). Em cada extremidade de um recipiente foi fixada uma tela plástica com malha de 0,5 mm, delimitando os espaços em que foram colocados os grupos de estímulo (20 girinos de um dos diferentes tratamentos). A parte central de cada recipiente foi marcada com caneta hidrográfica permanente, dividindo-a em três compartimentos de tamanhos iguais. Os girinos a serem testados (girinos-teste) foram colocados no centro de cada recipiente e submetidos a testes de escolha entre os dois grupos (como em O’Hara & Blaustein, 1981, 1982; Blaustein & O’Hara, 1982, 1983, 1986; Cornell et al., 1989; Saidapur & Girish, 2000; Leu et al., 2013; Rajput et al., 2014; Pizzato et al., 2016). Para que a presença do pesquisador não influenciasse o comportamento dos girinos, os experimentos foram filmados (câmera Kodak z990). Após 10 minutos de aclimatação dos girinos-teste, filmamos cada experimento por 29 minutos (1740 s), e posteriormente cronometramos o tempo que cada girino-teste permaneceu no compartimento próximo a cada grupo de estímulo. Cada girino foi testado apenas uma vez e, após cada teste, os recipientes foram limpos e a água foi trocada. A cada teste giramos os recipientes a 90˚ e invertemos o lado de cada grupo de estimulo. Cada experimento foi replicado 32 vezes. Foram filmadas quatro réplicas de cada vez. Todos os procedimentos foram repetidos para as duas espécies. Durante os experimentos, medimos a temperatura da água com um termômetro de mercúrio (precisão ± 1˚C). Após cada experimento, obtivemos o estágio e o comprimento total médio dos girinos utilizados nos testes e nos grupos de estímulo.

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Figura 2. Ilustração esquemática da arena de testes. Nas extremidades direita e esquerda estão representados os grupos de estímulo (20 girinos em cada grupo) e na região central, o girino a ser testado. A linha tracejada representa a tela, que delimita o espaço dos grupos de estímulo, mas possibilita a passagem de estímulos químicos e visuais à região central. As linhas verticais cinzas representam a demarcação das áreas próximas a cada grupo de estímulo. Cada divisão possui 20 cm de comprimento, totalizando 100 cm de comprimento total da arena.

Para cada experimento, os dois grupos de estímulo foram escolhidos em relação ao parentesco e à familiaridade com o girino-teste (Tabela 1; familiar = criados com contato entre si; não-familiar = criados sem contato entre si): Controle - irmãos familiares vs. irmãos familiares. Todos os girinos (girinos-teste e grupos de estímulo) provenientes da mesma desova e criados juntos num mesmo recipiente. Com esse experimento pudemos analisar se há erros no delineamento e aparato experimentais. O esperado, devido à ausência de diferenças de parentesco e familiaridade entre os girinos, é que os girinos-teste não demonstrem preferência de associação a um dos dois grupos. Experimento 1 - irmãos familiares vs. não-irmãos não-familiares. Girinos-teste provenientes da Desova A, criados segundo o 1º regime. Grupo de estímulo 1 formado por girinos provenientes da Desova A, criados juntos com os girinos-teste. Grupo de estímulo 2 formado por girinos da Desova B. Com esse experimento buscamos analisar a preferência ou repulsão dos girinos testados aos grupos de estímulo formados por irmãos ou não-irmãos, obtendo assim indicativos da presença ou ausência de mecanismos de discriminação de parentes nas espécies estudadas. Experimento 2 - irmãos familiares vs. não-irmãos familiares. Todos os girinos criados segundo o 2º regime, no mesmo recipiente. Grupo de estímulo 1 formado por girinos provenientes da mesma desova que os girinos-teste (Desova A). Grupo de estímulo 2 formado por girinos provenientes da Desova B. Com esse experimento buscamos analisar se o ambiente compartilhado por irmãos e não-irmãos durante o desenvolvimento influencia a escolha de associação a um dos grupos pelos girinos testados. 17

