Cc By-Nc-Nd 2.0)

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FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) UNIVERSITÉ CLAUDE BERNARD - LYON 1 FACULTÉ DE MÉDECINE LYON EST Année 2017 - N° 139

IMPACT DE LA TRANSPLANTATION PANCRÉATICO DUODÉNALE SUR LE MÉTABOLISME DES ACIDES BILIAIRES ET DES INCRÉTINES ÉTUDE ITABI

THÈSE

Présentée à l'université Claude Bernard - Lyon 1 Et soutenue publiquement le 15 septembre 2017 Pour obtenir le grade de Docteur en Médecine

Par Coralie FOURNIE Née le 9 juin 1988 à Lyon

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0)

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) UNIVERSITÉ CLAUDE BERNARD - LYON 1 FACULTÉ DE MÉDECINE LYON EST Année 2017 - N° 139

IMPACT DE LA TRANSPLANTATION PANCRÉATICO DUODÉNALE SUR LE MÉTABOLISME DES ACIDES BILIAIRES ET DES INCRÉTINES ÉTUDE ITABI

THÈSE

Présentée à l'université Claude Bernard - Lyon 1 Et soutenue publiquement le 15 septembre 2017 Pour obtenir le grade de Docteur en Médecine

Par Coralie FOURNIE Née le 9 juin 1988 à Lyon

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0)

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) REMERCIEMENTS

À NOTRE PRÉSIDENT DE THÈSE :

Monsieur le Professeur E. MORELON,

Pour avoir accepté la présidence de ce travail. Nous avons eu la chance de croiser tôt son chemin et celui de la néphrologie et le remercions très sincèrement pour l’écoute permanente qu’il a su nous accorder au cours de ces huit dernières années. Nous avons eu le privilège de bénéficier à plusieurs reprises de la qualité de son enseignement, et nous continuerons à nous inspirer de sa présence et de ses grandes compétences cliniques pour devenir meilleure néphrologue.

Qu’il soit assuré de notre profond respect.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0)

À NOS JUGES :

Monsieur le Professeur L. BADET,

Pour nous avoir fait l’honneur de s’intéresser à ce travail. Nous savons l’intérêt qu’il porte à l’échange quotidien entre exercice médical et chirurgical en transplantation et espérons avoir respecté les mêmes principes que lui et son équipe. Qu’il trouve ici le témoignage de notre reconnaissance.

Monsieur le Professeur O. THAUNAT,

Pour avoir accepté de juger ce travail. Nous avons été honorée d’avoir pu apprendre et pratiquer sous ses conseils avisés au cours de notre internat. Nous avons apprécié sa rigueur et son haut niveau d’exigence. Nous sollicitons son indulgence et l’assurons de notre grande estime.

Madame le Professeur F. GUEBRE-EGZIABHER (Directrice de thèse),

Pour son exceptionnel encadrement de notre travail de mémoire puis de thèse. Son art de l’enseignement et sa bienveillance nous ont permis d’apprendre la rigueur scientifique de la recherche clinique et de la rédaction d’articles. Son désir de transmission, de partage, nous a fait progresser en confiance. Qu’elle soit assurée de notre gratitude et surtout de notre profonde admiration.

Madame le Docteur S. LEMOINE (Maître de Conférence des Universités),

Pour avoir accepté de juger ce travail et avoir participé au recrutement de nos patients. Nous avons pu bénéficier lors de notre passage au pavillon P de son implication dans la formation des internes et de ses qualités organisationnelles, dans la bonne humeur permanente.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) À MA FAMILLE :

À mon mari, pour notre voyage.

À ma mère, pour son amour et son soutien précieux.

À mon père, pour sa tendresse. J’essaierai d’être un aussi bon docteur Fournie que lui.

À ma sœur, pour rester proche malgré la distance et toujours me faire rire.

Au premier docteur Guy Fournie et à ma grand-mère Jacqueline Fournie, qui m’inspire par sa volonté et sa force. Nos échanges restent des moments privilégiés.

À mes grands-parents Jacques et André Arlin, pour leurs sourires, leur amour de la nature et de la table. Mon Papili tu me manques tant.

À ma tante Bénédicte, à ma petite cousine Agathe (mio pulcino), la branche italienne de la famille.

À ma tante et mon oncle, Sylvère et Hervé

À mes cousins Sarène, Lyonel, Gaël, Vianney

À ma marraine Sophie

À mon parrain Régis et ma parraine Martine

À ma belle-famille

À mon petit chien Giotto

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) À MES COLLÈGUES :

À toute l’équipe de transplantation de P2, A tous les médecins, pour m’avoir encadrée et accompagnée, et plus particulièrement à Fanny et à Cécile pour leur bonté et leurs rires, et au docteur Cahen pour son temps et son expérience. A toutes les infirmières (et l’infirmier) et à l’équipe aide-soignante pour leur accueil et leur amitié.

À toute l’équipe médicale et paramédicale de néphrologie de P1, Notamment à monsieur le professeur Juillard pour sa bienveillance, au Dr Jolivot pour sa bonne humeur et ses conseils et au Dr Sens pour son aide précieuse en biostatistiques.

À mes amis néphrologues du Tonkin, Aux docteurs Solenne Linca, Marine Panaye, Alexandre Karamé, François Combarnous, Jérôme Finaz-de-Villaine, pour leur bonté, leur gentillesse, leur pédagogie, les biopsies et leur confiance.

À mes amis néphrologues du Centre du Rein Artificiel de Tassin-Charcot, Christie Lorriaux, Manolie Mehdi, Jean-Marc Hurot, Brice Mayor, Guillaume Jean, Patrik Deleaval, Charles Chazot, pour leur riche formation sur l’épuration extrarénale, les cathéters, les congrès, les posters, leur accueil, leur humanité et leur confiance.

À l’équipe de néphrologie de Lyon-Sud, Notamment à ma première assistante Amélie pour le début de ma formation, au docteur Trolliet pour la transmission de son savoir, au docteur Pelletier pour l’encadrement de mon mémoire.

À mes co-internes, À Flora, Gabrielle, Anne, pour partager le meilleur et supporter le pire. A Pascaline, Eric et Thomas, même si vous avez été mes assistants, Nans, Cécile, Lucien, Marion, François, Arthur, Jean-Pierre, pour m’avoir fait rire et accompagnée. A mes « petits » préférés Maxime X3, Elodie, Xiao fan.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) À ma famille carabine : Aline, Antoine F, Antoine V, Aurélie, Axelle, Bruno, Caroline, Fanny, Kristina, Laura, Louis, Marion, Pierre, Razvan, Sophie, Vincent ; À ma proche belle-famille carabine : Alice, Allyriane, Benjamin, Blandine, Gautier, Killien, Marine, Mélissa, et aux enfants de la communauté : Juliette, Eliott, Malo, Arsène… Pour les 12 ans de survie commune et de partages.

À mes amis de et pour toujours : Camille E, Marie D et Marie-Laure, Clément, Maud, Camille et François (et Salomé), Marie F, Adélaïde, Pauline, Virginie, Aude. Pour leur présence et leurs encouragements.

À Anna san et Akio sensei

Ces remerciements s’étendent à toutes les personnes qui me font l’amitié d’assister à la soutenance de cette thèse.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) TABLE DES ABRÉVIATIONS AB Acides biliaires AC Acide cholique ACDC Acide chénodéoxycholique ADC Acide déoxycholique ALC Acide lithocholique ASBT Apical Sodium Bile Acid Transporter AUC Area Under the Curve AUDC Acide ursodéoxycholique BMI Body Mass Index BSEP Bile Salt Export Pump CKD-EPI Chronic Kidney Disease - Epidemiology Collaboration CRNH Centre de Recherche en Nutrition Humaine CRP C Reactive Protein CYP27A1 Stérol 27-hydroxylase CYP7A1 Cholesterol 7α-hydroxylase CYP7B1 Oxysterol 7α-hydroxylase CYP8B1 Stérol 12α-hydroxylase DPP4 Dipeptidyl Peptidase 4 DT2 Diabète de Type 2 FGF 19 Fibroblast Growth Factor 19 FGFR4 FGF Receptor 4 FXR Farnesoid X Receptor GLP-1 Glucagon Like Peptide-1 GLUT Glucose Transporter HbA1c Hémoglobine glyquée HGPO HyperGlycémie Provoquée par voie Orale HOMA-IR Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance HSD 3β 3 -Hydroxy-D5-C27-steroid dehydroxylase IGI Indice Insulinogénique IMC Indiceβ de Masse Corporelle IPTR International Pancreas Transplant Registry IRS Insulin Receptor Substrate KT Kidney Transplantation MAPK-ERK Mitogen-activated protein kinase/Extracellular signal-regulated kinase MMF Mycophenolate mofetyl NTCP Na+ dependent taurocholate transporter OGTT Oral Glucose Tolerance Test PKB Protein kinase B PI3K Phosphatidyl Inositol 3 Kinase PIP3 Phosphatidyl Inositol 3 Phosphate QUICKI Quantitative Insulin Sensitivity Check Index SHP Small heterodimer partner SPKT Simultaneous Pancreas Kidney Transplantation T1D Type 1 Diabetes T2DM Type 2 Diabetes Mellitus TGR5 Takeda-G-protein-receptor-5

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) TABLE DES MATIÈRES

INTRODUCTION 14

REVUE DE LA LITTÉRATURE 16

I. TRANSPLANTATION PANCRÉATIQUE 16 I. 1. INDICATION 16 I. 2. MODALITÉS CHIRURGICALES 16 I. 3. SUIVI 18

II. RÉGULATION DE L'HOMÉOSTASIE DU GLUCOSE 20 II. 1. INSULINE 20 II. 1. 1. INSULINOSECRETION 20 II. 1. 2. INSULINO-RESISTANCE 21 II. 1. 3. INSULINORESISTANCE ET TRANSPLANTATION PANCREATIQUE 22 II. 2. GLUCAGON 25

III. ACIDES BILIAIRES : ROLE SIGNALÉTIQUE 26 III. 1. MÉTABOLISME 26 III. 1. 1. SYNTHESE 26 III. 1. 2. CYCLE ENTERO-HEPATIQUE 28 III. 2. ROLE SIGNALÉTIQUE ET INTERACTION AVEC LE MICROBIOTE INTESTINAL 31

IV. RÉGULATEURS DU GLUCOSE ET ACIDES BILIAIRES 34 IV. 1. VOIE DE RÉGULATION TGR5/GLP-1 34 IV. 1. 1. TGR5 34 IV. 1. 2. GLP-1 : EFFET INCRETINE 35 IV. 2. VOIE DE RÉGULATION FXR/FGF 19 37 IV. 2. 1. FXR 37 IV. 2. 2. FGF 19 39

IMPACT OF PANCREAS TRANSPLANTATION ON BILE ACIDS AND GLUCOSE METABOLISM41

TABLES ET FIGURES 57

CONCLUSIONS 66

RÉFÈRENCES 69

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) INTRODUCTION

La transplantation rénale est la transplantation d’organe vascularisé la plus fréquente en France. Non vitale, elle représente cependant le traitement à privilégier pour les patients présentant une insuffisance rénale chronique terminale. Parmi ces patients, ceux atteints d’un diabète de type I peuvent bénéficier d’une transplantation combinée rein- pancréas. Celle-ci permet de diminuer le risque de complications aiguës et chroniques notamment cardiovasculaires liées au diabète (1), d’améliorer la survie globale des patients et leur qualité de vie grâce à la restauration d’une insulinosécrétion (2,3).

Cependant, des perturbations de la fonction sécrétrice bêta-pancréatique, ainsi que de l’action de l’insuline semblent persister après transplantation (4–6). L’hyperglycémie provoquée par voie orale (HGPO) est utilisée en pratique courante dans le suivi des patients pour dépister ces perturbations et diagnostiquer une diminution de la tolérance au glucose, voire une réapparition du diabète. Les mesures concomitantes de glycémies, insulinémies et peptide C permettent de dériver des index d’insulinosécrétion et d’insulinosensibilité fiables (7–9).

Les mécanismes associés à la présence d’anomalies du métabolisme du glucose après transplantation rein-pancréas ne sont pas clairement définis. Les études antérieures ont montré chez ces patients une diminution de l'utilisation du glucose : il existe un défaut de stockage du glucose sous forme de glycogène (10) et de son utilisation périphérique par le muscle (11), couplée à une inhibition de la signalisation au niveau du récepteur de l'insuline dans le muscle (12). Il existerait également une diminution de la fonction bêta- pancréatique et de la sensibilité à l'insuline (13). Ces phénomènes sont probablement reliés à différents facteurs comme la prise de poids post transplantation, les traitements immunosuppresseurs (corticoïdes)(5), l'inflammation, la neuropathie digestive qui ralentit le transit et l'absorption de glucose (11), ainsi que la technique chirurgicale de transplantation. Des études antérieures ont permis de montrer que l’anastomose vasculaire (drainage systémique ou portal) a très peu d’influence mis à part une hyperinsulinémie probablement liée à un défaut de clairance de l’insuline du fait de l’absence du premier passage hépatique pour le drainage systémique (14).

