Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

Untersuchungen zum Replikationsverhalten des Hepatitis C Virus (HCV) in Zellkultursystemen mit manipuliertem 2’- 5’Oligoadenylatsynthetase-System

vorgelegt von Christina Röser geboren in Erfurt/Thüringen

Februar 2007

Eingereicht im Fachbereich 2 (Biologie/Chemie) der Universität Bremen Erster Gutachter: PD Dr. rer. nat. Andreas Dotzauer Universität Bremen, Fachbereich 2 Zweiter Gutachter: Prof. Dr. Reimer Stick Universität Bremen, Fachbereich 2

Tag des öffentlichen Kolloquiums: 19. April 2007 (Universität Bremen) Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung...... 1 1.1. Hepatitis C Virus ...... 1 1.1.1. Taxonomie...... 1 1.1.2. Genomorganisation...... 2 1.1.3. Genotypen...... 3 1.1.4. Verbreitung...... 5 1.1.5. Replikation...... 5 1.1.6. Übertragungswege ...... 7 1.1.7. Krankheitsbild und Therapie ...... 7 1.1.8. Diagnostik...... 9 1.1.8.1. Serologischer Antikörper Test...... 9 1.1.8.2. Virologische PCR Tests zum Nachweis von HCV RNA...... 10 1.1.9. Hepatitis C Virus in Zellkultur ...... 11 1.2. Unspezifische Immunabwehr ...... 13 1.2.1. 2’- 5’Oligoadenylatsynthetase-System und RNase L...... 14 1.2.2. RNase L Inhibitor (RLI) ...... 16 1.3. Polymerase Kettenreaktion...... 17 1.3.1. Historisches ...... 17 1.3.2. Prinzip der PCR...... 18 1.3.3. Real time PCR ...... 19 1.3.4. Fluoreszenzfarbstoffe ...... 20 1.3.5. ABI PRISM™ Systeme...... 21 1.3.6. RotorGene™...... 22 1.4. Ziel der Arbeit ...... 24 2. Material und Methoden ...... 25 2.1. Materialien...... 25 2.1.1. Antikörper...... 25 2.1.2. Bioreagenzien ...... 25 2.1.3. Gebrauchsfertige Kits...... 26 2.1.4. Geräte...... 26 2.1.5. Medien und Lösungen ...... 27 2.1.6. Oligonukleotide ...... 27 2.1.7. Plasmide...... 29 2.1.8. Restriktionsendonukleasen ...... 30 2.1.9. Software...... 30 2.1.10. Verbrauchsmaterialien...... 31 2.1.11. virologische Materialien ...... 31 2.1.12. Zelllinien...... 31 2.2. Methoden ...... 32 2.2.1. Molekularbiologie ...... 32 2.2.1.1. Aufreinigung von Zell-RNA mit dem RNeasy® Mini Kit...... 32 2.2.1.2. DNA-Auftrennung im Agarosegel ...... 32 2.2.1.3. cDNA-Synthese ...... 32 2.2.1.4. Real time PCR zum quantitativen Nachweis der mRNA von RNase L, RLI und GAPDH sowie der 18S rRNA ...... 33 2.2.1.5. Full length Amplifikation des RNase L Inhibitor ...... 34 2.2.1.6. Klonierung des RLI in pcDNA3.1/V5-His und Transformation von E.coli...... 35 2.2.1.7. Klonscreening mittels PCR ...... 36 2.2.1.8. Präparation der rekombinanten Plasmide...... 37 2.2.1.9. Sequenzierung ...... 37 2.2.1.10. Umklonierung des RLI aus pcDNA3.1/V5-His_RLI in pl.18...... 37 2.2.1.11. In vitro Transkription von HCV full length HCV RNA...... 39 2.2.1.12. Entwicklung eines HCV RotorGene Nachweissystems ...... 40 2.2.2. Zellkultur und virologische Methoden ...... 42 2.2.2.1. Kryokonservierung von Huh7- und FRhK-4-Zellen ...... 42 2.2.2.2. Auftauen von Huh7- und FRhK-4-Zellen ...... 42 2.2.2.3. Passagieren von Huh7- und FRhK-4-Zellen ...... 42 2.2.2.4. Transfektion mit FuGene 6 Transfection Reagent ...... 43 2.2.2.5. Transfektion mit jetPEI ...... 43 2.2.2.6. G418 Titration für Huh7-Zellen ...... 43 2.2.2.7. Stabile Überexpression des RLI in Huh7- und FRhK-4-Zellen ...... 44 2.2.2.8. Immunfluoreszenz ...... 44 2.2.2.9. Stabilitätstest von HCV RNA in zellfreiem Medium...... 45 2.2.2.10. HCV Infektion von FRhK-4-RLI-Klonen ...... 45 2.2.2.11. HCV Infektion transient RLI-transfizierter Huh7- und FRhK-4-Zellen...... 46 2.2.2.12. Transfektion in vitro transkribierter RNA in Huh7- und FRhK-4-Zellen...... 46 2.2.2.13. Transfektion in vitro transkribierter HCV full length RNA in transient RLI-transfizierten Huh7- und FRhK-4-Zellen...... 47 2.2.2.14. Aufreinigung viraler RNA mit dem QIAamp®Viral RNA Mini Kit.. 47 3. Ergebnisse...... 48 3.1. Erstellung der real time PCRs ...... 48 3.1.1. Real time PCR zum quantitativen Nachweis der mRNA von RNase L, RLI und GAPDH sowie der 18S rRNA ...... 48 3.1.1.1. Effizienz...... 49 3.1.1.2. Spezifität...... 51 3.1.2. Real time RT-PCR zum quantitativen Nachweis der HCV RNA ...... 52 3.1.2.1. Testung des HCV RotorGene Assay auf Kreuzreaktivität ...... 52 3.1.2.2. Sensitivität des HCV RotorGene Nachweissystems ...... 53 3.1.2.3. Nachweis verschiedener HCV Subtypen...... 55 3.1.3. Zusammenfassung real time PCRs...... 57 3.2. RNase L Inhibitor ...... 57 3.2.1. Sequenzierung RNase L Inhibitor ...... 57 3.2.2. Transfektion mit jetPEI bzw. FuGene 6 Transfection Reagent...... 59 3.2.3. RLI-Kinetik nach Transfektion mit pcDNA3.1/V5-His_RLI ...... 61 3.2.4. Vergleich der Expressionsraten von pcDNA3.1/V5-His_RLI und pl.18_RLI...... 62 3.2.5. Nachweis der RLI-Expression mittels Immunfluoreszenz...... 64 3.2.6. Stabile Überexpression des RLI in FRhK-4- und Huh7-Zellen ...... 65 3.2.7. RLI-Kinetik der FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5 ...... 67 3.2.8. Kinetik der RLI-Expression stabil transfizierter FRhK-4-6er Klone . 68 3.2.9. Zusammenfassung RNase L Inhibitor ...... 70 3.3. HCV Infektion ...... 70 3.3.1. Titer- und Subtypenbestimmung von HCV-positivem Plasma des Blutspendedienstes Hagen...... 71 3.3.2. Stabilität von HCV RNA...... 72 3.3.3. HCV Infektion der RLI-Klone 4 und 5 ...... 74 3.3.4. HCV Infektion transient RLI-transfizierter Zellen...... 76 3.3.5. Zusammenfassung HCV Infektion ...... 78 3.4. Transfektion in vitro transkribierter HCV full-length RNA...... 79 3.4.1. In vitro Transkription von full length HCV RNA ...... 80 3.4.2. Transfektion in vitro transkribierter RNA in Huh7- und FRhK-4-Zellen...... 81 3.4.3. Transfektion in vitro transkribierter HCV full length RNA in transient RLI-transfizierten Zellen ...... 84 3.4.4. Zusammenfassung Transfektion in vitro transkribierter HCV full length RNA...... 90 4. Diskussion ...... 91 4.1. Real time PCRs...... 91 4.1.1. Real time PCR zum quantitativen Nachweis der mRNA von RNase L, RLI und GAPDH sowie der 18S rRNA ...... 91 4.1.2. Real time PCRs zum quantitativen Nachweis der HCV RNA ...... 93 4.2. RNase L Inhibitor ...... 95 4.2.1. Isolation und Analyse des RLI aus FRhK-4- und humaner gesamt-Zell-RNA ...... 95 4.2.2. stabile Überexpression des RNase L Inhibitors in Huh7- und FRhK-4-Zellen...... 96 4.3. HCV Infektion und Transfektion von HCV full length RNA in RLI-transfizierte Zellen ...... 98 5. Zusammenfassung ...... 107 6. Literaturverzeichnis ...... 109 7. Anhang...... 117 7.1. Plasmidkarten ...... 117 7.2. Sequenzen und Alignments ...... 121 8. Danksagung ...... 137 9. Publikationsliste...... 138 10. Lebenslauf ...... 139 11. Erklärung ...... 140 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Genomische Organisation des Hepatitis C Virus...... 2 Abbildung 2: Stammbaum der HCV Geno- und Subtypen sowie deren geographische Verbreitung...... 4 Abbildung 3: Hepatitis C Prävalenz ...... 5 Abbildung 4: Schematische Darstellung der HCV Replikation ...... 6 Abbildung 5: Darstellung von branched DNA Assay und reverser Transkriptase PCR.... 11 Abbildung 6: schematische Darstellung des 2’-5’Oligoadenylatsynthetase-System ...... 15 Abbildung 7: Schematische Darstellung der PCR...... 18 Abbildung 8: Sequenz-unabhängige Fluoreszenzfarbstoffe...... 20 Abbildung 9: Sequenzspezifische TaqMan Sonde ...... 21 Abbildung 10: TaqMan 7900HT ...... 22 Abbildung 11: Optisches System des ABI PRISM™ 7700 ...... 22 Abbildung 12: RotorGene™ 3000...... 22 Abbildung 13: Querschnitt der Reaktionskammer des RotorGene™ 6000 ...... 22 Abbildung 14: Verdünnungsreihe der RNase L ...... 50 Abbildung 15: Verdünnungsreihe der RLI...... 50 Abbildung 16: Verdünnungsreihe der 18S rRNA ...... 51 Abbildung 17: Verdünnungsreihe von GAPDH...... 51 Abbildung 18: Spezifität der real time PCRs zum Nachweis der mRNAs von RNase L, RLI, GAPDH sowie der 18S rRNA ...... 52 Abbildung 19: Kreuzreaktivitätstest des HCV RotorGene System...... 53 Abbildung 20: Analytische Sensitivität des HCV RotorGene System...... 55 Abbildung 21: Nachweis verschiedener HCV Subtypen im HCV RotorGene Assay ...... 56 Abbildung 22: Sequenzierung der verwendeten RLI–Fragmente ...... 58 Abbildung 23: Vergleich der Transfektionsreagenzien jetPEI und FuGene 6 ...... 60 Abbildung 24: Einfluss der Transfektion auf die 18S rRNA ...... 61 Abbildung 25: RLI-Kinetik nach Transfektion mit pcDNA3.1/V5-His_RLI ...... 62 Abbildung 26: Vergleich der RLI-Transkriptionsraten nach Transfektion mit pcDNA3.1/V5-His_RLI und pl.18_RLI...... 63 Abbildung 27: Immunfluoreszenzen gegen den His-Tag der transfizierten pl.18_RLI Plasmide...... 64 Abbildung 28: RLI-Expression in stabil transfizierten FRhK-4-Klonen ...... 66 Abbildung 29: Bestimmung relativer Einheiten RLI-mRNA der FRhk-4-Klone 4 und 5. 67 Abbildung 30: RLI-Kinetik der FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5 ...... 68 Abbildung 31: RLI-Expression in FRhK-4-6er Zellen...... 69 Abbildung 32: Titerbestimmung und Genotypenanalyse HCV-positiven Frischplasmas.. 72 Abbildung 33: Stabilität von HCV-RNA in DMEM (lineare Darstellung)...... 74 Abbildung 34: Stabilität von HCV-RNA in DMEM (logarithmische Darstellung)...... 74 Abbildung 35: RLI-Expression der FRhK-4-RLI-Klone bei HCV Infektion ...... 76 Abbildung 36: RNase L-Expression der Klone bei HCV Infektion...... 76 Abbildung 37: Transkriptionsrate des RLI 3 Wochen nach HCV Infektion mit dreimaliger RLI-Transfektion ...... 78 Abbildung 38: Transkriptionsrate der RNase L 3 Wochen nach HCV Infektion mit dreimaliger RLI-Transfektion ...... 78 Abbildung 39: RotorGene Lauf der in vitro transkribierten HCV-RNA...... 81 Abbildung 40: RNase L-Expression in IVT-transfizierten Zellen ...... 82 Abbildung 41: HCV RNA-Titer in IVT-transfizierten Zellen...... 83 Abbildung 42: RLI-Expression in IVT-transfizierten Zellen ...... 84 Abbildung 43: RLI-Expression in IVT- und RLI-transfizierten Huh7-Zellen ...... 85 Abbildung 44: RLI-Expression in IVT- und RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen...... 86 Abbildung 45: HCV Titer in IVT- und RLI-transfizierten Zellen...... 88 Abbildung 46: RNase L-Expression in IVT- und RLI-transfizierten Huh7-Zellen ...... 89 Abbildung 47: RNase L-Expression in IVT- und RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen ...... 89 Abbildung 48: schematische Darstellung der zellulären viralen Abwehr mit Angriffsstellen des Hepatitis C Virus...... 99 Abbildung 49: schematische Darstellung von genomischer HCV RNA und subgenomischer Replikon RNA ...... 106

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Taxonomie der Familie Flaviviridae...... 1 Tabelle 2: In dieser Arbeit verwendete PCR-Primer...... 27 Tabelle 3: In dieser Arbeit verwendete Plasmide...... 29 Tabelle 4: In dieser Arbeit verwendete Restriktionsenzyme...... 30 Tabelle 5: PCR-Effizienz...... 49 Tabelle 6: Zusammenfassung der Daten der Sensitivitätsläufe...... 54 Tabelle 7: berechnete Wahrscheinlichkeiten, mit denen die Proben im HCV RotorGene System nachgewiesen werden konnten ...... 54 Tabelle 8: Darstellung der kalkulierten Konzentrationen der HCV Eluate und berechneten Konzentrationen der auf 50 IU/ml eingestellten Plasmaproben... 56 Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung bDNA branched / verzweigte DNA bp basepair / Basenpaar(e) BSA Rinderserumalbumin bp Basenpaar bzw. beziehungsweise ca. circa cDNA komplementäre DNA cm2 Quadratzentimeter CMV Cytomegalie Virus cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure ct cycle treshold / Zyklus, in dem die Fluoreszenz erstmals über die Hintergrund-Fluoreszenz ansteigt cp crossing point / entspricht dem ct °C Grad Celsius cop copy / Kopie CO2 Kohlendioxid d Tag(e) DMEM Dulbeccos Modification of Eagles Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonucleinsäure dNTPs desoxy-Nukleotidtriphosphate dsRNA doppelsträngiger RNA EBV Epstein Barr Virus EGTA Ethylenglykol-bis-(2-aminoethylethyl)-tetraessigsäure EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EIA Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay EMCV Enzephalomyokarditis Virus et al. et alteri / und andere Fa Firma FCS fetales calf serum / fötales Kälberserum FITC Fluoresceinisothiocyanat FRhK-4 fetal monkey rhesus kidney cells g Gramm GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase G418 Geneticindisulfat h Stunde(n) HAV Hepatitis A Virus HBV Hepatitis B Virus HCC hepatozelluläres Karzinom / Leberzellkarzinom HCV Hepatitis C Virus HIV human immunodeficiency virus / menschliches Immunschwäche Virus HSV Herpex Simplex Virus HTLV humanes T-Zell-Leukämie Virus Huh7 humane Hepatoma-Zellen IFN Interferon IF-2 Initialisierungsfaktor 2 IRF-3 interferon regulated factor 3 IRES internal ribosomal entry side IVT in vitro Transkript IU international unit / internationale Einheit μl Mikroliter kb Kilobasen min Minute(n) ml Milliliter MOI multiplicity of infection / Anzahl der Infektionen mRNA messenger Ribonukleinsäure NaCl Natriumchlorid NCBI biologische Datenbank ng Nanogramm nm Nanometer OA 2’ 5’ Oligoadenylate OAS 2’-5’Oligoadenylatsynthetase-System / Oligoadenylatsynthetase ORF open reading frame / offener Leserahmen PCR polymerase chain reaction / Polymerase Kettenreation PBS phosphat buffered saline / Phosphat-gepufferte Salzlösung PCR Polymerase-Ketten-Reaktion pH pondus hydrogenii = negativer dekatischer Logarithmus der H+-Konzentration pH = -log [H+] polyIC polyinosinic acid PKR Proteinkinase R RFLP Restriktions-Fragmente-Längen-Polymorphismus RG RotorGene RIBA Recombinant Immunoblot Assay RLI RNase L Inhibitor RNA Ribonukleinsäure RT Reverse Transkriptase RT-PCR Reverse Transkription mit anschließender Polymerase-Ketten-Reaktion Real time PCR s Sekunde(n) Sd Sonde Tab. Tabelle rpm rounds per minute / Umdrehungen pro Minute UTR untranslatierte Region VSV Vesikuläres Stomatitis Virus z.B. zum Beispiel % Prozent Einleitung

1. Einleitung

1.1. Hepatitis C Virus

1.1.1. Taxonomie

Bis zu ihrer molekularen Identifikation aus dem Serum eines Schimpansen 1989 (Choo et al., 1989) wurden die Hepatitis C Viren (HCV) den NonA-NonB-Hepatitisviren zugeordnet. Zu diesen Viren werden alle Erreger von Leberentzündungen gezählt, die nicht durch die Hepatitis A oder B Diagnostik erfasst werden (Modrow et al., 2003). Die kugelförmigen Viruspartikel besitzen einen Durchmesser von 55 – 65 nm mit stachelförmigen Oberflächenproteinen und lassen sich mit Hilfe der Sucrose- Dichtezentrifugation in der 1,14 – 1,16 g/ml Fraktion anreichern (Kaito et al., 1994). Das Genom des Hepatitis C Virus besteht wie das der Pestiviren und Flaviviren aus einer einzelsträngigen RNA in Plusstrangorientierung. Der ähnliche Genomaufbau von HCV, Pestiviren und Flaviviren führte zur Einordnung des Hepatitis C Virus als eigenständiges Genus Hepacivirus in die Familie der Flaviviridae (Major et al., 2001). Die Familie der Flaviviridae umfasst die drei Genera Flavivirus, Pestivirus und Hepacivirus (siehe Tabelle 1).

Tabelle 1: Taxonomie der Familie Flaviviridae und charakteristische Vertreter der Genera Familie Genus Vertreter Natürlicher Wirt

Flavivirus Gelbfieber-Virus Mensch, Affen

West-Nil-Virus Mensch, Vögel

Denguevirus Mensch, Affen

Pestivirus Schweinepest-Virus Schweine

Flaviviridae Border-Disease-Virus Schafe

Hepacivirus Hepatitis C Virus Mensch

Nichtklassifizierte Hepatitis G Virus Affen

Flaviviridae

1 Einleitung

1.1.2. Genomorganisation

Das Hepatitis C Virus ist ein RNA Virus mit einem ca. 9600 Basen großen RNA Einzelstrang in positiver Orientierung. Der RNA Einzelstrang enthält einen offenen Leserahmen (ORF), welcher für ein Polyprotein mit über 3000 Aminosäuren kodiert. Nach der Spaltung durch virale und wirtsspezifische Enzyme entstehen aus diesem Polyprotein zehn Polypeptide (siehe Abbildung 1)(Lyra et al., 2004).

Abbildung 1: Genomische Organisation des Hepatitis C Virus (Lyra et al., 2004). UTRs am 5’ und 3’Ende der RNA flankieren ein ca. 3000 Aminosäuren großes Polyprotein, welches in die zehn Polypeptide Core, E1 und E2, P7, NS2, NS3, NS4A/B und NS5A/B gespalten wird. Die Nukleotidpositionen entsprechen dem HCV Stamm J4 (Acc.nr D10749).

Die 5’untranslatierte Region (UTR) ist hoch konserviert und wird daher häufig als Targetregion für diagnostische Assays verwendet. Das Core-Protein stellt das virale Nukleokapsid, die Glykoproteine E1 und E2 die viralen Hüllproteine des Virus dar. Die Proteine E1 und E2, mit molekularen Massen von 31 und 70 kDa interagieren miteinander und bilden Heterodimere. Die E1 Region wird in der klinischen Diagnostik zur Genotypisierung genutzt (Lyra et al., 2004). Das Glykoprotein E2 besitzt Bindungsstellen für das Membranprotein CD81 und wird mit dem Viruseintritt in die Leberzelle in Verbindung gebracht (Pileri et al., 1998). Das P7-Protein zwischen E2 und NS2 ist ein sehr hydrophobes Polypeptid mit unbekannter Funktion (Bartenschlager & Lohmann, 2000). Das NS2-Protein ist ein Transmembranprotein, welches mit der C-terminalen Region im Lumen des endoplasmatischen Retikulums und mit der N-terminalen Region im Zytoplasma lokalisiert ist (Santolini et al., 1995).

2 Einleitung

Das NS3-Protein ist ein Protein mit Eigenschaften als Serinprotease, NTPase und RNA- Helikase. Die katalytischen Eigenschaften der Serinprotease sind notwendig für die Spaltung der Nicht-Strukturproteine NS3, NS4 und NS5. Die NS4-Region wird in die Proteine NS4A und NS4B gespalten. Diese gelten als Kofaktoren der NS3-Serinprotease. NS5 wird ebenfalls in zwei kleinere Proteine gespalten: NS5A und NS5B. Die genauen Aufgaben von NS5A und B sind noch nicht vollständig aufgeklärt. NS5A könnte als Komponente im viralen Replikationszyklus beteiligt sein. NS5B könnte als virale RNA Replikase während der HCV-RNA Synthese involviert sein (Tomei et al., 1993).

1.1.3. Genotypen

Der Vergleich der HCV Genome verschiedenster Isolate zeigt eine große genetische Heterogenität. Es existieren verschiedene Modelle zur Genotypisierung von Hepatitis C Viren. Dazu zählen zum Beispiel die RFLP Analyse (Restriktions-Fragment-Längen- Polymorphismus, Methode beschrieben in Alberts et al. (1995)) der 5’ UTR, reverse Dot Blot (Methode beschrieben in Saiki et al. (1989)) Hybridisierungsanalysen der 5’ UTR oder die nested PCR (Methode beschrieben in Gassen et al. (1994)) der Core Genregion. Die bewährteste Methode, um Sequenzunterschiede zwischen HCV Isolaten verschiedener Genotypen festzustellen, sind PCR Amplifikationen und Sequenzierung definierter Genomabschnitte wie Core, E1 und NS5. Auf der Grundlage von Sequenzunterschieden der kodierenden und nichtkodierenden Regionen wurden im Laufe der Zeit verschiedene Klassifikationssysteme vorgeschlagen. Eine 1990 von Enomoto vorgeschlagene Unterteilung der Hepatitis C Viren in HCV-K1 und HCV-K2 basiert auf der Sequenzanalyse eines 400 bp großen cDNA Fragmentes des NS5-Gens (Enomoto et al., 1990) (siehe auch Kapitel 1.1.2). 1992 wurde auf der Basis von Sequenzunterschieden innerhalb begrenzter Core Genregionen eine Einteilung des Hepatitis C Virus in die Genotypen I, II, III und IV entwickelt (Okamoto et al., 1992). Durch die phylogenetischen Eigenschaften der Genotypen I bis IV schlugen Chan et al. (1992) eine neue Nomenklatur vor, in der die Genotypen I und II als 1a/1b, Genotyp III und IV als 2a/2b zusammengefasst werden sollten. In einer Studie von 1993 wurde von 51 HCV Isolaten die gesamte Nukleotidsequenz des E1 bestimmt und aus den Unterschieden 12 verschiedene Genotypen generiert (Bukh et al., 1993). Ebenfalls 1993 wurde die

3 Einleitung

Einteilung des Hepatitis C Virus in 6 Haupt-Genotypen und eine Reihe von Subtypen anhand der phylogenetischen Analyse des NS5 vorgeschlagen (Simmonds et al., 1993). Relativ konservierte Regionen des HCV Genoms wie Core, E1 oder NS5 wurden ausführlich studiert und als Grundlage der heutigen Klassifikation der Isolate verwendet. Die Einteilung des Hepatitis C Virus erfolgt in 6 Genotypen und mehr als 50 Subtypen (Major et al., 2001). Die Genotypen werden mit arabischen Ziffern bezeichnet (1, 2, …), unterschiedliche Subtypen zusätzlich mit kleinen Buchstaben (1a, 1b, …) charakterisiert. Mit Hilfe phylogenetischer Stammbäume und der kompletten Sequenzanalyse von Core, E1 und NS5 fand eine Reklassifizierung der HCV-Typen 7, 8, 9 und 11 in den gemeinsamen Subtyp 6a sowie der Eingruppierung von 10a zu Genotyp 3 statt (Simmonds et al., 1996). Genotypen unterscheiden sich in 31 % bis 33 % ihrer Nukleotidsequenz voneinander, Subtypen in 20 % bis 25 % (Simmonds et al., 2005). Anhand der Nukleotidsequenzen des kompletten offenen Leserahmens wurde von Simmonds et al. (Simmonds et al., 2005) der Stammbaum der verschiedenen HCV Genotypen und Subtypen erstellt (siehe Abbildung 2).

Abbildung 2: Stammbaum der HCV Geno- und Subtypen sowie deren geographische Verbreitung (Simmonds et al., 2005). Der Stammbaum ist aufgebaut auf den kompletten Sequenzen des offenen Leserahmens der verschiedenen HCV Genotypen.

4 Einleitung

1.1.4. Verbreitung

Das Hepatitis C Virus ist weltweit verbreitet, wobei ca. 3 % der Bevölkerung chronisch mit dem Virus infiziert sind. Dabei sind, wie in Abbildung 3 ersichtlich, deutliche regionale Unterschiede in der Durchseuchungsrate zu beobachten (Wasley & Alter, 2000). Die Prävalenzraten reichen von 0,15 % in Skandinavien bis zu 44 % in Nordwest Ägypten und Südkamerun. In Westeuropa, den USA, Indonesien und Japan liegen die Prävalenzraten bei 0,2 - 2 %, in Südamerika und Asien bei 2,5 %. In den meisten Afrikanischen Ländern liegt die Infektionsrate bei 5 % (Maertens & Stuyver, 1997). Die einzelnen Genotypen sind weltweit unterschiedlich häufig zu finden. Genotyp 6 findet sich beispielsweise fast ausschließlich in Vietnam, Genotyp 4 hauptsächlich in Ägypten und im Nahen Osten. Genotyp 5 trat bisher lediglich in Südafrika auf. In Europa und den USA findet sich am häufigsten der Genotyp 1, in Japan die Genotypen 1 und 2 (Dusheiko et al., 1994). In Europa sind die Genotypen 1 und 3 am häufigsten vertreten, wobei Genotyp 3 vorwiegend bei Drogenabhängigen zu finden ist.

Abbildung 3: Hepatitis C Prävalenz. Quelle: WHO International Travel and Health 2003

1.1.5. Replikation

Aufgrund fehlender Zellkultursysteme und Tiermodelle ist der Replikationszyklus des Hepatitis C Virus noch nicht vollständig bekannt. Auf der Basis verschiedener Modellsysteme und den bekannten Replikationszyklen von Flaviviren und Pestiviren wird die Replikation des Hepatitis C Virus wie in Abbildung 4 dargestellt vermutet.

5 Einleitung

Abbildung 4: Schematische Darstellung der HCV Replikation in Anlehnung an das Modell von Thomson & Liang (2000).

Als ein möglicher hepatozellulärer Rezeptor für das Hepatitis C Virus wurde das Membranprotein CD81 identifiziert, da in vitro starke Wechselwirkungen zwischen CD81 und dem E2 festgestellt wurden (Bartosch et al., 2003; Lindenbach et al., 2005; Pileri et al., 1998). Möglicherweise bindet das Hepatitis C Virus auch wie andere Vertreter der Flaviviridae an den low-densitiy-lipoprotein (LDL) Rezeptor. Sowohl die Endozytose des HCV-LDL-Rezeptorkomplexes als auch seine Inhibition durch einen Anti-LDL-Rezeptor- Antikörper konnten in vitro bereits demonstriert werden (Major et al., 2001). Obwohl der zelluläre Rezeptor für HCV bisher nicht eindeutig identifiziert werden konnte, ist die Bedeutung des E2 unumstritten. Durch E2-spezifische Antikörper kann der Eintritt des Virus in die Zelle verhindert werden (Rosa et al., 1996). Nach der Bindung an die zelluläre Oberfläche wird das Virus mittels Endozytose aufgenommen. Durch Ansäuerung des Endosoms verschmilzt die Endosomenmembran mit der Virushülle (uncoating). Das HCV Genom wird direkt im Zytoplasma der Wirtszelle translatiert. Es ist nicht mit einer Cap-Struktur versehen (Bartenschlager & Lohmann, 2000). Das HCV Genom besitzt eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES), welche die Translation am rauen endoplasmatischen Retikulum vermittelt. An der Ausbildung eines Replikationskomplexes sind alle Nicht-Strukturproteine des Virus beteiligt (Dimitrova et al., 2003). Es wird zunächst ein Negativ-RNA-Strang produziert, der als Matritze für neue Plus-RNA-Stränge

6 Einleitung dient. Die Hülle enthält das Virus durch Knospung vom endoplasmatischen Retikulum (Bartenschlager & Lohmann, 2000).

1.1.6. Übertragungswege

Die Übertragung des Hepatitis C Virus erfolgt hauptsächlich durch Blut oder Blutprodukte. Obwohl das Virus auch in diversen Körperflüssigkeiten nachweisbar ist, schließen zahlreiche epidemiologische Studien eine Infektion durch Speichel, Schweiß, Tränen, Sperma und Muttermilch nahezu aus (Schreier et al., 2003). Daher sind intravenöse Injektionen (z.B. Drogenkonsum) oder Transfusionen die Hauptursache von HCV Infektionen. Ein weiteres Infektionsrisiko geht von Organtransplantationen und Dialysebehandlungen aus (Hepatitis C Ausbruch in der DDR 1978/79 (Roggendorf et al., 2000)). In bis zu 30 % der HCV Infektionen lassen sich jedoch keine eindeutigen Hinweise auf den Übertragungsweg feststellen (Hoofnagle, 1998). Der verbindliche HCV Antikörpernachweis seit April 1991 für Vollblut und der HCV Genomnachweis mittels Nukleinsäureamplifikation seit 1999 haben das Risiko bei Bluttransfusionen gesenkt (Schreier & Höhne, 2001). Seit dem 1. Juli 1995 unterliegt außerdem nicht inaktiviertes Plasma einer sechsmonatigen Quarantäne (Schreier et al., 2003). Nach dieser Zeit muss der Spender erneut auf HCV getestet werden. Nur wenn dieser Test negativ ausfällt, darf das tiefgefroren gelagerte Plasma als Frischplasma verwendet werden. Dadurch soll das Restrisiko einer nicht erkannten Hepatitis C Infektion in der Fensterperiode minimiert werden. Auch alle Organspender werden heute auf Hepatitis C Antikörper getestet.

1.1.7. Krankheitsbild und Therapie

Bei der Hepatitis C (griechisch hépar, hépatos = Leber, hépatitis = Leberentzündung) handelt es sich um eine virale Leberinfektion, die zu Störungen der Leberzellen und deren Organfunktion führen kann. Die Inkubationszeit des Hepatitis C Virus beträgt zwischen 3 und 12 Wochen. Innerhalb dieser Zeit ist der Infizierte symptomfrei. Die Ansteckung einer weiteren Person ist jedoch bereits möglich. Bis zu 75 % der Infektionen verlaufen völlig inapparent, lediglich bei einem kleinen Teil der Infizierten treten unspezifische Symptome wie grippeähnliche Beschwerden, Müdigkeit oder Übelkeit auf. In ca. 25 % der Erkrankungen tritt eine akute Gelbsucht auf. Bei der akuten Hepatitis C Infektion sind schwere oder tödlich verlaufende Fälle selten (0,2 %). Das Risiko eines Übergangs in eine

7 Einleitung chronische Hepatitis C Erkrankung liegt dagegen bei 50 bis 90 % (Wiese et al., 2000). Die akute Hepatitis C ist durch negative Serologie und positive PCR gekennzeichnet. Die chronische Hepatitis C ist durch positive Serologie, erhöhte Transaminasewerte und positive PCR charakterisiert. Schätzungen des Center for Disease Control and Prevention (CDC) zufolge entwickeln 20 - 50 % der chronisch infizierten Hepatitis C Patienten eine Leberzirrhose, wobei sich die Leber verhärtet, schrumpft und in ihrer Funktionsfähigkeit zunehmend eingeschränkt ist. Aus der Leberzirrhose entwickelt sich wiederum in 25 % der Fälle ein Leberzellkarzinom (HCC) oder ein Leberversagen, welches eine Lebertransplantation erfordert. Leberzellkarzinome entwickeln sich zum Teil erst nach über 20 Jahren (Wiese et al., 2000). Patienten mit einer akuten Hepatitis C haben gute Heilungschancen ohne zusätzliche Behandlung. In einer Studie zeigte sich bei bis zu 52 % der Personen mit einer akuten Hepatitis C innerhalb von 12 Wochen nach Ausbruch der Krankheit eine spontane Viruselimierung. Dagegen entwickelten alle Hepatitis C Patienten ohne Symptome eine chronische Hepatitis (Gerlach et al., 2003). Die Behandlung der chronischen Hepatitis C erfolgt ab drei Monaten nach Ausbruch der Krankheit durch Interferon alpha (Protein mit antiviraler Wirkung; Zytokin). Der Erfolg der Interferon-Monotherapie wird jedoch durch Non-Responder (Patienten ohne Virusverringerung oder Eliminierung) und Rückfälle herabgesetzt. Die Einführung der Kombinationstherapie von Interferon und Ribavirin erhöhte die Therapieerfolge auf 30 – 40 %. Das Medikament Ribavirin ist unter den Handelsnamen Copegus oder Rebetol erhältlich. Es handelt sich dabei um ein Nukleosidanalogon mit virostatischer Wirkung. Gerade Patienten mit HCV Genotyp 1, hoher Viruslast und ausgeprägter Fibrose oder Zirrhose reagierten deutlich besser auf die Kombinationstherapie als auf Interferon-Monotherapie. Die heute eingesetzte Kombinationstherapie aus pegyliertem Interferon und Ribavirin erreicht anhaltende Therapieerfolgsraten von bis zu 60 % (Leung, 2002). Die Kopplung von Interferon an Polyethylenglykol (= pegyliertes Interferon) bewirkt, dass die Interferonproteine eine längere Verweildauer im Körper aufweisen. Pegyliertes Interferon ist unter dem Handelsnamen PEGASYS erhältlich. Eine standardisierte Therapiemethode für Patienten mit Hepatitis C existiert nicht. Aufgrund der hohen Nebenwirkungen der Kombinationstherapie, fehlender Studien der Ribavirinbehandlung bei Kindern oder der kontrainduzierenden Wirkung bei Alkoholismus, Drogenabhängigkeit, Schilddrüsenfunktionsstörungen, Schwangerschaft oder psychischen Erkrankungen muss die Behandlung individuell abgestimmt und

8 Einleitung diskutiert werden. Für Patienten mit chronischer Hepatitis C wird generell eine Impfung gegen Hepatitis A und B empfohlen, sofern noch keine spezifischen Antikörper dagegen vorhanden sind (Schreier et al., 2003).

1.1.8. Diagnostik

Es existiert derzeit keine wirksame Schutzimpfung gegen das Hepatitis C Virus. Auch eine überstandene Hepatitis C Infektion mit vollständiger Viruseliminierung stellt keinen sicheren Schutz gegen eine erneute Infektion dar. Daher basieren alle Schutzmaßnahmen auf der Vermeidung einer Ansteckung. Verschiedenste Tests werden verwendet, um Patienten mit einer Hepatitis C zu erkennen und deren Therapieverläufe zu überwachen. Serologische Tests wie Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest (EIA) bzw. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) werden zum Screening von Blutprodukten eingesetzt (Urdea et al., 1997). Der ELISA wurde 1971 und 1972 von Engvall und Perlmann beschrieben (Engvall & Perlman, 1971; Engvall & Perlmann, 1972). Diese Tests basieren auf der Detektion von Hepatitis C Antikörpern im Serum, welche in nahezu allen Patienten mit einer chronischen Hepatitis C vorkommen. Antikörper gegen das Core- Protein lassen sich wenige Tage bis Wochen nach Beginn der Infektion nachweisen, Antikörper gegen NS3, NS4 oder NS5 erst später (Modrow et al., 2003). Innerhalb der Fensterperiode, d.h. der Zeit zwischen Ansteckung und dem Auftreten von Antikörpern, fallen die Tests jedoch negativ aus. Zur Diagnose von Patienten mit einer akuten Hepatitis C werden daher PCR Tests verwendet, welche das RNA Genom des Virus detektieren (Major et al., 2001).

1.1.8.1. Serologischer Antikörper Test

Im Rahmen einer Studie wurde das erste HCV ELISA System entwickelt (Fa. Ortho- Chemical Diagnostics, Rochester, NY). Es beruhte auf dem rekombinanten Polypeptid c100-3, welches in Hefen exprimiert wurde. Das Polypeptid besteht aus 363 viruscodierenden Aminosäuren der NS4 Region (Cuthbert, 1994) und dient der Detektion zirkulierender viraler Antikörper. Sowohl bei 80 % der Patienten mit chronischer, als auch bei 15 % der Patienten mit einer akuten Hepatitis C konnten diese zirkulierenden Antikörper nachgewiesen werden (Kuo et al., 1989), was jedoch weder hinsichtlich Sensitivität noch Spezifität ausreichend war.

9 Einleitung

Im ORTHO HCV 2.0 ELISA wurden weitere Antikörper gegen das Hepatitis C Virus detektiert. Der zusätzliche Nachweis des strukturellen Epitops c22-3 (Core-Region) und des nichtstrukturellen Epitops c33-c (NS3-Region) bewirkten eine Sensitivitätssteigerung in der Detektion sowohl einer chronischen als auch akuten Hepatitis C (Lazizi et al., 1992). Im Vergleich zum ELISA der ersten Generation ermöglicht dieser ELISA der zweiten Generation bereits einen Antikörpernachweis nach 6 statt 9 Wochen (Cuthbert, 1994). Der ELISA der dritten Generation enthielt ein weiteres zusätzliches Antigen der NS5-Region, was die Sensitivität nochmals steigerte. In den Assays aller drei Generationen werden die rekombinanten Antigene als Fusionsprotein der Superoxid- Dismutase in Saccharomyces cerevisiae exprimiert (Polywka et al., 2000). Ein ergänzender Test zum Ausschluss falsch negativer ELISA Ergebnisse ist das Recombinant Immunoblot Assay (RIBA) der Firma Chiron. In diesem System werden 5 synthetische Antigenpeptide der NS4-Region und 3 der Core-Region auf einem Teststreifen gebunden, mit welchem das Patientenserum getestet wird (Urdea et al., 1997). Auch das RIBA durchlief analog zum ELISA die drei Generationen der Entwicklung. Eine Genotypisierung anhand des Recombinant Immunoblot Assay ist ebenfalls möglich (Schroter et al., 1999). Die serologischen Nachweisverfahren der dritten Generation sind hochsensitiv und spezifisch (98 - 100 %). Für Dialysepatienten wird jedoch eine Absicherung negativer Ergebnisse mittels qualitativem HCV RNA Nachweis angeraten (Colin et al., 2001).