Experimento 3 – irmãos não-familiares vs. não-irmãos não-familiares. Girinos-teste criados segundo o 3º regime. Grupo de estímulo 1 formado por girinos provenientes da mesma desova que os girinos-teste (Desova B). Grupo de estímulo 2 formado por girinos provenientes da Desova A. Com esse experimento buscamos analisar se o regime de criação em total isolamento influencia a escolha de associação a um dos grupos pelos girinos testados. Experimento 4 – irmãos familiares vs. irmãos não-familiares. Todos os girinos provenientes da Desova B. Girinos-teste criados segundo o 1º regime. Grupo de estímulo 1 formado por girinos criados junto com os girinos-teste. Grupo de estímulo 2 formado por girinos criados em outro recipiente. Com esse experimento buscamos analisar se a familiaridade com um dos grupos de estímulo influencia a escolha de associação a um dos grupos de irmãos pelos girinos-teste. Experimento 5 – coespecíficos (não-irmãos não-familiares) vs. heteroespecíficos. Girino-teste proveniente da Desova B criado segundo o 1º regime. Grupo de estímulo 1 formado por girinos da Desova A, criados em um outro recipiente. Grupo de estímulo 2 formado por girinos da outra espécie estudada. Com isso, buscamos analisar se há preferência de associação com coespecíficos pela espécie testada. Experimento 6 – coespecíficos (não-irmãos não-familiares) vs. heteroespecíficos. Girino-teste proveniente da Desova A criado segundo o 3º regime. Grupo de estímulo 1 formado por girinos da Desova B, criados em um outro recipiente. Grupo de estímulo 2 formado por girinos da outra espécie estudada. Com isso, buscamos analisar se o regime de criação em total isolamento influencia a escolha de associação a um dos grupos pelos girinos testados. Experimento 7 – heteroespecíficos vs. vazio. Girino-teste proveniente da Desova A, criado segundo o 1º regime. Grupo de estímulo 1 formado por girinos da outra espécie estudada. Grupo de estímulo 2 vazio (ausência de girinos). Com esse experimento buscamos analisar a sociabilidade do girino-teste (preferência por agrupamento ou isolamento), além da atração ou repulsão do girino-teste por girinos da outra espécie estudada.

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Tabela 1. Síntese dos testes de associação e reconhecimento. Familiar = criados em um mesmo recipiente que o girino-teste; não-familiar = criados em um recipiente diferente daquele em que o girino-teste foi criado.

Experimento Grupo de estímulo 1 Girino-teste Grupo de estímulo 2

Controle irmãos familiares 1º regime irmãos familiares

1 irmãos familiares 1º regime não-irmãos não-familiares

2 irmãos familiares 2º regime não-irmãos familiares

3 irmãos não-familiares 3º regime não-irmãos não-familiares

4 irmãos familiares 1º regime irmãos não-familiares

5 não-irmãos não-familiares 1º regime heteroespecíficos

6 não-irmãos não-familiares 3º regime heteroespecíficos

7 heteroespecíficos 1º regime vazio

2.4. Análise dos dados

As análises estatísticas foram feitas com o auxílio do programa R (R Core Team, 2003). Consideramos o nível de significância α = 0,05. Os testes foram bilaterais. O nível de confiança utilizado foi de 95%. Para cada experimento, os dados considerados nos testes estatísticos foram as diferenças entre o tempo gasto pelo girino-alvo nos compartimentos localizados perto dos grupos de estímulo 1 e 2 (T₁ – T₂). Verificamos se os dados de cada experimento correspondiam à distribuição normal por meio do teste de Shapiro-Wilk (Hₒ = os dados correspondem à distribuição normal). Aos dados que atingiram a distribuição normal aplicamos o test t-pareado, devido à dependência das amostras, já que foram feitas duas medidas para um mesmo indivíduo em cada experimento (dados pareados). A alternativa não-paramétrica ao test t-pareado é o teste de postos-sinalizados de Wilcoxon, que foi aplicado aos dados que não atingiram a distribuição normal. Com os testes, pudemos analisar se a diferença entre o tempo gasto pelos girinos-teste perto de cada um dos dois grupos de estímulo era estatisticamente significativa. A hipótese-nula foi a de que a média (ou mediana) das diferenças é nula (Hₒ: ∆ = 0), enquanto que a hipótese alternativa foi a de que a média (ou mediana) das diferenças não é nula (H₁: ∆ ≠ 0). Quando a hipótese-nula foi rejeitada, usamos o teste binomial para analisar se o número de girinos que gastaram mais 19

tempo perto de um grupo de estímulo era estatisticamente significativo em relação ao número total de réplicas.