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0)

Concernant le pancréas exocrine, la technique actuelle de transplantation la plus utilisée est une transplantation hétérotopique pancréatico-duodénale avec anastomose ectopique (iléale) du moignon duodénal prélevé avec le pancréas du donneur (15). Ce montage chirurgical pourrait modifier les propriétés physico chimiques du liquide digestif, et donc modifier le métabolisme des acides biliaires, la flore intestinale et la perméabilité digestive. Les acides biliaires offrent ainsi une nouvelle cible d’intérêt. Il a été récemment établi qu’en plus de leur rôle dans l’absorption des lipides, ces acides biliaires sont de véritables molécules de signalisation influençant le métabolisme du glucose (16) en agissant sur des récepteurs spécifiques FXR et TGR5 pouvant ainsi moduler la sécrétion de deux hormones : Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) et Fibroblast Growth factor 19 (FGF19) qui ont un rôle dans le métabolisme énergétique et glucidique.

Il nous a donc semblé intéressant d’étudier les effets de cette transplantation sur le métabolisme des acides biliaires, sur la sécrétion de molécules impliquées dans le métabolisme du glucose appelées incrétines, et enfin sur la flore intestinale.

Ce travail se compose en premier lieu d'une revue de littérature, puis d'une étude prospective monocentrique comparant 3 groupes de sujets : transplantés rein-pancréas, transplantés rénaux (permettant de s’affranchir d’un éventuel biais lié à l’immunosuppression), témoins sains sélectionnés parmi les candidats pour un don vivant. Seule une partie des résultats sera présentée dans cette thèse, qui sera complétée prochainement par les dosages de glucagon, GLP-1 et FGF19. L'objectif sera d'étudier si la transplantation de pancréas s’accompagne d’une anomalie qualitative et quantitative des acides biliaires et des incrétines, et si ces perturbations sont corrélées avec les mesures dérivées de l’HGPO.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) REVUE DE LA LITTÉRATURE

I. TRANSPLANTATION PANCRÉATIQUE

I. 1. INDICATION

Le diabète de type 1 est lié à une carence absolue en insuline par destruction auto- immune des cellules bêta-pancréatiques. Cette maladie aboutit à une situation d’hyperglycémie chronique, et concerne 200 000 personnes en France (17). L’incidence est de 7,8 par an pour 100 000 habitants, avec une augmentation de 4% par an. La prise en charge de cette maladie chronique vise à retarder et réduire la gravité des complications micro et macro-angiopathiques, et repose sur l’insulinothérapie substitutive, les règles hygiéno-diététiques et l’éducation thérapeutique. En alternative à l’injection sous-cutanée d’insuline quotidienne, la transplantation pancréatique et la greffe d’ilôts de Langerhans sont les seuls traitements permettant de restaurer des glycémies équilibrées (18). La transplantation pancréatique en association à la transplantation rénale est maintenant une thérapeutique de référence dans la prise en charge des patients souffrant de diabète de type 1 avec insuffisance rénale chronique terminale (19).

Depuis la première réalisée en 1966 (20), plus de 35000 transplantations pancréatiques ont été rapportées au registre international des transplantations pancréatiques (IPTR), dont trois quart de transplantations combinées rein-pancréas. Malgré la morbidité péri-opératoire et la nécessité d’une immunosuppression au long cours, la transplantation pancréatique permet une amélioration de la survie et de la qualité de vie des patients diabétiques (15). La restauration de la sécrétion d'insuline permet un contrôle glycémique satisfaisant à long terme (10-20 ans)(3,21).

I. 2. MODALITÉS CHIRURGICALES

La technique de transplantation pancréatique la plus utilisée actuellement est une transplantation hétérotopique pancréatico-duodénale ("pancréas total") avec déversion intestinale du suc pancréatique (15). Le pancréas est prélevé avec un moignon du

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) duodénum du donneur qui est anastomosé à l'iléon du receveur au-dessus de la valvule iléo-cæcale, en position intra péritonéale. L'ensemble des sécrétions exocrines est donc drainé dans l'iléon. L’artère mésentérique supérieure et l’artère splénique sont implantées sur un greffon artériel iliaque en Y provenant du même donneur, lui-même ensuite implanté sur l’artère iliaque commune ou sur l’artère iliaque externe du receveur. Le drainage veineux du greffon est systémique : la veine porte du greffon est implantée dans la veine cave ou iliaque du patient receveur (figure 1). A noter qu'il existe une alternative d'anastomose portale (implantation sur la veine mésentérique supérieure du patient receveur) soumettant alors les sécrétions endocrines du pancréas à un premier passage hépatique.

Figure 1. Transplantation pancréatique et anastomoses d'après MAYO foundation for education and research (22)

La transplantation de pancréas total avec drainage entérique et anastomoses vasculaires systémiques est la technique chirurgicale actuellement utilisée à Lyon dans le département de transplantation de l’hôpital Edouard Herriot, majoritairement couplée à la transplantation rénale (figure 2).

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0)

Figure 2. Transplantation combinée rein-pancréas d'après Gruessner et Sutherland (23)

I. 3. SUIVI

La surveillance du pancréas transplanté est limitée. La biopsie du greffon pancréatique est difficile en raison de la position anatomique de l’organe et ne peut donc pas être utilisée en routine. La biopsie du greffon rénal transplanté de façon concomitante au greffon pancréatique pourrait être un marqueur de la présence ou non d’un rejet mais les études sur les biopsies des deux organes retrouvent une discordance dans plus de 30% des cas (24). L’augmentation de la lipasémie est un marqueur peu spécifique d’une souffrance du greffon pancréatique. L’hémoglobine glyquée (HbA1c) est un marqueur trop tardif d’une altération de la fonction endocrine du pancréas (25,26). Actuellement la mesure de la tolérance au glucose en utilisant l’HGPO permet d'évaluer en routine la fonction pancréatique après transplantation. L’administration de 75 g de

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) glucose per os est suivie des dosages plasmatiques de la glycémie, insulinémie et peptide-c à T0, T30, T60, T90, T120, T240 minutes.

Avant transplantation, une glycémie sanguine à jeun et 2 h après la charge de glucose suffit pour faire le diagnostic de diabète de type 2 (glycémie à jeun ≥ 7 et ≥ 11,1 mmol/L à 2 heures) et d'intolérance au glucose (≥ 6,1 à jeun et ≥ 7.8 mmol/l à 2 heures) (27). Après transplantation, le seuil définissant l’HGPO comme perturbée proposé par les études de Pfeffer et al et Mittal et al correspond à une glycémie veineuse à 120 minutes entre 7,8 et 11,1 mmol/L (28,29). Ces seuils correspondent à ceux définis par les critères de l'American Diabetes Association en 2010 (30).

Les études de suivi à long terme montrent que la glycémie lors d’une HGPO se détériore au cours du temps après une transplantation rein-pancréas, même si la sécrétion d'insuline au cours de l'HGPO peut rester stable. La sécrétion de glucagon augmente de manière significative. La tolérance au glucose par voie orale semble être un marqueur plus sensible de la dysfonction du greffon que la glycémie à jeun, même si une détérioration de ce test ne se traduit pas de façon obligatoire par la perte du greffon (2). Cependant une HGPO normale à 1 an (T120) après la transplantation du pancréas est un facteur prédictif de la survie du greffon au moins jusqu'à 4 ans post-transplantation (25,31).

Bien que les résultats de cette transplantation soient très encourageants des anomalies dans l'action de l'insuline et des altérations dans la fonction des cellules bêta persistent après la transplantation, même en l'absence de rejet (4–6,32).

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) II. RÉGULATION DE L'HOMÉOSTASIE DU GLUCOSE

II. 1. INSULINE

L’insuline est une hormone hypoglycémiante synthétisée par les cellules bêta du pancréas, dont la principale fonction est de contrôler l’homéostasie énergétique dans l’organisme. L’insuline agit sur les tissus hépatiques, musculaires et adipeux par le biais de multiples voies de signalisation.

II. 1. 1. Insulinosécrétion

A jeun, le glucose systémique est issu de la libération de glucose par le foie et les reins via la glycogénolyse et la néoglucogenèse (2–4,7,33). Après le repas, l'absorption des glucides ingérés contribue également à la concentration de glucose systémique. Afin d’éviter une hyperglycémie post prandiale, le pancréas augmente sa sécrétion d’insuline qui inhibe la production hépatique de glucose et stimule l’utilisation du glucose par les tissus périphériques (muscle squelettique et tissu adipeux). L'insuline est également sécrétée en continu par le pancréas pour permettre un transfert intracellulaire de glucose, constituant un substrat énergétique indispensable au fonctionnement cellulaire. L’équilibre de ce système permet de maintenir la glycémie aux alentours de 5 mmol/l.

Au niveau moléculaire, l’insuline se lie à son récepteur au niveau de la membrane cellulaire entraînant la phosphorylation en résidus tyrosine des substrats du récepteur de l’insuline IRS-1 et IRS-2 (Insulin receptor substrate). Cette phosphorylation permet le recrutement de la sous-unité régulatrice p85 de l’enzyme phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) associée avec sa sous-unité catalytique p110 qui devient ensuite activée. Le produit de cet enzyme, le phosphatidylinositol 3-phosphate (PIP3), recrute et active la kinase PKB/Akt. Dans le foie, l'insuline permet par cette voie d'inhiber la production de glucose (glycogénolyse et la néoglucogenèse) et de stimuler au contraire le stockage de glucose par la glycogénogénèse et la lipogenèse. Dans les tissus musculaires et adipeux, la phosphorylation d'Akt permet le recrutement du transporteur 4 du glucose (GLUT 4) vers la membrane cellulaire facilitant ainsi le transport du glucose qui une fois dans les cellules sert de substrat énergétique pour la

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) phosphorylation oxydative (production d’énergie: glycolyse) mais peut également être stocké sous forme de glycogène (figure 3).

PI3K

Figure 3. Voies de signalisation de l’insuline au niveau des tissus périphériques (muscle squelettique), d'après Koppe et al. (34)

IRS : insulin receptor substrate, IRS-1,2 : insulin receptor substrate-1 ou 2, PI3K : phosphatidyl inositol 3 phosphate, PKB/AKT : protéine kinase B, GLUT-4 : glucose transporter 4

II. 1. 2. Insulino-résistance

Les mécanismes qui interfèrent avec les processus décrits plus haut provoquent une insulino-résistance. Celle-ci se définit comme une diminution de la réponse des tissus périphériques cibles à l’action de l’insuline. L'insulino-résistance et l’hyperglycémie qui en découle sont associées à une augmentation significative du risque de maladies cardiovasculaires liées à l'athérosclérose (35,36). L'insulino-résistance est une composante majeure de la plupart des maladies métaboliques comme l’obésité, le diabète de type 2 et les maladies cardio-vasculaires. Elle peut être observée dans les états physiologiques tels que la grossesse et la puberté (27). Si cette situation est majoritaire chez les patients diabétiques de type 2, les diabétiques de type 1 présentent

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) également une insulino-résistance, dont les causes ne sont pas actuellement clairement identifiées (37).

La technique de référence pour mesurer la sensibilité à l'insuline est le clamp euglycémique hyperinsulinémique mais cette technique lourde ne peut être réalisée en routine. Des outils plus simples à utiliser ont été développés comme le test de tolérance orale au glucose : HGPO. Les mesures supplémentaires d'insulinémie et de glycémie toutes les 30 min après une charge orale en glucose peuvent permettre d'affiner l'estimation de la sensibilité à l'insuline et / ou de l'insulinosécrétion. Ces résultats sont fortement corrélés avec ceux du gold standard (9).

Des indices d’insulino-résistance et insulino sensibilité utilisant la glycémie et l'insulinémie à jeun ont également été développés. Ces paramètres sont simples d’utilisation et corrélés positivement avec les maladies cardio-vasculaires sur de larges cohortes. Les deux plus utilisés sont les index HOMA (8) et QUICKI. L’indice d’insulinosécrétion le plus simple à utiliser en routine est l’indice insulinogénique (IGI) mais le plus utilisé est l’indice de Matsuda proposé par l’équipe de De Fronzo (9).

II. 1. 3. Insulinorésistance et transplantation pancréatique

La transplantation pancréatique permet d'améliorer l’insulino-résistance associée à la maladie diabétique de type 1 mais ne permet pas de la normaliser (21). De nombreuses études mettent en évidence que les patients ayant une transplantation combinée rein–pancréas ont une glycémie à jeun normale, mais présentent une hyperinsulinémie et une intolérance au glucose (3,21).

Si dans la population diabétique cette hyperinsulinémie est délétère. Il n'existe cependant que peu de preuves qui permettent de suggérer que l'hyperinsulinémie post- transplantation rein-pancréas a un tel effet. Elle pourrait être une conséquence directe de l'insulino-résistance. Plusieurs études (6,21) utilisant des techniques de clamp euglycémique-hyperinsulinémique ont mis en évidence une utilisation périphérique de glucose réduite en réponse à une perfusion de dose supra physiologique d'insuline par

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) rapport à des témoins et des patients transplantés rénaux ayant la même immunosuppression.

Bien que plusieurs indices dérivés de l'HGPO soient actuellement disponibles et fournissent des informations importantes sur l'insulino-résistance, l'absence de valeurs de gamme de référence en transplantation de ces indices limite leur utilisation en pratique clinique. Il y a actuellement très peu de données disponibles chez les patients greffés rein-pancréas. L’index de Matsuda, l’HOMA-IR et le QUICKI peuvent être utilisés pour évaluer l'insulino-résistance chez ces patients (38,39). Réalisés deux ans après la transplantation, ils sont des marqueurs performants dans le diagnostic de dysfonction du greffon à moyen terme (25). Notamment une étude récente menée sur 156 patients par Pendón-Ruiz de Mier et al (2015) montrait une moins bonne survie chez les patients insulino-resistants avec score HOMA-IR > 4 (40). Les autres index n'ont jamais été évalués à notre connaissance chez les patients transplantés rein-pancréas.

