Bc. Roman Gogela

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie

CHARAKTERIZACE REPETITIVNÍCH SEKVENCÍ U RODU ALLIUM

Diplomová práce

Bc. Roman Gogela

VEDOUCÍ PRÁCE: Mgr. Martina Dvořáčková, Ph.D. Brno 2014

Bibliografický záznam

Autor: Bc. Roman Gogela Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie

Název práce: Charakterizace repetitivních sekvencí u rodu Allium

Studijní program: Experimentální biologie

Studijní obor: Molekulární biologie a genetika

Vedoucí práce: Mgr. Martina Dvořáčková, Ph.D.

Akademický rok: 2013/2014

Počet stran: 117 + 6 stran příloh

Klíčová slova: Allium, Asparagales, GISH, rDNA, repetitivní sekvence, telomery

Bibliographic Entry

Author: Bc. Roman Gogela Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology

Title of Thesis: Characterisation of repetitive sequences in genus Allium

Degree programme: Experimental Biology

Field of Study: Molecular Biology and Genetics

Supervisor: Mgr. Martina Dvořáčková, Ph. D.

Academic Year: 2013/2014

Number of Pages: 117 + 6 pages of appendix

Keywords: Allium, Asparagales, GISH, rDNA, repetitive sequences, telomeres

Abstrakt

Telomery jsou neodmyslitelnou součástí lineárních chromozomů eukaryotických buněk a struktury jim podobné můžeme nalézt i u lineárních chromozomů buněk prokaryotických. Tyto obvykle tandemové repetice nejen kompenzují erozi chromozomů vyvolanou neúplnou replikací, ale zároveň udržují cytogenetickou stabilitu genomu a jsou i regulátory dělivého potenciálu buněk. Od objevu první telomerické sekvence a mechanismu udržování telomer založeném na aktivitě RNA-dependentní DNA-polymerázy (telomerázy) bylo popsáno několik variant „klasické“ telomerické sekvence. Byla také zjištěna existence organismů s telomerami tvořenými jinými sekvencemi a závislými na jiném mechanismu udržování jejich délky. Stále však existují organismy, u kterých není telomerická sekvence známa. Jedněmi z nich jsou zástupci rodu Allium. Diplomové práce je zaměřena na studium lokalizace 45S rDNA a jejích strukturních podjednotek na chromozomech evolučně vzdálených zástupců rodu Allium ve vztahu k předpokládané telomerické úloze této sekvence u zmíněného rodu a dále pak na studium dalších kandidátních sekvencí. Byla provedena i genomová in situ hybridizace mezi modelovými druhy s cílem zjistit, zda sdílí společnou telomerickou sekvenci. Na základě zjištěných výsledků nelze potvrdit telomerickou roli testovaných kandidátních sekvencí. Vzhledem k lokalizaci 45S rDNA lokusů však existuje i nadále možnost, že tato sekvence tvoří telomeru chromozomů, na kterých je lokalizována, případně je zahrnuta v mechanismu jejich udržování. Důležitým zjištěním je objev doposud neznámé sekvence lokalizované na všech koncích chromozomů A. ursinum a sdílené s A. cepa. S velkou pravděpodobností se jedná o sekvenci telomerickou.

Abstract

Telomeres are important parts of linear chromosomes of eukaryotic cells and similar structures can be found at the ends of linear chromosomes of prokaryotic cells too. Telomeres are usually formed as tandem repeats that protect chromosomes against shortening caused by DNA replication. According to their localization, telomeres are involved in the maintenance of genome stability and regulation of cell proliferation capability. Since discovery of the first telomeric sequence and the mechanism of telomere lenght maintenance based on RNA-dependent DNA-polymerase (telomerase), several variants of „classical“ telomeric sequences have been described. Organisms with telomeres formed by other sequences and with different telomere length maintenance were detected. There are still organisms with unknown telomeric sequences, one of them are members of genus Allium. In this thesis, we have studied the localization of 45S rDNA and its subunits in selected species of genus Allium according to predicted role of 45S rDNA as telomeres in this genus. In the following steps, other candidate sequences were tested and genomic in situ hybridization between model species has been done. Based on the acquired results, we were not able to confirm role of the selected candidate sequences as a telomeric sequence within the tested plants from genus Allium According to the localization of the 45rDNA, it is possible that this sequence plays the role of a telomere within these localities, and probably can be involved in the telomere length maintenance process. An important result was the founding of a new sequence which is located on all of the telomeric ends of A. ursinum chromosomes and shared with A. cepa. Probably this sequence is of telomeric origin.

Poděkování

Na tomto místě bych rád poděkoval své vedoucí diplomové práce Mgr. Martině

Dvořáčkové, Ph. D. za odborné vedení, podporu a čas, který mi ochotně věnovala po celou dobu řešení mé diplomové práce.

Dále bych chtěl poděkovat Mgr. Vratislavu Peškovi, Ph. D. za možnost podílet se na projektu studia telomer rodu Allium a odborné rady a konzultace, které mi napomohly osvojit si danou problematiku. V neposlední řadě patří mé velké poděkování také Mgr. Terezii Mandákové, Ph. D. za cenné teoretické i praktické rady na poli rostlinné cytogenetiky. Závěrem chci poděkovat všem kolegů a kolegyním z Oddělení funkční genomiky a proteomiky, se kterými jsem měl čest pracovat, zvláště pak prof. RNDr. Jiřímu Fajkusovi, Csc.

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 14. května 2014 ……………………………… Bc. Roman Gogela

Obsah

1. Úvod ...... 13 2. Teoretický úvod ...... 14 2.1. Rod Allium ...... 14 2.1.1. Fylogenetické zařazení ...... 14 2.1.2. Morfologické znaky ...... 14 2.1.3. Oblast rozšíření ...... 15 2.1.4. Charakteristika genomu ...... 16 2.2. Klasické telomery ...... 19 2.2.1. Počátky studia telomer...... 19 2.2.2. Odhalení struktury telomer a mechanismu jejich udržování ...... 20 2.2.3. Čtyři základní charakteristiky „klasických telomer“...... 21 2.3. Neobvyklé telomery ...... 26 2.3.1. Telomerický systém Drosophila ...... 26 2.3.2. Telomery typu Chironomus ...... 29 2.3.3. Telomery typu Rhynchosciara...... 33 2.3.4. Alternativní způsoby udržování telomer u kvasinek ...... 33 2.4. Záhada telomer rodu Allium ...... 37 2.5. Ribosomální DNA (rDNA) ...... 44 2.5.1. Struktura rDNA a sekvenční konzervovanost ...... 44 2.5.2. 45S rDNA u rodu Allium ...... 46 3. Cíle diplomové práce: ...... 48 4. Materiál a metody: ...... 49 4.1. Seznam použitých roztoků: ...... 49 4.2. Materiál: ...... 50 4.2.1. Modelové organismy: ...... 50 4.2.2. Genetický materiál: ...... 50 4.3. Metody: ...... 51 4.3.1. Příprava sond: ...... 51 4.3.2. Příprava preparátů: ...... 56 5. Výsledky: ...... 62 5.1. Lokalizace 45S rDNA u A. ursinum ...... 62 5.2. Genomová in situ hybridizace (GISH) ...... 71 5.3. Lokalizace 45S rDNA a A. cepa ...... 75 5.4. Lokalizace kandidátních telomerických sekvencí na chromozomech Allium cepa ...... 80 6. Diskuze ...... 84 6.1. Telomery rodu Allium ...... 84 6.1.1. Hypotézy plynoucí z literatury ...... 84 6.1.2 Role 45S rDNA při formování telomer rodu Allium ...... 85 6.1.3. GISH A. cepa a A. ursinum – společná telomerická sekvence? ...... 86 6.1.4. Kandidátní telomerické sekvence – vyhodnocení a možnosti jejich predikce ...... 88 6.2. Variabilita v délce IGS oblasti sekvence 45S rDNA A. ursinum ...... 90 6.3. Variabilita v počtu lokusů 45S rDNA A. cepa a A. ursinum ...... 91 7. Souhrn ...... 93 8. Summary ...... 94 9. Literatura ...... 95

Seznam zkratek

ALT Alternative lengthening of telomeres APG Angiosperm phylogeny group BAC Bacterial artificial chromosome ETS External transcribed spacer FISH Fluorescenční in situ hybridizace gDNA Genomová DNA GISH Genomová in situ hybridizace HAATI Heterochromatin amplification-mediated and telomerase-independent IGS Intergenic spacer ITS Internal transcribed spacer LINE Long interspersed elements non-LTR Non-long terminal repeats NOR Nucleolus organizer region NTS Non-transcribed spacer rDNA Ribosomální DNA RPM Revolutions per minute (otáčky za minutu) SINE Short interspersed elements TER Telomerase RNA TERT Telomerase reverse transcriptase WCSP World Checklist of Selected Plant Families

1. Úvod

Rostliny z rodu Allium (česnek) patří mezi významné kulturní plodiny. Více než dvacet druhů, jako je cibule (Allium cepa), česnek (Allium sativum), pórek (Allium porrum) nebo pažitka (Allium schoeneprasum, Allium tuberosum), je pěstováno, ať už celosvětově či pouze lokálně. Další druhy, jako je například česnek medvědí (Allium ursinum), jsou hojně používané pro vysoký obsah léčivých látek v přírodní medicíně a v neposlední řadě jsou v této skupině hojně zastoupeny i druhy okrasné. Tento druhově velmi bohatý rod však není důležitý pouze z ekonomického hlediska, ale někteří jeho zástupci mají nepopiratelný význam při studiu různých odvětví biologie, především pak v cytogenetice. Allium cepa je jedním z klasických cytogenetických modelových organismů a Allium schorodoprasum bylo po dlouhou dobu využíváno ke studiu B chromosomů. Některé druhy jsou často spojovány s léčbou či prevencí některých onemocnění, proto není divu, že neunikly zájmu moderní medicíny. Druhy jako Allium sativa, Allium macrostemon, nebo Allium victorialis jsou v současnosti studovány s ohledem na jejich farmaceutické využití, převážně kvůli antimikrobiálním, antioxidačním a protinádorovým vlastnostem látek, které syntetizují. Ve své práci se však chci zaměřit na jiný fenomén, který je s těmito rostlinami spojen, a to na doposud nevyjasněnou strukturu jejich telomer. Skutečnost, že telomery těchto rostlin nejsou tvořeny žádnou z doposud známých telomerických sekvencí, byla poprvé popsána v roce 1995, avšak zatím žádná následná studie nepodala uspokojivou odpověď na otázku, o jakou sekvenci se v případě telomer u rostlin rodu Allium jedná. Cílem této práce je proto shrnout dosavadní poznatky o studiu této problematiky a zodpovědět tuto otázku, případně naznačit směr, kterým by se studium struktury telomer u rostlin rodu Allium mohlo dále ubírat.

2. Teoretický úvod 2.1. Rod Allium 2.1.1. Fylogenetické zařazení Rod Allium (česnek) v sobě sdružuje přibližně 900 druhů (WCSP 2012 - World Checklist of Selected Plant Families), (Memariani et al., 2012), což z něj činí jeden z nejrozsáhlejších rodů v rámci celé třídy jednoděložných rostlin (Li et al., 2010). Přesný počet zástupců tohoto rodu je však obtížné určit, neboť různé publikace uvádějí odlišné údaje a jsou popisovány stále nové druhy, čehož příkladem je Allium aladaghense (Memariani et al., 2012). Na území České republiky se v současné době volně vyskytuje přibližně dvacet druhů (Krahulec a Duchoslav, 2010). Fylogenetické zařazení tohoto rodu, i jeho vnitřní členění, bylo v posledních dvou desetiletích několikrát upravováno. Podle Angiosperm Phylogeny Group (APG) III systému spadá rod Allium do skupiny Allieae, která společně se skupinami Gilliesieae a Tulbaghieae vytváří podčeleď Allioideae (Chase et al., 2009). Ta nahradila původně samostatnou čeleď Alliaceae, jež byla nově sloučena s čeledí Agapanthaceae (kalokvětové) a s čeledí Amaryllidaceae (amarylkovité), pod kterou podle současného fylogenetického členění podčeleď Allioideae spadá. Čeleď Amaryllidaceae se dále řadí do řádu Asparagales (chřestotvaré), který je součástí třídy Liliopsida, někdy označované též jako Monocotyledonae (jednoděložné rostliny), (viz Příloha 1 a 2), (Bremer et al., 2009). Jelikož se jedná o rod druhově velmi bohatý, je i jeho vnitřní členění poměrně komplikované a není stále úplně dořešeno. Obecně je přijímán model, kdy je rod Allium členěn do tří kladů, které společně obsahují patnáct podrodů. Ty jsou dále rozděleny do sekcí, kterých je sedmdesát pět (viz Příloha 3), (Friesen et al., 2006; Li et al., 2010).

2.1.2. Morfologické znaky Rostliny, které do rodu Allium spadají, jsou obvykle charakterizovány jako vytrvalé byliny s cibulemi, jež přisedají na krátký oddenek. Ten může být u některých druhů redukován na pouhé podpučí. Cibule mohou být jednotlivé nebo nahloučené. Listy jsou přízemní, přisedlé nebo řapíkaté, často vytváří pochvu, která kryje spodní část stvolu. Uspořádání listů může být střídavé, dvouřadé, nebo šroubovicovité, čepel je nitkovitá, trubkovitá nebo plochá, čárkovitá až vejčitá, celokrajná, pouze vzácně se na okrajích vyskytují drobné zuby. Stvoly jsou oblé až hranaté, plné, nebo duté.

Květenstvím bývá zpravidla lichookolík (zvaný též šroubel), který je zprvu plně uzavřen v toulci. Okvětní lístky jsou vytrvávající, volné, nebo srostlé na bázi. Tvarově jsou dosti variabilní a vyskytují se vždy v počtu šesti. Květy jsou oboupohlavné, zpravidla se šesti tyčinkami, které jsou volné, případně na bázi rourkovitě srostlé, a mohou být přirostlé k bázi okvětí. Gyneceum je synkarpní, vzniklé ze tří plodolistů, semeník je svrchní. Jediná čnělka je gynobázická, blizna paličkovitá, nebo trojlaločná. Přestože mají oboupohlavné květy, jsou rostliny z rodu Allium cizosprašné (allogamní). Opylení probíhá pomocí hmyzu (hmyzosnubnost, entomogamie) a proti samosprášení (autogamii) jsou rostliny chráněny proterandrií, kdy pylová zrna dozrávají dříve, než dozrává pestík. Plodem je tobolka se třemi pouzdry, z nichž každé obsahuje 1-2 (i více) černá semena. Ta jsou trojhranná, nebo zmáčklá, pouze vzácně kulovitá (Mártonfi, 2007; Krahulec a Duchoslav, 2010). Jednou z dalších výrazných charakteristik tohoto rodu je obsah dráždivých látek s charakteristickým zápachem. Tyto sloučeniny na bázi alkenyl-cysteinsulfoxidů jsou v reakci na mechanický podnět enzymaticky měněny na diaalkenyl-thiosulfináty a dále na dialkenyl- sulfidy, případně různé alifatické či cyklické disulfidy, případně polysulfidy a jejich oxidované deriváty. Tyto látky mají primárně ekologickou funkci, protože slouží jako signální látky v symbióze s jinými druhy, ale pro člověka jsou důležité hlavně z farmakologického a nutraceutického hlediska. Nutriční význam těchto rostlin je ještě navýšen přítomností flavonoidů, aminokyselin, vitamínů, stopových prvků a antioxidantů (Stajner et al., 2008).

2.1.3. Oblast rozšíření Přirozený areál výskytu rodu Allium pokrývá holoarktickou oblast Eurasie a Severní Ameriky od subtropů až po severský jehličnatý les (tajgu). Nejseverněji popsaným druhem je Allium schoenoprasum, které se divoce vyskytuje i v subarktickém pásu. Za jižní hranici rozšíření se obecně považují oblasti severní Afriky (oblast Středozemního moře či horské oblasti Etiopie), (Fritsch a Friesen, 2002). Na jižní polokouli se vyskytuje pouze jediný zástupce, a to Allium dregeanum, jehož domovinou je Jihoafrická republika (De Sarker et al., 1997). Byly popsány dvě oblasti s výraznou druhovou variabilitou, které by mohly naznačovat původní domovinu tohoto rodu. První z nich je pás táhnoucí se od Středozemního moře přes centrální Asii až po Pákistán, druhá, méně výrazná, je situována v západní oblasti Severní Ameriky. Přestože většina druhů preferuje otevřená, slunná a spíše sušší stanoviště v oblastech suchého, případně mírně vlhkého klimatu, byly tyto rostliny schopny přizpůsobit

15 se mnoha různým typům ekosystémů a někteří zástupci tohoto rodu mohou tolerovat i poměrně slané prostředí a zásadité půdy (Fritsch a Friesen, 2002). Právě schopnost přizpůsobit se různým podmínkám, stejně jako vysoká různorodost v životních cyklech mezi jednotlivými druhy, může vést ke komplikacím s jejich kultivací, které jsem ostatně pozoroval i během vlastní práce.