1.1.8.2. Virologische PCR Tests zum Nachweis von HCV RNA

Zum Nachweis der HCV RNA unterscheidet man zwei Methoden: die reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) und den Nachweis mittels branched DNA (bDNA) Assay (siehe Abbildung 5). Die Technik der RT-PCR beruht auf der Isolation viraler RNA und deren reverse Transkription in komplementäre DNA (cDNA). Spezifische Nukleinsäuresequenzen dieser cDNA werden anschließend amplifiziert, detektiert und quantifiziert (Urdea et al., 1997). Die Detektion kann unter anderem durch konventionelle PCR mit anschließender Agarosegelelektrophorese oder durch real time PCR (siehe Kapitel 1.3.3) erfolgen. Nur bei negativer PCR ist ein zusätzlicher Antikörpertest notwendig. Fällt dieser positiv aus, liegt eine ausgeheilte Hepatitis C vor (siehe 1.1.8). Zu den kommerziell erhältlichen HCV

10 Einleitung

PCR Nachweissystemen zählen das AMPLICOR HCV Monitor Assay der Firma Roche Diagnostics (Major et al., 2001; Schroter et al., 2001) und das TM Versant HCV RNA Assay der Bayer Corporation. Bei der Technik der bDNA wird das Signal durch verzweigte DNA (engl. branched DNA) verstärkt und nicht durch die Zielsequenz selbst. Eine der HCV RNA komplementäre Sonde wird zunächst an das RNA Genom gebunden. An diese Sonde wird eine zweite Sonde gebunden, welche viele Abzweigungen (engl. branches) mit Reportermolekülen enthält. Diese Reportermoleküle ermöglichen die Detektion und Quantifizierung der HCV RNA. Die bDNA Assays sind weniger sensitiv als die RT-PCR Systeme. Zu den kommerziell erhältlichen bDNA Tests zählen die Versant HCV RNA Assays der Bayer Corporation (http://www.mediwiss.de/Tests.htm, (Elbeik et al., 2004)).

Abbildung 5: Darstellung von branched DNA Assay und reverser Transkriptase PCR zur Detektion und Quantifizierung von HCV RNA (Quelle: Urdea et al., 1997)

1.1.9. Hepatitis C Virus in Zellkultur

Um die Replikation des Hepatitis C Virus, Wirtszell-Virus-Interaktionen oder mögliche HCV-Therapieansätze genauer untersuchen zu können, ist ein effizientes Zellkultursystem nötig. Bis vor kurzem war es nicht möglich, Hepatitis C Viren in Zellkultur zu züchten. Um Informationen über den Verlauf von HCV Infektionen zu erhalten, wurden infizierte Patienten (Lechner et al., 2000) oder experimentell infizierte Schimpansen (Thimme et al., 2002) in die Studien einbezogen. Die heutigen Systeme zur Replikation viraler HCV RNA in Zellkultur basieren auf Replikons. 1999 entwickelte Lohmann et al. auf der Grundlage subgenomischer RNA das erste HCV Replikon (Lohmann et al., 1999). Dieses enthielt

11 Einleitung zunächst nur die RNA der Nicht-Strukturproteine des HCV Genotyps 1 aus der Leber eines chronisch infizierten Patienten. Die Replikationsrate der Replikons war sehr gering und wurde durch verschiedene Mutationen in fast allen Nicht-Strukturproteinen erhöht (Lohmann et al., 2001). Bis heute replizieren die hinsichtlich ihres Wachstums in Zellkultur veränderten HCV Replikons nur effizient in der humanen Hepatomazelllinie Huh7 (Bartenschlager et al., 2003). 2003 wurde zwar die Etablierung der HCV Replikons in Hela-Zellen (Gebärmutterhalskrebszelllinie) und in Hepa1-6-Zellen (Maus- Krebszelllinie) beschrieben (Zhu et al., 2003), jedoch enthielten auch diese Replikons adaptive Mutationen in den NS4A- und NS4B-Genregionen. Durch zahlreiche adaptive Mutationen in den Sequenzen von NS3, NS4B, NS5A und NS5B wurde die Effizienz der ersten Replikonsysteme in Huh7-Zellen im Laufe der Zeit deutlich verbessert (Lohmann et al., 2003), die HCV Sequenzen jedoch immer weiter von der natürlichen vorkommenden HCV RNA entfernt. Experimente mit HCV Replikons müssen daher nicht einer Infektion mit natürlichen Isolaten entsprechen. 2001 isolierten Kato et al. den hochinfektiösen HCV Stamm JFH-1 aus einem Patienten mit einer fulminanten Hepatitis C (Kato et al., 2001). Die fulminante Hepatitis ist eine seltene Ausnahme bei der HCV Infektion. Im Verlauf der fulminanten Hepatitis C Infektion kommt es innerhalb kürzester Zeit zu einer dramatischen Verschlechterung des Allgemeinzustandes bis hin zum Versagen der Leberfunktion. In der akuten Phase wurde der Patient im Serum PCR positiv getestet, nach Auftreten von HCV Antikörpern negativ. Phylogenetisch wurde JFH-1 als Subtyp 2a klassifizert, unterschied sich jedoch in 5’UTR, Core, NS3 und NS5A deutlich zu den bisher bekannten Subtyp 2a Hepatitis C Viren. Im subgenomischen Replikon replizierte diese RNA ohne anpassende Mutationen sehr effizient in Zellkultur. 2005 wurden nach Transfektion der full length RNA von JFH-1 in Huh7-Zellen die RNA repliziert und neue virale Partikel produziert (Kato & Wakita, 2005). Mit Hilfe dieses Systems kann der gesamte Ablauf einer HCV Infektion vom Viruseintritt bis hin zur Bildung neuer infektiöser Viruspartikel betrachtet werden. Lindenbach et al. zeigten, dass die Virusnachkommen aus dem JFH-1-Replikon mit Hilfe von Antikörpern gegen das Glykoprotein E2 neutralisiert werden (Lindenbach et al., 2005). Sie zeigten weiterhin, dass die Virusreplikation unter anderem durch Interferon alpha gehemmt wird. Die Replikation des Hepatitis C Virus gelang bis heute jedoch nur in Huh7-Zellen und nur mit dem HCV Stamm JFH-1. Es ist daher anzunehmen, dass diese Zellen eine bestimmte Eigenschaft besitzen, welche die Replikation der HCV RNA ermöglicht. Bartenschlager et

12 Einleitung al. vermuten die besondere Eignung der Huh7-Zellen für HCV-Replikationen in einem Defekt der Zellen, auf doppelsträngige RNA zu reagieren (Bartenschlager et al., 2003). Verschiedene Versuche weisen zwar auf mögliche Defekte der Zellen im Signalweg für dsRNA hin, diese konnten jedoch nicht genauer charakterisiert werden (Cheng et al., 2006; Lanford et al., 2003). Was diese Zellen für die HCV Replikonsysteme präferiert ist damit nicht bekannt. Da alle Replikonsysteme aktiv in die Zelle gebracht werden müssen (Transfektion), ist die Analyse des Zelleintritts weiterhin nur begrenzt möglich. Die effiziente Replikation von JFH-1 verläuft wie die der Replikons nur in Huh7-Zellen. Jedoch liefert JFH-1 die Möglichkeit, HCV Infektionen vom Viruseintritt bis hin zum Virusaustritt zu untersuchen. Problematisch ist, dass JFH-1 zum Subtypen 2a gehört, jedoch zu allen bekannten 2a Sequenzen deutliche Unterschiede aufweist. Erkenntnisse durch Infektionen mit JFH-1 beziehen sich nur auf diesen speziellen, extrem virulenten Virusstamm und können nicht unbedingt generalisiert werden. Es ist weiterhin nicht möglich, natürliche Isolate aller Subtypen in Zellkultur anzuziehen. Die klinische Relevanz liegt aufgrund seiner weltweiten Verbreitung und der schlechteren Reaktion auf die Interferon-Therapie bei Genotyp 1. Subtypenspezifische Erkenntnisse sind bisher nur durch Versuche entsprechender Replikons möglich. Die Korrelation experimenteller Ergebnisse mit einer natürlichen Infektion kann nicht unbedingt vorausgesetzt werden. Noch immer ist unklar, warum JFH-1 als einziges Isolat so infektiös ist. Die Unterschiede in den Genomanalysen von JFH-1 und anderen Isolaten könnten erklären, warum einige HCV Stämme unkultivierbar sind.

1.2. Unspezifische Immunabwehr

Die unspezifische Immunabwehr wird auch als natürliches oder angeborenes Immunsystem bezeichnet. Sie besteht aus einer Vielzahl löslicher Stoffe, den Zytokinen. Diese können zum einen Fremdstoffe (Erreger) direkt abwehren oder durch ihre Bindung an Zellen Proliferation, Differenzierung und Apoptose auslösen. Zu den Zytokinen gehören u.a. Interferone, Interleukine und der Tumor-Nekrose-Faktor. Die Interferone wurden 1957 als antiviral wirkende Substanzen erstmals durch Isaacs und Lindenmann beschrieben (Lindenmann & Isaacs, 1957). Sie können von den Zelltypen Fibroblasten, T- Lymphozyten und Makrophagen produziert werden. Interferone werden in die Gruppen Typ I und Typ II Interferone eingeteilt. Die Typ I Interferone werden auch virale Interferone genannt, da sie durch virale Infektionen induziert werden. Zu ihnen zählen

13 Einleitung unter anderem die Interferone α (Leukozyteninterferon) und β (Fibroblasteninterferon). Das Typ II Interferon genannte Interferon γ wird als Immun-Interferon bezeichnet und durch Mitogen- oder Antigenstimulierte T-Lymphozyten produziert (Samuel, 2001). Die Produktion von Interferon α und β stellt eine frühe Reaktion der Zelle dar und besitzt daher eine Schlüsselrolle in der viralen Abwehr. Ein entscheidendes intrazelluläres Signal zur Produktion von Interferon ist das Vorhandensein von doppelsträngiger RNA (dsRNA). Gesunde Zellen enthalten normalerweise keine dsRNA, welche jedoch während vielen viralen Infektionen gebildet wird (Biron, 1998). Die Anwesenheit von dsRNA führt in der Zelle zur Transkription und Translation von Interferonen. Interferone agieren nicht direkt mit dem Virus, sondern induzieren die Synthese von Proteinen, welche den antiviralen Status der Zelle vermitteln. Interferone können zum einen die Expression der RNA abhängigen Proteinkinase (PKR), zum anderen das 2’-5’Oligoadenylatsynthetase-System (OAS) stimulieren (Dougherty et al., 1981). Die Expression der PKR wird vorwiegend durch Interferon α und β stimuliert. Nach Bindung der PKR an dsRNA kommt es intrazellulär zur Aktivierung der PKR durch Autophosphorylierung. Die aktivierte Proteinkinase phosphoryliert den eukaryontischen Initiationsfaktor 2 (IF-2) der Proteinbiosynthese. IF-2 hat die Aufgabe, Met-tRNA zur 40S Untereinheit des Ribosoms zu transportieren und dadurch die Translation zu initiieren. Dabei wird jeweils an IF-2 gebundenes GDP durch GTP ausgetauscht. Durch die Phosphorylierung des IF-2 entsteht ein inaktiver Komplex aus IF-2 und GDP, wodurch die Translation gehemmt wird. Es scheint jedoch eine relative Selektivität für die Hemmung der viralen Translation zu bestehen (Zeuzem et al., 2001).

1.2.1. 2’- 5’Oligoadenylatsynthetase-System und RNase L

Das RNase L System oder OAS ist neben der Hemmung der Proteinsynthese durch die PKR ein wichtiger antiviraler Signalweg und setzt sich aus den drei folgenden enzymatischen Aktivitäten zusammen: der Oligadenylatsynthetase, der 2’-5’-Phosphodiesterase und der RNase L (siehe Abbildung 6). Während Interferon die Expression der Oligoadenylatsynthetase erhöht, ist dsRNA als Kofaktor für die Aktivierung der Synthetase erforderlich (Han & Barton, 2002). Die OAS katalysiert die Polymerisierung von ATP zu 2’-5’Oligoadenylaten (OA). Diese 2’-5’Oligoadenylate aktivieren das Hauptenzym des 2’-5’OAS - die 2’-5’Oligoadenylatabhängige Endoribonuclease L oder RNase L (Bisbal et al., 1995).

14 Einleitung

Abbildung 6: schematische Darstellung des 2’-5’Oligoadenylatsynthetase-System

Die RNase L wurde 1979 von Slattery als 185 kDa großes Protein mit einem isoelektrischen Punkt von 5.5 beschrieben, wobei das Molekulargewicht durch die Analysemethoden, Proteinkonzentrationen oder die Herkunft der Zellextrakte stark schwanken kann (Slattery et al., 1979). Das Enzym kann mit nanomolaren Mengen von 2’-5’Oligoadenylate mit Kettenlängen von drei bis vier Adenylaten reversibel aktiviert werden. Diadenylaten scheint die Fähigkeit der RNase L Aktivierung zu fehlen (Dougherty et al., 1981). 1993 wurde ein 80 kDa großes Polypeptid kloniert, welches 2’-5’Oligoadenylate binden und RNA spalten kann (Zhou et al., 1993). Ein monoklonaler Antikörper, welcher dieses 80 kDa Protein erkennt, neutralisiert die RNase L Aktivität (Bisbal et al., 1995). Die Arbeitsgruppe um C. Bisbal vermutete, dass es sich bei dem 185 kDa großen Protein, welches Slattery als RNase L beschrieben hatte, um einen Proteinkomplex aus mehreren Polypeptiden handelt. Die RNase L wird durch ein einzelnes Gen kodiert und konstitutiv in den Zellen exprimiert. Das latent vorliegende Enzym wird nicht durch Interferon reguliert (Player & Torrence, 1998). An der reversiblen Aktivierung scheint die Bindung von 2’-5’Oligoadenylaten beteiligt zu sein. In Abwesenheit von 2’-5’Oligoadenylaten liegt die RNase L als Monomer und inaktiv vor (Han & Barton, 2002). Nach der Bindung von

15 Einleitung

2’-5’Oligoadenylaten dimerisieren die Monomere, was zur Aktivierung des Enzyms führt (Cole et al., 1997). Die aktive RNase L spaltet virale RNA hauptsächlich an den 3’Enden von UA, UG oder UU Sequenzen in Regionen ohne Wasserstroffbrückenbindung (Dougherty et al., 1981). Die 2’-5’Phosphodiesterase baut 2’-5’Oligoadenylate zu ATP und AMP ab (Han & Barton, 2002), wodurch die Aktivität der RNase L reguliert wird. Die Regulation der RNase L erfolgt sowohl durch die 2’-5’Phosphodiesterase als auch mit Hilfe des RNase L Inhibitors (Benoit De Coignac et al., 1998).

1.2.2. RNase L Inhibitor (RLI)

1995 charakterisierten und klonierten Bisbal et al. ein Polypeptid, welches die RNase L inhibiert (Bisbal et al., 1995). Dieses Polypeptid wurde RNase L Inhibitor (RLI) genannt. Das Protein besitzt eine Größe von 68 kDA und bindet spezifisch an die RNase L. Sequenzanalysen des RLI zeigen, dass die cDNA aus einer 5’ nicht kodierten Region von 118 Nukleotiden besteht, sowie einem ORF bis zu Nukleotid 1914 und einer 3’ nicht translatierten Region von 1654 bp. In der Zelle existieren zwei RLI mRNAs verschiedener Längen. Die mRNAs von 2.8 kb bzw. 3.5 kb unterscheiden sich lediglich in der Länge ihrer 3’ nicht translatierten Region, kodieren jedoch für das gleiche RLI-Protein (Aubry et al., 1996). Möglicherweise ist die 3’-UTR durch ihre Sekundärstruktur und Protein-RNA- Interaktion an der Stabilität der mRNA beteiligt. Die biologische Relevanz der beiden mRNAs ist nicht erforscht (Bisbal et al., 1995). Es wird angenommen, dass das RLI als Regulatorprotein dient, welches die Bindung von 2’-5’Oligoadenylaten an die RNase L inhibiert. Dabei geht das RLI möglicherweise eine direkte Verbindung mit der RNase L ein, um die Bindungsstellen der OA zu blockieren (siehe Abbildung 6). Das RLI fördert weder den Abbau der 2’-5’Oligoadenylate noch ist es selbst daran beteiligt (Bisbal et al., 2001). In Zellkulturversuchen mit dem Enzephalomyokarditis Virus (EMCV) wurde eine verminderte Aktivität der RNase L detektiert (Cayley et al., 1982). Diese Inhibition könnte das Resultat einer erhöhten RLI-Expression während der EMCV Infektion sein. Western-Blot-Analysen der RNase L während der EMCV Infektion zeigten keine verringerten Mengen an RNase L-Protein, während bereits 4 Stunden nach Infektion gesteigerte Mengen RLI-Protein nachweisbar waren. Die stabile Transfektion eines RLI- Antisense-Kontrukts führte zur Hemmung der RLI Inhibition und RNase L Inaktivierung

16 Einleitung

(Martinand et al., 1998). Das EMC-Virus scheint die Produktion des RLI-Proteins aktiv zu steigern und dadurch die Aktivierung der RNase L zu hemmen. Auch für das HI-Virus wurde ein Einfluss auf die Expression des RLI beschrieben (Martinand et al., 1999). In Infektionsversuchen mit HIV in Zellkultur wurden erhöhte Mengen an RLI-Protein nachgewiesen (Martinand et al., 1999). Strukturanalysen des Proteins lassen vermuten, dass das RLI als ein ATP-angetriebenes Enzym an der ribosomalen Biogenese und dem HIV Zusammenbau beteiligt ist (Karcher et al., 2005). In klinischen Studien wurde ebenfalls festgestellt, dass die RNase L in Blutzellen von AIDS Patienten inaktiv ist, obwohl 2’-5’Oligoadenylate als Aktivatoren der RNase L vorhanden sind (Carter et al., 1987). Diese Hemmung der Aktivität der RNase L könnte auf das RLI zurückzuführen sein. In klinischen Studien mit Leberbiopsiematerial chronischer Hepatitis C Patienten wurde dagegen eine signifikante Reduktion der Expression des RNase L Inhibitors festgestellt (Yu et al., 2000). Es könnte daher eventuell ein Einfluss des RLI und der RNase L auf die HCV Infektion vorliegen. Möglicherweise führt eine Reduktion des RLI durch die Replikation des Hepatitis C Virus zu einer Aktivität der RNase L. Ein Gleichgewicht zwischen Virusreplikation und RNase L-Aktivität könnte möglicherweise zur Ausbildung der chronischen Hepatitis führen. Für das Hepatitis C Virus wurden noch keine Zellkulturversuche unter Betrachtung des RLI durchgeführt. Die Transkriptionsraten des RLI unter den experimentellen Bedingungen der HCV Infektion sollten im Rahmen der vorliegenden Arbeit analysiert werden. Die experimentelle Überexpression des RLI sollte eine potentielle Aktivierung der RNase L verhindern und eine initiale Replikation des Virus in Zellkultur ermöglichen.

1.3. Polymerase Kettenreaktion

1.3.1. Historisches

Bereits 1971 führte der Norweger Kjell Kleppe Versuche zur Vervielfältigung von DNA mit Hilfe von Primern durch, welche jedoch nicht weiter verfolgt wurden (Kleppe et al., 1971). 1982 wurde die eigentliche Polymerase Kettenreaktion (PCR) von Kary Mullis erfunden, der 1993 für diese Technik den Nobelpreis erhielt. Mullis verwendete zunächst eine DNA Polymerase, welche bei jedem Denaturierungsschritt zerstört und anschließend neu hinzugefügt werden musste. Später wurde eine hitzestabile Polymerase aus

17 Einleitung

Thermophilus aquaticus (Taq) eingesetzt, wodurch die PCR deutlich vereinfacht werden konnte. Kary Mullis arbeitete für die Firma Cetus Corporation, welche 1992 die Technik sowie das Patent der Taq-Polymerase an die Firma Roche für 300 Millionen Dollar verkaufte (Mullis, 1998). Sowohl in den USA als auch vor dem Europäischen Gerichtshof wurde der Firma Hoffmann-La Roche das Patent für die hitzestabile Taq-Polymerase wieder aberkannt, da die Polymerase aus Thermophilus aquaticus bereits 1980 beschrieben wurde (Kaledin et al., 1980). Das US-Patent für die eigentliche Technik der PCR lief am 28. März 2005 aus.

1.3.2. Prinzip der PCR

Die PCR ist ein in vitro Verfahren zur selektiven Amplifikation von DNA-Bereichen definierter Länge, die von zwei bekannten Sequenzen flankiert werden. Das Originalprotokoll der PCR wurde 1985 in der Zeitschrift Science veröffentlicht. Saiki et al. beschreiben in dieser Arbeit die Vervielfältigung des β-Globin Gens, welches zur Diagnostik der Sichelzellanämie verwendet wurde (Saiki et al., 1985). Das Prinzip der PCR basiert auf der Verdopplung der DNA. Jeder PCR-Zyklus setzt sich aus drei Teilschritten mit verschiedenen Temperaturen zusammen, welche in mehreren Zyklen wiederholt werden (siehe Abbildung 7).

Abbildung 7: Schematische Darstellung der PCR

Im ersten Schritt erfolgt die Auftrennung der Doppelstränge bei 90°C - 95°C in Einzelstränge (Denaturierung). Beim zweiten PCR-Schritt hybridisieren spezifische

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Primer bei 55°C - 65°C an die Einzelstränge (Annealing). Eine Taq-Polymerase vervollständigt im dritten Schritt bei 72°C den neuen Doppelstrang (Amplifikation). Der entstandene Doppelstrang wird im nächsten Zyklus zum Ausgangsmaterial. Durch die mehrfache Wiederholung der Reaktionsfolge von Denaturierung, Hybridisierung und Amplifikation kommt es in jedem Zyklus zu einer Verdoppelung der DNA. Nach n Zyklen sollte die gesuchte DNA theoretisch 2n-fach vervielfacht worden sein. Die Effizienz der PCR ist von Matrize zu Matrize unterschiedlich und vom Optimierungsstatus der Methode abhängig.

1.3.3. Real time PCR

Die real time PCR basiert auf dem Prinzip der Polymerasekettenreaktion und wurde 1992 von Higuchi et al. entwickelt (Higuchi et al., 1992). Konventionelle PCRs detektieren die Amplifikationsprodukte am Ende der Kettenreaktion z.B. mittels Gelelektrophorese, während die real time PCR die Menge der Amplifikate innerhalb der exponentiellen Phase bestimmt. Der Einsatz interkalierender Farbstoffe oder fluoreszenzmarkierter Sonden ermöglicht die direkte Beobachtung des Reaktionsverlaufes. Dadurch ist in der real time PCR eine Quantifizierung des Ausgangsmaterials möglich. Die Quantifizierung basiert auf der Grundlage, dass eine quantitative Beziehung zwischen der Menge des Ausgangsmaterials und der Menge des Amplifikates während der exponentiellen Phase besteht (Bustin, 2004). Nach n Zyklen sollte die gesuchte DNA 2n-fach vervielfacht worden sein, vorausgesetzt die Ausbeute beträgt in jedem Zyklus 100 %. Zu Beginn der Reaktion liegt der Farbstoff nicht-fluoreszierend vor oder fluoresziert nur so schwach, dass das Signal nicht vom Hintergrund unterschieden werden kann (Kubista et al., 2006). Die Fluoreszenz nimmt proportional zur Menge der PCR-Produkte zu (siehe Abbildung 8 und Abbildung 9). Entscheidend für die Quantifizierung ist der cycle threshold oder auch crossing point (ct – oder cp Wert). Dieser Wert beschreibt den Zyklus, in dem die Fluoreszenz erstmals die Hintergrund-Fluoreszenz übersteigt. Die Berechnung der eingesetzten DNA-Menge mit Hilfe einer Standardreihe sowie die Berechnung der PCR-Effizienz werden in Kapitel 2.2.1.4 beschrieben. Vorteile der real time PCR sind die schnelle Durchführbarkeit, der Nachweis der Amplifikation in Echtzeit und die Quantifizierung des Ausgangsmaterials durch eine mitgeführte Standardreihe. Das kleine Reaktionsvolumen in verschlossenen

19 Einleitung

Reaktionsgefäßen vermindert außerdem die Kontaminationsgefahr. Verglichen mit ELISA’s sind real time PCRs ebenso spezifisch und sensitiv (Klein et al., 2003).

1.3.4. Fluoreszenzfarbstoffe

Die Detektion der Amplifikate kann in der real time PCR mit Hilfe sequenz- unspezifischer Farbstoffe (siehe Abbildung 8) oder sequenz-spezifischer Sonden (siehe Abbildung 9) erfolgen. Zu den sequenz-unspezifischen Farbstoffen zählen Ethidiumbromid und SybrGreen. Diese Farbstoffe interkalieren zwischen den Basenpaaren der DNA, wodurch nach Anregung mit ultraviolettem Licht die PCR- Amplifikate fluoreszieren. Ein Nachteil interkalierender Substanzen wie Ethidiumbromid oder SybrGreen ist die geringe Spezifität, da zwischen verschiedenen PCR-Produkten nicht unterschieden werden kann. Es werden sowohl spezifische als auch unspezifische Amplifikate detektiert. Aus diesem Grund sind auch Multiplex-Reaktionen (Nachweis verschiedener spezifischer Templates in einem PCR Reaktionsansatz) mit Hilfe interkalierender Substanzen nicht möglich.

Abbildung 8: Sequenz-unabhängige Fluoreszenzfarbstoffe. Interkalierung von SybrGreen in doppelsträngige DNA

Spezifische Sonden sind teurer als interkalierende Farbstoffe, gewährleisten jedoch die nötige Spezifität und ermöglichen Multiplex-PCR Analysen. Es existieren verschiedene Sondenformate, z.B. HyProbes, TaqMan-Sonden, Molecular Beacons oder MGB Sonden (Eurogentec, 2004; Kubista et al., 2006). Da in dieser Arbeit lediglich TaqMan-Sonden verwendet wurden, sollen nur diese kurz erläutert werden (siehe Abbildung 9). TaqMan- Sonden, auch Hydrolyse-Sonden genannt, sind sequenzspezifische Oligonukleotide, welche an einem Ende mit einem sogenannten Quencher-Farbstoff (z.B. BHQ oder

20 Einleitung

Tamra), am anderen Ende mit einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff markiert sind (z.B. Fam oder Joe). Durch die räumliche Nähe des Quenchers zum Farbstoff wird keine Fluoreszenz detektiert. Während der Amplifikation wird die Sonde durch die Endonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase stückchenweise abgebaut. Dadurch werden Quencher und Fluoreszenzfarbstoff voneinander getrennt. Die Wirkung des Quenchers zum Farbstoff wird aufgehoben und ein Anstieg der Fluoreszenz gemessen.

Abbildung 9: Sequenzspezifische TaqMan Sonde. Die Trennung von Fluorophor und Quencher durch Hydrolyse der Sonde führt zur Entstehung von Fluoreszenz.

1.3.5. ABI PRISM™ Systeme

Die ABI PRISM™ Systeme, auch TaqMan genannt, der Firma Applied Biosystems verwenden 0,2 ml tubes (Reaktionsgefäße) oder 96-well-Platten. Die Beleuchtung der Proben erfolgt in allen Geräten mit Hilfe einer Wolframlampe durch einen einzelnen Anregungsfilter (siehe Abbildung 11). Die Detektion der Fluoreszenz erfolgt mittels Spektograph und einer gekühlten CCD Kamera. Die Laser- oder Halogen-basierenden ABI Systeme sind lediglich zur Detektion von TaqMan oder SybrGreen Chemie entwickelt worden (Bustin, 2004). Der TaqMan 7900HT (siehe Abbildung 10) gehört zur zweiten Generation der real time Systeme von Applied Biosystems. Es ist das einzige Gerät, welches sowohl 96- als auch 384-well-Platten verwenden kann. Außerdem ist es möglich, die Beladung des Geräts

21 Einleitung vollautomatisch durchführen zu lassen. Ein Laser scannt die wells der Reaktionsplatte und regt alle Farbstoffe mit einer kontinuierlichen Wellenlänge von 500 bis 660 nm an. (http://keck.med.yale.edu/affymetrix/rtpcr/quantitative/7900HTbrochure.pdf)

Abbildung 10: TaqMan 7900HT Abbildung 11: Optisches System des ABI PRISM™ 7700

1.3.6. RotorGene™

Der RotorGene™ der Firma Corbett Research (siehe Abbildung 12) unterscheidet sich hauptsächlich durch sein rotierendes Probenkarussel von anderen real time PCR Systemen.

Abbildung 12: RotorGene™ 3000 Abbildung 13: Querschnitt der Reaktionskammer (Quelle: Operator Manual) des RotorGene™ 6000 (Quelle: Operator Manual)

22 Einleitung

Das Gerät verwendet entweder einen 32er Rotor für 0,2 ml PCR-Gefäße oder einen 72er Rotor für spezielle 0,1 ml tubes. Alle Reaktionsgefäße rotieren mit ca. 500 rpm durch eine luftgefüllte Kammer (Bustin, 2004). Temperaturunterschiede zwischen den einzelnen Reaktionsgefäßen (edge effect), wie sie bei Plattensystemen vorkommen, treten im RotorGene nicht auf. Zur Anregung und Detektion der Fluoreszenz bewegen sich alle tubes über die gleiche Optik, wodurch eine Kalibrierung unnötig ist (siehe Abbildung 13). Auch eine passive Referenz wie beispielsweise ROX ist aus diesem Grund nicht nötig (http://www.corbettlifescience.com/shared/images/flash/rotor-gene_brochure_ a4_72dpi.pdf). Der RotorGene kann jede derzeitig verfügbare real time Sondenchemie detektieren. Dabei verwendet das Gerät vier LEDs, welche die Farbstoffe mit den Wellenlängen 470, 530, 585 und 625 nm anregen können. Der Detektionsfilter besitzt 6 Filter zwischen 510 und 660 nm (Bustin, 2004).

23 Einleitung

1.4. Ziel der Arbeit

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine initiale Replikation des Hepatitis C Virus in Zellkultur zu ermöglichen. Hauptaspekt war dabei, die eingesetzte virale RNA nicht zu verändern. In der Annahme, dass bei der HCV Infektion oder Transfektion von full length RNA doppelsträngige Intermediate entstehen, welche die zelluläre RNase L über den OAS-Weg aktivieren, sollte diese mit Hilfe der Überexpression des RLI ausgeschaltet werden. Aktive RNase L degradiert doppelsträngige RNA und verhindert dadurch die virale Replikation. Es sollten Huh7- und FRhK-4-Zellen werden. Humane Leberzellen (Huh7) sind die natürlichen Wirtszellen des Hepatitis C Virus und die Zellen, in denen HCV Replikons und JFH-1 bereits effizient replizieren. Für Klone von FRhK-4-Zellen, welche mit dem RLI transfiziert wurden, konnte in einer Diplomarbeit der Universität Bremen ein gesteigertes HAV Wachstum beobachtet werden (Gotter, 1999). HAV ist wie das Hepatitis C Virus ein einzelsträngiges RNA Virus in Plusstrangorientierung. Es sollte analysiert werden, ob die Zelleigenschaft der FRhK-4-Klone auch auf die Replikation des Hepatitis C Virus einen positiven Einfluß ausübt. Der RNase L Inhibitor sollte aus humaner- und Affen-gesamt-Zell-RNA amplifiziert und in einen Transfektionsvektor kloniert werden. Nach Transfektion in FRhK-4- und Huh7- Zellen sollte die Expressionsrate mittels real time PCR nachgewiesen werden. Für den Nachweis auf Genexpressionsebene sollten zunächst real time PCRs für die Analyse der mRNAs von RNase L, RLI und GAPDH sowie der 18S rRNA entwickelt werden. Es sollte versucht werden, Transfektanten von Huh7- und FRhK-4-Zellen heranzuziehen, welche das RLI stabil überexprimieren. Diese Zellen sollten mit HCV-positivem und infektiösem Frischplasma infiziert werden. Zur Umgehung des kritischen Viruseintritts in die Zellen sollte HCV full length RNA transfiziert werden. Zur Analyse der HCV RNA sollte auf Basis eines existierenden HCV Primer- und Sondensystems der Firma QIAGEN Hamburg GmbH (ehemals artus GmbH) ein neues real time RT-PCR System entwickelt und optimiert werden. Aufgrund qualitativer Schwankungen verwendeter Enzyme im bestehenden HCV Nachweissystem sollte eine Umstellung der Puffer und Enzyme erfolgen. Hinsichtlich einer potentiellen kommerziellen Nutzung des HCV Assays waren neben Spezifität und Sensitivität die Herstellungskosten des Systems ebenfalls Kriterium der Neuentwicklung.

24 Material und Methoden

2. Material und Methoden

2.1. Materialien

2.1.1. Antikörper

Anti His(C-term)-FITC Antibody, Invitrogen, Karlsruhe, Catalog no. R933-25

2.1.2. Bioreagenzien

Alkalische Phosphatase Roche, Mannheim Agarose analytical grade Gibco, Karlsruhe β-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt CIP-Puffer (Dephosphorylation buffer) Roche, Mannheim DMEM Sigma, Deisenhofen DNA-Marker, 100 bp MBI Fermentas, St. Leon-Roth DNA-Marker, 1 kb MBI Fermentas, St. Leon-Roth DNA-Marker, 100 bp ladder plus MBI Fermentas, St. Leon-Roth DNA-Marker, Hyperladder V Bioline, USA DNA-Marker, 1 kb Invitrogen, Karlsruhe DNase I QIAGEN, Hilden Ethanol p.a. Carl Roth, Karlsruhe Ethidiumbromid Merck, Darmstadt FCS Gibco, Karlsruhe FuGene 6 Transfection Reagent Roche, Mannheim Geneticin (G418) Gibco, Karlsruhe Glycerol p.a. Roth, Karlsruhe ISIS DNA Polymerase™ 5U/μl QBiogene,USA LB-Agar (Lennox L Agar) Invitrogen, Karlsruhe LB Broth Base (Lennox Broth Base) Invitrogen, Karlsruhe L-Glutamin Sigma, Deisenhofen

MgSO4 1M Sigma, Deisenhofen

NaHCO3 Sigma, Deisenhofen

25 Material und Methoden

Penicillin10000 U/ml /Streptomycin 10mg/ml Gibco, Karlsruhe Platinum® Taq DNA Polymerase 5U/μl Invitrogen, Karlsruhe Pu3-5x-PCR-Puffer QIAGEN, Hamburg Takara Taq HS 5U/μl Takara, Japan TaqMan® 2x Universal PCR Master Mix (ABI 2x Puffer) Applied Biosystem, USA Tetrazyklinhydrochlorid Sigma, Deisenhofen Trypsin-EDTA (2,5 mg/ml Trypsin + 1,25 mg/ml EDTA) Sigma, Deisenhofen jetPEI QBiogene,USA human liver total RNA Ambion, Austin / USA human kidney total RNA Ambion, Austin / USA

2.1.3. Gebrauchsfertige Kits

Endofree Plasmid Maxi Kit QIAGEN, Hilden MEGAscript® High Yield Transcription Kit Ambion, Austin / USA NucleoSpin® Plasmid Kit Machery-Nagel, Düren pcDNA3.1/V5-His© TOPO® TA Expression Kit Invitrogen, Karlsruhe Rapid DNA Ligation Kit MBI Fermentas, St. Leon-Roth RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit MBI Fermentas, St. Leon-Roth RNeasy® Mini Kit QIAGEN, Hilden QIAamp®Viral RNA Mini Kit QIAGEN, Hilden QIAGEN® Plasmid Mini Kit QIAGEN, Hilden QIAprep® Mini Kit QIAGEN, Hilden QIAquick® Gel Extraction Kit QIAGEN, Hilden RealArt TM HAV LC RT PCR Reagents QIAGEN, Hamburg

2.1.4. Geräte

ABI PRISM™ 7900HT Applied Biosystem, USA Artus 3000/RotorGene™ 3000 Corbett, Research, Australia BioPhotometer Eppendorf, Hamburg Brutschrank Heraeus, Hanau Elektrophoresekammer Bio-Rad, Herculas, CA, USA Fluoreszenzmikroskop "Axioskop 2" Carl Zeiss, Jena

26 Material und Methoden

Geldokumentationsanlage Kodak, Stuttgart Kolbenhubpipetten (verschiedene Größen) Eppendorf, Hamburg Tischzentrifugen Eppendorf und Heraeus Schüttler LTF-Labortechnik, Wasserburg Mastercycler 5330 Eppendorf, Hamburg

2.1.5. Medien und Lösungen

DMEM: DMEM Pulver für 500 ml, 2mM L-Glutamin, 26 mM NaHCO3, 50 ml FCS, 5 ml Penicillin/Streptomycin Im Folgenden bezieht sich die Bezeichnung Medium oder DMEM immer auf das komplette Medium mit allen zugefügten Komponenten.

PBS (Phosphat buffered saline/Phosphat-gepufferte Salzlösung): 1xPBS: 8 g NaCl, 0,2 g

KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 , 1l destilliertes Wasser, autoklaviert.