Dans la littérature se dégagent plusieurs hypothèses sur les causes de cette altération de régulation du métabolisme glucidique chez le patient transplanté pancréatique :

1. Le pancréas transplanté est relié directement à la circulation systémique sans premier passage portal ce qui pourrait modifier le rapport entre les concentrations d'insuline portale et périphérique, et conduire à une hyperinsulinémie périphérique. Par ailleurs il n'y a pas de premier passage hépatique qui détruit une partie de l'insuline circulante (5,11). Cependant les études comparant des clamps euglycémiques hyperinsulinémiques chez des patients transplantés rein-pancréas ayant un drainage systémique ou portal n'ont jamais mis en évidence de différence significative sur l'insulino-résistance (14).

2. L'immunosuppression, surtout les corticoïdes et les anti-calcineurines, utilisée après la transplantation pourrait entretenir cette insulino-résistance (11). Mais d’autres études montrent que les immunosuppresseurs ne semblent pas jouer un rôle majeur dans ce trouble de métabolisme du glucose (5).

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) 3. La persistance d'une neuropathie digestive (gastroparésie) peut retarder l'absorption de repas et ainsi faire persister le modèle du métabolisme du glucose post-prandial chez les diabétiques, même après transplantation de pancréas (11).

4. Il persisterait une dysfonction de la voie de signalisation de l'insuline. Plusieurs études mettent en évidence une persistance des anomalies du récepteur à l'insuline, persistance de phosphorylation inhibitrice d'IRS-1 (12), un niveau réduit de GLUT 4. Ainsi Boden et al montrent une diminution de l’expression et du nombre des récepteurs à l'insuline et une résistance à l'action anti lipolytique de l'insuline chez les patients ayant reçu une transplantation rein-pancréas (41).

5. Plusieurs études (6,11,21) montrent que si l'oxydation du glucose lors d'une transplantation rein-pancréas est normale, il existe un défaut de l'utilisation non oxydative du glucose , c'est à dire la capacité à stocker le glucose sous forme de glycogène. Cependant ce défaut de glycogénogénèse ne peut être expliqué par une activation réduite de l'enzyme "glycogène synthase" dans le muscle squelettique car il n'y a pas de différence entre l'activité totale de l'hexokinase dans le muscle de sujets ayant reçu une transplantation rein- pancréas par rapport aux sujets ayant reçu une transplantation rénale seule (11,42).

6. Certaines études émettent l'hypothèse d'une diminution de la masse des cellules β avec une perte de réactivité et de sécrétion d'insuline en réponse à une stimulation de glucose au cours de clamp hyperglycémique (13,42), (insulinopénie) mais cela est controversé car d'autres études montrent que la sécrétion du peptide-C est identique chez les patients ayant une transplantation rein-pancréas par rapport aux sujets ayant reçu une transplantation rénale seule (5). Cette diminution de la masse pancréatique pourrait être liée à plusieurs facteurs, dont les rejets, la récidive de la maladie initiale, les immunosuppresseurs, et la durée d'ischémie froide.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) II. 2. GLUCAGON

Le glucagon est également une hormone sécrétée par le pancréas et a une action inverse de l'insuline en augmentant la glycémie.

La perte de la capacité à inhiber la sécrétion de glucagon (42) au cours de la transplantation pancréatique pourrait entretenir l'insulinorésistance. Le glucagon est généralement éliminé par le foie (43), et contourner l'effet de ce premier passage du foie pourrait conduire à une hyperglucagonémie périphérique dans les transplantations de pancréas avec un drainage systémique. L'immunosuppression est également supposée provoquer une hyperglucagonémie, puisque des concentrations de glucagon similaires ont été retrouvées chez des patients ayant reçu une greffe de rein seul (44). L'hyperglucagonémie est un élément important dans la pathogenèse de diabète de type 2 et donc de l'insulino-résistance (45). Cependant il existe peu de données sur l'activité des cellules alpha du greffon pancréatique et sur le rôle réel de cette hyperglucagonémie dans l’entretien de l'insulino-résistance.

D'autres régulateurs du glucose existent, agissant via leur effet sur la sécrétion d'insuline comme le Glucagon-like peptide-1 (GLP-1), ou indépendants comme le Fibroblast growth factor 19 (FGF 19). Ces régulateurs détaillés ci-après sont tous les deux influencés par l'action des acides biliaires.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) III. ACIDES BILIAIRES : ROLE SIGNALÉTIQUE

III. 1. MÉTABOLISME

III. 1. 1. Synthèse

Les acides biliaires (AB) sont des dérivés du cholestérol synthétisés dans le foie. Ils sont ensuite conjugués pour former des sels biliaires chargés négativement, hydrophiles leur conférant une haute solubilité, ou hydrophobes avec hautes capacités détergentes (46). Le pool humain se compose des acides biliaires dits primaires : acide cholique (AC), acide chénodeoxycholique (ACDC) synthétisés dans le foie à partir du cholestérol grâce à deux voies moléculaires différentes ; et AB secondaires : acide déoxycholique (ADC), acide ursodéoxycholique (AUDC) et acide lithocholique (ALC), obtenus à partir des AB primaires grâce à l'activité enzymatique de bactéries présentes dans l'intestin. La synthèse des AB est ainsi dépendante de plusieurs réactions successives pouvant emprunter deux voies différentes : classique (ou neutre) et alternative (ou acide) résumés dans la figure 4a.

Ainsi chaque jour, 500 mg de cholestérol sont convertis en AB par le foie. Cette transformation provient de deux voies différentes : La voie classique qui produit 75% du pool total d'AB, et la voie alternative. AC et ACDC représentent les deux produits principaux issus de ces deux voies. Les étapes permettant la synthèse de ces AB primaires incluent des réactions d'hydroxylations et oxydations, où 3 enzymes jouent chacune un rôle déterminant. CYP7A1 (cholesterol 7α-hydroxylase) est l'enzyme limitant la quantité d'AB primaires produits via la voie classique, et donc détermine la taille du pool d'AB. CYP8B1 (stérol 12α-hydroxylase) oriente vers la génération d'AC plutôt que d'ACDC et détermine donc la composition de ce pool d'AB. CYP27A1 (stérol 27-hydroxylase) est la première enzyme de la voie alternative. Ces acides biliaires libres nouvellement synthétisés seront en majorité conjugués (98%) avec la glycine chez les humains, et la taurine chez les souris.

La production des acides biliaires secondaires nécessite ensuite une interaction forte entre acides biliaires et flore intestinale. Dans la lumière intestinale, les enzymes

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) bactériennes modifient les acides biliaires primaires par le biais de déconjugaisons, oxydations, déshydroxylations pour produire les AB secondaires : ADC, AUDC et ALC.

Une fois retransportés dans le foie, ces AB secondaires peuvent encore être transformés en AB tertiaires, dont la quantité est marginale. L'ensemble de ces voies métaboliques permet la production de plus de 18 AB différents. (47)

Figure 4a. Synthèse des acides biliaires primaires et secondaires : voie classique et alternative, d'après Li et Chiang (46). Abréviations : cholesterol 7 -hydroxylase (CYP7A1) ; 3 -hydroxysteroid dehydrogenase (HSD3B7) ; sterol 12 hydroxylase (CYP8B1) ; cholic acid (CA) ; chenodeoxycholic acid (CDCA) ; sterol 27-hydroxylase (CYP27A1) ; oxysterol 7 -hydroxylase (CYP7B1)α ; deoxycholic acidβ (DCA) ; lithocholic acid (LCA) ; -muricholic acid ( - MCA)α ; -muricholic acid ( -MCA) ; v-muricholic acid (v-MCA) ; tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) ; taurohyocholicα acid (THCA) ; taurohyodeoxycholic acid (THDCA) ; tauromurideoxycholicα acid (TMDCA). α β β

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) La première enzyme microsomale cholesterol 7 -hydroxylase (CYP7A1) convertit le cholestérol en 7 - hydroxycholesterol (48). La 3 -hydroxy-D5-C27-steroidα dehydroxylase (3 -HSD) convertit ce dernier en 7α- hydroxy-4-cholestene-3-one quiβ est le précurseur commun à la formation βdes deux acides biliaires primairesα AC et ACDC. Les enzymes sterol 12 -hydroxylase (CYP8B1) puis sterol 27-hydroxylase (CYP27A1) permettent la production d'AC. La premièreα régule le ratio AC/ACDC et la seconde la concentration générale d'acides biliaires produits. La voie alternative est minoritaire chez l'homme, mais cette répartition n'est pas égale selon les espèces (50% de la production chez les souris : la majorité d'ACDC produit est convertie en MCA). L'enzyme mitochondriale CYP27A1 catalyse l'hydroxylation du cholestérol en 27-hydroxycholesterol et acide 3 - hydroxy-5-cholestenoique, qui atteint sa forme dihydroxylée 3 ,7 -dihydroxy-5-cholestenoique après actionβ de l'oxysterol 7 -hydroxylase (CYP7B1). Ce dérivé d'oxysterolβ peutα également être produit dans les tissus périphériques oùα CYP7B1 est présente, puis transporté jusqu'au foie et converti majoritairement en ACDC.

III. 1. 2. Cycle entéro-hépatique

Une fois synthétisés, les acides biliaires sont stockés dans la vésicule biliaire et déversés via la bile dans l’intestin au cours du repas pour permettre l‘absorption de lipides. Ils sont ensuite réabsorbés et retournent vers le foie par la circulation portale. Il s’agit du cycle entéro-hépatique (Figure 4b).

L'existence d'un pool circulant régulé évite l'accumulation intracellulaire toxique d'AB, et assure le maintien des AB adéquats en concentration suffisante aux différents sites physiologiques requérant leur action : dans les canalicules biliaires pour la formation de bile, dans la vésicule pour éviter la cristallisation du cholestérol, dans la lumière intestinale pour l'absorption des graisses. Après un repas les concentrations des acides biliaires augmentent dans l'intestin et dans le foie mais également dans la circulation systémique ( (49).

de 5 μg/l à 15 μg/l)

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0)

Figure 4b. Cycle entéro-hépatique des acides biliaires, d'après Chiang et al (50).

Le bon fonctionnement de ce cycle répété plusieurs fois par jour requiert de nombreux transports d'AB dans le foie et l'intestin pour l'adaptation des flux plasmatiques et biliaires. L'ensemble de ces transferts implique des transports actifs transmembranaires, donc des transporteurs de haute affinité pour les acides biliaires (51). Les mouvements cellulaires des acides biliaires aux domaines membranaires basolatéraux et apicaux dans les hépatocytes et les entérocytes sont résumés dans la figure 4c.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0)

Figure 4c. Transports des acides biliaires dans les hépatocytes et les entérocytes, d'après Li et Chiang (46).

Abréviations : cholesterol 7 -hydroxylase (CYP7A1) ; Na+ dependent taurocholate transporter (NTCP) ; microsomal epoxide hydrolase (mEH) ; organic anion transporters (OATPs) ; bile salt export pump (BSEP) ; multidrug resistance–associatedα protein (MRP) ; ATP-binding cassette sub-family G (ABCG) ; multidrug- resistant protein (MDR2) ; organic solute transporters (OSTa, OST ) ; apical sodium bile acid transporter (ASBT) ; intestinal bile acid binding protein (IBABP) ; cytochrome P450 (CYP3A4/2B/2C) ; hyocholic acid (HCA) ; ursodeoxycholic acid (UDCA) β

Dans les hépatocytes, la captation des acides biliaires conjugués dans le sang portal à la membrane basolatérale est réalisé par un cotransporteur sodium-dépendant : le Na+ dependent taurocholate transporte (NTCP), probablement médiée par la microsomal epoxide hydrolase (mEH) (52,53). Les transporteurs d'anions organiques (OATPs) permettent la captation des acides biliaires non conjugués. Au niveau de la membrane canaliculaire, la sécrétion est majoritairement assurée par un transporteur ATP dépendant (bile salt export pump : BSEP)(54), et en partie par multidrug resistance–associated protein (MRP2). Les autres composants de la bile sont excrétés par ATP-binding cassette sub-family G 5 et 8 : ABCG5, ABCG8 (cholestérol) et multidrug-resistant protein MDR2 (phospholipides). Enfin les transporteurs de solutés organiques (organic solute transporters OSTα, OST ), MRP3 et MRP4 permettent la sécrétion des acides biliaires en excès dans la circulation sanguine pour leurβ élimination rénale.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) Les entérocytes captent les acides biliaires à partir de la bile déversée dans l'iléon via ASBT (apical sodium bile acid transporter). Les acides biliaires sont ensuite liés à l'intestinal bile acid binding protein (IBABP) pour être transportés en intracellulaire jusqu'à la membrane basolatérale, et être sécrétés par OSTα et OSTβ. Les acides biliaires secondaires ADC et ALC sont cytotoxiques. Les cytochromes CYP3A4, CYP2B, et CYP2C permettent le métabolisme et la détoxification d'ALC en acide hyolocholique (AHC) et acide ursodeoxycholique (AUDC) dans l'intestin. Enfin MRP2 excrète les acides biliaires conjugués à la membrane apicale.