2.1.4. Charakteristika genomu Velikost genomu rostlin rodu Allium, posuzovaná podle množství DNA obsažené v diploidním jádře jedné buňky (označováno jako hodnota 2C) (Swift, 1950), se pohybuje od 15,3 pg u Allium schoenoprasum po 70,80 pg u Allium siculum (Bennett et al., 2000a), což při obecně platném převodu 0,1 pg = 100 Mb činí přibližné rozpětí 17 až 70 Gb na diploidní genom. Například u Allium cepa se uvádí hodnota 2C = 33,2 pg, resp. 32,94 Gb. Mezi jednotlivými varietami tato hodnota lehce kolísá, ale nijak výrazně (Bennett et al., 2000b). Pro srovnání, u člověka hodnota 2C = 6,22 pg, u myši (Mus musculus) 2C = 6,08 pg a například u kura domácího 2C = 2,32 pg (Greilhuber et al., 1983). Při srovnání se zástupci rostlinné říše zjistíme, že například genom Arabidopsis thaliana, ekotyp Columbia, má velikost pouze 2C = 0,321 pg, resp. 312 Mb, ale u Fritillaria crassifolia najdeme genom o velikosti 2C = 133 pg, resp. 130 Gb (Bennett a Leitch, 2011). V současnosti je rostlinou s největším doposud popsaným genomem Trillium hagae s 2C = 264,9 pg (Zonneveld, 2010). Při tomto srovnání je zohledněn i různý stupeň ploidie, která se v rámci rodu pohybuje od 2x po 16x (Ricroch et al., 2005). Proto se ve studiích, které jsou výše citovány, u polyploidních druhů hodnota 2C přepočítává tak, aby odpovídala pouze diploidnímu genomu a bylo možné tyto hodnoty mezi sebou porovnávat. U polyploidních druhů pak může celková velikost genomu dosáhnout výrazně vyšších hodnot. Příkladem je Allium vallidum, oktaploidní druh s 56 chromozomy, jehož jaderný genom (bez korelace ploidie) má velikost 148,9 pg (Bennett a Leitch, 1997). Poměrný obsah repetitivních sekvencí vůči celkové velikosti genomu u zástupců tohoto rodu byl naposledy publikován v 70. let 20. století a je jistě zajímavé, že údaje zjištěné pomocí metody renaturační (reasociační) kinetiky ukazují zastoupení repetitivních sekvencí jen v rozsahu 44 – 65 % (Ranjekar et al., 1978). To, v porovnání s údaji o rostlinách s menšími genomy, jako je například rýže (Oryza sativa) s genomem o velkosti 2C = 1,2 pg (1,14 Gb) a obsahem repetitivních sekvencí pohybujícím se v závistlosti na poddruhu mezi 42 a 45 % (Goff et al., 2002; Yu et al., 2002; Bennett a Leitch, 2011), nebo kukuřice (Zea mays),

16 jejíž genom má velikost 2C = 5,9 pg (5,8 Gb) a je ze 77 % tvořen repetitivními sekvencemi (Meyers et al., 2001; Bennett a Leitch, 2011), ukazuje, že ani tak rozsáhlé genomy nemusí vykazovat enormní výskyt repetitivních sekvencí. To potvrzují i další závěry studie citované v úvodu tohoto odstavce, neboť nárůst velikosti genomu u zkoumaných druhů rodu Allium nekorespondoval vždy s nárůstem zastoupení repetitivních sekvencí (Ranjekar et al., 1978). Byly však publikovány i závěry, podle kterých se genom Allium cepa skládá až z 95 % z repetitivních sekvencí (Flavell et al., 1974) Jak již bylo zmíněno ve fylogenetickém okénku, rod Allium se dělí na tři klady. Jejich členění částečně odpovídá různým základním chromozomovým číslům, která jsou pro jednotlivé klady shodná. U kladu 1 bývá n = 7, méně často pak n = 8, n = 9 nebo n = 11. Pro klad 2 a 3 je nacházeno totožné n = 8. Navíc tato chromozomová čísla vydělují rod Allium od dalších rodů sdružených pod skupinu Allieae, neboť pro ně je typické základní chromozomové číslo 10, případně 12 (Sykorova et al., 2006a). Obsah GC párů bází u typického zástupce, jakým je Allium cepa, je 38,7 % a tato hodnota je pouze s malým rozptylem zachována i u ostatních druhů (Ricroch et al., 2005). Je zajímavé srovnat zastoupení GC párů bází ve vztahu k různým chromosomovým počtům. V porovnání s Allium fistulosum, které má nižší obsah DNA v genomu (2C = 33,2 pg u A. cepa a 23,3 pg u A. fistulosum), je zastoupení GC párů bází u A. cepa nepatrně nižší (38,7 % GC párů bází u A. cepa vůči 39,8 % u A. fistulosum). Tento jev by mohl být vysvětlen přítomností jednoho páru chromozomů v jádře A. cepa navíc. Bylo totiž zjištěno, že zastoupení GC párů bází se mezi jednotlivými chromozomy může výrazně lišit, což v případě přítomnosti, resp. absence, některého chromozomového páru může vést ke změně poměru GC párů bází (Ricroch a Brown, 1997). Od 70. let 20. století byla diskutována teorie, podle které množství DNA v genomu může korelovat s různými biofyzikálními charakteristikami na úrovních od jádra po celý organismus. Předpokládalo se, že některé fenotypové efekty mohou být způsobené množstvím jaderné DNA nezávisle na informaci, kterou kódují (Bennett, 1987). Byly popsány vztahy mezi velikostí genomu a schopností růst při nízkých teplotách (Grime et al., 1985), odolností vůči mrazu (Macgillivray a Grime, 1995), nebo dobou kvetení (Bennett, 1972). Rod Allium se, díky své početnosti a rozsahu velikostí genomů jednotlivých zástupců, jevil jako velmi vhodný pro studie zaměřené na tuto problematiku. Prováděné studie však dospěly k rozdílným závěrům a žádný přímý (pozitivní, či negativní) vztah mezi velikostí genomu a životní strategií u zkoumaných druhů pozorován nebyl (Ohri a Pistrick, 2001).

Bylo naopak zjištěno, že velikost genomu koresponduje s fylogenetickým řazením v rámci podrodů a sekcí (Ohri a Pistrick, 2001). Tyto nižší fylogenetické jednotky se často vyznačují podobnými životními strategiemi a rytmy, proto při nižších počtech zkoumaných druhů mohl být tento jev v minulosti podkladem pro teorii, podle které velikost genomu tyto vlastnosti přímo ovlivňuje, nebo je jimi ovlivňována. Zdá se ovšem, že se jedná pouze o shodu mezi tím, jak se vyvíjel genom těchto rostlin a jaká se u nich vytvářela životní strategie, než že by mezi těmito dvěma charakteristikami existoval nějaký přímý vztah. Přestože genom rostlin z rodu Allium již svou velikostí vzbuzuje patřičný zájem, ukrývá v sobě tajemství, které pobízí vědce k jeho dalšímu hlubšímu zkoumání. Tímto velmi dobře střeženým tajemstvím, které si rod Allium i po téměř dvaceti letech výzkumu udržuje, jsou jeho telomery. A právě jim je věnována další kapitola.

2.2. Klasické telomery

Telomery jsou nukleoproteinové struktury lokalizované na koncích lineárních chromozomů, které a) chrání chromozomy před erozí vyvolanou neúplnou replikací konců opožďujícího se řetězce, b) zabraňují fúzi chromozomů, která by vedla ke vzniku dicentrických chromozomů a následným poruchám při mitóze/meióze, c) zabraňují rozpoznávání konců chromozomů exonukleázami a jejich degradaci, d) zajišťují rozlišování přirozených konců chromozomů od dvouřetězcových zlomů, e) hrají významnou roli při regulaci dělivého potenciálu buňky (Hayflick a Moorhead, 1961; Olovnikov, 1971; Lundblad a Szostak, 1989; Levy et al., 1992).

2.2.1. Počátky studia telomer Poprvé bylo neobvyklé chování konců chromozomů popsáno v roce 1938 Hermanem Mullerem, který při své práci s chromozomy octomilky (Drosophila melanogaster) zjistil, že působením rentgenového záření je možné indukovat různé chromozomové přestavby, ale nikdy ne koncové delece. Ve spojitosti s faktem, že velkou část takto indukovaných aberací představovaly fúze chromozomů, dospěl k závěru, že koncová část chromozomu hraje zásadní roli a její ztráta, pokud není kompenzována fúzí s jiným chromozomem, je letální. Pro tuto oblast chromozomu také jako první použil název telomera, odvozený od řeckých slov „telos“ (konec) a „meros“ (část), (Muller, 1938). Když k podobným závěrům dospěla o čtyři roky později během svých studií chromozomů kukuřice (Zea mays) i Barbara McClintock (McClintock, 1942), začalo být jasné, že telomera, nebo alespoň její funkční nepostradatelnost, je zachována i u evolučně velmi vzdálených druhů. Je zajímavé, jaký časový úsek uplynul od okamžiku, kdy byl v roce 1958 prokázán semikonzervativní průběh replikace DNA (Meselson a Stahl, 1958) a od popisu Heyflickova limitu v roce 1961 (Hayflick a Moorhead, 1961) do doby, než byly tyto dvě teorie v roce 1971, resp. 1972, spojeny a byl postulován problém zkracování telomer, tzv. „marginotomy“, později „end replication problem“ (Olovnikov, 1971; Watson, 1972). Zároveň však vyvstala otázka, zda existuje mechanismus, který by tento proces, vedoucí jinak k neodvratnému zániku chromozomu, mohl zvrátit. Odpověď na tuto otázku byla vcelku prostá. Eukaryotické buňky na této planetě existují již minimálně 800 milionů let (Cavalier-Smith, 2009), někteří autoři posouvají jejich původ ještě hlouběji do minulosti (Knoll et al., 2006), a společně se vznikem lineárního uspořádání chromozomů se musel vyvinout i mechanismus udržování 19 jejich stabilní délky, který umožní vyrovnat zkracování chromozomů vyvolané neúplnou replikací. Existence takového mechanismu byla Olovnikovem ve výše citované publikaci taktéž předpovězena, ale trvalo ještě celé jedno desetiletí, než byl tento proces objasněn.

2.2.2. Odhalení struktury telomer a mechanismu jejich udržování Prvním důležitým krokem k poznání struktury telomer byla práce Elizabeth Blackburn, ve které popsala telomerickou sekvenci prvoka rodu Tetrahymena. U tohoto jednobuněčného organismu je telomera tvořena tandemovou repetitivní sekvencí, jejíž základní jednotka má délku 6 bp a sekvenci 5´-(T2G4)-3´ (Blackburn a Gall, 1978). Tento objev sice odhalil způsob, jakým jsou konce chromozomů formovány, ale nepřinesl žádné vysvětlení, jak je tato repetitivní sekvence udržována. Ztráta i poměrně rozsáhlého úseku tandemové repetice by neměla žádný negativní vliv na životaschopnost buněk, ale žádná tandemová repetice není nekonečná. Jakmile by došlo k odbourání telomery vlivem neúplně replikace DNA pod kritickou mez, začaly by být narušovány i kódující oblasti DNA, což by mělo pro buňku fatální následky. Dnes je známo, že kritická délka telomer u člověka je 2 až 2,8 kb (Allsopp a Harley, 1995), tady asi 1/5 až 1/6 délky telomer při narození (Lansdorp et al., 1996). Poté buňky ztrácejí svou dělivou schopnost a přecházejí do stavu „replikativní senescence“ (Karlseder et al., 2002). Tento stav je charakteristický vysokou frekvencí chromozomových fúzí, které jsou příčinou často rozsáhlých chromozomových přestaveb. Narůstající nestabilita genomu buňky má pak za následek její smrt (Counter et al., 1992). Jak je tedy možné zajistit udržování délky telomer? Odpověď na tento problém předložila studentka Elizabeth Blackburn, Carol Greider. Povedlo se jí v buněčném extraktu prvoka Tetrahymena detekovat enzym schopný prodlužovat syntetické primery, a to právě o hexanukleotid 5´-(T2G4)-3´ (Greider a Blackburn, 1985). Tato RNA-dependentní DNA-polymeráza (dříve označovaná jako telomerická terminální transferáza) je schopna kompenzovat zkrácení telomer v důsledku semikonzervativní replikace DNA. Dnes je známo, že se tento enzym skládá ze dvou hlavních podjednotek: a) RNA podjednotky (TER – telomerase RNA); b) katalytické podjednotky (TERT – telomerase reverse transcriptase). Zatímco RNA podjednotka obsahuje vzor („templát“), podle kterého je 3´ konec DNA řetězce prodlužován, katalytická podjednotka zajišťuje vazbu TER na DNA a reverzní transkripci, která je podstatou celého tohoto procesu (Obr. 1), (Zvereva et al., 2010).

Obr. 1. Mechanismus udržování telomer pomocí telomerázy (Zvereva et al., 2010).

Tento popsaný mechanismus však poměrně ostře kontrastuje s již dříve popsaným Hayflickovým limitem. Proč tedy u lidských buněk dochází po určitém počtu dělení k zastavení buněčného cyklu? Jsou snad konce lidských chromozomů chráněny jiným mechanismem? Rozřešení této otázky je vcelku prosté. Mechanismus udržování lidských telomer je totožný s mechanismem, který je přítomen v buňkách prvoka Tetrahymena, ovšem podléhá silné regulaci a telomerázová aktivita je detekovatelná pouze v embryonálních a tkáňových kmenových buňkách (Prowse a Greider, 1995; Cong et al., 2002). Tento mechanismus se patrně vyvinul jako ochrana před neregulovaným buněčným dělením, tedy rakovinou. Je však známo, že při nádorovém bujení jsou buňky schopny tuto bariéru prolomit a to buďto reaktivací telomerázy (85 – 90 % nádorů), (Chen a Chen, 2011), nebo pomocí mechanismu alternativního prodlužování telomer (ALT - Alternative Lengthening of Telomeres), (10 – 15 % nádorů), (Bryan et al., 1995; Bryan et al., 1997; Heaphy et al., 2011).

2.2.3. Čtyři základní charakteristiky „klasických telomer“. Práce, kterou při studiu telomer odvedly E. Blackburn a C. Greider a za kterou byli v roce 2009, spolu s Jackem Szostakem, zaslouženě odměněni Nobelovou cenou, otevřela

21 cestu mnoha dalším vědeckým výzkumným týmům, které se o tuto problematiku začaly zajímat.