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3. RESULTADOS

As medições do comprimento total (CT; média aritmética ± desvio padrão) e dos estágios de desenvolvimento dos girinos (Gosner, 1960) e a variação de temperatura da água (˚C) em cada experimento estão apresentados nas Tabelas 2 (Rhinella icterica) e 4 (Rhinella ornata). O CT dos girinos testados de R. icterica variou entre 17,53 e 21,80 mm e os estágios entre 30 e 38. Nos girinos testados de R. ornata, o CT variou entre 13,63 e 18,69 mm e os estágios entre 27 e 37. A temperatura da água variou entre 20 e 27˚C nos experimentos com R. icterica e entre 19 e 28˚C nos experimentos com R. ornata. Os dados obtidos nos experimentos Controle, 1, 4, 5 e 7 com girinos de Rhinella icterica e nos experimentos Controle, 2, 3, 4, 5 e 7 com R. ornata corresponderam à distribuição normal (teste de Shapiro-Wilk; Tabela 3 e 5); nesses casos, utilizamos o teste-t pareado para analisar as diferenças entre o tempo gasto pelos girinos-teste próximo a cada grupo de estímulo. Contudo, nos experimentos 2, 3 e 6 com R. icterica e no experimento 1 com R. ornata, os dados não corresponderam à distribuição normal (teste de Shapiro-Wilk; Tabelas 3 e 5), então utilizamos o teste de Wilcoxon. As diferenças entre o tempo gasto pelos girinos-teste próximo a cada grupo de estímulo, bem como a média das diferenças (valor usado no teste t-pareado) e a pseudomediana das diferenças (valor usado no teste de Wilcoxon), quando negativas, indicam um maior tempo de permanência dos girinos-teste próximo ao grupo de estímulo 2, ao passo que, quando positivas, indicam um maior tempo de permanência dos girinos-teste próximo ao grupo de estímulo 1 (Tabelas 3 e 5; Figuras 3 a 8). A variação dos dados obtidos com os experimentos está apresentada nas Figuras 5 e 6. Em geral, os dados variaram mais para R. ornata que para R. icterica. O intervalo de confiança (Figuras 3, 4, 7 e 8) indica 95% de probabilidade de que um valor amostrado aleatoriamente, dentro daqueles valores obtidos em cada experimento, esteja contido entre os limites inferior e superior desse intervalo. Desse modo, o intervalo de confiança localizado totalmente no setor dos valores positivos do gráfico representa uma forte tendência de os girinos testados preferirem a proximidade com o grupo de estímulo 1 (Figuras 4 e 8). Nos experimentos Controle, 1, 4, e 7 com R. icterica e nos experimentos Controle 2, 3, 4, e 5 com R. ornata, a média das diferenças não diferiu estatisticamente da média 22

hipotética obtida pelo teste-t pareado (Tabelas 3 e 5). Similarmente, nos experimentos 2 e 3 com R. icterica e no experimento 1 com R. ornata, a pseudomediana das diferenças não diferiu estatisticamente da mediana hipotética obtida pelo teste de Wilcoxon (Tabelas 3 e 5). Portanto, para esses experimentos, não rejeitamos a hipótese-nula e concluímos que não houve diferença estatisticamente significativa entre o tempo gasto pelos girinos próximo a cada grupo de estímulo (Hₒ: ∆ = 0). No experimento 5 com R. icterica e no experimento 7 com R. ornata, a média das diferenças diferiu estatisticamente da média hipotética obtida pelo teste-t pareado (Tabelas 3 e 5). Similarmente, no Experimento 6 com R. icterica, a pseudomediana das diferenças diferiu estatisticamente da mediana hipotética pelo teste de Wilcoxon (Tabelas 3 e 5). Portanto, para esses experimentos, rejeitamos a hipótese nula e concluímos que houve diferença estatisticamente significativa entre o tempo gasto pelos girinos próximo a cada grupo de estímulo (H₁: ∆ ≠ 0). Nesses experimentos, confirmamos, com o teste binomial, que o número de girinos que mostraram preferência pelo grupo 1 foi significativo em relação ao número total de réplicas (Tabelas 3 e 5).