Dans le foie, l'excrétion des AB à la membrane canaliculaire est principalement médiée par la pompe BSEP (bile salt export pump). Quand ce système est saturé, les AB sont sécrétés dans le sang portal afin d'éviter leur accumulation toxique intracellulaire, et permettre leur élimination rénale. Les canaux biliaires permettent le drainage des AB dans la lumière intestinale.

95% des AB sont captés activement dans les entérocytes par le transporteur ASBT (apical sodium bile acid transporter) à partir de la lumière intestinale. Seulement 5% du pool d’acides biliaires échappent à cette réabsorption intestinale. Cette perte fécale des acides biliaires est compensée par la biosynthèse de novo d'AB dans le foie pour maintenir constante la taille du pool.

Les AB sont ensuite sécrétés dans le sang par les entérocytes grâce à des molécules de liaison, hormis certains (déconjugués par des hydrolases bactériennes dans la lumière intestinale), qui peuvent traverser passivement par diffusion la membrane basale entérocytaire.

La dernière étape est l'extraction des AB par les hépatocytes à partir du sang portal, grâce au système sodium dépendant NTCP (Na+ dependent taurocholate transporter)

(55).

III. 2. ROLE SIGNALÉTIQUE ET INTERACTION AVEC LE MICROBIOTE INTESTINAL

Les acides biliaires sont principalement connus comme molécules détergentes pour l'absorption des graisses alimentaires et des vitamines liposolubles dans l'intestin grêle, et le maintien de l'homéostasie du cholestérol dans le foie.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) Toutefois, leur rôle est beaucoup plus large et ils sont maintenant reconnus comme d'importantes molécules de signalisation avec des fonctions endocrines propres, comme le faisait soupçonner la perturbation du profil des acides biliaires dans le diabète (56,57). Chez les diabétiques de type 2, il existe une diminution de la production d'AC au profit de l'augmentation des concentrations plasmatiques des AB secondaires (ADC) (58). Sun et al ont récemment montré chez 9603 patients que l'insulinorésistance était positivement corrélée à une concentration globale élevée d'acides biliaires, chez les diabétiques mais également chez les non diabétiques (59).

Le microbiote intestinal est un organe virtuel qui effectue de nombreuses fonctions digestives et métaboliques de l'hôte (46). On sait que les avancées techniques récentes ont mis en évidence que la santé de l’homme est influencée par l’interaction entre le microbiote intestinal, l’hôte et l’environnement (en particulier le régime alimentaire). L’être humain peut donc être considéré comme un super organisme constitué à la fois de cellules humaines et de cellules microbiennes majoritaires en particulier le microbiote intestinal. Les communautés microbiennes ont co-évolué avec l'homme et montrent une diversité en fonction de l'origine géographique des individus mais également une forte variation inter et intra personnelle : sa composition dépend des sécrétions digestives, du pH local, et peut varier en fonction de l’âge et de facteurs extrinsèques (comme l’alimentation ou la prise de certains médicaments antibiotiques). Ainsi différentes espèces bactériennes sont présentes à des points différents du tractus digestif et la quantité et le type de bactéries diffèrent en fonction de l’environnement local. La quantité la plus importante se trouve en distalité dans le colon. Ce microbiote est impliqué notamment dans différentes fonctions essentielles telles que la digestion des nutriments ingérés, le développement de la réponse immunitaire, la protection contre la colonisation par des micro-organismes pathogènes, l’intégrité de la barrière intestinale (60). Les perturbations de ce microbiote ou dysbiose sont maintenant reconnues comme acteurs importants dans différentes pathologies telles que l’obésité ou le diabète (61– 63).

Il existe des interactions intenses entre flore intestinale et acides biliaires. La circulation entéro-hépatique fournit une source importante de métabolites à la flore intestinale

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) présente. Le profil des acides biliaires est lui fortement tributaire des activités microbiennes et du type de flore intestinale (64), étant donné que ces bactéries permettent la production des acides biliaires secondaires.

Aucune étude n'a recherché si une transplantation de pancréas au niveau iléal pouvait avoir des conséquences sur la flore intestinale et donc sur le profil des acides biliaires. Cependant des études ont été réalisées dans ce sens après chirurgie bariatrique type Bypass, qui permet de créer une situation de malabsorption en modifiant le circuit alimentaire. Les aliments passent dans l'intestin en court-circuitant une grande partie de l'estomac, le duodénum et le jéjunum. Pournaras et al (65) ont montré chez 12 patients une augmentation de la concentration plasmatique total d'acides biliaires après Bypass, qui s’accompagne d’une augmentation de FGF 19 et GLP-1. Ainsi, indépendamment de la perte de poids et de la restriction calorique, la modification des concentrations d’acides biliaires permet d’améliorer les glycémies post-prandiales, l’insulinosensibilité et donc le contrôle du diabète de type 2 (66).

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) IV. RÉGULATEURS DU GLUCOSE ET ACIDES BILIAIRES

Les AB jouent un rôle spécifique comme « intégrateurs métaboliques » dans le contrôle du métabolisme énergétique, glucidique et lipidique. Ces effets sont modulés via leur interaction avec deux récepteurs : le récepteur nucléaire spécifique Farnesoid X receptor (FXR) et un récepteur membranaire Takeda-G-protein-receptor-5 (TGR5) permettant la sécrétion de deux hormones ayant un effet incrétine : GLP-1 et FGF19.

IV. 1. VOIE DE RÉGULATION TGR5/GLP-1

IV. 1. 1. TGR5

Takeda-G-protein-receptor-5 (TGR5), un récepteur membranaire couplé aux protéines G, est un récepteur des acides biliaires. Il est exprimé de manière ubiquitaire, avec un niveau d'expression variable selon les différents tissus. Dans le foie, TGR5 est exprimé dans les cellules endothéliales sinusoïdales, les cellules de Kupffer, les cellules épithéliales des voies biliaires avec un haut niveau d'expression. Au niveau intestinal, il est exprimé au niveau des cellules entéro endocrines.

L'activation de TGR5 par les acides biliaires entraine l'internalisation du récepteur, qui provoque la stimulation d'une adénylate cyclase puis des réactions de phosphorylation de protéines cibles intracellulaires. Les conséquences sont dépendantes du type de cellules concernées : augmentation de la dépense énergétique et de la consommation d'oxygène dans le tissu adipeux, diminution de la résistance à l'insuline, augmentation de la mobilité intestinale, relaxation de la vésicule biliaire, augmentation de la sécrétion biliaire de bicarbonate avec alcalinisation du pH de la bile.(58) Par ailleurs, la sécrétion entérique de GLP-1, hormone régulatrice du métabolisme du glucose, peut être stimulée par les acides biliaires, via TGR-5 (58). La figure 5 résume les principaux effets de TGR5 sur les organes intervenant dans le contrôle de l'homéostasie du glucose.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0)

Figure 5. Rôles médiateurs des acides biliaires via TGR5 dans les différents organes. Abréviations : AB : Acides biliaires, GLP-1 : glucagon-like peptide-1, TGR5 : Takeda-G-protein-receptor-5

IV. 1. 2. GLP-1 : effet incrétine

L'effet incrétine est une réponse spécifique au glucose oral, afin de stimuler la sécrétion d'insuline.

Les cellules endocrines de l'épithélium intestinal peuvent détecter les éléments nutritifs qui passent dans la lumière digestive. Une des hormones sécrétées par ces cellules digestives pour la régulation du métabolisme glucidique est le GLP-1 appartenant aux groupes d’hormones appelés incrétines. Le GLP-1 a pour effet de ralentir la vidange gastrique, réduire l'appétit, augmenter la sécrétion d'insuline et réduire celle du glucagon. Il existe deux voies principales de stimulation de la sécrétion de GLP-1 : via le cotransporteur (sodium glucose transporter 1 ou SGLT-1) ou via la fixation des AB à

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) TGR5 (67–69). La demi-vie du GLP-1 est très courte, et une fois secrété il est dégradé rapidement par une enzyme DPP4 (Dipeptidyl Peptidase 4).

L'administration de GLP-1 chez les patients transplantés pancréatiques (drainage portal) induit une hypoglycémie réactionnelle via la sécrétion excessive d'insuline (70). Dans les modèles animaux les résultats sont contradictoires : chez les chiens transplantés du pancréas les auteurs retrouvent une abolition de l’effet incrétine (71) alors que chez les porcs, cet effet était conservé (72). Une seule étude chez l'homme étudie la sécrétion des incrétines (GLP-1) aux cours d'une HGPO chez des patients ayant reçu une transplantation rein-pancréas. Celle-ci semble montrer que la réponse de sécrétion de GLP-1 après une charge orale de glucose chez les patients ayant une transplantation rein-pancréas est atténuée en comparaison avec celle des patients transplantés du rein seul (73). Cependant ces différences étaient à la limite de la significativité. Par ailleurs, dans cette étude ancienne le drainage du pancréas exocrine était réalisé grâce à une anastomose au niveau vésical et non digestif. Ce qui pourrait expliquer le peu d’impact de la transplantation pancréatique. Si le profil des acides biliaires est modifié par la transplantation pancréatique avec anastomose digestive, alors la voie de signalisation TGR5/GLP-1 pourrait être perturbée et entrainer une modulation de la sécrétion d’insuline et de glucagon.

De nouvelles molécules visant cette voie de régulation sont utilisées pour traiter le diabète de type 2, afin d'augmenter la sécrétion d'insuline et lutter contre l'insulino- résistance. Il s'agit d'analogues de GLP-1 ou d'antagonistes de DPP-4 qui empêche la dégradation du GLP-1. Des études préliminaires montrent que des perfusions de GLP-1, chez les receveurs de greffe d'îlots et de pancréas total réduisent la glycémie basale en améliorant la sécrétion d'insuline en réponse à un apport oral de glucose (74). Par ailleurs plusieurs études mettent en évidence le rôle du GLP-1 dans la prolifération des cellules β et son effet anti apoptotique (75). Ainsi des traitements par agoniste de GLP-1 (76) ou inhibiteur de la DPP-4 ont déjà démontré un effet bénéfique pour la survie et le fonctionnement d'ilots transplantés dans des modèles animaux (77). Ces médicaments ont donc un effet inhibiteur sur la sécrétion de glucagon et favoriseraient la survie des

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) cellules bêta transplantées. Ils présentent ainsi une cible thérapeutique intéressante si la sécrétion de GLP-1 est effectivement altérée dans la transplantation pancréatique.

IV. 2. VOIE DE RÉGULATION FXR/FGF 19

IV. 2. 1. FXR

Les acides biliaires sont des ligands naturels pour le récepteur nucléaire Farnesoid X Receptor (FXR). Il est exprimé dans de nombreux tissus comme notamment le foie, l'intestin, le rein, le cœur, la glande surrénalienne et le tissu adipeux. L'activation de FXR joue un rôle dans de nombreux mécanismes (hépatoprotection, effet anti tumoral hépatique, néphroprotection, modulation de l'immunité...) (78–80). La plupart des gènes codant pour des protéines impliquées dans la synthèse, le métabolisme et le transport des acides biliaires dans la circulation entéro-hépatique sont strictement contrôlées par les acides biliaires eux-mêmes via l'activation de FXR (58).

Par ailleurs, FXR semble jouer un rôle important dans la régulation du métabolisme lipidique et glucidique. En effet plusieurs groupes ont démontré que le profil des acides biliaires est perturbé dans le diabète via le rôle critique de FXR (81,82).

FOIE : après un passage intra-entérocytaire via des transporteurs spécifiques, les acides biliaires sont pris en charge par le système porte pour arriver dans le foie. Là, l'activation de FXR par les acides biliaires conduit à l'augmentation de l’expression du récepteur nucléaire SHP (small heterodimer partner) qui à son tour inhibe CYP7A1. FXR active également l'expression de BSEP sur la membrane canaliculaire des hépatocytes (55). FXR a donc un rôle important de détoxification hépatique en stimulant la conjugaison des acides biliaires, en inhibant leur synthèse intra-hépatique (CYP7A1), et en augmentant leur excrétion dans les canicules biliaires (BSEP). Parmi les acides biliaires, le CDCA et ses dérivés conjugués sont reconnus comme les agonistes les plus puissants de FXR Lors de l'ingestion de repas, la circulation entéro-hépatique accrue des acides biliaires active FXR, conduit à une inhibition de la glycolyse, pour promouvoir le stockage du glucose en glycogène intra-hépatique. Puis, l’augmentation des concentrations plasmatiques d'insuline liée à l'alimentation réduit l'expression de FXR, ce qui peut 37

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) contribuer à une réorientation vers la glycolyse à jeun (83). Dans les modèles animaux de diabète de type 1 il existe une diminution d'expression de FXR hépatique, que l'insulinothérapie restaure (84).

INTESTIN : l'activation locale de FXR stimule la synthèse et sécrétion de FGF19 par les cellules épithéliales de l'intestin. Une fois libéré dans la circulation systémique, FGF 19 va inhiber la synthèse de triglycérides et activer la synthèse de glycogène.

Figure 7. Rôles médiateurs des acides biliaires via FXR dans les différents organes Abréviations: AB : Acides biliaires, FGF19 : fibroblast growth factor 19, FXR : farnesoid X receptor, GLP-1 : glucagon-like peptide-1.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) IV. 2. 2. FGF 19

Les acides biliaires stimulent donc au niveau intestinal la synthèse et la sécrétion plasmatique de FGF 19 via FXR lors de leur passage dans l'iléon. FGF19 se lie ensuite à son récepteur membranaire hépatocytaire FGFR4 (FGF receptor 4) (58).

