Diversidad Genética En El Manjuarí (Atractosteus Tristoechus; Bloch Y Schneider, 1801; Actinopterygii: Lepisosteidae) E Implicaciones Para El Manejo

Un endémico en riesgo: Diversidad genética en el manjuarí (Atractosteus tristoechus; Bloch y Schneider, 1801; Actinopterygii: Lepisosteidae) e implicaciones para el manejo.

Item Type Thesis/Dissertation

Authors Ulmo Díaz, Gabriela

Publisher Centro de Investigaciones Marinas, Universidad de la Habana

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Un endémico en riesgo: Diversidad genética en el manjuarí (Atractosteus tristoechus; Bloch y Schneider, 1801; Actinopterygii: Lepisosteidae) e implicaciones para el manejo

Tesis presentada en opción al Título Académico de Maestro en Biología Marina y Acuicultura con Mención en Ecología Marina

Gabriela Ulmo Díaz

Ciudad de La Habana 2016

Un endémico en riesgo: Diversidad genética en el manjuarí (Atractosteus tristoechus; Bloch y Schneider, 1801; Actinopterygii: Lepisosteidae) e implicaciones para el manejo

Tesis presentada en opción al Título Académico de Maestro en Biología Marina y Acuicultura con Mención en Ecología Marina

Autor: Lic. Gabriela Ulmo Díaz

Tutores: Dra. Jessy Castellanos-Gell Dr. Erik García-Machado

Asesor: M.C. Andrés Hurtado

Ciudad de La Habana 2016

Al manjuaricito, con su sonrisa invertida

Agradecimientos

Esto puede parecer un poco largo, pero creo que soy muy afortunada por tener tantas personas a quién agradecer. Como son tantas y son importantes en mi vida de diferentes maneras, he decidido redactar en orden cronológico.

A la primera persona que quiero agradecer es a mi mamá, y no hay nada que pueda decir que exprese lo que ha sido su influencia en mi vida. Es una mujer valiente, inteligente y hermosa, me ama incondicionalmente y ha hecho siempre lo que cree es mejor para mí. Aunque a veces no estemos de acuerdo, sé que sólo quiere que sea feliz.

Quiero agradecer a mi papá, con el que comparto tantas virtudes y defectos, y que siempre ha creído en mí.

También se merecen un lugar enorme en mi corazón Tony y la Cuquita, que más que ser las parejas de mis padres son mis padres ellos mismos, mis amigos, dos personas que, con sus defectos y virtudes, me enorgullezco de llamar familia. Los adoro, y soy muy afortunada de tenerlos en mi vida.

A mis abuelos: Luisito y Luis, que llenaron mi infancia con sus cuentos de tiburones y de leones, mi primer acercamiento a la biología marina y mis primeras aventuras respectivamente, y son uno de los más hermosos y vívidos recuerdos de mi infancia. Con ambos comparto el amor a los libros y al cine, y quiero creer que hay en mí más de la tolerancia y la comprensión que los caracteriza de lo que muestro.

A mis abuelas, que como todas las otras mujeres de mi familia me enseñaron el valor del trabajo. A mi abuela Leticia por sus croquetas de pescado y su fortaleza y a mi abuela Marta por sus labores de costura, por su comprensión, sinceridad, desenfado y generosidad.

A mis tíos, a todos, que son muchos, pero todos maravillosos y siempre han estado ahí para mí. Mi tío Luisito y mi tía Mercy, tía Tata, tía Yazmín, mis tíos Yiyi y Jhonny. Todos se preocuparon por mí desde pequeña, y lo que soy hoy se lo debo a todo el amor que me dieron siempre.

A Camila, que más que mi tía es mi hermana, con ella he compartido todo, y sé que no hay persona más buena, dulce y especial que ella. Por ser la beba más bella del planeta.

Mis primos, Giselle y Jorgito, a los dos los cargué de niños y estoy algo envidiosa de que ya ambos me sacan una cabeza, jejeje. Los quiero mucho y estoy orgullosa de ustedes.

A Marilú, otra mamá sustituta, de la que he aprendido tanto y a la que quiero tanto.

A mi tía Ali, que desde Jiguaní manda el mejor sofrito del mundo.

A Alfredo y a Yolanda, por los almuerzos de domingo y por esa risa de Yoli.

A la familia que conocí hace poco, pero que fue como si les conociera de siempre. Mis tíos Maickel, Normita, Grettel, la preciosa Lola, con su gran personalidad y el buenote de Lucas.

A tía América y a Yoyo, que demuestran que la familia es la gente que te quiere.

Y a José y José Enrique y Lisset, esa otra familia de La Víbora. AGRADECIMIENTOS

A mis amigos, que son los que me mantienen lejos del psiquiatra, mis hermanos Tommy, el Perecito y Sergio, a todos los de la Lenin: Yeni, Grettel, Maricet, Paloma, Cynthia, Guzmi, Frank. A mi otro yo trigueño, la López. A mi grupo de Bioquímica: Ariel, Casuso, Kike, Felito, Chuchi, Mariacarla, Lilita, Yeny, Elenita, Alinita, Anabel, Leli, Ana Martha, Haydeé y Anaixis. A todos los quiero mucho, y a los agregados, el Gabo, Daily, Anabel, Oslandy, y los sobrinos Fabián y Paulita. También a Rubencito, a Edu, a Jessica, a Jenny, a David y a Carlos Llapur. A Oski y a Dachel.

A todos mis profesores de la carrera y de la maestría, pero especialmente a Mey y a Maday, que me enseñaron tanto de ciencia como de la vida.

A todos los trabajadores del CIM, a todos, a Ela, la mejor secretaria del planeta, Laura, Melba (gracias por preocuparte por mí siempre), Daugmara, el Flaco, a Lázaro.

A Yuriem y a Camila, por ser tan eficientes y amables, tan dulces y educadas siempre, si todo el mundo fuera como ustedes el planeta tendría muchos menos problemas.

A los buzos, el Coco con sus locuras, Iván que lo arregla todo, Pedrito que es tan bueno, y a Lachi, por ser el tipo de persona que merece que ponga mi vida en sus manos.

Las profes Ana y Betty, la profe Tsai, por todas las buenas clases y su buen ánimo para todo. A Maickel por no ponerse bravo cada vez que voy a interrumpirlo por preguntar cualquier cosa. A Zenaida a la que también molesto con preguntas de vez en cuando.

A todos aquellos que hacen que venir al CIM no sea un trabajo, en vez de ello, es algo que me gusta: Amanda, Emma, Víctor, Betty, Gaby, Volta, Anmari, Laura, Adrián y Leandro. Muchos de ustedes comparten mi locura gatuna, gracias por el apoyo.

A José Andrés y a Alexeis, por todo el apoyo, los buenos momentos, las risas compartidas, por ser tan divertidos y siempre dar una mano, ambos tienen un corazón de oro. A algunos que ya no están, pero sí en mi corazón, mi Rosa, Dania, la mejor amiga del mundo, y Ari, a pesar de todo.

El profe Jorge, que me dio su apoyo y me abrió las puertas del centro sin conocerme, gracias por la confianza.

La profe Patricia, que me ha apoyado tanto y me ha honrado con su confianza, culta, inteligente, y al mismo tiempo dulce y bien humorada.

A mis tutores. A Erik, por darme tanto más, y hacerme tan feliz; y a Jessy, por ser mi primera amiga en el centro, ser una persona excelente, dulce, amable, inteligente, paciente, siempre con una sonrisa. Ella fue la que me enseñó a trabajar en el labo, cuando yo venía de trabajar con proteínas, fue y es comprensiva conmigo. Además, es uno de esos extraños seres que te llenan de confianza y con los que puedes compartir hasta tu lado más espiritual. Tal vez tú no te acuerdes, pero yo siempre te agradeceré una conversación una tarde en el Felipe.

A mi oponente, una autoridad en éste tema en Cuba, y alguien admirable.

Y por supuesto, todo mi agradecimiento a Andrés Hurtado, sin el cual esta investigación no hubiera sido posible.

A Miércoles, Filipo y Macavity, y a la boba, que en paz descanse.

Resumen

Atractosteus tristoechus (nombre común: manjuarí), es una especie endémica de Cuba. Es una de las más amenazadas del orden Lepisosteiformes y la que presenta menor distribución natural. Este pez de agua dulce se encuentra restringido a la Ciénaga de Zapata, donde se encuentra la mayor población (Poey, 1854; Alfonso y Gutiérrez, 1995), la Ciénaga de Lanier y el sur de la provincia Pinar del Río. Esta investigación se centra en la caracterización genética de las poblaciones cautiva y natural de la Ciénaga de Zapata, mediante marcadores mitocondriales (gen Citocromo Oxidasa I y Región de Control) y nucleares (nueve loci microsatélites). Un total de 47 individuos se incluyeron en este estudio. Se detectó escasa variabilidad genética en ambos marcadores empleados. Esto se manifestó a nivel mitocondrial en valores de diversidad haplotípica de h=0,202 ± 0,077 y de diversidad nucleotídica de π=0,00021 ± 0,00008. De manera similar, el valor estimado de heterocigosidad observada (Ho =0,016) fue bajo para los loci microsatélites analizados. El coeficiente de endogamia para los reproductores del Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena fue de 0,7 ± 0,18 y para los individuos de la población natural fue de 0,88 ± 0,06. Comparativamente con otros lepisosteidos estudiados esta especie es la que muestra los niveles más bajos de diversidad genética. Dichos valores sugieren que la especie sufrió un cuello de botella y que, en consecuencia, tiene un tamaño efectivo poblacional pequeño. Dada la crítica situación inferida a partir de los resultados de este estudio, se hace evidente la necesidad de atención particular hacia la especie y de incrementar los esfuerzos para su conservación.

Palabras clave: Atractosteus sp., Genética para la Conservación, manejo genético en cautiverio.

III

Abstract

Atractosteus tristoechus (common name: Cuban gar) is an endemic species of Cuba. Among the members of the order Lepisosteiformes, this species is one of the most threatened and has the lowest natural distribution range. This freshwater fish is restricted to Zapata´s Swamp, with the largest population (Poey, 1854; Alfonso and Gutiérrez, 1995), to Lanier´s Swamp and to the south low lands of Pinar del Río province. This research is focused on the genetic characterization of captive and wild populations of Zapata´s Swamp, using mitochondrial (Citochrome Oxidase I gen and Control Region) and nuclear markers (nine microsatellite loci). A total of 47 individuals were included in the study. Low genetic variability was detected with both markers. The mitochondrial DNA sequences showed values of haplotipic diversity of h=0,202 ± 0,077 and of nucleotide diversity of π=0,00021 ± 0,00008. Similarly, the observed heterozygosity (Ho = 0.016) estimated from the microsatellite loci was very low. The inbreeding coefficient estimated for Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena´s founders and the wild population were 0,7 ± 0,18 and 0,88 ± 0,06 respectively. Among the lepisosteids studied so far, this species is the less genetically variable. The results strongly suggest that the species have a low effective population size probably due to a bottleneck event. Given the critical situation of this species, inferred from the results of this study, the need for special attention and increase of conservation efforts are evident.

Keywords: Atractosteus sp., Conservation Genetics, genetic management in captivity.