V září roku 1988 byla publikována lidská telomerická sekvence 5´(-T2AG3)n-3´ (Moyzis et al., 1988), která je v současnosti, díky shodě v rámci celé skupiny obratlovců (Meyne et al., 1989), označována jako typická obratlovčí (někdy též savčí) sekvence. Ve stejném roce, jen o pár měsíců dříve, byla popsána také telomerická sekvence 5´-(T3AG3)n-3´ u Arabidopsis thaliana (Richards a Ausubel, 1988), která je dnes označována jako typická rostlinná telomerická sekvence, neboť se vyskytuje u většiny zástupců vyšších rostlin, u kterých byla telomerická DNA popsána (Fuchs et al., 1995). Přestože telomerická sekvence bývá uváděna jako základní charakteristika telomer, není charakteristikou jedinou, stejně jako není jejich jedinou strukturní součástí. Velmi dobře je tato problematika popsána v dizertační práci Vratislava Pešky (2011), který shrnul čtyři základní charakteristiky tzv. klasických telomer a to:

a) Kanonická repetitivně sekvence 5´-(TxAyGz)n-3´ b) Jednořetězcový přesah DNA tvořený G-bohatým vláknem c) Homologie funkčních domén telomerových proteinů d) Telomerázový systém udržování délky telomer

Ad a) Tak, jak je zde uvedena, představuje tato konsenzuální sekvence univerzální zápis tzv. klasické telomerické sekvence. Přesto, že se může v rámci jednotlivých skupin organismů více či méně lišit v zastoupení jednotlivých bází, je tento motiv až na výjimky zachován. Repetitivní jednotky jsou vzájemně orientovány systémem „hlava k patě“, anglicky „head-to-tail“. V genomech živých organismů můžeme poměrně často nalézt situaci, kdy v telomeře existuje současně několik variant telomerické repetitivní jednotky (Rotkova et al., 2004). Tento jev může nastat působením dvou faktorů. Tím prvním, při kterém jsou různé motivy rozmístěny náhodně (vždy je ovšem jeden z nich dominantní), je nepřesné začleňování nukleotidů během reverzní transkripce, jako je tomu v případě Paramecium tetraurelia (McCormick-Graham et al., 1997). Stejný následek má i přítomnost alternativních start a stop pozic na templátu (Prescott a Blackburn, 1997). Ve druhém případě se v telomeře nachází dvě, či více odlišných sekvencí repetitivní jednotky (Allshire et al., 1989). Zatímco motiv v distální části odpovídá sekvenci TER podjednotky telomerázy, v proximální části (blíže centromeře) se nachází telomerická sekvence s jiným (většinou velmi podobným) motivem, případně soubor několika různých

22 motivů společně se standardní sekvencí (Kirk a Blackburn, 1995). Pro tento jev mohou existovat dvě různá vysvětlení. První z nich je založeno na předpokladu, že zde postupně dochází k akumulaci repetitivních jednotek s různou sekvencí, neboť tato oblast není telomerázou přirozeně obnovována a mohou se zde hromadit různé mutace. Toto vysvětlení odpovídá například situaci u Arabidopsis thaliana (Kuo et al., 2006). Druhá možnost vystihuje situaci u Tetrahymena thermophila, kde jsou proximální a distální oblast telomer tvořeny dvěma naprosto odlišnými sekvencemi (Kirk a Blackburn, 1995). Zde se může jednat o zbytek původní telomery, jejíž motiv byl, například mutací v TER podjednotce, pozměněn (Baird et al., 2000) a která byla posléze překryta telomerou s novým motivem.

Ad b) Jednořetězcový přesah G-bohatého vlákna, který je dalším charakteristickým rysem telomery (Makarov et al., 1997), je zároveň podmínkou formování složitějších telomerických struktur, jako je telomerová smyčka (T-smyčka, T-loop) (Griffith et al., 1999) nebo guaninový kvadruplex (Smith a Feigon, 1992; Oganesian et al., 2006). Tyto nukleoproteinové formace jednak zabraňují chybnému rozpoznání telomery jakožto dvouřetězcového zlomu a zároveň zabraňují exonukleázám v napadání konců telomer. Stabilizace těchto struktur by nebyla možná bez účasti specifických proteinů, které jsou na telomeru vázány a které jsou jejím dalším charakteristickým znakem

Ad c) Struktuře DNA v telomerách jsem se věnoval v předchozích odstavcích, proto se teď chci krátce zmínit i o proteinové složce, tzv. telomera-vazebných proteinech, bez které by si telomery mohly pouze stěží uchovávat svou strukturu a plnit svou funkci. Základní charakteristikou telomera-vazebných proteinů je konzervovanost terciální struktury a klíčových aminokyselin ve dvou vazebných a interakčních motivech. Prvním z těchto motivů je telobox (MYB-like doména s helix-turn-helix motivem), který je přítomen u proteinů vázajících se na dsDNA (Bilaud et al., 1996). Druhým je Oligonucleotide/oligosaccharide-Binding-fold (OB-fold) doména, u které jsou beta-listy peptidového řetězce uspořádány do tzv. beta-barelu (Mitton-Fry et al., 2002; Croy a Wuttke, 2006; Flynn a Zou, 2010). Tyto proteiny jsou organizovány do polypeptidů, z nichž nejlépe prozkoumaným je v tomto ohledu lidský shelterinový komplex (de Lange, 2005; Palm a de Lange, 2008), složený ze šesti podjednotek, a to proteinů TRF1 (Zhong et al., 1992), TRF2 (Bilaud et al., 1997), RAP1 (Li et al., 2000), POT1 (Yang et al., 2005), TPP1 (Houghtaling et al., 2004; Liu et al., 2004; Ye et al., 2004) a TIN2 (Kim et al., 1999), (Obr. 2).

Zatímco podjednotky TRF1, TRF2 a POT1 rozpoznávají telomerickou sekvenci a interagují s ní, zbylé tři proteiny je spojují a stabilizují tak celý kompex (de Lange, 2005). Každý z proteinů shelterinového komplexu má nenahraditelnou funkci a celý systém by bez něj selhával.

Obr. 2. A) Podjednotky lidského shelterinového komplexu. B) T-smyčka s přesahujícím 3´ koncem pronikajícím do dvouřetězce telomery je přirozeným zakončením chromozomu. C) Shelterinový komplex stabilizující T-smyčku (Moon a Jarstfer, 2007).

Přestože shelterinový komplex byl detailně popsán jen u savců, byla objevena řada funkčních i sekvenčních homologů jeho podjednotek. Příkladem jsou rostlinné proteiny podobné TRF proteinům (TRF-like proteiny, TRFL), (Chen et al., 2001a; Karamysheva et al., 2004; Peska et al., 2011; Prochazkova Schrumpfova et al., 2014) a již výše zmíněné kvasinkové telomera-vazebné proteiny. To vede k přesvědčení, že stejně jako je vysoce konzervativní DNA struktura telomer (přestože základní repetitivní jednotka nemusí být a také není vždy stejná), bude pravděpodobně značně konzervována i struktura proteinových telomera-vazebných komplexů.

Ad d) Čtvrtým společným charakteristickým rysem uvedeným ve výše zmíněné práci (Peška, 2012) je telomerázový systém udržování délky telomer, jehož charakteristika je uvedena v části 2.2.2. Do těchto čtyř bodů je tedy možné shrnout popis telomer ve formě, která je pro ně nejtypičtější. Jsou však známy i případy, kdy se struktura telomer a systém jejich udržování těmto pravidlům vymykají.

2.3. Neobvyklé telomery

V dnešní době je již známo, že telomerická sekvence neexistuje jen v několika málo variantách. Mezi organismy se vyskytuje široká plejáda jejich různých verzí, což je dobře pozorovatelné zvláště u velmi členitých a druhově bohatých skupin jako jsou řasy (Algae), (Fulnečková et al., 2012) nebo hmyz (třída Insecta), (Frydrychova et al., 2004). Právě u druhé zmíněné skupiny je dobře dokumentováno několik evolučních událostí, během kterých došlo ke ztrátě telomerické sekvence 5´-(T2AG2)n-3´, poprvé popsané u Bombyx mori (Okazaki et al., 1993), typické pro celý kmen Arthropoda (Frydrychova a Marec, 2002; Vitkova et al., 2005). U některých skupin, jako je například nadčeleď Tenebrionoidea s telomerickou sekvencí 5´-(TCAGG)n-3´, došlo pouze k jednoduché záměně telomerické sekvence (Mravinac et al., 2011), ale u jiných druhů byl telomerický systém kompletně nahrazen.

2.3.1. Telomerický systém Drosophila Je paradoxní, že druh octomilky, u kterého byla telomera poprvé popsána – Drosophila melanogaster – se strukturou svých telomer charakteristice popsané v předchozích odstavcích značně vymyká. U octomilky nebyla doposud detekována telomerázová aktivita (Sasaki a Fujiwara, 2000) a ani telomerická sekvence není tvořena tandemovou minisatelitní repeticí s GT bohatým motivem repetitivní jednotky, ale třemi typy non-LTR retrotranspozonů: HeT-A, TART a TAHRE (Mason a Biessmann, 1995; Pardue et al., 1996; Abad et al., 2004; Mason et al., 2008). Označení non-LTR (non-Long Terminal Repeats) se používá pro skupinu retrotranspozonů, které ve své struktuře postrádají dlouhé obrácené koncové repetice, které slouží k začleňování transpozonu do genomu v průběhu transpozice. Do této skupiny patří mimo jiné i lidské transpozony SINE (Short Interspersed Elements) a LINE (Long Interspersed Elements). Z hlediska struktury jsou transpozony, tvořící telomery Drosophila, podobné právě lidským LINE transpozonům, ale v některých důležitých aspektech se od nich liší. První popsanou složkou byl retrotranspozon HeT-A. Ten představuje 80 – 90 % všech elementů nacházejících se v telomeře octomilky a má délku přibližně 6 kb. Od LINE transpozonů ho odlišuje jednak enormně rozsáhlý, zhruba 3 kb dlouhý, nepřekládaný (UTR – UnTranslated Region) 3´ konec, dále pak absence otevřeného čtecího rámce (ORF – Open Reading Frame) pro reverzní transkriptázu a taktéž transkripční promotor lokalizovaný na 3´ konci. Tato změna má své důležité opodstatnění. Jelikož jsou všechny retrotranspozony 26 uspořádány tandemově za sebou systémem „hlava k patě“ a jsou orientovány 3´ polyA koncem k proximální části telomery a 5´ koncem k distálnímu konci, mohla by eroze chromozomu vyvolaná neúplnou replikací způsobit ztrátu promotoru, nezbytného pro proces transpozice, a tím by mohlo dojít k narušení obnovování délky telomer. Retrotranspozon TART, který byl popsán jako druhý v pořadí, je oproti HeT-A výrazně delší, okolo 10 kb, ale má také mnohem nižší zastoupení, jen 10 – 20 %. Stejně jako HeT-A se vyznačuje rozsáhlým 3´ UTR koncem, ale má navíc dvojici nedegenerovaných dlouhých repetic, které, na rozdíl od LTR transpozonů, nejsou lokalizovány na koncích transponovatelného elementu, nýbrž uvnitř jeho sekvence. Další zvláštností je i přítomnost silného protismyslového promotoru s doposud nevyjasněnou funkcí. Oproti HeT-A tento retrotranspozon obsahuje aktivní gen pro reverzní transkriptázu, který je pro celý proces transpozice a tedy i udržování délky telomer nezbytný. Důvodem, proč se tyto dva elementy vyskytují vždy spolu a jsou na sebe existenčně vázány, je ten, že TART poskytuje reverzní transkriptázu, která zajišťuje přepis RNA transpozonu do DNA a její začlenění do genomu, a HeT-A poskytuje funkční Gag-like protein, který umožňuje cílené začleňování těchto elementů do telomerické oblasti. Gag-like protein kódovaný genem neseným na TART transpozonu totiž není schopný směrovat RNA transkript transpozonu na telomeru samostatně, ale pouze v součinnosti s Gag-like proteinem HeT-A transpozonu (Rashkova et al., 2002). Posledním ve výčtu retrotranspozonů podílejících se na formování a udržování telomer je retrotranspozon TAHRE, jenž vykazuje vysokou podobnost s HeT-A retrotranspozonem (Abad et al., 2004). Zásadní odlišností je však jeho schopnost kódovat vlastní reverzní transkriptázu. Stojí jistě za povšimnutí, že i když je TAHRE jedinou ze tří komponent schopnou nezávislé transpozice a tudíž i replikace, je v celém systému zastoupena jen jedním procentem. O tom, že tento systém není záležitostí jen jediného druhu, svědčí i fakt, že transpozony podobné svou strukturou Het-A a TAHRE byly nalezeny i v telomerách druhu příbuzného Drosophila melanogaster, Drosophila virilis (Casacuberta a Pardue, 2003a; b). S detekcí těchto telomerických retrotranspozonů je však spojen jeden zásadní problém, a to nízká sekvenční homologie i u blízce příbuzných druhů, která zabraňuje jejich efektivnímu vyhledávání. To ztěžuje případné objasnění struktury telomer u daších skupin blízce příbuzných řádu Diptera, do kterého Drosophila spadá. Jedná se o řády Mecoptera a Siphonaptera, u kterých taktéž nebyla zjištěna přítomnost žádné z dosud známých telomerických sekvencí (Frydrychova et al., 2004).

Přestože se může telomerický systém založený na transpozonech jevit od klasického, telomerázou udržovaného konceptu telomer, naprosto odlišný, najdeme i zde několik společných rysů. Obě struktury se vyznačují přítomností tandemové repetice, byť v jednom případě se jedná o klasickou satelitní sekvenci a ve druhém o mnohonásobné, souhlasně orientované uskupení retrotranspozonů. Druhou, neméně zajímavou skutečností je, že u obou těchto přístupů směřujících k ochraně vnitřních oblastí chromozomů se využívá princip prodlužování tandemové repetice založený na jisté formě reverzní transkripce. U systému nalézajícího se u rodu Drosophila je to klasická transpozice, při níž nejprve dochází k přepisu sekvence transpozonu do mRNA, která je následně transportována do cytoplazmy. Na ribozomech dochází k translaci mRNA do Gag proteinů, které mRNA obalí a po průniku jadernou membránou zpět do jádra jsou schopné přenést transkript transpozonu do oblasti telomery, kde dojde pomocí reverzní transkriptázy k začlenění nové kopie transpozonu do genomu (Obr. 3). U klasického systému plní roli templátu TER podjednotka, zatímco funkci reverzní transkriptázi plní TERT podjednotka.

Obr. 3. Mechanismus transpozice při udržování telomer D. melanogaster. Upraveno podle (Rashkova et al., 2002).

Cestu, kterou se mohla ubírat evoluce udržování telomer u D. melanogaster, naznačuje příklad u Bombyx mori, zástupce řádu Lepidoptera. Tento motýl má telomeru tvořenou kanonickou sekvencí 5´-(TTAGG)n-3´, ale zároveň se v jeho telomeře hojně vyskytují non-LTR retrotranspozony rodiny TRAS a SART (Okazaki et al., 1995; Kubo et al., 2001). Navíc telomeráza tohoto organismu vykazuje pouze velmi nízkou enzymatickou

28 aktivitou, což v kombinaci s vysokou úrovní transkripce a retrotranspozice uvedených elementů do oblasti telomery nasvědčuje, že udržování telomer závisí právě na aktivitě retrotranspozonů (Fujiwara et al., 2005; Osanai et al., 2006; Tatsuke et al., 2010). Je možné, že evoluční událost s podobnými následky vedla u D. melanogaster i B. mori k tomu, že úlohu udržování telomer přejaly retrotranspozony, pouze s tou výjimkou, že zatímco u D. melanogaster došlo k úplnému vymizení telomerické sekvence, u B. mori je tato sekvence přenášena společně s retrotranspozony Tento příklad skvěle demonstruje nejen nezbytnost telomer a mechanismu jejich udržování pro organismus, ale také stav, kdy je organismus, potažmo jeho genom, nucen vyrovnat se s jejich ztrátou a najít nový způsob, jak své chromozomy ochránit. Že se v evoluci nejedná o ojedinělou událost, dokumentují i dva příklady z infratřídy (taxonomická kategorie mezi podtřídou a nadřádem) Culicomorpha.

2.3.2. Telomery typu Chironomus U druhu Chironomus pallidivittatus byla zjištěna absence telomerické sekvence založené na tandemovém opakování krátkých GT bohatých sekvencí. Místo toho byla v koncové oblasti chromozomu zjištěna přítomnost tandemové repetice s AT bohatou repetitivní jednotkou o délce 340 bp. Tato telomerická struktura byla zjištěna na obou koncích chromozomů u tří chromozomových párů a na jednom konci u čtvrtého chromozomového páru (Cohn a Edstrom, 1992a). Sekvence 340 bp se vyskytuje ve čtyřech hlavních variantách. Ancestrální sekvence je označována jako M1 a její základní struktura je tvořena dvěma páry repetic ve střídavém uspořádání (Obr. 4), které jsou vzájemně odděleny mezerníkovou sekvencí. Zatímco mezerníkové sekvence jsou unikátní, repetice vykazují homologii vyšší než 90 %. Zbývající tři sekvence, které jsou od ancestrální odvozeny, nesou označení D1, D2 a D3. Tyto odvozené varianty se od původní liší sekvenční degenerací, která u každé z těchto tří sekvencí postihuje jinou oblast (Cohn a Edstrom, 1992a). U D3 varianty je navíc přítomna substituce části L4 mezerníku sekvencí z mezerníku L2 (Lopez et al., 1996) Sekvence M1, D1, D2 a D3 společně tvoří úsek o délce 50 až 200 kb, jehož struktura je, co do zastoupení jednotlivých typů podjednotek, telomerově-specifická. Nejjednodušší typ, který se vyskytuje ve dvou případech, je tvořen pouze odvozenou sekvencí D3. V druhém typu převažuje ancestrální sekvence M1, většinou doplněná sekvencí D3. Ta je typická pro jediný chromozom, ale může v některých případech nahrazovat třetí typ, ve kterém jsou zastoupeny všechny sekvenční varianty společně (Kamnert et al., 1997).