Einfriermedium: 10%DMSO in FCS

LB-Medium: 20 g LB Broth Base, 1l destilliertes Wasser, autoklavieren

LB-Agarplatte: 32 g LB-Agar, 1l destilliertes Wasser, autoklavieren Nach dem Autoklavieren ca. 25 ml LB-Agar pro Platte gießen und erkalten lassen

2.1.6. Oligonukleotide

Tabelle 2: In dieser Arbeit verwendete PCR-Primer (Metabion, Martinsried). Name Sequenz und Nukleotidposition Anwendung RNase L for 5`-GAC CTG CTG GGT CAT CCC TT-3´ Vorwärtsprimer RNase L Nukleotidposition 1901-1920 NCBI NM_021133 RNase L rev 5´-CAT TTC CCA CAT TCC GAA GC -3` Rückwärtsprimer RNase L Nukleotidposition 1971-1952 NCBI NM_021133 RNase L Sd 5´-FAM-TTT TGG ACT TGG GAG AGC CGC Sonde RNase L TAT AGG A-TAMRA-3´ Nukleotidposition 1923-1950 NCBI NM_021133

27 Material und Methoden

RLI for 5`-AAG ACT GAT GGC AGC TCG AGT T -3´ Vorwärtsprimer RLI Nukleotidposition 898-919 NCBI X74987 RLI rev 5´- ATG ACG CGA TCC GCT AGA TAG -3` Rückwärtsprimer RLI Nukleotidposition 1007-987 NCBI X74987 RLI Sd 5´-FAM-CGT TTC ATA CTC CAT GCA AAA Sonde RLI AAG ACA GCC TTT -TAMRA-3´ Nukleotidposition 926-958 NCBI X74987 RLI full nah 5’ – TCG TTT CTC CAG AAG AGC TGG ATA Vorwärtsprimer für die full- for T – 3’ lenght Amplifikation des Nukleotidposition 79-103 NCBI X76388 RLI full nah 5’ – GTA AAT ACT CCT TTT AAT AAA TGG Rückwärtsprimer für die rev CTT ATC AAT – 3’ full- lenght Amplifikation Nukleotidposition 1965-1933 NCBI X76388 des RLI RLI full for 5’ – ATG GCA GAC AAG TTA ACG AGA Vorwärtsprimer für die full- direkt ATT GCT – 3’ lenght Amplifikation des Nukleotidposition 118-144 NCBI X76388 RLI RLI full rev 5’ – CGA ATC ATC CAA GAA AAA GTA Rückwärtsprimer für die ohne Stop GTT TCC ACT – 3’ full- lenght Amplifikation Nukleotidposition 1898-1917 NCBI X76388 des RLI ohne Stop-Codon 18S rRNA 5`- ACG GCT ACC ACA TCC AAG GA -3’ Vorwärtsprimer 18S rRNA for Nukleotidposition 550-569 NCBI M10098 18S rRNA 5´- CCA ATT ACA GGG CCT CGA AA -3` Rückwärtsprimer 18S rRNA rev Nukleotidposition 660-640 NCBI M10098 18S rRNA 5´-FAM- CAG GCG CGC AAA TTA CCC ACT Sonde 18S rRNA Sd CC -TAMRA-3´ Nukleotidposition 576-588 NCBI M10098 GAPDH for 5`- CCT GCA CCA CCA ACT GCT TAG -3´ Vorwärtsprimer GAPDH Nukleotidposition 512-532 NCBI BC025925 GAPDH rev 5´- CAG TCT TCT GGG TGG CAG TGA -3` Rückwärtsprimer GAPDH Nukleotidposition 622-601 NCBI BC025925 GAPDH Sd 5´-FAM- ACA ACT TTG GTA TCG TGG AAG Sonde GAPDH GAC TCA TGA CC -TAMRA-3´ Nukleotidposition 557-588 NCBI BC025925

28 Material und Methoden

T7 5’ –TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG -3’ Vorwärtsprimer zur Sequenzierung des Inserts aus pcDNA3.1/V5-His BGH rev 5’ –TAG AAG GCA CAG TCG AGG –3’ Rückwärtsprimer zur Sequenzierung aus pcDNA3.1/V5-His

2.1.7. Plasmide

Tabelle 3: In dieser Arbeit verwendete Plasmide. Plasmid Charakteristika Herkunft pcDNA3.1/V5-His Vektor zur Klonierung von PCR- Invitrogen, Karlsruhe Topo TA Fragmenten in E.coli pcDNA3/RLI 3’ Klonierungsvektor, abgeleitet von (Bisbal et al., 1995) pcDNA3.1, der das humane RLI enthält pcDNA3.1/V5-His- Klonierungsvektor, abgeleitet von Teil dieser Arbeit m_RLI pcDNA3.1/V5-His, der das Affen (monkey) -RLI enthält pcDNA3.1/V5-His- Klonierungsvektor, abgeleitet von Teil dieser Arbeit h_RLI pcDNA3.1/V5-His, der das humane-RLI enthält pl.18 Vektor zur Klonierung von PCR- Jim Robertson; NCBI Fragmenten in E.coli pl.18-m_RLI Klonierungsvektor, abgeleitet von pl.18, Teil dieser Arbeit der das Affen (monkey) -RLI mit His- Tag enthält pl.18-h_RLI Klonierungsvektor, abgeleitet von pl.18, Teil dieser Arbeit der das humane-RLI mit His-Tag enthält P90/HCV FL-long PU Klonierungsvektor, abgeleitet von Ph.D. C. M. Rice pBR322, der die komplette Konsensus (Washington University in cDNA des HCV-Isolats H77 St. Louis, School of (Kolykhalov et al., 1997) vom Genotyp Medicine, Department of 1a unter der Kontrolle eines T7 Molecular Microbiology) Promoters enthält

29 Material und Methoden pSV2neo Vektor mit G418 Resistenzgen zur Clontech, U.S.A Kotransfektion von pl.18 ZC-5.1 pBluescript abgeleiteter Vektor mit der zur Verfügung gestellt von RNase L als Insert R.Silverman (Cleveland Clinic Foundation)

2.1.8. Restriktionsendonukleasen

Tabelle 4: In dieser Arbeit verwendete Restriktionsenzyme. Restriktionsenzym Schnittstelle Firma EcoRI G↓AATTC Roche, Mannheim EcoRV GAT↓ATC Roche, Mannheim Hind III A↓AGCTT MBI Fermentas, St. Leon-Roth Kpn I GGTAC↓C Roche, Mannheim Mss I (Pme I) GTTT↓AAAC MBI Fermentas, St. Leon-Roth Mva1269I (Bsm I) GAATGC(N)1/-1↓ MBI Fermentas, St. Leon-Roth Xba I T↓CTAGA Roche, Mannheim Xho I C↓TCGAG MBI Fermentas, St. Leon-Roth

2.1.9. Software

ABI 7900HT SDS 2.1 Applied Biosystem, USA DNASTAR: MegAlign und EditSeq Vers 5.06 DNASTAR Inc., Madison EndNote 5.0 Thomson Scientific, London Kodak ds 1D Vers. 2.0.3 Kodak digital science, Rochester, USA. Microsoft Word/Exel 2002 Microsoft GmbH, Unterschleißheim Plasmid Processor 1.02 University of Kuopio, Finnland Primer Express Version 2.0.0 Applied Biosystem, USA PriProbit Vers. 1.63 Kyoto University, Kyoto, Japan RotorGene Software Version 5.0.63 Corbett Research, Australia Sequence Navigator Version 1.0.1 Perkin Elmer, USA

30 Material und Methoden

2.1.10. Verbrauchsmaterialien

Pipetten 10 ml, 25 ml Sarstedt, Nümbrecht Zellkulturflaschen 75 cm2 Nunc, Wiesbaden Zellkultkurplatten 6-well, 24-well, 96-well Nunc, Wiesbaden Eppendorfgefäße 1,5 ml, 2 ml Eppendorf, Hamburg Schalen 6 cm, 10 cm Nunc, Wiesbaden Falkons 15 ml, 50 ml Sarstedt, Nümbrecht 0,5 ml Thermo-tubes Abgene, UK 96-well optical reaction plate Applied Biosystem, USA RotorGene 0,1 ml tubes Corbett Research, Australia

2.1.11. virologische Materialien

Hepatitis C Panel Referenzzentrum für Hepatitis C, Universität Essen, Virologisches Institut, Prof. Dr. M. Roggendorf http://www.hepatitis-c-referenzzentrum.de/html/hcvpanel.htm Hepatitis C Plasma Blutspendedienst Hagen, Frischplasma, infektiös

2.1.12. Zelllinien

FRhK-4-Zellen: Zelllinie von fetalen Rhesusaffennierenzellen, Center für Biologics Evaluation and Research (CBER/FDA) Abteilung für Virologie, Bethesda, Maryland, USA. FRhK-4-Zellen reagieren nicht auf Interferon, zeigen aber eine konstitutive Expression der OAS und RNase L (Brack, 1999).

FRhK-4-6er Klone: Zelllinie von fetalen Rhesusaffennierenzellen stabil mit dem humanen RNase L Inhibitor aus pcDNA3/RLI 3’ transfiziert, Diplomarbeit Jörn Gotter (1999), Universität Bremen. In diesen Zellen zeigt das Hepatitis A Virus ein stärkeres Wachstum als in FRhK-4-Zellen (Gotter, 1999).

Huh7-Zellen: Zelllinie von humanen Leberzellkarzinomzellen, Universität Bremen. Nur in dieser Zelllinie war bisher die Anzucht des Hepatitis C Virus JFH-1 oder die Replikation von HCV-RNA durch Replikonsysteme möglich (Bartenschlager et al., 2003; Kato & Wakita, 2005)

31 Material und Methoden

2.2. Methoden

2.2.1. Molekularbiologie

2.2.1.1. Aufreinigung von Zell-RNA mit dem RNeasy® Mini Kit

Die Aufreinigung der zellulären RNA erfolgte nach Protokollangaben des Herstellers. Für die Aufarbeitung transient transfizierter Zellen war ein zusätzlicher DNase Verdau zum Abbau von Plasmid DNA nötig. Die Zellen wurden zunächst nach Protokoll aufgereinigt und die QIAamp Säulen aufbewahrt. Das Eluat wurde erneut in 350 μl RLT-Puffer aufgenommen, mit 250 μl Ethanol gemischt und auf die Säule gegeben. Nach dem RW1- Wasch- und Zentrifugationsschritt erfolgt der DNase Verdau. Hierzu wurden 15 μl DNase I mit 90 μl RDD-Puffer gemischt, auf die Säule gegeben und bei Raumtemperatur (20°C - 30°C) für mindestens 60 min inkubiert. Die weitere Aufarbeitung wurde nach RNeasy® Protokoll ab dem RW1-Waschschritt durchgeführt.

2.2.1.2. DNA-Auftrennung im Agarosegel

Die Auftrennung von PCR-Produkt bzw. Plasmid-DNA erfolgte durch Agarosegel- Elektrophorese. Je nach Fragmentgröße der zu trennenden DNA wurde ein 1, 2 oder 3%iges Agarosegel verwendet. 8 μl DNA wurden mit 2 μl Ladepuffer (6x Loading Dye MBI Fermentas, St. Leon-Roth) versetzt und bei 80 V elektrophoretisch analysiert. Je nach Fragmentgröße wurden verschiedene Marker verwendet.

2.2.1.3. cDNA-Synthese

Die cDNA-Synthese wurde nach Protokoll des RevertAidTM H Minus First Strand cDNA- Synthesis Kit durchgeführt. Es wurden 5 μl der RNeasy® aufgereinigten Zell-RNA eingesetzt und mit random hexamer Primern in cDNA umgeschrieben (Ausnahme: cDNA-Synthese für die full length Amplifikation des RLI. Hier wurden oligodT-Primer verwendet). Zur Kontrolle des DNase Verdaus wurde die Synthese sowohl mit als auch ohne Reverse Transkriptase durchgeführt.

32 Material und Methoden

2.2.1.4. Real time PCR zum quantitativen Nachweis der mRNA von RNase L, RLI und GAPDH sowie der 18S rRNA

Zur Kontrolle der RNA-Aufreinigung und des DNase Verdaus wurde die cDNA-Synthese jeweils mit und ohne Reverse Transkriptase durchgeführt. Der Einsatz von cDNA ohne Reverse Transkriptase in die PCR zeigte mindestens eine log-Stufe weniger Amplifikate als der Einsatz von cDNA mit Reverser Transkriptase. Je später PCR-Signale von cDNA- Templates ohne Reverser Transkriptase detektiert werden, desto erfolgreicher und sauberer sind die RNA-Aufreinigung und der DNase Verdau verlaufen.

PCR-Ansatz: Wasser 10,1 μl ABI 2x Puffer 12,5 μl Primer for (10 μM) 0,1 μl Primer rev (10 μM) 0,1 μl Platinum (5 U/μl) 0,1 μl Template cDNA 2 μl

Real time PCR Temperaturprofil: Initiale Denaturierung 10 min, 95 °C Denaturierung 15 sec, 95°C Amplifikation 1 min, 55°C Zyklenanzahl: 40

Spezifität der PCR: Die Spezifität ist ein Maß für die Wahrscheinlichkeit eines falsch- positiven Ergebnisses. Um unspezifische Amplifikationen durch die eingesetzten Primer auszuschließen, wurde gesamt-Zell-RNA in cDNA umgeschrieben und als Template in die verschiedenen real time PCRs (RLI, RNase L, 18S rRNA, GAPDH) eingesetzt. Die PCR-Amplifikate wurde im 3%igen Agarosegel aufgetrennt und auf unspezifische Bandenmuster überprüft. PCR-Effizienz: Die PCR-Effizienz ist ein Maß für das Verhältnis von Amplifikat- und eingesetzter Probenmenge. Im Idealfall liegt eine Verdopplung der Amplifikate pro Zyklus vor. In diesem Fall beträgt die PCR-Effizienz 100 %.

33 Material und Methoden

Zur Berechnung der PCR-Effizienz wurde die „slope“-Methode (Anstiegsmethode) verwendet. Für diese Methode wird eine Verdünnungsreihe für jedes Template generiert und der ct-Wert jedes Verdünnungspunktes bestimmt. In einem Diagramm werden die ct- Werte gegen die jeweiligen logarithmischen Konzentrationen der cDNA aufgetragen. Eine lineare Regressionsgerade (y = ax + b) wird berechnet und ihr Anstieg bestimmt. Der erwartete Anstieg (a) einer logarithmischen Verdünnungsreihe beträgt -3,32, wenn die PCR-Effizienz bei (E) = 1,0 (100 %) liegt. Die PCR-Effizienz berechnet sich mit der Anstiegsmethode der linearen Regressionsgeraden nach der Formel: E = 10(-1/Anstieg) -1 (Eurogentec, 2004). Beispiel: Beträgt der Anstieg einer Regressionsgeraden -3,33, so berechnet sich die PCR-Effizienz durch E = 10(-1/-3,33) -1. E = 1,995-1. Die PCR-Effizienz beträgt somit 0.995 oder 99,5%. Quantifizierung: Mit Hilfe der Regressionsgeraden oder Standardkurve erfolgt auch die Quantifizierung der unbekannten Proben. Die Konzentrationen der Verdünnungspunkte der Standardreihe werden definiert. Die RNA-Menge der unbekannten Proben wird anschließend durch die Software des ABI 7900HT anhand der Standardkurve berechnet. Es wird davon ausgegangen, dass das Verhältnis der eingesetzten cDNA proportional zur mRNA ist, d.h. für jede spezifische mRNA während der cDNA Synthese in einem konstanten Verhältnis entsprechend viel cDNA entsteht.

2.2.1.5. Full length Amplifikation des RNase L Inhibitor

Aus FRhK-4-Zellen wurde die RNA mit dem RNeasy® Mini Kit nach Protokoll aufgereinigt und 5 μl des Eluates in die cDNA-Synthese eingesetzt. Bei der Verwendung humaner Nieren-gesamt-Zell-RNA von Ambion wurde 1 μl Probe in die cDNA-Synthese eingesetzt. 2 μl der cDNA wurden anschließend in die long-range PCR zur full length Amplifikation des RLI verwendet. Für die Amplifikation des RLI wurden die Vor- und Rückwärtsprimer „RLI full nah“ eingesetzt. Um den His-Tag des pcDNA3.1/V5-His zu exprimieren, wurden in einer weiteren full length Amplifikation die Primer „RLI full direkt for“ und „RLI full direkt rev ohne Stop“ verwendet, um das Stop-Codon auszuschalten. Die long-range PCR wurde im Eppendorf Mastercycler durchgeführt.

34 Material und Methoden

PCR-Ansatz: Wasser 34,35 μl Pu3-Puffer (5x) 10 μl dNTP (5 mM) 1,5 μl

MgSO4 (50 mM) 1,5 μl Takara (5 U/μl) 0,35 μl ISIS Taq (1 IU/μl) 0,1 μl Primer for (10 μM) 0,1 μl Primer rev (10 μM) 0,1 μl Template cDNA 2 μl

Long-range PCR Temperaturprofil: Initiale Denaturierung 2 min, 95 °C Denaturierung 1 min, 95°C Amplifikation 1 min, 55°C 5 min, 72°C 10 min, 72°C Zyklenanzahl: 40

Die Kontrolle der full length Amplifikation erfolgte im 1%igen Agarosegel.

2.2.1.6. Klonierung des RLI in pcDNA3.1/V5-His und Transformation von E.coli

Die Klonierung von humanem und Affen RNase L Inhibitor erfolgte mit dem pcDNA3.1/V5-His© TOPO® TA Expression Kit nach den Protokollangaben des Herstellers. Je 4 μl PCR-Produkt wurden mit 1 μl Salt-Solution und 1 μl pcDNA3.1/V5- His versetzt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Transformation wurde nach der Hitzeschock-Methode (Hanahan, 1983) durchgeführt. Ein Röhrchen Top10 E.coli Zellen wurde auf Eis aufgetaut und mit 2 μl des Ligationsansatzes versetzt. Nach 3-minütiger Inkubation auf Eis erfolgte der Hitzeschock bei 42°C für 30 sec im Wasserbad. Die Zellen wurden für 2 min auf Eis gestellt und anschließend mit 250 μl SOC-Medium versetzt. Nach 1 h Inkubation im Schüttler bei 37°C und 500 rpm wurde der komplette Transformationsansatz auf LB-Agar mit Ampicillin (100 μg/ml) ausgestrichen. Über Nacht wurden die Agarplatten bei 37°C inkubiert. Die Klone wurden mit sterilen

35 Material und Methoden

Pipettenspitzen in 96-well-Mikrotiterplatten gepickt, welche pro Vertiefung 200 μl LB Medium 100 μg/ml Ampicillin enthielten. Nach 24 h Inkubation bei 37°C wurden die Klone per PCR auf das Insert (RLI) getestet. In die Vertiefungen der Mikrotiterplatte wurden je 75 μl 66%iges steriles Glycerol gegeben, vorsichtig gemischt und die Platte bei -70°C eingefroren.

2.2.1.7. Klonscreening mittels PCR

In einer TaqMan Platte wurde in jede Vertiefung 10 μl Wasser vorgelegt. Mit einer Multipipette wurden die Bakterienkulturen der 96-well-Mikrotiterplatte einmal aufgezogen und wieder in die Vertiefungen entlassen. Die Pipettenspitzen wurden anschließend in den vorgelegten 10 μl Wasser gespült. Jeder Vertiefung wurde 15 μl PCR- Mastermix zugegeben, die Platte verschlossen und die PCR im Eppendorf Mastercycler durchgeführt.

PCR-Ansatz: Wasser 8,2 μl Pu3-Puffer (5x) 5 μl dNTP (5 mM) 0,75 μl

MgSO4 (50 mM) 0,75 μl Takara (5 U/μl) 0,2 μl T7 Primer (10 μM) 0,05 μl RLI rev (10 μM) 0,05 μl

PCR Temperaturprofil: Initiale Denaturierung 10 min, 95°C Denaturierung 1 min, 95°C Amplifikation 1 min, 55°C 3 min, 72°C 10 min, 72°C Zyklenanzahl: 35

Die Kontrolle der full length Amplifikation erfolgte im 1%igen Agarosegel.

36 Material und Methoden

2.2.1.8. Präparation der rekombinanten Plasmide

Einige ausgewählte E.coli Klone, welche das Insert enthalten, wurden über Nacht in 5 ml LB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin bei 37°C angezogen. Je 850 μl Bakterienkultur wurde mit 150 μl sterilem Glycerol gemischt und bei -70°C eingefroren. Zur Aufreinigung der Plasmid-DNA wurden je 3 ml Bakterienkultur in das NucleoSpin® Plasmid Kit eingesetzt. Die Aufarbeitung erfolgt nach Protokollangaben des Herstellers. 1 μl Eluat wurde mit 50 μl sterilem Wasser gemischt und die Konzentration der enthaltenen DNA im Eppendorf BioPhotometer gemessen. Zur Kontrolle der Orientierung des Inserts wurden die Plasmide einem Restriktionsverdau unterzogen. Je 8 μl pcDNA3.1/V5-His-m_RLI bzw. 8 μl pcDNA3.1/V5-His-h_RLI wurden mit 0,2 μl Wasser, 1 μl 10x Puffer R+ und je 0,4 μl HindIII (10 U/μl) und XhoI (10 U/μl) versetzt. Die Restriktion erfolgte 90 min bei 37°C im Eppendorf Mastercyler. Zur Transfektion von Plasmid-DNA in FRhK-4- und Huh7-Zellen wurden endotoxinfreie Plasmide verwendet. Dazu wurden je 150 - 200 ml Bakterienkultur mit dem Endofree Plasmid Maxi Kit nach Protokollangaben des Herstellers aufgereinigt. Die Plasmide wurden photometrisch vermessen und mittels Restriktion kontrolliert.

2.2.1.9. Sequenzierung

Die Sequenzierung des humanen- und FRhK-4-RLI-Inserts der verwendeten Plasmide pcDNA3.1/V5-His_RLI und pl.18_RLI wurde von Dr. H. Schmidt vom DNA-Cloning- Service (Ohnhorststrasse 18, 22609 Hamburg) durchgeführt. Es wurden folgende Primer verwendet: T7, BGH rev (beide nur für pcDNA3.1/V5-His_RLI), RLI for, RLI rev, RLI full rev ohne Stop (nur für Plasmide mit ausgeschaltetem Stopcodon). Die Auswertung der Sequenzdaten erfolgte mit dem Sequence Navigator Version 1.0.1.

2.2.1.10. Umklonierung des RLI aus pcDNA3.1/V5-His_RLI in pl.18

Restriktion: Das humane und das Affen RLI sollten mit dem His-Tag aus den entsprechenden pcDNA3.1/V5-His_RLI Vektoren herausgeschnitten werden. Restriktionsansatz 1. Schnitt: 2 μl Puffer B + 1,4 μl pcDNA3.1-V5/His_RLI (2 μg) + 12,6 μl H2O + 4 μl MssI (5 U/μl). Die Restriktion erfolgte für 2 h bei 37°C, die Enzyminaktivierung anschließend bei 65°C für 20 min. Restriktionsansatz 2. Schnitt: Dem

37 Material und Methoden ersten Restriktionsansatz wurden 2 μl KpnI (10 U/μl) zugegeben. Die Restriktion erfolgte für 2 h bei 37°C, die Enzyminaktivierung anschließend bei 65°C für 20 min. Der Klonierungsvektor pl.18 wurde ebenfalls mit zwei Restriktionsenzymen geschnitten. Restriktionsansatz 1. Schnitt: 2 μl Puffer L + 10 μl pl.18 (2 μg) + 2 μl BSA (1 mg/ml) +

4 μl H2O + 2 μl KpnI (10 U/μl). Die Restriktion erfolgte für 2 h bei 37°C, die Enzyminaktivierung anschließend bei 65°C für 20 min. Restriktionsansatz 2. Schnitt: Dem ersten Restriktionsansatz wurden 0,8 μl 2,5 M NaCl und 2 μl EcoRV (10 U/μl) zugegeben. Die Restriktion erfolgte für 2 h bei 37°C, die Enzyminaktivierung anschließend bei 65°C für 20 min. Dephosphorylierung von pl.18: Um das Religationsvermögen von pl.18 zu verringern, wurde der geschnittene Vektor dephosphoryliert. Dephosphorylierungsansatz: pl.18 Restriktionsansatz + 2,2 μl Dephophorylationbuffer + 2 μl Alkalische Phophatase. Die Inkubation erfolgte 30 min bei 37°C. Zur Inaktivierung der Alkalischen Phosphatase wurden 4 μl 100 mM EGTA zugegeben und 10 min bei 65°C inkubiert. Aufreinigung des restringierten RLI: Die geschnittenen Vektoren pcDNA3.1/V5-His- m_RLI und pcDNA3.1-V5/His-h_RLI wurden im 1%igen Agarosegel aufgetragen und die Restriktion kontrolliert. Die RLI-Banden bei 18 kb wurden aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem QIAquick® Gel Extraction Kit nach Angaben des Herstellers aufgereinigt. Die DNA-Fragmente wurde in je 30 μl EB Puffer eluiert. Ligation: Die Ligation von pl.18 und RLI erfolgt mittels Rapid DNA Ligation Kit nach den Angaben des Herstellers. Ligationsansatz: je 13,6 μl humanes- bzw. FRhk-4-RLI_His + 2,4 μl pl.18 + 4 μl 5x Rapid ligation buffer + 1 μl T4 DNA Ligase (5 U/μl). Nach kurzem Vortexen und Zentrifugieren wurde 30 min bei 22 °C inkubiert. Transformation: 50 μl E.coli C600 wurden 10 min auf Eis aufgetaut und anschließend mit 2 μl Ligationsansatz versetzt. Nach 20-minütiger Inkubation auf Eis wurde 2 min bei 42°C im Wasserbad ein Hitzeschock durchgeführt, 2 min auf Eis inkubiert, danach 200 μl LB++ Medium zugegeben. Nach 1 h bei 37°C auf dem Schüttler wurde der Transformationsansatz auf LB-Agar mit 100 μg/ml Ampicillin ausplattiert. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 37°C. Je 8 Klone (humanes bzw. FRhK-4 pl.18_RLI) wurden in je 3 ml LB-Medium mit Ampicillin (100 μg/ml) gepickt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Aufreinigung von je 1,5 ml Bakterienkultur erfolgte mit dem QIAprep® Mini Kit nach Protokoll des Herstellers.

38 Material und Methoden

Kontrollrestriktion: Zur Kontrolle von pl.18_RLI wurden 20 μl Eluat der Plasmidpräparation mit 3 μl Puffer H und 0,3 μl XhoI versetzt und 2 h bei 37°C inkubiert. Die Kontrolle der Restriktionen erfolgte im 1%igen Agarosegel.

2.2.1.11. In vitro Transkription von HCV full length HCV RNA

Transformation: Die Transformation wurde nach der Hitzeschock-Methode (Hanahan, 1983) durchgeführt. Ein Röhrchen Top10 E.coli Zellen wurde auf Eis aufgetaut und mit 2 μl p90/HCV FL-long pU (100 ng/μl) versetzt. Nach 3minütiger Inkubation auf Eis erfolgte der Hitzeschock bei 42°C für 30 sec im Wasserbad. Die Zellen wurden für 2 min auf Eis gestellt und anschließend mit 250 μl SOC-Medium versetzt. Nach 1 h Inkubation im Schüttler bei 37°C und 500 rpm wurde der komplette Transformationsansatz auf LB- Agar mit Tetrazyklin (10 μg/ml) ausgestrichen. Über Nacht wurden die Agarplatten bei 37°C inkubiert. Sieben Klone wurden mit sterilen Pipettenspitzen in je 7 ml LB Medium mit 10 μg/ml Tetrazyklin gepickt. Miniprep und Kontrollrestriktion: Nach 24 h Inkubation bei 37°C wurden die Plasmide mit dem QIAGEN® Plasmid Mini Kit aufgereinigt. Je 15 μl der Plasmidpräparation wurden mit 3 μl Puffer H, 0,3 μl Xba I (10 U/μl) und 0,3 μl EcoR I (10 U/μl) versetzt und 2 h bei 37°C inkubiert. Die Kontrolle der Restriktionen erfolgte im 1%igen Agarosegel. Linearisierung des Plasmides: Für die in vitro Transkription war eine Linearisierung des

Plasmides nötig. Dazu wurden 10 μl der Plasmidpräparation mit 1 μl Puffer R, 8,4 μl H2O und 0,6 μl Bsm I (10 U/μl) versetzt und 2 h bei 37°C inkubiert. Gelkontrolle und Aufreinigung: Bsm I schneidet zweimal in p90/HCV FL-long pU, wodurch Fragmente von 1427 bp und 11553 bp entstehen. Die Restriktionskontrolle erfolgte im 1%igen Agarosegel. Die das HCV Insert enthaltene Bande von 11553 kb wurde mit dem QIAquick® Gel Extraktion Kit nach Protokoll aufgereinigt. Eluiert wurde in 30 μl EB-Puffer. Die Kontrolle der Aufreinigung erfolgte ebenfalls im 1%igen Agarosegel. In vitro Transkription: Die in vitro Transkription wurde nach Protokoll des MEGAscript® High Yield Transcription Kit durchgeführt. Je 2 μl ATP, CTP, UTP und GTP wurden mit 2 μl Puffer, 2 ml Enzymmix und 8 μl linearisiertem Plasmid versetzt. Die in vitro Transkription erfolgte für 4 h bei 37°C. Aufreinigung der RNA, Gelkontrolle und Konzentrationsbestimmung: Um DNA-freie RNA zu erhalten, wurde 1 μl TURBO DNase zum Transkriptionsansatz gegeben und

39 Material und Methoden

20 min bei 37°C inkubiert. Die Aufreinigung der in vitro Transkription erfolgte mit Hilfe des RNeasy® Mini Kit nach Protokoll. Nach Elution in 50 μl RNase freiem Wasser erfolgte die Kontrolle im 1%igen Agarosegel. Zur Konzentrationsbestimmung der in vitro transkribierten RNA wurden 10 μl des Transkripts 10-6 verdünnt. 10 μl dieser 10-6 Verdünnung wurde in das HCV RotorGene Assay eingesetzt. Es wurden jeweils Doppelbestimmungen der IVT-Ansätze durchgeführt. Mit Hilfe der mitgeführten Standardreihe wurde die Konzentration des HCV IVTs (in vitro Transkripts) berechnet.

2.2.1.12. Entwicklung eines HCV RotorGene Nachweissystems

Die Primer und Sondensequenzen wurden von einem bestehenden HCV RotorGene Assay der Firma artus GmbH (seit 2002 QIAGEN Hamburg) übernommen, welches in Puffer- und Enzymzusammensetzung vollständig umgestellt, optimiert und validiert werden sollte. Probleme des bestehenden Systems mit starken Qualitätsschwankungen der Reversen Transkriptase sollten durch Umstellung auf Enzyme anderer Hersteller eliminiert werden. Das neue System sollte außerdem kostengünstiger produziert werden können, als das existierende HCV RotorGene System. Die finale Version des neu entwickelten Nachweissystems für HCV RNA soll von der QIAGEN Hamburg GmbH als Kit vertrieben werden. Die genaue Zusammensetzung der einzelnen Kit Komponenten sowie die Sequenzen der Primer und Sonden unterliegen damit der Geheimhaltung und werden in dieser Arbeit nicht veröffentlicht.

Optimierung: Auf Basis eines 5x in-house-Puffers sollte das HCV Nachweissystem unter Verwendung der bereits existierenden Primer und Sonden entwickelt werden. Die Optimierungsversuche wurden mit einer Standardreihe (in vitro Transkript) sowie bereits aufgereinigten Positivkontrollen des Blutspendedienstes in Springe durchgeführt. Es wurden verschiedene pH-Werte des Puffers ausgetestet, sowie diverse Enzyme verschiedener Hersteller. Nach Auswahl des Puffer pH-Wertes folgten Titrationen der verwendeten Enzyme, dNTPs, Magnesium, Primer und Sonden.

40 Material und Methoden

RT-PCR-Temperaturprofil: Reverse Transkription: 10 min. 50°C Aktivierung HotStart Enzym: 50 sec, 95°C Touch down 8 sec, 95°C 20 sec, 65°C → Fluoreszenzmessung 20 sec, 72°C 10 Zyklen, bei jedem Zyklus wird die Annealing-Temperatur um 1°C abgesenkt Amplifikation: 8 sec, 95°C 20 sec, 55°C → Fluoreszenzmessung 20 sec, 72°C Zyklenanzahl: 45 Gesamtzyklenzahl: 55

Spezifität: Zur Kontrolle der RT-PCR-Spezifität wurden verschiedene ebenfalls in Blut oder Plasma vorkommende Erregergenome (HIV, HAV, HBV, Parvo B19, HSV1+2, M. pneumophiae, Enterovirus, WestNil-Virus, HHV6+7, CMV, EBV, HTLV1+2) in das HCV System eingesetzt und auf unspezifische Amplifikation getestet. Zur Kontrolle der spezifischen Amplifikation wurde die HCV in vitro Transkript-Standardreihe (5x100- 5x103 IU/ml) mitgeführt. Sensitivität: die Sensitivität beschreibt die Nachweisgrenze eines Systems. Die Nachweisgrenze einer PCR wird unterschiedlich definiert. In Anlehnung an die Monographie „PCR“ der Europäischen Pharmakopöe wird als „positiver Grenzwert“ die Konzentration der Zielnukleinsäure definiert, die in 95 % der Experimente noch amplifiziert wird. Die Bestimmung dieses Wertes erfolgt durch Anwendung der Probit- Analyse, einem statistischen Verfahren zur Beschreibung von alternativen und quantitativen "Dosis-Wirkung"-Beziehungen. Zur Bestimmung der Sensitivität wurden 6 Verdünnungsstufen von HCV positiven Plasma des Blutspendedienstes aus Hagen in DMEM angesetzt und zu je 8 Replikaten mit dem QIAamp®Viral RNA Mini Kit aufgereinigt. Die Elution der HCV RNA erfolgte in je 50 μl AVE-Puffer. Jedes Replikat der Verdünnungsstufen wurde in 3 unabhängigen RT-PCR- Läufen analysiert. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit Hilfe der Software PriProbit.

41 Material und Methoden

2.2.2. Zellkultur und virologische Methoden

In dieser Arbeit wurden FRhK-4-Zellen, FRhK-4-Klone und Huh7-Zellen verwendet. Alle Zellen wurden mit DMEM 10 % FCS, 1% Penicillin, 1 % Streptomycin in 75 cm2

Zellkulturflasche bei 37°C, 5 % CO2 kultiviert.

Die virologischen Arbeiten mit dem Hepatitis C Virus wurden unter der Sicherheitsstufe 3 durchgeführt.

2.2.2.1. Kryokonservierung von Huh7- und FRhK-4-Zellen

In einer konfluent gewachsenen 75 cm2 Zellkulturflasche befinden sich ca. 2x107 Zellen. Diese wurden mit 1xPBS gewaschen. Nach dem Ablösen mit 2 ml Trypsin wurden dem Trypsin-Zellgemisch 8 ml DMEM 10 % FCS zugegeben. Die Zellen wurden bei 500 rpm pelletiert und der Überstand verworfen. In ca. 10 ml FCS resuspendiert, wurde die Zell- Suspension zu je 1,8 ml pro Kryoröhrchen aliquotiert und in einem Styroporgefäß bei -70°C langsam eingefroren. Nach ca. 24 h wurden die Kryoröhrchen in den Stickstoffbehälter überführt.

2.2.2.2. Auftauen von Huh7- und FRhK-4-Zellen

Die eingefrorenen Zellen wurden aus dem Stickstofftank geholt und bei 37°C im Wasserbad aufgetaut. Mit 8 ml frischem DMEM wurden diese Zellen in eine 2 25 cm Zellkulturflasche gegeben und bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert. Nach ca. 24 h wurde ein Mediumwechsel durchgeführt, um das restliche Einfriermedium zu entfernen.

2.2.2.3. Passagieren von Huh7- und FRhK-4-Zellen

Das Medium von konfluent gewachsenen Huh7- bzw. FRhK-4-Zellen in einer 75 cm2 Zellkulturflasche wurde abgenommen und die Zellen einmal mit 1xPBS gewaschen. Anschließend wurden 2 ml Trypsin auf die Zellen gegeben, wobei das Ablösen der Zellen im Mikroskop kontrolliert und durch Inkubation bei 37°C oder Klopfen der Flasche unterstützt wurde. Nachdem alle Zellen in Lösung waren, wurde die Proteolyse durch Zugabe von 8 ml Medium abgestoppt. Es wurde eine definierte Menge Zellen in eine neue

42 Material und Methoden

75 cm2 Zellkulturflasche überführt und nach Hinzufügen von ca. 18 ml frischem DMEM bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert.

2.2.2.4. Transfektion mit FuGene 6 Transfection Reagent

6 Für eine 6-well-Platte wurden 2x10 Zellen ausgesät und über Nacht bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert. Pro Transfektionsansatz wurden 100 μl serumfreies Medium in sterile Eppendorfgefäße abgefüllt und 15 μl FuGene so in die Flüssigkeit gegeben, dass das Plastikgefäß nicht berührt wurde. Anschließend wurden 5 μg Plasmid-DNA zugegeben und durch pipettieren gemischt. Das Medium der Zellen wurde abgenommen und durch je 3 ml serumfreies DMEM ersetzt. Nach 20 min Inkubationszeit wurde der Transfektionsansatz tropfenweise auf die Zellen gegeben. Durch leichtes Schwenken der

Platte wurde gemischt. Nach 4 h 37°C, 5 % CO2 wurde das Transfektionsmedium durch je 5 ml DMEM mit allen Zusätzen ausgetauscht.

2.2.2.5. Transfektion mit jetPEI

6 Für eine 6-well-Platte wurden 2x10 Zellen ausgesät und über Nacht bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert. Pro Transfektionsansatz wurden zwei Eppendorfgefäße benötigt. In jedes Eppendorfgefäß wurden 250 μl sterile 150 mM NaCl vorgelegt. In ein Gefäß wurden 5 μg Plasmid-DNA pipettiert, 10 s gevortext und abzentrifugiert. In das andere Gefäß wurden 10 μl jetPEI gegeben und ebenfalls 10 s gevortext und zentrifugiert. Die jetPEI-Lösung wurde anschließend zur DNA-Lösung gegeben, 10 s gevortext, zentrifugiert und alles 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Medium der Zellen wurde abgenommen und durch je 4,5 ml serumfreies DMEM ersetzt. Nach der Inkubationszeit wurde der jetPEI- DNA-Komplex tropfenweise auf die Zellen gegeben. Durch leichtes Schwenken der Platte wurde gemischt. Nach 4 h 37°C, 5 % CO2 wurde das Transfektionsmedium durch je 5 ml DMEM mit allen Zusätzen ausgetauscht.

2.2.2.6. G418 Titration für Huh7-Zellen

Auf eine 24-well-Platte wurden 106 Huh7-Zellen ausgesät und direkt mit der G418 Titration begonnen. Es wurden zwei wells mit DMEM als Kontrolle mitgeführt, alle anderen wells wurden mit G418 von 0,2 mg/ml bis 4 mg/ml in 0,2er Verdünnungsschritten

43 Material und Methoden versetzt. Alle 3 Tage wurde das Medium durch frisches DMEM mit entsprechender G418 Menge ersetzt. In den höheren Antibiotikakonzentrationen war bereits nach 2 Tagen ein Absterben der Zellen zu beobachten. Nach 14 Tagen waren ab einer Konzentration von 0,4 mg/ml G418 alle Huh7 Zellen abgestorben. Es wurde daher für die Selektion G418- resistenter Klone eine Konzentration von 0,6 mg/ml G418 eingesetzt. Diese Menge wurde ebenfalls für die Selektion resistenter FRhK-4-Zellen verwendet. Die Titration von FRhK- 4-Zellen wurde bereits von Jörn Gotter in Rahmen seiner Diplomarbeit durchgeführt (Gotter, 1999).

2.2.2.7. Stabile Überexpression des RLI in Huh7- und FRhK-4-Zellen

6 In 6 cm Schalen wurden 10 Zellen ausgesät und über Nacht bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert. Die Transfektion erfolgte mit 10 μg der entsprechenden Plasmid-DNA. Da die pl.18_RLI Plasmide kein Resistenzgen tragen, wurde mit pSV2neo nach Protokoll kotransfiziert (Transfektionsansatz: je 8 μg pl.18-m_RLI bzw. pl.18-h_RLI, 2 μg pSV2neo, 30 μl FuGene). 48 h nach Transfektion wurde das Medium gegen 4 ml Medium mit 0,6 mg/ml G418 ausgetauscht. Die Kultivierung der Zellen erfolgt im Folgenden durchgehend mit DMEM 0,6 mg/ml G418. Zellen, die kein Plasmid mit Geneticin-Resistenz aufgenommen haben, sterben im Verlauf der Zeit ab. Alle 3 bis 4 Tage wurde das Medium gewechselt. Nach Erreichen eines konfluenten Zellrasens wurden die Zellen in hohen Verhältnissen umgesetzt (1:1.000 bis 1:10.000), um einzelne Kolonien zu erhalten. Zum Selektieren der Klone wurden ausreichend gewachsene Kolonien markiert, das Medium abgenommen und Klonierungszylinder (abgeschnittene Eppendorfhütchen) mit Silicon Grease (Beckmann) aufgesetzt. Mit 100 μl Trypsin wurden die Zellen innerhalb der Zylinder abgelöst und in 24-well-Platten vereinzelt. Zellen konfluent bewachsener Vertiefungen wurden in 6-well- Platten überführt. Die Kontrolle der Klone auf RLI-Überexpression erfolgte mittels PCR.

2.2.2.8. Immunfluoreszenz

In jede Vertiefung einer 6-well-Platte wurden drei runde, autoklavierte Deckgläschen gelegt, darauf die Zellen ausgesät und bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert. Die Transfektion wurde ca. 16 - 24 h nach Protokoll durchgeführt. Als Negativkontrolle dienten nicht transfizierte Zellen. Die Auswertung mittels Immunfluoreszenz erfolgte 3 Tage nach Transfektion.

44 Material und Methoden

Nach Abnahme des Mediums und zweimaligem Waschen der Zellen mit je 1 ml 1xPBS wurden die Zellen durch 2 ml Ethanol für 5 min bei Raumtemperatur fixiert. Die Fixierzeit von 5 Minuten sollte nicht überschritten werden. Es wurde 5-mal mit je 2 ml 1xPBS für je 2 Minuten gewaschen. Durch 20 min Inkubation mit 2 ml PBS 10 % FCS wurde geblockt. 1 ml 1xPBS 10 % FCS wurde mit 0,2 μl Trypanblau und 2 μl Anti His(C-term)-FITC Antikörper gemischt und auf die Zellen gegeben. Nach 1 h Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur wurden die Zellen zweimal mit je 4 ml 1xPBS gewaschen. Die Deckgläschen wurden aus den Vertiefungen entnommen, an der Luft getrocknet und mit den Zellen nach unten auf Objektträger mit einem Tropfen Glycerin gegeben. Mit Hilfe von Nagellack wurden die Deckgläschen auf dem Objektträger fixiert und anschließend im Fluoreszenzmikroskop analysiert.