ÍNDICE

Agradecimientos...... I Resumen…………………………………………………………………………………………III Abstract…………………………………………………………………………………………..IV 1. Introducción…………………………………………………………………………………..1 2. Revisión Bibliográfica………………………………………………………………………4 2.1. Generalidades de la familia Lepisosteidae (Cuvier,1825)……………………………….4 2.1.1 Características biológicas del manjuarí (Atractosteus tristoechus)………………………………...... 6 2.1.2 Estudios genéticos y marcadores moleculares en lepisosteidos……………………………………………………………8 2.2. Marcadores moleculares………………………………………………………………………….10 2.2.1 ADN mitocondrial…………………………………………………………………………………………………………………………………10 2.2.2 ADN microsatélite………………………………………………………………………………………………………………………………..10 2.3. Genética para la conservación y manejo de especies en peligro de extinción…11

3. Materiales y Métodos……………………………………………………………………..13 3.1. Recolecta del material biológico……………………………………………………………….13 3.2. Procesamiento de las muestras………………………………………………………………..14 3.2.1 Extracción del ADN total………………………………………………………………………………………………………………………14 3.2.2 Amplificación de genes mitocondriales……………………………………………………………………………………………….14 3.2.3 Purificación del producto de la amplificación………………………………………………………………………………………15 3.2.4 Secuenciación del ADN………………………………………………………………………………………………………….15 3.2.5 Amplificación de ADN microsatélite……………………………………………………...... 16 3.2.6 Identificación de alelos………………………………………………………………………………………………………………………..17 3.3. Procesamiento estadístico……………………………………………………………………….17 3.3.1 ADN mitocondrial…………………………………………………………………………………………………………………………………17 3.3.2 ADN microsatélite……………………………………………………………………………………………………………...... 18

4. Resultados……………………………………………………………………………………20 4.1. ADN mitocondrial……………………………………………………………………………………20 4.2. ADN microsatélite…………………………………………………………………………………..22

5. Discusión……………………………………………………………………………………..24 5.1. Estructura poblacional, diversidad genética y demografía……………………………24 5.1.1 ADN mitocondrial…………………………………………………………………………………………………………………………………24 5.1.2 ADN microsatélite………………………………………………………………………………………………………………………………..27 5.1.3 Demografía………………………………………………………………………………………………………………………………………….29 5.2. Implicaciones para el manejo y la conservación………………………………………….30

6. Conclusiones………………………………………………………………………………..33 7. Recomendaciones…………………………………………………………………………34 Literatura citada………………………………………………………………………………..V Anexos…………………………………………………………………………………………XIII

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1…………………………………………………………………………………………………………4 Las siete especies vivientes de lepisosteidos. (A) Atractosteus spatula. (B) A. tristoechus. (C) A. tropicus. (D) Lepisosteus osseus. (E) L. platyrhincus. (F) L. platostomus. (G) L. oculatus. Modificado de Wrigth et al., (2012). Figura 2……………………………………………………………………………………………………….13 Localidades de recolecta de A. tristoechus en la Ciénaga de Zapata. Entre paréntesis se muestra el número de individuos muestreado en cada punto. Los puntos negros representan poblaciones naturales y el gris la población cautiva. A: Arroyones, CRII: Centro de Reproducción de la Ictiofauna Indígena, FC: Fiesta Campesina, GG: Guanal Grande, LT: Boca de Guamá-Laguna del Tesoro, ST: Zanja de Santo Tomás. Figura 3……………………………………………………………………………………………………….20 Red de haplotipos elaborada con 999 pb de la región de control del ADNmt y el gen COI para A. tristoechus, provenientes de la población natural de la Ciénaga de Zapata y el Centro de Reproducción para la Ictiofauna Indígena. La N indica la frecuencia absoluta de cada haplotipo. Figura 4……………………………………………………………………………………………………….21 Distribución de los haplotipos de ADN mitocondrial. Entre paréntesis se muestran los haplotipos encontrados en cada localidad. Los puntos negros representan poblaciones naturales y el gris la población cautiva. A: Arroyones, CRII: Centro de Reproducción de la Ictiofauna Indígena, FC: Fiesta Campesina, GG: Guanal Grande, LT: Boca de Guamá-Laguna del Tesoro, ST: Zanja de Santo Tomás. Figura 5……………………………………………………………………………………………………….21 Red de haplotipos elaborada con 535 pb del gen COI para A. tristoechus, provenientes de la población natural de la Ciénaga de Zapata, el Centro de Reproducción para la Ictiofauna Indígena y secuencias de GenBank (Wright et al. 2012). N indica la frecuencia absoluta de cada haplotipo Cuando el número de sustituciones nucleotídicas fue mayor que uno el valor se indicó en la rama correspondiente. Figura 6……………………………………………………………………………………………………….25 Mapa de distribución de las especies continentales de lepisosteidos vivientes. En el mapa superior a la derecha se observa la distribución superpuesta de todas las especies; A. L. platostomus, B. L osseus, C. A. spatula, D. L. oculatus (negro) y L. platyrhincus (rayado), E. A. tropicus. Modificado de Sipiorski (2011).

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1………………………………………………………………………………………………………….9 Resumen de la diversidad genética encontrada en lepisosteidos mediante marcadores mitocondriales. Citocromo b (cytb), Citocromo oxidasa I (COI), Citocromo oxidasa II (COII), ARN ribosomal 16S (16S), Región no codificadora (RNC). Tabla 2………………………………………………………………………………………………………..15 Cebadores de amplificación y secuenciación de los fragmentos de ADN mitocondrial RNC (Sipiorski, 2011) y COI (Hebert et al., 2003). (F: Directo; R: Reverso). Tabla 3………………………………………………………………………………………………………..16 Cebadores de amplificación y secuenciación de los loci microsatélites descritos por Moyer et al. (2009) para A. spatula (F: Directo; R: Reverso). Los colores en cada fluorocromo corresponden con el color del cromóforo utilizado. Tabla 4………………………………………………………………………………………………………..23 Índices de variabilidad genética estimados mediante loci microsatélites. Entre paréntesis, valor del estadístico calculado sólo para el locus polimórfico Asp 341. Rs: Riqueza alélica. Ho:

Heterocigosidad observada ± Desviación Estándar, He: Heterocigosidad esperada ± Desviación

Estándar, Ht: Heterocigosidad total, FIS: Estimados del índice de fijación FIS empleados para comprobar el ajuste al equilibrio genético de Hardy-Weinberg luego de aplicar la corrección de Bonferroni para el 5 % de nivel de significación (α=0,00278) mediante 360 permutaciones.

Introducción

El orden Lepisosteiformes tuvo gran diversidad y estuvo ampliamente distribuido durante el Cretácico, acorde evidencias del registro fósil (Cavin, 2010). La familia Lepisosteidae (Cuvier, 1825), única de este orden, comprende los manjuaríes o peces caimanes, también conocidos como pejelagartos, catanes, gaspares, garpikes o gars. En la actualidad se reconocen dos géneros, Atractosteus y Lepisosteus, representados por siete especies vivientes, restringidas a Norteamérica, Centroamérica y el Caribe (Wiley, 1976; Bussing, 1987). Conocido por el nombre común de manjuarí, la especie Atractosteus tristoechus (Bloch y Schneider, 1801) es endémica de Cuba y el único representante del orden Lepisosteiformes en el Caribe insular (Vergara, 1992a). Se encuentran reportes de la presencia de este pez en ríos, esteros, canales y lagunas de agua dulce en la región sur occidental de Cuba, principalmente en la Ciénaga de Zapata, donde se estima existen las mayores poblaciones, y en la Isla de la Juventud (Poey, 1854; Lee et al., 1983; Vergara, 1980; 1992a; 1992b; Alfonso y Gutiérrez, 1995). Las poblaciones de A. tristoechus se encuentran sometidas a elevado estrés ambiental debido tanto a la pérdida de hábitat (que se suma a la restricción espacial original) como a drásticas alteraciones ecológicas ocurridas en los mismos. Dichas alteraciones incluyen la transformación y degradación de los ecosistemas dulceacuícolas como consecuencia del desarrollo socioeconómico, la pesca indiscriminada tanto de la especie como de los peces que le sirven de alimento, así como la introducción de peces exóticos con fines comerciales (ie: Clarias sp.) que compiten por alimento y espacio, y depredan sus alevines (Prats, 2003; Comabella, 2011). Por esto se infiere que las poblaciones de A. tristoechus han desaparecido o disminuido su número drásticamente (Prats, 2003; Andrés Hurtado, com. pers.1). En la actualidad existen pocos estudios sobre los lepisosteidos al compararlos con otros órdenes de peces, siendo minoritarios los estudios relacionados con el manjuarí. La causa principal por la cual su estatus no ha sido evaluado por CITES (Convention on International Trade in Endangered Species) o la IUCN (International Union for Conservation of Nature) es el desconocimiento existente sobre la biología de la especie, así como sobre el estado de sus poblaciones naturales (Ibarra y Cotazo, 2003). No obstante, se han dado algunos pasos hacia el manejo de esta especie. Entre ellos podemos citar: 1) la creación del Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena en la Ciénaga de Zapata en 1990, dedicado a la reproducción ex situ y a la obtención de juveniles que se comercializan como peces

1. Andrés Hurtado. 2015. Director del Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena de la Ciénaga de Zapata. CITMA.

INTRODUCCIÓN ornamentales; 2) la prohibición de su captura de acuerdo con el Decreto Ley 164 del Ministerio de la Industria Pesquera. Además, se le otorgó el estatus de Vulnerable en el taller de Conservación, Análisis y Manejo Planificado realizado en La Habana en 1999 (Pérez et al., 1999) y el de En Peligro en el Libro Rojo de los Vertebrados de Cuba (Ponce de León et al., 2012). A pesar de estos avances, es necesario desarrollar planes de manejo y estrategias para elevar la supervivencia de esta especie tanto en vida libre como en cautiverio, por lo que es imprescindible ampliar el marco de las investigaciones que respondan a estos propósitos. Una de las aproximaciones que brindaría información útil en este sentido son los estudios que emplean caracteres moleculares para inferir diversidad y estructura genética de las poblaciones. Estudios anteriores (Wright et al., 2012) han mostrado polimorfismo nulo en las secuencias parciales de algunos genes nucleares de A. tristoechus (ENC1, myh6, plagl2, intrón 1 proteína ribosomal S7, sreb2, tbr1, zic1). Únicamente el gen mitocondrial que codifica para la enzima COI mostró polimorfismo (tres haplotipos). No obstante, es importante tener en cuenta que en dicho trabajo se incluyeron sólo tres ejemplares de manjuarí, extraídos del Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena de la Ciénaga de Zapata. De forma general, se han informado bajos niveles de diferenciación interespecífica en lepisosteidos utilizando el gen codificador de COI (Lara et al., 2010; Solomon, 2012). El uso de loci microsatélites se recomienda cuando otros marcadores no muestran un alto grado de polimorfismo (Mancera-Rodríguez et al., 2013). Moyer et al. (2009) aislaron un grupo de microsatélites para Atractosteus spatula, de los que varios presentaron amplificación cruzada en Atractosteus tropicus (Bohn et al., 2013). También en ambos trabajos se obtuvieron bajos valores de diversidad genética, con número promedio de alelos por locus de 4,82 (Moyer et al., 2009) y 3,00 (Bohn et al., 2013). El conocimiento de las poblaciones desde el punto de vista genético, de su variabilidad y de los procesos que las regulan, es vital para el establecimiento de planes de manejo y programas que minimicen el deterioro genético de estas, con objeto de reducir su riesgo de extinción (Frankham et al., 2010). Este trabajo pretende dilucidar el estado actual de las poblaciones de A. tristoechus en cautiverio y vida libre en la Ciénaga de Zapata, mediante el estudio de la variabilidad genética utilizando marcadores mitocondriales y loci microsatélites. Estos resultados aportan información sobre el estado de conservación de la especie, la estructura genética y la diversidad de las poblaciones de manjuarí. Con esta información es posible implementar estrategias de manejo en la población ex situ, lo que a largo plazo posibilitaría la reintroducción de la especie en su hábitat natural. Además, los resultados de este estudio pueden utilizarse como referencia para el manejo de la especie in situ. Sobre la base de las consideraciones anteriores acerca del estado actual de las poblaciones de manjuarí, en el presente trabajo nos planteamos la siguiente hipótesis:

INTRODUCCIÓN

El manjuarí, A. tristoechus, presenta bajos valores de diversidad genética y baja estructuración de la población natural de la Ciénaga de Zapata, así como alto grado de parentesco en la población cautiva del Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena de la Ciénaga de Zapata.

Objetivos de la Investigación

Objetivo general Evaluar la diversidad genética de las poblaciones naturales y en cautiverio de A. tristoechus en la Ciénaga de Zapata.

Objetivos específicos  Describir la estructura y diversidad genética de la población natural de la Ciénaga de Zapata empleando marcadores nucleares y mitocondriales.  Evaluar la variabilidad genética de la población cautiva de A. tristoechus del Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena de la Ciénaga de Zapata empleando marcadores nucleares y mitocondriales.  Determinar el grado de parentesco existente entre los individuos de la población cautiva de A. tristoechus.