Obr. 4. Struktura čtyř variant telomerických sekvencí nalezených u Chironomus pallidivittatus. Oblasti ds1 – ds3 jsou lokusy s degenerovanou sekvencí (Kamnert et al., 1997).

Rozmístění jednotlivých sekvenčních variant není náhodné. Podjednotky M1, D2, a D3 se vždy vyskytují v dlouhých homogenních úsecích. Jedinou výjimkou je podjednotka D1, která představuje asi 10 % celkového množství a je rozptýlena mezi ostatními podjednotkami. Pokud je D3 podjednotka přítomna v sekvenci, vyskytuje se vždy v distální oblasti. To má své opodstatnění, neboť tato podjednotka má potenciál, díky palindromatické struktuře, vytvářet smyčku ssDNA podobnou T-smyčce u klasických telomer (Zhang et al., 1994). Tato struktura však zatím byla pouze předpovězena. Jak je uvedeno výše, tři ze čtyř chromozomových párů Chironomus pallidivittatus mají všechny telomery tvořeny výše uvedenou 340 bp sekvencí. V případě čtvrtého, telocentrického, chromozomového páru, tato sekvence tvoří pouze telomeru jednoho konce chromozomu, zatímco na druhém konci přebírá funkci telomery tandemově uspořádaná 155 bp dlouhá centromerická repetice, která zde funguje současně jako centromera i jako telomera. Zajímavou skutečností je, že v těsné blízkosti centromerické repetice se nachází transkripčně aktivní otevřený čtecí rámec, jehož předpokládaný produkt má motivy podobné transponáze, endonukleáze a DNA vazebným motivům, což nasvědčuje jeho 30 transpozonovému původu. Navíc uvnitř obrácených repetic obsahuje modifikovanou formu již známého elementu, který byl nalezen jako inzert 155 bp repetice, a oblast náchylnou k rekombinaci. To nasvědčuje tomu, že by tento potencionální protein, resp. transpozon, mohl mít funkční vztah k centromerické, a tím pádem i telomerické oblasti (Rosen et al., 2002a). O evoluci telomerického systému rodu Chironomus svědčí přítomnost kratších, 176 bp dlouhých, do tandemové repetice uspořádaných telomerických sekvencí u druhu Chironomus thummi. Stejně jako u Chironomus pallidivittatus se vyskytují pouze u sedmi z celkových osmi chromozomových konců a chybí na krátkém konci akrocentrického chromozomu (chromozom 4). V genomu Chironomus thummi jsou přítomny i dvě intersticiální sekvence tvořené 176 bp tandemovou repeticí uvnitř chromozomu 2 (Carmona et al., 1985). Oblast intersticiálních repetic je navíc transkripčně aktivní, neboť byla detekována přítomnost malých nekódujících RNA molekul se sekvencí odpovídající DNA sekvenci telomer. Transkripty jsou různě dlouhé, ale jejich variabilita vykazuje pravidelnost odpovídající polymerům základní sekvence, jejíž délka je v souladu se základní repetitivní jednotkou formující telomery. Dále byla zjištěna pozitivní korelace mezi působením přirozených stresových faktorů na organismus a úrovní transkripce telomerické DNA Chironomus thummi (Martinez-Guitarte et al., 2008). Velmi zajímavým údajem je i zjištění, že u dvou blízkých poddruhů - Chironomus thummi piger a Chironomus thummi thummi - jsou transkripčně aktivní lokusy na jiných chromozomech. Zatímco u C. th. piger se do odpovědi na teplotní šok zapojuje lokus na chromozomu 4, u C. th. thummi se jedná o lokus na chromozomu 3 (Morcillo et al., 1988). Třetím zástupcem rodu Chironomus, u kterého byla popsána telomerická sekvence sestávající se z dlouhých repetitivních segmentů, je Chironomus tentans, u něhož byla popsána telomerická sekvence o délce 350 bp se strukturou podobnou jako u Chironomus pallidivittatus. Při dalším zkoumání bylo zjištěno, že pravděpodobně vznikla inzercí mezerníkových sekvencí do jednodušší, 165 bp dlouhé podjednotky, velikostí podobné základní repetitivní jednotce telomery Chironomus thummi. Podjednotka 165 bp se, stejně jako současné klasické telomery, vyznačuje výraznou asymetrií v obsahu cytosinu a guaninu mezi řetězci. Pouze ve dvou krátkých úsecích je tato asymetrie narušena. Právě nerovnoměrné rozložení guaninu a cytosinu mezi řetězci bylo motivací pro studium, které ukázalo, že původní 165 bp podjednotka je tvořena degenerovanou, sedm až deset nukleotidů dlouhou repetitivní podjednotkou. Byla sestavena konsenzuální sekvence 5´-(TTGAG(G,A))-3´, která se nápadně podobá konsenzuální sekvenci vyskytující se mezi organismy s obvyklými telomerami (Nielsen a Edstrom, 1993). Zdá se ovšem, že rozsah přestaveb byl natolik

31 rozsáhlý, že neumožňuje formování struktur podobných T-smyčkám, neboť u Chironomus thummi nebyla zjištěna přítomnost jednořetezcových přesahů (Rosen a Edstrom, 2002). Výše uvedené důkazy svědčí o tom, že určitá dosud neobjasněná evoluční událost vedla u rodu Chironomus k přestavbě původní klasické telomery na alternativní, tvořenou dlouhými tandemovými repeticemi. Mechanismus, jakým jsou udržovány, zatím není detailně objasněn, ale jedná se pravděpodobně o proces genové konverze (Cohn a Edstrom, 1992b). Alternativní udržování telomer pomocí genové konverze bylo popsáno u Anopheles gambiae, dalšího zástupce řádu Diptera. Do telomery chromozomu 2 tohoto přenašeče malárie byl vnesen transgenní plazmid a po dobu tří let byla sledována dynamika délky jeho telomery. Kritickým pro tento pokus byla populace 1993, jejíž telomery chromozomu 2 byly délkově poměrně homogenní, ale končily uvnitř plazmidu, nikoliv tandemovou repeticí. U populace 1995 se začala projevovat heterogenita v délce telomery 2, neboť u části sledované populace docházelo k dalšímu zkracování telomery, zatímco u zbývajících členů populace se začaly prodlužovat. Za původce prodlužování telomer, resp. plazmidu, který v tu dobu tvořil konec chromozomu, byla označena genová konverze (Obr. 5), (Roth et al., 1997).

Obr. 5. Mechanismus genové konverze. Model prodlužování transgenního plazmidu pUChsneo, nesoucího gen „White“ Drosophila melanogaster, gen pro rezistenci k neomycinu (hs-Neo) a jeho zkrácenou nefunkční variantu (Neo), genovou konverzí. Převzato z (Roth et al., 1997).

Podstata genové konverze je shodná s rekombinací. Volný 3´ konec, nahrazující jednořetězcový zlom, vytváří díky částečné či úplné homologii duplex s nesesterskou chromatidou, případně telomerickou oblastí jiného chromozomu. Pomocí polymerázy je 3´ konec prodloužen, což po rozpadu duplexu umožní i dosyntetizování 5´ konce.

2.3.3. Telomery typu Rhynchosciara O složitosti studia neobvyklých telomer hmyzu svědčí i případ Rhynchosciara americana. Původně byly u tohoto druhu popsány telomery strukturně podobné rodu Chironomus, tedy tandemové repetice s dlouhou repetitivní jednotkou (414 bp), (Madalena a Gorab, 2005). Jejich lokalizace se však následně ukázala jako pouze subtelomerická a brzy byla popsána telomerická sekvence s repetitivní jednotkou M-22 (22 bp), která byla na chromozomech R. americana, i příbuzného druhu R. hollaenderi, lokalizována až za repeticí 414 bp (Rossato et al., 2007). Další popsanou součástí této telomery byla sekvence M-16 (16 bp). Tyto repetice nejsou rozmístěny náhodně, ale vyskytují se v dlouhých tandemech. I tato sekvence se vyskytuje u obou zmíněných druhů, ale s různým poměrným zastoupením. Sekvence M-16 vykazuje s M-22 sekvenční shodu 56 %, což může svědčit o jejich společném původu. Jako nejpravděpodobnější se v tomto ohledu jeví teorie o duplikaci ancestrální repetitivní jednotky a následná homogenizace úseků s pouze jednou repeticí, která byla způsobena genovou konverzí (Madalena et al., 2010). Poslední doposud objevenou strukturou v telomerách R. americana je tandemově uspořádaná sekvence T-14 (14 bp) se zastoupením AT párů bází 93 % (Fernandes et al., 2012).

2.3.4. Alternativní způsoby udržování telomer u kvasinek 2.3.4.1 Mechanismus založený na rekombinaci Případy, kdy se buňky úspěšně vyrovnaly se ztrátou telomerázového systému, nenajdeme jen u hmyzu. U kvasinek byl popsán mechanismus alternativního udržování telomer založený, podobně jako u některých hmyzích druhů, na rekombinaci mezi zbývajícími telomerickými, případně subtelomerickými, sekvencemi (Teng a Zakian, 1999). Tento proces byl navržen jako jeden z možných mechanismů udržování telomer již v době, kdy sice byla známa struktura telomery jakožto tandemové repetice, ale chyběla znalost telomerázy (Bernards et al., 1983; Walmsley et al., 1984). Dnes je tato strategie označována jako zlomem indukovaná replikace DNA (break-induced DNA replication) a byla nejprve popsána jako závislá na proteinu Rad52 (Lundblad a Blackburn, 1993). Bylo však zarážející,

že se u přežívajících buněk vyskytovaly dva typy nových telomer, a to typ I, u kterého došlo k amplifikaci subtelomerické „Y“ sekvence společně se sekvencí telomerickou, nebo typ II, u kterého došlo pouze k výraznému prodloužení telomerické sekvence (Teng a Zakian, 1999). Následné experimenty prokázaly, že existují dvě geneticky podmíněné dráhy řídící prodlužování telomer pomocí rekombinace a to dráha závislá na proteinu Rad50, která je spojena s produkcí telomer typu II, a dráha závislá na proteinu Rad51, spojená s produkcí telomer typu I. Absence proteinu Rad51 má výrazně horší následky a nižší zastoupení přeživších buněk, než absence proteinu Rad50 (Le et al., 1999; Teng et al., 2000). O tom, jak komplikovaným buněčným pochodem rekombinace je, svědčí i kritická role proteinů Rad59 a Sgs1p u Rad50-závislého typu rekombinace (Cohen a Sinclair, 2001; Huang et al., 2001; Chen et al., 2001b; Johnson et al., 2001). Role proteinu Sgs1p je o to zajímavější, že se nezapojuje to procesu rekombinace, pokud probíhá uvnitř chromozomu (Signon et al., 2001). Prodlužování telomer pomocí rekombinace je popsáno i u lidských nádorových buněk (Dunham et al., 2000) a lze proto předpokládat, že jeho variace se mohou vyskytovat v širokém spektru organismů.

2.3.4.2. PAL-mechanismus Mechanismus, který umožňuje kvasinkám vyrovnat se se ztrátou telomerázy a také rekombinační mašinérie, je takzvaný PAL-mechanismus (PALindrom-dependent mechanism, mechanismus závislý na palindromech). Sestává ze čtyř následných kroků, které dovolují předejít senescenci vyvolané zkrácením telomer pod kritickou mez a obnovují buněčnou nesmrtelnost. První fází a zároveň nezbytnou podmínkou PAL-mechanismu je inaktivace nukleázy Exo1, případně jejího funkčního ekvivalentu. Tento enzym generuje, v případě, že konec chromozomu není chráněn telomerou, jednořetězcové přesahy, které vedou k degradaci esenciálních genů a zastavení buněčného cyklu. V druhé fázi dochází k adaptaci na postupné zkracování telomer, která umožní pokračování buněčného cyklu i při absenci telomerázy a ve třetí, brzké postsenescenční fázi, k postupné degradaci konců chromozomů. Nakonec se, v pozdní postsenescenční fázi, začínají vytvářet palindromatické útvary z invertovaných repetic, které vedou k reduplikaci a/nebo deleci oblastí uvnitř ramen. Asymetrická replikace vede postupně k vytvoření jednořetězcového přesahu. Pokud tento řetězec obsahuje invertovanou repetici, je její přirozenou tendencí vytvořit palindromatickou dvouřetězcovou strukturu, která je posléze ligací spojena k již existujícímu řetězci. Tím na konci chromozomu vznikne uzavřená struktura imitující kružnicové

34 chromozomy. Během S-fáze buněčného cyklu, kdy dochází k replikaci DNA, pak vznikají dicentrické chromozomy. Tyto chromozomy jsou nestabilní a během anafáze se lámou. Buňky, v jejich jádře se nacházejí chromozomy se zachovanými invertovanými repeticemi a případně i duplikované oblasti vnitřní části chromozomů, tímto mohou vyřešit (alespoň dočasně) problém s erozí konců chromozomů a přežít. Ostatní buňky podléhají senescenci, případně odumírají (Obr. 6). Jak je však z tohoto obrázku zároveň patrné, existuje i jiná cesta využívající invertované repetice a umožňující buňkám vyhnout se senescenci, případně smrti v důsledku ztráty telomer. Volný 3´ konec palindromatické struktury totiž může fungovat současně i jako počátek replikace, tedy primer pro DNA polymerázu. Tento zlomem indukované replikaci podobný mechanismus (Break-Induced Replication-like, BIR-like) má za následek duplikaci krátké oblasti vnitřní části chromozomu, která se po replikaci v S-fázi ocitá na konci chromozomu, stejně jako v případně předchozího mechanismu.

Obr. 6. Udržování telomer pomocí palindromů. A. Inaktivace nukleázy umožňuje udržování telomer pomocí 4a) vzniku dicentrických chromozomů; 4b) BIR-podobné syntéze DNA. B. Stálá aktivita nukleázy vede k degradaci chromozomu (Maringele a Lydall, 2004).

Tento proces asi nemá svůj význam jen u kvasinek, ale je pravděpodobné, že hraje významnou roli i v případě nádorových buněk, kde jednak může sloužit k udržování délky telomer během přechodného období, kdy ještě není aktivní telomeráza, jednak může sloužit k amplifikaci onkogenů, nebo genů rezistence k léčivům a v neposlední řadě může být i zdrojem amplifikace celých chromozomů, čehož následkem je aneuplodie buňky, významný to rys nádorových buněk (Maringele a Lydall, 2004). Další možností, jak obejít ztrátu telomerázy, je přechod na kružnicovou formu chromozomů. Dochází k tomu fúzí opačných konců chromozomů bez interchromozomálních fúzí (Nakamura et al., 1998).

2.3.4.3. Mechanismus „HAATI“ Poslední doposud popsaný mechanismus udržování telomer u kvasinek bez přítomnosti telomerázy byl pojmenován „HAATI“ (Heterochromatin Amplification-mediated And Telomerase-Independent, na telomeráze nezávislý amplifikací heterochromatinu zprostředkovaný). Kanonická sekvence telomery je v tomto případě nahrazena kontinuálně amplifikovanou heterochromatinovou sekvencí. Existují dva typy buněk „HAATI“. U první skupiny, tzv. „HAATIrDNA“ dochází k amplifikaci a rozšíření rDNA lokusů, které se původně nacházely pouze na koncích chromozomu 3, na konce všech chromozomů, zatímco u druhé skupiny, zvané „HAATISTE“ dochází k amplifikaci nedokonalé subtelomerické repetice o délce 20 kb při velikosti základní repetitivní jednotky 80 bp. Zastoupení těchto dvou typů přežívajících buněk není rovnoměrné. Buňky „HAATIrDNA“ jsou zastoupeny mnohem častěji než buňky „HAATISTE“. Přesný mechanismus tohoto procesu nebyl zatím objasněn. Je ale jisté, že nezahrnuje pouze přestavbu telomerické oblasti, ale důležité je zde i přizpůsobení se telomera-vazebných proteinů na tuto novou sekvenci. Bylo zjištěno, že protein Ccq1 se váže na heterochromatin a slouží k ukotvení proteinu Pot1, jinak vázaného na kanonickou telomerickou sekvenci, který pak může vykonávat svou protektivní funkci. Takto pravděpodobně může i nadále vykonávat svou funkci spjatou s ochranou telomer, přestože jejich sekvence je odlišná (Jain et al., 2010).