2.2.2.9. Stabilitätstest von HCV RNA in zellfreiem Medium

Es wurden 4 μl HCV positives Plasma in 4 ml DMEM gegeben und zu je 1 ml auf 4 wells einer 12-well-Platte verteilt. Die Zellkulturplatte wurde im Brutschrank bei konstanten

Bedingungen (37°C, 5 % CO2) inkubiert. Im Abstand von 2 Tagen wurden je 140 μl Medium abgenommen und mittels RT-PCR der Virus RNA-Titer bestimmt. Die Aufreinigung der HCV RNA erfolgte mit dem QIAamp®Viral RNA Mini Kit nach Protokoll. Eluiert wurde in 50 μl AVE-Puffer. Die entnommene Mediumsmenge wurde mit 140 μl DMEM aufgefüllt.

2.2.2.10. HCV Infektion von FRhK-4-RLI-Klonen

2x106 Zellen der FRhK-4-RLI-Klone wurden in einer 6-well-Platte ausgesät und bei 37°C,

5 % CO2 inkubiert. Am folgenden Tag wurde das Medium entnommen und pro well 150 μl HCV positives Frischplasma zugegeben (MOI = 1). Nach 2 h Inkubation im Brutschrank wurde das Inokulum abgenommen und dreimal mit 1xPBS gewaschen. Anschließend wurde frisches Medium zugegeben. 140 μl Überstand wurden als 0 d - Wert zur Bestimmung der HCV RNA herangezogen. Die entnommenen 140 μl wurden durch frisches Medium aufgefüllt.

45 Material und Methoden

2.2.2.11. HCV Infektion transient RLI-transfizierter Huh7- und FRhK-4-Zellen

2x106 Zellen Huh7 bzw. FRhK-4 wurden in einer 24-well-Platte ausgesät und bei 37°C,

5 % CO2 inkubiert. Am folgenden Tag wurden die wells mit je 3 μg des entsprechenden pl.18_RLI-Plasmides nach Protokoll transfiziert. 48 h nach Transfektion wurde das Medium entnommen und pro well 150 μl HCV Frischplasma zugegeben (MOI = 1). Nach 2 h Inkubation im Brutschrank wurde das Inokulum abgenommen und dreimal mit 1xPBS gewaschen. Anschließend wurde frisches Medium zugegeben. 140 μl Überstand wurden als 0 d - Wert zur Bestimmung der HCV RNA herangezogen. Die entnommenen 140 μl wurden durch frisches Medium aufgefüllt. 5 Tage nach Infektion (6 Tage nach Transfektion) wurden die Zellen in eine 12-well-Platte überführt. Der Überstand wurde zuvor abgenommen und 140 μl zur Bestimmung der HCV-RNA eingesetzt. Die Aufreinigung der HCV RNA erfolgte mit dem QIAamp®Viral RNA Mini Kit nach Protokoll. Eluiert wurde in 50 μl AVE-Puffer. 24 h nach Umsetzung wurden die Zellen zur Aufrechterhaltung der RLI-Expression erneut wie beschrieben transfiziert (Einsatz von 5 μg des entsprechenden pl.18_RLI-Plasmides). Weitere 6 Tage später wurden die Zellen in eine 6-well-Platte überführt und am folgenden Tag mit 5 μg des entsprechenden RLI- Plasmides transfiziert.

2.2.2.12. Transfektion in vitro transkribierter RNA in Huh7- und FRhK-4-Zellen

Für die Transfektion von in vitro transkribierter HCV RNA (IVT) in FRhK-4- oder Huh7- Zellen war die Angabe der IVT Konzentration in [ng/μl] notwendig. Die Umrechnung von [IU/μl] in [g/μl] wurde folgendermaßen berechnet:

Konz [g/μl] = cop/μl*330 g/mol*10 kb/6*1023

Dabei entsprachen 330 g/mol dem Gewicht der RNA und 10 kb der Länge des IVT. Die Angabe der HCV Viruslast in Internationale Einheit (IU) ist eine mehr oder weniger willkürlich festgesetzte Einheit. Der Umrechnungsfaktor von IU zu Kopien liegt zwischen 2 und 5. Für die Umrechnung von HCV Internationalen Einheiten in Kopien wurde in der vorliegenden Arbeit der Faktor 3 verwendet (http://www.hepatitis-c.de/titer.htm).

46 Material und Methoden

2x106 Zellen Huh7 bzw. FRhK-4 wurden in einer 24-well-Platte ausgesät und bei 37°C,

5 % CO2 inkubiert. Am folgenden Tag erfolgte die Transfektion von IVT ebenfalls mit dem FuGene 6 Transfection Reagent nach bereits beschriebenem Protokoll. Pro well der 24-well-Platte wurden 250 ng IVT für die Transfektion eingesetzt. Nach 4stündiger Inkubationszeit wurde der IVT-haltige Überstand abgenommen, zweimal mit 1xPBS gewaschen und frisches DMEM auf die Zellen gegeben.

2.2.2.13. Transfektion in vitro transkribierter HCV full length RNA in transient RLI-transfizierten Huh7- und FRhK-4-Zellen

2x106 Zellen Huh7 bzw. FRhK-4 wurden in einer 24-well-Platte ausgesät und bei 37°C,

5 % CO2 inkubiert. Am folgenden Tag wurden die wells mit je 3 μg des entsprechenden pl.18_RLI-Plasmides nach Protokoll transfiziert. Um den Zellen die RLI Expression zu ermöglichen, wurde 48 h bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert. Die Transfektion von HCV full length IVT erfolgte ebenfalls mit dem FuGene 6 Transfection Reagent nach bereits beschriebenem Protokoll. Pro well der 24-well-Platte wurden 250 ng HCV IVT zur Transfektion eingesetzt. Nach vierstündiger Inkubation wurde der HCV IVT-haltige Überstand abgenommen, zweimal mit 1xPBS gewaschen und frisches DMEM auf die Zellen gegeben.

2.2.2.14. Aufreinigung viraler RNA mit dem QIAamp®Viral RNA Mini Kit

Die Aufreinigung der viralen RNA aus Zellkulturüberstand oder virushaltigem Medium erfolgte mit dem QIAamp®Viral RNA Mini Kit nach Protokollangaben des Herstellers. Eluiert wurde in 50 μl AVE-Puffer. Die Berechnung der RNA-Konzentration der eingesetzten Probe errechnet sich nach folgender Formel:

RNA-Konz. der eingesetzten Probe [IU/μl]= calc. Konz. [IU/μl] * 50 μl / 140 μl calc. Konz. = kalkulierte Konzentration der Probe durch die Software der RotorGene™ anhand der mitgeführten Standardreihe 50 μl = Menge des Eluates 140 μl = Menge der eingesetzten Probe

47 Ergebnisse

3. Ergebnisse

3.1. Erstellung der real time PCRs

Unter den Bedingungen der experimentellen HCV Infektion wurden die Expressionsraten des RLI und der RNase L analysiert. Zur Analyse und Auswertung der mRNA Transkription von RNase L und RNase L Inhibitor war daher die Erstellung spezifischer und quantitativer real time PCRs notwendig. Ebenfalls wurden real time PCRs für die konstitutiv in Zellen exprimierten Referenzgene 18S rRNA und GAPDH entwickelt. Zum Nachweis und zur Quantifizierung von HCV RNA wurde ein HCV RotorGene System auf der Basis eines bestehenden Systems entwickelt. Vorhandene Primer und Sonden der Firma QIAGEN Hamburg wurden in einem neuen Puffer- und Enzymsystem optimiert und validiert. Wegen großer Probleme des alten Systems aufgrund qualitätiver Schwankungen der reversen Transkriptase erfolgte eine Umstellung der bisher verwendeten Enzyme auf Enzyme anderer Hersteller. Das neue System kann außerdem kostengünstiger als das bisherige System produziert werden.

3.1.1. Real time PCR zum quantitativen Nachweis der mRNA von RNase L, RLI und GAPDH sowie der 18S rRNA

Die Analyse der mRNA Transkription von RNase L, RLI, und GAPDH sowie der 18S rRNA erfolgte mit Hilfe einer two-step PCR. Nach der cDNA Synthese zellulärer RNA mit random hexamer Primern erfolgte in der real time PCR die spezifische Amplifikation der zu analysierenden Gene. Nach Design und Auswahl spezifischer Primer und Sonden für die RNase L, das RLI sowie die Referenzgene 18S rRNA und GAPDH (sieheTabelle 2) erfolgte die Optimierung der real time PCRs auf dem ABI 7900HT. Zum PCR-Ansatz von 10,1 μl Wasser, 12,5 μl ABI 2x Puffer, je 0,1 μl Primer und Sonde sowie 0,1 μl Platinum Taq wurden 2 μl cDNA Template gegeben und im TaqMan amplifiziert (initiale Denaturierung: 10 min - 95°C; 40 Zyklen: Denaturierung 15 sec - 95°C, Amplifikation 1 min - 55°C). Zur relativen Quantifizierung der eingesetzten Proben, wurden logarithmische Verdünnungsreihen aus ZC-5.1 (RNase L), pcDNA3.1/RLI 3’ (RLI) und cDNA aus Nieren gesamt-Zell-RNA (18S rRNA und GAPDH) mitgeführt. Mit Hilfe dieser definierten Standardreihen berechnete

48 Ergebnisse die ABI 7900HT SDS 2.1 Software die in den unbekannten Proben enthalte RNA. Dabei wird davon ausgegangen, dass das Verhältnis der cDNA proportional zur mRNA ist. Für jede spezifische mRNA entsteht während der cDNA Synthese in einem konstanten Verhältnis entsprechend viel cDNA.

3.1.1.1. Effizienz

Die PCR-Effizienz ist ein Maß für das Verhältnis von Amplifikat- und eingesetzter Probenmenge. Im Idealfall liegt eine Verdopplung der Amplifikate pro Zyklus vor, was einer PCR-Effizienz von 100 % entsprechen würde. Zur Berechnung der PCR-Effizienz wurde die „slope“-Methode (Anstiegsmethode) verwendet. Bei dieser Methode wird eine logarithmische Verdünnungsreihe für jedes Template (RNase L, RNase L Inhibitor, 18S rRNA, GAPDH) hergestellt und der ct-Wert jedes Verdünnungspunktes bestimmt. Da in humaner gesamt-Zell- RNA zu wenig RNase L und RLI vorhanden sind, um Verdünnungsreihen über mehrere Logstufen herzustellen, wurden für diese Parameter die entsprechenden Plasmide ZC-5.1 (RNase L) und pcDNA3/RLI 3’ (RLI) verwendet. Für die Erstellung der Verdünnungsreihen von 18S rRNA und GAPDH wurde cDNA aus humaner Nieren (kidney) gesamt-Zell-RNA verwendet. In Abbildung 14 bis Abbildung 17 wurden die ct-Werte der einzelnen Verdünnungspunkte gegen die jeweiligen logarithmischen Konzentrationen der cDNA aufgetragen. Eine lineare Regressionsgerade (y = ax + b) wurde durch die ABI 7900HT SDS Software generiert und ihr Anstieg bestimmt. Liegt die PCR-Effizienz bei (E) = 1,0 (100 %), würde der erwartete Anstieg (a) einer logarithmischen Verdünnungsreihe -3,32 betragen. Die PCR-Effizienz berechnet sich mit der Anstiegsmethode der linearen Regressionsgeraden nach der Formel: E = 10(-1/Anstieg) -1 (Eurogentec, 2004). Nach Ermittlung des Anstiegs der Regressionsgeraden ergab sich für die erstellten PCRs von RNase L, RLI, 18S rRNA und GAPDH eine Effizienz von über 99 %. (siehe Tabelle 5)

Tabelle 5: PCR-Effizienz Anstieg E = 10(-1/Anstieg) -1 PCR-Effizienz RLI -3,34 E = 10(0.299) -1 99,2% RNase L -3,3 E = 10(0,3) -1 100% 18S rRNA -3,33 E = 10(0,3) -1 99,7% GAPDH -3,169 E = 10(0,31) -1 101%

49 Ergebnisse

Abbildung 14: Verdünnungsreihe der Abbildung 15: Verdünnungsreihe der RLI RNase L aus dem Plasmid ZC-5.1. Die ct- aus dem Bisbal-Plasmid. Die ct-Werte der Werte der Verdünnungspunkte wurden Verdünnungspunkte wurden gegen die gegen die logarithmische Konzentration des logarithmische Konzentration des Plasmides Plasmides aufgetragen und eine aufgetragen und eine Regressionsgerade Regressionsgerade generiert. generiert.

50 Ergebnisse

Abbildung 16: Verdünnungsreihe der 18S Abbildung 17: Verdünnungsreihe von rRNA aus kidney cDNA. Die ct-Werte der GAPDH aus kidney cDNA. Die ct-Werte Verdünnungspunkte wurden gegen die der Verdünnungspunkte wurden gegen die logarithmische Konzentration der cDNA logarithmische Konzentration der cDNA aufgetragen und eine Regressionsgerade aufgetragen und eine Regressionsgerade generiert. generiert.

3.1.1.2. Spezifität

Um unspezifische Amplifikate mit positivem Signal im TaqMan auszuschließen, wurde gesamt-Zell-RNA in cDNA umgeschrieben und als Template in die verschiedenen real time PCRs (RLI, RNase L, 18S rRNA, GAPDH) eingesetzt. Die PCR-Amplifikate wurden im 3%igen Agarosegel überprüft (siehe Abbildung 18). Es konnten keine unspezifischen Banden beobachtet werden. Die spezifischen Proben zeigten Banden der erwarteten Größen von 60 bp für die RNase L, 111 bp für das RLI, 110 bp für die 18S rRNA und 100 bp für GAPDH.. Alle Wasserkontrollen zeigten weder ein Signal in der real time PCR noch eine Bande im Agarosegel.

51 Ergebnisse

← 100 bp 60 bp →

Abbildung 18: Spezifität der real time PCRs zum Nachweis der mRNAs von RNase L, RLI, GAPDH sowie der 18S rRNA: Spur 1-2: RNase L aus FRhK-4-RNA (Fragmentgröße 60 pb); Spur 3-4: RNase L Wasserkontrolle; Spur 5-6: RLI aus pcDNA3.1_RLI (Fragmentgröße 111 bp); Spur 7-8: RLI Wasserkontrolle; Spur 9-10: 18S rRNA aus FRhK-4-RNA (Fragmentgröße 110 bp); Spur 11-12: 18S rRNA Wasserkontrolle; Spur 13-14: GAPDH aus FRhK-4-RNA (Fragmentgröße 100 bp), Spur 15-16: GAPDH Wasserkontrolle; M: 100 pb Marker Fermentas

3.1.2. Real time RT-PCR zum quantitativen Nachweis der HCV RNA

Auf der Basis existierender Primer und Sonden der Firma QIAGEN Hamburg (ehemals artus GmbH) wurde ein neues one-step HCV Nachweissystem für den RotorGene entwickelt. Es wurden verschiedene pH-Werte eines 5x-in-house-Puffers ausgetestet, sowie diverse Enzyme verschiedener Hersteller. Nach Auswahl des Puffer-pH-Wertes wurden Enzyme, dNTPs, Magnesium, Primer und Sonden titriert. Die finale Version des neu entwickelten HCV RT- PCR Nachweissystems soll von der QIAGEN Hamburg GmbH als Kit vertrieben werden. Die genaue Zusammensetzung der einzelnen Kit Komponenten sowie die Sequenzen von Primer und Sonden unterliegen der Geheimhaltung und werden deshalb in dieser Arbeit nicht veröffentlicht. Die Optimierungsversuche wurden mit in vitro transkribierter RNA sowie bereits aufgereinigten Positivkontrollen des Blutspendedienstes in Springe durchgeführt. In einem RT-PCR-Ansatz von 25 μl (15 μl Master + 10 μl Probe) wurden die Proben dieser Arbeit im RotorGene amplifiziert (Temperaturprofil siehe 2.2.1.12).

3.1.2.1. Testung des HCV RotorGene Assay auf Kreuzreaktivität

Um falsch positive Ergebnisse im RotorGene auszuschließen, wurden verschiedene Erreger- Genome auf mögliche Amplifikation im HCV Assay getestet (siehe Abbildung 19): Unter

52 Ergebnisse anderem wurden aufgereinigte Erregermaterialien wie HAV, HIV, Parvo, HSV 1 und 2, VZV, und CMV getestet, die wie das Hepatitis C Virus in Blutprodukten oder Plasma vorkommen können (weitere getestete Erregermaterialien siehe Abbildung 19). Bei keinem der eingesetzten Erregermaterialien konnte ein positives Signal in der RT-PCR nachgewiesen werden. Zur Kontrolle der RT-PCR wurde die HCV Standardreihe mitgeführt.

Abbildung 19: Kreuzreaktivitätstest des HCV RotorGene System: Es wurden verschiedene Erreger-Genome ins HCV RG System eingesetzt und auf potentielle Amplifikation getestet. Es wurde lediglich die HCV Standardreihe amplifiziert.

3.1.2.2. Sensitivität des HCV RotorGene Nachweissystems

Zur Bestimmung der Senstitivität des HCV RotorGene Systems wurde eine Probit-Analyse durchgeführt. Es wurden 6 Verdünnungsstufen von HCV-positivem Frischplasma des Blutspendedienstes aus Hagen in DMEM angesetzt und zu je 8 Replikaten mit dem QIAamp®Viral RNA Mini Kit aufgereinigt. Die Elution der HCV RNA erfolgte in je 50 μl AVE-Puffer. Jedes Replikat der Verdünnungsstufen wurde in drei unabhängigen RT-PCR- Läufen analysiert. Die Daten der drei Sensitivitätsläufe wurden mit Hilfe des Programms PriProbit Vers. 1.63 analysiert. Die von dem Programm berechneten Daten wurden mit Excel graphisch ausgewertet (siehe Abbildung 20). Dabei wurden die Wahrscheinlichkeiten, mit denen eine Anzahl an Internationalen Einheiten (IU, dose) noch nachgewiesen werden kann, gegen den Logarithmus der entsprechenden IUs aufgetragen. Durch die Datenpunkte wurde anschließend eine Sigmoidalkurve gelegt und der 95 % Wert durch zwei sich kreuzende

53 Ergebnisse

Linien gekennzeichnet. Das Programm PriProbit errechnet diesen 95 % Wert aus der Gleichung für die Sigmoidalkurve. Die Zusammenfassung der Daten ist in Tabelle 6 dargestellt. Die berechneten Wahrscheinlichkeiten, mit denen die Proben im RotorGene Assay detektiert werden können, sind in Tabelle 7 aufgeführt. Die graphische Auswertung der Probitanalyse ist in der darauf folgenden Abbildung 20 dargestellt. Die Probit-Analyse ergab eine Nachweisgrenze von 35 IU/ml auf einem Signifikanzniveau von 0,05. Das heißt, in dem entwickelten HCV RotorGene System können 35 IU/ml mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 % nachgewiesen werden. Die Menge an Viren, die in einer definierten Menge Plasma vorkommt wird als Viruslast bezeichnet. Die Angabe der Viruslast erfolgt in IU/ml. Diese Einheit ist mehr oder weniger willkürlich festgesetzt. Für die Umrechnung von Internationalen Einheiten (IU) in Viruskopien werden verschiedene Faktoren verwendet. Diese liegen zwischen 2 und 5 Viren pro IU. Für diese Arbeit wurde der Faktor 3 verwendet. Das bedeutet, bei einer analytischen Nachweisgrenze von 35 IU/ml können im HCV RotorGene System noch 105 cop/ml mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 % detektiert werden.

Tabelle 6: Zusammenfassung der Daten Tabelle 7: berechnete Wahrscheinlichkeiten, der Sensitivitätsläufe mit denen die Proben im HCV RotorGene System nachgewiesen werden konnten IU/ml N Anzahl positiver Proben Log (dose) Wahrscheinlichkeit

100 24 24 2.000 1.000

50 24 24 1.699 1.000

25 24 21 1.398 0.875

12.5 24 18 1.097 0.750

6.25 24 16 0.796 0.667

3.125 24 10 0.495 0.417

N: Gesamtprobenzahl Geradengleichung: Y = -1.119 + 1.791X A B

54 Ergebnisse

Probit-Analyse: Hepatitis C Virus (RotorGene 3000) 1.00 95%

0.80

0.60 Proportions 0.40

0.20 1.54363 ~ 34.965 IU/ml (95%)

0.00 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 log (dose) Abbildung 20: Analytische Sensitivität des HCV RotorGene System. Aufgetragen sind die logarithmischen Konzentrationen der gesteteten Proben gegen die Wahrscheinlichkeiten, mit denen diese im HCV RotorGene System nachgewiesen werden konnten. Die Nachweisgrenze (95 % -Wert) lag bei 35 IU/ml. Für eine Angabe der HCV RNA in Viruskopien ergab sich eine Nachweisgrenze von 105 cop/ml.

3.1.2.3. Nachweis verschiedener HCV Subtypen

Um sicherzustellen, dass mit dem HCV RotorGene Assay alle HCV Subtypen detektiert werden, wurde das Subtypenpanel der Universität Essen aufgereinigt und im HCV RotorGene System getestet. Das Subtypenpanel umfasst die Subtypen 1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 2i, 3a, 4, 5a und 6. Die Konzentrationen der verschiedenen Plasmaproben waren vom Hersteller bekannt. Alle Plasmaproben wurden auf eine Konzentration von 50 IU/ml eingestellt, mit dem QIAamp®Viral RNA Mini Kit aufgereinigt und 10 μl Eluat im HCV RotorGene Assay eingesetzt. Es wurden alle HCV-positiven Proben im RotorGene Assay detektiert (siehe Abbildung 21), während die Negativkontrolle kein Signal lieferte. Anhand der mitgeführten Standardreihe wurde durch die RotorGene Software die Konzentration der eingesetzten Eluate kalkuliert. Aus diesen Werten wurden die Konzentrationen der Plasmaproben berechnet (siehe Tabelle 8). Die berechneten Konzentrationen der Proben lagen zwischen 27 IU/ml (Subtyp 3a) und 143 IU/ml (Subtyp 4). Die Konzentrationen unter 50 IU/ml ergeben sich aufgrund von Aufreinigungsverlusten oder Pipettierschwankungen. Ein Faktor von 2 ist durch Pipettierschwankungen sowohl bei der Aufreinigung als auch der RT-PCR möglich und akzeptabel. Da die Standardreihe aus in vitro Transkripten von Subtyp 1a besteht, sind Schwankungsfaktoren auch durch unterschiedliche Sensitivitäten und Spezifitäten in der

55 Ergebnisse

Detektion anderer Subtypen möglich. Um dies auszuschließen, müsste zur genauen Quantifizierung der einzelnen Subtypen für jeden Subtyp eine spezifische Standardreihe mitgeführt werden. Da für alle Versuche die gleiche Standardreihe verwendet wird, ist dies nicht nötig. Ein möglicher Faktor würde für alle Proben gleichermaßen gelten.

Abbildung 21: Nachweis verschiedener HCV Subtypen im HCV RotorGene Assay. Getestet wurden die Subtypen 1 bis 6. Alle Subtypen wurden detektiert, während die Wasserkontrolle kein Signal zeigte.

Tabelle 8: Darstellung der kalkulierten Konzentrationen der HCV Eluate und berechneten Konzentrationen der auf 50 IU/ml eingestellten Plasmaproben Subtyp calc. IU/μl IU/ml Probe 1a 0.2438 87.07 1b 0.2455 87.68 2a 0.3486 124.50 2b 0.1199 42.82 2c 0.2199 78.54 2i 0.1175 41.96 3a 0.0746 26.64 4 0.4004 143.00 5a 0.2612 93.29 6 0.1465 52.32

56 Ergebnisse

3.1.3. Zusammenfassung real time PCRs

Es wurden quantitative real time PCRs zum spezifischen Nachweis der mRNAs von RNase L und RLI entwickelt. In two-step Reaktionen erfolgten zunächst die cDNA Synthese aus gesamt-Zell-RNA mit random hexamer Primern und anschließend die spezifischen real time PCRs. Zur relativen Quantifizierung wurden die zellulären Housekeeping-Gene 18S rRNA und GAPDH verwendet, für welche ebenfalls spezifische real time PCRs entwickelt wurden. Keine der erstellten real time PCRs zum Nachweis der mRNAs von RNase L, RLI und GAPDH sowie von 18S rRNA zeigte unspezifische Amplifikationen. Alle PCR-Effizienzen betrugen mindestens 99 %. Ebenfalls wurde ein neues HCV RotorGene Nachweissystem entwickelt und optimiert. Der Nachweis der HCV RNA erfolgte in einer one-step RT-PCR. Auf der Basis existierender Primer und Sonden wurde nach Umstellung des gesamten Puffer- und Enzymsystems ein in seiner Herstellung kostengünstiges und in seiner Anwendung reproduzierbares Assay entwickelt. Die Probleme des vorangegangenen HCV Systems durch Qualtitätsschwankungen der Reversen Transkriptase wurden durch die Verwendung der RT eines anderen Herstellers eliminiert. Das neue System zeigte keinerlei Kreuzreaktivität mit verschiedenen RNA- oder DNA-Erregermaterialien. Die analytische Nachweisgrenze des HCV RotorGene Systems lag bei 35 IU/ml bzw. 105 cop/ml.

3.2. RNase L Inhibitor

Um eine potentielle Aktivität der RNase L auszuschalten, wurde in der vorliegenden Arbeit der RNase L Inhibitor sowohl in FRhK-4- als auch in Huh7-Zellen überexprimiert. Da das Referenzplasmid pcDNA3/RLI 3’ die Sequenz des humanen RLI enthielt, wurde das RLI aus FRhK-4 Zellen full length amplifiziert und kloniert. Parallel zu dieser Amplifikation wurde das humane RLI aus Nieren-gesamt-Zell-RNA erneut full length amplifiziert und ebenfalls kloniert. In einer weiteren full length Amplifikation wurde das Stop-Codon des RLI ausgeschaltet, um den His-Tag des Klonierungsverktors pcDNA3.1/V5-His zu exprimieren

3.2.1. Sequenzierung RNase L Inhibitor

Nach Isolation, full length Amplifikation und Klonierung des RNase L Inhibitors wurde dieser in den pcDNA3.1/V5-His-Plasmiden sequenziert und anhand der Datenbanksequenz

57 Ergebnisse

Acc.nr. X74987 (Bisbal et al., 1995) analysiert. Gegenüber der Datenbanksequenz zeigten sowohl das humane als auch das FRhK-4 RLI gehäufte Nukleotidaustausche in den Abschnitten 520 bp bis 540 bp und 1412 bp bis 1422 bp (siehe Abbildung 22 A und B). Die Nukleotidunterschiede bewirken eine Veränderung der Aminosäuresequenz innerhalb dieser Bereiche (siehe Abbildung 22 C und D). Um Mutationen durch full length Amplifikation und Klonierung auszuschließen, wurde das RLI im Referenzplasmid pcDNA3/RLI 3’ von C. Bisbal sequenziert. Das RLI-Insert des pcDNA3/RLI 3’ zeigte ebenfalls die Nukleotid- und Aminosäuresequenz der full length amplifizierten RLI-Gene aus humaner- bzw. FRhK-4- gesamt-Zell-RNA. Damit unterschieden sich sowohl die Sequenz des Referenzplasmides pcDNA3/RLI 3’ als auch die in dieser Arbeit amplifizierten RLI-Genabschnitte von der Datenbanksequenz. Es ist anzunehmen, dass ein Sequenzierfehler zu der in der Datenbank angegebenen Sequenz geführt hat. Sequenzen und Alignments des kompletten RNase L Inhibitors aus humaner- bzw. FRhK-4-gesamt-Zell-RNA sowie des Bisbal-Plasmides und der NCBI Referenz befinden sich im Anhang dieser Arbeit (siehe Kapitel 7.2).

1 1 2 2 3 3 4 4

A B

1 1 2 2 3 3 4 4

C D Abbildung 22: Sequenzierung der verwendeten RLI–Fragmente: A und B: Nukleotidsequenz und Alignment; C und D: Aminosäuresequenz im Einbuchstaben-Code und Alignment; 1 = RLI Sequenz NCBI Acc.nr X74987, 2 = RLI aus pcDNA3/RLI 3’, 3 = RLI full length amplifiziert aus humaner gesamt-RNA, 4 = RLI full length amplifiziert aus FRhK-4-gesamt- Zell-RNA

58 Ergebnisse

3.2.2. Transfektion mit jetPEI bzw. FuGene 6 Transfection Reagent

Für die Transfektion des klonierten RLI in FRhK-4- und Huh7-Zellen wurden die Transfektionsreagenzien jetPEI der Firma QBiogene und FuGene 6 Transfection Reagent der Firma Roche getestet. Das kationische Polymer jetPEI (Polyethylenimin) bildet Komplexe mit der Plasmid-DNA. Die positive Nettoladung dieser Komplexe ermöglicht die Interaktion mit anionischen Glykoproteinen auf der Zelloberfläche und anschließend die Aufnahme der jetPEI-DNA- Komplexe in die Zelle durch Endocytose. Auch die Transfektion mit FuGene 6 erfolgt durch Komplexbildung. Die kationischen Lipide des FuGene 6 Transfection Reagent binden an die negativ geladene Plasmid-DNA und können als Liposomen-Nukleinsäure-Komplex mit der Plasmamembran der Zelle fusionieren. Die Transfektion wurde sowohl mit jetPEI als auch mit dem FuGene 6 Transfection Reagent und den RLI-Plasmiden pcDNA3.1/V5-His-m_RLI für FRhK-4- und pcDNA3.1/V5-His- h_RLI für Huh7-Zellen durchgeführt und die Zellen nach 24 h geerntet. Die verschiedenen Transfektionsreagenzien wurden mit und ohne Plasmid getestet. Dadurch wurde ausgeschlossen, dass die Transfektionsreagenzien einen regulativen Einfluss auf die mRNA- Transkription des konstitutiv exprimierten zellulären RLI ausüben. Die zelluläre RNA wurde mit dem RNeasy® Mini Kit aufgereinigt und DNase I verdaut. Mittels real time PCR wurden die RLI-Transkriptionsraten bestimmt (siehe Abbildung 23). Mit jetPEI zeigten die FRhK-4- und Huh7-Zellen eine sechsfach erhöhte Transkription des RNase L Inhibitors. Der Einsatz von FuGene 6 führte zu einer fünffachen Überexpression des RLI in FRhK-4-Zellen und zu einer siebenfachen Überexpression des RLI in Huh7-Zellen. Ohne Zusatz des pcDNA3.1/V5- His_RLI konnte keine erhöhte RLI-Expression detektiert werden. Mit diesem Ergebnis wurde ein potentieller Einfluss von jetPEI oder FuGene 6 auf die Transkription des zellulären RLI ausgeschlossen. Die Grenzwerte der Genexpression wurden bei 0,5 und 2 definiert. Diese - Werte entsprechen Transkriptionsabweichungen um Faktoren von /+ 2 und gelten damit als nicht reguliert.

59 Ergebnisse

8 8

7 7

6 6

5 5

4 4

3 3 in Relation zur 18S rRNA in Relation zur in Relation zur 18S rRNA 18S rRNA in Relation zur 2 2 und unbehandelter Kontrolle unbehandelter und und unbehandelter Kontrolle unbehandelter und relative Einheiten RLI-mRNA Einheiten relative relative Einheiten RLI-mRNA Einheiten relative 1 1

0 0 jetPEI+pcDNA3.1/V5-His_RLI jetPEI+pcDNA3.1/V5-His_RLI jetPEI jetPEI FuGene+pcDNA3.1/V5-His_RLI FuGene+pcDNA3.1/V5-His_RLI FuGene FuGene

A B Abbildung 23: Vergleich der Transfektionsreagenzien jetPEI und FuGene 6 hinsichtlich der relativen Einheiten an RLI-mRNA. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA. Es wurden sowohl die Transfektionsreagenzien mit RLI-Plasmid als auch ohne Plasmid getestet. Die Auswertung der Expressionsdaten erfolgte 24 h nach Transfektion. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. Der Einsatz der Transfektionsreagenzien ohne Plasmid hatte keinen Einfluss auf die RLI-Expression. A: Huh7-Zellen, B: FRhK-4-Zellen

Der Einfluss der Transfektion mit und ohne RLI-Plasmid auf die 18S rRNA der Zellen ist in Abbildung 24 dargestellt. Weder jetPEI noch FuGene 6 hatten innerhalb von 24 h einen quantitativen Einfluss auf die 18S rRNA der Zellen. In Transfektionsversuchen mit jetPEI über längere Inkubationszeiten, zeigte sich eine übermäßig starke Zunahme toter Zellen (Daten nicht gezeigt, da mikroskopische Beobachtungen). Diese Beobachtungen waren unabhängig davon, ob die Transfektionen mit oder ohne Zusatz der RLI-Plasmide durchgeführt wurden. Aus diesem Grund ist davon auszugehen, dass jetPEI einen Einfluss auf die Vitalität und Lebensfähigkeit der Zellen hat. Diese Langzeit-Auswirkungen konnten bei der Verwendung von FuGene 6 Transfection Reagent nicht beobachtet werden, so dass in den weiteren Versuchen FuGene 6 als Transfektionsreagenz verwendet wurde.

60 Ergebnisse

1600 1600 1400 1400 1200 1200 1000 1000 800 800 600 600 400 400

200 18S rRNA Einheiten relative 200 relative Einheiten 18S rRNA 18S relative Einheiten 0 0 jetPEI+pcDNA3.1/V5-His_RLI jetPEI+pcDNA3.1/V5-His_RLI jetPEI jetPEI FuGene+pcDNA3.1/V5-His_RLI FuGene+pcDNA3.1/V5-His_RLI FuGene FuGene

A B Abbildung 24: Einfluss der Transfektion auf die 18S rRNA. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten 18S rRNA. Es wurden sowohl der Einsatz der Transfektionsreagenzien mit RLI- Plasmid als auch ohne Plasmid im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen getestet. Die Auswertung der Expressionsdaten erfolgte 24 h nach Transfektion. Die Berechnung der relativen 18S rRNA Einheiten erfolgte durch eine externe Verdünnungsreihe von cDNA aus Nieren-gesamt-Zell-RNA A: Huh7-Zellen, B: FRhK-4-Zellen

3.2.3. RLI-Kinetik nach Transfektion mit pcDNA3.1/V5-His_RLI

Die Überexpression des RLI sollte über eine möglichst lange Inkubationszeit mit möglichst hohen Expressionsraten erfolgen. Um den Verlauf der transienten Transkription des RLI zu analysieren, wurde eine Kinetik erstellt. RLI-transfizierte Zellen wurden 1 bis 4 Tage nach Transfektion geerntet, die RNA mit dem RNeasy® Mini Kit aufgereinigt und DNase I verdaut. Die Bestimmung der Transkriptionsraten erfolgte mittels real time PCR (siehe Abbildung 25). Nach 24 h wurde in den FRhK-4-Zellen eine leicht erhöhte RLI-Transkription um den Faktor 3 detektiert. Der Höhepunkt der Überexpression wurde nach 2 Tagen mit einer gesteigerten relativen RLI-mRNA-Menge um den Faktor 6 gemessen. Nach 3 Tagen überschritt die Transkriptionsrate gerade noch den Grenzwert der nicht-regulierten Genexpression von zweifach und war nach 4 Tagen nicht mehr nachweisbar. Die Huh7-Zellen erreichten bereits nach 24 h die maximale Steigerung der RLI-mRNA-Menge um den Faktor 5. In den weiteren Tagen nahm die relative mRNA-Menge des RLI stetig ab. Nach 4 Tagen konnte nur noch eine erhöhte Expression des RNase L Inhibitors um den Faktor 3 nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der Expressionshöhe und der Expressionsdauer des RLI waren weder für die FRhk-4- noch für die Huh7-Zellen zufriedenstellend. Die maximalen Transkriptionsraten und die Dauer der erhöhten Expression von 4 Tagen waren viel zu gering. Aus diesen Gründen

61 Ergebnisse wurden sowohl die Möglichkeiten eines anderen Expressionsvektors (pl.18) als auch der stabilen Transfektion (statt transiente Transfektion) zur Steigerung der Transkriptionsraten und Expressionsdauer herangezogen.

7 7

6 6

5 5

4 4

3 3

2 2 in Relation zur 18S rRNA zur 18S rRNA in Relation in Relation zur 18S rRNA zur 18S rRNA in Relation und unbehandelter Kontrolle und unbehandelter und unbehandelter Kontrolle und unbehandelter 1 1 relative Einheiten RLI-mRNA relative Einheiten RLI-mRNA

0 0 24 h 48 h 72 h 96 h 24 h 48 h 72 h 96 h B A Abbildung 25: RLI-Kinetik nach Transfektion mit pcDNA3.1/V5-His_RLI. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Zeit. Die relativen Einheiten RLI- mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. A: Huh7-Zellen, B: FRhK-4-Zellen

3.2.4. Vergleich der Expressionsraten von pcDNA3.1/V5-His_RLI und pl.18_RLI

Da die maximalen Transkriptionsraten des pcDNA3.1/V5-His_RLI sehr gering ausfielen und bereits nach 4 Tagen kaum eine erhöhte Transkription mehr nachgewiesen werden konnte, wurde das RLI mit angehängten His-Tag in den Vektor pl.18 umkloniert. Dieser Vektor zeichnet sich durch besonders hohe Expressionsraten aus und sollte eine stärkere und länger anhaltende Expression des RLI ermöglichen. Um die Transkriptionsraten der Plasmide zu vergleichen, wurden Huh7- und FRhK-4-Zellen zum einen mit den entsprechenden pcDNA3.1/V5-His_RLI, zum anderen mit den entsprechenden pl.18_RLI transfiziert (siehe Abbildung 26).

62 Ergebnisse

45 45

40 40 35 35 30 30 25 25 20 20 15 15 in Relation zur 18S rRNA zur 18S rRNA in Relation in Relation zur 18S rRNA zur 18S rRNA in Relation

und unbehandelter Kontrolle und unbehandelter 10 10 Kontrolle und unbehandelter

relative Einheiten RLI-mRNA 5 5 relative Einheiten RLI-mRNA 0 0 24 h 72 h 120 h 24 h 72 h 120 h pcDNA3.1V5-His/RLI pl.18-h_RLI pcDNA3.1V5-His/RLI pl.18-m_RLI

A B Abbildung 26: Vergleich der RLI-Transkriptionsraten nach Transfektion mit pcDNA3.1/V5- His_RLI und pl.18_RLI. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. A: Huh7-Zellen, B: FRhK-4-Zellen

Bereits nach 24 h zeigten die Transfektionsansätze mit den pl.18_RLI Plasmiden eine deutlich stärkere RLI-Transkription als die Ansätze mit den entsprechenden pcDNA3.1/V5-His_RLI. Bei Transfektion mit pcDNA3.1/V5-His_RLI wiesen die FRhK-4-Zellen eine gesteigerte RLI-mRNA-Menge um den Faktor 4, die Huh7-Zellen um den Faktor 8 auf. Demgegenüber lag die Erhöhung der RLI-mRNA-Menge durch pl.18_RLI für die FRhK-4-Zellen um einen Faktor von 20 und für die Huh7-Zellen um einen Faktor von 38. Im Vergleich zum 24 h – Wert (1 d) zeigte der 72 h – Wert (3 d) für die Transfektionen mit pcDNA3.1/V5-His_RLI keine weitere Steigerung der RLI-Transkription. Durch Transfektion mit pl.18_RLI wurde nach 3 Tagen für beide Zelllinien eine Überexpression um Faktoren oberhalb von 40 erreicht. Nach 120 h (5 d) sanken die Transkriptionsraten mit pl.18_RLI wieder ab, lagen jedoch für beide Zelllinien noch um den Faktor 10 höher als in den transfizierten Kontrollzellen. Unter dem Einfluss von pcDNA3.1/V5-His_RLI war die Expression sowohl für FRhK-4- als auch für Huh7-Zellen nur noch um den Faktor 2,5 erhöht. Aufgrund der deutlich besseren Transkriptionsraten der pl.18_RLI Plasmide im Vergleich zu den pcDNA3.1/V5-His_RLI Plasmiden wurden in den weiteren Versuchen die pl.18_RLI Plasmide verwendet.