Kir et al ont démontré chez la souris que le FGF19 était capable d'activer la synthèse de glycogène par le foie par une voie de signalisation indépendante de celle de l'insuline : MAPK-ERK (Mitogen-activated protein kinase/Extracellular signal-regulated kinase) (85). Il permet également une optimisation de l'utilisation du glucose au niveau du tissu adipeux, avec une amélioration de la tolérance au glucose et une perte de poids, via son action sur le système nerveux central, encore mal définie (86). Marcelin et al ont ainsi montré que trois injections intraventriculaires de FGF19 chez les souris provoquaient une baisse de la glycémie et de l'insulino résistance (87).

Figure 6. Actions métaboliques du FGF 19 d'après Jahn et al (88).

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) Les concentrations de FGF 19 sont diminuées chez les patients présentant un syndrome métabolique ou une stéatose hépatique non alcoolique (89). Il est intéressant de noter que ces concentrations sont restaurées à des valeurs normales après chirurgie bariatrique (Bypass) chez les patients obèses (65).

FXR et FGF19 sont donc des nouvelles cibles clefs du métabolisme glucidique impliquant les acides biliaires. Tous les AB n'activent pas FXR avec la même efficacité. Le plus efficace est l'ACDC, puis ADC, ALC et enfin AC (58). Tout changement de la composition du pool d'AB est donc susceptible de modifier les signaux médiés par FXR. La transplantation pancréatique pourrait avoir un impact sur la sécrétion de FGF 19 via FXR en modifiant la composition des acides biliaires passant dans l'iléon, et ainsi pourrait expliquer les modifications du métabolisme glucidique observées après transplantation.

Notre hypothèse est que l'anastomose ectopique du pancréas exocrine lors d'une transplantation pancréatico-duodénale au niveau iléal pourrait perturber le cycle entéro-hépatique des acides biliaires et leurs voies métaboliques. Ceci pourrait induire une modification de la quantité et/ou de la composition des acides biliaires et affecter ainsi la sécrétion des incrétines.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) IMPACT OF PANCREAS TRANSPLANTATION ON BILE ACIDS AND GLUCOSE METABOLISM

ABSTRACT BACKGROUND. Simultaneous pancreas-kidney transplantation (SPKT) in type 1 diabetes (T1D) patients restores endogenous insulin secretion and normal fasting glucose. However, qualitative and quantitative defects of β cell function have been demonstrated in most, but not all, SPKT patients with nondiabetic glycemic control. The underlying mechanisms are still unclear but enteric drainage of exocrine pancreas which is performed in the ileum could play a role by changing physicochemical properties of intestinal secretions and gut flora. As a consequence it could impact gut derived metabolic factors like incretin secretion and the enterohepatic cycle of bile acids (BA), that are important mediators that regulate lipid, glucose and energy metabolism.

METHODS. We prospectively measured total BA concentration and composition (cholic acid, chenodeoxycholic acid, deoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, lithocholique acid (LCA)) in 15 SPKT subjects before and one year after transplantation (Y1), compared to 16 kidney transplant (KT) patients and 10 controls. Oral glucose tolerance test (OGTT) was performed at Y1 to evaluate glucose metabolism (glucose, insulin, c-peptide).

RESULTS. The 3 groups were similar for demographic data but SPKT subjects were significantly younger. At Y1, fasting blood glucose was in the normal range but SPKT subjects showed significantly higher insulin levels than the KT and controls. Glucose excursion after oral glucose were similar, but at 240 min, plasma glucose remained significantly elevated in SPKT group and plasma insulin increased less markedly in SPKT subjects and remained elevated at the end of OGTT. Total BA concentrations were not different between groups. LCA concentration decreased significantly after SPKT (p<0.01) and was lower than the KT group (p<0.01); but not different compared to control group. Before transplantation, T1D patients had higher DCA and lower CA proportions vs KT group. Univariate analysis showed that primary BA proportion was negatively correlated with T180 glucose level while secondary BA were positively related. T90 insulin levels were positively correlated with primary BA and negatively with secondary BA proportions. No correlation was found between BA and fasting

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) plasma glucose, HbA1c and T120 plasma glucose in one hand and BA concentrations or proportions on the other hand.

CONCLUSIONS. Our study confirms that SPKT patients exhibit an impaired glucose and insulin response after glucose challenge despite a normal fasting glucose and HbA1c. We report a different BA profile of type 1 diabetic subjects before transplantation that is modified after SKPT. Whether this profile impacts BA dependent metabolic pathway through the modulation of fibroblast growth factor-19 (FGF-19) and glucagon like peptide-1 (GLP-1) is under investigation.

Keywords: pancreas transplantation, bile acids, incretin, glucose metabolism, insulin

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) INTRODUCTION

Simultaneous pancreas-kidney transplantation (SPKT) is the treatment of choice for type 1 diabetes (T1D) patients with end-stage renal failure (1). Successful pancreas transplantation in these patients results in sustained normalization of fasting plasma glucose and HbA1c levels without the requirement of exogenous insulin injections and reduces long-term diabetic complications (3,18). SPKT is indeed associated with the improvement of long-term survival among these patients (19), and is able to restore endogenous insulin secretion (2,21,31).

Although the majority of patients with T1D obtains a normal fasting glucose after SPKT, an impaired insulin response after oral glucose stimulation has been reported (90). Boden et al. have shown that patients who have undergone SPKT are hyperinsulinemic and have impaired insulin-stimulated whole body glucose uptake, due to insulin resistance at the tissue level, as for type 2 diabetes mellitus (T2DM) (6). The mechanisms behind this altered glucose metabolism and β cell function are still unclear (4–6,28,32). It has been shown with sophisticated C13 nuclear magnetic resonance (NMR) studies that these patients have a reduced capacity to store glucose as glycogen primarily due to a defect in post prandial or insulin stimulated glycogen storage (6,10,11,21). Euglycemic hyperinsulinic clamp studies combined with muscle biopsy have shown a reduction in peripheral glucose utilization, associated with increased inhibitory serine phosphorylation of insulin receptor substrate in muscle (11,12). Lack of peripheral insulin receptors, and the decrease of their expression were also described among SPKT patients(41). And finally hyperglycemic clamp studies have shown a decrease in functional beta cell mass and insulin sensitivity (13), but peptide-C (coproduced with insulin) levels after SPKT and kidney transplantations (KT) are preserved (5). All this is believed to be partly related with some factors like body weight gain, immunosuppressive treatments (as corticosteroids) (5), inflammation, graft rejection/relapse of the initial disease, digestive neuropathy which could delay food transport and glucose absorption, with prolonged postprandial insulin secretion (11) and surgical techniques.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) Several different surgical techniques for pancreas transplantation have been described, including systemic-venous (SV) drainage and portal-venous (PV) drainage of the graft. SV drainage has the disadvantage that it circumvents the portal circulation and results in hyperinsulinemia, both under basal and stimulated conditions (5,11), when compared with patients with PV drainage of the pancreas graft. Petruzzo et al. have shown, using euglycemic hyperinsulinemic clamp, a lower insulin clearance and a slight decreased peripheral responsiveness to insulin without modifications of hepatic glucose production and lipid status for patients with SV compared to PV drainage (14). Finally there could be a lack of control of glucagon secretion (43). Systemic drainage could prevent glucagon from crossing the liver leading to its accumulation and may contribute to abnormal glucose metabolism (44).

Enteric drainage is currently the predominant surgical technique for exocrine pancreas graft secretion combined with SV drainage of the endocrine pancreas. The pancreatic duct is inserted into the small bowel using a small “button” of duodenum (15). This duodeno pancreatic anastomosis is performed in a heterotopic site (ileum) and thus could change physico chemical properties of intestinal secretions, the gut flora, as well as intestinal permeability. This procedure could modify gut derived metabolic factors: the enterohepatic cycle of bile acids (BA), incretin secretion and intestinal flora.

Bile acids, which are synthetized in the liver, are end products of cholesterol catabolism, and are released into the small intestine after meal ingestion. They are first synthetized as primary BA : cholic acid (CA) and chenodeoxycholic acid (CDCA), then transformed in secondary BA : deoxycholic acid (DCA), ursodeoxycholic acid (UDCA) and lithocholic acid (LCA). They enhance intestinal absorption of dietary fat, steroids, drugs, and lipophilic vitamins (16,49). Most BA are efficiently reabsorbed in the ileum and transported back to the liver via portal circulation (46). This enterohepatic circulation regulates lipid, glucose, energy metabolism, as well as a feedback inhibition of BA on their own liver synthesis (50). These regulations are mediated by modulation of Glucagon like peptide one (GLP-1) and Fibroblast growth factor 19 (FGF19) secretions, two ileum-produced hormones that are key players in glucose and energy metabolism.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) This prospective study is aimed to evaluate the modification of bile acids concentrations and pool composition in SPKT subjects compared to kidney transplant patients and control subjects, and their impact on glucose metabolism measured by oral glucose tolerance test OGTT performed one year post transplant.

PATIENTS AND METHODES

Patients: We performed clinical and biological investigations in a single-centre prospective study in the Transplantation Department of Lyon, France, from September 2013 to February 2016. Three groups of patients were recruited: simultaneous pancreas-kidney recipients (n=15) kidney transplants recipients (n=16), healthy subjects (n=10). Inclusion criteria for all participants were: age between 18 and 55 years old, BMI (body mass index) < 30 kg/m2, without any current treatment that could interfere with our biological data (laxative, hypoglycemic drugs for KT and controls). To be included transplants recipients should present the following conditions: first kidney or combined pancreas-kidney transplantation, no contraindication for immunosuppressive therapy combining corticoids, mycophenolate mofetil (MMF), tacrolimus). Kidney transplants should not present UNOS (United Network for Organ Sharing) extended donors criteria, but could be from live donors. Healthy subjects were selected from live kidney donors. Both kidney recipients and live donor should have normal fasting blood glucose (< 7 mmol/L). Exclusion criteria were: Type 2 diabetes, history of intestinal resection or cholecystectomy, pregnancy and breastfeeding for women. Patients were excluded from the study when the following complication occurred during the year after transplantation: rejection with graft loss, major infection, diabetes with insulin or oral antidiabetic requirement. This study agrees to the Principles of Helsinki Declaration. All patients gave informed consent after written information to participate. The study was approved by an independent ethical committee (Comité de Protection des Personnes Lyon Sud Est IV) and is registered at Clinical Trial NCT02234349.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) Methods: The following clinical and biological parameters were recorded for all subjects: age, gender, blood pressure, BMI, waist circumference (WC), medical and surgical history, comorbidities, intestinal transit disorders and treatments. Blood samples were collected for bile acids measurement, and OGTT was performed in all subjects (except one participant in the KT group). All transplant patients were recruited the day they were called for transplantation (D0) and blood sample was collected for baseline bile acids measurements. At their one year follow-up mandatory medical visit (Y1), we collected the same clinical and biological parameters as baseline and performed OGTT. For the control subjects, clinical data and fasting serum were collected for each patient during one of the living donor kidney evaluation visit. OGTT was performed during an additional visit.

Biological data: Serum creatinine was measured by a colorimetric method. Glomerular filtration rate (GFR) was evaluated by Iohexol clearance measurement (at one year for transplant patients, and during evaluation for kidney donation for the controls). Glycosylated hemoglobin (HbA1c) was measured by high pressure liquid chromatography, C reactive protein (CRP) by immunoturbidimetry, and T0 tacrolimus dosage by electrochemical method, MMF area under the curve (AUC) and glycemia by enzymatic method, proteinuria by photometry.

Total bile acid concentrations were measured by enzymatic colorimetric methods (Architect, Abbott, Rungis, France). Gas chromatography system (GC Focus, ThermoFisherScientific, Les Ulis, France) was used to separate cholic acid (CA), chenodeoxycholic acid (CDCA), deoxycholic acid (DCA), ursodeoxycholic acid (UDCA) and lithocholic acid (LCA). The results were expressed as percentage of the total area of all bile acids peaks and quantified in µmol/L. Normal reference values were : total BA: 0- 6 µmol/L; CA 0.8-1.6 µmol/L ; CDCA 2.2-3.2 µmol/L ; DCA : 0.8-1.6 µmol/L ; UDCA 0.4-1 µmol/L ; LCA : 0-0.5 µmol/L;

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) OGTT was performed with a standardized protocol: after an overnight fast in the absence of the immunosuppressants or other drugs an intraveinous line was placed, glucose, insulin, C-peptide and HbA1c were measured and glucose tolerance test was performed using 75 g of glucose. Blood samples were taken at baseline, 30, 60, 90, 120, 180, 240 minutes after glucose load for the measurement of plasma glucose, insulin, C- peptide and glucagon (chemiluminiscent microparticle immunoassay). Normal glucose tolerance was defined by fasting glycemia < 7 mmol/L and T120 glycemia < 11.1 mmol/L(27,30). After pancreas transplantation, T120 glycémia > 7,8 mmol/L defines impaired glucose tolerance (29,42). Normal values for basal C-peptide: 0.8-5.2 ug/L (T0). Normal values for basal insulin: 5-25 mUI/L (T0).