2.4. Záhada telomer rodu Allium

Lidské, hmyzí a kvasinkové buňky nejsou jediné, u kterých byla zjištěna přítomnost neobvyklých telomer, případně neobvyklý mechanismus udržování telomer. U kalusových kultur připravených z pozdních generací telomeráza-deficientních rostlin A. thaliana byla pozorována odlišná reakce na absenci telomerázy a na kritické zkrácení telomer. Zatímco u kultury v publikaci označované jako buněčná linie B byly pozorovány těžké poruchy růstu, vysoká úroveň buněčné smrti a karyologická analýza prokázala vysokou variabilitu ploidie buněk, genomové přestavby a vysoké zastoupení anafázních mostů plynoucí z poklesu genomové stability, kultura A byla schopná překonat krizi a její fenotypové projevy byly shodné s kulturami připravenými z rostlin divokého typu s plně funkční telomerázou. I přes všechny projevy genomové nestability byla kultura B schopná uchovat si dělivý potenciál a množit se stejně jako kultura A. Na základě těchto poznatků byla vypracována teorie, podle níž se kultura B může vyrovnat se ztrátou telomerázy díky aneuploidii, nebo polyploidii, které zabraňují ztrátě genů nezbytných pro buněčné dělení, a navíc zmnožení jejich kopií může usnadnit přežívání buněk. U kultury A pravděpodobně došlo ke stochastické události umožňující uchování přirozeného fenotypu. Podstata tohoto mechanismu, který není shodný s žádným doposud popsaným mechanismem, nebyla objasněna, ale byla vyslovena domněnka, že svou roli může v tomto případě hrát heterochromatin přejímající funkci telomery (Watson et al., 2005). Přítomnost alternativního udržování telomer byla prokázána nejen u kalusových kultur. Rostliny A. thaliana s vyřazeným genem pro telomerázu, konkrétně pro její katalytickou TERT podjednotku, vykazovaly výrazně nižší rychlost zkracování telomer, než by odpovídalo jejich přirozené degradaci vinou neúplné replikace. To svědčí o přítomnosti mechanismu, který je schopen u těchto rostlin telomerázu nahradit (Ruckova et al., 2008). Ani v tomto případě však mechanismus alternativního udržování telomer nebyl objasněn. Jednou z teorií je existence RAD50-nezávislého mechanismu udržování telomer. Protein RAD-50 hraje při udržování funkčních telomer zásadní roli. Rostliny A. thaliana nesoucí v genu AtRAD50 T-DNA inzerci vykazovaly v homozygotním stavu (rad50/rad50) progresivní zkracování telomer vedoucí k senescenčnímu fenotypu i při zachované expresi a enzymatické aktivitě telomerázy. U přežívajících mutantů však byl pozorován výskyt výrazně delších telomer než u divokého typu, což nasvědčuje tomu, že část buněk je schopná ztrátu proteinu RAD-50 doposud neznámým způsobem překonat (Gallego a White, 2001). 37

Další možností je udržování telomer pomocí mechanismu založeného na homologní rekombinaci mezi telomerickou DNA a dvouřetězcovými kroužky DNA tvořenými telomerickou sekvencí (T-kroužky, T-circles). Poprvé byla existence těchto struktur pozorována u Triticum aestivum (Bucholc a Buchowicz, 1995). Následovala jejich detekce v lidských nádorových buňkách bez aktivní telomerázy (Yeager et al., 1999), u kvasinkových lineárních mitochondriálních chromozomů (Tomaska et al., 2000), dále u obojživelníků (Xenopus laevis), (Cohen a Mechali, 2002) a hmyzu (Chironomus), (Rosen et al., 2002b). Jejich role při alternativním udržování telomer byla potvrzena u jaderných chromozomů kvasinek Kluyveromyces lactis (Natarajan a McEachern, 2002). Právě na kvasinkách a lidských nádorových buňkách byla v této oblasti provedena největší část dosavadního výzkumu, který mimo jiné odhalil závislost tvorby T-kroužků na přítomnosti aktivní telomerázy a Ku70/80 komplexu. Přítomnost aktivní telomerázy a absence Ku70/80 komplexu vede k výraznému poklesu množství T-kroužků v buňkách. U rostlin v současnosti podrobnější poznatky o udržování telomer pomocí T-kroužků chybí, ale fakt, že byly v genomu rostlin zjištěny, umožňuje předpokládat, že i u rostlin je tento mechanismus přítomen (Tomaska et al., 2004; Zellinger et al., 2007). Možné způsoby zapojení T-kroužků do procesu alternativního udržování telomer jsou shrnuty na obrázku níže (Obr. 7).

Obr. 7. Možné role T-kroužků v prodlužování telomer závislém na rekombinaci (RTE, recombinational telomere elongation). A) Na T- kroužcích nezávislá RTE. B) Možné mechanismy vzniku T-kroužků. 1) Homologní intramolekulární rekombinace uvnitř telomerické repetice. 2) Homologní intramolekulární rekombinace iniciovaná na T-smyčce. 3) Ligace lineárních telomerických fragmentů. C) Možné mechanismy RTE zprostředkované přes T-kroužky. 1) Rekombinace s lineárním telomerickým fragmentem. 2) Začlenění T-kroužku rekombinací. 3) Prodloužení telomer mechanismem valivé kružnice s T-kroužkem jako templátem. 4) Amplifikace extrachromozomálních telomerických fragmentů mechanismem valivé kružnice. Převzato z (Tomaska et al., 2004). 39

Mechanismy alternativního udržování telomer byly popsány u rostlin, jejichž chromozomy jsou ukončeny telomerami s klasickou rostlinnou sekvencí. Jsou známy i případy, kdy rostliny tuto sekvenci postrádají. Jedním z příkladů jsou rody Cestrum, Vestia a Sessea z čeledi Solanaceae, u kterých se rostlinná telomerická sekvence vyskytuje pouze jako rozptýlené krátké segmenty v genomu (Sykorova et al., 2003a). Struktura telomer tohoto rodu nebyla doposud objasněna a tato absence je o to zajímavější, že do stejné čeledi patří i rod Nicotiana, který slouží jako modelový organismus pro studium telomer. Dalším příkladem jsou telomery u rostlin rodu Allium, u kterých, stejně jako v minulém případě, doposud nebyla popsána telomerická sekvence. Celý příběh začal v roce

1988, když byla popsána telomerická sekvence u A. thaliana 5´-(T3AG3)n-3´ (Richards a Ausubel, 1988), jakožto první rostlinná telomerická sekvence. V roce 1995 byla provedena studie, která měla za cíl zmapovat konzervovanost telomerické sekvence typu Arabidopsis v rámci celého oddělení krytosemenných rostlin. Bylo vybráno 44 rostlinných druhů ze 14 čeledí, které měly reprezentovat průřez celým oddělením. U všech vybraných zástupců se podařilo telomerickou sekvenci rostlinného typu prokázat (u 23 druhů a 7 čeledí se jednalo o vůbec první popis). Jedinou výjimkou byla Allium cepa, která byla v této skupině vybrána jako zástupce řádu Asparagales. Proto byl vytvořen předpoklad, že v rámci tohoto řádu došlo k evoluční změně, která měla za následek změnu telomerického motivu (Fuchs et al., 1995). Bylo provedeno několik studií, které měly za cíl zjistit skutečnou strukturu telomer u rostlin řádu Asparagales i samotného rodu Allium. Mezi prvními byly testovány sekvence, které byly již dříve lokalizovány na koncích chromozomů. Jmenovitě se jednalo o tandemovou repetici s repetitivní jednotkou 375 bp (Barnes et al., 1985), lokus rDNA (Schubert a Wobus, 1985), retrotranspozon ze skupiny Ty1-copia (Pearce et al., 1996) a En/Spm-podobný transponovatelný element. Závěry studie však nevedly k jasnému závěru o uspořádání telomer u Allium cepa. Díky své lokalizaci na koncích všech chromozomů Allium cepa byla GC bohatá sekvence 375 bp pojata jako kandidátní telomerická sekvence (Pich a Schubert, 1998). Tuto domněnku podporovala i skutečnost, že se nachází i na koncích chromozomů dalších druhů ze sekce Cepa (Pich et al., 1996). Předpoklad, že sekvence 375 bp je telomerickou sekvencí celého rodu Allium, nebyl prokázán. Mimo sekci Cepa se totiž sekvence 375 bp nevyskytuje a to ani jako terminální, ani jako intersticiální sekvence. Jedinou výjimkou je Allium roylei, jehož příslušnost do sekce Rhizideum je však stále diskutována. Navíc byla ve stejné práci diskutována i skutečnost, že rozlišovací schopnost použité metodiky nemůže vyloučit přítomnost další sekvence distálně od sekvence 375 bp. (Stevenson et al., 1999).

Že ztráta typické rostlinné telomerické sekvence není v řádu Asparagales omezena pouze na rod Allium, ale týká se podstatné části řádu, potvrdila studie provedená na rodu Aloe (čeleď Asphodelaceae), (Adams et al., 2000), kde telomerická sekvence typu Arabidopsis nebyla detekována. To byl podklad pro další studii, která prokázala ztrátu telomerické sekvence typu A. thaliana 5´-(TTTAGGG)n-3´ u dvanácti čeledí rodu Asparagales (Adams et al., 2001). Nejasnosti spojené s neznámou telomerickou sekvencí u části řádu Asparagales pomohlo vysvětlit zjištění, že telomery rostlin rodu Aloe jsou tvořeny lidskou (resp. savčí) telomerickou sekvenci 5´-(TTAGGG)n-3´ (Weiss a Scherthan, 2002). Hybridizace DNA dalších zástupců řádu Asparagales s různými známými variantami konsenzuální telomerické repetice posléze ukázala, že kromě zástupců rodu Allium vykazují všechny zkoumané druhy vysokou míru hybridizace s lidskou telomerickou sekvencí. U všech druhů byla zjištěna i hybridizace se sondami odvozenými od telomerické sekvence typu

Arabidopsis 5´-(TTTAGGG)n-3´, respektive od typu Tetrahymena 5´-(TTGGGG)n-3´. Síla signálu však byla vždy výrazně nižší, než v případě lidské telomerické sekvence. U některých druhů byla pozorována také hybridizace se sekvencemi typu Oxytricha 5´-(TTTTGGGG)n-3´ a Bombyx 5´-(TTAGG)n-3´. Sekvence odpovídající telomerické sekvenci typu

Chlamydomonas 5´-(TTTTAGGG)n-3´ se podle těchto dat v genomech zkoumaných druhů vyskytuje jen zřídka a ve velmi malém počtu kopií (Sykorova et al., 2003b). Údaje o zastoupení telomerických sekvencí v genomu rostlin řádu Asparagales byly doplněny i důležitým zjištěním, že s výjimkou rodu Allium mají všechny rostliny tohoto řádu, které nemají telomery tvořeny typicky rostlinnou sekvencí, aktivní telomerázu, která prodlužuje primerovou sekvenci o tandemovou repetici se základní repetitivně jednotkou o délce 6 bp. Následným zkoumáním bylo potvrzeno, že tento hexanukleotid je totožný se sekvencí syntetizovanou lidskou telomerázou (Sykorova et al., 2003b). To potvrdila i nezávislá studie u dalšího zástupce řádu Asparagales, Othocallis siberica (Weiss- Schneeweiss et al., 2004). Později byly studovány geny kódující rostlinné telomerázy syntetizující lidský typ telomerové sekvence a byly identifikovány kandidátní mutace zodpovědné za tuto sekvenční změnu (Sykorova et al., 2006b). Shrnutím všech poznatků byl vytvořen model, podle kterého a) část řádu Asparagales má telomeru tvořenu rostlinnou telomerickou sekvencí; b) v evoluci řádu Asparagales došlo k události, která zapříčinila záměnu typické rostlinné telomerické sekvence za sekvenci typicky lidskou a rostlinná sekvence je zachována pouze uvnitř chromozomů; c) druhá evoluční událost zapříčinila ztrátu typicky lidské telomerické sekvence u rostlin čeledi

Alliaceae, resp. podčeledi Allioide podle nového fylogenetického řazení (Obr. 8), (Sykorova et al., 2006a; Sykorova et al., 2006b).

Obr. 8. Variabilita telomerické sekvence uvnitř řádu Asparagales. (I) čeledi s typicky rostlinnou telomerickou sekvencí TTTAGGG; (II) čeledi s typicky lidskou sekvencí TTAGGG; (III) rod Allium bez známé telomerické sekvence Upraveno podle (Sykorova et al., 2006b).

Popsaným modelem byla objasněna absence typicky rostlinné telomerické sekvence u části řádu Asparagales, ale stále nebyla vyjasněna situace v podčeledi Allioide. Byla proto provedena studie s cílem určit telomerickou sekvenci v rámci této podčeledi a zároveň zjistit, kdy v průběhu evoluce došlo ke ztrátě typicky lidské telomerické sekvence. Výsledky ukázaly, že ztráta lidské telomerické sekvence se týká pouze rodu Allium. U ostatních rodů zahrnutých v této podčeledi je telomerická sekvence shodná s lidskou. Navíc žádná z testovaných telomerických sekvencí (typ Tetrahymena, Bombyx, Chlamydomonas, Oxytricha) se v telomerách rodu Allium nevyskytuje (Sykorova et al., 2006a).

Současné poznání telomer rostlin z řádu Asparagales se tedy dá shrnout tak, že víme, že došlo k záměně rostlinné telomerické sekvence za sekvenci lidskou a následně u rodu Allium došlo k další záměně, tentokrát lidské telomerické sekvence za sekvenci neznámou. Tato změna se týká všech tří kladů tohoto rodu, ale struktura jejich telomery, ani systém jejího udržování není doposud znám. Stejně tak není stále vyjasněno, zda mají všechny klady stejnou telomerickou sekvenci.

2.5. Ribosomální DNA (rDNA)

Jedna z teorií, která byla ve spojení s telomerami rostlin rodu Allium diskutována, byla založena na převzetí funkce telomer sekvencí 45S rDNA, nebo některou její částí (Pich a Schubert, 1998). O tom, že ribosomální DNA může být zapojena do procesu udržování telomer, svědčí například mechanismus „HAATIrDNA“ popsaný u kvasinek (Jain et al., 2010). Vůbec poprvé byly sekvence rDNA odhaleny již ve 30. letech 20. století, kdy B. McClintock popsala závislost mezi formováním jadérka a částí krátkého raménka chromozomu 6 u Zea mays. Tento úsek chromozomu, který je v jadérku vždy přítomen, byl nazván „jadérko organizující oblast“ (Nucleolus Organizer Region – NOR), (McClintock, 1934) a o třicet let později bylo zjištěno, že NOR obsahuje kódující oblast pro 18S a 25S podjednotku ribozomu (Ritossa a Spiegelman, 1965; Birnstiel et al., 1966). Díky současným poznatkům víme, že NOR, který je pozorovatelný při barvení chromozomů stříbrem, nebo jako sekundární konstrikce u metafázních chromozomů, je jen dekondenzovanou, stále transkripčně aktivní oblastí 45S rDNA lokusu a představuje pouze jeho malou část.