2. Revisión bibliográfica

2.1. Generalidades de la familia Lepisosteidae (Cuvier,1825) Los fósiles más antiguos pertenecientes a la familia Lepisosteidae (orden Lepisosteiformes; Hay, 1929) datan del Cretácico (120 millones de años atrás) (Cavin, 2010; Alvarado- Ortega et al., 2016). Se tienen registros de numerosas especies que habitaron desde América del Norte y América del Sur hasta Madagascar incluyendo Europa, África e India (Grande, 2010). En la actualidad su distribución es mucho más limitada, con solo siete especies distribuidas en Norteamérica, Centroamérica y Cuba (Wiley, 1976). La sistemática de esta familia ha transitado por numerosos cambios donde destacan redefiniciones sinonímicas y reconocimiento de nuevos géneros. En 1825, Cuvier conforma la familia Lepisosteidae (Fig. 1). Sobre la base de un estudio comparativo de individuos fósiles y vivientes Wiley (1976) propuso dos géneros para la familia Lepisosteidae: Lepisosteus y Atractosteus.

Figura 1. Las siete especies vivientes de lepisosteidos. (A) Atractosteus spatula. (B) A. tristoechus. (C) A. tropicus. (D) Lepisosteus osseus. (E) L. platyrhincus. (F) L. platostomus. (G) L. oculatus. Modificado de Wrigth et al., (2012).

El género Atractosteus incluye tres especies: A. tristoechus (Bloch y Schneider, 1801; Cuba); A. spatula (Lacépède, 1803; EE.UU. y Centroamérica) y A. tropicus (Gill, 1863; Centroamérica). Los lepisosteidos son fácilmente reconocibles debido al cuerpo y mandíbulas alargadas (con una serie exterior de dientes pequeños, seguida por una o dos series de dientes mayores

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA aguzados), las escamas ganoideas oblicuamente imbricadas, la aleta caudal heterocerca con un lóbulo superior abreviado y las aletas dorsal y anal ubicadas hacia la parte posterior del cuerpo (Wiley, 1976). Las escamas forman una coraza protectora que al mismo tiempo permite curvaturas corporales extremas (Gemballa y Bartsch, 2002). La mandíbula superior se proyecta sobre la inferior (Kammerer et al., 2006) y en este grupo, el hueso infraorbital es el portador de los dientes. Las narinas están ubicadas cerca del final de la mandíbula superior. No presentan espiráculos, aunque sí pseudobranquias. Otra característica es la presencia de un “pulmón” funcional que no es más que una vejiga natatoria altamente irrigada por vasos sanguíneos (Wiley, 1976; Grande, 2010). Los huesos frontales de los lepisosteidos reflejan un alargamiento de las regiones etmoide y otica, para formar el hocico típico de estos peces, a diferencia del resto de los actinopterigios. Los hocicos del género Atractosteus por lo general son más cortos y anchos que los de Lepisosteus, debido fundamentalmente a la longitud de los huesos frontales y a su articulación con los procesos premaxilares, los parietales y los dermopteróticos (Wiley, 1976). Si bien los lepisosteidos presentan un comportamiento poco gregario, durante la temporada de reproducción forman grupos de 20 o más individuos (Holloway, 1954; Alemán y Contreras, 1987, tomado de Comabella, 2011). Los huevos de cada hembra son fecundados por el esperma de entre uno y cuatro machos (Suttkus, 1963; Contreras y Alemán, 1987, tomado de Comabella, 2011; Hurtado et al., 1994). Se conoce que algunos miembros de la familia (A. tropicus, L. platyrhincus, L. osseus) son generalmente más activos de noche (Goodyear, 1967; Reséndez y Salvadores, 1983, tomado de Comabella, 2011). Sin embargo, Vergara (1992a) describe a A. tristoechus como una especie diurna. Las especies del género Atractosteus son depredadoras secundarias oportunistas primariamente ictiófagas en la adultez (Suttkus, 1963; Kammerer et al., 2006) y habitan estanques y cursos de agua dulce, pero algunas especies (incluyendo al manjuarí) se aventuran ocasionalmente a hábitats salobres o marinos (Vergara, 1992a; Grande, 2010). Estos peces son reguladores del ecosistema y limpiadores de desechos (Goodyear, 1967). No obstante, han sido considerados plagas por su voracidad y naturaleza depredadora de otras especies ícticas de valor comercial; también por afectar la pesca deportiva (por su habilidad para robar carnadas de los anzuelos). En Norteamérica se han llegado a desarrollar campañas para su exterminio (Gómez de la Maza, 1965; Herald, 1966; Scott y Crossman, 1973; Bussing, 1987; Scarnecchia, 1992, citado por Mora et al., 1997). No obstante, en los últimos años se han realizado esfuerzos para su conservación en el medio natural (Buckmeier, 2008; Di Benedetto, 2009; Buckmeier y Reeves, 2012; Snow, 2014; Binion et al., 2015; Smylie et al., 2016). Es importante destacar que la especie A. tropicus

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA es criada con fines comerciales en México y Centroamérica (Barrientos-Villalobos y Espinosa de los Monteros, 2008; Arias-Rodríguez et al., 2009). De forma general, son peces de larga vida. Se ha informado de hembras de más de 50 años en A. spatula y de 25 años en L. osseus, ambas en vida libre (Ferrara, 2001; Smylie et al., 2016). Actualmente existen pocos estudios sobre los lepisosteidos en comparación con otras especies de neopterigios, destacándose las investigaciones relacionadas con aspectos morfológicos (Kammerer et al., 2006; Grande, 2010) e historia de vida (Buckmeier, 2008; Snow, 2014; Smylie et al., 2016).

2.1.1 Características biológicas del manjuarí (Atractosteus tristoechus) El único representante antillano del género Atractosteus es A. tristoechus (nombre común: manjuarí), especie endémica de Cuba (Scott y Crossman, 1973; Wiley, 1976; Bussing, 1987). Se nombró primeramente Esox tristoechus, incluyéndolo en el género propuesto por Linnaeus (1758) al describir la especie Esox osseus (actual Lepisosteus osseus). Como es el caso de todos los lepisosteidos vivientes, la posición taxonómica del manjuarí ha estado sometida a diferentes sinonimias (Bloch y Schneider, 1801; Poey, 1854; Suttkus, 1963; Gómez de la Maza, 1965; Alayo 1973, Wiley, 1976). Nelson (2006) ubica taxonómicamente la especie en: Phylum Chordata Subphylum Craniata Superclase Gnathostomata Clase Actinopterygii Subclase Neopterygii Orden Lepisosteiformes Familia Lepisosteidae Género Atractosteus Especie Atractosteus tristoechus (Bloch & Schneider, 1801) La coloración del pez varía de pardo oscuro a gris verdoso, más clara en el vientre. Difiere del resto de los lepisosteidos en algunas características de los huesos craneales y el número de rastrillos branquiales, en la adultez carece de manchas en la región de la cabeza, las aletas y el dorso del cuerpo (Poey, 1854; Suttkus, 1963; Wiley, 1976). Los análisis de los caracteres morfológicos y moleculares indican que la especie viviente más cercana filogenéticamente a A. tristoechus es A. spatula (Wiley, 1976; Grande, 2010; Wright et al., 2012). Prats (2003) sugiere que el sistema de crestas Cozumel-Cabo San Antonio puede haber sido la vía de acceso más probable del género Atractosteus desde Centroamérica hacia Cuba. Este es el género de mayor edad absoluta presente en Cuba,

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA de acuerdo a los registros fósiles en áreas continentales próximas (Wiley, 1976; Vergara, 1980). Sobre el manjuarí, al igual que sobre otros representantes de la familia, se han realizado pocas investigaciones. Destacan varias en el área de la parasitología (Pérez, 1936; Barus y Moravec, 1967; Coy y Hernández, 1982; Hurtado et al., 1994), la ontogenia y el desarrollo larval (Comabella et al., 2006; Comabella, et al., 2010; Comabella et al., 2013a; Comabella et al., 2013b; Comabella et al., 2014), la morfometría (Suttkus, 1963; Wiley, 1976; Prats, 2003) y la reproducción (Hurtado et al., 1994). Conocido en inglés como Cuban gar, el manjuarí habita en la región sur occidental del archipiélago de Cuba, fundamentalmente en la Ciénaga de Lanier y la Ciénaga de Zapata, donde se estima que exista la mayor población (Poey, 1854; Lee et al., 1983; Vergara, 1980; 1992a; 1992b). Buide et al. (1974) consideraron al manjuarí como especie primariamente amenazada (aquella que presenta determinado grado de reducción de los componentes numérico y/o espacial de su población, sea esta reducción normal en la especie o producto de su disminución), dentro del grupo VI correspondiente a especies restringidas (cuando una parte considerable de dicho hábitat no está ocupada por la especie) y poco escasas (aquella cuya población presenta un nivel numérico aparentemente normal o, al menos, no significativamente inferior al conocido en otro tiempo). Posteriormente, Vergara (1980) establece, teniendo en cuenta la abundancia, cinco categorías para los peces de agua dulce cubanos (1= muy raro; 2= raro; 3= común; 4= abundante y 5= muy abundante). Según esta clasificación, ubica al manjuarí dentro de la categoría 3 (común) para el occidente de la Isla de Cuba (restringida a la vertiente sur) y para la Isla de la Juventud dentro de la categoría 1 (muy raro). No obstante, durante la última década los avistamientos y/o capturas de este pez en el medio natural han disminuido drásticamente (Andrés Hurtado, com. pers.). Entre los principales factores que afectan la supervivencia de la especie está la degradación de los ecosistemas dulceacuícolas y la introducción de peces exóticos con fines comerciales (aproximadamente 13 especies exóticas han sido introducidas en la Ciénaga de Zapata, destacándose Clarias gariepinus). Otros factores influyentes son la destrucción y transformación del hábitat natural en beneficio de la actividad agrícola (canalizaciones de lagunas y ríos) y la contaminación de las aguas como consecuencia del desarrollo socioeconómico. El descenso en tamaño poblacional de esta especie se debe también a la pesca indiscriminada de la especie y de los peces que le sirven de alimento, estimuladas por el desarrollo creciente de la acuicultura y la comercialización con fines ornamentales (Hurtado et al., 1994; Prats, 2003; Ponce de León et al. 2012). El desconocimiento acerca de la biología de la especie, así como la carencia de información censal sobre la situación de sus poblaciones naturales, son las principales causas de que el estatus de conservación de este pez no haya sido evaluado por CITES (siglas en inglés

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA de Convention on International Trade in Endangered Species) ni por la IUCN (siglas en inglés de International Union for Conservation of Nature) (Ibarra y Cotazo, 2003). Los primeros pasos dados para el manejo de la especie fueron: la creación del Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena en la Ciénaga de Zapata en 1990, dedicado a la reproducción ex situ y a la obtención de juveniles que se comercializan como peces ornamentales; y la prohibición de su captura (Decreto Ley 164 del anteriormente Ministerio de la Industria Pesquera). Además, se le otorgó el estatus de vulnerable en el taller de Conservación, Análisis y Manejo Planificado realizado en La Habana en 1999, basándose fundamentalmente en los factores de amenaza anteriormente descritos y en la escasa información que sobre el grupo se tenía (Pérez et al., 1999). La evaluación más reciente del estado de la especie fue realizada por Ponce de León y colaboradores en el año 2012, para el Libro Rojo de Vertebrados de Cuba, quienes consideraron al manjuarí “En Peligro”. En la actualidad, aún se desconocen las áreas de desove para el manjuarí. Mcdonal (2002) describió como áreas de desove, para otros representantes de la familia, zonas con abundante vegetación y someras, con profundidades entre los 30 y 60 cm. Estas zonas han desaparecido en la mayor parte del territorio antes poblado por la especie, lo que atenta contra su conservación (Prats, 2003). A pesar de su importancia para el manejo y conservación de especies en peligro, no existen datos previos a esta investigación sobre la diversidad genética y estructura poblacional de la especie.