Tabela 2. Comprimento total (média ± desvio padrão) e estágios (Gosner, 1960) dos girinos de Rhinella icterica testados e usados para compor os grupos de estímulo (GE 1 e GE 2); e variação da temperatura da água durante cada experimento.

Comprimento total (mm) Temperatura Experimento Estágio da água (˚C)

Girinos-teste GE 1 GE 2

17,53 ± 1,12 16,70 ± 1,68 Controle 20–24 30–32 30–32 18,64 ± 1,36 18,81 ± 1,86 16,81 ± 2,07 1 24–26 34–38 31–37 30–35 21,49 ± 1,69 19,21 ± 3,08 16,78 ± 1,21 2 23–26 33–38 31–36 30–32 26,41 ± 1,23 18,38 ± 2,98 21,97 ± 2,54 3 23–26 36–38 30–37 33–38 18,60 ± 2,54 19,39 ± 2,45 21,45 ± 2,38 4 26–27 31–36 31–37 32–36 21,80 ± 1,94 21,38 ± 2,33 17,97 ± 2,02 5 22–26 32–37 31–38 30–35 21,14 ± 2,39 19,10 ± 2,92 21,88 ± 2,49 6 22–26 32–37 30–37 31–38 19,79 ± 1,65 19,55 ± 2,14 7 - 25–27 36–38 31–36 23

Tabela 3. Resultados dos testes estatísticos para cada experimento com girinos de Rhinella icterica. gl = graus de liberdade; IC = intervalo de confiança. Teste Média Teste t-pareado (t) Pseudomediana Teste Experim. Shapiro- das IC (95%) ou Wilcoxon (V) das diferenças binomial Wilk diferenças Lim. Lim. inf. sup. W = 0,97 t = -0,98 ; gl = 31; Controle -159,68 -490,68 171,3 - p = 0,58 p = 0,33 - W = 0,97 t = 0,44; gl = 31; 1 44,8 - -162,26 252,01 - p = 0,72 p = 0,66 W = 0,89 V = 348; gl = 31; 2 - 111 -36 235 - p = 0,003 p = 0,12 W = 0,88 V = 295; gl = 30; 3 - 87,63 -110 273 - p = 0,002 p = 0,36 W = 0,96 t = 0,11; gl = 31; 4 11,31 -195,11 217,73 - p = 0,37 p = 0,91 - W = 0.97 t = 4,89; gl = 31; n = 24 5 430,93 - 251,49 610,38 p = 0,53 p < 0,001 p < 0,001 W = 0,92 V = 384; gl = 31; n = 22 6 - 176 31,99 325,99 p = 0,02 p = 0,02 p < 0,001 W = 0,98 t = 0,57; gl = 31; 7 55,68 -142,55 253,93 - p = 0,91 p = 0,57 -

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Figura 3. Representações gráficas dos experimentos Controle, 1, 2 e 3 executados com girinos da espécie Rhinella icterica. Em cada gráfico, os pontos correspondem à diferença entre o tempo gasto pelo girino-teste, em cada réplica, próximo ao grupo de estímulo 1 e 2. As linhas pontilhadas correspondem aos limites inferiores e superiores do intervalo de confiança (nível de confiança = 95%). A linha tracejada corresponde à média das diferenças (valor usado no teste-t pareado: Controle e Experimento 1) ou à pseudomediana das diferenças (valor usado no teste de Wilcoxon: Experimentos 2 e 3).