Insulin secretion was evaluated using Insulinogenic index (IGI) formula (91): (insulinT30min (IU/L) - insulinT0 (IU/L)) / (glucoseT30min (mmol/L) - glucoseT0 (mmol/L)). Insulin resistance was evaluated using homeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA-IR) formula (39) : insulinT0 (IU/L)X glucoseT0 (mmol/L)/22.5.

Statistical analysis: Data were expressed as medians ± interquartile ranges (IQR). Results were described first in each group at D0 and Y1. A Student T-test was used to compare bile acids profiles between D0 and Y1 among pancreas-kidney. We also used Student T-tests to compare post-transplantation data between the two transplant recipients groups in one hand (with additional covariance analysis), and between pancreas-kidney recipients and normal subject on the other hand. Finally univariate Spearman correlations were realized to evaluate the hypothetic correlation between bile acids and insulin resistance parameters. All statistical tests were two-tailed. A two-sided p value <0.05 was considered as statistically significant. Statistical analyses were performed using Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 21.0 (IBM software, Armonk, NY, USA).

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) RESULTS

Characteristics of patients The clinical, anthropometric and biological characteristics of patients before transplantation are summarized in Table 1a. Characteristics of patients one year after transplantation and of kidney donors (controls) are summarized in Table 1b.

Groups were comparable for gender. SPKT were younger than KT patients and controls (median age 33 (31-35), 42 (38-50) p<0.01, 46 (39-50) p<0.01 years respectively). Although in the normal range SPKT had a lower BMI and WC than controls and KT before transplantation, but this difference between the two transplant groups did not longer persist one year after transplantation (table 1b). Tacrolimus was used for all transplanted patients with equivalent trough level, only one KT patient did not receive MMF and 2 were without corticoids at Y1. Corticosteroids dose for all other patients was 5 mg/day. Estimated GFR with CKD-EPI at Y1 (data not shown) was better in SPKT compared to KT group, without any difference for measured GFR. Iohexol clearance for SPK and KT groups were respectively 62.5 (49.3-70.8) and 54.5 (42.8-64.5) ml/min/1.73 m2 and as expected were lower than the control group. There was no difference for proteinuria.

Glucose metabolism related data Median SPKT HbA1c at D0 was 9.1% and decreased to normal range one year after transplantation: 5.5% (5.0-5.7). OGTT parameters for each group are described in Figures 8a, b and c. and Table 2. KT and controls showed normal basal and stimulated glucose concentrations. Fasting glucose was in the normal range for SPKT patients (4.8 (4.6-5.2) mmol/L) but significantly higher compared to the controls (table 2). Within the first 60 min, glucose excursions after oral glucose were similar, but at 120, 180 and 240 min plasma glucose remained elevated in SPKT group (table 2, figure 8a). At T120, median SPKT plasma glucose (7.7 (5.8-8.6) mmol/L) was significantly higher than controls 5.0 (4.5-5.8) mmol/L, p<0.01 and remained significantly elevated (5.4 (4.3-6.3) mmol/L) compared to controls and KT group at the end of OGTT (T240): 3.5 (2.9-3.8) mmol/L), p<0.01 and 4.0 (3.7-4.4) mmol/L, p<0.01, respectively.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0)

Basal insulin levels were higher in SPKT group: 12.0 (10.5-16.0) mUI/L, compared to KT and control groups: 8.0 (6.0-8.5) mUI/L, p<0.01; 6.5 (5.3-11.3) mUI/L, p<0.01 respectively, whereas there is no difference between KT and controls. During OGTT plasma insulin increased more markedly in control subjects (900%) than in both transplanted groups (630% for KT group and 283% for SPKT), but T60 values were not statistically different. The decrease of insulin concentration after glucose stimulation was slower in SPKT group and insulin concentration was significantly higher at the end of OGTT (T240): 17.5 (10.3-22.3) mUI/L than in KT group : 5.0 (4.0-6.0) mUI/L, p<0.01 (table 2, figure 8b).

Basal c-peptide levels were similar in each group. From T30 to T120, c-peptide concentrations were lower in SPKT group vs KT group, as shown in figure 8c, and returned to normal basal value at T180 and T240 for all groups.

HOMA-IR was also higher in SPKT group, compared to KT and controls, (figure 9). Median HOMA-IR are respectively: 2.7 (2.3-3.5) vs 1.7 (1.1-1.8), p<0.01; and 1.4 (0.7- 2.4), p<0.01. IGI are not different between groups (figure 9).

Bile acids Total BA concentrations were not different between groups, before and after transplantation (Table 3a and 3b). Before transplantation, BA profile was different between SPKT and KT patients. DCA concentrations were higher in SPKT group, representing 33.6% vs 13.6% of BA respectively, and above the normal values (1.60 µmol/L for SPKT). CA proportions were also significantly lower in SPKT group (11.5% vs 22.6%). Although, DCA median concentration in SPKT group decreased one year after pancreas transplantation, it did not reach statistical significance (Supplement table). The difference in concentrations of DCA between SPKT and KT groups did not persist, but the difference in the profiles still persisted (24 vs 9.9%, p<0.01). The primary BA CA did not change, but CDCA concentration tended to increase after pancreas transplantation but did not reach significance, furthermore its’ proportion in the BA profile was not different between groups (supplement table).

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) At baseline, LCA (a secondary BA) concentration and proportion were not different between the transplanted groups but significantly decreased in SPKT group, one year after transplantation (supplement table) and remained statistically significant after Variance test (p=0.003). At Y1, LCA concentrations and proportion were lower in SPKT group compared to KT group. After one year of transplantation, there is no difference between SPKT patients' and controls' BA profile. All five BA profiles are described in figure 10.

Univariate analysis Table 4 shows univariate analysis between BA concentrations and OGTT parameters in SPKT group. %CA was only positively associated with T90 insulin (r=0.60 p=0.02). %CDCA had a negative correlation with T180 glucose (r=-0.60 p=0.03) and a positive correlation with T60 insulin (r=0.58 p=0.04). %DCA was negatively associated with T60 and 90 insulin: respectively r=-0.70 p<0.01 and r=-0.68 p<0.01. %UDCA was positively associated with T180 plasma glucose (r=0.55 p=0.05). Primary BA proportion was positively associated with T60 (r=0.67, p=0.01) and T90 (r=0.52, p=0.06) insulin concentrations, then negatively with late glucose concentration at T180 (r=-0.55, p= 0.05). At the opposite, secondary BA proportion was negatively correlated with T60 (r=-0.77, p<0.01) and T90 (r=-0.62, p=0.01) insulin concentrations and positively with T180 glucose (r=0.59, p=0.04).

No association was found between LCA and OGTT parameters, nor between total BA and OGTT parameters. IGI was not correlated with any BA concentration. HbA1c and T120 glucose had no correlation with BA concentrations. (data not shown)

DISCUSSION

In our study SPKT restored an efficient pancreas endocrine function with normal HbA1c and fasting glycemia one year after transplantation. However, we confirm an impaired response after oral glucose challenge in these patients. We were able to show that type 1 diabetic patients exhibit an altered BA profile before transplantation with an increased DCA (a secondary BA) proportion. SPKT has an impact in BA composition with primarily

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) a decrease in LCA concentration and proportion and a trend toward an increase of the primary BA: CDCA.

There are evidence of diverse alterations in the concentration of bile acids in the diabetic state (92). Insulin resistance is even positively associated with increased bile acids levels among type 2 diabetic population (59). In our study total bile acid concentration is not different between each group before transplantation, but SPKT T1D patients have a different initial BA profile, with increased DCA and a predominant proportion of secondary BA. Brufau et al did not find any difference in the total bile acid concentration, but the contribution of specific bile acid species to the BA pool was altered in T2DM (93). Thus, the concentration and proportion of DCA was elevated (93). Elevated DCA levels in plasma of well controlled diabetic patients compared to healthy volunteers were also observed by Suhre et al (94). They found lower CA concentrations, that we also observe in our type 1 diabetic population. One hypothesis was that CA might be increasingly converted into DCA in the gut of patients with diabetes. Our results for T1D patients (also known to present insulin resistance) suggest that similar BA profiles exist between T1D and T2DM.

Over the past decade, numerous studies have highlighted the importance of BA beyond their classic function in bile formation and fat absorption. They have emerged as key modulators of post prandial glucose and energy metabolism. Because of their enteric circulation, bile acids are in close interaction with intestinal bacteria. They undergo multistep biotransformation usually catalyzed by enzymatic activities in gut bacteria. Bile acids signaling functions should then be strongly influenced by microbial modulation (95). Enteric drainage of the pancreas transplant into distal ileum could potentially modify local environment (PH, digestive secretions) and therefore gut microbiota, and as a consequence bile acids concentrations or composition. For instance, after bariatric surgery, Kaska et al (66) have shown that improved glucose metabolism was associated with increased circulating bile acid concentrations and remodeling of the gut microbiome. Pancreas transplantation in our study does not modify total BA concentration, but there is a modification of BA composition with a statistically significant decrease in LCA concentration and proportion which are lower in SPKT than in KT group after

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) transplantation, while there is no difference with controls, highlighting pancreas graft potential role in these modifications. LCA is a cytotoxic secondary BA formed mainly by bacterial deconjugation and 7 -dehydroxylation of conjugated CDCA, then passively absorbed in the colon after αdetoxification (47). Its production could be indeed influenced by the digestive secretions effect on gut microbiota in SPKT.

BA are natural ligands that activate a nuclear receptor Farnesoid X receptor (FXR) and G-protein coupled bile acid receptor 1 (TGR5). FXR is a dedicated nuclear receptor of bile acids, and has an established role for enterohepatic recycling and the feedback regulation of BA biosynthesis. FXR is expressed at high level in liver and intestine and also in kidney and adrenal cortex, which has a major role in lipid and glucose homeostasis. In the intestine FXR activation increase the synthesis and secretion of FGF19 (86) which is a secreted fibroblast growth factor that signals from the intestine to liver and acts in a way parallel to and independent from insulin to govern postprandial glucose metabolism in liver, restoring hepatic glycogen synthesis (85). FGF19 concentrations are lower among patients with metabolic syndrome (89), but restored to normal after bariatric surgery (65). SPK modifies bile acids composition, which could modulate FGF 19 secretion. Actually, LCA has the lowest potency in FXR activation (highest being CDCA)(58). This modification of BA profile which is in favour of primary bile acids could modulate FXR signaling, and thus FGF19 synthesis and secretion.

Activation of TGR5 in the intestine has been shown to induce the production of glucagon-like peptide-1 (GLP-1) by ileum entero endocrine cells (69). GLP-1 normally functions to enhance glucose-dependent insulin secretion and glucagon suppression. These effects are thought to be dependent in part on GLP-1 receptors present on visceral afferent nerves and -cells and require intact islet innervation that is disrupted in pancreas transplantation.α Previous studies have shown a preserved incretin effect in SPKT subjects whose functioning pancreas is denervated indicating a lesser role for the nervous system, but in this study the exocrine secretion were drained in the bladder (73). LCA is the strongest natural agonist of TGR5 (47). Its decreased concentration and proportion in total BA pool leads to a minor stimulation of TGR5, and maybe a decreased GLP-1 secretion, that would explain persistent insulin resistance after SPKT.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) Early insulin release after glucose stimulation was positively associated with primary BA concentration (and negatively with secondary BA) while late glucose concentration was negatively associated with primary BA (and positively with secondary BA). Decreased proportion of LCA and normalization of DCA concentration after SPKT could participate to primary/secondary BA ratio reestablishment, explaining better insulin secretion and glucose tolerance. This ratio was <1 before transplantation (higher DCA levels) and >1 after SPKT transplantation. Similar observations were made in diet- induced obese rats after ileal interposition surgery, with a higher ratio of primary to secondary bile acids and improved glucose tolerance (96).

T120 plasma glucose levels were higher in SPKT and KT patients compared to controls, probably partially because of immunosuppressive drugs. In line with previous studies (13,25), fasting glucose and HbA1C where in the normal range in SPKT patients whereas insulin levels were elevated probably related in part to a decreased insulin clearance. After glucose challenge, glucose and insulin plasma excursions remained elevated in SPKT patients at the end of OGTT, whereas early insulin excursion tended to increase less markedly in SPKT patients. This persistent hyperinsulinemia might also be explained by decreased insulin clearance, but the glucose response highlights that a certain degree of insulin resistance may also persist in SPKT recipients (5,21,41). Using euglycemic hyperinsulinemic clamp in 6 SPKT, 6 KT and 6 control patients, Christiansen et al. showed that SPKT group also had an increased insulin resistance that was explained by chronic peripheral hyperinsulinemia and impaired peripheral action of insulin (11). We obtained similar results with HOMA-IR that estimates basal insulin resistance, which is known to strongly correlate with the euglycemic clamp gold standard test (8,39). SPKT patients had lower c-peptide concentrations than KT patients after glucose stimulation. By performing hyperglycemic clamp, Frystyk et al (90), have also shown similar results in SPKT subjects at 3 months post transplant compared to healthy controls. Their main hypothesis was the presence of a beta cells mass defect, caused by perisurgical organ damage. However, in our study OGTT were performed much later (one year post transplant for all subjects) excluding the surgical effect. In addition all participants were in a stable condition, without associated glucose tolerance

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) impairment. Moreover, specific role of immunosuppressive drugs cannot be suspected as treatments were comparable between our two groups. In contrast to previous studies, basal c peptide levels were similar between SPKT and controls. Previous studies have shown an increased c peptide level in SPKT subjects (5,13). But in these studies the participants were evaluated later after transplantation (36 months in average) and the kidney function of SPKT subjects was lower than KT subjects. They concluded that higher c-peptide levels might be related to a decreased renal excretion (13) which is not the case in our study. However, the lower c peptide increment after glucose stimulation that we report is in line with their results. Again, specific role of immunosuppressive drugs cannot be suspected, as treatments were comparable between our two groups. This c-peptide excursion persisted longer after stimulation in SPKT patients, and is associated with hyperinsulinemia up until T240. This may suggest also the presence of a secondary insulin secretion, which might be related to an incretin effect. As glucose plasma peak was not higher nor delayed in our SPKT patients, we excluded a slower gastric emptying (digestive neuropathy) (90). Insulin secretion in SPKT patients has been reported previously by Gillard et al, using hyperglycemic clamp. While their c-peptide profile was similar to our results, they were not able to show higher insulin levels. Since their SPKT patients had systemic drainage, one hypothesis explaining this discrepancy is the lack of incretin effect, as the glucose challenge was not oral in their study. But we cannot totally exclude the potential role of systemic drainage in delaying insulin clearance.