2.1.2 Estudios genéticos y marcadores moleculares en lepisosteidos Las primeras aproximaciones acerca de las características genéticas de los lepisosteidos datan de los años 70. Sánchez et al. (1977), estudiaron el cariotipo de un manjuarí y encontraron 52 cromosomas, de los cuales 32 eran metacéntricos y submetacéntricos, 18 acrocéntricos y dos sexuales, un submetacéntrico y un gran acrocéntrico. El cariotipo y el genoma mitocondrial de L. osseus y A. tropicus han sido dilucidados más recientemente (Ráb et al., 1999; Brougthon y Reneau., 2006; Arias-Rodríguez et al., 2009; Del Río- Portilla et al., 2014). También se conocen los mitogenomas de A. spatula, L. oculatus y L. platyrhincus (Inoue et al., 2003; Yu, 2015, sin publicar). La errada concepción de ser considerados “fósiles vivientes”, por ser especies pertenecientes a linajes antiguos dentro de los cuales la mayoría de las especies están ahora extintas y que han sufrido relativamente poco cambio evolutivo (Gould, 2002), de forma meramente aparente, ha hecho a esta familia un objeto muy atractivo en estudios de evolución y filogenética (Inoue et al., 2003; Sipiorski, 2011). Wright et al. (2012) actualizaron la filogenia de la familia mediante el análisis de secuencias de ADN del gen mitocondrial COI y 7 genes nucleares (ENC1, myh6, plagl2, el intrón 1 de la proteína ribosomal S7, sreb2, tbr1 y zic1). En ese análisis tres ejemplares de A. tristoechus

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provenientes del Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena de la Ciénaga de Zapata fueron utilizados y sólo el gen COI mostró polimorfismo con tres haplotipos. Todos los autores que han abordado este tema han concluido que la familia Lepisosteidae presenta, de forma intrínseca, bajos valores de diversidad genética tanto intra como interespecífica (Barrientos-Villalobos y Espinosa de los Monteros, 2008; Lara et al., 2010; Sipiorski, 2011; Solomon, 2012; Wright et al., 2012).

Tabla 1. Resumen de la diversidad genética encontrada en lepisosteidos mediante marcadores mitocondriales. Citocromo b (cytb), Citocromo oxidasa I (COI), Citocromo oxidasa II (COII), ARN ribosomal 16S (16S), Región no codificadora (RNC).

Número de Número de Distribución muestras haplotipos Especie Referencia geográfica (fragmento (fragmento mitocondrial) mitocondrial) Barrientos- Villalobos y México, Guatemala, El 86 (cytb) 83 A. tropicus 7 (cytb) 21 (COII) Espinosa de los Salvador y Costa Rica (COII) Monteros, 2008

Missouri, Mississippi, A. spatula 17 (RNC) 9 (RNC) Sipiorski, 2011 Louisiana, Tabasco(México)

Michigan Illinois,

Oklahoma, Florida, 23 (RNC) 22 Sipiorski, 2011 L. oculatus 16 (RNC) 3 (COI) Arkansas, Kentucky, (COI, 16S, COII) Solomon, 2012 1 (16S) 4 (COII) Indiana, Louisiana y Texas

4 (RNC) 3 (COI, Sipiorski, 2011 L. platyrhincus Florida 3 (RNC) 1 (COI) 16S, COII) Solomon, 2012 1 (16S) 3 (COII)

Illinois, Oklahoma, Sipiorski, 2011 L. platostomus Mississippi, Wisconsin, 19 (RNC) 13 (RNC) Arkansas, Indiana

Illinois, Oklahoma, Wisconsin, Indiana, New Mexico, Florida, L. osseus 57 (RNC) 32 (RNC) Sipiorski, 2011 Texas, Missouri, Mississippi, Iowa, Ohio, North Carolina, Nebraska

A pesar de ser especies consideradas en riesgo o vulnerables en casi todas sus poblaciones naturales, pocos estudios se han realizado desde el contexto de la genética de poblaciones y la filogeografía. El primer estudio de este tipo se registra en la especie A. tropicus (Barrientos-Villalobos y Espinosa de los Monteros, 2008), seguido por una investigación sobre las cinco especies de lepisosteidos que habitan América del Norte (Sipiorski, 2011).

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Solomon (2012) profundizó este tema en la especie L. oculatus. Un resumen de estos trabajos se encuentra en la Tabla 1. En el año 2009, Moyer et al., publican los primeros loci microsatélites aislados para un miembro de la familia, A. spatula (17 loci polimórficos), e informan la posibilidad de amplificación cruzada en L. osseus y L. oculatus (10 loci polimórficos en cada caso). Posteriormente se obtuvo amplificación cruzada de dichos loci microsatélites en la especie Centroamericana A. tropicus (nueve loci polimórficos) (Bohn et al., 2013). También en ambos trabajos se obtuvieron bajos valores de diversidad genética, con número promedio de alelos por locus de 4.82 (Moyer et al., 2009) y tres (Bohn et al., 2013).

2.2. Marcadores moleculares Un marcador molecular o genético es cualquier biomolécula cuyo fenotipo se emplee para inferir información de la especie, población, u organismo individual al que pertenece. Según la biomolécula objeto de análisis, los marcadores se pueden clasificar en marcadores de proteínas y ADN. Respecto a los marcadores de ADN, se pueden diferenciar aquellos basados en ADN repetitivo o ADN no repetitivo (Schlötterer, 2004).

2.2.1 ADN mitocondrial El ADN mitocondrial (ADNmt) es una molécula circular, cerrada por enlaces covalentes y de doble cadena; se localiza en la matriz mitocondrial (Krebs et al., 2014). En lepisosteidos (y teleósteos en general) tiene un tamaño aproximado de 16.000 pares de bases (pb) y codifica para 37 genes (transcritos a partir de un único promotor), entre los que se encuentran aquellos que codifican las tres subunidades de la enzima citocromo oxidasa (COI, COII y COIII) (Infante y Manchado, 2009; Del Río et al., 2014). Además, posee dos secuencias de ADN no codificador conocidas, la región de control (o D-loop) y OriL (Infante y Manchado, 2009). Este tipo de marcador se caracteriza por su abundancia celular (miles de copias), carácter homoplásmico (copias idénticas, aunque en algunas especies (i.e: Dicentrarchus labrax) existe heteroplasmia), la ausencia de recombinación (si bien hay datos recientes en algunos organismos de este fenómeno, entre ellos peces (Hoarau et al., 2002; Ciborowski et al., 2007) y herencia materna. Esta última característica hace que el tamaño efectivo poblacional para el ADNmt sea más pequeño que para el nuclear, y por tanto sea muy sensible a fenómenos poblacionales tales como cuellos de botella (bottlenecks) (Infante y Manchado, 2009).

2.2.2 ADN microsatélite Los microsatélites son secuencias cortas de menos de 10 nucleótidos que aparecen repetidas en tándem un número variable de veces y se encuentran distribuidas por todo el genoma, aunque su distribución dentro de los cromosomas no es uniforme puesto que se

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA hayan en menor abundancia en las regiones subteloméricas (Koreth et al., 1996). La variabilidad del marcador está dada por dichas repeticiones (Krebs et al., 2014). Además, tienen una alta tasa de mutación espontánea, entre 10-2 para humanos (Weber y Wong, 1993) y 10-6 en Drosophila (Schug et al., 1997). Se encuentran tanto en las regiones codificadoras como en las no codificadoras (Toth et al., 2000) aunque en eucariotas se encuentran en exceso en las últimas (Metzgar et al., 2000). El desarrollo de marcadores microsatélites para especies con importancia en acuicultura ha crecido enormemente dada su utilidad para la identificación y diferenciación de poblaciones, control de endogamia y grado de parentesco, mapas de ligamiento, programas de selección genética asistida por marcadores o para manipulaciones genéticas relacionadas con poliploidías o ginogénesis (Infante y Manchado, 2009).

2.3. Genética para la conservación y manejo de especies en peligro de extinción Debido a que la pérdida de diversidad genética está usualmente asociada a procesos de endogamia y a la reducción total de la reproducción y supervivencia (fitness) (Frankham et al., 2010), el principal organismo internacional de conservación, la IUCN, reconoce la necesidad de conservar la diversidad genética a nivel global, para que las poblaciones evolucionen y se adapten a los continuos cambios ambientales. De acuerdo con Frankham et al. (2010), existen varios tópicos genéticos que son de particular relevancia para la conservación biológica, entre los que se encuentran los siguientes: la depresión por consanguinidad o endogámica, la pérdida de variación genética en poblaciones pequeñas, la deriva genética, la fragmentación de las poblaciones y la consecuente reducción de la migración. Estas materias son objeto de investigación primaria en programas de conservación de especies vulnerables o en peligro. La pérdida de diversidad genética y el aumento de la endogamia pueden causar depresión endogámica, adaptación limitada a condiciones medioambientales cambiantes y en última instancia la extinción de la población o la especie (Allendorf y Luikart, 2007). La cría en cautiverio permite conservar especies que son incapaces de sobrevivir en sus hábitats naturales y es fuente potencial de individuos para la reintroducción. El rascón de Lord Howe (Gallirallus sylvestris) y la trucha común (Salmo trutta) son ejemplos exitosos de este método (Caughley y Gunn, 1996; Bouza, 2008). El establecimiento de sistemas de cultivo de peces (amenazados o no) constituye una vía eficaz para la reducción de la presión de pesca sobre los mismos, y en muchas ocasiones se ha convertido en una opción efectiva para la repoblación de áreas naturales (Leitão et al., 2011). En las poblaciones ex situ, es importante contar con el número adecuado de fundadores. Además, estos individuos fundadores deben representar la diversidad genética de la

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA especie, conservando también los alelos raros (Frankham et al., 2010). Si los fundadores provienen de una especie o población ya en estado crítico, o la población in situ sufre un cuello de botella, el manejo genético se hace más difícil. No obstante, numerosos ejemplos demuestran que poblaciones con bajos niveles de variación genética y pequeños tamaños efectivos son capaces de mantenerse saludables y estables en el tiempo (Robinson et al., 2016) o de aumentar su tamaño (Weber et al., 2000). La meta actual de la mayoría de los programas de cría en cautiverio de especies en peligro es retener el 90% de la diversidad genética durante 100 años. En una población de tamaño estable, la cantidad de fundadores debe ser inversamente proporcional al largo de una generación (L) en años, según la ecuación tamaño efectivo (Ne)=475/L. También es importante evitar adaptaciones genéticas al cautiverio que pueden ser deletéreas en estado salvaje (Frankham et al., 2010). El efecto de la depresión por endogamia, la pérdida de diversidad genética y la deriva genética son fenómenos más severos en poblaciones de pequeño tamaño efectivo; mientras, la adaptación genética al cautiverio es mayor en poblaciones grandes (Frankham et al., 2010). En Cuba existen pocas investigaciones con el fin de realizar manejo genético de especies en condiciones de cautiverio. Milián-García (2015) y Milián-García et al., (2015) desarrollaron los primeros trabajos de este tipo en nuestro país en las especies de cocodrilos Crocodylus rhombifer y Crocodylus acutus, así como en la cotorra (Amazona leucocephala).

3. Materiales y Métodos

3.1. Recolecta del material biológico Durante los años 2013, 2014 y 2015 se recolectaron muestras de individuos adultos pertenecientes a la población cautiva del Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena del Parque Nacional Ciénaga de Zapata, y a la población natural de dicho Parque Nacional (Fig. 2). Todos los individuos pertenecientes al Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena (forman el banco reproductor del CRII) fueron a su vez recolectados de la población natural de la Ciénaga de Zapata durante los primeros años de la década de 1990 (Andrés Hurtado, com. pers.). En la totalidad de los casos se tomó un fragmento de la aleta caudal que se conservó en etanol (96 %) a -20°C, con el objetivo de conservar el material genético. Las capturas se realizaron con redes de arrastre manuales (4,0m2), lo que permitió la devolución del individuo, sin afectación, al lugar de recolecta.

Figura 2. Localidades de recolecta de A. tristoechus en la Ciénaga de Zapata. Entre paréntesis se muestra el número de individuos muestreado en cada punto. Los puntos negros representan poblaciones naturales y el gris la población cautiva. A: Arroyones, CRII: Centro de Reproducción de la Ictiofauna Indígena, FC: Fiesta Campesina, GG: Guanal Grande, LT: Boca de Guamá-Laguna del Tesoro, ST: Zanja de Santo Tomás.