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Figura 4. Representações gráficas dos resultados dos experimentos 4, 5, 6, 7 executados com girinos de Rhinella icterica. Em cada gráfico, os pontos correspondem à diferença entre o tempo gasto pelo girino-teste, em cada réplica, próximo aos grupos de estímulo 1 e 2. As linhas pontilhadas correspondem aos limites inferiores e superiores do intervalo de confiança (nível de confiança = 95%). A linha tracejada corresponde à média das diferenças (valor usado no teste-t pareado: Experimentos 4, 5 e 7) ou à pseudomediana das diferenças (valor usado no teste de Wilcoxon: Experimento 6).

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Figura 5. Boxplot dos dados resultantes dos experimentos com girinos de Rhinella icterica. Cada ponto representa a diferença entre o tempo gasto pelo girino-teste, em cada réplica, próximo aos grupos de estímulo 1 e 2.

Figura 6. Boxplot dos dados resultantes dos experimentos com girinos de Rhinella ornata. Cada ponto representa a diferença entre o tempo gasto pelo girino-teste, em cada réplica, próximo aos grupos de estímulo 1 e 2.

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Tabela 4. Comprimento total (média ± desvio padrão) e estágios (Gosner, 1960) dos girinos de Rhinella icterica testados e usados para compor os grupos de estímulo (GE 1 e GE 2); e variação da temperatura da água durante cada experimento.

Comprimento total (mm) Temperatura Experimento Estágio da água (˚C)

Girinos-teste GE 1 GE 2

14,58 ± 1,00 13,90 ± 1,23 Controle 19–23 27–29 27–29 13,63 ± 0,86 13,44 ± 0,98 14,84 ± 0,57 1 19–24 27–30 28–30 30–31 15,98 ± 1,26 13,09 ± 0,77 15,93 ± 1,58 2 21–25 30–33 28–30 30–33 14,78 ± 1,18 16,40 ± 0,98 14,95 ± 1,30 3 21–25 29–31 31–33 30–31 16,29 ± 0,80 16,27 ± 1,12 16,00 ± 1,16 4 20–24 31–33 31–33 31–33 17,94 ± 1,90 16,83 ± 1,33 16,99 ± 1,24 5 19–24 31–35 32–35 32–34 18,69 ± 2,10 20,01 ± 1,55 7 - 23–28 31–37 33–38

Tabela 5. Resultados dos testes estatísticos para cada experimento com girinos de Rhinella ornata. gl = graus de liberdade; IC = intervalo de confiança. Teste Média Teste t-pareado (t) Pseudomediana Teste Experim. Shapiro- das IC (95%) ou Wilcoxon (V) das diferenças binomial Wilk diferenças Lim. Lim. inf. sup. W = 0,96 t = 1,08; gl = 31; Controle 154,37 -135,44 444,19 - p = 0,47 p = 0,28 - W = 0,91 V = 160; gl = 31; 1 - -408,5 -853 1 - p = 0,01 p = 0,052 W = 0,93 t = 1,49; gl = 31; 2 270,68 -97,81 639,19 p = 0,059 p = 0,14 - W = 0,95 t = -0,60, gl = 31; 3 -111,31 -488,86 266,24 - p = 0,18 p = 0,55 - W = 0,94 t = 1,09, gl = 31; 4 164,68 -141,92 471,30 - p = 0,07 p = 0,28 - W = 0,94 t = -1,41, gl = 31, 5 -174,12 -425,26 77,01 - p = 0,10 p = 0,16 - W = 0,95 t = 3,32; gl = 31; n=25 7 496,5 - 192,14 800,85 p = 0,20 p = 0,02 p < 0,001

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Figura 7. Representações gráficas dos experimentos Controle, 1, 2 e 3 executados com girinos de Rhinella ornata. Em cada gráfico, os pontos correspondem à diferença entre o tempo gasto pelo girino-teste, em cada réplica, próximo aos grupos de estímulo 1 e 2. As linhas pontilhadas correspondem aos limites inferiores e superiores do intervalo de confiança (nível de confiança = 95%). A linha tracejada corresponde à média das diferenças (valor usado no teste-t pareado: Controle e Experimentos 2 e 3) ou à pseudomediana das diferenças (valor usado no teste de Wilcoxon: Experimento 1).