2.5.1. Struktura rDNA a sekvenční konzervovanost V genomu všech živých organismů jsou přítomny v mnoha kopiích čtyři geny kódující čtyři RNA podjednotky ribozomu. Jedná se o geny 5S, 5,8S, 18S a 25S u rostlin, resp. 28S u savců (Neves et al., 2005). U eukaryot jsou rDNA geny uspořádány následovně: a) geny 18S, 5,8S a 25/28S jsou uspořádány za sebou v orientaci „hlava k patě“ a vzájemně jsou odděleny vnitřními přepisovanými mezerníkovými oblastmi (ITS), čímž tvoří sekvenci označovanou jako 45S rDNA. Tyto sekvence jsou v genomu mnohonásobně zmnoženy a jsou uspořádány do tandemové repetice v orientaci „hlava k patě“, přičemž jsou od sebe odděleny mezerníkovou sekvencí skládající se z mezigenové nepřepisované oblasti (IGS) a vnější přepisované oblasti (ETS), (Obr. 9), (Eickbush a Eickbush, 2007). Celkový počet 45S rDNA podjednotek se u rostlin pohybuje v rozmezí od několika set, 570 kopií u A. thaliana (Pruitt a Meyerowitz, 1986), po desítky tisíc, 31 000 kopií u Hyacinthus orientalis (Ingle et al., 1975), na haploidní genom, ale transkripčně aktivní je jen velmi malá část (Carmo-Fonseca et al., 2000). U Pissum sativum je to jen přibližně 5 % (Gonzalez-Melendi et al., 2001), zatímco u A. thaliana je to přibližně 10 % (Mozgova et al., 2010). Bylo prokázáno, že počet podjednotek, potažmo genů rDNA, u eukaryot koreluje s velikostí genomu (Prokopowich et al., 2003).

Nejčastěji se v haploidním genomu rostlin vyskytuje pouze jediný pár 45S rDNA lokusů (Roa a Guerra, 2012), ale jejich počet může být i podstatně vyšší, jako je tomu u Kyllinga brevifolia, která má v diploidním genomu celkem 45 lokusů (Sousa et al., 2011). Rostliny s monocentrickými chromozomy mají obecně nižší počet NOR, než rostliny s holokinetickými chromozomy a stejně tak je vyšší počet NOR u nahosemenných (Gymnospermae), než u krytosemenných (Magnoliophyta) (Roa a Guerra, 2012). Bylo navíc zjištěno, že lokusy 45S rDNA, se preferenčně vyskytují v subtelomerické oblasti krátkých ramének rostlinných i zvířecích chromozomů (Lima-de-Faria, 1976).

Obr. 9. Struktura rostlinného 45S rDNA lokusu. Geny 18S, 5,8S a 25/28S jsou vzájemně odděleny vnitřními přepisovanými mezerníky (internal transcribed spacer – ITS). Součástí celé přepisované podjednotky je i vnější přepisovaný mezerník (external transcribed spacer – ETS). Podjednotky jsou od sebe odděleny nepřepisovaným mezigenovým mezerníkem (intergenic spacer – IGS). Upraveno podle (Eickbush a Eickbush, 2007).

b) gen 5S rDNA o velikosti 120 bp vytváří obdobnou tandemovou repetici, ve které jsou jednotlivé sekvence genu odděleny nepřepisovanou mezerníkovou sekvencí (nontranscribed spacer – NTS) (Shibata a Hizume, 2002). Obvykle je 5S rDNA tandemová repetice u vyšších eukaryot lokalizována na jiném místě genomu, než 45S rDNA lokus (Hemleben a Grierson, 1978; Heslop-Harrison, 2000), ale u některých skupin nahosemenných rostlin mohou být geny 5S rDNA součástí lokusu 45S rDNA. Jednotlivé sekvence genu 5S rDNA, případně krátké tandemy jsou v takovém případě lokalizovány v IGS sekvenci mezi genem 25S a 16S rDNA (Garcia a Kovarik, 2013). Počet kopií 5S rDNA bývá u rostlin obvykle vyšší, než počet kopií genů zahrnutých v lokusu 45S rDNA. Pohybuje se v rozmezí od 3 600 kopií u Matthiola incana (Hemleben a Werts, 1988) po 100 000 kopií u rodu Linum (Goldsbrough et al., 1981), ale žádná přímá

45 korelace mezi počtem kopií 45S rDNA a 5S rDNA nebyla zjištěna (Maluszynska et al., 1998). Navíc je tento poměr u některých rostlin obrácený. Příkladem může být Lycopersicon esculenium (Lapitan et al., 1991). Počet lokusů 5S rDNA je, stejně jako v případě 45S rDNA, druhově specifický, ale mezidruhově variabilní. Příkladem může být případ A. cepa a A. schoenoprasum, které ve svých genomech nesou dva rozdílně velké lokusy 5S rDNA (Shigyo et al., 1996), zatímco jim blízce příbuzné druhy nesou lokus pouze jeden (vztaženo na haploidní genom), (Do a Seo, 2000). Tato skutečnost je spojena i s existencí dvou různých repetitivních jednotek tvořených genem a NTS sekvencí (350 bp a 520 bp), které lokusy tvoří (Shibata a Hizume, 2002). Podobně je tomu například u Pissum sativum (Ellis et al., 1988). Z evolučního hlediska patří geny pro rRNA mezi jedny ze sekvenčně nejkonzervovanějších v eukaryotických genomech (Eickbush a Eickbush, 2007), ale mezerníkové oblasti patří naopak mezi jedny z nejvariabilnějších. Díky tomu se jich využívá při taxonomických studiích, kdy základním hodnotícím kritériem je délka mezerníkové oblasti a její nukleotidová sekvence (Rogers a Bendich, 1987; Pasolini et al., 2006; Campo et al., 2009).

2.5.2. 45S rDNA u rodu Allium Nejvíce informací o 45S rDNA lokusu rostlin rodu Allium pochází ze studií provedených na Allium cepa. Nachází se na dvou chromozomech haploidního genomu a to na krátkém raménku subtelomerického chromozomu 6 a na krátkém raménku submetacentrického chromozomu 8, který je nejmenší z celého genomu (Ricroch et al., 1991). Dodatečně pak byl detekován ještě další lokus a to na dlouhém raménku jednoho z chromozomů 8 (Panzera et al., 1996). Dalším zástupcem rodu Allium, u kterého byl lokus 45S rDNA lokalizován, je Allium fistulosum. V jeho genomu se nachází taktéž čtyři lokusy a to na krátkých raméncích chromozomů 5 a 8 (Ricroch et al., 1991). Allium cepa není jediným druhem rodu Allium, u kterého byl popsán polymorfismus v počtu NOR. U Allium schoenoprasum byly dříve popisovány pouze dva NOR a to na krátkých raméncích chromozomu 8. Až studie na několika britských populacích odhalila přítomnost dalšího 45S rDNA lokusu na chromozomu 7. Tento lokus může být přítomen buďto pouze na jednom, nebo na obou chromozomech tohoto páru (Bougourd a Parker, 1976). Podrobnější studie odhalila, že pokud je v populaci přítomen lokus 45S rDNA na chromozomu 7, nemusí být vždy transkripčně aktivní a podílet se na formování jadérka. U ostatních populací nebyla přítomnost lokusu 45S rDNA na chromozomu 7 zjištěna (Garrido et

46 al., 1994). Další zástupci rodu Allium s variabilním počtem NOR jsou Allium flavum (Loidl a Greilhuber, 1983), Allium subvillosum (Jamilena et al., 1990) a Allium sphaerocephalon (Garrido-Ramos et al., 1992). Mimo rod Allium byl variabilita v počtu 45S rDNA lokusů uvnitř jednoho druhu popsána například u Oryza sativa (Chung et al., 2008). Jedna z teorií diskutovaných v souvislosti s přítomností sekvence 45S rDNA na chromozomu 7 A. schoenoprasum a její transkripční neaktivitou hovoří o umlčení transkripce rDNA genů NOR jako o prvním kroku jeho eliminace z genomu během evoluce (Garrido et al., 1994). Existují určité poznatky o tom, že existuje evoluční tendence ustálit počet NOR v genomu na jednom páru (Roa a Guerra, 2012), ale důvod ani mechanismus tohoto procesu nejsou zatím známy. Umlčení exprese genů pro rRNA však může být zahrnuto nejen v evolučních procesech, ale může také souviset s ontogenezí. Transkripční aktivita rRNA genů se totiž podle dostupných poznatků mění. V případě buněk získaných z kořenů klíčících semen A. cepa byly po hybridizaci se sondou specifickou k 45S rDNA sekvenci detekovány silné signály na čtyřech z pěti dříve popsaných lokusech Jen lokus na dlouhém rameni chromozomu 8 se nepodařilo lokalizovat. Oproti tomu v případě, že byly použity buňky adventivních kořenů, bylo možné detekovat pouze dva silné signály. Zbývající dva lokusy poskytovaly jen velmi slabý signál. Přesný mechanismus není doposud objasněn, ale jako možná příčina byla diskutována vzrůstající úroveň methylace DNA, která je hlavním znakem umlčování genů, v těchto dvou lokusech (Hasterok a Maluszynska, 2000). Pro tento předpoklad hovoří i transkripční dynamika 5S rDNA pozorovaná v průběhu ontogeneze Arabidopsis thaliana (Benoit et al., 2013). Hlavním důvodem, proč byla rDNA navržena a diskutována jako možná náhrada za klasickou telomerickou sekvenci u rodu Allium byla její preference k lokalizaci u konců chromozomů a hlavně pak její struktura. Jakožto dlouhá tandemová repetice snadno podléhá rekombinaci, která je současně jedním z mechanismů pro alternativní udržování telomer. U A. cepa může vést rekombinace mezi sekvencemi rDNA k jevu nazývanému skákající rDNA („jumping NOR“), při kterém dochází k výměně terminálních oblastí chromozomů (Schubert a Wobus, 1985).

3. Cíle diplomové práce:

Náplní této diplomové práce je bližší charakterizace lokusů rDNA u vybraných druhů rodu Allium se zaměřením na detailnější objasnění možné role rDNA jakožto telomerické sekvence a dále pak hledání a testování nových kandidátních telomerických sekvencí u tohoto rodu.

Detailní cíle této práce je možné shrnout do následujících bodů:

1) Lokalizace 45S rDNA A. ursinum. a. Lokalizace 45S rDNA pomocí sondy pro 25S rDNA. b. Porovnání lokalizace komponent 45S rDNA pomocí sond specifických pro genovou a mezerníkovou oblast (IGS) A. ursinum

2) Cytogenetická analýza genomů A. ursinum a A. cepa pro zjištění přítomnosti shodných sekvencí v telomerických oblastech chromozomů. a. Genomová in situ hybridizace (GISH) mezi chromozomy A. ursinum a genomovou DNA (gDNA) A. cepa. b. GISH mezi chromozomy A. cepa a gDNA A. ursinum

3) Lokalizace ostatních kandidátních telomerických sekvencí.

4. Materiál a metody: 4.1. Seznam použitých roztoků:

 EB pufr: 100mM Tris-HCl (pH 8,0), 50mM EDTA (pH 8,0), 500mM NaCl  BTE: 50mM Tris-HCl (pH 8,0), 1mM EDTA  TE: 10mM Tris-HCl (pH 8,0), 1mM EDTA (pH 8,0)

 10x NT pufr: 0,5M Tris-HCl (pH 7,5), 50mM MgCl2 0,05% BSA (bovine serum

albumine, albumin z bovinního séra), ddH2O  50x TAE: 2M Tris, 2M kyselina octová, 50mM EDTA  10x citrátový pufr: (100mM kys. citrónová, 100Mm citronan sodný; poměr 4:60)  Směs cytolytických enzymů: 1% cytohelikáza, 1% pektolyáza, 1% celuláza, mícháno v poměru 1:1:1  20x SSC: 3M NaCl, 300mM citrát sodný, pH 7,0.  Formaldehydová fixáž: 3,7% formaldehyd, 2x SSC  Hybridizační pufr: 50% formamid, 10% dextransulfát, 2x SSC  Formamidový odmývací roztok: 20-50% formamid, 0,1-2x SSC  Blokovací roztok: 5% bovine serum albumin, 0,2% Tween-20, 4xSSC  4T pufr: 4x SSC (pH 7,0), 0,05% Tween-20  10x TN pufr: 1M Tris-HCl (pH 7,5), 1,5M NaCl  TNT pufr: 1x TN pufr, 0,05% Tween-20  Směs protilátek:  streptavidin-Alexa Fluor 594 (Invitrogen), (výsledná koncentrace 3µg/ml), TNB pufr  streptavidin (Invitrogen), (výsledná koncentrace 3µg/ml), TNB pufr  antistreptavidin-biotin (Vector Laboratories), (výsledná koncentrace 1µg/ml), TNB pufr  myší antidigoxigenin (Jackson Immuno-Research) ředěno 1:250 v TNB pufru  kozí anti-antidigoxigenin-Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) ředěno 1:200 v TNB pufru  TNB pufr: 1x TN pufr, 0,05% Tween-20, 0,5% Blocking Reagent (Roche)

4.2. Materiál: 4.2.1. Modelové organismy: Jako modelové organismy byly použity dva zástupci rodu Allium: a) Allium cepa, n = 8, klad 1, podrod Cepa, sekce Cepa, Variety: Snowball, Všetana, Stuttgart, Piroska

b) Allium ursinum, n = 7, klad 3, podrod Amerallium, sekce Arctoprasum, místo sběru: Černovický hájek, Brno období sběru: květen 2012, květen 2013, duben 2014 Tyto druhy byly vybrány záměrně kvůli svému fylogenetickému postavení a také kvůli dostupnosti. A. cepa je možné pěstovat v umělých podmínkách a přestože se pro A. ursinum nepodařilo připravit vhodné kultivační podmínky, jeho zdroje z volné přírody byly pro potřeby tohoto projektu dostačující.

4.2.2. Genetický materiál: Genomová DNA (gDNA) pro přípravu celogenomových a druhově specifických rDNA sond byla izolována z listů A. cepa a A. ursinum. Mladé listy A. cepa byly sbírány z rostlin v dobré kondici rostoucích v kontrolovaných podmínkách ve fytotronu a ve skleníku. Neprodleně po odstřihnutí z rostliny byly listy zamraženy v tekutém dusíku a uchovávány při teplotě – 80 °C. Listy A. ursinum byly sbírány z volně žijící populace. Po odebrání byly listy nejprve uloženy pro přepravu do suchého ledu, poté zamraženy v tekutém dusíku a uloženy při – 80 °C. DNA izolovaná z těchto listů byla použita pro přípravu celogenomových sond a byly z ní polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) amplifikovány druhově specifické sekvence pro genovou a IGS oblast 45S rDNA lokusu. Jako obecná 25S rRNA sonda byla použita sekvence genu 25S rRNA Lycopersicon esculentum, klonovaná do plazmidu v bakteriích Escherichia coli (Kiss et al., 1989). Pro přípravu obecné 45S rDNA sondy byl využit BAC klon T15P10 (AF167571) obsahující sekvenci 45S rDNA Arabidopsis thaliana, nesený v bakteriích E. coli (Mandáková et al., 2013).

4.3. Metody:

Během zpracování této diplomové práce jsem používal převážně cytogenetické metody za účelem zjištění přítomnosti a lokalizace studovaných sekvencí. Tato metodika má čtyři základní kroky a to: a) přípravu sond, b) přípravu preparátu, c) hybridizaci sondy s preparátem a d) vyhodnocení.