MATERIALES Y MÉTODOS

3.2. Procesamiento de las muestras

3.2.1 Extracción del ADN total El ADN total de los individuos muestreados se extrajo con fenol-cloroformo mediante la metodología de Sambrook et al. (1989). En todos los casos se partió de un fragmento de aleta (4,0mm2) que se lavó con 500μL de solución de extracción (TrisHCl 100mM, EDTA 10mM, NaCl 100mM, SDS 0.1%, DTT 50mM). Luego de añadir 200μL de solución de extracción y 15μL de proteinasa K (10mg/mL) al tejido, éste se incubó en un baño termostatado a 55°C durante toda la noche. Una vez digerido, el homogenado fue procesado mediante la resina de extracción Phase Lock Gel (PLG) (Eppendorf) (www.eppendorf.com), que permite recuperar de 20 a 30% más de ácidos nucléicos en comparación con los métodos tradicionales. Para precipitar el ADN, se agregó a la fase acuosa NaAc (3M, pH 5,2) en proporción de un décimo del volumen y se añadieron dos volúmenes de etanol (100 %). Se incubó a -20°C durante la noche y se centrifugó a 15 294,24g por 15 minutos (min). El precipitado se lavó con 200µL de etanol (70%) y se centrifugó nuevamente a 15 294,24 g por 15 min. Una vez seco, fue disuelto en 50µL de tampón TE (Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, pH 7,5). La verificación de la extracción y la cuantificación del ADN se realizó mediante electroforesis en geles de agarosa (1 %) con bromuro de etidio adicionado al gel en una concentración de 0.5µg/mL. Se utilizó como tampón de corrida TBE (Tris-HCl 10mM, Ácido Bórico 40mM, EDTA 1mM) y agua destilada (1:9, v:v) en una cámara de electroforesis horizontal a 100V durante 25 min. Como patrón de comparación para la cuantificación, se utilizó un marcador de peso molecular (Eurogentec) (www.eurogentec.com) y el ADN se visualizó en un transiluminador de luz ultravioleta.

3.2.2 Amplificación de genes mitocondriales Se realizó la amplificación de dos fragmentos del genoma mitocondrial: la región de control o región no codificadora (RNC) y el gen que codifica para la enzima citocromo oxidasa I (COI). En todos los casos la reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) se realizó con las siguientes proporciones: una unidad de GoTaq® DNAPolimerasa (Promega) (www.promega.com), 6,0μL de 5x GoTaq® Flexi Buffer (Promega), 0,6μL de dNTPs [10mM] (Promega), 1,8μL de MgCl2 [25mM], 0,6μL de cada uno de los oligonucleótidos [10μM], 1μL del ADN disuelto en TE (Macherey-Nagel) y agua desionizada estéril para completar un volumen final de reacción de 30μL. Las condiciones de amplificación en el termociclador Mastercycler 5333 H 01306 (Eppendorf) fueron: 5 min a 95°C y 8 ciclos del siguiente perfil: 45 segundos (s) a 92°C, 45s a 53°C para la unión de los oligos al ADN molde y 45s a 72°C para la extensión de las cadenas; luego 30 ciclos como sigue: 45s a 92°C, 45s a 58°C para la unión de los oligonucleótidos al ADN molde y

MATERIALES Y MÉTODOS

45s a 72°C para la extensión de las cadenas. Con este propósito, se emplearon para la RNC los cebadores L16594 y H22 (Sipiorski, 2011) y para COI los cebadores FishCOIf y FishCOIr (Hebert et al., 2003) (Tabla 2). Los productos de PCR se visualizaron en geles de agarosa al 1 %, como se describió anteriormente para la extracción de ADN total.

Tabla 2. Cebadores de amplificación y secuenciación de los fragmentos de ADN mitocondrial RNC (Sipiorski, 2011) y COI (Hebert et al., 2003). (F: Directo; R: Reverso).

Fragmento Oligonucleótido Secuencia del cebador (5′–3′) RNC L16594 F: CCTTAACTCCCAAAGCTAAGATTC R: H22 ATCTTARCATCTTCAGTGCTACTATGC COI FishCOIf F: AAYCAYAAAGAYGGYACCCT FishCOIr R: CCTCNGGRTGNCCRAAGAAYCA

3.2.3 Purificación del producto de la amplificación Luego de la amplificación, se realizó la purificación del producto de la PCR con el objetivo de optimizar los resultados de la secuenciación. Para ello se empleó el kit PCR clean-up Gel extraction Nucleospin® Extract II (Macherey-Nagel) (www.mn-net.com) siguiendo las indicaciones del fabricante. El producto fue nuevamente visualizado en geles de agarosa al 1 % tal como se ha descrito anteriormente.

3.2.4 Secuenciación del ADN Una vez purificado el producto de la amplificación, se procedió a la secuenciación en el sistema automático ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, HITACHI) (www.appliedbiosystems.com). La mezcla de reacción se preparó a partir de 20 a 40ng de producto de PCR, 1μL de oligonucleótidos [3,3mM], 3μL de tampón de secuenciación 5X y 2μL de Mix Big Dye (Applied Biosystems). El programa a emplear incluyó: 1min a 96°C, 24 ciclos de: 10s a 96°C, 5s a 50°C y 4min a 60°C. Posteriormente se realizó un paso de precipitación en el que se agregaron 2μL de una mezcla de EDTA [125mM] y AcNa [3M] y 50μL de etanol absoluto. Para la precipitación, el producto de la amplificación se agitó vigorosamente y se colocó por 15min en la oscuridad. Luego se centrifugó durante 20min a 15 294,24g y se desechó el sobrenadante. El precipitado se lavó con 70μL de etanol (70%) y se centrifugó nuevamente por 5min a la misma velocidad. Finalmente se eliminó el alcohol, se secó en una estufa a 37°C durante tres horas, se disolvió en diformamida (5%) y luego la muestra se analizó en el secuenciador automático.

MATERIALES Y MÉTODOS

3.2.5 Amplificación de ADN microsatélite Se amplificaron 10 loci microsatélites de los 17 descritos previamente por Moyer et al. (2009) para A. spatula (Tabla 3).

Tabla 3. Cebadores de amplificación y secuenciación de los loci microsatélites descritos por Moyer et al. (2009) para A. spatula (F: Directo; R: Reverso). Los colores en cada fluorocromo corresponden al color del cromóforo utilizado.

LOCUS Secuencia del cebador (5′–3′) Fluorocromo

Asp007 F: AATCCTGGGTTCGGTTCAG VIC R: GCGATGCGTCCGTTATTATT Asp031 F: CAGAGGAGCTTTCACTGTGTG PET

R: AAGGACATGTCAACCGTGCT Asp035 F: CGCAAAGGTCCAGCTTTTA 6-FAM

R: TGCCCTTGTTATGTGGTGAG Asp040 F: TCTTCCAAGGGGCTTTACCT NED

R: CAGGGGGTTCACAAACTTTATT Asp046 F: TAAAGTCAGCCCGGAGAGAA VIC

R: GAGCTGGAGGGGTAGAGTCC Asp057 F: CGACGAGATCAAGAAGCTCA PET

R: TTCACGCCATGGTCAGTAGT Asp066 F: GAGTTTGCTGGGAAGTTGGA 6-FAM

R: ATGCGCATTCAAGGTTTAGC Asp122 F: TTCAGGAATCTCCAGCAAGG Ninguno R: CAAGAATTGCTTTCCCCAAA Asp159 F: AAATTGAGAAGCCGCCTTTA VIC

R: CAAGAGGCAGGTCTGGAAAG Asp341 F: AAAAGATTTCCCATCTCACATACTG NED

R: CCCTTGTGGTTGTTAGCTCTG

La amplificación se desarrolló en un termociclador Mastercycler 5333 H 01306 (Eppendorf) con el siguiente programa: una etapa preliminar de desnaturalización a 95°C por 5min, seguida de 8 ciclos de desnaturalización a 92°C por 45s, 53°C por 45s para la unión de los oligonucleótidos y 72°C por 45s para la extensión de las cadenas; luego 30 ciclos de desnaturalización durante 45s a 92 °C, 45s a 58°C para la unión de los oligonucleótidos al ADN molde y 45s a 72 °C para la extensión de las cadenas, finalizando con una temperatura de 72°C por 10 min para completar la extensión de los productos de amplificación. Los oligonucleótidos en sentido directo (5’) se marcaron con los fluorocromos VIC, PET, 6-FAM o NED (Tabla 3). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se desarrolló en un volumen final de 9,0μL con las siguientes proporciones: 5,0μL de Platinum Multiplex PCR Master Mix

MATERIALES Y MÉTODOS

2X (Applied Biosistems), 1,0μL de Primer mix 10X [2μM], 1μL del ADN disuelto en TE (Macherey-Nagel) y agua desionizada estéril hasta completar el volumen final. Se realizaron dos PCR múltiples (Henegariu et al., 1997); uno con cuatro loci (Asp 046, Asp057, Asp066 y Asp 341) y el otro con cinco loci (Asp031, Asp035, Asp040, Asp057, Asp159).

3.2.6 Identificación de alelos Los productos resultantes de las reacciones de la PCR se analizaron automáticamente en el sistema ABI 3130X Genetic Analyser (Applied Biosystems, HITACHI) con el marcador de peso molecular GeneScan500 (-250) LIZ Size. Para determinar la talla de los alelos se utilizó el programa Peak Scanner™ Software 2 (Applied Biosystems).

3.3. Procesamiento estadístico

3.3.1 ADN mitocondrial Las secuencias fueron editadas mediante el programa Finch TV 1.4.0 (Geospiza Inc.) y se alinearon con el algoritmo propuesto en Clustal-W implementado en el programa MEGA 6.0 (Tamura et al., 2013). Para el análisis del polimorfismo de las secuencias de ADN se calculó la diversidad nucleotídica (π) y la haplotípica (h) (Nei, 1987), así como sus desviaciones estándar. La primera, determina el número promedio de diferencias nucleotídicas por sitio entre dos secuencias (es independiente del número total de variantes haplotípicas) y la segunda condensa la información sobre el número y la frecuencia de los diferentes alelos de un locus (es independiente de la relación existente entre las secuencias) y es equivalente a la heterocigosidad de la muestra. Dichos cálculos se desarrollaron empleando el programa DnaSP v5 (Librado y Rozas, 2009). Para construir las redes de haplotipos se empleó el programa Network ver 5.0.0.0 con el algoritmo de Median Joining (Bandelt et al., 1999) y se realizó una optimización a posteriori basada en el método de máxima parsimonia. Los límites de confianza se fijaron a 95%. Con excepción de las redes de haplotipos, todos los análisis se realizaron con los fragmentos RNC y COI concatenados y considerando una única población. En la red haplotípica de COI, se añadieron tres secuencias tomadas de GenBank (números de acceso: JN853329.1, JN853330.1, JN853331.1) (Wright et al., 2012). Además, se realizó el análisis de frecuencia de los haplotipos por grupo mediante una tabla de contingencia RxC implementada en el programa ChiRxC (Zaykin y Pudovkin, 1993) Este análisis no se ve afectado cuando el tamaño de la muestra es pequeño y existen valores nulos en la matriz (Roff y Bentzen, 1989). El ajuste a la neutralidad de las secuencias se estimó mediante los estadísticos D de Tajima

(Tajima, 1989) y Fs de Fu (Fu, 1997), así como sus límites de confianza, cuyo cálculo está

MATERIALES Y MÉTODOS implementado en el programa DnaSP v5 (Librado y Rozas, 2009). Bajo la hipótesis de neutralidad los valores de dichos estadísticos deben ser iguales a cero, por lo que sus desviaciones permiten realizar interpretaciones relacionadas con la acción de la selección natural y con la ocurrencia de eventos de expansión o reducción demográfica. Es importante destacar que para considerar Fs estadísticamente significativo son necesarios valores de p<0,02 (Fu, 1997).

3.3.2 ADN microsatélite Antes de analizar los datos provenientes del ADN microsatélite, se comprobó el desequilibrio de ligamiento genético entre pares de loci mediante la prueba disponible en el programa FSTAT 2.9.3.2 (Goudet, 2001), que se basa en la obtención de valores de máxima verosimilitud del estadístico G. Para identificar alelos nulos y corregir errores de genotipaje se empleó el programa Micro-Checker (Van Oosterhout et al., 2004). Se estimó la variabilidad genética a partir del cálculo del número de alelos por locus y su frecuencia observada como la proporción de un alelo respecto al número total. Se obtuvieron los valores de riqueza alélica (Rs) (programa FSTAT 2.9.3.2; Goudet, 2001), heterocigosidad observada (Ho) y esperada (He) (programa Genetix 4.1; Belkhir et al., 2000) para la población natural y la población en cautiverio por separado. También se obtuvo el valor de heterocigosidad total (Ht), implementada en el paquete estadístico FSTAT 2.9.3.2 (Goudet, 2001). Todos los valores de heterocigosidad fueron obtenidos de acuerdo a lo descrito por Nei (1987). Las desviaciones del equilibrio de Hardy-Weinberg

(HWE, por sus siglas en inglés) se estimaron mediante el estadístico FIS (Wright, 1965), (programa FSTAT 2.9.3.2; Goudet, 2001) modificado por Weir y Cockerham (1984). Con esta modificación, el estadístico no se afecta por el número de poblaciones analizadas, su tamaño, ni la frecuencia de individuos heterocigotos. En esta prueba, los alelos son permutados entre individuos para cada población y cada locus y el valor de FIS se comparó con el conjunto de datos aleatorizados. Los valores de probabilidad se obtuvieron teniendo en cuenta la proporción de valores de FIS que resultaron mayores que los observados. En el cálculo de FIS se ajustó el nivel de significación en los análisis de comparaciones múltiples, aplicando la corrección de Bonferroni para el 5 %. Con esta corrección las tasas de error tipo I son corregidas para comparaciones múltiples (Rice, 1989). Además, se calcularon los coeficientes globales de consanguinidad con intervalos de confianza para el 95 %. El tamaño de muestra pequeño sesga los coeficientes de endogamia individuales, pero no afecta significativamente los coeficientes medios de la población (Taylor, 2015). Se usó el estimador TrioML de Wang (2007) implementado en COANCESTRY (Wang, 2011). De los cuatro estimadores de endogamia implementados en dicho programa, se escogió TrioML pues este presentó la menor varianza y la correlación

MATERIALES Y MÉTODOS más alta con los valores verdaderos de endogamia en simulaciones realizadas en otras especies con bajo polimorfismo (Hammerly et al., 2013; Taylor, 2015). Con excepción de las inferencias bayesianas, todos los estadísticos se calcularon para la población natural y la población en cautiverio por separado, en adición al cálculo considerando como una población a todos los individuos.