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Figura 8. Representações gráficas dos Experimentos 4, 5 e 7 executados com girinos de Rhinella ornata. Em cada gráfico, os pontos correspondem à diferença entre o tempo gasto pelo girino-teste, em cada réplica, próximo ao grupo de estímulo 1 e 2. As linhas pontilhadas correspondem aos limites inferiores e superiores do intervalo de confiança (nível de confiança = 95%). A linha tracejada corresponde à diferença das médias.

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4. DISCUSSÃO

Nos Experimentos 1, 2 e 3, os girinos de Rhinella icterica não demonstraram preferência de associação espacial pelos grupos de irmãos ou de não-irmãos. A distribuição aleatória dos girinos-teste sugere que não há discriminação entre irmãos e não-irmãos por girinos dessa espécie. Em girinos da espécie R. marina, que pertence ao mesmo grupo filogenético que R. icterica (Grupo Rhinella marina; Maciel et al., 2010), foi constatada uma fraca tendência de associação com irmãos (Raven et al., 2017): em testes de escolha entre um grupo de irmãos ou um compartimento vazio, os girinos-teste gastaram significativamente mais tempo próximo ao grupo de irmãos, enquanto que, quando submetidos à escolha entre não-irmãos ou um compartimento vazio, os girinos-teste apresentaram distribuição aleatória; no entanto, em um terceiro teste, os girinos falharam na discriminação entre irmãos e não- irmãos, apresentando distribuição aleatória ao serem submetidos à escolha entre os dois grupos. No Experimento 1 com Rhinella ornata, os girinos permaneceram consideravelmente mais tempo perto do compartimento do grupo de não-irmãos que do de irmãos, porém a diferença entre o tempo gasto próximo a um ou outro grupo pelo girino- teste não foi estatisticamente significativa, devido à grande variação dos dados (Figura 7), não caracterizando assim um padrão de escolha de associação por um ou outro grupo. Os resultados dos Experimentos 2 e 3 indicam que não houve discriminação entre os grupos de irmãos ou não-irmãos pelos girinos dessa espécie. Apesar do comportamento de reconhecimento de irmãos entre girinos estar presente em diversas espécies de bufonídeos (e.g., Waldman, 1981, 1982; O’Hara e Blaustein, 1982; Saidapur & Girish, 2000; Gramapurohit et al., 2006; Eluvathingal et al., 2009), as espécies do gênero Rhinella, mesmo compartilhando características ecológicas e morfológicas com espécies de outros gêneros da família, aparentemente não apresentam a habilidade de discriminação de parentes (Raven et al., 2017; presente estudo). Em girinos de outras famílias de anuros a presença desse comportamento também é variável, até mesmo dentro de um mesmo gênero, como é o caso de Lithobates, da família Ranidae (Waldman, 1984; Fishwild et al., 1990;) e de Spea, da família Scaphiopodidae (Pfening, 1990; Hall et al. 1995). 32