Our study has several limits: SPKT were younger than KT and controls patients, but we assume that the impaired response to glucose challenge could have been even worse in older patients. Our small sample could have prevented us to show some other differences in BA profiles and concentrations. But previous studies in the same topic has been performed with smaller number of subjects because of recruitment (13,14,90). We measured BA concentration and profile but lack information whether there is a change in the conjugated forms of these bile acids. OGTT was used instead of gold standard for glucose metabolism exploration. Euglycemic hyperinsulinemic clamp is not routinely performed in the patients follow up, and would have prevented us to study incretins pathway regulation. However our study is strengthened by the fact that the same surgical technic for transplantation was performed in all patients, its’ prospective

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) nature, the metabolic evaluations that were performed one year after transplantation for all transplant subjects which is late enough to evaluate the specific effect of SPKT excluding other confounders : surgical damage, high corticosteroids use. Furthermore, all transplant patients had similar BMI, without inflammation and were on similar immunosuppressive treatment. In addition GFR was measured with the gold standard technique.

CONCLUSIONS

With this single-center study, we confirm an impaired (post prandial) glucose metabolism in SPKT subjects which is associated with changes in BA profiles, with a decrease in LCA concentration and proportion, without differences in total BA concentration. There was no direct correlation between LCA and OGTT parameters, but its decreased proportion could participate to primary/secondary BA ratio reestablishment. Whether this BA modification is associated with the modification of the two key mediators of BA metabolic action FGF19 and GLP-1 is under investigation. Finally, study of our patients' intestinal microbiota through stool samples before and one year after transplantation could be the missing link explaining BA profiles modifications.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) AKNOWLEDGMENTS

We thank Fitsum Guebre-Egziabher (PHD; Department of Nephrology, Dialysis, Transplantation, Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble- Alpes, Grenoble, France), Emmanuel Morelon (PHD), Claire Pouteil-Noble (PHD), Olivier Thaunat (PHD), Cécile Chauvet (MD), Fanny Buron (MD), Maria Brunet (MD), Rémi Cahen (MD), Sameh Daoud (MD) (Department of Immunology and Transplantation, Hospices Civils de Lyon, Edouard Herriot Hospital, Lyon, France), Lionel Badet (PHD; Department of Urology and Transplantation, Hospices Civils de Lyon, Edouard Herriot Hospital, Lyon, France), Sandrine Lemoine (MD; Department of Nephrology, Hospices Civils de Lyon, Edouard Herriot Hospital, Lyon, France), Laeticia Koppe (MD; Unité 1060 INSERM CarMen, Lyon1 university, Lyon, France) for their help in patients’ recruitment, and Daniel Sperandio for patients’ follow-up; Florence Sens (MD; Department of Nephrology, Hospices Civils de Lyon, Edouard Herriot Hospital, Lyon, France) for her help in statistical analysis. We also thank Emilie Blond

-Sud Hospital,(Fédération Lyon, de France), Biochimie, Régine Unité Cartier de Biochimie and Véronique Métabolique Raverot et Moléculaire, Lyon (FédérationHospital, Lyon, de France), Biochimie, Christophe Unité de Soulage Biochimie (PHD Métabolique ; Unité 1060 et INSERM Moléculaire, CarMen, Lyon Lyon1 Est university, Lyon, France) and Martine Laville (MD, PHD; CRNH Rhône-Alpes, Lyon Sud Hospital, Lyon France) for their help in measuring laboratory values.

This work was supported by the financial support from "groupement inter régional à la recherche clinique et à l’innovation GIRCI" without any involvement in the conduct of the research or preparation of the manuscript.

The study is registered on Clinical trial NCT02234349.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) TABLES ET FIGURES

Pancreas-Kidney Kidney p transplantation transplantation N 15 16 age (years) 32 (30-34) 41 (37-49) 0.001* male/female 4/11 9/7 0.095 Ischaemic heart disease (%) 1 (7) 1 (6) 0.742 Peripheral arterial disease (%) 2 (13) 0 (0) 0.226 Hypertension (%) 11 (73) 9 (56) 0.320 Dialysis (%) 12 (80) 13 (81) 0.641 Statin treatment (%) 6 (40) 6 (38) 0.886 BMI (kg/m2) 21.5 (20.5-22.1) 24.0 (19.7-26.7) 0.037* Waist circumference (cm) 79.0 (76.3-82.5) 93.5 (82-99.3) 0.004* Systolic blood pressure (mmHg) 148 (129-160) 139 (122-151) 0.097 Diastolic blood pressure (mmHg) 89 (79-107) 89 (73-97) 0.441 HbA1c (%) 9.1 (6.8-10.8) 5.3 (4.9-5.3) 0.001* Fasting blood glucose (mmol/l) 8.0 (5.5-15.0) 5.4 (4.9-6.3) 0.097 CRP (mg/L) 2.9 (2.9-2.9) 2.9 (2.9-5.0) 0.934 Hemoglobin (g/L) 113 (105-126) 114 (109-124) 0.708

Table 1a. Clinical and biological characteristics of patients before transplantation

Median and interquartile ranges. Student T-tests. Abbreviations. BMI : Body mass index; HbA1c : glycosylated hemoglobin, CRP : C reactive protein; *p<0.05

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) Pancreas-Kidney Kidney transplantation Controls SPKT vs KT SPKT vs transplantation (p) controls (p) N 15 16 10 age (years) 33 (31-35) 42 (38-50) 46 (39-50) 0.001* 0.001* male/female 4/11 9/7 3/7 0.095 0.601 BMI (kg/m2) 21.0 (20.0-22.0) 22.5 (20.5-25.8) 25.8 (22.7-27.9) 0.108 0.001* Waist circumference (cm) 81 (77-88) 90 (76-94) 95 (84-102) 0.149 0.014* SBP (mmHg) 135 (120-139) 136 (199-140) 117 (107-131) 0.693 0.052 DBP (mmHg) 78 (69-86) 85 (74-93) 75 (61-83) 0.145 0.533 tacrolimus (ug/L) 8.0 (7.7-11.5) 8.5 (7.7-9.9) 0.337 MMF AUC (mg.h/L) 53 (46-76) 56 (53-62) 0.463 steroid treatment (%) 15 (100) 13 (81) 0.211 HbA1c (%) 5.5 (5.0-5.7) 5.3 (5.2-5.5) 5.3 (5.0-5.7) 0.715 0.547 creatinine (µmol/L) 83 (70-112) 119 (111-135) 67 (56-74) 0.020* 0.001* Iohexol Clearance 62.5 (49.3-70.8) 54.5 (42.8-64.5) 99.5 (83-106) 0.739 0.001* (ml/min/1.73m2) proteinuria (g/day) 0.11 (0.05-0.13) 0.11 (0.00-0.22) 0.04 (0-0.10) 0.921 0.052 hemoglobin (g/L) 126 (118-143) 133 (121-145) 133 (125-148) 0.923 0.453 CRP (mg/L) 2.9 (2.9-2.9) 2.9 (1.3-2.9) 2.9 (2.9-3.5) 0.057 0.170

Table 1b. Clinical and biological characteristics of controls and patients one year after transplantation

Median and interquartile ranges. Student T-tests. Abbreviations. BMI : Body mass index; HbA1c : glycated hemoglobin, CRP : C reactive protein; SBP : systolic blood pressure; DBP : diastolic blood pressure; MMF : Mycophenolate mofetil; AUC : area under the curve; SPKT : simultaneous pancreas kidney transplantation; KT : kidney transplantation; * p<0.05.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) SPKT KT Controls SPKT vs KT SPKT vs KT vs controls controls p p p Glc T0 4.8 (4.6-5.2) 4.8 (4.6-5.0) 4.6 (3.8-4.9) 0.228 0.046* 0.270 Ins T0 12.0 (10.5-16.0) 8.0 (6.0-8.5) 6.5 (5.3-11.3) 0.001* 0.004* 0.779 Glc T120 7.7 (5.8-8.6) 6.2 (5.4-7.1) 5.0 (4.5-5.8) 0.152 0.009* 0.038* Ins T120 53.5 (29.8-70.0) 35.5 (20.5-48.8) 32.0 (22.0-67.0) 0.066 0.357 0.494 Glc T180 5.2 (4.7-6.5) 4.3 (3.8-5.2) 4.3 (4.0-4.6) 0.038* 0.027* 0.803 Ins T180 20.5 (14.3-34.3) 9.0 (6.0-19.0) 16.0 (7.5-22.3) 0.020* 0.101 0.491 Glc T240 5.4 (4.3-6.3) 4.0 (3.7-4.4) 3.5 (2.6-3.8) 0.001* 0.001* 0.089 Ins T240 17.5 (10.3-22.3) 5.0 (4.0-6.0) 6.0 (3.3-8.8) 0.001* 0.009* 0.240

Table 2a. OGTT parameters at T0 T120 T180 and T240 min.

SPKT KT Controls SPKT vs KT p Cpep T30 3.3 (2.5-4.1) 5.3 (4.6-6.7) 3.3 (2.8-5.6) 0.001* Cpep T60 4.9 (3.9-5.3) 8.2 (7.0-9.3) 6.6 (4.6-8.9) 0.009* Cpep T90 5.4 (4.7-6.8) 8.0 (7.1-9.4) 6.2 (4.4-9.0) 0.003* Cpep T120 5.6 (4.7-7.4) 8.0 (6.4-9.5) 5.6 (3.7-9.0) 0.039*

Table 2b. C-peptide values from T30 to T120 min.

Median and interquartile ranges. Student T-test results. No significance for T-test between PKT and controls. Abbreviations : Glc: glucose in mmol/L; Ins: insulin in mUI/L; Cpep: c-peptide in ug/L; SPKT: simultaneous pancreas kidney transplantation; KT: kidney transplantation; T0: time 0, T120: time 120 minutes; T180: time 180 minutes. OGTT: oral glucose tolerance test ; *p<0.05 59

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) SPKT D0 KT D0 p

Total BA (µmol/L) 6.00 (4.40-8.00) 4.75 (1.63-6.43) 0.281 CA (µmol/L) 0.80 (0.30-1.30) 1.40 (0.85-2.72) 0.054 CA (%) 11.5 22.6 0.017* CDCA (µmol/L) 1.70 (0.60-2.80) 1.95 (0.90-3.08) 0.344 CDCA (%) 30.5 24.2 0.844 DCA (µmol/L) 2.10 (1.50-2.30) 0.75 (0.33-1.70) 0.013* DCA (%) 33.6 13.8 0.001* LCA (µmol/L) 0.20 (0.00-0.50) 0.35 (0.10-0.90) 0.179 LCA (%) 2.70 8.6 0.119 UDCA (µmol/L) 0.80 (0.80-1.00) 0.80 (0.60-1.48) 0.629 UDCA (%) 16.5 14.8 0.467

Table 3a. Bile acid concentrations and pool composition before transplantation

Median and interquartile ranges. Student T-test results. Abbreviations. BA: bile acids; CA: Cholic acid; CDCA: Chenodeoxycolic acid; DCA: Deoxycholic acid; LCA: Lithocholic acid; UDCA: Ursodeoxycholic acid; SPKT: pancreas kidney transplantation; KT: kidney transplantation; D0: day of transplantation; * p<0.05.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) Pancreas-Kidney Kidney transplantation Controls SPKT vs KT SPKT vs controls transplantation p p N 15 16 10 Total bile acids (µmol/L) 5.60 (3.30-9.30) 4.60 (4.03-6.23) 5.1 (4.4-7.7) 0.226 0.478 CA (µmol/L) 0.80 (0.60-1.80) 0.65 (0.60-1.30) 0.65 (0.45-1.95) 0.747 0.715 CA (%) 13.6 16.5 14.3 0.761 0.947 CDCA (µmol/L) 2.70 (1.10-4.00) 2.00 (1.53-3.05) 1.80 (0.98-3.30) 0.291 0.398 CDCA (%) 36.9 42.5 35.7 0.304 0.570 DCA (µmol/L) 1.00 (0.70-2.50) 0.50 (0.23-0.98) 1.60 (1.10-1.88) 0.111 0.398 DCA (%) 24.0 9.9 25.9 0.005* 0.550 LCA (µmol/L) 0.10 (0.10-0.10) 0.20 (0.10-0.40) 0.10 (0.00-0.13) 0.002* 0.357 LCA (%) 1.1 2.7 1.75 0.003* 0.216 UDCA (µmol/L) 0.80 (0.60-1.60) 1.05 (0.83-1.55) 0.95 (0.58-1.20) 0.871 0.440 UDCA (%) 17.5 23.4 15.5 0.179 0.329