63 Ergebnisse

3.2.5. Nachweis der RLI-Expression mittels Immunfluoreszenz

Um nachzuweisen, ob die hohen RLI-Transkriptionsraten mit der RLI-Proteinsynthese korrelieren, wurden diese mittels Immunfluoreszenz kontrolliert. Dazu wurden FRhK-4- und Huh7-Zellen auf Deckgläschen angezogen und mit den entsprechenden pl.18_RLI Plasmiden transfiziert. 3 Tage nach Transfektion wurden die Zellen mit Ethanol auf den Deckgläschen fixiert und die synthetisierten RLI-Proteine mit Hilfe eines spezifischen FITC-gekoppelten Antikörper gegen den angefügten His-Tag im Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht (siehe Abbildung 27).

A1 B1

A2 B2 Abbildung 27: Immunfluoreszenzen gegen den His-Tag der transfizierten pl.18_RLI Plasmide. Aufgenommen unter Blaulicht mit 40x Vergrößerung. A: Huh7-Zellen: A1 ohne RLI, A2 mit RLI, B: FRhK-4-Zellen: B1 ohne RLI, B2 mit RLI

In den nicht transfizierten Kontrollzellen waren weder bei FRhK-4- noch bei Huh7-Zellen fluoreszierende Zellen zu finden (siehe Abbildung 27 A1 und B1). Die transfizierten Huh7- Zellen zeigten sehr wenige leuchtende Zellen (siehe Abbildung 27 A2). Die transfizierten FRhK-4-Zellen wiesen im Vergleich zu den Huh7-Zellen eine größere Anzahl und deutlich

64 Ergebnisse stärker leuchtende Zellen auf. Generell gab es jedoch keine nebeneinanderliegenden fluoreszierenden Zellen. Die Transfektionsrate betrug maximal 10 %. Nach der Messung erhöhter RLI-mRNA um Faktoren von bis zu 40 nach 3 Tagen (siehe Abbildung 26) wurden deutlich mehr leuchtende Zellen in der Analyse der Immunfluoreszenz erwartet. Es kann nicht beurteilt werden, ob lediglich diese geringe Anzahl an Zellen transfiziert wurde oder die Proteindichte für den Nachweis durch die Immunfluoreszenz noch oder nicht mehr ausreichend war.

3.2.6. Stabile Überexpression des RLI in FRhK-4- und Huh7-Zellen

Da in transient RLI-transfizierten Zellen bereits nach 1 Woche keine erhöhte Menge an RLI- mRNA mehr nachweisbar war, sollte das RLI stabil in FRhK-4- und Huh7-Zellen überexprimiert werden. Dadurch sollte eine dauerhafte und konstante Transkriptionsrate des RLI erreicht werden. FRhK-4- und Huh7-Zellen wurden mit den entsprechenden pl.18_RLI Plasmiden transfiziert und potentielle Klone mit Hilfe von G418 selektiert. Eine Woche nach Transfektion wurden die Zellen in Ansätzen von 1:500 bis 1:5000 gesplittet und das Wachstum einzelner Klonkolonien beobachtet. Die Selektion stabil transfizierter Huh7-Klone war nicht möglich, da Huh7-Zellen bei dem sehr hohen Umsetzungsverhältnis im Rahmen der Klonselektion ihr Wachstum komplett einstellten. Es konnten lediglich Mischklone selektiert werden, bei denen jedoch nach kurzer Zeit keine erhöhte RLI-Transkriptionsrate mehr nachgewiesen werden konnte. Von den FRhK-4-Zellen wurden 11 Klonkolonien selektiert und auf RLI-Überexpression untersucht. 5 Wochen nach Transfektion zeigten noch 6 dieser 11 Klone eine erhöhte Menge an RLI-mRNA (siehe Abbildung 28 A). Die Klone 4, 5 und 8 zeigten gesteigerte Transkriptionsraten um Faktoren von 5 bis 6,5. Die Klone 1, 7 und 11 zeigten erhöhte Transkriptionen um Faktoren von 7,5 bis 8,5. Gegenüber der relativen Mengen an RLI-mRNA von Tag 3 bis 5 bei einer transienten Transfektion (siehe Abbildung 26 B) zeigten alle stabil transfizierten FRhK-4-RLI-Klone vergleichsweise geringe Überexpressionswerte des RNase L Inhibitors. 8 Wochen nach Transfektion wurden Aliquots der Klone eingefroren und zu diesem Zeitpunkt die Transkriptionsraten erneut bestimmt (siehe Abbildung 28 B). Es zeigte sich, bis auf Klon 5, eine Abnahme der relativen Mengen an RLI-mRNA gegenüber den relativen Mengen an RLI-mRNA 5 Wochen nach Transfektion. Die Transkriptionsraten der Klone 8 und 11 überschritten kaum noch den Grenzwert von 2. Alle anderen Klone zeigten nur noch leicht erhöhte Transkriptionen um Faktoren von 4 bis 6.

65 Ergebnisse

Lediglich Klon 5 zeigte noch eine RLI-Überexpression um den Faktor 8, was gegenüber dem 5 Wochen-Wert eine Steigerung der Transkription bedeutete.

12 9

8 10 7 8 6 5 6 4 4 3 in Relation zur 18S rRNA in Relation zur 18S rRNA und unbehandelter Kontrolle und unbehandelter Kontrolle 2 2 relative Einheiten RLI-mRNA Einheiten relative relative Einheiten RLI-mRNA Einheiten relative 1 0 0 1457811 1457811 Klon Klon

A B Abbildung 28: RLI-Expression in stabil transfizierten FRhK-4-Klonen. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Nummer der Klone. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. A: 5 Wochen nach Transfektion; B: 8 Wochen nach Transfektion

Die Klone 4 und 5 wurden zur Weiterkultivierung ausgewählt. Klon 4 mit einer vergleichsweise niedrigen RLI-Überexpression und Klon 5 mit einer höheren Transkriptionsrate. Die Zellen wurden geteilt, umgesetzt und die RLI-Transkriptionsrate nach einer weiteren Woche erneut analysiert (siehe Abbildung 29). Klon 4 zeigte noch immer eine leicht erhöhte RLI-mRNA-Menge um einen Faktor von ca. 4. Für Klon 5 konnte keine Überexpression des RNase L Inhibitor mehr nachgewiesen werden. Somit konnten auch für die FRhK-4 Zellen keine Klone mit konstant stabiler Überexpression des RNase L Inhibitors gewonnen werden. Durch mikroskopische Betrachtung wurden weder morphologische Veränderung der Zellen noch ein erhöhtes Maß an toten Zellen festgestellt. Trotzdem ist nicht auszuschließen, dass eine erhöhte RLI-Transkription mit anschließender RLI-Proteinsynthese toxisch auf die Zellen wirkt und diese dadurch absterben.

66 Ergebnisse

4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5

in Relation zur 18S rRNA 18S zur Relation in 1.0 und unbehandelter Kontrolle 0.5 relative Einheiten RLI-mRNA Einheiten relative 0.0 45 Klon

Abbildung 29: Bestimmung relativer Einheiten RLI-mRNA der FRhk-4-Klone 4 und 5. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Nummer der Klone. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. 10 Wochen nach RLI- Transfektion

3.2.7. RLI-Kinetik der FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5

Die RLI-Expression der stabil transfizierten FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5 wurde genauer analysiert. Zur Erstellung einer RLI-Kinetik wurden Aliquots der FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5 aufgetaut und angezogen. Die Klone sowie nichttransfizierte FRhK-4-Zellen wurden in 6- well-Platten ausgesät und nach 0, 2, 4, 6, 10 und 14 Tagen geerntet. Mittels real time PCR wurden die relativen Mengen an RLI-mRNA in den aufgereinigten RNAs bestimmt. Die stabil transfizierten FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5 zeigten über einen Zeitraum von 14 Tage keine gleichbleibende Transkription des RLI sondern deutliche Schwankungen (siehe Abbildung 30). Sowohl Klon 4 als auch Klon 5 wiesen RLI-Transkriptionsraten um Faktoren von unter 2 bis über 8 auf. Je nach Inkubationszeit der Zellen schwankten die relativen mRNA-Mengen des RLI in den FRhK-4-RLI-Klonen 4 und 5 sehr stark. Die maximale relative Steigerung des RLI-mRNA-Gehalts um Faktoren von 8 bis 10 konnte in mehrfachen Versuchsansätzen nicht reproduziert werden. In manchem Versuchsansatz war die maximale Menge an relativer RLI-mRNA bereits bei einem Faktor von 4 erreicht. Aus diesem Grund wurde in Abbildung 30 lediglich ein Einzelexperiment abgebildet. Die Messung der mRNA- Mengen von RLI sowie der 18S rRNA wurde mit der real time PCR in Doppelbestimmung durchgeführt. Eine stabil und gleichmäßig erhöhte Expression des RNase L Inhibitors in FRhK-4-Klonen konnte nicht gezeigt werden. Auch mit Hilfe der Immunfluoreszenz zum Nachweis von RLI-Protein konnten keine leuchtenden Zellen in den FRhK-4-Klon 4-Zellen

67 Ergebnisse detektiert werden (Daten nicht gezeigt). Trotz erhöhter RLI-Transkription lag die Menge an produziertem RLI mit angehängtem His-Tag deutlich unter der Nachweisgrenze. Auch in diesem Fall konnte nicht unterschieden werden, ob Zellen mit gesteigerter RLI-Expression und möglicherweise erhöhtem RLI-Proteinanteil absterben oder die Menge an RLI-Protein für den Nachweis mittels Immunfluoreszenz nicht ausreichend war.

12 12

10 10

8 8

6 6

4 4 in Relation zur 18S rRNA zur 18S in Relation in Relation zur 18S rRNA zur 18S rRNA in Relation und unbehandelter Kontrolle und unbehandelter und unbehandelter Kontrolle und unbehandelter

relative Einheiten RLI-mRNA 2 2 relative Einheiten RLI-mRNA

0 0 0 h 48 h 96 h 144 h 240 h 336 h 0 h 48 h 96 h 144 h 240 h 336 h

A B Abbildung 30: RLI-Kinetik der FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5. Die relativen Einheiten RLI- mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. A: Klon 4, B: Klon 5

3.2.8. Kinetik der RLI-Expression stabil transfizierter FRhK-4-6er Klone

Da eine stabile Transfektion des RLI in FRhK-4-Zellen nicht möglich schien, wurde die RLI- Transkription in einem bereits vorhandenen potentiellen RLI-Klon analysiert. 1999 wurden von Jörn Gotter im Rahmen seiner Diplomarbeit (Gotter, 1999) FRhK-4-Zellen mit dem pcDNA3/RLI 3’ Plasmid stabil transfiziert. Eine Analyse der RLI-Transkription wurde jedoch nie durchgeführt. In Infektionsversuchen mit HAV wurde eine gesteigerte Replikationsrate von HAV in den gewonnenen FRhK-4-6er Klonen gegenüber nicht transfizierten FRhK-4- Zellen festgestellt. Das führte zu der Annahme, dass die FRhK-4-6er-Zellen das RLI überexprimieren. Die FRhK-4-6er Zellen wurden im Stickstofftank aufbewahrt. Ein Aliquot dieser Zellen wurde aufgetaut und angezogen. Es wurden 6-well-Platten mit FRhK-4-6er Zellen ausgesät und die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet. Die zelluläre RNA

68 Ergebnisse wurde mit dem RNeasy® Mini Kit aufgereinigt und nach der cDNA-Synthese die relativen RLI-mRNA-Mengen mittels real time PCR bestimmt (siehe Abbildung 31).

3

2.5

2

1.5

1 in Relation zur 18S rRNA zur 18S rRNA in Relation und unbehandelter Kontrolle und unbehandelter

relative Einheiten RLI-mRNA Einheiten relative 0.5

0 0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h 168 h 240 h 336 h Mittelwert

Abbildung 31: RLI-Expression in FRhK-4-6er Zellen. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zu FRhK-4-Zellen als Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnen die Grenzwerte der nicht regulierten Genexpression.

Es waren Transkriptionsraten des RNase L Inhibitors zwischen Faktoren von 0,3 und 2,7 zu detektieren. Lediglich für die Tage 1 und 5 der Probennahme wurden die Grenzen der Genexpression überschritten. Diese Tage entsprechen den Tagen nach Aussaat und Mediumwechsel. Über den Inkubationszeitraum von 14 Tagen konnten keine stabil erhöhten Mengen an RLI-mRNA in den FRhK-4-6er Klonen festgestellt werden. Die gesteigerte HAV- Replikationsrate in diesen Zellen ist nach diesem Ergebnis mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht auf eine Überexpression des RNase L Inhibitors zurückzuführen, sondern auf eine nicht definierte Eigenschaft der FRhK-4-6er Klone. Möglicherweise zeigten die FRhK-4-6er-Klone nach Transfektion mit pcDNA3/RLI 3’ zunächste eine Überexpression des RLI, welche jedoch wie bei den FRhK-4 Klon 4- und Klon 5-Zellen der vorliegenden Arbeit nicht aufrechterhalten wurde.

69 Ergebnisse

3.2.9. Zusammenfassung RNase L Inhibitor

Aus humaner- und Rhesusaffen-gesamt-Zell-RNA wurde der RNase L Inhibitor full length amplifiziert. Dabei wurde das Stop-Codon ausgeschaltet, um die Expression des RLI mit dem His-Tag des Klonierungsvektors zu ermöglichen. Nach Klonierung des RLI in das Plasmid pcDNA3.1-V5/His zeigten sowohl die FRhK-4- als auch die Huh7-Zellen eine gesteigerte RLI-Transkription um Faktoren von maximal 7, welche jedoch bereits nach 4 Tagen nicht mehr nachweisbar war. Zur Steigerung der RLI-Expression wurde das RLI in den Vektor pl.18 umkloniert und zeigte in beiden verwendeten Zelllinien eine gesteigerte RLI-Expression um Faktoren von bis zu 45. Allerdings konnte auch mit Hilfe der entsprechenden pl.18_RLI- Plasmide eine erhöhte Transkription nicht länger als 1 Woche nachgewiesen werden. Aus diesem Grund sollte das RLI stabil in die Zellen transfiziert werden. Eine stabile Transfektion des RLI war weder in Huh7- noch in FRhK-4-Zellen erfolgreich. Die Huh7-Zellen stellten bei dem hohen Umsetzungsverhältnis, welches Vorrausetzung für die Selektion von potentiellen RLI-Klonen war, ihr Wachstum komplett ein. Auch durch die Selektion transfizierter FRhK- 4-Zellen konnten keine Klone gewonnen werden, die das RLI stabil und dauerhaft überexprimieren. Die relativen Mengen an RLI-mRNA der FRhK-4-Klone 4 und 5 unterlagen starken Schwankungen oder waren häufig nicht erhöht. Es wurde angenommen, dass FRhK- 4-6er Zellen, welche in einer vorangegangenen Diplomarbeit aus der stabilen Transfektion von FRhK-4-Zellen mit pcDNA3/RLI 3’ gewonnen wurden, das RLI überexprimieren. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte auch in diesen Zellen keine gesteigerte Menge an RLI-mRNA gegenüber nicht transfizierten FRhK-4-Zellen nachgewiesen werden.

3.3. HCV Infektion

In diesem Teil der Arbeit wurden RLI überexprimierende Huh7- und FRhK-4-Zellen mit dem Hepatitis C Virus aus infektiösem Frischplasma infiziert. Das für die Infektion verwendete Frischplasma wurde zunächst mit Hilfe des HCV RotorGene Systems und durch Sequenzierung genauer charakterisiert. Die Infektion erfolgte sowohl bei den FRhK-4-RLI- Klonen 4 und 5 (siehe Kapitel 3.2.6) als auch bei transient RLI-transfizierten Huh7- und FRhK-4-Zellen. Huh7-Zellen sind derzeitig die einzige Zelllinie, in der das Hepatitis C Virus JFH-1 oder HCV-Replikons effizient replizieren, so dass aus diesem Grund Huh7-Zellen in dieser Arbeit verwendet wurden. In HAV-Infektionsversuchen mit RLI-transfizierte FRhK-4- Zellen zeigte sich ein stärkeres Viruswachstum. Es wurde daher versucht, diese Eigenschaft

70 Ergebnisse der RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen auf das Hepatitis C Virus zu übertragen. Neben der Bestimmung der HCV-RNA wurde die Expression von RNase L und RLI analysiert. Obwohl bisher keine Regulation der RNase L in der Literatur beschrieben wurde, wurde diese ebenfalls analysiert. In Infektionsversuchen mit HAV einer parallel laufenden Arbeit zeigte die Datenlage zwischenzeitlich eine mögliche gesteigerte Expression der RNase L. Aus diesem Grund wurde auch die Expression der RNase L im Rahmen der vorliegenden Arbeit unter den Bedingungen einer HCV-Infektion analysiert. Es wurde überprüft, ob das Virus möglicherweise einen Einfluss auf die RNase L ausübt und ob sich die Überexpression des RLI positiv auf die Replikation des HCV auswirkt.

3.3.1. Titer- und Subtypenbestimmung von HCV-positivem Plasma des Blutspendedienstes Hagen

HCV-positives und infektiöses Frischplasma vom Blutspendedienst Hagen (in der RotorGene Beschriftung Abbildung 32 A Hagenplasma genannt) wurde für die Infektion von Huh7- und FRhK-4 Zellen verwendet. Zunächst wurde der Virustiter des Plasmas im HCV RotorGene System quantifiziert und durch Sequenzierung des Amplifikates der Subtyp des Virus bestimmt (siehe Abbildung 32). Anhand der mitgeführten Standardreihe wurde die Konzentration des eingesetzten Eluates durch die RotorGene Software kalkuliert und anschließend ein HCV Titer im Plasma von ca. 2,76 x 106 IU/ml berechnet. Die Auswertung der Sequenz des PCR Amplifikates mit Hilfe der HCV Datenbank http://hcv.lanl.gov/cgi- bin/BASIC_BLAST/basic_blast.cgi ergab eine 100%ige Übereinstimmung mit dem HCV Subtyp 3a (siehe Abbildung 32 B). Der Subtyp 3a ist wie 1a und 1b weltweit verbreitet, findet sich jedoch hauptsächlich bei Drogenabhängigen.

71 Ergebnisse

5’ - GCC CCC CCC TCC CGG GAG AGC CAT AGT GGT CTG CGG AAC CGG TGA GTA CAC CGG AAT CGC TGG GGT GAC CGG GTC CTT TCT TGG AAC AAC CCG CTC AAT ACC CAG AAA TTT GGG CGT GCC CCC GCA AGA TCA CTA GCC GAG TAG TGT TGG GTC GCG AAA GGC CTT GTG GTA CTG CCT GAT AGG GTG CTT GCG AGA – 3’

B A Abbildung 32: Titerbestimmung und Genotypenanalyse HCV-positiven Frischplasmas A: Amplifikation des aufgereinigten Plasmas im HCV RotorGene System. blau: Standardreihe, rot: HCV Eluat in 10fach-Bestimmung; grün: Wasserkontrolle; B: Sequenz des Amplifikates.

3.3.2. Stabilität von HCV RNA

Um die Ergebnisse der HCV RNA-Bestimmung von infizierten Zellen nach verschiedenen Inkubationszeiten beurteilen zu können, wurde zunächst die Stabilität von Hepatitis C Virus RNA im Viruskapsid bestimmt. Die Stabilität der RNA wurde in Medium und unter Brutschrankbedingungen, jedoch ohne den Einfluss zellulärer Enzyme bestimmt. Anhand der Inkubationszeit nachweisbarer RNA im zellfreien Medium wurde beurteilt, ob die detektierte HCV RNA in den Infektionsversuchen noch vom Inokulum an den Zellen haften könnte oder repliziert wurde. Durch die zusätzlichen zellulären RNasen in den Infektionsversuchen wurde davon ausgegangen, dass die zeitliche Nachweisgrenze von Inokulum RNA deutlich vor dem Zeitpunkt liegt, an dem die Nachweisgrenze der HCV RNA im zellfreien Medium erreicht wurde. Für den Stabilitätstest wurden 4 μl HCV-positives Frischplasma (entspricht ca. 104 IU) in 4 ml DMEM gegeben und zu je 1 ml auf 4 wells einer 12-well-Platte verteilt. Die Konzentration pro well betrug somit ca. 2500 IU/ml. Die Zellkulturplatte wurde im

72 Ergebnisse

Brutschrank bei konstanten Bedingungen (37°C, 5 % CO2) inkubiert. Im Abstand von 2 Tagen wurden je 140 μl Medium abgenommen und mittels real time RT-PCR die Konzentration der Virus RNA bestimmt. Zur besseren Veranschaulichung wurden die RNA- Konzentrationen sowohl linear (siehe Abbildung 33Abbildung 34) als auch logarithmisch (siehe Abbildung 34) dargestellt. Nach 30 Tagen waren in den einzelnen wells lediglich noch 300 μl Medium vorhanden. Aufgrund der konstanten Inkubationsbedingungen und gleichbleibender Mediumoberfläche wird eine Verdunstung von ca. 23 μl pro Tag (entspricht 700 μl in 30 Tagen) angenommen. Diese Verdunstungsmenge wurde in die Berechnung der Virusmenge pro ml einbezogen. Bis zu Tag 18 (432 h) konnte für alle Proben ein reproduzierbar positives Signal in der real time RT-PCR detektiert werden. Die Virusmenge sank innerhalb dieser Tage stetig von ursprünglichen 2800 IU auf 20 IU pro ml Medium. Ohne den rechnerischen Faktor der Verdunstung enthielten die aufgereinigten Mediumsproben von Tag 18 eine RNA-Konzentration von durchschnittlich 34 IU/ml. Diese RNA-Konzentration korreliert mit dem 95 % Wert der Sensitivitätsbestimmung (siehe Abbildung 20) und entspricht der Konzentration, die noch zu 95 % mit dem RotorGene System nachgewiesen werden kann. D.h. an Tag 18 wurde die Nachweisgrenze des HCV RotorGene Systems erreicht. Niedrigere HCV Konzentrationen im Medium waren nicht mehr reproduzierbar detektierbar. In den Versuchstagen nach Tag 18 nahm die Anzahl der Signalausfälle stetig zu. Nach 30 Tagen waren alle Proben RT-PCR negativ. In keinem der 4 Ansätze war noch HCV-RNA nachweisbar. Ohne RNA-Abbau hätte sich die Anzahl der Internationalen HCV Einheiten alle 2 Tage lediglich um die Anzahl der in 140 μl Probe enthaltenen Internationalen Einheiten verringern müssen (siehe Abbildung 33 und Abbildung 34 blaue Balken). Die entnommenen HCV-Mediumsuspensionen von je 140 μl wurden durch je 140 μl Medium aufgefüllt, so dass ohne RNA-Abbau nach 30 Tagen rechnerisch noch eine RNA-Konzentration von 90 IU/ml vorhanden gewesen wäre. Durch den Abbau der HCV RNA in DMEM im Brutschrank war jedoch nach 30 Tagen im HCV RotorGene System keine RNA mehr nachweisbar. Durch das zusätzliche Vorhandensein zellulärer RNasen in den Infektionsversuchen, ist davon auszugehen, dass die Nachweisgrenze von 35 IU/ml HCV RNA im RotorGene System bereits vor Ablauf von 18 Tagen Inkubationszeit erreicht sein wird. Nach maximal 30 Tagen Inkubationszeit ist ein Nachweis von HCV Inokulum-RNA in den Infektionsversuchen sehr unwahrscheinlich.

73 Ergebnisse

3200

2800

2400

2000

1600

1200 HCV-RNA [IU/ml] 800

400

0 0 h 48 h 96 h 144 h 192 h 240 h 288 h 336 h 384 h 432 h 480 h 528 h 576 h 624 h 672 h 690 h berechnete IU/ml theoretische IU/ml ohne Abbau

Abbildung 33: Stabilität von HCV-RNA in DMEM (lineare Darstellung). Aufgetragen wurde die Menge an HCV-RNA gegen die Inkubationszeit. blau: therotische IU/ml HCV ohne RNA Abbau, dunkelgrau: berechnete IU/ml HCV RNA im Versuchsansatz.

10000

1000

100 HCV-RNA [IU/ml]HCV-RNA 10

1 0 h 48 h 96 h 144 h 192 h 240 h 288 h 336 h 384 h 432 h 480 h 528 h 576 h 624 h 672 h 690 h berechnete IU/ml theoretische IU/ml ohne Abbau

Abbildung 34: Stabilität von HCV-RNA in DMEM (logarithmische Darstellung): Aufgetragen wurde die Menge HCV-RNA gegen die Inkubationszeit. blau: therotische IU/ml HCV ohne RNA Abbau, dunkelgrau: berechnete IU/ml HCV RNA im Versuchsansatz.

3.3.3. HCV Infektion der RLI-Klone 4 und 5

Die FRhK-4-RLI-Klone 4 und 5 wurden trotz möglicherweise niedriger Expression des RNase L Inhibitors mit infektiösem, HCV-positivem Frischplasma infiziert. Es wurden Zellen der RLI-Klone 4 und 5 in 6-well-Platten ausgesät und nach 24 h mit 150 μl HCV-positivem Frischplasma (MOI = 1) infiziert. Nach 2 Stunden Inkubation wurden die Zellen gewaschen

74 Ergebnisse und mit frischem Medium versehen. Durch diesen Waschschritt wurde die in Kapitel 3.3.2 bestimmte maximale zeitliche Nachweisgrenze der HCV RNA von 30 Tagen nochmals verringert. Direkt nach dem Mediumwechsel (= 0 d), nach 2 d, 4 d, 6 d, 10 d und nach 14 d wurden die Zellen von je einem well des Infektionsversuchsansatzes geerntet. Aus Zellen und Zellüberstand wurde die RNA aufgereinigt. Die Eluate der aufgereinigten Zellen wurden nach der cDNA-Synthese in den entsprechenden real time PCRs auf die relativen Mengen an mRNA von RNase L und RLI bzw. HCV RNA untersucht. Die Normalisierung der relativen mRNA-Mengen von RNase L und RLI erfolgte auf die 18S rRNA und auf die nicht transfizierten Kontrollzellen. Klon 4 zeigte für die 4 d -, 6 d - und 14 d - Werte eine gesteigerte RLI-Transkription um Faktoren von 3 bis 7 (siehe Abbildung 35 A) im Vergleich zu den nicht transfizierten Kontrollen. Der 10 d - Wert zeigte keine erhöhte relative Menge an RLI-mRNA. Da alle Zeitpunkte Probennahmen einzelner unabhängiger wells waren, verdeutlich dieser Wert ein weiteres Mal die starken Schwankungen der RLI-Expression in den transfizierten Klonen. Für alle anderen Zeitpunkte entsprechen die relativen Einheiten an RLI-mRNA für Klon 4 nahezu den relativen Einheiten der in Abbildung 30 A dargestellten Kinetik. Die Expression des RNase L Inhibitors während der HCV Infektion war für Klon 5 zu keinem Zeitpunkt deutlich erhöht (siehe Abbildung 35 B). Lediglich der 14 d - Wert (336 h) zeigt eine leicht gesteigerte relative Menge an RLI-mRNA um den Faktor 2,8. Aufgrund der Schwankungen der relativen Mengen an RLI-mRNA zwischen den Experimenten wurde in Abbildung 35 lediglich ein Einzelexperiment dargestellt. Die Messung der mRNA-Mengen von RLI sowie der 18S rRNA wurde mit der real time PCR in Doppelbestimmung durchgeführt. Die Transkriptionsraten der RNase L lagen über den gesamten Zeitraum der Probennahmen für beide Klone innerhalb der Schwankungsgrenzen (siehe Abbildung 36). Die Eluate der RNA-Aufreinigung der Zellen und der Zellkulturüberstände wurden im HCV RG System auf HCV RNA getestet. Sowohl die nicht infizierten FRhK-4-Kontrollzellen als auch die FRhK4-RLI-Klon 4- und Klon 5 - Zellen waren nach 4 Tagen intrazellulär und extrazellulär HCV negativ. Da keine virale Replikation in den Zellen stattgefunden hat, kann über einen potentiellen Einfluss des HCV auf die Expression der RNase L keine Aussage getroffen werden.

75 Ergebnisse

8 8

7 7

6 6

5 5

4 4

3 3 in Relation zur 18S rRNA zur 18S rRNA in Relation in Relation zur 18S rRNA zur 18S rRNA in Relation 2 2 und unbehandelter Kontrolle und unbehandelter und unbehandelter Kontrolle und unbehandelter relative Einheiten RLI-mRNA relative Einheiten RLI-mRNA 1 1

0 0 0 h 48 h 96 h 144 h 240 h 336 h 0 h 48 h 96 h 144 h 240 h 336 h

A B Abbildung 35: RLI-Expression der FRhK-4-RLI-Klone bei HCV Infektion. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelten Linien kennzeichnen die Grenzwerte der nicht regulierten Genexpression. A: Klon 4, B: Klon 5

2.0 2.0

1.5 1.5

1.0 1.0

in Relation zur 18S rRNA zur 18S rRNA in Relation 0.5 0.5 in Relation zur 18S rRNA zur 18S rRNA in Relation und unbehandelter Kontrolle und unbehandelter und unbehandelter Kontrolle unbehandelter und relative Einheiten RNase L-mRNA RNase Einheiten relative

0.0 L-mRNA RNase Einheiten relative 0.0 0 h 48 h 96 h 144 h 240 h 336 h 0 h 48 h 96 h 144 h 240 h 336 h

A B Abbildung 36: RNase L-Expression der Klone bei HCV Infektion. Die relativen Einheiten RNase L-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RNase L-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. A: Klon 4, B: Klon 5

3.3.4. HCV Infektion transient RLI-transfizierter Zellen

Da es nicht möglich war, RLI-Klone von FRhK-4- und Huh7-Zellen zu etablieren, welche das RLI stabil überexprimieren, wurde der Verlauf einer HCV Infektion in transient transfizierten Zellen untersucht. 2 Tage nach Transfektion erfolgte die Infektion mit HCV-positivem und infektiösem Frischplasma (siehe Kapitel 2.2.2.10). Um eine Überexpression des RNase L

76 Ergebnisse

Inhibitors über einen Zeitraum von 4 Wochen zu garantieren, wurden die Zellen dreimal im Abstand von je einer Woche mit dem Plasmid pl.18_RLI transfiziert. Nach je einer Woche wurden alle Zellen eines wells in ein neues gegebenenfalls größeres well überführt und nach 24 h Inkubationszeit transfiziert. Während des Versuches wurden keine Zellen abgenommen, um die RLI-Transkriptionsrate zu bestimmen. Aus den Ergebnissen der vorangegangenen Versuche wurde davon ausgegangen, dass nach einer Woche noch eine erhöhte Menge an RLI-mRNA in den Zellen vorhanden war. Das Aufrechterhalten der erhöhten Transkription über einen längeren Inkubationszeitraum als eine Woche erfolgte durch die erneute Transfektion. Die Bestimmung der relativen Mengen an RLI-mRNA mit Hilfe der real time PCR wurde am Ende des Versuches durchgeführt. Der mehrfache Austausch des Zellkulturüberstandes durch Transfektionsansatz, 1xPBS und frisches Medium führte bereits nach einer Woche dazu, dass keine HCV RNA im Überstand mehr nachgewiesen werden könnte. Nach insgesamt 4 Wochen wurden alle Zellen geernten. Die zelluläre RNA wurde mit dem RNeasy® Mini Kit aufgereinigt und die Eluate in den entsprechenden real time PCRs auf die relativen Mengen an mRNA von RNase L und RLI bzw. HCV RNA untersucht. Auf Genexpressionsebene wurden sowohl die Transkriptionsraten des RLI (siehe Abbildung 37) als auch der RNase L analysiert (siehe Abbildung 38). Die FRhK-4- und die Huh7-Zellen zeigten 4 Wochen nach Versuchsbeginn noch eine deutliche Überexpression des RNase L Inhibitors. Sowohl auf das Referenzgen 18S rRNA als auch auf GAPDH bezogen, wiesen die Huh7-Zellen erhöhte Mengen an RLI-mRNA um Faktoren von 32 bis 40 auf (siehe Abbildung 37 A). Für die FRhK-4-Zellen konnten mit Hilfe der real time PCR gesteigerte relative mRNA-Einheiten des RNase L Inhibitors um Fakoren von 17 bis 30 detektiert werden (siehe Abbildung 37 B). Weder in den FRhK-4- noch in den Huh7-Zellen wurde eine gesteigerte Transkription der RNase L detektiert (siehe Abbildung 38). Für beide Zelllinien lagen die relativen Einheiten der RNase L-mRNA innerhalb der Schwankungsgrenzen von 0,5 bis 2. Intrazellulär und extrazellulär konnte 4 Wochen nach Infektion keine HCV RNA mehr nachgewiesen werden. Die Überexpression des RLI hatte auch in diesem Fall keinen positiven Einfluss auf die HCV Replikation.

77 Ergebnisse

45 45

40 40 35 35 30 30 25 25 20 20 15 15 10 10 in Relation zum Referenzgen Referenzgen Relation zum in in Relation zum Referenzgen Referenzgen Relation zum in und zur unbehandelten Kontrolle zur unbehandelten und 5 Kontrolle zur unbehandelten und relative Einheiten RLI-mRNArelative 5 relative Einheiten RLI-mRNA 0 0 Referenzgen 18S RNA Referenzgen GAPDH Referenzgen 18S rRNA Referenzgen GAPDH

A B Abbildung 37: Transkriptionsrate des RLI 3 Wochen nach HCV Infektion mit dreimaliger RLI-Transfektion. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA bzw. der mRNA von GAPDH und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI- mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression. A: Huh7, B: FRhK-4

3.0 3.0

2.5 2.5

2.0 2.0

1.5 1.5

1.0 1.0 in Relation zum Referenzgen zum Referenzgen in Relation und zur unbehandelter Kontrolle und zur unbehandelter in Relation zum Referenzgen Referenzgen Relation zum in und zur unbehandelter Kontrolle zur unbehandelter und 0.5 0.5 relative Einheiten L-mRNA RNase relative Einheiten RNase L-mRNA RNase Einheiten relative 0.0 0.0 Referenzgen 18S RNA Referenzgen GAPDH Referenzgen 18S RNA Referenzgen GAPDH

A B Abbildung 38: Transkriptionsrate der RNase L 3 Wochen nach HCV Infektion mit dreimaliger RLI-Transfektion. Die relativen Einheiten RNase L-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA bzw. der mRNA von GAPDH und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RNase L-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelten Linien kennzeichnen die Grenzwerte der nicht regulierten Genexpression. A: Huh7, B: FRhK-4

3.3.5. Zusammenfassung HCV Infektion

Die Charakterisierung des HCV-positiven und infektiösen Frischlasmas vom Blutspendedienst Hagen erfolgte im HCV RotorGene System. Mit einer Viruskonzentration

78 Ergebnisse von 2,76x106 IU/ml ist das Plasma als sehr hoch positiv einzuschätzen. Nach Sequenzierung des Amplifikates konnte das Virus im Plasma dem HCV Subtypen 3a zugeordnet werden. Im Stabilitätstest der HCV RNA konnte gezeigt werden, dass ohne den Einfluss zellulärer Enzyme HCV RNA bis zu 30 Tagen bei 37°C nachweisbar ist. Dieser Versuch diente dazu, den Inkubationszeitraum zu bestimmen, in dem HCV Inokulum mit Hilfe des HCV RotorGene Systems noch nachgewiesen werden kann. In den HCV Infektionsversuchen sollte die maximale Nachweisgrenze von 30 Tagen durch das Waschen der Zellen und das Vorhandensein zellulärer RNasen deutlich unterschritten werden. Reproduzierbar positive Nachweisbarkeit von HCV Inokulum wird in den Infektionsversuchen nur unter 18 Tagen erwartet. Nach HCV Infektion der FRhK-4-Klon 4 und 5 Zellen konnte keine Replikation der Viren festgestellt werden. 4 Tage nach Infektion waren intrazellulär und extrazellulär alle Proben HCV negativ. Klon 4 wies innerhalb des Infektionsversuches erhöhte relative Mengen an RLI-mRNA um Faktoren von 2 bis 6 auf. In Klon 5 konnte keine gesteigerte RLI-Expression nachgewiesen werden. Obwohl für die RNase L in der Literatur keine Regulation auf Genexpressionsebene beschrieben wurde, wurde diese im Rahmen der Manipulation des 2’-5’Oligoadenylatsynthetasesystem ebenfalls analysiert. Die relativen Mengen an mRNA der RNase L zeigten in HCV infizierten FRhK-4-Klon 4 und 5 Zellen keinen Unterschied zu nicht infizierten Zellen. Da keine virale Replikation in den Zellen stattgefunden hat, kann keine Aussage über einen potentieller Einfluss des HCV auf die Expression der RNase L getroffen werden. Die Analyse der relativen Mengen an mRNA des RNase L Inhibitors in transient RLI- transfizierte Huh7- und FRhK-4-Zellen zeigte erhöhte Transkriptionen um Faktoren bis zu 40. Durch dreimalige Transfektion mit den entsprechenenden pl.18_RLI Plasmiden wurde die Überexpression über einen Inkubationszeitraum von 4 Wochen aufrecht erhalten. Nach Ablauf der 4 Wochen konnte weder in den Huh7- noch in den FRhK-4-Zellen intrazellulär oder extrazellulär HCV RNA nachgewiesen werden. Die Expression der RNase L wurde auch in transient RLI-transfizierte Huh7- und FRhK-4-Zellen nicht durch die HCV Infektion beeinflusst.

3.4. Transfektion in vitro transkribierter HCV full-length RNA

Um zu gewährleisten, dass die Aufnahme der HCV RNA in das Zytoplasma der Zellen erfolgt, wurde der Schritt des Viruseintritts experimentell umgangen und HCV full length

79 Ergebnisse

RNA transfiziert. Dazu wurde zunächst das Plasmid p90/HCV FL-long pU angezogen, welches die full length RNA vom HCV Subtyp 1a enthält. Nach Linearisierung des Plasmids erfolgte die in vitro Transkription der HCV full length RNA. Um einen Einfluss der Transfektion von in vitro Transkript (IVT) auf die Transkription der RNase L und des zellulären RLIs auszuschließen, sollte ein möglichst langes nicht virales IVT im Vergleich zum HCV IVT in FRhK-4- und Huh7-Zellen transfiziert werden. Daher wurde der 2 kb lange Elongationsfaktor von Xenopus (Krallenfrosch) aus dem Plasmid pTRI, welches als Kontrollplasmid im MEGAscript® High Yield Transcription Kit enthalten ist, ebenfalls in vitro transkribiert. Der potentielle Einfluss der Transfektion von HCV IVT auf die Transkription der RNase L und des zellulären RLI wurden analysiert. Die Auswertung der HCV RNA erfolgte neben den zellulären Standardbedingungen auch unter den Bedingungen erhöhter RLI-Expression durch Transfektion von pl.18-RLI.