Se estimaron los parámetros poblaciones Ɵ (4Neµ) y g (crecimiento exponencial) empleando una aproximación bayesiana implementada en el programa LAMARC v. 2.1.9

-gt (Kuhner, 2006). Dichos parámetros se relacionan de acuerdo a la ecuación Өt = Өactual e donde Өactual es Ө en el presente y Өt es el valor del parámetro t generaciones atrás. Valores positivos de este parámetro denotan crecimiento de la población y valores negativos denotan decrecimiento. Para los cálculos iniciales se usaron los valores implícitos ofrecidos en el menú de LAMARC v. 2.1.9 (Kuhner, 2006) y para las corridas subsiguientes el número de cadenas cortas y largas se fijaron a cero y uno, respectivamente. El análisis se efectuó para 30 000 000 generaciones en total, con un árbol muestreado al azar como punto de partida. La cadena larga final se realizó con 500 000 árboles muestreados cada 60 iteraciones y con un período inicial (burn-in) de 100 000 árboles. El modelo evolutivo al que mejor se ajustan los datos (F84) se seleccionó de acuerdo al criterio de selección de Akaike en el programa jModelTest 2.1.3 (Darriba et al., 2012).

4. Resultados

4.1. ADN mitocondrial Se analizaron en total 999 pares de bases del ADN mitocondrial, distribuidos casi equitativamente entre los fragmentos secuenciados (RNC=464 pb, COI=535 pb). De los 47 individuos recolectados, 34 pertenecen a la población cautiva del Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena (CRII) de la Ciénaga de Zapata (constituyen la totalidad del banco reproductor) y 13 forman parte de la población natural de la Ciénaga de Zapata. La comparación de los fragmentos totales de ADN mitocondrial entre todos los individuos mostró la existencia de tres sitios polimórficos, lo que define cuatro haplotipos diferentes. De los tres sitios de segregación, dos son transiciones (una en cada fragmento analizado) y uno es una transversión (en la RNC), para una proporción de 2:1. Los valores relativos de composición nucleotídica revelaron un predominio del par AT (61,3%) sobre el par CG (38,8%). El análisis del polimorfismo arrojó bajos valores de diversidad haplotípica (h=0,202 ± 0,077) y diversidad nucleotídica (π=0,00021 ± 0,00008). A manera de ilustración gráfica de las relaciones entre los haplotipos, se construyó una red de haplotipos (Fig. 3). Como resultado se obtuvo una representación en forma de estrella en la que aparece un haplotipo en frecuencia mayoritaria (42 individuos), a partir del cual se deriva el resto mediante un paso mutacional. Se aprecia que no existe una relación evidente entre los haplotipos y las diferentes localidades muestreadas, sin embargo, los haplotipos que se encuentran en menor frecuencia aparecen solo en uno u otro grupo de muestreo.

Figura 3. Red de haplotipos elaborada con 999 pb de la región de control del ADNmt y el gen COI para A. tristoechus, provenientes de la población natural de la Ciénaga de Zapata y el Centro de Reproducción para la Ictiofauna Indígena. La N indica la frecuencia absoluta de cada haplotipo.

RESULTADOS

El haplotipo más frecuente (A) reúne 33 individuos de los reproductores del CRII y nueve individuos pertenecientes a la población natural. El haplotipo B consiste en una transición en el gen COI presente en un reproductor del criadero. Los haplotipos C y D representan dos individuos cada uno, los cuatro de la población in situ de la Ciénaga (Fig 4), y en ambos casos el polimorfismo se encuentra en la RNC. Adicionalmente se realizó una red de haplotipos para el fragmento COI (Fig. 5), en la que se incluyeron tres secuencias de este fragmento obtenidas por Wright et al. (2012) y depositadas en GenBank. Así, se detectaron dos haplotipos nuevos para este gen.

Figura 4. Distribución de los haplotipos de ADN mitocondrial. Entre paréntesis se muestran los haplotipos encontrados en cada localidad. Los puntos negros representan poblaciones naturales y el gris la población cautiva. A: Arroyones, CRII: Centro de Reproducción de la Ictiofauna Indígena, FC: Fiesta Campesina, GG: Guanal Grande, LT: Boca de Guamá-Laguna del Tesoro, ST: Zanja de Santo Tomás.

Figura 5. Red de haplotipos elaborada con 535 pb del gen COI para A. tristoechus, provenientes de la población natural de la Ciénaga de Zapata, el Centro de Reproducción para la Ictiofauna Indígena y secuencias de GenBank (Wright et al. 2012). N indica la frecuencia absoluta de cada haplotipo. Cuando el número de sustituciones nucleotídicas fue mayor que uno el valor se indicó en la rama correspondiente. 21

RESULTADOS

El valor de χ2 obtenido con 10 millones de réplicas de MCMC fue de 11,66 (p=0,004), muy significativo según el criterio de p<0,01. Esto implica que ambos grupos difieren en las frecuencias de los haplotipos; la población en cautiverio presenta un haplotipo no detectado en la población natural, y en ésta existen variantes genéticas que no están representadas en la población en cautiverio. Los tres individuos de la población natural recolectados en la zona occidental de la Ciénaga de Zapata son A, mientras que en la zona oriental hay otros haplotipos. El resultado de las pruebas de neutralidad para el total del ADN mitocondrial mostró que el valor de D = -1,451 (-1,30817; 1,70311) (Tajima, 1989) y el valor del estadístico FS = -2,9295 (-2,23498; 1,95079) (Fu, 1997) fueron negativos y no significativos (D de Tajima con p=0,73; Fs de Fu con p=0,03).

4.2. ADN microsatélite Se probaron 10 loci microsatélites de los 17 aislados por Moyer et al. (2009) para A. spatula (Tabla 3). De ellos, nueve presentan amplificación cruzada en A. tristoechus: Asp007, Asp031, Asp035, Asp040, Asp046, Asp057, Asp066, Asp159, Asp341. Sólo el locus Asp341 fue polimórfico mostrando dos variantes alélicas, de 203 (frecuencia relativa=0,18) y 206 pb (frecuencia relativa =0,82) cada una. La variabilidad genética de las muestras se analizó sobre la base de dicho locus polimórfico y sobre la base de todos los loci (Tabla 4). El análisis de ligamiento reflejó valores no significativos en la comparación por pares de cada uno de loci analizados, luego de ajustar a 0,005 el valor de probabilidad por la corrección secuencial de Bonferroni. Se detectaron alelos nulos con p<0,05 para todos los loci. Al tener en cuenta todos los loci microsatélites los estimados de heterocigosidad observada

(Ho) resultaron muy bajos con valores de 0,024 ± 0,073 y 0,009 ± 0,026 para la población en cautiverio y la población natural respectivamente. Por su parte la heterocigosidad esperada (He) osciló entre 0,040 ± 0,12 en la población en cautiverio y 0,008 ± 0,25 en la población natural. El valor de heterocigosidad total (Ht) fue de 0,027 (Tabla 4). La riqueza alélica fue de 2,0 en ambas poblaciones.

Los valores de Ho al analizar el locus polimórfico Asp 341 fueron 0,219 para la población cautiva y 0,077 en la población natural. La He mostró valores de 0,359 y 0,074 en la población en cautiverio y la población natural respectivamente. El valor de Ht fue de 0,255 al tomar en cuenta sólo el locus polimórfico (Tabla 4). El ajuste al equilibrio genético de Hardy-Weinberg se estimó a partir del cálculo del índice de fijación FIS, con nivel de significación de α=0,00278 (360 permutaciones) de acuerdo con la corrección de Bonferroni. Se encontró que sólo la población natural se encuentra en equilibrio (Tabla 4).

RESULTADOS

Tabla 4. Índices de variabilidad genética estimados mediante loci microsatélites. Entre paréntesis, valor del estadístico calculado sólo para el locus polimórfico Asp 341. Rs: Riqueza alélica. Ho:

Heterocigosidad observada ± Desviación Estándar, He: Heterocigosidad esperada ± Desviación

Población en Todos los Población natural Índices cautiverio individuos N=13 N=34 N=47

Rs 2,000 2,000 2,000

Ho 0,024±0,073 (0,219) 0,009±0,026 (0,077) 0,016 (0,148)

He 0,040±0,12 (0,359) 0,008±0,25 (0,074) 0,025 (0,225)

Ht - - 0,027 (0,240)

FIS 0,40* 0,0 0,377**

*: p = 0,036 **: p= 0,010

El promedio global del coeficiente de endogamia (TrioML; Wang, 2007) para los reproductores del CRII fue de 0,7 ± 0,18 y para los individuos de la población natural fue de 0,88 ± 0,06.

Se estimaron los parámetros demográficos θ (4Neµ) y g (crecimiento exponencial) mediante inferencias bayesianas. Los valores fueron θ=4,41 (IC 95%: 0,021; 7.527) y g= 14,26 generaciones-1 (IC 95%: -7,838; 65,397).

5. Discusión

5.1. Estructura poblacional, diversidad genética y demografía Dado el escaso número de individuos y su restringida distribución geográfica, las poblaciones de A. tristoechus son las más amenazadas de todos los lepisosteidos vivientes. No obstante, no se ha realizado ningún estudio previo enfocado en la variabilidad y estructura genética de esta especie. Así, esta investigación es la primera en analizar elementos de la genética poblacional del manjuarí y en hacer uso de marcadores mitocondriales y nucleares para ello. De forma general, existen escasos estudios de genética de poblaciones en la familia Lepisosteidae, todos relativamente recientes y con marcadores mitocondriales (Barrientos-Villalobos y Espinosa de los Monteros, 2008; Sipiorski, 2011; Solomon, 2012). Si bien se han desarrollado marcadores microsatélites nucleares para este grupo (Moyer et al., 2009; Bohn et al., 2013), hasta el momento no se habían utilizado en un estudio poblacional propiamente dicho.