Table 3b. Bile acids concentrations and pool composition of controls and patients one year after transplantation

Median and interquartile ranges. Student T-test results. Abbreviations: CA : Cholic acid; CDCA : Chenodeoxycolic acid; DCA : Deoxycholic acid; LCA : Lithocholic acid; UDCA : Ursodeoxycholic acid; SPKT : simultaneous pancreas kidney transplantation; KT : kidney transplantation;* p<0.05.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0)

%CDCA %CA %DCA %UDCA %BA %BA I II T60 insulin r 0,580 0,226 -0,696 -0,154 0,669 -0,765 p 0,0375* 0,4580 0,0082** 0,6148 0,0125* 0,0023** T90 insulin r 0,262 0,595 -0,682 -0,096 0,517 -0,618 p 0,3659 0,0249* 0,0072** 0,7446 0,0583 0,0184* T180 glc mmol/l r -0,602 -0,292 0,440 0,555 -0,553 0,583 p 0,0293* 0,3337 0,1323 0,0489* 0,0500* 0,0364*

Table 4. Spearman correlations between BA proportions and OGTT parameters in SPKT group. Abbreviations: BA: bile acids, I: primary; II: secondary; CA: cholic acid; CDCA: chenodeoxycholic acid; DCA: deoxycholic acid; UDCA: ursodeoxycholic acid; OGTT: oral glucose test tolerance; T: time in minutes; glc: glucose; ins: insulin; r: correlation factor. *p<0.05 **p<0.01

SPKT D0 SPKT Y1 p Total BA (µmol/L) 6.00 (4.40-8.00) 5.60 (3.30-9.30) 0.325 CA (µmol/L) 0.80 (0.30-1.30) 0.80 (0.60-1.80) 0.552 CA (%) 11.5 13.6 0.167 CDCA (µmol/L) 1.70 (0.60-2.80) 2.70 (1.10-4.00) 0.448 CDCA (%) 30.5 36.9 0.318 DCA (µmol/L) 2.10 (1.50-2.30) 1.00 (0.70-2.50) 0.486 DCA (%) 33.6 24.0 0.525 LCA (µmol/L) 0.20 (0.00-0.50) 0.10 (0.10-0.10) 0.003* LCA (%) 2.70 1.1 0.010* UDCA (µmol/L) 0.80 (0.80-1.00) 0.80 (0.60-1.60) 0.503 UDCA (%) 16.5 17.5 0.774

Supplement table. Bile acid pool composition before and one year after transplantation (median and interquartile ranges).

Abbreviations. BA : bile acids; CA : Cholic acid; CDCA : Chenodeoxycolic acid; DCA : Deoxycholic acid; LCA : Lithocholic acid; UDCA : Ursodeoxycholic acid; SPKT : simultaneous pancreas kidney transplantation; D0 : day of transplantation; Y1 : one year after transplantation; * p<0.05.

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0)

Figure 8a. Glucose concentrations (mmol/L) during oral glucose tolerance test, in SPKT and KT groups one year after transplantation, and in controls groups. Student T-tests * SPKT vs KT SPKT vs controls KT vs controls Abbreviations: SPKT: simultaneous pancreas kidney transplantation ; KT kidney transplantation ; T time (min)

Figure 8b. Insulin concentrations (mUI/L) during oral glucose tolerance test, in PKT and KT groups one year after transplantation, and in controls groups. Student T-tests * SPKT vs KT SPKT vs controls Abbreviations: SPKT: simultaneous pancreas kidney transplantation ; KT kidney transplantation ; T time (min)

63 FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0)

Figure 8c. C-peptide concentrations (µg/L) during oral glucose tolerance test, in PKT and KT groups one year after transplantation, and in controls groups. Student T-tests * SPKT vs KT Abbreviations: SPKT: simultaneous pancreas kidney transplantation ; KT kidney transplantation ; T time (min)

HOMA IR 5,0 60,0 IGI 4,5 40,0 4,0

3,5 20,0 3,0

2,5 0,0 2,0

1,5 -20,0

1,0 * -40,0 0,5  0,0 -60,0 PKT KT KD PKT KT KD

Figure 9. Insulin resistance evaluated by HOMA IR index and insulin secretion evaluated with IGI index one year after transplantation and in controls group. Boxplots representations. Student T-tests * SPKT vs KT SPKT vs controls Minimums, quartiles 1, medians, quartiles 3, maximums. Abbreviations: HOMA-IR: homeostasis model assessment of insulin resistance; IGI: insulinogenic index; SPKT simultaneous pancreas kidney transplantation; KT kidney transplantation

64 FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0)

Bile acid pool composition

D0 One year after transplantation

Pancreas Kidney Transplantion

Kidney Transplantation

Controls

Figure 10. Effect of transplantation on bile acid pool composition. D0 : day of transplantation or of medical visit for donors

65 FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0)

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Nom, prénom du candidat : Fournie Coralie

CONCLUSIONS

La transplantation combinée rein-pancréas est le traitement de choix pour les patients diabétiques de type 1 présentant une insuffisance rénale chronique (IRC) et permet d'améliorer le contrôle glycémique et la survie et la qualité de vie de ces patients. Bien que les résultats de cette transplantation soient très encourageants, il persiste chez ces patients un certain degré de perturbations de l’action de l’insuline et de fonction bêta-pancréatique dont les mécanismes ne sont pas encore clairement définis. La technique chirurgicale actuelle est une transplantation hétérotopique avec une anastomose ectopique (iléale) du moignon duodénal prélevé avec le pancréas du donneur et drainage veineux systémique. La déversion iléale du suc pancréatique pourrait modifier les propriétés physicochimiques des sécrétions intestinales, et avoir un impact sur le métabolisme des acides biliaires (AB), la sécrétion des incrétines ainsi que la flore microbienne. Les AB sont produits dans le foie (AB primaires : acide cholique (AC) et chenodeoxycholique (CDCA)) et subissent plusieurs transformations avec notamment l’intervention de la flore intestinale permettant la formation des AB secondaires (acide lithocholique (LCA) et deoxycholique (DCA)) et sont constamment renouvelés grâce au cycle entéro hépatique. Il est actuellement reconnu que les AB possèdent un rôle important de médiateur métabolique, intervenant dans le maintien de l'homéostasie glucidique, en modulant la sécrétion des incrétines Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) et fibroblast growth factor-19 (FGF19), en agissant sur des récepteurs spécifiques. Ces effets sont variables en fonction des espèces d’AB (primaires ou secondaires) et de leur profil (hydrophile ou hydrophobe).

66 FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0)

------Dans cette étude pilote monocentrique, nous avons inclus de façon prospective trois groupes de sujets : transplantés rein-pancréas SPKT (n=15), transplantés rénaux KT (n=16), témoins sains contrôles (n=10), dans le département de transplantation de l'Hôpital Edouard Herriot. Nous avons étudié la composition quantitative et qualitative d'acides biliaires avant et un an après la transplantation, ainsi que leur corrélation aux différents paramètres de métabolisme glucidique : HbA1c, glycémie à jeun et aux différents temps au cours de l’hyperglycémie provoquée par voie orale (HGPO) à un an post transplantation.

Le groupe SPKT était plus jeune par rapport aux KT et contrôles. Comme précédemment décrit, les données de l’HGPO montrent un retard au retour à la normale de la glycémie après une charge glucidique chez les SPKT et une hyperinsulinémie à jeun persistante en fin d'HGPO par rapport aux deux autres groupes. Nous ne retrouvons pas de modification de la concentration totale des AB chez les SPKT. Par contre l'étude de la composition en AB met en évidence des différences de profils : les patients SPKT ont une proportion plus faible d'AB hydrophiles (AC) et un pourcentage élevé d'ADC avant transplantation par rapport aux patients non diabétiques. Nous retrouvons ensuite une diminution significative de la concentration en ALC chez les patients transplantés pancréatiques un an après transplantation. Il existe une corrélation négative entre la glycémie à T180 et la proportion d'AB primaires et positive avec celle d'AB secondaires ; et une corrélation positive à T60 et 90 minutes entre l’insulinémie et la proportion d'AB primaires à T90 et négative avec celle d'AB secondaires. Nous ne retrouvons pas de corrélation entre les AB et l’HbA1c, la glycémie à jeun et à T120. Le profil particulier avec faible proportion des AB primaires et hydrophiles des patients diabétiques de type 1, et la modification du pourcentage d'ALC après transplantation pancréatique pourrait expliquer en partie l'intolérance au glucose persistant en l'absence de dysfonction du greffon pancréatique.

67 FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0)

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77 FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) LE SERMENT D'HIPPOCRATE

Je promets et je jure d'être fidèle aux lois de l’honneur et de la probité́ dans l'exercice de la Médecine. , sans discrimination.

Je respecterai toutes les personnes, leur autonomie et leur volonté

J'interviendrai pour les protégerme sous si elles la contrainte, sont vulnérables je ne ferai ou menacées pas usage dans de mes leur intégrité ou leur dignité. Mê connaissances contre les lois de l'humanité. J'informerai l

es patients des décisions envisagées, de leurs raisons et de leurs conséquences. Je ne tromperai jamais leur confiance. je n'exigerai pas un salaire au-dessus de mon travail.Je donnerai mes soins à l'indigent et

Admis dans l'intimité des personnes, je tairai les secrets qui me seront confiés et ma conduite ne servira pas à corrompre les mœurs. Je ferai tout pour soulager les souffrances. Je ne prolongerai pas abusivement la vie ni ne

provoquerai délibérément la mort.

Je préserverai l'indépendance nécessaire et je n'entreprendrai rien qui dépasse mes compétences. Je perfectionnerai mes connaissances pour assurer au mieux ma mission.

Quecouvert les d'opprobrehommes m'accordent leur estime si je suis fidèle à mes promesses. Que je sois et méprisé si j'y manque.

78 FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0)

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0) Coralie Fournie : IMPACT DE LA TRANSPLANTATION PANCRÉATICO DUODÉNALE SUR LE MÉTABOLISME DES ACIDES BILIAIRES ET DES INCRÉTINES

5 tables, 10 figures, 78 pages Thèse de Médecine : Lyon 2017 n°139

RÉSUMÉ : Introduction : La transplantation rein-pancréas restaure une sécrétion endogène d'insuline et des glycémies normales chez les patients diabétiques de type 1 (DT1) avec insuffisance rénale terminale. Cependant il persiste une hyperinsulinémie avec insulino-résistance périphérique. L'anastomose ectopique avec déversion iléale des sucs pancréatiques pourrait modifier les propriétés physico chimiques du liquide digestif, donc des facteurs métaboliques digestifs. Sont concernés : les incrétines et les acides biliaires (AB), régulateurs du métabolisme du glucose.

Méthodes : Il s'agit d'une étude pilote prospective monocentrique menée de septembre 2013 à février 2017. L’objectif est d’évaluer l'effet de la transplantation pancréatique (n=15) à un an sur la concentration et la composition des AB, comparées à celles de transplantés rénaux (n=16) et de donneurs vivants (n=10). Un test d'hyperglycémie provoquée orale (HGPO) a été réalisé pour explorer les troubles de régulation de l'homéostasie du glucose : glycémies, insulinémies, peptide-c, fibroblast growth factor 19 (FGF19) et glucagon like peptide-1 (GLP-1).

Résultats : Un an après transplantation pancréatique, les valeurs d'hémoglobine glyquée et glycémie à jeun sont normales, mais il existe une hyperinsulinémie basale persistant en fin d'HGPO, et un retour lent aux valeurs de base des glycémies après stimulation, par rapport aux transplantés reins et contrôles. La concentration totale d'AB n'est pas modifiée. Avant transplantation, les patients DT1 ont une proportion plus élevée d'acide déoxycholique et plus faible d'acide cholique versus rein seul. La proportion d'acide lithocholique diminue après transplantation pancréatique et est inférieure dans le groupe rein-pancréas versus rein seul. La glycémie à T180 est associée négativement à la proportion d'AB primaires et positivement à celle d'AB secondaires. Inversement l'insulinémie à T60 et T90 est associée positivement à la proportion d'AB primaires et négativement à celle d’AB secondaires.

Conclusion : Nous confirmons que les patients transplantés rein-pancréas présentent une HGPO perturbée. Nous décrivons un profil d'AB différent chez les patients DT1 avant transplantation, qui se modifie après transplantation pancréatique. L'influence de ce profil sur les voies métaboliques AB-dépendantes à travers la modification des concentrations de FGF19 et GLP-1 est en cours d'investigation.

MOTS-CLÉS : Acides biliaires, Transplantation pancréatique, Métabolisme glucose, Insuline, Incrétines, Diabète

JURY : Président : Monsieur le Professeur Emmanuel Morelon Membres : Monsieur le Professeur Lionel Badet Monsieur le Professeur Olivier Thaunat Madame le Professeur Fitsum Guebre-Egziabher, Directrice de Thèse Madame le Docteur Sandrine Lemoine

DATE DE SOUTENANCE : 15 septembre 2017

ADRESSE DE L'AUTEUR : 136 rue du Docteur Edmond Locard 69005 Lyon

FOURNIE (CC BY-NC-ND 2.0)