3.4.1. In vitro Transkription von full length HCV RNA

Nach der Transformation von Plasmid p90/HCV FL-long pU, wurden E.coli Klone herangezogen. Mit Hilfe des QIAGEN® Plasmid Mini Kit wurde das Plasmid aufgereinigt und für die full length Transkription mit dem Restriktionsenzym Bsm I linearisiert. Dieses Enzym schnitt zweimal in p90/HCV FL-long pU, wodurch Fragmente von 1427 bp und 11553 bp enstanden. Der komplette Linearisationsansatz wurde im Agarosegel aufgetrennt und die das HCV Insert enthaltene Bande von 11553 bp aufgereinigt. Die Kontrolle dieser Aufreinigung im 1%igen Agarosegel zeigte eine saubere Bande bei 11553 bp ohne weitere Nebenbanden. Die in vitro Transkription wurde nach Protokoll des MEGAscript® High Yield Transcription Kit für 4 h bei 37°C durchgeführt. Die Kontrolle des IVT im 1%igen Agarosegel zeigte deutlich die DNA-Bande des linearisierten Plasmides. Nach DNase-Verdau und RNA- Aufreinigung war die DNA vollständig abgebaut und ein sauberes IVT im Eluat enthalten. Zur Konzentrationsbestimmung wurde die 10-6 Verdünnung der in vitro transkribierte RNA in das HCV RotorGene Assay eingesetzt (siehe Abbildung 39). Es wurden jeweils Doppelbestimmungen der IVT-Ansätze durchgeführt. Mit Hilfe der mitgeführten Standardreihe wurden die Konzentrationen der HCV IVTs berechnet. Für alle Ansätze der in vitro transkribierten RNA ergab sich eine Konzentration von 104 IU/μl. Nach der in Kapitel 2.2.2.12 angegebenen Formel für die Umrechnung von IU/μl in g/μl ergaben sich für die einzelnen in vitro Transkripte Mengen zwischen 115 ng/μl und 175 ng/μl.

80 Ergebnisse

Abbildung 39: RotorGene Lauf der in vitro transkribierten HCV-RNA. rot: Standardreihe; schwarz: HCV IVTs in Doppelansätzen; grün: Wasserkontrolle

3.4.2. Transfektion in vitro transkribierter RNA in Huh7- und FRhK-4-Zellen

Obwohl bekannt ist, dass Antikörper gegen CD81 die HCV Infektion in Huh7-Zellen hemmen (Zhong et al., 2005), d.h. die Huh7-Zellen den CD81-Rezeptor exprimieren, wurde der Viruseintritt umgangen und die HCV RNA transfiziert. In der Literatur gibt es jedoch keine Angaben über das Vorhandensein des CD81-Rezeptors in FRhK-4-Zellen. Es besteht sowohl für die FRhK-4- als auch für die Huh7-Zellen die Möglichkeit, dass in den Infektionsversuchen das Hepatitis C Virus nicht in die Zellen gelangt ist. Daher wurde die Rezeptor-abhängige Virusaufnahme umgangen und die HCV RNA in die Zellen transfiziert. Mit Hilfe der Transfektion wurde sichergestellt, dass die HCV RNA in das Zytoplasma der Zellen gelangt. Durch einen Vergleichsversuch (Transfektion von HCV IVT bzw. IVT des Elongationsfaktors II von Xenopus = pTRI IVT) wurde ein potentieller Einfluss der Transfektion von IVT auf die Transkription der RNase L und des zellulären RLI überprüft. Nach vierstündiger Inkubation der Transfektionsansätze mit den Zellen wurden diese gewaschen und mit frischem Medium versehen. Direkt nach dem Mediumwechsel (= 0 h), nach 3 h, 6 h, 9 h, 12 h und nach 24 h wurden die Zellen von je einem well geerntet. Intrazelluläre und extrazelluläre RNA wurden aufgereinigt und die Eluate in den entsprechenden real time PCRs auf die Menge an mRNA von RNase L, RLI sowie der

81 Ergebnisse

18S rRNA bzw. auf die Menge an HCV RNA untersucht. Die relativen mRNA-Mengen der RNase L der Huh7-Zellen lagen sowohl bei der Transfektion mit HCV IVT als auch mit pTRI IVT über den gesamten Inkubationszeitraum von 24 h innerhalb der Schwankungsgrenzen der nicht regulierten Genexpression von 0,5 bis 2 (siehe Abbildung 40 A). Auch in den FRhK-4- Zellen konnte keine signifikante Erhöhung der RNase L-Expression festgestellt werden. Lediglich der 24 h - Wert zeigte eine leicht erhöhte Transkription der RNase L um den Faktor 2,5 (siehe Abbildung 40 B). In den folgenden Abbildungen werden jeweils Einzelexperimente dargestellt. Die Analyse der verschiedenen mRNAs sowie der HCV RNA erfolgten in Einzelbestimmungen.

3 3

2.5 2.5

2 2

1.5 1.5

1 1 in Relation zur 18S rRNA in Relation zur 18S rRNA und unbehandelter Kontrolle und unbehandelter Kontrolle 0.5 0.5 relative Einheiten RNase L-mRNA

relative Einheiten RNase L-mRNA 0 0 0 h 3 h 6 h 9 h 12 h 24 h 0 h 3 h 6 h 9 h 12 h 24 h HCV IVT pTRI IVT HCV IVT pTRI IVT

A B Abbildung 40: RNase L-Expression in IVT-transfizierten Zellen. Die relativen Einheiten RNase L-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RNase L-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelten Linien kennzeichnen die Grenzwerte der nicht regulierten Genexpression. A: Huh7, B: FRhK-4

Die Konzentration der HCV RNA nahm sowohl intrazellulär als auch extrazellulär über die Inkubationszeit kontinuierlich ab. Die Transfektion erfolgte mit 250 ng HCV IVT, was nach der in Kapitel 2.2.2.12 angegebenen Formel 4,5*104 Kopien bzw. 1,5*104 IU entspricht. Für die Huh7-Zellen waren nach 24 Stunden extrazellulär noch 43 IU/μl Probe nachweisbar. In einem Milliliter Zellkulturüberstand enspricht diese Konzentration 4,3*104 Internationalen Einheiten HCV RNA. Diese Menge an HCV RNA ist größer als die rechnerisch eingesetzte Menge von 1,5*104 IU. Da die Abnahme der HCV RNA im Verlauf der Probennahme gegen eine Zunahme der HCV RNA innerhalb von 24 Stunden spricht, ist diese RNA-Menge sehr wahrscheinlich durch Pipettierungenauigkeiten bei der IVT Transfektion zu erklären. Bereits

82 Ergebnisse

1 μl Pipettierungenauigkeit bewirken einen Unterschied von 7,5*103 IU HCV RNA. Es ist daher davon auszugehen, dass im Inokulum mehr als 1,5*104 IU HCV RNA eingesetzt wurden. Anhand der in Abbildung 41 A dargestellten extrazellulären RNA-Konzentration des 0 h - Wertes, betrug die tatsächliche Inokulummenge mindestens 5*105 IU. Intrazellulär war nach 24 Stunden noch HCV RNA von 180 IU/μl pro relative 18S rRNA-Einheiten zu detektieren (siehe Abbildung 41 A). Das entsprach in 50 μl gesamt-Zelleluat einer HCV- Menge von 9*103 IU bzw. 2,7*104 Kopien. In den RNA-Eluaten der FRhK-4- Zellkulturüberstände wurden nach 24 h noch 60 IU/μl nachgewiesen, d.h. im Zellkulturüberstand von einem Milliliter wurden noch 6*104 IU HCV RNA detektiert. Intrazellulär lag die RNA-Konzentration bei 17 (IU/μl)/relative 18S rRNA-Einheiten. In 50 μl gesamt-Zelleluat ensprach das einer HCV-Menge von 850 IU oder 2,55*103 Kopien. Die intrazellulären 0 h - Werte der Analyse der HCV RNA von 5,6*104 (Huh7-Zellen) bzw. 1,4*104 (Frhk4-Zellen) weisen auf eine gelungene Transfektion der RNA in das Zytoplasma der Zellen hin. Eine Replikation der RNA konnte jedoch nicht beobachtet werden.

1400 1400 1200 1200

1000 1000 800 800 600 600 400 400

200 200 relative Einheiten HCV-RNA Einheiten relative relative Einheiten HCV-RNA 0 0 0 h 3 h 6 h 9 h 12 h 24 h 0 h 3 h 6 h 9 h 12 h 24 h extrazellulär [IU/μl] extrazellulär [IU/μl] intrazellulär [(IU/μl)/18S rRNA] intrazellulär [(IU/μl)/18S rRNA]

A B Abbildung 41: HCV RNA-Titer in IVT-transfizierten Zellen. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten HCV-RNA gegen die Zeit. A: Huh7, B: FRhK-4

Die Transkription des zellulären RLI wurde unter den Bedingungen der IVT-Transfektion (siehe Abbildung 42) ebenfalls analysiert. Weder bei den Huh7- noch bei den FRhK-4-Zellen konnte eine RLI-Expression ausserhalb der Schwankungsbereiche festgestellt werden. Weder die Transfektion von HCV full length RNA noch die Transfektion der RNA des Xenopus Elongationsfaktors hatte einen Einfluss auf die Transkription des zellulären RLI.

83 Ergebnisse

1.4 1.4

1.2 1.2

1 1

0.8 0.8

0.6 0.6

0.4 0.4 in Relation zur 18S rRNA in Relation zur 18S rRNA zur 18S in Relation und unbehandelter Kontrolle und unbehandelter Kontrolle und unbehandelter 0.2 0.2 relative Einheiten RLI-mRNA Einheiten relative relative Einheiten RLI-mRNA 0 0 0 h 3 h 6 h 9 h 12 h 24 h 0 h 3 h 6 h 9 h 12 h 24 h HCV IVT pTRI IVT HCV IVT pTRI IVT

A B Abbildung 42: RLI-Expression in IVT-transfizierten Zellen. Die relativen Einheiten RLI- mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnen die Grenzwerte der nicht regulierten Genexpression. A: Huh7, B: FRhK-4

3.4.3. Transfektion in vitro transkribierter HCV full length RNA in transient RLI-transfizierten Zellen

Um den Einfluss des überexprimierten RLI auf die Replikation von in vitro transkribierter HCV full length RNA zu untersuchen, wurden FRhK-4- und Huh7-Zellen in 24-well-Platten ausgesät und nach 24 Stunden Inkubationszeit mit den entsprechenden pl.18-RLI Plasmiden bzw. dem pl.18-Leervektor transfiziert. 2 Tage nach RLI-Transfektion erfolgte die Transfektion mit in vitro transkribierter HCV full length RNA bzw. dem pTRI IVT. Nach vierstündiger Inkubation der IVT-Transfektionsansätze wurden die Zellen gewaschen und mit frischem Medium versehen. Direkt nach dem Mediumwechsel (= 0 h), nach 3 h, 6 h, 9 h, 12 h, 24 h, 36 h, 2 d, 3 d und nach 4 d wurde je ein well der Zellen geerntet und die intrazelluläre und extrazelluläre RNA aufgereinigt. Die intrazellulären RNA Eluate wurden hinsichtlich HCV RNA und relativer mRNA-Mengen an RNase L bzw. RLI analysiert. In den extrazellulären RNA Eluaten wurde lediglich die Menge an HCV RNA bestimmt. Der gesamte Zellansatz eines weiteren wells wurde nach 4 Tagen in eine 6-well-Platte umgesetzt und nach 24 h Inkubationszeit erneut mit den entsprechenden pl.18 Plasmiden transfiziert. Nach einer weiteren Woche (11 Tage nach HCV-Transfektion) wurde der Zellansatz dieses wells gesplittet. Ein Teil der Zellen wurde im Brutschrank weiter inkubiert und nach 24 h Inkubationszeit erneut mit den entsprechenden pl.18 Plasmiden transfiziert. Die RNA der

84 Ergebnisse zweiten Splithälfte wurde aufgereinigt und hinsichtlich HCV RNA und relativer mRNA- Mengen an RNase L bzw. RLI analysiert. Ein weiterer Split mit anschließender Transfektion oder RNA-Aufreinigung erfolgte nach insgesamt 3 Wochen (26 d / 624 h). 33 Tage nach Versuchsbeginn wurden die Zellen erneut geteilt, jedoch nicht mehr transfiziert. Die relativen Einheiten an RLI-mRNA der Huh7-Zellen sanken innerhalb von 4 Tagen nach HCV-Transfektion von einem erhöhten Faktor von 180 auf einem Faktor von 16 (siehe Abbildung 43). Nach 11 Tagen war die Transkriptionsrate des RNase L Inhibitors noch um einen Faktor von 18 erhöht, nach 26 Tagen um einen Faktor von 8. 33 Tage nach Versuchsbeginn konnte in den Huh7-Zellen keine Überexpression des RLI mehr nachgewiesen werden.

200

180

160

140

120

100

80 in Relation zur 18S rRNA zur 18S rRNA in Relation und unbehandelter Kontrolle und unbehandelter 60 relative Einheiten RLI-mRNA 40

20

0 0 h 3 h 6 h 9 h 12 h 24 h 36 h 48 h 72 h 96 h 264 h 624 h 792 h

pl.18_RLI+HCV pl.18+HCV

Abbildung 43: RLI-Expression in IVT- und RLI-transfizierten Huh7-Zellen. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Es wurde entweder das pl.18- h_RLI oder der pl.18 Leervektor transfiziert.

Die Expressionsrate des RNase L Inhibitors der FRhK-4-Zellen nahm von einer maximalen Erhöhung um den Faktor von 180 stetig bis auf einen Faktor von 34 nach 4 Tagen ab (siehe Abbildung 44). Dabei zeigten die RLI Transkriptionsraten keinen so schönen kinetischen Verlauf wie die Daten der relativen Einheiten an RLI-mRNA der Huh7-Zellen. Die maximale Überexpession des RLI der FRhK-4-Zellen wurde erst 6 h nach IVT-Transfektion erreicht. Nach einer Woche erfolgte eine zweite RLI-Transfektion, wodurch die relative Menge an RLI-mRNA nach insgesamt 11 Tagen sogar noch um einen Faktor von 120 erhöht war. 26

85 Ergebnisse

Tage nach Versuchsbeginn und nach der dritten Transfektion zeigte der RNase L Inhibitor noch eine leicht erhöhte Expression um einen Faktor von 5. 33 Tage nach Versuchsbeginn konnte in den FRhK-4-Zellen keine Überexpression des RLI mehr nachgewiesen werden.

200

180

160

140

120

100

80 in Relation zur 18S rRNA 18S rRNA in Relation zur

und unbehandelter Kontrolle unbehandelter und 60

relative Einheiten RLI-mRNA 40

20

0 0 h 3 h 6 h 9 h 12 h 24 h 36 h 48 h 72 h 96 h 264 h 624 h 792 h

pl.18_RLI+HCV pl.18+HCV Abbildung 44: RLI-Expression in IVT- und RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen. Die relativen Einheiten RLI-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RLI-mRNA gegen die Inkubationszeit. Es wurde entweder das pl.18- m_RLI oder der pl.18 Leervektor transfiziert.

Der HCV RNA Titer nahm sowohl in den FRhK-4- als auch in den Huh7-Zellen extrazellulär und intrazellulär über die Inkubationszeit kontinuierlich ab. Unterschiedliche Ausgangsmengen an HCV RNA im Überstand zwischen RLI-transfiziertem Ansatz und dem Vergleichsansatz mit dem pl.18-Leervektor sind auf verschieden gute Wascheffekte nach der Transfektion zurückzuführen (siehe Abbildung 45 A2 und B2). Der mehrfache Austausch des Zellkulturüberstandes durch Transfektionsansatz, 1xPBS und frisches Medium führten nach dem Umsetzen der Zellen in die 6-well-Platte zur vollständigen Entfernung der HCV RNA im Zellkulturüberstand. Intrazellulär nahm die HCV RNA Menge der RLI-transfizierten Huh7-Zellen von 0,55 (IU/μl)/relative Einheit 18S rRNA bis auf 0,06 (IU/μl)/relative Einheit 18S rRNA nach 11 Tagen ab (siehe Abbildung 45 A1). Für das gesamt-Zelleluat von 50 μl entsprachen diese Werte 22 IU (3 h nach Infektion) und 3 IU (11 Tage / 254 h nach Infektion). Direkt nach Abnahme des Inokulums wurden intrazellulär 2,76 (IU/μl)/relative Einheit 18S rRNA, d.h. 135 IU in 50 μl gesamt-Zelleluat detektiert (Datenpunkt in Abbildung 45 A1 nicht

86 Ergebnisse abgebildet). Da für die Transfektion 1,5*104 IU (250 ng) HCV RNA eingesetzt wurden, weist der 0 h - Wert von 135 IU in der Zelle auf eine nur sehr geringe Aufnahme der RNA hin. Auch in den Kontrollzellen mit dem pl.18-Leervektor konnte für den 0 h - Wert nur eine sehr geringe intrazelluläre HCV RNA Menge von 185 IU in 50 μl gesamt-Zelleluat detektiert werden (Datenpunkt in Abbildung 45 A1 nicht abgebildet). Warum in diesem Transfektionsversuch nur sehr wenig HCV RNA in die Huh7-Zellen aufgenommen wurde ist unklar. 3 h nach HCV Transfektion wurden noch 0,6 (IU/μl)/relative Einheit 18S rRNA nachgewiesen, was in 50 μl gesamt-Zelleluat einer Menge von 30 IU entsprach. Die RNA- Konzentration nahm wie bei der Transfektion mit dem humanen RLI-Plasmid innerhalb von 11 Tagen auf 0,07 (IU/μl)/relative Einheit 18S rRNA ab. Die HCV RNA Menge der RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen nahm von 0,16 (IU/μl)/relative Einheit 18S rRNA auf 0,02 (IU/μl)/relative Einheit 18S rRNA ab (siehe Abbildung 45 B1). Diese Konzentrationen entsprachen schon ab dem 3 h - Wert in 50 μl gesamt-Zelleluat weniger als 0,4 IU und damit weniger als einer HCV Kopie. Im Kontrollansatz mit dem pl.18- Leervektor konnten 3 Stunden nach HCV Transfektion 0,4 (IU/μl)/relative Einheit 18S rRNA nachgewiesen werden, was 18 IU in 50 μl gesamt-Zelleluat entsprach. Für den 0 h - Wert wurden im gesamt-Zelleluat der Kontrollzellen 2200 IU HCV RNA detektiert, während in den transfizierten Zellen mit dem Affen RLI-Plasmid 1770 IU HCV RNA detektiert wurden (Datenpunkte in Abbildung 45 B1 nicht abgebildet). Die für die Transfektion eingesetzte HCV RNA von 1,5*104 IU (250 ng) wurde von den FRhK-4-Zellen besser aufgenommen als von den Huh7-Zellen. Ob die starke Abnahme der HCV RNA innerhalb der ersten drei Inkubationsstunden auf den Abbau der HCV RNA oder auf absterbende, transfizierte Zellen zurückzuführen ist, ist unklar. Es wurden mikroskopisch einige tote Zellen beobachtet, jedoch nicht in unerwartet hoher Zahl. 11 Tage nach HCV Transfektion konnten sowohl in den RLI- transfizierten FRhK-4-Zellen als auch in den Kontrollzellen nur noch weniger als 0,5 IU HCV RNA in 50 μl gesamt-Zellelulat detekiert werden. In den Proben der Tage 26 und 33 konnte weder in den Huh7- noch in den FRhK-4-Zellansätzen noch HCV RNA nachgewiesen werden. Der intrazelluläre 0 h - Wert der HCV RNA lag für alle Ansätze 1,5 Logstufen über dem 3 h - Wert. Zur besseren grafischen Darstellung der niedriger konzentrierten HCV-Zellproben ab dem 3 h – Wert, wurden die 0 h - Werte nicht in die Abbildungen einbezogen.

87 Ergebnisse

0.7 0.4

0.6 ] 0.3 0.5 l)/18S rRNA] l)/18S μ

0.4 rRNA l)/18S μ 0.2 0.3

0.2 0.1

0.1 [(IU/ RNA HCV HCV RNA Titer [(IU/RNA Titer HCV 0.0 0 3 h 6 h 9 h 3 h 6 h 9 h 12 h 12 h 24 h 36 h 48 h 72 h 96 12 h 12 h 24 h 36 h 48 h 72 h 96 264 h 264 h pl.18_RLI+HCV pl.18+HCV pl.18_RLI+HCV pl.18+HCV A1 B1

70 400 350 l] 60 l] μ μ 300 50 250 40 200 30 150 20 100 HCV RNA Titer [IU/ HCV RNA Titer

HCV RNA TiterHCV RNA [ IU/ 10 50 0 0 3 h 6 h 9 h 3 h 6 h 9 h 12 h 24 h 36 h 48 h 72 h 96 h 12 h 24 h 36 h 48 h 72 h 96 h pl.18_RLI+HCV pl.18+HCV pl.18_RLI+HCV pl.18+HCV A2 B2 Abbildung 45: HCV Titer in IVT- und RLI-transfizierten Zellen. Aufgetragen wurden die relativen RNA Einheiten gegen die Zeit. A: Huh7, B: FRhK-4, A1/B1: intrazellulärer HCV Titer, A2/B2: HCV Titer im Überstand

Die relativen Einheiten an RNase L-mRNA lagen sowohl für die FRhK-4- als auch für die Huh7-Zellen über den gesamten Zeitraum der Probennahmen innerhalb der definierten Grenzen der Genexpression (siehe Abbildung 46 und Abbildung 47). Die mit dem pl.18- Leervektor transfizierten Huh7-Zellen zeigten nach 3 und 4 Tagen eine leicht verringerte RNase-L Transkription mit Faktoren von 0,4 und 0,3. Die mit dem Leervektor transfizierten FRhK-4-Kontrollzellen zeigten ein ähnliches Ergebnis 3 Stunden nach HCV-Transfektion mit relativen Einheiten an RNase L-mRNA von 0,35. Die Verringerung der RNase L-mRNA- Mengen hatte weder in den FRhK-4- noch in den Huh7-Zellen eine Auswirkung auf die kontinuierliche Abnahme der HCV-Konzentration (siehe Abbildung 45). Insgesamt zeigten

88 Ergebnisse weder die RLI-transfizierten Zellen noch die Kontrollzellen mit dem Leervektor eine signifikante Erhöhung oder Verringerung der RNase L-Transkription.

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6 in Relation zur 18S Relation rRNA in zur und unbehandelter Kontrolle unbehandelter und 0.4

relative Einheiten RNase L-mRNA 0.2

0.0 0 h 3 h 6 h 9 h 12 h 24 h 36 h 48 h 72 h 96 h 264 h 624 h 792 h

pl.18_RLI+HCV pl.18+HCV Abbildung 46: RNase L-Expression in IVT- und RLI-transfizierten Huh7-Zellen. Die relativen Einheiten RNase L-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RNase L-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelte Linie kennzeichnet den Grenzwert der nicht regulierten Genexpression.

2.50

2.00

1.50

1.00 in Relation zur 18S rRNA Relation zur in und unbehandelter Kontrolle unbehandelter und 0.50 relative Einheiten RNase L-mRNA

0.00 0 h 3 h 6 h 9 h 12 h 24 h 36 h 48 h 72 h 96 h 264 h 624 h 792 h pl.18_RLI+HCV pl.18+HCV Abbildung 47: RNase L-Expression in IVT- und RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen. Die relativen Einheiten RNase L-mRNA beinhalten eine Normalisierung auf die relativen Einheiten der 18S rRNA und den Faktor zur unbehandelten, normalisierten Kontrolle. Aufgetragen wurden die relativen Einheiten RNase L-mRNA gegen die Inkubationszeit. Die rot gestrichelten Linien kennzeichnen die Grenzwerte der nicht regulierten Genexpression.

89 Ergebnisse

3.4.4. Zusammenfassung Transfektion in vitro transkribierter HCV full length RNA

Es wurde HCV full length RNA sowie die RNA des Elongationsfaktors von Xenopus in vitro transkribiert und in FRhK-4- bzw. Huh7-Zellen transfiziert. Die Transfektion von IVT hatte keinen Einfluss auf die endogene Expression der RNase L oder des zellulären RNase L Inhibitors. 24 h nach Transfektion konnte in beiden Zelllinien sowohl extrazellulär als auch intrazellulär nur noch sehr geringe Konzentrationen an HCV RNA nachgewiesen werden. Die Transfektion von in vitro transkribierter HCV full length RNA hatte auch in RLI- transfizierten Zellen keinen Einfluss auf die Expressionsrate der RNase L. Die Überexpression des RNase L Inhibitors sank von Faktoren von 140 innerhalb einer Woche auf Faktoren von 10. Durch dreimalige Transfektion wurde die erhöhte Expression des RLI über einen Inkubationszeitraum von 4 Wochen erhalten. Trotz erhöhter RLI-Expression konnte in den Zellkulturüberständen von FRhK-4- und Huh7-Zellen 96 h nach Transfektion keine HCV RNA mehr nachgewiesen werden. Intrazellulär war 11 Tage nach Transfektion keine HCV RNA mehr im HCV RotorGene System zu detektieren. Damit scheint die Überexpression des RNase L Inhibitors keinen Einfluss auf die Replikation der transfizierten full length HCV RNA zu haben.

90 Diskussion

4. Diskussion

4.1. Real time PCRs

4.1.1. Real time PCR zum quantitativen Nachweis der mRNA von RNase L, RLI und GAPDH sowie der 18S rRNA

In der vorliegenden Arbeit sollten die Expressionsraten des RLI sowie der RNase L unter den experimentellen Bedingungen einer HCV Infektion analysiert werden. Es sollte sowohl der Einfluss der HCV RNA auf die Expression des zellulären RLI als auch der Einfluss des überexprimierten RLI auf die potentielle Replikation von HCV RNA untersucht werden. Obwohl bisher keine Regulation der RNase L in der Literatur beschrieben wurde, sollte diese ebenfalls analysiert werden. In Infektionsversuchen mit HAV in einer parallel laufenden Arbeit zeigte die Datenlage zwischenzeitlich eine mögliche Steigerung der Expression der RNase L. Aus diesem Grund sollte auch die Expression der RNase L unter den Bedingungen einer HCV Infektion im Rahmen der vorliegenden Arbeit analysiert werden. Um die Transkriptionsraten von RNase L und RLI detektieren und auswerten zu können, mussten die entsprechenden real time PCRs erstellt werden. Zur Messung der relativen Genexpression mit Hilfe der real time PCR wurde zunächst eine geeignete endogene Kontrolle ausgewählt. Die endogene Kontrolle wird, wie das zu untersuchende Gen, von der Proben-cDNA amplifiziert. Sie wird genutzt, um die Menge der in der Reaktion eingesetzten RNA zu standardisieren (Eurogentec, 2004). Häufig werden Housekeeping-Gene wie GAPDH oder 18S rRNA als endogene Kontrollen verwendet. Idealerweise sollte das Kontrollgen stabil exprimiert und nicht durch die experimentellen Bedingungen beeinflusst werden. In verschiedenen Versuchen mit Hepatitis C Viren oder viraler RNA wurde GAPDH als endogene Kontrolle verwendet (Kapadia et al., 2003; Uprichard et al., 2006), so dass in dieser Arbeit real time PCRs sowohl für GAPDH als auch für 18S rRNA erstellt wurden. Verschiedene Untersuchungen mit Tumorzelllinien oder Zellkulturen zeigten widersprüchliche Ergebnisse mit GAPDH, während 18S rRNA sehr gute Ergebnisse lieferte (Aerts et al., 2004). Für GAPDH wurden RNA-bindende Eigenschaften festgestellt. Es bindet an untranslatierte RNA-Sequenzen verschiedener Viren wie beispielsweise Influenza, HAV oder HBV (Yi et al., 2000). Die von Yi et al. nachgewiesene Interaktion von GAPDH mit viraler RNA wurde sowohl mit den in dieser Arbeit verwendeten FRhK-4- als auch den

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Huh7-Zellen gezeigt (Yi et al., 2000). Für das Hepatitis C Virus konnten bisher, auch aufgrund fehlender Zellkultursysteme, keine Wechselwirkungen mit GAPDH belegt werden. Um einen möglichen Einfluss von Hepatitis C Virus RNA oder HCV IVT auf GAPDH auszuschließen, wurde für alle Versuche 18S rRNA als endogene Kontrolle zur Auswertung der Genepression herangezogen. Lediglich in Kapitel 3.3.4 „HCV Infektion transient RLI- transfizierter Zellen“ wurden die Expressionsraten von RNase L und RLI sowohl auf GAPDH als auch auf 18S rRNA normalisiert. Weder die relativen Einheiten der RNase L-mRNA noch die relativen Einheiten der RLI-mRNA zeigten durch die Normalisierungen auf GAPDH bzw. 18S rRNA signifikante Unterschiede. Bezogen auf beide Referenzgene zeigten sowohl die FRhK-4- als auch die Huh7-Zellen nach RLI Transfektion eine deutlich erhöhte RLI- Expression um Faktoren oberhalb von 20 (siehe Abbildung 37). Für beide Zelllinien waren die detektieren relativen Mengen an RNase L-mRNA weder durch die Normalisierung auf GAPDH noch auf 18S rRNA außerhalb der Grenzen der nicht regulierten Genexpression von 0,5 und 2 (siehe Abbildung 38). Da jedoch zum Zeitpunkt der Auswertung keine HCV RNA nachgewiesen werden konnte, kann über einen möglichen Einfluss viraler HCV RNA auf GAPDH keine Aussage getroffen werden.

Um reproduzierbare Ergebnisse in der Auswertung der Genepressionsdaten zu generieren, sollten die Effizienzen der real time PCRs bei nahezu 100 % liegen. Die Effizienz wird neben dem GC-Gehalt der Amplifikate oder der Sekundärstrukturen von Primern und Sonden maßgeblich durch die Länge der Amplifikate beeinflusst. Je kürzer das zu bildende Amplifikat, desto höher die Effizienz der PCR. Aus diesem Grund werden für die Quantifizierung mit dem TaqMan Amplifikatlängen von bis zu 150 bp empfohlen (Eurogentec, 2004; Schield, 1998). Die zu amplifizierenden Genabschnitte der vorliegenden Arbeit hatten Längen von 60 bp (RNase L) und 111 bp (RLI). Aus dem Anstieg der Standardgeraden konnte die Effizienz der PCR berechnet werden. Alle Effizienzen der im Rahmen dieser Arbeit erstellten real time PCRs zum Nachweis der Genepressionen betrugen mindestens 99 % (siehe Tabelle 5). Mit Hilfe der Standardkurve erfolgte auch die Quantifizierung der RNA. Für jede Probe wurde die Menge der enthaltenen RNA anhand dieser Standardkurve berechnet (Eurogentec, 2004). Der Faktor von spezifischem Signal (RNase L, RLI) und endogener Kontrolle (18S rRNA) konnte für jede Probe bestimmt und damit normalisiert werden. Eine weitere Methode der relativen Quantifizierung ist die ΔΔct-Methode (Pfaffl,

92 Diskussion

2001). Die ct-Werte von spezifischer Probe und endogener Kontrolle werden bei dieser Methode voneinander abgezogen. Voraussetzung dieser Auswertung ist eine gleiche Effizienz der beteiligten PCR-Reaktion. Auch wenn die PCR-Effizienzen der real time PCRs von RNase L, RLI, GAPDH und 18S rRNA nahezu gleich waren, wurde die Standardkurvenmethode gewählt, um mögliche Schwankungen zwischen den einzelnen PCR- Läufen auszuschließen. Die in dieser Arbeit erstellten und optimierten real time PCRs lieferten sehr genaue und reproduzierbare Ergebnisse in den Messungen der zellulären Expressionsraten von RNase L und RLI.

4.1.2. Real time PCRs zum quantitativen Nachweis der HCV RNA

Ziel der Arbeit war es, die initiale Replikation des Hepatitis C Virus in Zellkultur zu ermöglichen. Dafür sollte nicht verändertes Virus bzw. in vitro transkribierte full length RNA zur Infektion oder Transfektion von FRhK-4- bzw. Huh7-Zellen und Zellen mit überexprimiertem RLI eingesetzt werden. Um eine potentielle Replikation der HCV RNA zu detektieren, war es notwenig, ein sensitives und quantitatives Nachweissystem für die Hepatitis C Virus RNA zu entwickeln. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein real time System zum Nachweis der HCV RNA auf der Basis existierender Primer und Sonden der Firma QIAGEN Hamburg in einem neuen Puffer- und Enzymsystem hinsichtlich Sensitivität, Spezifität und Herstellungskosten optimiert. Die Probleme des vorangegangenen Systems mit Qualitätsschwankungen der Reversen Transkriptase wurden durch den Einsatz von Reverser Transkriptase eines anderen Herstellers eliminiert. Eine hohe Sensitivität des Systems war neben dem potentiellen kommerziellen Einsatz des HCV RotorGene Nachweissystems durch die QIAGEN Hamburg für die durchgeführten Zellkulturexperimente dieser Arbeit entscheidend, um auch geringe Mengen replizierter RNA detektieren zu können Mit Hilfe der Probit-Analyse wurde für das entwickelte HCV RotorGene Assay eine Nachweisgrenze von 35 IU/ml bestimmt. Für Assays zum qualitativen Nachweis von HCV RNA besteht die Vorgabe, Konzentrationen von 50 IU/ml oder weniger nachweisen zu können. Ebenso muß die Detektion aller Subtypen gewährleistet sein (Chevaliez & Pawlotsky, 2006). Sowohl der Nachweis von mindestens 50 IU/ml als auch die Detektion aller Subtypen waren mit dem entwickelten HCV RotorGene System gegeben (siehe Kapitel 3.1.2). Die Nachweisgrenze ist von der eingesetzten Probenmenge und deren Aufkonzentrierung durch die Aufreinigung abhängig. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde für die Aufreinigung der Zellkulturüberstände das QIAamp®Viral RNA Mini Kit

93 Diskussion genutzt. Durch die Kooperation der Universität Bremen und der QIAGEN Hamburg GmbH sollte eine auf QIAGEN-Produkten basierende Aufreinigung verwendet werden. Für eine möglichst breite Einsetzbarkeit der Aufreinigung, standen die manuellen Aufreinigungssysteme QIAamp®Viral RNA Mini Kit und QIAamp®DSP Virus Kit zur Auswahl. Das QIAamp®DSP Virus Kit basiert auf einem Vakuum-System, was für den Anwender einen höheren Anschaffungsaufwand bedeutet als das QIAamp®Viral RNA Mini Kit. Für dieses Kit wird lediglich eine in allen Laboratorien vorhandene Zentrifuge benötigt. In die Aufreinigung mit dem QIAamp®DSP Virus Kit werden im Vergleich zum QIAamp®Viral RNA Mini Kit 500 μl statt 140 μl Probe eingesetzt. Da in den, für diese Arbeit, verwendeten 24-well-Zellkulturplatten maximal 1 ml Zellkulturüberstand pro well vorhanden war, mußte ein Aufreinigungssystem verwendet werden, das möglichst wenig Zellkulturmaterial verbraucht. Die Auswertung der Proben sollte in Doppelbestimmung möglich sein, und bei einer potentiellen HCV Replikation sollte eine Reinfektion mit den Zellkulturüberständen erfolgen. Aus diesen Gründen wurde das QIAamp®Viral RNA Mini Kit für die Aufreinigung der Zellkulturüberstände verwendet. Es wurden 140 μl Zellkulturüberstand in die Aufreinigung eingesetzt und in einem Volumen von 50 μl eluiert. Das entsprach einem Aufkonzentrierungsfaktor von 3. Von diesem Eluat wurden 10 μl, d.h. ein fünftel in die PCR eingesetzt. Für einen möglichen Einsatz des HCV RotorGene System zum Monitoring von HCV Therapien, könnte die Sensitivität durch Änderung der Aufreinigung (QIAamp®DSP Virus Kit oder Aufreinigungsroboter) mit stärkerer Aufkonzentrierung der Proben gesteigert werden. Für die Auswertung der Versuche der voliegenden Arbeit war die erzielte Nachweisgrenze von 35 IU/ml jedoch hervorragend geeignet, da eine Replikation des Virus eine Erhöhung der RNA-Konzentration zur Folge gehabt hätte. Eine gesteigerte Sensitivität des Assays hätte lediglich den Zeitpunkt verschoben, an dem die HCV RNA in den durchgeführten Versuchen nicht mehr nachweisbar gewesen wäre. Da im Falle einer potentiellen Replikation des Viruses nur sehr geringe Mengen replizierter RNA erwartet wurde, hätten niedrigere Sensitivitäten des HCV RotorGene Systems zu falschen Versuchsergebnissen führen können. Um eine Zunahme der RNA detektieren zu können war ein quantitatives Assay notwendig. Durch den Nachweis der HCV RNA mittels konventioneller PCR und anschließender Geldokumentation wäre eine quantitative Analyse der RNA nicht möglich gewesen. Die Erstellung und Optimierung eines spezifischen, sensitiven und quantitativen HCV Nachweissystem war somit Voraussetzung für die Auswertung der HCV Infektions- und Transfektionsversuche der vorliegenden Arbeit.

94 Diskussion

4.2. RNase L Inhibitor

4.2.1. Isolation und Analyse des RLI aus FRhK-4- und humaner gesamt-Zell-RNA

Das in dieser Arbeit aus FRhK-4- und humaner gesamt-Zell-RNA isolierte und full length amplifizierte RLI-Gen wurde sequenziert und mit der Referenzsequenz Accesion nr. X74987 verglichen (siehe Abbildung 22). Es wurden Unterschiede innerhalb der Basensequenz des RLI in den Bereichen von 520 bp bis 540 bp und 1412 bp bis 1422 bp nachgewiesen, welche Veränderungen der Aminosäuresequenz zur Folge haben. Das Referenzplasmid (Bisbal et al., 1995), auf welchem die veröffentlichte RLI-Sequenz beruht, wurde daraufhin ebenfalls sequenziert und zeigte analoge Ergebnisse zu den Sequenzen des isolierten und full length amplifizierten RNase L Inhibitors. Die unter NCBI angegebene Referenzsequenz X74987 entstand höchstwahrscheinlich durch Sequenzierfehler. Bei 521 bp fehlt in der Referenzsequenz ein Adenin, wodurch sich die folgenden Basen verschieben. Bei 538 bp ist dagegen ein Guanin zu viel, wodurch die Sequenzen von Referenzplasmid und full length Amplifikat des RLI anschließend wieder übereinstimmten. Zwischen 1412 bp und 1422 bp sind jeweils die Basen Guanin und Cytosin vertauscht, was ebenfalls auf einen Fehler in der Auswertung der Sequenzierung von Bisbal et al. (1995) schließen lässt. Da alle Ergebnisse durch Sequenzierung überlappender Abschnitte bestätigt wurden, sind Fehler in den Sequenzdaten der vorliegenden Arbeit ausgeschlossen. 1996 führten Aubry et al. Versuche zur chromosomalen Lokalisation das RLI durch (Aubry et al., 1996). Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Sequenzunterschiede, welche in der vorliegenden Arbeit zum Referenz- RLI festgestellt wurden, ebenfalls detektiert. Eine Aktualisierung der Sequenz in der Datenbank ist jedoch nicht erfolgt. Die Sequenzierung der RLI-Referenzsequenz X74987 wurde 1995 nach der Didesoxymethode (Sanger et al., 1977) mit Hilfe des T7 Sequencing Kits der Firma Pharmacia durchgeführt. Auch Aubry et al. verwendeten das T7 Sequencing Kit. Die Sequenzunterschiede der Ergebnisse von Bisbal et al. (1995) und Aubry et al. (1996) weisen auf eine Anfälligkeit der Sequenzierergebnisse mit diesem Kit hin. Nach Auftrennung der DNA-Fragmente im Polyacrylamidgel erfolgte die Auswertung der Radioaktivität mittels Audioradiographie (Amersham-Pharmacia, 1994). Heute existieren optimiertere Methoden zur Sequenzierung. Neben der radioaktiven Markierung der DNA-Fragmente werden mit Fluoreszenz-Farbstoffen markierte Didesoxynukleotidtriphosphate eingesetzt, wodurch der Umgang mit Radioisotopen entfällt. Die gelelektrophoretischen Auftrennungen wurden

95 Diskussion optimiert und in ihrer Auflösung deutlich verbessert. Die Sequenzierungen der vorliegenden Arbeit wurden von Dr. H. Schmidt vom DNA-Cloning-Service durchgeführt. PCR- Amplifikate des RLI wurden zunächst mit den Restriktionsenzymen Exonuklease I und Shrimp-Alkaline-Phosphatase (Exo/SAP) verdaut, um Primer- und dNTPs zu beseitigen. Anschließend erfolgte die Sequenzierung ebenfalls nach der Sanger-Methode mit dem BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit der Firma Applied Biosystems. Mit dem 3100 Genetic Analyzer von ABI wurden die DNA-Fragmente aufgetrennt und detektiert. Der 3100 Genetic Analyzer ist ein automatisches Kapillarelektrophorese-System, in dem bis zu 16 Kapillaren analysiert und detektiert werden können. Die Fluoreszenz der markierten Fragmente wird durch eine CCD Kamera aufgenommen, zum Computer übertragen und von diesem mit Hilfe der Sequenzier-Software ausgewertet (ABI, 2001). Es ist davon auszugehen, dass die in der vorliegenden Arbeit verwendete optimierte Sequenziermethode im Vergleich zu den früher verwendeten Verfahren genauer ist. Die vorliegenden Ergebnisse werden neben reproduzierten Sequenzdaten durch die Arbeit von Aubry et al. (1996) bestätigt. Eine Revision der in der Datenbank NCBI angegeben Sequenz des RNase L Inhibitors wäre daher anzustreben. Die Aminosäuresequenzen der in der vorliegenden Arbeit isolierten RLI-Gene aus Rhesusaffe und Mensch zeigten keinerlei Unterschiede. Einzelne Basenaustausche hatten keine Auswirkung auf die Aminosäuresequenz der entsprechenden RLI-Proteine. Es ist nicht auszuschließen, dass einzelne Basenaustausche im Rahmen der Klonierung oder Sequenzierung eingebaut wurden. Aufgrund der gleichen Aminosäuresequenz wird das humane RLI auch in Affenzellen aktiv sein und das FRhK-4-RLI auch in humanen Zellen wirken.