4.3.1. Příprava sond: 4.3.1.1. Izolace DNA: Izolace plazmidové DNA byla provedena pomocí komerční sady a GenEluteTM HP Plasmid Miniprep Kit (Sigma). Genomová DNA modelových rostlin byla izolována nejprve pomocí komerční sady GenEluteTM Plant Genomic DNA Miniprep Kit (Sigma). Tato metoda se ukázala jako postačující pro izolaci gDNA A. cepa, ale efektivita izolace gDNA A. ursinum byla příliš nízká. Proto byla použita upravená metoda podle S. L. Dellaporta (Dellaporta et al., 1983): 1) V tekutém dusíku rozdrtit 0,5g materiálu a rozpustit v 500 µl EB pufru (viz seznam použitých roztoků) s přidaným merkaptoethanolem (Sigma), (7 µl na 10ml EB pufru). 2) Po přidání 35 µl 20% SDS inkubovat deset minut při 70 °C. 3) Do vytemperovaného roztoku přidat 130 µl 5M KAc, promíchat a nechat odstát na ledu. 4) Vzorek po ochlazení stočit na 17 000 g po dobu pěti minut a při teplotě 4 °C. 5) Supernatant přepipetovat a přidat 60 µl 3M NaAC a 640 µl isopropanolu, čímž se vysráží DNA. Roztok lehce promíchat a nechat odstát při pokojové teplotě po dobu minimálně deseti až patnácti minut. 6) Vysráženou DNA centrifugovat na 17 000 g v nechlazené centifuze po dobu patnácti minut. 7) Odsát supernatant, pelet opláchnout 70% EtOH, usušit a rozpustit přes noc ve 200 µl BTE (viz seznam použitých roztoků). 8) Rozpuštěnou DNA rychle zcentrifugovat, supernatant přepipetovat k 2 - 6 µl RNázy A (10 mg/ml,DNase free, Aplichem) a nechat inkubovat minimálně 60 minut při 37 °C. 9) Přidat 12 µl 0,5M EDTA, 60 µl 10% SDS, 7 µl proteinázy K (10 mg/ml, Sigma) a nechat inkubovat přes noc při 50 °C. 51

10) Po deproteinaci přidat k roztoku DNA 120 µl směsi fenol-chloroform (vzájemný poměr 1:1) na 200 µl rozpouštěcího BTE a deset minut lehce promíchávat. Následně centrifugovat 10 minut při 15 000 až 20 000 g. Supernatant přepipetovat k 120 µl směsi fenol-chloroform. Extrakci opakovat minimálně třikrát. 11) Po posledním opakování přepipetovat supernatant k 500 µl směsi chloroform- isoamylalkohol (Sevageova směs, poměr 24:1). Pět minut lehce promíchávat, centrifugovat dvě minuty při 7 000 g a vyměnit Sevageovu směs (spodní vrstvu). Celý proces opakovat minimálně třikrát. 12) Přenést roztok DNA k roztoku NaCl (4 µl 5M NaCl na 200 µl roztoku DNA, výsledná koncentrace 100 mM) a vysrážet DNA isopropanolem (120 µl isopropanolu na 200 µl rozpouštěcího BTE, srážet při pokojové teplotě), nebo ethanolem (410 µl 96% ethanolu na 200 µl rozpouštěcího BTE, srážet při teplotě 4 °C). 13) Centrifugovat 10 minut na 17 000 g, odstranit supernatant, pelet opakovaně

opláchnout 70% EtOH, vysušit a rozpustit ve sterilní H2O.

4.3.1.2. Polymerázová řetězová reakce (PCR): Pro amplifikaci genové a IGS oblasti lokusů rDNA A. cepa a A. ursinum byla provedena PCR se dvěma sadami specifických primerů (Tab. 1). Primery byly navrženy na základě sekvenčních dat konzervovaných oblastí 45S rDNA lokusu A. thaliana tak, aby pokrývaly celý lokus 45S rDNA ve dvou produktech, přičemž první z produktů PCR představoval převážně mezigenovou oblast (IGS) a druhý představoval genovou oblast sekvence včetně ITS, (Obr. 10). Primery byly připraveny na zakázku firmou IDT-KRD.

Sada Název Lokalizace Sekvence primerů primeru sekvence 25S-F CCCAGTGCTCTGAATGTCAA 25S rDNA 1 18S-R GAATCGAACCCTAATTCTCCG 18S rDNA 18S-F CTAGAGCTAATACGTGCAACAAAC 18S rDNA 2 25S-R GACGGTCTAAACCCAGCTCA 25S rDNA

Tab. 1. Primery použité pro amplifikaci specifických oblastí 45S rDNA sekvence.

Obr. 10. Pokrytí 45S rDNA sekvence pomocí dvou sad primerů s produkty specifickými pro genovou a IGS oblast. Upraveno podle (Tucker et al., 2010).

PCR byla prováděna pomocí Phusion Hot Start II DNA Polymerase (Thermo Scientific) podle návodu doporučeného výrobcem na přístrojích Bio-Rad C1000TM a Biometra. Složení reakční směsi (50 µl) Podmínky reakce: 600 ng gDNA 98 °C 30 sec 10 µl CG buffer (5x) 98 °C 10 sec 1 µl 10mM dNTPs 55,7 °C* 30 sec 35x 2 µl přímý primer (10 µM) 72 °C 3 min 2 µl zpětný primer (10 µM) 72 °C 10 min 0,5 µl Phusion DNA Polymerase (2u/µl) 10 °C do ukončení reakce

Sterilní ddH2O do objemu 50 µl *v závislosti na požadované skladbě produktů byla reakce prováděna při teplotě nasedání primerů 55,7 °C, 64,6 °C, nebo 68,9 °C. Kontrola správného průběhu PCR byla provedena pomocí konvenční elektroforézy na 0,8% agarózovém gelu. Příslušné množství agarózy je rozvařeno v odpovídajícím objemu 1x TAE pufru (viz seznam použitých roztoků) a po ochlazení na přibližně 60 °C je přidán ethidium bromid (10 mg/ml) v množství 1µl na 10ml objemu agarózy. Pak se gel nechá zatuhnout ve formě s hřebínkem pro jamky. Standardem pro vyhodnocení délky produktů a jejich koncentrace byl GeneRulerTM 1 kp DNA Ladder (Fermentas). Data byla získána na přístroji Fujifilm Lass-3000 a vyhodnocena na programu MultiGauge V3.0.

4.3.1.3. Značení sond: Pro značení sond byly použity dva základní přístupy. Prvním z nich byla metoda označovaná jako nick-translace a druhým metoda využívající začleňování značených nukleotidů během PCR. Metoda nick-translace byla využita pro přípravu celogenomových a rDNA specifických sond, zatímco metoda využívající začleňování značených nukleotidů byla využita při přípravě sond pro ostatní kandidátní telomerické sekvence identifikované RepeatExplorerem

Nick-translační metoda: Metoda nick-translace, zvaná někdy také „Head translation“, využívá jednořetězcových zlomů indukovaných na náhodných místech genomu působením endonukleázy (DNáza I), které jsou zacelovány aktivitou DNA polymerázy. Během oprav takto vzniklých zlomů jsou do nově syntetizovaných řetězců začleňovány značené nukleotidy (Rigby et al., 1977). Nukleotidy mohou být značené přímo pomocí fluorescenčních sloučenin, nebo nepřímo pomocí chemických látek jako je biotin, nebo digoxigenin. Při zpracování této diplomové práce byl využit postup převzatý z (Mandakova et al., 2010) Složení reakce pro nick-translaci: 5 µl 10x NT pufr 5 µl dNTP (0,4mM dATP; 0,4mM dGTP; 0,4mM dCTP; 0,08mM dTTP) 5 µl 0,1M merkaptoethanol (Sigma) 1-4 µl biotin-dUTP (1nmol/µl) Alexa fluor 488-dUTP (1nmol/µl) digoxigenin-dUTP (1nmol/µl) 1,5 µl DNA polymeráza (1u/µl, Fermentas) 0,5 µl DNáza I (1u/µl, Fermentas); ředěná 1:9 v DNáza I pufru 1 µg DNA (sonda z 1 µg gDNA stačí na provedení pěti hybridizačních reakcí)

doplnit do 50 µl ddH2O.

Reakce probíhala při teplotě 15 °C v přístroji MJ Research PTC-200. Doba reakce je závislá na použité DNA. Při přípravě celogenomových sond z A. ursinum a A. cepa byla doba štěpení přibližně 95 minut, při přípravě sond z plazmidové DNA přibližně 35 minut. Pro

54 stanovení přibližné doby štěpení, stejně jako pro stanovení vhodných poměrů DNA polymerázy a DNázy I, je nutná optimalizace. Kontrola naštěpení sond na požadovanou délku se provádí pomocí konvenční elektroforézy na 1% agarózovém gelu. Délka štepených sond je stanovena podle GeneRulerTM 50 bp DNA Ladder (Fermentas). Pokud jsou sondy příliš dlouhé, je nutné reakci prodloužit. Pokud mají požadovanou délku, zastaví se reakce přidáním 1 µl 0,5M EDTA a zahřátím reakční směsi na 60 °C po dobu 10 minut. Po ukončení reakce jsou sondy sráženy přidáním 3M NaAc, v množství odpovídajícím 1/10 objemu nick-translační reakce, a absolutního EtOH v množství rovnajícím se trojnásobku objemu nick-translační reakce + 3M NaAC. Po srážení je roztok DNA centrifugován při přetížení 17000g po dobu 15 minut. Supernatant je odstraněn, pelet opatrně opláchnut 70% EtOH a vysušen. Takto připravené sondy jsou připravené k použití, nebo je možné je po kratší dobu skladovat. Úspěšné začlenění značeného dUTP do sondy je možné ověřit reakcí části sondy s protilátkou proti použité značce a následnou detekcí signálu. V případě fluorescenčních sond je možná i vizuální kontrola přímo na gelu po elektroforéze, neboť po ozáření UV světlem vydává fluorescenční barvivo jasný signál.

Metoda začleňování značených nukleotidů v průběhu PCR Metoda využívající začleňování značených nukleotidů do sekvence sondy je jednoduchou PCR využívající primery ohraničující budoucí sondu. dNTP nezbytné pro správný průběh reakce jsou obohaceny o značené dUTP, což v tomto případě byl biotinylovaný dUTP (Roche). Kandidátní telomerové sekvence (Tab. 2) byly získány z celogenomových sekvenačních dat A. cepa po zpracování programem RepeatExplorer (osobní komunikace, Peška 2013, nepublikováno). Vybrány byly satelitní sekvence, u kterých existoval předpoklad, že by mohly představovat hledanou telomerickou sekvenci. Podle protokolu uvedeného v části 4.2.1.3. byly z těchto sekvencí, metodou PCR s biotinem značenými nukleotidy, připraveny sondy pro fluorescenční in situ hybridizaci. Následně byla provedena hybridizace těchto sond s chromozomy Allium cepa s cílem objasnit umístění těchto sekvencí na chromozomech a zjistit, zda nevykazují lokalizaci typickou pro telomerické sekvence. Detekce sond byla provedena pomocí streptavidinu s následnou amplifikací podle protokolu uvedeného v části 4.3.2.7.

Primery sonda 1Rev 1Fw Cl 20 GCGTTTAACGTTCTCCTCGA GTAGAACATGGAAAGAGCTTC Cl 37 ATTTCCATTCTACCGATT ACCTTAATTCGAGCTTTG Cl 39 GATGGGTTTACTCACGCTGG CCTCCTGAGCTCCAGAAC

Tab. 2. Přehled použitých kandidátních sekvencí

4.3.2. Příprava preparátů: 4.3.2.1. Sběr kořenových špiček: Provádí se u vzrostlých rostlin z čerstvých, nově narostlých kořenů, nebo z klíčících semen. Nejlepší možností, jak indukovat růst nových kořenů u vzrostlých rostlin, je jejich vystavení suchu a následné zalití, nebo odstranění části kořenového systému a přesazení do čerstvé hlíny. Ke sběru jsou vhodné pouze kořínky staré maximálně jeden až dva dny, ideálně jen několik hodin. Kořínky by měly být světlé, téměř průhledné a kořenová špička by měla být mléčně zakalená. Při sběru je nutné zaměřit se pouze na kořenové špičky, aby se snížilo množství nevyužitelného materiálu a tudíž i přebytečného materiálu na sklech, který může zhoršovat průběh hybridizace, detekce sond a vyhodnocení.

4.3.2.2. Příprava kořenových špiček: Opláchnuté špičky vyndáme z vody a následuje předpůsobení, které napomůže dosažení co nejvyššího poměru mezi buňkami v mitóze vůči buňkám s dekondenzovanými chromozomy v interfázi. Předpůsobení je možné provést několika různými způsoby. Při své práci jsem testoval nejprve inkubaci v ledové vodě “přes noc” (od sběru do druhého dne, tedy 12 až 24 hodin) a následně předpůsobení pomocí bromnaftalenu. Právě předpůsobení pomocí 100% bromnaftalenu se u Alliaceae ukázal jako vhodnější postup. V případě použití postupu s bromnaftalenem postupujeme následovně: 1) Špičky opláchneme v destilované vodě a osušíme. Osušení je nutné, protože bromnaftalen a voda jsou vzájemně nemísitelné, a pokud špičky řádně neosušíme, voda k nim bromnaftalen nepustí. Musíme ale zároveň dbát na to, aby špičky nezaschly úplně a nedošlo k jejich znehodnocení.

2) Doba působení bromnaftalenu je minimálně 3 – 4 hodiny. Provádí se ve tmě, protože bromnaftalen je světlem degradován. S bromnaftalenem je nutné manipulovat zásadně v digestoři, případně v dobře větraném prostoru. 3) Po působení bromnaftalenem následuje fixace špiček ve fixačním roztoku (etanol “EtOH” + kyselina octová v poměru 3:1). Před fixací je opět důležitý oplach špiček v destilované H2O, následně oplach ve fixačním roztoku a v posledním kroku naložení špiček do fixačního roztoku. Ve fixačním roztoku je možné nechat špičky i několik dní, v případě dlouhodobého skladování je vhodné fixační roztok vyměnit za 70% EtOH a uložit špičky do mrazničky. Samotná fixace ve směsi EtOH + kyselina octová by měla trvat několik hodin, ideálně přes noc.

4.3.2.3. Opracování špiček celulytickými enzymy Dalším krokem při přípravě preparátu pro hybridizaci je narušení buněčných stěn kořenových špiček ve směsi celulytických enzymů. Postup je následující: 1) Opakovaný oplach špiček v citrátovém pufru (viz seznam použitých roztoků) minimálně 3x5 minut při pokojové teplotě (room temperature, dále jen RT), na třepačce. 2) Štěpení buněčné stěny buněk kořenových špiček ve směsi enzymů (viz seznam použitých roztoků): a. Cytohelikáza (Sigma) b. Celuláza (Onozuka R10), (Serva) c. Pektolyáza (Duchefa) 3) Doba štěpení závisí na kvalitě a stáří špiček, před ukončením štěpení je nutné vyzkoušet správné natrávení. Průměrná doba štěpení u A. ursinum se pohybuje okolo devadesáti minut. Správně natrávené špičky se snadno rozpadají i po jemném dotyku preparační jehly. 4) Proces trávení je možné ukončit přidáním citrátového pufru, odpipetováním enzymatické směsi a opakovaným opatrným oplachem v citrátovém pufru. V případě, že chceme směs enzymů použít opakovaně, je možné směs enzymů odpipetovat, po stočení v centrifuze zamrazit a opětovně použít. Doba štěpení u opakovaně používaných enzymů je delší přibližně o 5 – 15 minut/štěpení. 5) Po štěpení musí být špičky uloženy v citrátovém pufru, který zabrání jejich vysychání a následně jsou zpracovány při přípravě preparátů. V této fázi není možné kořenové špičky dlouhodobě skladovat.

4.3.2.4. Příprava preparátů pro hybridizaci: Existuje několik postupů přípravy skel s fixovanými chromozomy. V případě práce s rostlinami rodu Allium je nejvhodnější tento: 1) Pomocí pipety, pinzety, nebo Pasteurovy pipety přenést jednu kořenovou špičku na podložní sklo i s menším množstvím citrátového pufru. 2) Rozmělnit špičku pomocí preparačních nebo injekčních jehel až na samostatné buňky, případně malé shluky buněk. Všechny kousky pletiv, které nelze rozsuspendovat, je nutné před dalším krokem odstranit. 3) K buněčné suspenzi připipetovat 50 - 60% kyselinu octovou, která způsobí rozpad zbytků buněčných stěn, praskání cytoplazmatické membrány a degradaci složek cytoplazmy. Objem je potřeba empiricky odhadnout. 4) Sklíčko s buněčnou suspenzí položíme na plotýnku předehřátou na 50 °C. Preparační jehlou lehkým taženým pohybem „promícháváme“ buněčnou suspenzi. V závislosti na míře natrávení buněk inkubujeme přibližně dvě minuty. V případě, že dochází k nadměrnému vypařování kyseliny octové, je nutné ji znovu do suspenze přidat. 5) Po inkubaci do buněčné suspenze na podložním skle přidáme větší množství fixačního roztoku (EtOH + kyselina octová v poměru 3:1). Je nutné dbát na to, aby nedošlo k odtečení suspenze ze skla. Poté podložní sklo ponoříme do již zmíněného fixačního roztoku a necháme ho v něm několik minut. Obvykle stačí doba nutná pro přípravu dalšího skla. 6) Po vytažení z fixačního roztoku necháme sklo oschnout a pokračujeme fixací v 3,7% formaldehydového roztoku (viz seznam roztoků). Nejprve je preparát opláchnut 5 minut v 2x SSC po dobu 5 minut a následuje fixace v 3,7% formaldehydové fixáži po dobu 10 minut. Po vytažení z fixáže je preparát třikrát opláchnut v 2x SSC, vždy 5 minut, odvodněn vzestupnou EtOH řadou a vysušen.