No Experimento 5, os girinos de R. icterica demonstraram uma forte atração por coespecíficos não-familiares. Esse resultado sugere que esses girinos possuem a capacidade de discriminação entre coespecíficos e heteroespecíficos. Com o Experimento 6, pudemos concluir que esse comportamento de discriminação é inato, pois girinos criados em isolamento, desde a fase embrionária, também demonstraram preferência de associação espacial com coespecíficos. O Experimento 7 demonstrou que essa preferência é resultado de atração por coespecíficos, em vez de repulsão por heteroespecíficos, porque os girinos- teste apresentaram distribuição aleatória quando submetidos à escolha entre heteroespecíficos e um compartimento vazio. O reconhecimento de coespecíficos por girinos de R. icterica está, portanto, baseado em fatores genéticos e pode ser importante, se essa habilidade permanecer na fase adulta, para evitar cruzamentos interespecíficos com indivíduos de R. ornata e consequente hibridações, que resultam em proles inviáveis (Haddad et al., 1990). Em testes de escolha entre um grupo de não-irmãos e um compartimento vazio, os girinos de R. marina não demonstraram atração por coespecíficos quando esses não eram seus irmãos (Raven et al., 2017). No entanto, os girinos dessa espécie diminuem a atividade e evitam os sinais químicos de coespecíficos injuriados, caracterizando um processo de reconhecimento e discriminação, porém isso não leva à agregação, que é formada em resposta a fatores ambientais, como luz, temperatura e complexidade estrutural do hábitat (Hagman & Shine, 2008; Raven et al. 2017). Há diferentes reações a sinais de coespecíficos injuriados em girinos de outras espécies de bufonídeos: Anaxyrus boreas também apresentam repulsão a esses sinais, porém com aumento de atividade (Hews & Blaustein, 1985), enquanto Sclerophrys danielae responde a esses sinais com a formação de agregações (Spieler & Linsenmair, 1999). Sontag e colaboradores (2006) demonstraram que girinos de Anaxyrus americanus reconhecem sinais de coespecíficos para encontrar fontes de alimento e até mesmo para discriminar a qualidade do alimento. Similarmente, girinos de R. marina apresentam uma atração mais forte por sinais de coespecíficos que estão se alimentando que por sinais provindos diretamente do alimento (Raven et al., 2017). O mecanismo de reconhecimento de coespecíficos pode ser usado em contextos de canibalismo. Crossland e Shine (2011) constataram que girinos de R. marina são atraídos por sinais químicos de ovos de coespecíficos e se alimentam destes. Este comportamento não é 33

consequência de um forrageamento indiscriminado, pois esses girinos raramente se alimentam de ovos de outras espécies presentes no mesmo ambiente (Crossland & Shine, 2010). Esse tipo de canibalismo pode fornecer uma importante fonte de nutrição aos girinos e reduzir a futura competição entre girinos da mesma espécie (Crossland et al., 2011). Além disso, ao encontrar ovos de coespecíficos, os girinos de R. marina podem liberar substâncias químicas que suprimem o desenvolvimento dos embriões (Crossland & Shine, 2012; Clarke et al., 2015). Crossland e colaboradores (2012) demonstraram que as substâncias envolvidas no processo de atração de girinos de R. marina por ovos de coespecíficos são as toxinas usadas na defesa contra predadores, conhecidas como bufadienolídeos. Desse modo, é possível que essas substâncias estejam envolvidas no reconhecimento de coespecíficos em R. icterica e em outros bufonídeos. Esses exemplos de comportamentos baseados em reconhecimento de sinais de coespecíficos em espécies geneticamente aparentadas a R. icterica sugerem que o reconhecimento de coespecíficos nessa espécie pode estar relacionado a comportamentos semelhantes. Em relação ao reconhecimento de coespecíficos, constatamos uma diferença notável entre os girinos de R. icterica e de R. ornata. No Experimento 5, os girinos de R. ornata não demonstraram preferência por nenhum dos grupos, formados por coespecíficos ou heteroespecíficos, indicando que o reconhecimento de coespecíficos pode não ocorrer. Infelizmente, cometemos um erro na execução do Experimento 6 para essa espécie, e a análise dos dados não foi possível; desse modo, não pudemos determinar se o regime em isolamento influenciaria a escolha dos girinos. No Experimento 7, os girinos de R. ornata gastaram mais tempo perto de heteroespecíficos que do compartimento vazio da arena. Esses resultados sugerem que os girinos de R. ornata não discriminam entre coespecíficos e heteroespecíficos, mas preferem associar-se com girinos de outra espécie a ficarem isolados. No Experimento 7 para as duas espécies, a atração espacial de girinos de R. ornata pelos grupos de girinos de R. icterica, e também a não-repulsão dos girinos de R. icterica aos grupos de girinos de R. ornata, sugerem que a interação espacial entre esses girinos em ambiente natural não envolve grandes custos de competição. Girinos de duas espécies de bufonídeos, Anaxyrus americanus e A. boreas, quando criados somente entre irmãos, apresentam comportamento de discriminação entre irmãos e 34