4.2.2. stabile Überexpression des RNase L Inhibitors in Huh7- und FRhK-4-Zellen

Um einen möglichen Einfluss des RNase L Inhibitors auf die experimentelle zelluläre Infektion mit dem Hepatitis C Virus zu testen, sollte der Inhibitor stabil transfiziert werden. Wie in Kapitel 3.2.6 „Stabile Überexpression des RLI in FRhK-4- und Huh7-Zellen“ dargestellt, konnte der RNase L Inhibitor nicht in konstantem Maße und dauerhaft überexprimiert werden. 8 Wochen nach Transfektion konnten nur noch in 4 von 6 selektierten FRhK-4-RLI-Klonen erhöhte relative Mengen an RLI-mRNA um Faktoren von 4 bis 8 nachgewiesen werden (siehe Abbildung 28). Die Kinetik von zwei ausgewählten RLI-Klonen (Klon 4 und Klon 5) zeigte deutliche Transkriptionsunterschiede des RNase L Inhibitors im Versuchszeitraum von 14 Tagen. Innerhalb dieser Inkubationszeit wurden relative Mengen an

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RLI-mRNA um Faktoren von 2 bis zu Faktoren von 10 detektiert (siehe Abbildung 30). Eine stabile und konstante Überexpression des RLI konnte nicht erreicht werden. Für die Huh7- Zellen war eine Selektion potentieller RLI-Klonen nicht möglich, da die Zellen bei dem sehr hohen Umsetzungsverhältnis im Rahmen der Klonselektion ihr Wachstum eingestellt haben. Möglicherweise wäre eine schrittweise Selektion mit kleineren Umsetzungsverhältnissen erfolgversprechender gewesen. In Huh7-RLI-Mischklonen konnte jedoch bereits nach kurzer Zeit keine RLI-Überexpression mehr nachgewiesen werden. Ob die Zellen das Gen eliminieren oder überexprimierende Zellen frühzeitig absterben ist völlig unklar. Eine möglicherweise letale Wirkung gesteigerter Mengen an RLI-Protein kann nicht beurteilt werden. Ob die Verwendung von pcDNA3.1/V5-His_RLI wegen seiner geringeren Überexpressionsraten für eine stabile Transfektion gegenüber pl.18_RLI günstiger gewesen wäre, ist nicht auszuschließen. Potentiell letal wirkende hohe Mengen an RLI- Protein hätten durch die geringen Transkriptionsraten der pcDNA3.1/V5-His_RLI Plasmide mit maximalen relativen Einheiten an RLI-mRNA um Faktoren von 6 möglicherweise unterschritten werden können. Jedoch wurde bereits 1999 im Rahmen einer Diplomarbeit schon einmal versucht, FRhK-4-Zellen stabil mit dem pcDNA3/RLI 3’ zu transfizieren (Gotter, 1999). Die dadurch gewonnenen FRhK-4-6er Klone zeichneten sich in HAV Infektionsexperimenten durch eine stärkere Replikation des HAV aus, wodurch von einer Überexpression des RLI ausgegangen wurde. Ein Nachweis der RLI-Transkription auf Genexpressionsebene ist nicht erfolgt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die FRhK- 4-6er Klon-Zellen auf ihre RLI-Transkriptionsrate getestet und zeigten keine erhöhten Mengen relativer Einheiten an RLI-mRNA (siehe Abbildung 31). Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass auch bei dem Versuch einer stabilen Überexpression des RLI mit pcDNA3.1/V5-His_RLI keine dauerhaft stabilen Transfektanten gewonnen werden können. In der Literatur gibt es keine Daten zur Überexpression des RNase L Inhibitors in FRhK-4- oder Huh7-Zellen. Generell gibt es nur sehr wenig Arbeiten mit Bezug zum RNase L Inhibitor. Diese wenigen Arbeiten wurden fast ausschließlich mit Hela-Zellen (Epithelzellen aus Gebärmutterhalskrebs) durchgeführt (Bisbal et al., 1995; Martinand et al., 1998). Ausnahme bilden zwei Arbeiten, in denen H9- (humane T Lymphozytenzellen) bzw. Daudi- Zellen (Burkitt-Lymphomzellen) verwendet wurden (Bisbal et al., 2001; Martinand et al., 1999). In diesen Arbeiten wurde die Überexpression des RLI zwar benannt, jedoch nicht mit Daten belegt. Auch ist in den Arbeiten häufig unklar, ob für die Versuche stabil transfizierte Zellen verwendet wurden oder eine transiente Transfektion durchgeführt wurde. Fehlende

97 Diskussion

Angaben über die Herkunft der verwendeten stabil transfizierten RLI-Klone in den verschiedenen Arbeiten lassen mutmaßen, dass die stabil transfizierten Zellen für jede Arbeit neu hergestellt wurden. Dies wäre ein Hinweis auf eine nicht mögliche, dauerhafte Überexpression des RNase L Inhibitors. Aus diesen Gründen wurden für die Versuche der vorliegenden Arbeit transiente RLI-Transfektionen durchgeführt. Mit Hilfe der transienten RLI-Transfektion konnte die Überexpression des RNase L Inhibitors für mindestens 5 Tage mit erhöhten relativen Mengen an RLI-mRNA um Faktoren von mindestens 10 sichergestellt werden (siehe Abbildung 26). Durch Mehrfachtransfektion konnte die Dauer der RLI Überexpression über einen beliebig langen Inkubationszeitraum verlängert werden.

4.3. HCV Infektion und Transfektion von HCV full length RNA in RLI-transfizierte Zellen

Ziel der HCV Infektions- und Transfektionsversuche der vorliegenden Arbeit war es, mit Hilfe der Überexpression des RLI die RNase L auszuschalten und dadurch eine initiale Replikation des Hepatitis C Virus in Zellkultur zu ermöglichen. Hauptaspekt war dabei, die eingesetzte virale RNA nicht zu verändern. Das Passagieren geringer Mengen an Virusnachkommen sollte eine Anpassung der Viren an die Zellkultur bewirken. Der gewählte Versuchsansatz, durch Überexpression des RLI die RNase L auszuschalten und dadurch eine initiale Replikation des HCV zu ermöglichen, soll kurz erläutert werden. Dazu werden bekannte inhibitorische Effekte des Hepatitis C Virus auf zelluläre antivirale Abwehrmechanismen in die Betrachtung einbezogen. Cheng et al. vermuten, dass das Hepatitis C Virus den antiviralen Signalweg nach dessen Aktivierung blockiert (Cheng et al., 2006). Die Transfektion von polyIC in JFH-1 infizierten Zellen hat gezeigt, dass Hepatitis C Viren die Aktivierung von IRF-3 (interferon regulated factor 3) durch dsRNA blockieren. Auch Foy et al. zeigten in ihrer Arbeit, dass die viralen Proteine NS3/4A die intrazelluläre virale Antwort unterbrechen, welche die IFN β-Expression induzieren (Foy et al., 2005). Die Blockade der Interferon-Produktion verhindert somit die Induktion der Oligoadenylatsynthetase-Expression (siehe Abbildung 48). Ebenfalls wurde bereits 2000 die Fähigkeit des Hepatitis C Virus beschrieben, durch Bindung des NS5A- Proteins an die Proteinkinase R dessen Aktivierung zu verhindern (Francois et al., 2000). Auch das E2-Protein blockiert die Kinase Aktivität der PKR und dadurch deren hemmenden Effekt auf die Proteinsynthese (Taylor et al., 1999). Durch das Verhindern der Induktion der Oligoadenylatsynthetase und durch die Inaktivierung der PKR werden sowohl das

98 Diskussion

2’-5’Oligoadenylatsynthetase-System als auch die PKR als Interferon-induzierte antivirale Signalweges durch das Hepatitis C Virus unterwandert (siehe Abbildung 48). In klinischen Studien mit Leberbiopsiematerial chronischer Hepatitis C Patienten wurde eine signifikante Reduktion der Expression des RNase L Inhibitors festgestellt (Yu et al., 2000). Es könnte daher eventuell ein Einfluss des RLI oder der RNase L auf die HCV Infektion vorliegen. Möglicherweise führt eine Reduktion des RLI durch die Replikation des Hepatitis C Virus zu einer Aktivität der RNase L. Ein Gleichgewicht zwischen Virusreplikation und RNase L- Aktivität könnte möglicherweise zur Ausbildung der chronischen Hepatitis führen. Ob die Expression der latent vorliegenden RNase L oder des zellulären RLI durch das Hepatitis C Virus bei der experimentellen Infektion von FRhK-4- und Huh7-Zellen beeinflusst werden, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit analysiert. Eine potentielle Aktivierung der RNase L wurde durch die Überexpression des RLI verhindert.

Abbildung 48: schematische Darstellung der zellulären viralen Abwehr mit Angriffsstellen des Hepatitis C Virus

Man muss bedenken, dass alle Erkenntnisse über die Interaktion der HCV-Proteine auf Versuchen mit Replikonsystemen oder dem HCV Stamm JFH-1 beruhen. Ohne adaptive

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Mutationen der HCV-Replikons an die Bedingungen der verwendeten Zellen war eine Replikation nicht möglich (Bartenschlager et al., 2003). Diese adaptiven Mutationen sowie die Unterschiede von JFH-1 in 5’UTR, Core-Protein und verschiedenen Nicht- Strukturproteinen zu allen bekannten HCV Sequenzen spiegeln deshalb nicht zwangsläufig die zelluläre Replikation des Hepatitis C Virus wider. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher unabhängig von Adaptionen oder dem besonders virulenten HCV-Stamm JFH-1 ein möglicher Einfluss der HCV Infektion auf die zellulären antiviralen Signalwege analysiert. In klinischen Studien mit Leberbiopsiematerial chronischer Hepatitispatienten wurden sowohl auf mRNA-Ebene als auch immunohistochemisch erhöhte Expressionen der Proteinkinase R festgestellt (Shimada et al., 1998; Yu et al., 2000). Die Ergebnisse einer gesteigerten aktiven PKR widersprechen der experimentell festgestellten Fähigkeit des Hepatitis C Virus, die Proteinkinase R zu inhibieren (Francois et al., 2000; Taylor et al., 1999). Yu et al. beobachteten weiterhin eine signifikante Reduktion der RLI-mRNA, jedoch keine Veränderung des RNase L-Expressionsmusters (Yu et al., 2000). Keiner der Studienpatienten erhielt eine zusätzliche Interferontherapie, so dass Expressionsunterschiede zu Leberbiopsieproben gesunder Personen aufgrund der Gabe von Interferon ausgeschlossen werden können. Die manuelle Zugabe von Interferon erhöht innerhalb der Zellen deutlich den Anteil an 2’-5’Oligoadenylaten. Auf der dadurch gesteigerten Aktivität der RNase L und der anschließenden Spaltung viraler RNA beruht der Erfolg der Interferonbehandlung zahlreicher Virusinfektionen (Williams et al., 1979). Für HCV Infektionen wird angenommen, dass der Erfolg der Interferontherapie direkt mit der Fähigkeit der Spaltung von HCV RNA durch die RNase L korreliert (Han & Barton, 2002). Einige HCV Typen wie beispielsweise Subtyp 1a zeigen sich gegenüber Interferon weniger sensitiv als andere HCV Subtypen. Wie jedoch in der Arbeit von Han und Barton gezeigt werden konnte, werden die RNAs aller HCV Subtypen effektiv durch die RNase L gespalten (Han & Barton, 2002). Die Ausschaltung der RNase L-Aktivität mit Hilfe der Überexpression des RLI stellt daher einen Versuch dar, die Replikation des Hepatitis C Virus in Zellkultur zu ermöglichen.

Um die Ergebnisse der HCV RNA-Bestimmung infizierter Zellen nach verschiedenen Inkubationszeiten beurteilen zu können, wurde zunächst die Stabilität von Hepatitis C Virus RNA im Viruskapsid bestimmt. Dieser Versuch diente dazu, abschätzen zu können, wie lange Hepatitis C Virus RNA des Inokulums nachgewiesen werden kann. Die Nachweisgrenze von 35 IU/ml wurde bereits 18 Tage nach Versuchsbeginn erreicht. In den nachfolgenden Probennahmen konnte die HCV RNA nicht mehr reproduzierbar detektiert werden. In

100 Diskussion

Zellkulturmedium und unter Brutschrankbedingungen, jedoch ohne den Einfluss zellulärer Enzyme, konnte bis zu maximal 30 Tagen nach Versuchsbeginn in einzelnen Proben HCV RNA detektiert werden. Nach 30 Tagen Inkubationszeit waren alle Proben im HCV RotorGene System negativ (siehe 3.3.2). Gegen ubiquitär vorkommende RNasen ist die HCV RNA durch die virale Hülle relativ geschützt, während zelluläre RNasen in diesem Versuchsansatz keine Rolle spielten. Für die HCV Infektionsversuche wird aufgrund vorhandener zellulärer RNasen angenommen, dass die zeitliche Nachweisgrenze der Inokulum-RNA deutlich unter 30 Tagen liegt. Reproduzierbare positive Ergebnisse für HCV Inokulum-RNA sollten sogar unter 18 Tagen liegen. Auch durch das Waschen der Zellen nach Infektion und durch Mediumwechsel werden die Mengen an Inokulum-RNA weiter deutlich herabgesetzt. Dadurch wird der Zeitraum der Detektierbarkeit von Inokulum-RNA stark reduziert. Es ist daher davon auszugehen, dass ab 30 Tagen nach Infektion mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit keine Inokulum-RNA mehr nachgewiesen werden kann. Durch die Erstellung eines sensitiven und quantitativen Nachweises für HCV RNA im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist bei einem Anstieg der HCV RNA Konzentrationen in den Zellkulturproben mit hoher Wahrscheinlichkeit von einer Replikation auszugehen.

Alle bisherigen Versuche, natürliche HCV Isolate verschiedener Subtypen in Zellkultur anzuzüchten, verliefen erfolglos (Ausnahme JFH-1). Die effiziente Replikation des Hepatitis C Virus gelang bis heute nur in Huh7-Zellen und nur mit Replikonsystemen oder mit dem hochinfektösen HCV Stamm JFH-1 (Bartenschlager et al., 2003; Kato et al., 2001). Die Infektionsversuche der vorliegenden Arbeit wurden parallel mit FRhK-4- und Huh7-Zellen durchgeführt. Huh7-Zellen stellen als Vertreter der humanen Leberzellen die natürlichen Wirtszellen des Hepatitis C Virus dar. Für Klone von FRhK-4-Zellen konnte im Rahmen einer Diplomarbeit der Universität Bremen ein gesteigertes HAV Wachstum gezeigt werden (Gotter, 1999). Aus diesem Grund wurden die FRhK-4-Zellen parallel zu den Huh7-Zellen verwendet. Bartenschlager et al. vermuten die besondere Eignung der Huh7-Zellen für HCV- Replikationen in einem Defekt der Zellen, auf doppelsträngige RNA zu reagieren und die dsRNA-abhängigen antiviralen Signalwege zu aktivieren (Bartenschlager et al., 2003). Allerdings wurde die Fähigkeit der Huh7-Zellen, auf doppelsträngige RNA zu reagieren, durch Cheng et al. mit Hilfe von polyIC (synthetischer dsRNA) gezeigt (Cheng et al., 2006). 16 Stunden nach Transfektion von polyIC war die Interferon-β Expression induziert. Auch die

101 Diskussion

Versuche von Lanford et al. mit Huh7-Zellen weisen zwar auf einen Defekt der Zellen in einigen Teilen des Signalweges für dsRNA hin, diese beeinflussen jedoch nicht die Reaktion auf Interferon α oder Interferon γ (Lanford et al., 2003). Ob der nicht genauer beschriebene Defekt einen Einfluss auf die Replikationsfähigkeit von JFH-1 oder HCV-Replikons besitzt ist nicht bekannt. Doppelsträngige RNA aktiviert als Kofaktor die Oligoadenylatsynthetase. Gesteigerte Interferon β-Expression und ein aktiviertes Oligoadenylatsynthetase-System führen zur Aktivierung der RNase L. Eine Regulation der RNase L-Expression wurde in der Literatur bisher nicht beschrieben. In HAV Infektionsversuchen einer parallel verlaufenden Doktorarbeit sah die Datenlage zwischenzeitlich jedoch so aus, als ob eine gesteigerte Expression der RNase L durch HAV erfolgen würde. Aus diesem Grund wurde die Expression der RNase L während der Infektionsversuche mit HCV ebenfalls analysiert. Eine Regulation der RNaseL-mRNA-Mengen durch das Hepatitis C Virus konnte nicht festgestellt werden (siehe Abbildung 38). Man muß jedoch beachten, dass die Analyse der mRNA der RNase L erst 4 Wochen nach der HCV Infektion erfolgt ist. Um alle potentiell HCV infizierten Zellen über einen möglichst langen Zeitraum mit überexprimiertem RLI zu kultivieren, wurden während des Versuches keine Zellen zur Analyse der mRNA-Menge von RNase L bzw. RLI abgenommen. Aus diesem Grund könnte eine potentiell erhöhte Expression der RNase L zu Beginn der Inkubationszeit bereits wieder abgeklungen sein. Da jedoch keine HCV Replikation in den infizierten Zellen stattgefunden hat, kann über einen potentiellen Einfluss des Hepatitis C Virus auf die Expression der RNase L keine Aussage getroffen werden. Zu den FRhK-4-Zellen ist bekannt, dass sie nicht auf Interferon reagieren. Trotz Anwesenheit des von ihnen produzierten Interferons bleiben diese Zellen permissiv für eine VSV Infektion, was auf eine Blockade innerhalb der Interferon-Signaltransduktion hindeutet (Brack, 1999). Oligoadenylatsynthetase und RNase L werden jedoch konstitutiv in diesen Zellen exprimiert (Brack, 1999). In den HCV Infektionsversuchen der vorliegenden Arbeit konnte auch für die FRhK-4-Zellen keine Regulation der RNase L-Expression festgestellt werden. Die relativen Einheiten der RNase L-mRNA der stabil RLI-transfizierten FRhK-4-Klone 4 und 5 sowie der transient RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen lagen innerhalb der Grenzen nicht regulierter Genexpression (siehe Abbildung 36 und Abbildung 38). Auch die Analyse der RNase L- Expression in transient RLI-transfizierten FRhK-4-Zellen erfolgte erst 4 Wochen nach Infektion. Aus diesem Grund könnte wie bereits für die Huh7-Zellen beschrieben eine potentiell erhöhte Expression der RNase L zu Beginn der Inkubationszeit bereits wieder

102 Diskussion abgeklungen sein. Da auch in den FRhK-4 Zellen keine HCV Replikation erfolgt ist, kann über einen möglichen Einfluss des Hepatitis C Virus auf die Expression der RNase L auch in diesem Fall keine Aussage getroffen werden. Sowohl in den FRhK-4- als auch in den Huh7-Zellen kann latent vorhandene RNase L durch doppelsträngige RNA während der HCV Infektion aktiviert werden. Diese Aktivierung ist mittels real time PCR nicht messbar. Versuche, die RNase L im Western-Blot nachzuweisen scheiterten an vermutlich viel zu geringen Konzentrationen an RNase L-Protein in den Versuchsansätzen. Die Überexpression des RLI hatte weder in den FRhK-4- noch in den Huh- Zellen einen positiven Einfluss auf eine potentielle Replikation des Hepatitis C Virus. In transient RLI-transfizierten Zellen ergab die Analyse der RLI-mRNA 4 Wochen nach HCV Infektion noch ein Erhöhung um Faktoren von über 30 für Huh7- und FRhK-4-Zellen (siehe Abbildung 37). Weder intrazellulär noch extrazellulär konnte jedoch HCV RNA nachgewiesen werden. Es ist daher davon auszugehen, dass das 2’-5’Oligoadenylatsynthetase-System mit dem Effektorenzym RNase L höchstwahrscheinlich keinen Einfluss auf die experimentelle HCV Infektion in Huh7- bzw. FRhK-4-Zellen ausübt.

Im Rahmen der Infektionsversuche stellt der Viruseintritt in die Zellen einen wichtigen Aspekt dar. Der CD81-Rezeptor wird mit dem Eintritt des Hepatitis C Virus in die Leberzellen in Verbindung gebracht (Bartosch et al., 2003; Pileri et al., 1998). Es ist bekannt, dass Antikörper gegen CD81 die HCV Infektion in Huh7-Zellen hemmen (Zhong et al., 2005), d.h. die Huh7-Zellen den CD81-Rezeptor exprimieren. In der Literatur gibt es jedoch keine Angaben über das Vorhandensein des CD81-Rezeptors in FRhK-4-Zellen. Es ist daher möglich, dass diese Zellen den Rezeptor nicht besitzen und bei den Infektionsversuchen kein Viruseintritt in die Zellen erfolgt ist. Trotz Expression des CD81 in Huh7-Zellen kann auch für die Infektionsversuche dieser Zellen nicht davon ausgegangen werden, dass die Aufnahme des Hepatitis C Virus in die Zellen erfolgt ist. Aus diesen Gründen wurde der Viruseintritt umgangen und HCV full length RNA in die Zellen transfiziert. Dadurch wurde sichergestellt, dass die HCV RNA in das Zytoplasma der Zellen gelangt. Ein möglicher Einfluss der Transfektion von RNA in vitro Transkript auf die Expression von RNase L und zellulärem RLI wurde durch die Transfektion von in vitro transkribierter RNA des Elongationsfaktors II von Xenopus ausgeschlossen. Weder die Transfektion von HCV IVT noch von Xenopus IVT führten zu einer erhöhten Expression der RNase L in FRhK-4- oder Huh7-Zellen (siehe Abbildung 40). Die Expression des zellulären RLI wurde durch die Transfektion von IVT ebenfalls nicht beeinflusst. In einem Inkubationszeitraum von 24 Stunden nach Transfektion

103 Diskussion lagen die relativen Mengen an RLI-mRNA sowohl in den FRhK-4- als auch in den Huh7- Zellen innerhalb der Grenzen nicht regulierter Genexpression (siehe Abbildung 42). Die Expression der RNase L wurde auch durch die Transfektion von HCV IVT in transient RLI- transfizierte FRhK-4- oder Huh7-Zellen nicht reguliert (siehe Abbildung 46 und Abbildung 47). Die relativen Mengen an RLI-mRNA waren aufgrund der transienten RLI-Transfektion bis zu 26 Tagen nach HCV Transfektion um Faktoren von mindestens 5 erhöht. Zum Zeitpunkt der HCV Transfektion waren die relativen mRNA-Einheiten des RLI sogar um Faktoren von 140 (FRhK-4-Zellen) bzw. 180 (Huh7-Zellen) erhöht (siehe Abbildung 43 und Abbildung 44). 26 Tage nach HCV Transfektion konnte jedoch weder für die FRhK-4- noch für die Huh7-Zellen intrazellulär oder extrazellulär HCV RNA nachgewiesen werden (siehe Abbildung 45). Die Überexpression des RLI hatte daher keinen positiven Effekt auf die potentielle HCV Replikation. Eine Replikation der HCV RNA ist offensichtlich nicht erfolgt. Ob die in vitro transkribierte HCV RNA möglicherweise bereits vor der Transfektion abgebaut wurde, ist nicht bekannt. Ohne Proteinhülle sind die „nackt“ vorliegenden in vitro Transkripte gegenüber RNasen sehr ungeschützt. Die Stabilität von RNA ist von der Länge des polyA-Anhangs oder besonderer Sequenzen in der 3’-UTR abhängig (Alberts et al., 1995). Durch das Einfrieren und Auftauen könnte der polyA-Anhang der IVTs bereits verkürzt oder abgebaut und dadurch die Stabilität der RNA stark beeinträchtigt worden sein. Eine Stabilitätsbestimmung der in vitro transkribierten RNA ist im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht durchgeführt worden. Da im HCV RotorGene System lediglich ein kurzer Genabschnitt der 5’-UTR amplifiziert wird, ist eine Aussage über die Länge oder Qualität der Ausgangs-RNA nicht möglich. In vitro transkribierte RNA besitzt jedoch eine hohe Empfindlichkeit gegenüber ubiquitär vorkommenden RNasen. Auch wenn das Transfektionsreagenz einen Schutz vor RNasen bieten sollte, ist ein Abbau der RNA während der 20minütigen Inkubation von IVT und Transfektionsreagenz nicht auszuschließen. Intrazellulär wäre der Abbau des IVTs durch latent vorliegende unnd möglicherweise aktive RNase L zu erklären. Eine Aktivierung der RNase L wurde jedoch durch die Überexpression des RLI ausgeschlossen. In der Arbeit von Han und Barton wurde ausserdem eine minimale HCV RNA Konzentration von 20nM zur Aktivierung der Oligoadenylatsynthetase und RNase L bestimmt. Geringere RNA Mengen waren innerhalb des Versuchsaufbaus stabil. Größere Mengen an RNA führen zur schnellen und effektiven Spaltung durch die RNase L (Han & Barton, 2002). Die in dieser Arbeit für die Transfektion eingesetzten 250 ng IVT entsprechen einer Konzentration von ca. 8 nM. Diese Konzentration liegt deutlich unter der von Han und Barton bestimmten minimalen Aktivierungkonzentration von 20nM, so dass eine Aktivierung

104 Diskussion der RNase L durch das IVT nicht erfolgt sein sollte. Die Abnahme der in vitro transkribierten RNA-Konzentration ist in diesem Falle auf ubiquitär vorkommende RNasen und nicht auf eine Aktivierung der RNase L zurückzuführen. Eine Aktivierung der RNase L wäre erst bei einer erhöhten RNA Menge nach einer Replikation der HCV RNA erfolgt. In diesem Fall hätte die Überexpression des RNase L Inhibitors dieser Aktivierung jedoch entgegengewirkt und eine weitere Replikation der HCV RNA ermöglicht. Da keine Replikation des Hepatitis C Virus in Zellkultur erfolgt ist, ist eine Aktivierung der RNase L durch HCV RNA sehr unwahrscheinlich. Die Überexpression des RLI hatte auf die potentielle Replikation der HCV RNA keinen positiven Einfluss.

Es ist weiterhin nicht möglich, eine Aussage darüber zu treffen, ob die transfizierte RNA innerhalb der Zelle translatiert wurde. Wie in Kapitel 1.1.9 „Hepatitis C Virus in Zellkultur“ beschrieben, existieren derzeitig keine Zellkultursysteme zur Anzucht des Hepatitis C Virus aus Patientenmaterial oder full length RNA (Sonderfall JFH-1 mit deutlichen Sequenzunterschieden zu den bekannten Hepatitis C Viren in fast allen Nicht- Strukturproteinen). Replikationen sind bisher lediglich auf der Basis von Replikonsystemen möglich (Lohmann et al., 1999). Alle diese Replikonsysteme enthalten eine zusätzliche internal ribosomal entry side des Enzephalomyokarditis Virus (EMCV-IRES). Diese zusätzlich eingebrachte IRES ermöglicht die Translation der nachfolgenden Sequenzen der HCV Nicht-Strukturproteine (siehe Abbildung 49). Möglicherweise erfolgt die HCV-IRES- induzierte Translation der HCV RNA in geringerem Maße als durch die EMCV-IRES. Eine potentielle sehr geringe Replikation wäre in diesem Falle nicht detektiert worden. Möglicherweise wurde für den Fall einer sehr schwachen Translation durch die HCV-IRES auch zu wenig RNA transfiziert, um die sehr geringen Mengen HCV RNA einer potentiellen Replikation zu detektieren.

105 Diskussion

Abbildung 49: schematische Darstellung von genomischer HCV RNA und subgenomischer Replikon RNA (Uprichard et al., 2006). Im Gegensatz zum full length Replikon enthält das subgenomische Replikon lediglich die Core-Sequenz der HCV IRES, nicht jedoch die Sequenzen für die Strukturproteine.

In möglicherweise folgenden Versuchen sollte die Transfektion mit größeren Mengen viraler RNA durchgeführt werden. Geringe Mengen transfizierter RNA führen eventuell dazu, dass die sehr kleinen Mengen replizierter HCV RNA nicht detektiert werden. Potentiell aktivierte RNase L kann durch die Überexpression des RLI gehemmt werden. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit ist ein Einfluss des 2’-5’Oligoadenylatsynthetase-Systems mit dem Effektorenzym RNase L auf die experimentelle HCV Infektion sehr unwahrscheinlich. Ausserdem ist anzuraten, die Transfektions- und Infektionsversuche in weiteren Zelllinien durchzuführen. Möglicherweise könnte die stabile Überexpression des RNase L Inhibitors in anderen Zelllinien erfolgversprechender verlaufen. Da ein Einfluss der RNase L und ihrer Ausschaltung aufgrund gesteigerter RLI-Expression auf die experimentelle HCV Infektion sehr unwahrscheinlich ist, sollte ein Schwerpunkt folgender Arbeiten möglicherweise auf die Betrachtung der Proteinkinase R gerichtet werden. Unterschiedliche Erkenntnisse aus in vivo (Shimada et al., 1998; Yu et al., 2000) und in vitro Studien (Francois et al., 2000; Taylor et al., 1999) geben möglicherweise einen Anlass, die Proteinkinase R unter den experimentellen Bedingungen der HCV Infektion detaillierter zu analysieren.

106 Zusammenfassung

5. Zusammenfassung

Das Hepatitis C Virus ist weltweit verbreitet, wobei ca 3 % der Bevölkerung chronisch mit dem Virus infiziert sind. Nach Schätzungen des CDC entwickeln 20 – 50 % der chronisch infizierten Hepatitis C Patienten eine Leberzirrhose. Aus der Leberzirrhose entwickeln sich wiederum in 25 % der Fälle ein Leberzellkarzinom oder ein Leberversagen. Patienten einer akuten Hepatitis C haben gute Heilungschancen ohne zusätzliche Behandlung, während Patienten mit einer chronischen Hepatitis heute mit einer Kombinationstherapie aus pegyliertem Interferon und Ribavirin behandelt werden. Diese Behandlung erreicht langanhaltende Therapieerfolgsraten von bis zu 60 %. Standardisierte Therapiemethoden oder Erfolgsgarantien der Therapie für Patienten mit Hepatitis C existieren nicht. Das Hauptproblem der Erforschung des Hepatitis C Virus liegt bis heute in einem fehlenden Zellkulturmodell. Bisher ist es nicht gelungen, natürliche Isolate aller Hepatitis C Subtypen in Zellkultur anzuziehen. Effektive Replikationen des Hepatitis C Virus gelangen bisher nur mit HCV Replikonsystemen oder dem hochinfektiösen Virustyp JFH-1. Alle existierenden HCV Replikons enthalten jedoch adaptive Mutationen in fast allen Nicht-Strukturproteinen. Und auch JFH-1 weist zu allen bekannten HCV Subtyp 2a Sequenzen deutliche Unterschiede auf. Aus diesen Gründen sollte das Ziel der vorliegenden Arbeit sein, eine initiale Replikation des Hepatitis C Virus in Zellkultur zu ermöglichen. Hauptaspekt war dabei, die virale RNA nicht zu verändern. Eine Manipulation sollte auf Seiten der zellulären viralen Abwehr durch Überexpression des RLI erfolgen. Dadurch sollte die RNase L als Effektorenzym des 2’-5’Oligoadenylatsynthetase-Systems ausgeschaltet werden. Zur Analyse der HCV RNA wurde auf der Basis existierender Primer und Sonden ein spezifisches, sensitives und quantitatives HCV RotorGene Nachweissystem entwickelt. Zur Analyse der zellulären Genexpression wurden spezifische und quantitative real time PCRs zum Nachweis der mRNA-Mengen von RLI, RNase L und GAPDH sowie der 18S rRNA entwickelt. Die Infektionsversuche wurden sowohl in Huh7- als auch in FRhK-4-Zellen durchgeführt. Humane Leberzellen (Huh7) sind die natürlichen Wirtszellen des Hepatitis C Virus und die Zellen, in denen HCV Replikons und JFH-1 bereits effizient replizieren. Für Klone von RLI- transfizierten FRhK-4-Zellen konnte in einer Diplomarbeit der Universität Bremen ein gesteigertes HAV Wachstum beobachtet werden. Es sollte analysiert werden, ob diese Eigenschaft auch auf die Replikation von HCV einen positiven Einfluss ausübt.

107 Zusammenfassung

Der RNase L Inhibitor wurde aus humaner- und Affen-gesamt-Zell-RNA isoliert und sequenziert. Die Auswertungen der RLI-Sequenzen ergaben Unterschiede in den Nuklein- und Aminosäuresequenzen zur RLI-Referenzsequenz der NCBI Datenbank. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden jedoch durch Reproduktion und eine existierende Publikation von 1999 bestätigt. Die RNase L Inhibitoren von Mensch und Affe sind in ihren Aminosäuresequenzen vollkommen identisch. Die stabile Überexpression des RLI ist weder in Huh7- noch in FRhK-4-Zellen gelungen. Ob das RLI-Gen aus den Zellen elimiert wird oder das Vorhandensein größerer Mengen an RLI- Protein letal auf die Zellen wirkt ist unklar. Transiente Überexpressionen des RLI waren um Faktoren von bis zu 200 möglich. Nach einer Woche Inkubationszeit konnte noch eine erhöhte RLI-mRNA-Menge um Faktoren von mindestens 6 detektiert werden. Durch Mehrfachtransfektion konnte die Dauer der RLI-Überexpression beliebig verlängert werden. Es wurden sowohl HCV Infektionsversuche, als auch Transfektionsversuche mit in vitro transkribierter HCV RNA durchgeführt. Durch Transfektion der HCV RNA wurde der kritische Schritt des Viruseintritts in die Zelle umgangen. Weder die HCV Infektion noch die Transfektion von in vitro transkribierter full length RNA hatten einen Einfluss auf die Expression des zellulären RLI. Die Überexpression des RLI hatte wiederum keinen positiven Effekt auf die Replikation der HCV RNA. Weder in Huh7- noch in FRhK-4-Zellen ist die initiale Replikation des Hepatitis C Virus mit Hilfe der Überexpression des RLI gelungen. Da eine Replikation von Hepatitis C Virus RNA weder in RLI-transfizierten noch in nicht transfizierten Zellen erfolgt ist, kann über einen potentiellen Einfluss der HCV RNA auf die Expression der RNase L keine Aussage getroffen werden. Es ist jedoch sehr wahrscheinlich, dass das 2’-5’Oligoadenylatsynthetases-System mit dem Effektorenzym RNase L keinen Einfluss auf die Replikation des Hepatitis C Virus in Zellkultur hat.

108 Anhang 6. Literaturverzeichnis

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116 Anhang 7. Anhang

7.1. Plasmidkarten

pcDNA3/RLI 3’

Dieses Plasmid ist von pcDNA3 (Invitrogen) abgeleitet und enthält die Sequenz der humanen RLI cDNA (Bisbal et al., 1995).

pcDNA 3.1/V5-His Topo TA (Invitrogen)

Dieses Plasmid der Firma Invitrogen dient als Klonierungvektor von PCR-Fragmenten in E.coli.

117 Anhang pcDNA3.1/V5-His_RLI

Dieses Plasmid ist abgeleitet von pcDNA3.1/V5His TOPO TA und enthält die Sequenz des RNase L Inhibitors. pcDNA3.1/V5-His-m_RLI enthält die Sequenz des FRhk-4-RLI (monkey-RLI) und pcDNA3.1/V5-His-h_RLI enthält die Sequenz des humanen RLI.

pl.18

Dieses Plasmid dient als Klonierungvektor von PCR-Fragmenten in E.coli.Es zeichnet sich durch seine sehr hohe Expressionrate aus.

118 Anhang pl.18_RLI

Dieses Plasmid ist abgeleitet von pl.18 und enthält die RLI Sequenz mit angehängtem V5- His. Das Insert wurde mit Hilfe von KpnI und MssI/PmeI aus pcDNA3.1/V5His_RLI herausgeschnitten und in pl.18 einkloniert. pl.18-m_RLI enthält die Sequenz des FRhk-4-RLI (monkey-RLI) und pl.18-h_RLI enthält die Sequenz des humanen RLI.

p90/HCV FL-long pU

p90/HCV FL-long pU ist ein Klonierungsvektor, abgeleitet von pBR322, der die komplette Konsensus cDNA des HCV-Isolats H77 (Kolykhalov et al., 1997) vom Genotyp 1a unter der Kontrolle eines T7 Promoters enthält.

119 Anhang ZC-5.1

Dieses Plasmid ist abgeleitet von ZC-5.1 und enthält die Sequenz des humanen RNase-L- Gens. Die angegebenen Basen im Hind-III-Fragment der Rnase L entspricht den Positionen im RNase L Gen. Die Positionen im Vektor sind durch einen hochgestellten * gekennzeichnet.