5.1.1 ADN mitocondrial El ADN mitocondrial posee características distintivas que lo convierten en una herramienta muy útil para estudios de estructuración poblacional y variabilidad genética. Su transmisión ocurre exclusivamente por vía materna (usualmente sin recombinación) y su tasa de cambio es relativamente rápida acumulando mutaciones con una frecuencia de cinco a 10 veces mayor que el ADN nuclear (Galtier et al., 2009). La diversidad genética encontrada con marcadores mitocondriales fue la más baja informada dentro de la familia Lepisosteidae. Si se comparan los valores de los índices de diversidad obtenidos para A. tristoechus en RNC y COI con los informados por Barrientos- Villalobos y Espinosa de los Monteros (2008) para A. tropicus (π=0,0016 ± 0,0018; h=0,477 ± 0,302) en cytb y COII se hace evidente que son mucho menores los presentados por la especie cubana (π=0,00021 ± 0,00008; h=0,202 ± 0,077). En general los lepisosteidos poseen bajos valores de diversidad genética y se han informado estimados de variación interespecífica de 1,21 % (genes cytb y COII, Barrientos-Villalobos y Espinosa de los Monteros, 2008) y 1,6 ± 0,5 % (gen COI) (Lara et al., 2010) entre A. tristoechus y A. spatula. En comparación, los esturiones Acipenser transmontanus y Acipenser stellatus, también considerados con baja tasa de mutación mitocondrial (Krieger y Fuerst, 2002), mostraron 2,8 % de variación interespecífica con los genes cytb y COII (Barrientos- Villalobos y Espinosa de los Monteros, 2008). En este trabajo se encontraron cuatro haplotipos mitocondriales al analizar de conjunto los dos fragmentos secuenciados (Fig. 3). La región no codificadora del ADN mitocondrial mostró un número bajo de haplotipos (tres). En el mismo fragmento de ADN Sipiorski

DISCUSIÓN

(2011) informó nueve haplotipos en A. spatula, 13 haplotipos en L. platostomus, 16 en L. oculatus y 32 en L. osseus. Todas las muestras de dicha investigación fueron recolectadas de poblaciones distantes entre sí, a través de todo el rango de distribución de las especies (Fig. 6). Es de señalar que, en el caso de L. platyrhincus, con una distribución geográfica más pequeña (Fig. 6), se reportaron tres haplotipos de RNC con una muestra de sólo cuatro individuos. La RNC usualmente contiene secuencias altamente polimórficas, y la tasa de sustitución nucleotídica es entre dos y cinco veces más rápida que la observada en genes que codifican para proteínas. Debido a que las mutaciones se acumulan más rápidamente en la región control, ésta es la secuencia de ADN mitocondrial que con mayor frecuencia se elige al realizar estudios genéticos poblacionales y evolutivos, entre especies muy relacionadas y entre diferentes poblaciones de una misma especie, incluyendo peces (Mancera-Rodríguez et al., 2013). La RNC, al ser un fragmento menos conservado evolutivamente, debe presentar mayor diversidad genética que el gen COI (Galtier et al., 2009; Hodgkinson y Eyre-Walker, 2011). Esto se cumple para toda la familia Lepisosteidae, pero la menor variación la presenta A. tristoechus.

Figura 6. Mapa de distribución de las especies continentales de lepisosteidos vivientes. En el mapa superior a la derecha se observa la distribución superpuesta de todas las especies; A. L. platostomus, B. L osseus, C. A. spatula, D. L. oculatus (negro) y L. platyrhincus (rayado), E. A. tropicus. Modificado de Sipiorski (2011).

La presencia de dos haplotipos diferentes en el fragmento secuenciado del gen COI está dentro del rango de diversidad haplotípica de los lepisosteidos para este gen. Solomon

DISCUSIÓN

(2012) informó tres haplotipos de este gen para L. oculatus, especie con una amplia distribución (Fig. 6); también informó de sólo un haplotipo para este gen en L. platyrhincus, de distribución mucho más restringida pues se encuentra sólo en la península de la Florida. Para A. tristoechus se detectaron dos haplotipos nuevos (E y F; Fig. 5) al incluir en el análisis independiente del gen COI, las tres secuencias obtenidas por Wright et al. (2012). Es probable que los parentales, hembras, portadores de estos mitotipos, ya no estén en la población cautiva, lo que permite inferir reducción de la variabilidad inicial del banco de reproductores. Estos haplotipos tampoco se detectaron en la población natural, lo que también sugiere reducción de la variabilidad en las poblaciones naturales, ya que las muestras de la población cautiva provienen de individuos recolectados en vida libre en la Ciénaga de Zapata (Andrés Hurtado, com. pers.). Otra posibilidad es que las muestras declaradas por Wright et al., (2012) como provenientes del criadero en la Ciénaga de Zapata no sean realmente de allí y pertenezcan a otra población, posiblemente de la Isla de la Juventud. Esto último es sugerido por la divergencia relativamente alta del mitotipo F respecto al resto de los haplotipos. No obstante, una vez traducida a proteína dicha secuencia de nucleótidos (número de acceso en GenBank: JN853329.1) muestra varios cambios en la secuencia aminoacídica respecto al resto de los haplotipos, todos en la última porción de la secuencia, por lo que podría tratarse de un pseudogen erróneamente identificado por Wright et al. (2012). Las diferentes variantes haplotípicas encontradas en cada población, así como las diferencias entre sus frecuencias, implican que, para un correcto manejo genético, sería conveniente incluir las variantes haplotípicas C y D (sólo encontradas en la población natural) en la población en cautiverio. Esto se debe a que su presencia pudiera sugerir la existencia de variabilidad en otras regiones del genoma. La existencia del haplotipo B en un solo individuo, perteneciente a la población en cautiverio, puede deberse a varios factores. Uno de ellos es que sea un alelo raro y dado el pequeño tamaño de muestra disponible de la población natural, no se encontró en ésta. También es posible que haya desaparecido completamente de la población natural. Se conoce que en poblaciones que sufren un cuello de botella los alelos raros tienden a desaparecer como consecuencia de la deriva genética (Frankham et al., 2010). Por último, podría ser una mutación con selección negativa en la naturaleza y que el individuo portador sobreviva debido a su condición de cautividad. Si bien estos individuos cautivos proceden del medio natural, no existe información acerca del estadio de vida en el cual fueron capturados los individuos de la población. En este sentido, la secuencia nucleotídica se tradujo a secuencia aminoacídica y se observó un cambio del aminoácido serina por el aminoácido asparagina, ambos polares sin carga (Nelson y Cox, 2004), por lo que no es evidente una afectación en la función proteica.

DISCUSIÓN

Las pruebas de neutralidad son indicadores de variación demográfica y de selección (Ramírez-Soriano et al., 2008; Lohmueller et al., 2011). En el ADN mitocondrial de varias especies de vertebrados, (incluyendo peces; Consuegra et al., 2015; Strohm et al., 2015) se ha descrito selección (tanto positiva como purificante) en fragmentos codificadores de proteínas, por lo que no es confiable asumir a priori que este marcador evoluciona de manera estrictamente neutral. En peces también se ha encontrado que la RNC contiene una secuencia central conservada la cual posee alguna homología con los bloques C-F de secuencias conservadas en mamíferos (Southern et al., 1988). Descrita por Lee et al. (1995) y denominada CSB (Conserved Sequence Blocks, por sus siglas en inglés), este segmento es el más conservado entre las familias de peces, lo que sugiere que está involucrado en funciones críticas en el metabolismo mitocondrial. En este estudio se aplicaron dos pruebas de neutralidad: la prueba de Tajima, la cual emplea el estadístico D

(Tajima, 1989), y la prueba de Fu (Fu, 1997), que considera el estadístico Fs. Este último es más potente para determinar expansiones en fragmentos de ADN no recombinantes y es más sensible al barrido selectivo (hitchhiking en inglés) (Fu, 1997). No obstante, es fuertemente afectado por desestimaciones de la recombinación, efecto que no influye sobre los valores de la D de Tajima (Ramírez-Soriano et al., 2008). Valores negativos en ambas pruebas indicarían expansión demográfica o selección purificante. Sin embargo, tanto la D de Tajima como la Fs de Fu no fueron estadísticamente significativos. Además, los intervalos de confianza fueron del mismo orden que el resultado y abarcan tanto el espectro de los números positivos como negativos. Estos resultados no muestran evidencia de cambios en el tamaño de la población o ningún patrón particular de selección en estos loci. Si la población ha transitado por algún cambio demográfico probablemente sea necesario el análisis de mayor número de loci polimórficos.

5.1.2 ADN microsatélite Los loci microsatélites se caracterizan por ser altamente polimórficos en cuanto a su longitud, por lo tanto, son regiones útiles para usarse como marcadores moleculares en el nivel poblacional y se recomiendan cuando otros marcadores no muestran adecuado grado de polimorfismo (Selkoe y Toonen, 2006; Mancera-Rodríguez et al., 2013). Este alto grado de polimorfismo es consecuencia de una elevada tasa de mutación (desde 10-6 hasta 10-2 mutaciones por sitio por generación) (Schlötterer, 2000). No obstante, en casos de especies amenazadas, con tamaños poblacionales muy pequeños o poblaciones muy fraccionadas, la variabilidad de estos marcadores puede ser muy pequeña (Fünfstück y Vigilant, 2015). Aunque el desarrollo de marcadores microsatélites es en ocasiones un proceso lento (Selkoe y Toonen, 2006), múltiples estudios han mostrado que loci microsatélites aislados para una especie pueden presentar amplificación cruzada en otra especie del mismo

DISCUSIÓN género, y en ocasiones de la misma familia (i.e: Holman et al., 2005). Moyer et al. (2009) desarrollaron un grupo de loci microsatélites para A. spatula y determinaron que un subgrupo de estos loci amplificó exitosamente en otras dos especies de la familia: L. oculatus y L. osseus. Posteriormente, Bohn et al. (2013) demostraron amplificación cruzada de varios de estos loci en A. tropicus. Dado que A. spatula es la especie hermana de A. tristoechus (Wrigth et al., 2012), en este estudio se probaron 10 loci microsatélites desarrollados para esta especie y polimórficos en ella (Tabla 3). De ellos, nueve amplificaron exitosamente en todas las muestras de A. tristoechus. Sin embargo, sólo el locus Asp 341 fue polimórfico y aún éste con bajo grado de polimorfismo. Si bien la diversidad alélica a menudo disminuye cuando los cebadores son usados en especies diferentes a la especie para la que fueron diseñados, se espera que la tasa de éxito sea mayor mientras más cercanas filogenéticamente sean las especies (Selkoe y Toonen, 2006). Especies más alejadas de A. spatula que el manjuarí presentaron mayor diversidad alélica en los mismos loci microsatélites que se utilizaron en esta investigación (Anexo 1). Al comprobar el ajuste de las frecuencias alélicas al equilibrio genético de Hardy-Weinberg se encontró que en la población en cautiverio el valor de FIS se desvió significativamente de cero. Este desajuste se debió a un déficit en la proporción de heterocigotos (o un exceso en la proporción de homocigotos). La desviación del equilibrio de Hardy-Weinberg hacia un déficit de heterocigotos puede deberse, en poblaciones naturales, a causas biológicas que aparten a la población de los criterios de población ideal, como puede ser una fuerte endogamia o selección positiva o negativa hacia cierto alelo (Selkoe y Toonen, 2006). En la población cautiva una de las posibles causas de este fenómeno es la presencia de alelos nulos. Sin embargo, aunque la prueba estadística para detectar alelos nulos fue significativa, indicando presencia de estos, dicho resultado era esperado dado el elevado número de homocigotos presentes. Para esta especie, el déficit de heterocigotos parece ser una realidad tangible y no un artefacto. Además, otras evidencias apoyan esta hipótesis y son: la amplificación satisfactoria de los loci microsatélites en todos los individuos analizados y el hecho de que el mismo locus no esté en desequilibrio en la población natural. La población en cautiverio es pobre genéticamente en estos loci posiblemente neutrales, pero esto puede reflejar la tendencia general para el resto de los genes nucleares. El efecto de déficit de heterocigotos también se observa en ocasiones debido al llamado efecto Wahlund (Selkoe y Toonen, 2006), que ocurre cuando la escala espacial escogida para muestrear la población es mayor que la escala real de la población. No obstante, no existen evidencias de subestructuración poblacional en la Ciénaga de Zapata, por lo que es poco probable que este efecto sea la causa del desequilibrio genético encontrado. La consanguinidad produce efectos negativos tanto en la supervivencia como en la reproducción de las especies. Suele provocar la disminución del valor adaptativo vinculado

DISCUSIÓN a la reproducción y los riesgos de extinción (Frankham et al., 2010). Todos los estimadores de endogamia basados en marcadores moleculares calculan F en relación a una población de referencia, de la que se asume que sus individuos no están emparentados. En la mayoría de las investigaciones (como en esta) la población en estudio actúa también como población de referencia, lo que implica que la consanguinidad es estimada en relación a todos los individuos de la muestra; esto puede producir ligeros sesgos en los coeficientes de endogamia, usualmente subestimando los valores reales de consanguinidad (Wang, 2014). Taylor (2015) plantea que valores de F entre 0 y 0,1 pueden ser considerados muy bajos, así como valores entre 0,9 y 1,0 son considerados muy altos. Tanto en la población cautiva de manjuarí, como en la natural, la media del coeficiente de endogamia fue alta (F= 0,7 ± 0,18; F= 0,88 ± 0,06 respectivamente). Es importante destacar que, cuando el polimorfismo del marcador es bajo (como en este caso), la identidad por estado se incrementa, por lo que la diversidad genética es similar en individuos no emparentados e individuos con gran consanguinidad. Esto dificulta la discriminación entre identidad por descendencia e identidad por estado. El alto nivel de consanguinidad en ambas poblaciones era esperado, pues si bien se desconoce su ascendencia, provienen de una población de tamaño poblacional reducido, lo que incrementa la probabilidad de que compartan alelos idénticos por descendencia.