não-irmãos, ao passo que, quando criados com irmãos e não-irmãos, os girinos falharam na discriminação (Waldman, 1981; O’Hara & Blaustein, 1982). No entanto, nos Experimentos 1, 2 e 3 do presente estudo, independentemente dos diferentes regimes de criação dos girinos testados, os resultados foram semelhantes, tanto para R. icterica como para R. ornata, indicando que, nessas espécies, a experiência social prévia não influencia a posterior escolha de associação a grupos de girinos mais ou menos aparentados. No Experimento 4, os resultados também foram semelhantes entre as duas espécies: os girinos-teste apresentaram distribuição aleatória, indicando que a familiaridade não é um fator importante na escolha de associação espacial entre dois grupos de irmãos por esses girinos. A ausência de discriminação de parentes e de familiares pelos girinos de R. ornata sugerem que fatores sociais são menos importantes que fatores ambientais no comportamento de agregação apresentado por essa espécie. Os girinos de R. icterica também falharam na discriminação de parentes, mas demonstraram uma maior afinidade espacial por coespecíficos a heteroespecíficos, indicando que podem usar essa habilidade de reconhecimento para associar-se com girinos da mesma espécie, enquanto girinos de R. ornata devem agregar-se indiscriminadamente. Uma possível explicação para a falha no reconhecimento de parentes e o sucesso no reconhecimento de coespecíficos em girinos de R. icterica seria que, em populações com baixa diversidade genética, os mecanismos de reconhecimento são prejudicados, devido à ausência de uma variação significativa entre os alelos usados no reconhecimento (Nevison et al. 2000; Tsutsui et al. 2000, 2003). Contudo, estudos moleculares sobre a diversidade genética dessa população serão necessários para elucidar essa hipótese. Alguns autores tentam explicar a ausência de discriminação entre irmãos por girinos em condições laboratoriais como uma consequência da falta de estímulos para que reproduzam o comportamento de agregação (Blaustein et al., 1993). A formação de agregação, com parentes ou não, pode ser dependente do balanço entre os custos e benefícios desse comportamento (Hamilton, 1964). Tanto os processos de reconhecimento como a formação de agregações podem variar dentro de uma mesma espécie dependendo de alguns fatores, como a presença e a densidade de predadores (Wrona & Dixon, 1991; Fitzgeral, 1992; Watt et al. 1997), a diferença entre as dietas dos girinos (Gamboa et al., 1990; Pfenning, 1990), o estágio de desenvolvimento (Blaustein & O’Hara, 1986; Rautio et al., 1991; Blaustein et al., 1993; Nicieza et al,. 1999), a distribuição de recursos e a variação 35

de temperatura (Hokit & Blaustein, 1997). Girinos de Lithobates sylvaticus, por exemplo, apresentaram reconhecimento e atração por parentes em experimentos de laboratório, mas, em ambiente natural, demonstraram tanto atração como repulsão a parentes, em diferentes lagoas (Waldman, 1984; Halverson et al., 2006). Neste estudo, ao optar pelos testes em laboratório, buscamos evitar grande parte dessas variáveis, que poderiam influenciar os resultados. Assim, nossos resultados indicam a presença ou a ausência da habilidade de reconhecer irmãos e coespecíficos nos girinos de R. icterica e R. ornata. No entanto, a função ecológica e adaptativa desses mecanismos de reconhecimento para cada espécie do estudo poderá ser interpretada com um grau maior de confiança quando houver um conhecimento maior sobre a ecologia de cada espécie, e o presente estudo proporcionará bases para o estudo do comportamento social dos girinos dessas espécies. Os resultados deste trabalho corroboram a grande variação da presença de comportamentos de reconhecimento e discriminação analisada em diversos táxons. As diferenças relacionadas a esses comportamentos observadas neste estudo entre duas espécies estreitamente relacionadas, ecológica e geneticamente, indica que não pode haver generalizações quanto à presença e à expressão desses comportamentos em larvas de anuros.

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REFERÊNCIAS

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