120 Anhang 7.2. Sequenzen und Alignments

H.sapiens mRNA for 2'-5' oligoadenylate binding protein (RLI); NCBI Accesion nr. X74987

humanes RLI mit angehängtem His-Tag aus Plasmid 8_14_27

FRhK-4 RLI mit angehängtem His-Tag aus Plasmid 6_5_2

121 Anhang nachsequenziertes RLI aus dem Plasmid von C. Bisbal (Bisbal et al., 1995)

122 Anhang Alignments :

Plasmide 8_14_27+His („humanes“ RLI Plasmid) und 6_5_2+His („FRhK-4“ RLI Plasmid) versus RLI-Sequenz NCBI Acc.nr. X74987 (Bisbal et al., 1995)

10 20 30 40 50 60 ------+------+------+------+------+------+- 1 A T G G C A G A C A A G T T A A C G A G A A T T G C T A T T G T C A A C C A T G A C A A A T G T A A A C C T A A G A A A X74987 1 ...... 8-14-27+His 1 ...... 6-5-2+His 70 80 90 100 110 120 ------+------+------+------+------+------+- 61 T G T C G A C A G G A A T G C A A A A A G A G T T G T C C T G T A G T T C G A A T G G G A A A A T T A T G C A T A G A G X74987 61 . . C ...... 8-14-27+His 61 . . C ...... 6-5-2+His 130 140 150 160 170 180 ------+------+------+------+------+------+- 121 G T T A C A C C C C A G A G C A A A A T A G C A T G G A T T T C C G A A A C T C T T T G T A T T G G T T G T G G T A T C X74987 121 ...... 8-14-27+His 121 ...... 6-5-2+His 190 200 210 220 230 240 ------+------+------+------+------+------+- 181 T G T A T T A A G A A A T G C C C C T T T G G C G C C T T A T C A A T T G T C A A T C T A C C A A G C A A C T T G G A A X74987 181 ...... C . . . . . 8-14-27+His 181 ...... C . . . . . 6-5-2+His 250 260 270 280 290 300 ------+------+------+------+------+------+- 241 A A A G A A A C C A C A C A T C G A T A T T G T G C C A A T G C C T T C A A A C T T C A C A G G T T G C C T A T C C C T X74987 241 ...... G ...... G ...... 8-14-27+His 241 ...... G ...... 6-5-2+His 310 320 330 340 350 360 ------+------+------+------+------+------+- 301 C G T C C A G G T G A A G T T T T G G G A T T A G T T G G A A C T A A T G G T A T T G G A A A G T C A G C T G C T T T A X74987 301 ...... T ...... A ...... 8-14-27+His 301 ...... 6-5-2+His 370 380 390 400 410 420 ------+------+------+------+------+------+- 361 A A A A T T T T A G C A G G A A A A C A A A A G C C A A A C C T T G G A A A G T A C G A T G A T C C T C C T G A C T G G X74987 361 ...... 8-14-27+His 361 ...... 6-5-2+His 430 440 450 460 470 480 ------+------+------+------+------+------+-

123 421 C A G G A G A T T T T G A C T T A T T T C C G T G G A T C T G A A T T A C A A A A T T A C T T T A C A A A G A T T C T A X74987 421 . . A ...... G . . . . . G ...... C ...... 8-14-27+His 421 ...... 6-5-2+His Anhang

490 500 510 520 530 540 ------+------+------+------+------+------+- 481 G A A G A T G A C C T A A A A G C C A T C A T C A A A C C T C A A T A T G T A G C C A G A T T C C T A A G G C T G G C A X74987 481 ...... A . C A G A . T . C T . A . G C T . . . 8-14-27+His 481 ...... A . C A G A . T . C T . A . A C T . . . 6-5-2+His 550 560 570 580 590 600 ------+------+------+------+------+------+- 541 A A G G G G A C A G T G G G A T C T A T T T T G G A C C G A A A A G A T G A A A C A A A G A C A C A G G C A A T T G T A X74987 541 ...... 8-14-27+His 541 ...... 6-5-2+His 610 620 630 640 650 660 ------+------+------+------+------+------+- 601 T G T C A G C A G C T T G A T T T A A C C C A C C T A A A A G A A C G A A A T G T T G A A G A T C T T T C A G G A G G A X74987 601 ...... 8-14-27+His 601 ...... 6-5-2+His 670 680 690 700 710 720 ------+------+------+------+------+------+- 661 G A G T T G C A G A G A T T T G C T T G T G C T G T C G T T T G C A T A C A G A A A G C T G A T A T T T T C A T G T T T X74987 661 ...... C ...... 8-14-27+His 661 ...... C ...... 6-5-2+His 730 740 750 760 770 780 ------+------+------+------+------+------+- 721 G A T G A G C C T T C T A G T T A C C T A G A T G T C A A G C A G C G T T T A A A G G C T G C T A T T A C T A T A C G A X74987 721 ...... 8-14-27+His 721 ...... 6-5-2+His 790 800 810 820 830 840 ------+------+------+------+------+------+- 781 T C T C T A A T A A A T C C A G A T A G A T A T A T C A T T G T G G T G G A A C A T G A T C T A A G T G T A T T A G A C X74987 781 ...... G . . . 8-14-27+His 781 ...... G . . . 6-5-2+His

850 860 870 880 890 900 ------+------+------+------+------+------+- 841 T A T C T C T C C G A C T T C A T C T G C T G T T T A T A T G G T G T A C C A A G C G C C T A T G G A G T T G T C A C T X74987 841 . . . . . G ...... 8-14-27+His 841 . . . . . G ...... 6-5-2+His

910 920 930 940 950 960 ------+------+------+------+------+------+- 901 A T G C C T T T T A G T G T A A G A G A A G G C A T A A A C A T T T T T T T G G A T G G C T A T G T T C C A A C A G A A X74987 901 ...... 8-14-27+His 901 ...... 6-5-2+His 970 980 990 1000 1010 1020 ------+------+------+------+------+------+- 961 A A C T T G A G A T T C A G A G A T G C A T C A C T T G T T T T T A A A G T G G C T G A G A C A G C A A A T G A A G A A X74987 124 961 ...... G ...... 8-14-27+His 961 ...... G ...... 6-5-2+His Anhang

1030 1040 1050 1060 1070 1080 ------+------+------+------+------+------+- 1021 G A A G T T A A A A A G A T G T G T A T G T A T A A A T A T C C A G G A A T G A A G A A A A A A A T G G G A G A A T T T X74987 1021 ...... G . . . 8-14-27+His 1021 ...... G ...... G . . . 6-5-2+His 1090 1100 1110 1120 1130 1140 ------+------+------+------+------+------+- 1081 G A G C T A G C A A T T G T A G C T G G A G A G T T T A C A G A T T C T G A A A T T A T G G T G A T G C T G G G G G A A X74987 1081 ...... 8-14-27+His 1081 ...... 6-5-2+His 1150 1160 1170 1180 1190 1200 ------+------+------+------+------+------+- 1141 A A T G G A A C G G G T A A A A C G A C A T T T A T C A G A A T G C T T G C T G G A A G A C T T A A A C C T G A T G A A X74987 1141 ...... 8-14-27+His 1141 ...... 6-5-2+His 1210 1220 1230 1240 1250 1260 ------+------+------+------+------+------+- 1201 G G A G G A G A A G T A C C A G T T C T A A A T G T C A G T T A T A A G C C A C A G A A A A T T A G T C C C A A A T C A X74987 1201 ...... 8-14-27+His 1201 ...... 6-5-2+His 1270 1280 1290 1300 1310 1320 ------+------+------+------+------+------+- 1261 A C T G G A A G T G T T C G C C A G T T A C T A C A T G A A A A G A T A A G A G A T G C T T A T A C T C A C C C A C A A X74987 1261 ...... G ...... T ...... 8-14-27+His 1261 ...... 6-5-2+His

1330 1340 1350 1360 1370 1380 ------+------+------+------+------+------+- 1321 T T T G T G A C C G A T G T A A T G A A G C C T C T G C A A A T T G A A A A C A T C A T T G A T C A A G A G G T G C A G X74987 1321 ...... A . . . . . G ...... C ...... 8-14-27+His 1321 ...... 6-5-2+His

1390 1400 1410 1420 1430 1440 ------+------+------+------+------+------+- 1381 A C A T T A T C T G G T G G T G A A C T A C A G C G A G T A C G T T T A C G C C T T T G C T T G G G C A A A C C T G C T X74987 1381 ...... G C . . . . G C ...... T ...... 8-14-27+His 1381 ...... G C . . . . G C ...... 6-5-2+His 1450 1460 1470 1480 1490 1500 ------+------+------+------+------+------+- 1441 G A T G T C T A T T T A A T T G A T G A A C C A T C T G C A T A T T T G G A T T C T G A G C A A A G A C T G A T G G C A X74987 1441 ...... C ...... 8-14-27+His 1441 ...... 6-5-2+His

1510 1520 1530 1540 1550 1560 ------+------+------+------+------+------+- 125 1501 G C T C G A G T T G T C A A A C G T T T C A T A C T C C A T G C A A A A A A G A C A G C C T T T G T T G T G G A A C A T X74987 1501 ...... A ...... 8-14-27+His 1501 ...... 6-5-2+His Anhang

1570 1580 1590 1600 1610 1620 ------+------+------+------+------+------+- 1561 G A C T T C A T C A T G G C C A C C T A T C T A G C G G A T C G C G T C A T C G T T T T T G A T G G T G T T C C A T C T X74987 1561 ...... C . . T ...... 8-14-27+His 1561 ...... C . . T ...... 6-5-2+His 1630 1640 1650 1660 1670 1680 ------+------+------+------+------+------+- 1621 A A G A A C A C A G T T G C A A A C A G T C C T C A A A C C C T T T T G G C T G G C A T G A A T A A A T T T T T G T C T X74987 1621 ...... C ...... 8-14-27+His 1621 ...... 6-5-2+His 1690 1700 1710 1720 1730 1740 ------+------+------+------+------+------+- 1681 C A G C T T G A A A T T A C A T T C A G A A G A G A T C C A A A C A A C T A T A G G C C A C G A A T A A A C A A A C T T X74987 1681 ...... T ...... 8-14-27+His 1681 ...... T ...... 6-5-2+His 1750 1760 1770 1780 1790 1800 ------+------+------+------+------+------+- 1741 A A T T C A A T T A A G G A T G T A G A A C A A A A G A A G A G T G G A A A C T A C T T T T T C T T G G A T G A T T A G X74987 1741 ...... G ...... C . 8-14-27+His 1741 ...... C . 6-5-2+His

1800 X74987 1801 A A G G G C A A T T C T G C A G A T A T C C A G C A C A G T G G C G G C C G C T C G A G T C T A G A G G G C C C G C G G 8-14-27+His 1801 A A G G G C A A T T C T G C A G A T A T C C A G C A C A G T G G C G G C C G C T C G A G T C T A G A G G G C C C G C G G 6-5-2+His

1800 X74987 1861 T T C G A A G G T A A G C C T A T C C C T A A C C C T C T C C T C G G T C T C G 8-14-27+His 1861 T T C G A A G G T A A G C C T A T C C C T A A C C C T C T C C T C G G T C T C G 6-5-2+His

Nachsequenzierung RLI-Plasmid von C. Bisbal (Bisbal et al., 1995) versus RLI-Sequenz NCBI Acc.nr. X74987

10 20 30 40 50 60 ------+------+------+------+------+------+- 1 A T G G C A G A C A A G T T A A C G A G A A T T G C T A T T G T C A A C C A T G A C A A A T G T A A A C C T A A G A A A X74987 1 ...... Bisbal-Plasmid 70 80 90 100 110 120 ------+------+------+------+------+------+- 61 T G T C G A C A G G A A T G C A A A A A G A G T T G T C C T G T A G T T C G A A T G G G A A A A T T A T G C A T A G A G X74987 61 ...... Bisbal-Plasmid 130 140 150 160 170 180 126 ------+------+------+------+------+------+- 121 G T T A C A C C C C A G A G C A A A A T A G C A T G G A T T T C C G A A A C T C T T T G T A T T G G T T G T G G T A T C X74987 121 ...... Bisbal-Plasmid Anhang

190 200 210 220 230 240 ------+------+------+------+------+------+- 181 T G T A T T A A G A A A T G C C C C T T T G G C G C C T T A T C A A T T G T C A A T C T A C C A A G C A A C T T G G A A X74987 181 ...... Bisbal-Plasmid 250 260 270 280 290 300 ------+------+------+------+------+------+- 241 A A A G A A A C C A C A C A T C G A T A T T G T G C C A A T G C C T T C A A A C T T C A C A G G T T G C C T A T C C C T X74987 241 ...... Bisbal-Plasmid 310 320 330 340 350 360 ------+------+------+------+------+------+- 301 C G T C C A G G T G A A G T T T T G G G A T T A G T T G G A A C T A A T G G T A T T G G A A A G T C A G C T G C T T T A X74987 301 ...... Bisbal-Plasmid 370 380 390 400 410 420 ------+------+------+------+------+------+- 361 A A A A T T T T A G C A G G A A A A C A A A A G C C A A A C C T T G G A A A G T A C G A T G A T C C T C C T G A C T G G X74987 361 ...... Bisbal-Plasmid 430 440 450 460 470 480 ------+------+------+------+------+------+- 421 C A G G A G A T T T T G A C T T A T T T C C G T G G A T C T G A A T T A C A A A A T T A C T T T A C A A A G A T T C T A X74987 421 ...... Bisbal-Plasmid 490 500 510 520 530 540 ------+------+------+------+------+------+- 481 G A A G A T G A C C T A A A A G C C A T C A T C A A A C C T C A A T A T G T A G C C A G A T T C C T A A G G C T G G C A X74987 481 ...... A . C A G A . T . C T . A . A C T . . . Bisbal-Plasmid 550 560 570 580 590 600 ------+------+------+------+------+------+- 541 A A G G G G A C A G T G G G A T C T A T T T T G G A C C G A A A A G A T G A A A C A A A G A C A C A G G C A A T T G T A X74987 541 ...... Bisbal-Plasmid

610 620 630 640 650 660 ------+------+------+------+------+------+- 601 T G T C A G C A G C T T G A T T T A A C C C A C C T A A A A G A A C G A A A T G T T G A A G A T C T T T C A G G A G G A X74987 601 ...... Bisbal-Plasmid 670 680 690 700 710 720 ------+------+------+------+------+------+- 661 G A G T T G C A G A G A T T T G C T T G T G C T G T C G T T T G C A T A C A G A A A G C T G A T A T T T T C A T G T T T X74987 661 ...... Bisbal-Plasmid 730 740 750 760 770 780 ------+------+------+------+------+------+- 721 G A T G A G C C T T C T A G T T A C C T A G A T G T C A A G C A G C G T T T A A A G G C T G C T A T T A C T A T A C G A X74987 721 ...... Bisbal-Plasmid 790 800 810 820 830 840 ------+------+------+------+------+------+- 127 781 T C T C T A A T A A A T C C A G A T A G A T A T A T C A T T G T G G T G G A A C A T G A T C T A A G T G T A T T A G A C X74987 781 ...... Bisbal-Plasmid Anhang

850 860 870 880 890 900 ------+------+------+------+------+------+- 841 T A T C T C T C C G A C T T C A T C T G C T G T T T A T A T G G T G T A C C A A G C G C C T A T G G A G T T G T C A C T X74987 841 ...... Bisbal-Plasmid 910 920 930 940 950 960 ------+------+------+------+------+------+- 901 A T G C C T T T T A G T G T A A G A G A A G G C A T A A A C A T T T T T T T G G A T G G C T A T G T T C C A A C A G A A X74987 901 ...... Bisbal-Plasmid 970 980 990 1000 1010 1020 ------+------+------+------+------+------+- 961 A A C T T G A G A T T C A G A G A T G C A T C A C T T G T T T T T A A A G T G G C T G A G A C A G C A A A T G A A G A A X74987 961 ...... Bisbal-Plasmid 1030 1040 1050 1060 1070 1080 ------+------+------+------+------+------+- 1021 G A A G T T A A A A A G A T G T G T A T G T A T A A A T A T C C A G G A A T G A A G A A A A A A A T G G G A G A A T T T X74987 1021 ...... Bisbal-Plasmid 1090 1100 1110 1120 1130 1140 ------+------+------+------+------+------+- 1081 G A G C T A G C A A T T G T A G C T G G A G A G T T T A C A G A T T C T G A A A T T A T G G T G A T G C T G G G G G A A X74987 1081 ...... Bisbal-Plasmid 1150 1160 1170 1180 1190 1200 ------+------+------+------+------+------+- 1141 A A T G G A A C G G G T A A A A C G A C A T T T A T C A G A A T G C T T G C T G G A A G A C T T A A A C C T G A T G A A X74987 1141 ...... Bisbal-Plasmid 1210 1220 1230 1240 1250 1260 ------+------+------+------+------+------+- 1201 G G A G G A G A A G T A C C A G T T C T A A A T G T C A G T T A T A A G C C A C A G A A A A T T A G T C C C A A A T C A X74987 1201 ...... Bisbal-Plasmid 1270 1280 1290 1300 1310 1320 ------+------+------+------+------+------+- 1261 A C T G G A A G T G T T C G C C A G T T A C T A C A T G A A A A G A T A A G A G A T G C T T A T A C T C A C C C A C A A X74987 1261 ...... Bisbal-Plasmid 1330 1340 1350 1360 1370 1380 ------+------+------+------+------+------+- 1321 T T T G T G A C C G A T G T A A T G A A G C C T C T G C A A A T T G A A A A C A T C A T T G A T C A A G A G G T G C A G X74987 1321 ...... Bisbal-Plasmid

1390 1400 1410 1420 1430 1440 ------+------+------+------+------+------+- 1381 A C A T T A T C T G G T G G T G A A C T A C A G C G A G T A C G T T T A C G C C T T T G C T T G G G C A A A C C T G C T X74987 1381 ...... G C . . . . G C ...... Bisbal-Plasmid

1450 1460 1470 1480 1490 1500 ------+------+------+------+------+------+- 128 1441 G A T G T C T A T T T A A T T G A T G A A C C A T C T G C A T A T T T G G A T T C T G A G C A A A G A C T G A T G G C A X74987 1441 ...... Bisbal-Plasmid Anhang

1510 1520 1530 1540 1550 1560 ------+------+------+------+------+------+- 1501 G C T C G A G T T G T C A A A C G T T T C A T A C T C C A T G C A A A A A A G A C A G C C T T T G T T G T G G A A C A T X74987 1501 ...... Bisbal-Plasmid 1570 1580 1590 1600 1610 1620 ------+------+------+------+------+------+- 1561 G A C T T C A T C A T G G C C A C C T A T C T A G C G G A T C G C G T C A T C G T T T T T G A T G G T G T T C C A T C T X74987 1561 ...... Bisbal-Plasmid 1630 1640 1650 1660 1670 1680 ------+------+------+------+------+------+- 1621 A A G A A C A C A G T T G C A A A C A G T C C T C A A A C C C T T T T G G C T G G C A T G A A T A A A T T T T T G T C T X74987 1621 ...... Bisbal-Plasmid 1690 1700 1710 1720 1730 1740 ------+------+------+------+------+------+- 1681 C A G C T T G A A A T T A C A T T C A G A A G A G A T C C A A A C A A C T A T A G G C C A C G A A T A A A C A A A C T T X74987 1681 ...... Bisbal-Plasmid 1750 1760 1770 1780 1790 1800 ------+------+------+------+------+------+- 1741 A A T T C A A T T A A G G A T G T A G A A C A A A A G A A G A G T G G A A A C T A C T T T T T C T T G G A T G A T T A G X74987 1741 ...... Bisbal-Plasmid

klonierte Plasmide sowie RLI-Plasmid von C. Bisbal (Bisbal et al., 1995) versus RLI-Sequenz NCBI Acc.nr. X74987

10 20 30 40 50 60 ------+------+------+------+------+------+- 1 A T G G C A G A C A A G T T A A C G A G A A T T G C T A T T G T C A A C C A T G A C A A A T G T A A A C C T A A G A A A X74987 1 ...... 8-14-27+His 1 ...... 6-5-2+His 1 ...... Bisbal-Pl.seq

70 80 90 100 110 120 ------+------+------+------+------+------+- 61 T G T C G A C A G G A A T G C A A A A A G A G T T G T C C T G T A G T T C G A A T G G G A A A A T T A T G C A T A G A G X74987 61 . . C ...... 8-14-27+His 61 . . C ...... 6-5-2+His 61 ...... Bisbal-Pl.seq 130 140 150 160 170 180 ------+------+------+------+------+------+- 121 G T T A C A C C C C A G A G C A A A A T A G C A T G G A T T T C C G A A A C T C T T T G T A T T G G T T G T G G T A T C X74987 121 ...... 8-14-27+His 121 ...... 6-5-2+His 121 ...... Bisbal-Pl.seq 190 200 210 220 230 240 ------+------+------+------+------+------+-

129 181 T G T A T T A A G A A A T G C C C C T T T G G C G C C T T A T C A A T T G T C A A T C T A C C A A G C A A C T T G G A A X74987 181 ...... C . . . . . 8-14-27+His 181 ...... C . . . . . 6-5-2+His Anhang

181 ...... Bisbal-Pl.seq 250 260 270 280 290 300 ------+------+------+------+------+------+- 241 A A A G A A A C C A C A C A T C G A T A T T G T G C C A A T G C C T T C A A A C T T C A C A G G T T G C C T A T C C C T X74987 241 ...... G ...... G ...... 8-14-27+His 241 ...... G ...... 6-5-2+His 241 ...... Bisbal-Pl.seq 310 320 330 340 350 360 ------+------+------+------+------+------+- 301 C G T C C A G G T G A A G T T T T G G G A T T A G T T G G A A C T A A T G G T A T T G G A A A G T C A G C T G C T T T A X74987 301 ...... T ...... A ...... 8-14-27+His 301 ...... 6-5-2+His 301 ...... Bisbal-Pl.seq 370 380 390 400 410 420 ------+------+------+------+------+------+- 361 A A A A T T T T A G C A G G A A A A C A A A A G C C A A A C C T T G G A A A G T A C G A T G A T C C T C C T G A C T G G X74987 361 ...... 8-14-27+His 361 ...... 6-5-2+His 361 ...... Bisbal-Pl.seq 430 440 450 460 470 480 ------+------+------+------+------+------+- 421 C A G G A G A T T T T G A C T T A T T T C C G T G G A T C T G A A T T A C A A A A T T A C T T T A C A A A G A T T C T A X74987 421 . . A ...... G . . . . . G ...... C ...... 8-14-27+His 421 ...... 6-5-2+His 421 ...... Bisbal-Pl.seq 490 500 510 520 530 540 ------+------+------+------+------+------+- 481 G A A G A T G A C C T A A A A G C C A T C A T C A A A C C T C A A T A T G T A G C C A G A T T C C T A A G G C T G G C A X74987 481 ...... A . C A G A . T . C T . A . G C T . . . 8-14-27+His 481 ...... A . C A G A . T . C T . A . A C T . . . 6-5-2+His 481 ...... A . C A G A . T . C T . A . A C T . . . Bisbal-Pl.seq

550 560 570 580 590 600 ------+------+------+------+------+------+- 541 A A G G G G A C A G T G G G A T C T A T T T T G G A C C G A A A A G A T G A A A C A A A G A C A C A G G C A A T T G T A X74987 541 ...... 8-14-27+His 541 ...... 6-5-2+His 541 ...... Bisbal-Pl.seq 610 620 630 640 650 660 ------+------+------+------+------+------+- 601 T G T C A G C A G C T T G A T T T A A C C C A C C T A A A A G A A C G A A A T G T T G A A G A T C T T T C A G G A G G A X74987 601 ...... 8-14-27+His 601 ...... 6-5-2+His 601 ...... Bisbal-Pl.seq 670 680 690 700 710 720 ------+------+------+------+------+------+- 661 G A G T T G C A G A G A T T T G C T T G T G C T G T C G T T T G C A T A C A G A A A G C T G A T A T T T T C A T G T T T X74987 130 661 ...... C ...... 8-14-27+His 661 ...... C ...... 6-5-2+His 661 ...... Bisbal-Pl.seq Anhang

730 740 750 760 770 780 ------+------+------+------+------+------+- 721 G A T G A G C C T T C T A G T T A C C T A G A T G T C A A G C A G C G T T T A A A G G C T G C T A T T A C T A T A C G A X74987 721 ...... 8-14-27+His 721 ...... 6-5-2+His 721 ...... Bisbal-Pl.seq

790 800 810 820 830 840 ------+------+------+------+------+------+- 781 T C T C T A A T A A A T C C A G A T A G A T A T A T C A T T G T G G T G G A A C A T G A T C T A A G T G T A T T A G A C X74987 781 ...... G . . . 8-14-27+His 781 ...... G . . . 6-5-2+His 781 ...... Bisbal-Pl.seq 850 860 870 880 890 900 ------+------+------+------+------+------+- 841 T A T C T C T C C G A C T T C A T C T G C T G T T T A T A T G G T G T A C C A A G C G C C T A T G G A G T T G T C A C T X74987 841 . . . . . G ...... 8-14-27+His 841 . . . . . G ...... 6-5-2+His 841 ...... Bisbal-Pl.seq 910 920 930 940 950 960 ------+------+------+------+------+------+- 901 A T G C C T T T T A G T G T A A G A G A A G G C A T A A A C A T T T T T T T G G A T G G C T A T G T T C C A A C A G A A X74987 901 ...... 8-14-27+His 901 ...... 6-5-2+His 901 ...... Bisbal-Pl.seq 970 980 990 1000 1010 1020 ------+------+------+------+------+------+- 961 A A C T T G A G A T T C A G A G A T G C A T C A C T T G T T T T T A A A G T G G C T G A G A C A G C A A A T G A A G A A X74987 961 ...... G ...... 8-14-27+His 961 ...... G ...... 6-5-2+His 961 ...... Bisbal-Pl.seq

1030 1040 1050 1060 1070 1080 ------+------+------+------+------+------+- 1021 G A A G T T A A A A A G A T G T G T A T G T A T A A A T A T C C A G G A A T G A A G A A A A A A A T G G G A G A A T T T X74987 1021 ...... G . . . 8-14-27+His 1021 ...... G ...... G . . . 6-5-2+His 1021 ...... Bisbal-Pl.seq ------+------+------+------+------+------+- 1081 G A G C T A G C A A T T G T A G C T G G A G A G T T T A C A G A T T C T G A A A T T A T G G T G A T G C T G G G G G A A X74987 1081 ...... 8-14-27+His 1081 ...... 6-5-2+His 1081 ...... Bisbal-Pl.seq 1150 1160 1170 1180 1190 1200 131 ------+------+------+------+------+------+- 1141 A A T G G A A C G G G T A A A A C G A C A T T T A T C A G A A T G C T T G C T G G A A G A C T T A A A C C T G A T G A A X74987 1141 ...... 8-14-27+His Anhang

1141 ...... 6-5-2+His 1141 ...... Bisbal-Pl.seq 1210 1220 1230 1240 1250 1260 ------+------+------+------+------+------+- 1201 G G A G G A G A A G T A C C A G T T C T A A A T G T C A G T T A T A A G C C A C A G A A A A T T A G T C C C A A A T C A X74987 1201 ...... 8-14-27+His 1201 ...... 6-5-2+His 1201 ...... Bisbal-Pl.seq 1270 1280 1290 1300 1310 1320 ------+------+------+------+------+------+- 1261 A C T G G A A G T G T T C G C C A G T T A C T A C A T G A A A A G A T A A G A G A T G C T T A T A C T C A C C C A C A A X74987 1261 ...... G ...... T ...... 8-14-27+His 1261 ...... 6-5-2+His 1261 ...... Bisbal-Pl.seq 1330 1340 1350 1360 1370 1380 ------+------+------+------+------+------+- 1321 T T T G T G A C C G A T G T A A T G A A G C C T C T G C A A A T T G A A A A C A T C A T T G A T C A A G A G G T G C A G X74987 1321 ...... A . . . . . G ...... C ...... 8-14-27+His 1321 ...... 6-5-2+His 1321 ...... Bisbal-Pl.seq 1390 1400 1410 1420 1430 1440 ------+------+------+------+------+------+- 1381 A C A T T A T C T G G T G G T G A A C T A C A G C G A G T A C G T T T A C G C C T T T G C T T G G G C A A A C C T G C T X74987 1381 ...... G C . . . . G C ...... T ...... 8-14-27+His 1381 ...... G C . . . . G C ...... 6-5-2+His 1381 ...... G C . . . . G C ...... Bisbal-Pl.seq 1450 1460 1470 1480 1490 1500 ------+------+------+------+------+------+- 1441 G A T G T C T A T T T A A T T G A T G A A C C A T C T G C A T A T T T G G A T T C T G A G C A A A G A C T G A T G G C A X74987 1441 ...... C ...... 8-14-27+His 1441 ...... 6-5-2+His 1441 ...... Bisbal-Pl.seq 1510 1520 1530 1540 1550 1560 ------+------+------+------+------+------+- 1501 G C T C G A G T T G T C A A A C G T T T C A T A C T C C A T G C A A A A A A G A C A G C C T T T G T T G T G G A A C A T X74987 1501 ...... A ...... 8-14-27+His 1501 ...... 6-5-2+His 1501 ...... Bisbal-Pl.seq

1570 1580 1590 1600 1610 1620 ------+------+------+------+------+------+- 1561 G A C T T C A T C A T G G C C A C C T A T C T A G C G G A T C G C G T C A T C G T T T T T G A T G G T G T T C C A T C T X74987 1561 ...... C . . T ...... 8-14-27+His 1561 ...... C . . T ...... 6-5-2+His 1561 ...... Bisbal-Pl.seq 132 1630 1640 1650 1660 1670 1680 ------+------+------+------+------+------+- Anhang

1621 A A G A A C A C A G T T G C A A A C A G T C C T C A A A C C C T T T T G G C T G G C A T G A A T A A A T T T T T G T C T X74987 1621 ...... C ...... 8-14-27+His 1621 ...... 6-5-2+His 1621 ...... Bisbal-Pl.seq 1690 1700 1710 1720 1730 1740 ------+------+------+------+------+------+- 1681 C A G C T T G A A A T T A C A T T C A G A A G A G A T C C A A A C A A C T A T A G G C C A C G A A T A A A C A A A C T T X74987 1681 ...... T ...... 8-14-27+His 1681 ...... T ...... 6-5-2+His 1681 ...... Bisbal-Pl.seq 1750 1760 1770 1780 1790 1800 ------+------+------+------+------+------+- 1741 A A T T C A A T T A A G G A T G T A G A A C A A A A G A A G A G T G G A A A C T A C T T T T T C T T G G A T G A T T A G X74987 1741 ...... G ...... C . 8-14-27+His 1741 ...... C . 6-5-2+His 1741 ...... Bisbal-Pl.seq

133 Anhang Aminsoäuresequenz klonierte Plasmide mit aktivem His-Tag sowie RLI-Plasmid von C. Bisbal (Bisbal et al., 1995) versus RLI-Sequenz NCBI Acc.nr. X74987

MADK1...LTRIAVNHDK...CKPRQECK...KSCPVRMGKL...CIEVTPQSKAW...IS.ETLCGGI..X749878-14-27+His6-5-2+HisBisbal-Pl.seq

CIKK181...KLA361CPFGALSIVNL...KQNYDPSNLEKTHR...DWQITYYCANFKLHRL.R..GSEQFTPIRGEVLLV...KDAIKGT.PQNIKSAAL..YVRFLLADA.X749878-14-27+His6-5-2+HisBisbal-Pl.seq

...361...... DQIPKT.8-14-27+His6-5-2+His

...361KGTV541DEPS721...GSILDRKETKYVQKA...TQAIVCLDLRSNPD...THLKERNVDLYIDLS...SGELQRFACAVVDYICL.VCYGDQIPKT.AFMF..SVTBisbal-Pl.seqX749878-14-27+His6-5-2+His

...721...... 6-5-2+His

721MPFS901...VREGINFLDG...YVPTENLRFRD...ASLVFKETA...NEVKMCYK...YP.GMKEF..Bisbal-Pl.seqX749878-14-27+His6-5-2+His

ELAI1081...TGSV1261VAGEFTDSIM...RQLHKIDAVMLGENTKT...YHPQFDVMTFIRMLAGLK...KPQENDQPDEGVLNV...QTSQRSY.VRAKPQIKS..LCGPAX749878-14-27+His6-5-2+HisBisbal-Pl.seq

1261...... A..8-14-27+His6-5-2+HisBisbal-Pl.seq

DVYL1441...KNTV1621IDEPSAYLSE...NQTGMQRLMAVKR...NKFSEITFFILHAKTFV...RDPNYRIVEHDFIMATYLA...NKLSQKDR.KSVIFGPS..NYLD..SX749878-14-27+His6-5-2+HisBisbal-Pl.seq

......

1621 1798KGNS1801 ADIQHSGRSS LEGPRFKPI PNLGDSTR TGH.V ...Bisbal-Pl.seqX749878-14-27+His6-5-2+His

1 M A D K L T R I A I V N H D K C K P K K C R Q E C K K S C P V V R M G K L C I E V T P Q S K I A W I S E T L C I G C G I X74987 1 ...... 8-14-27+His 1 ...... 6-5-2+His 1 ...... Bisbal-Pl.seq 181 C I K K C P F G A L S I V N L P S N L E K E T T H R Y C A N A F K L H R L P I P R P G E V L G L V G T N G I G K S A A L X74987 181 ...... R ...... T . . 8-14-27+His 181 ...... 6-5-2+His 181 ...... Bisbal-Pl.seq 361 K I L A G K Q K P N L G K Y D D P P D W Q E I L T Y F R G S E L Q N Y F T K I L E D D L K A I I K P Q Y V A R F L R L A X74987 361 ...... D Q I P K A . 8-14-27+His 361 ...... D Q I P K T . 6-5-2+His 361 ...... D Q I P K T . Bisbal-Pl.seq 541 K G T V G S I L D R K D E T K T Q A I V C Q Q L D L T H L K E R N V E D L S G G E L Q R F A C A V V C I Q K A D I F M F X74987 541 ...... 8-14-27+His 541 ...... 6-5-2+His 541 ...... Bisbal-Pl.seq 721 D E P S S Y L D V K Q R L K A A I T I R S L I N P D R Y I I V V E H D L S V L D Y L S D F I C C L Y G V P S A Y G V V T X74987 721 ...... 8-14-27+His 721 ...... 6-5-2+His 721 ...... Bisbal-Pl.seq 901 M P F S V R E G I N I F L D G Y V P T E N L R F R D A S L V F K V A E T A N E E E V K K M C M Y K Y P G M K K K M G E F X74987 901 ...... 8-14-27+His 901 ...... 6-5-2+His 901 ...... Bisbal-Pl.seq 1081 E L A I V A G E F T D S E I M V M L G E N G T G K T T F I R M L A G R L K P D E G G E V P V L N V S Y K P Q K I S P K S X74987 1081 ...... 8-14-27+His 1081 ...... 6-5-2+His 1081 ...... Bisbal-Pl.seq 1261 T G S V R Q L L H E K I R D A Y T H P Q F V T D V M K P L Q I E N I I D Q E V Q T L S G G E L Q R V R L R L C L G K P A X74987 1261 ...... A . A ...... 8-14-27+His 1261 ...... A . A ...... 6-5-2+His 1261 ...... A . A ...... Bisbal-Pl.seq

1441 D V Y L I D E P S A Y L D S E Q R L M A A R V V K R F I L H A K K T A F V V E H D F I M A T Y L A D R V I V F D G V P S X74987 1441 ...... 8-14-27+His 1441 ...... 6-5-2+His 1441 ...... Bisbal-Pl.seq 1621 K N T V A N S P Q T L L A G M N K F L S Q L E I T F R R D P N N Y R P R I N K L N S I K D V E Q K K S G N Y F F L D D . X74987 1621 ...... S 8-14-27+His 134 1621 ...... S 6-5-2+His 1621 ...... Bisbal-Pl.seq Anhang

1798 X74987 1801 K G N S A D I Q H S G G R S S L E G P R F E G K P I P N P L L G L D S T R T G H H H H H H . 8-14-27+His 1801 K G N S A D I Q H S G G R S S L E G P R F E G K P I P N P L L G L D S T R T G H H H H H H . 6-5-2+His 1798 Bisbal-Pl.seq 135 8. Danksagung

Mein Dank geht zunächst an PD Dr. rer. nat. Andreas Dotzauer für die Bereitstellung dieses interessanten Themas und seiner Diskussionsbereitschaft und Unterstützung bei Fragen und Problemen. Danken möchte ich der QIAGEN Hamburg GmbH (ehemals artus GmbH) für die Stellung meines Arbeitsplatzes, was mir diese Arbeit und die vielen Erfahrungen sowohl in der Wirtschaft als auch in der Wissenschaft überhaupt erst ermöglicht hat.

Vielen Dank an alle Mitarbeiter der Qiagen Hamburg GmbH, in der ein supernettes Arbeitsklima herrscht und ich mich immer wohlgefühlt habe. Danke für die vielen Gespräche auf dem Flur und gemeinsame Kaffee- und Mittagspausen. Mein ganz persönlicher und besonderer Dank geht an Dr. Meike Eickhoff, die trotz eigenem vollen Terminplan immer ein offenes Ohr für meine Fragen und Probleme hatte.

Mein besonderer Dank geht auch an Oliver Janssen-Weets, für die gute Zusammenarbeit und die ständige Hilfsbereitschaft bei allen Fragen und Unklarheiten. Für die baldige Beendigung seiner Doktorarbeit wünsche ich ihm ganz viel Glück und Erfolg.

Nicht zuletzt geht mein Dank natürlich auch an meine Freunde und meine Familie, die mich all die Jahre unterstützt haben und mir dadurch diese Arbeit ermöglicht haben.

Ein ganz persönlicher Gruß geht an die Menschen, die mir in meinem Leben sehr viel bedeutet haben, aber diesen Lebensabschnitt leider nicht mehr miterleben dürfen. Oma, Opa, Tante Inge – ich hab euch nicht vergessen

136 9. Publikationsliste

Günther, S., Asper, M., Röser, C., Luna, L. K., Drosten, C., Becker-Ziaja, B., Borowski, P., Chen, H.M. & Hosmane R.S. (2004). Application of real-time PCR for testing antiviral compounds against Lassa virus, SARS coronavirus and Ebola virus in vitro. Antiviral Research. 63, 209-215

Posterbeiträge:

Röser, C., Asper, M., Borowski, P. & Günther, S. (2003). Cell culture system für screening antiviral compounds against Lassa virus. Kongress der Gesellschaft für Virology e.V.

Röser, C., Laue, T. & Dotzauer, A. (2005). Cloning of the RNase L inhibitor (RLI) for manipulation of the 2’-5’oligoadenylate synthetase (OAS) assay in virus infected cells. Kongress der Gesellschaft für Virology e.V.

137 10. Lebenslauf

Persönliche Daten Name Christina Röser Anschrift Münchener Strasse 150 28215 Bremen geboren am 07.07.1978 in Erfurt

Familienstand ledig

Schulausbildung 09.1985 – 08.1991 Grundschule Erfurt 09.1991 – 07.1997 Kooperative Gesamtschule am Schwemmbach Erfurt Abschluß: Abitur (Notendurchschnitt 1,9)

Hochschulstudium 10.1997 - 06.2003 Biologiestudium an der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster Diplomarbeit am Bernhard-Nocht-Institut Hamburg Thema: „Etablierung eines Zellkultursystems und Testung potentieller Inhibitoren des Lymphocytären Choriomeningitis Virus und Lassa-Virus“ Abschluss: Diplom (Notendurchschnitt 1,6)

Praktika 17.09.2001 – 31.10.2001 Praktikum am Bernhard-Nocht-Institut Hamburg

Thema: „Untersuchung zur bakteriellen Expression und Aufreinigung von Nukleoprotein und Polymerase des Lassa-Virus“

Berufliche Weiterbildung 01.05.2003 - 30.6.2003 Promotionsstudium an der Universität Gießen seit 01.07.2003 Promotionstudent bei der artus GmbH Hamburg in Kooperation mit der Universität Bremen Abt. Virologie (1.10.2005 Umbenennung der artus GmbH Hamburg in Qiagen Diagnostics Hamburg)

Fremdsprachen Englisch

Weiterbildung 10.-11.10.2005 Ausbildung zum Ersthelfer/Betriebshelfer

138 11. Erklärung

Hiermit erkläre ich nach §6 (5) der Promotionsordnung,

1) die Arbeit ohne unerlaubte fremde Hilfe angefertig zu haben.

2) keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt zu haben.

3) die den benutzen Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht zu haben.

Ort, Datum Unterschrift

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