5.1.3 Demografía Un aspecto que es necesario valorar es que el tamaño efectivo de la población se haya mantenido estable en el tiempo, lo cual pudiera estar relacionado con las características reproductoras y el nicho trófico que ocupa esta especie. El manjuarí tiene un periodo largo de reproducción, sólo desova una vez al año (Hurtado et al., 1994; Smylie et al., 2016), aunque Brinkman (2003) sugiere que en algunos ecosistemas podrían tener ciclos reproductivos más largos. Además, la madurez reproductora se alcanza tardíamente. En L. osseus se ha informado madurez sexual en el 50 % de los machos de un año y en el 50 % de las hembras de 5,6 años (Smylie et al., 2016); las hembras de A. spatula alcanzan la madurez sexual entre los 10 y 14 años y los machos aproximadamente a los seis años (Ferrara, 2001; García de León et al., 2001). Esto hace que las poblaciones se mantengan demográficamente estables por largos periodos de tiempo. Igualmente, siendo un depredador piscívoro, alto en la escala trófica, sus tamaños poblacionales deben estar regulados por la disponibilidad de recursos tróficos, sobre todo en las etapas de adultez cuando las presas son de mayor tamaño (Kammerer et al., 2006). Los parámetros θ y g son a menudo útiles para establecer la historia demográfica de la población en estudio. No obstante, para estimar dichos parámetros son necesarios niveles de polimorfismo superiores a los encontrados en los fragmentos mitocondriales analizados. El programa LAMARC v. 2.1.9 (Kuhner, 2006) requiere como mínimo dos regiones en

DISCUSIÓN equilibrio de ligamiento para estimar θ y no menos de tres para estimar g. Además, para que la estimación sea fiable, son necesarios al menos 10 sitios polimórficos en el fragmento utilizado. Los fragmentos de ADN mitocondrial analizados en este estudio mostraron sólo tres sitios polimórficos. Por otro lado, el ADN microsatélite sí permitió realizar estimaciones demográficas mediante inferencias bayesianas. Se obtuvo una distribución unimodal al relacionar los valores de los parámetros θ y g obtenidos en cada cadena con sus valores de probabilidad (Anexo 2). Esto indica que la cobertura de los datos fue adecuada y los resultados son fiables. El valor de g fue positivo (g = 14,26 generaciones-1; IC=-7,837890; 65,39682), pero los estimados obtenidos con el programa LAMARC están sesgados hacia la región positiva de la superficie de probabilidad. Esto implica que si el valor de g es pequeño (menor de 100 generaciones- 1) y el intervalo de confianza incluye el valor de cero, no existe crecimiento en la población, si bien no discrimina si la población sufre una reducción o el tamaño efectivo se mantiene constante. Para estimar el tamaño efectivo (Ne) de la población de manjuarí a partir del parámetro θ es necesario contar con una estimación externa de la tasa de mutación de la especie (µ), de la que no existe información en la literatura. Sobre el tamaño efectivo de la población de A. tristoechus y sus implicaciones se profundiza a continuación.

5.2. Implicaciones para el manejo y la conservación A partir de los resultados de esta investigación se puede inferir un pequeño tamaño efectivo de la población de manjuarí de la Ciénaga de Zapata. De forma general, tanto las secuencias de ADN mitocondrial como los genotipos microsatélites analizados mostraron poco o ningún polimorfismo. Escasos valores de diversidad genética, similares a los encontrados en A. tristoechus, se han observado previamente en especies en peligro de extinción, cuyas poblaciones tienen un tamaño censal muy pequeño; a menudo, el menor tamaño de la población se correlaciona con menor diversidad genética (Méndez et al., 2014; Sato et al., 2014). Niveles de diversidad genética tan bajos como los encontrados en ésta investigación a menudo son indicio de un cuello de botella reciente en la población en estudio (Halliburton, 2004). Este evento demográfico se manifiesta como una reducción del tamaño poblacional hacia tallas muy pequeñas. Genéticamente, los cuellos de botella tienen como consecuencia la disminución de la diversidad génica, la pérdida de alelos raros y el cambio de las frecuencias alélicas (Frankham et al., 2010). Por ejemplo, el elefante marino (Mirounga angustirostris) sufrió un cuello de botella hace un siglo. Se han descrito sólo dos haplotipos diferentes en 300 pb de la RNC en 185 individuos posteriores al cuello de botella. Sin embargo, en 22 individuos anteriores al cuello de botella se han encontrado siete haplotipos en 116 pb del mismo fragmento mitocondrial (Weber et al., 2000; Hoelzel et al., 2002).

DISCUSIÓN

La deriva genética produce una homogenización genética de la población, lo que reduce su potencial para adaptarse a cambios ambientales (Chang et al., 2012). Además, al ser una fuerza estocástica, puede provocar la fijación de alelos deletéreos o desventajosos. No obstante, se ha informado de especies con muy escaso tamaño censal y escaso o ningún polimorfismo genético cuyas poblaciones se han mantenido estables durante décadas (Robinson et al., 2016). Es posible que en estos casos diversos factores epigenéticos sean los que permiten la adaptación (Vergeer et al., 2012), o que la pequeña población ha purificado en pocas generaciones los alelos deletéreos preexistentes. Ello nos sugiere que, de no existir presiones antropogénicas y sin la presencia de los peces introducidos del género Clarias, las poblaciones de manjuarí de la Ciénaga de Zapata podrían mantenerse estables en el tiempo. Si bien tanto la baja variabilidad genética como las observaciones recientes (Andrés Hurtado, com. pers.) indican que el manjuarí está sufriendo una reducción del tamaño poblacional, es posible que el efecto de este cuello de botella actúe sobre un tamaño efectivo pequeño pre-existente, sostenido en el tiempo, dadas las características de la especie. Se considera que las especies basales de los actinopterigios presentan bajas tasas de mutación al compararse a otros teleósteos (Bermingham y Avise, 1986; Krieger y Fuerst, 2002). Cómo se ha discutido anteriormente, los lepisosteidos se caracterizan por una baja diversidad genética, con niveles de divergencia entre géneros cercanos muy bajos (Atractosteus vs. Lepisosteus, 12,5 ± 1,5 %), además son peces con tiempos de generación relativamente largos al compararlos con otros peces. La contribución desigual de cada sexo a la nueva generación disminuye también la proporción N/Ne (Frankham et al., 2010). Los lepisosteidos son poliándricos, y en varias especies de esta familia se ha reportado exceso de machos en la población (Binion et al., 2015; Smylie et al., 2016). La reducción abrupta del tamaño censal puede afectar no sólo el tamaño efectivo de la población, también aumenta el tiempo de recuperación de la diversidad. La población cautiva del CRII de la Ciénaga de Zapata aporta seguridad acerca de la supervivencia de la especie. Especies de peces de agua dulce como el cachorrito del potosí (Cyprinodon alvarezi) han sobrevivido debido a las poblaciones en cautiverio, aún mucho después de extintas en la naturaleza (Contreras-Balderas y Almada-Villela, 1996; Allendorf y Luikart, 2007). Además, el establecimiento de sistemas de cultivo de peces es una opción efectiva para la repoblación de áreas naturales (Leitão et al., 2011). Éste es el objetivo final de la cría en cautiverio del manjuarí. Existen antecedentes de cultivos a gran escala de otra especie del género Atractosteus (Arias-Rodríguez et al., 2009) y han resultado exitosos. Sin embargo, en el caso del manjuarí urge un adecuado manejo genético para mantener la estabilidad demográfica y contrarrestar cambios nocivos en el material genético poblacional, evitando fenómenos de depresión por endogamia, pérdida de la variación

DISCUSIÓN genética, acumulación de mutaciones y adaptaciones genéticas a la cautividad que son destructivas en la naturaleza. Estos factores tienen impactos diferentes y se aplican sobre intervalos de tiempo distintos, pero todas afectan a las poblaciones cautivas (Frankham et al., 2010). La baja variabilidad encontrada en la población en cautiverio impide establecer relaciones de parentesco entre los individuos reproductores, así como hacer recomendaciones de manejo basadas en un plan de apareamientos conformado a partir de los datos genéticos. Dada la crítica situación inferida a partir de los resultados de este estudio, se hace evidente la necesidad de atención particular hacia la especie. Se imponen la caracterización de toda la diversidad genética existente mediante genómica, así como un incremento del esfuerzo de muestreo.

5. Conclusiones

 La población natural de A. tristoechus en la Ciénaga de Zapata no muestra estructura genética y exhibe muy bajos niveles de diversidad genética, incluso al ser comparada con los estándares de la familia, lo que reafirma el grado extremo de riesgo en el que se encuentra la especie.

 La población en cautiverio de A. tristoechus del Centro para la Reproducción de la Ictiofauna Indígena de la Ciénaga de Zapata presenta niveles muy bajos de diversidad genética.

 La baja variabilidad genética entre los individuos de la población cautiva de A. tristoechus hace imposible determinar el grado de parentesco por pares mediante los marcadores utilizados.

6. Recomendaciones

• Aumentar en la medida de lo posible el tamaño de la muestra, así como analizar las poblaciones de A. tristoechus de la Isla de la Juventud y Pinar del Río.

• Realizar estudios genómicos para detectar marcadores adaptativos en esta especie.

• Estudiar los posibles efectos de la selección natural y la deriva genética en la evolución de la especie, su perdurabilidad y su capacidad de adaptación comparando las poblaciones de diferentes áreas.

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XII

Anexos

Anexo 1. Índices de variabilidad genética en cinco especies de la familia Lepisosteidae estimados mediante los loci microsatélites utilizados en este estudio. A: Número de alelos, Ho: Heterocigosidad observada, He: Heterocigosidad esperada. NA: no amplifica.

Especie Locus A. tristoechus A. spatula A. tropicus L. oculatus L. osseus A 1 4 4 NA NA Asp007 Ho - 0,205 0,686 NA NA He - 0,19 0,652 NA NA A 1 6 NA NA NA Asp031 Ho - 0,483 NA NA NA He - 0,5 NA NA NA A 1 4 1 NA NA Asp035 Ho - 0,857 - NA NA He - 0,662 - NA NA A 1 4 1 1 3 Asp040 Ho - 0,684 - - 0,769 He - 0,674 - - 0,53 A 1 4 1 5 8 Asp046 Ho - 0,391 - 0,857 0,77 He - 0,37 - 0,73 0,846 A 1 4 1 6 7 Asp057 Ho - 0,205 - 0,857 0,615 He - 0,19 - 0,798 0,648 A 1 5 3 13 10 Asp066 Ho - 0,744 0,549 1 0,917 He - 0,689 0,656 0,901 0,847 A 1 5 4 NA NA Asp159 Ho - 0,315 0,292 NA NA He - 0,669 0,321 NA NA A 2 5 NA NA NA Asp341 Ho 0,148 0,486 NA NA NA He 0,225 0,518 NA NA NA

XIII

ANEXOS

Anexo 2. Distribución al relacionar los valores de los parámetros θ y g estimados en cada cadena por el programa LAMARC con sus valores de probabilidad.

5,00E-02 4,50E-02 4,00E-02 3,50E-02 3,00E-02 2,50E-02 2,00E-02 1,50E-02 1,00E-02 5,00E-03 0,00E+00 311 908 12,5 72,2 -286 -47,2 131,9 191,6 251,3 370,7 430,4 490,1 549,8 609,5 669,2 728,9 788,6 848,3 967,7 -584,5 -524,8 -465,1 -405,4 -345,7 -226,3 -166,6 -106,9 1027,4

Like(Growth1:Overall)

4,00E-01 3,50E-01 3,00E-01 2,50E-01 2,00E-01 1,50E-01 1,00E-01 5,00E-02 0,00E+00 0,98 -4,89 0,393 1,567 2,154 2,741 -10,76 -9,586 -8,999 -8,412 -7,825 -7,238 -6,651 -6,064 -5,477 -4,303 -3,716 -3,129 -2,542 -1,955 -1,368 -0,781 -0,194 -12,521 -11,934 -11,347 -10,173

Like(Theta1:Overall)

XIV