4.3.2.5. Předhybridizační úprava skel: Po osušení je vhodné skla prohlédnout pod fázovým a případně i fluorescenčním mikroskopem po barvení pomocí DAPI (4',6-diamidin-2-fenylindol; 2-(4-amidinofenyl)-1H- indol-6-carboxamidin). Zjištěné poznatky o množství chromozomových sestav, jejich kvalitě a množství nečistot jsou důležité pro vytřídění a další zpracování skel. Úprava skel se provádí působením RNázy a pepsinu s cílem odstranit z nich RNA a proteiny. RNA by mohla hybridizovat se sondou a poskytovat falešně pozitivní výsledky, zatímco proteiny a zbývající složky cytoplazmy mohou bránit správnému průběhu hybridizace. RNA hybridizující se sondou a také proteiny reagující s látkami používanými pro

58 detekci signálu při značení sond pomocí chemických značek jsou také zdrojem silného pozadí. Degradace RNA pomocí RNázy A (DNase free, Aplichem): 1) Oplach skel v 2x SSC roztoku minimálně 1x 5 minut 2) Na každé sklo nanést 200 µl RNázy A o koncentraci 100 µg/ml a překrýt krycím sklem. Inkubovat jednu hodinu při 37 °C ve vlhké komůrce, čímž se zabrání vysychání roztoku RNázy A. 3) Oplach skel v 2x SSC roztoku 3x 5 minut.

Inaktivace RNázy A a odstranění proteinů a zbytků cytoplazmy pomocí pepsinu (Sigma): 1) Oplach skel v 2x SSC roztoku po aplikaci RNázy 2) Oplach skel v 0,01M roztoku HCl 1x 5 minut 3) Inkubace skel v roztoku pepsinu o koncentraci 10 – 100 µg/ml. Čas je nutné otestovat podle množství nečistot na skle. Je vhodné použít roztok o nižší koncentraci a nechat působit delší dobu. 4) Oplach 3x 5 minut v 2x SSC, fixace v 3,7% roztoku formaldehydu 10 minut při pokojové teplotě, oplach 3x 5 minut v 2x SSC. 5) Skla je následně možno odvodnit vzestupnou alkoholovou řadou (70, 80 a 96% EtOH) vysušit a použít pro hybridizaci, nebo uschovat v bezprašných podmínkách, ale vhodnější je přebarvit pomocí DAPI (1µg/ml) a pod fluorescenčním mikroskopem zkontrolovat výsledek předhybridizačních úprav, hlavně pak přítomnost zbytků cytoplazmy. Pokud kontrola ukáže přítomnost zbytků cytoplazmy, je možné pokusit se o jejich odstranění pomocí pepsinu opakovaně. 6) Po kontrole skel pod fluorescenčním mikroskopem, nebo po působení pepsinu je nutné skla znovu opláchnout v 2x SSC a fixovat ve formaldehydové fixáži tak, jak je popsáno v bodě 4) s tím, že po posledním oplachu v 2x SSC jsou skla odvodněna ve vzestupné koncentrační ethanolové řadě, vysušena a uskladněna.

4.3.2.6. Hybridizace sond a chromozomů fixovaných na podložních sklech Sondu z jedné nick-translační reakce, tj. 1 µg, po vysrážení, přečištění a vysušení rozpustíme ve 125 až 150 µl hybridizačního roztoku (viz seznam použitých roztoků). Tento objem je vhodný pro rozpouštění celogenomové sondy. Pro sondy rDNA je možné rozpouštět sondu i ve větším objemu, protože pro hybridizaci postačují nižší koncentrace. Sondu

59 rozpouštíme hodinu při teplotě 37 °C ve vyhřívané míchačce při rychlosti 450 RPM (Revolutions Per Minute; otáčky za minutu). Takto připravenou sondu pipetujeme na skla po 22 µl a lehce přimáčkneme krycím sklem o rozměrech 22x22. Pokud preparát zabírá na podložním skle větší plochu, je možné pipetovat větší objem a použít větší krycí sklo. Hrany krycího skla oblepíme kaučukovým lepidlem, čímž se zabrání vysychání. Dalším krokem je denaturace, prováděná zahřátím na 80 °C po dobu dvou minut. Následně jsou skla umístěna do vlhké komůrky a inkubována při 37 °C přes noc.

4.3.2.7. Odmytí sondy Po opatrném odstranění krycího skla pomocí pinzety je proveden oplach preparátu v 2x SSC po dobu 5 minut a v roztoku formamidu (viz seznam použitých roztoků) 3x 5 minut s cílem odstranit nenavázané a nespecificky vázané sondy. Následuje oplach v 2x SSC po dobu 2x 5 minut a v 4T pufru (viz seznam použitých roztoků) 5 minut. Všechny oplachy během odmývání sondy a její detekce se provádí ve vyhřáté vodní lázni s míchačkou při teplotě 37 °C, nebo 42 °C. Stringence odmývání sond se optimalizuje pomocí koncentrace formamidu v odmývacím roztoku (od 25 % do 50 %), iontové síly pufru SSC (od 0,1x do 2x) a teplotou lázně. Nejpřísnějších podmínek je dosaženo při použití roztoku 0,1x SSC, 50% formamid a teplotě 42 °C.

4.3.2.8. Detekce sondy Na preparáty je po odmytí sondy naneseno 100 µl blokovacího roztoku (viz seznam použitých roztoků), je překryt krycím sklem a 30 minut inkubován ve vlhké komůrce při teplotě 37 °C. Následují dva pětiminutové oplachy ve 4T pufru a na preparát je nanesena směs protilátek. Po překrytí krycím sklem je preparát inkubován opět 30 minut ve vlhké komůrce při 37 °C. Poté je opláchnut dvakrát v 4T pufru, pokaždé 5 minut, a jednou v TNT pufru (viz seznam použitých roztoků) 5 minut. V případě, že nenásleduje amplifikace signálu, je preparát odvodněn vzestupnou EtOH řadou, vysušen a může proběhnout detekce signálu. Pokud je prováděna amplifikace signálu, je na preparát po oplachu v TNT pufru nanesena směs protilátek a inkubace probíhá opět při 37 °C ve vlhké komůrce po dobu 30 minut. Následné oplachy v TNT pufru 2x 5 minut se střídají s inkubací se směsí protilátek, dokud není kaskáda amplifikace signálu kompletní. Po posledním oplachu v TNT pufru je preparát odvodněn vzestupnou ethanolovou řadou a vysušen. Po vysušení je na preparát

60 nanesen vectashield s DAPI a po překrytí krycím sklem je možná kontrola pod fluorescenčním mikroskopem. Při vypracovávání této práce byly využity jak přímo značené, tak nepřímo značené sondy. Nepřímé značení bylo prováděno pomocí biotinu a digoxigeninu. Jednoduchá detekce biotinu byla prováděna pomocí streptavidin-Alexa Fluor 594 (Invitrogen), amplifikace signálu pak pomocí streptavidinu (Invitrogen) a biotinylovaného antiavidinu s následnou detekcí streptavidinem-Alexa Fluor 594 (Invitrogen). V případě značení digoxigeninem byla detekce prováděna pomocí myšího antidigoxigeninu (Jackson Immuno-Research) a kozího anti- antidigoxigeninu-Alexa Fluor 488 (Molecular Probes), (Mandakova et al., 2013).

4.3.2.9. Zpracování a vyhodnocení dat: Analýza fluorescenčních signálů byla provedena fluorescenčním mikroskopem Olympus BX-61 s CCD kamerou Cool Cube 1 (Metasystems). Vyhodnocení signálů a jejich úprava byla provedena pomocí softwarů Adobe Photoshop CS5 a ImageJ.

5. Výsledky: 5.1. Lokalizace 45S rDNA u A. ursinum

Z kořenových špiček A. ursinum byly připraveny preparáty, na kterých byla pomocí specifických sond provedena lokalizace lokusů 45S rDNA. Nejprve byla použita sonda značená biotinem odvozená od sekvence 25S rDNA z Lycopersicon esculentum. Detekce byla provedena s následnou amplifikací. Následné vyhodnocení lokalizace sekvence 25S rDNA bylo provedeno na třiceti dvou vybraných mitózách, které splňovaly tato kritéria: a) kompletní sada čtrnácti chromozomů; b) dobrý rozestup chromozomů, který umožní stanovení počtu chromozomů; c) nepřekrývající se konce chromozomů; d) kvalitně provedená hybridizace Získaná data potvrdila mnohočetnou lokalizaci sekvence 25S rDNA na koncích chromozomů A. ursinum, ale nepotvrdila její lokalizaci, a tím ani lokalizaci genové oblasti lokusu 45S rDNA, na všech chromozomech, jak by se dalo očekávat v případě, že by tento lokus přejal funkci telomerické sekvence. Počty detekovaných lokusů 25S rDNA byly následující:  u šesti mitóz bylo detekováno deset signálů 25S rDNA sondy  u sedmi mitóz bylo detekováno jedenáct signálů 25S rDNA sondy  u čtrnácti mitóz bylo detekováno dvanáct signálů 25S rDNA sondy  u tří mitóz bylo detekováno třináct signálů 25S rDNA sondy  u jedné mitózy bylo detekováno čtrnáct signálů 25S rDNA sondy  u jedné mitózy bylo detekováno šestnáct signálů 25S rDNA sondy Ve všech případech se jednalo o signály detekované v terminální části chromozomů. Pouze dvakrát byly detekovány signály uvnitř chromozomu, jednou v případě detekce dvanácti signálů, podruhé v případě detekce šestnácti signálů. Síla signálů nebyla stejná. Zpravidla bylo na každé mitóze detekováno osm, případně deset silných signálů a dále pak různý počet signálů slabších. Lokalizace signálů byla jednotná, byly přítomny vždy pouze na jednom raménku chromozomu. Pouze ve dvou případech se podařilo zjistit lokalizaci slabších signálů na obou raméncích téhož chromozomu.

Obr. 11. Lokalizace sekvence 25S rDNA na chromozomech A. ursinum. A) chromozomy A. ursinum; B) sonda 25S rDNA Lycopersicon esculentum; C) kombinovaný obrázek; D) výřez původního obrázku s viditelnými signály na obou koncích chromozomů.

Sekvence 25S rDNA je mezidruhově vysoce konzervativní a je nepravděpodobné, že by sonda pocházející z L. esculentum nehybridizovala s 25S rDNA sekvencí A. ursinum. Je to ovšem pouze jedna z několika součástí lokusu 45S rDNA, u kterého se předpokládá, že mohl 63 roli telomer alespoň u některých chromozomů rostlin rodu Allium převzít a je tudíž možné, že se na telomerické funkci podílí některé z jeho nekódujících oblastí. Proto byly použity sondy specifické pro lokus 45S rDNA rostlin rodu Allium. Jedna z nich byla navržena tak, aby pokrývala genovou oblast sekvence 45S rDNA, zatímco druhá pokrývá oblast IGS. To umožňuje detailnější lokalizaci jednotlivých složek tohoto lokusu (Obr. 10 v části 4.3.1.). Při přípravě těchto sond byla zjištěna zajímavá skutečnost. U A. cepa existuje pro každou sadu primerů (viz tabulka č. 1) jen jeden produkt, což ukazuje na uniformitu v délce genové i IGS oblasti 45S rDNA sekvence. U A. ursinum ovšem existuje pro každou sadu primerů několik produktů o různé délce a to jak pro genovou oblast tak i pro IGS oblast 45S rDNA sekvence. To může poukazovat na variabilitu v délce těchto sekvencí (Obr. 12),

(osobní komunikace, Peška 2012, nepublikováno). Za účelem optimalizace PCR při přípravě sond pro IGS oblast byla provedena PCR při teplotním gradientu, která prokázala závislost délky hlavních produktů PCR na teplotě nasedání primerů (Obr. 13). Proto byly pro následující experimenty sondy pro IGS i genovou oblast 45S rDNA připravovány ze směsi produktů PCR reakcí prováděných při teplotě nasedání primeru 55,7 °C, 64,6 °C a 68,9 °C (Obr. 15). Potvrzení amplifikaci částí sekvence 45S rDNA, bylo provedeno hybridizací PCR produktů s 45S rDNA specifickou sondou (Obr. 14).

Obr. 12. Srovnání PCR produktů při použití 45S rDNA specifických primerů u A. cepa a A. ursinum. A) jeden specifický produkt pro mezerníkovou oblast 45S rDNA (1) a jeden specifický produkt pro genovou oblast 45S rDNA A. cepa (2); B) několik specifických produktů pro genovou (1) i mezerníkovou (2) oblast 45S rDNA sekvence A. ursinum (osobní komunikace, Peška 2012, nepublikováno). 64

Obr. 13. Závislost délky produktů PCR reakce s 45S rDNA A. ursinum specifickými primery na teplotě nasedání primerů. 1) mezerníková oblast 45S rDNA sekvence A. ursinum; 2) genová oblast 45S rDNA sekvence A. ursinum. Reakce probíhaly při teplotě nasedání primerů: A) 54 °C; B) 55,7 °C; C) 59,7 °C; D) 64,7 °C; E) 68,4 °C; F) 71,5 °C; G) 72 °C (osobní komunikace, Peška 2012, nepublikováno).

1 2

Obr. 14. Potvrzení amplifikace částí sekvence 45S rDNA hybridizací produktů PCR s 45S rDNA specifickou sondou (osobní komunikace, Peška 2012, nepublikováno).

Obr. 15. Produkty PCR s primery specifickými pro mezerníkovou (1) a genovou (2) oblast 45S rDNA A. ursinum při teplotách A) 55,7 °C; B) 64,6 °C; C) 68,9 °C. Ze směsi těchto produktů byly následně připraveny sondy pro FISH.

A. ursinum specifické 45S rDNA sondy připravené nick-translací produktů PCR reakce byly následně hybridizovány s chromozomy A. ursinum v následujících kombinacích: a) Mezerníková oblast sekvence 45S rDNA, přímo značená pomocí AF488, hybridizovaná samostatně (Obr. 16); b) Genová oblast sekvence 45S rDNA, přímo značená pomocí AF488 hybridizovaná v kombinaci s mezerníkovou oblastí 45S rDNA značenou nepřímo biotinem (Obr. 17); c) Genová oblast sekvence 45S rDNA, přímo značená pomocí AF488 hybridizovaná v kombinaci s 25S rDNA sekvencí L. esculentum značenou nepřímo biotinem (Obr. 18);

Při vyhodnocování dat bylo zjištěno, že: a) V případě samostatné hybridizace sondy pro mezerníkovou oblast sekvence 45S rDNA je možné detekovat pouze osm základních, silných signálů (hodnoceno deset mitóz) b) V případě společné hybridizace sond pro mezerníkovou a genovou oblast sekvence 45S rDNA A. ursinum vykazují obě sondy stejný počet signálů a tyto signály se vzájemně překrývají. Na všech hodnocených sklech bylo možné detekovat osm silných signálů a malý počet signálů slabší. Celkově bylo hodnoceno dvacet mitóz, přičemž u třinácti z nich bylo možné detekovat deset signálů a u sedmi mitóz dvanáct signálů. c) Společně hybridizované sondy pro genovou oblast sekvence 45S rDNA A. ursinum a pro sekvenci 25S rDNA L. esculentum vykazují shodnou lokalizaci na chromozomech A. ursinum. Tato kombinace byla použita pro potvrzení funkčnosti sond použitých při předešlých pokusech a dále pak společná lokalizace použitých sond je dalším důkazem, že produkty PCR jsou 45S rDNA specifické.

Obr. 16. Lokalizace mezerníkové sekvence 45S rDNA na chromozomech A. ursinum. A) chromozomy A. ursinum; B) sonda pro mezerníkovou oblast 45S rDNA A. ursinum; C) kombinovaný obrázek.

Obr. 17. Srovnání lokalizace mezerníkové a genové sekvence 45S rDNA na chromozomech A. ursinum. A) chromozomy A. ursinum; B) sonda pro genovou oblast 45S rDNA A. ursinum; C) sonda pro mezerníkovou oblast 45S rDNA A. ursinum; D) kombinovaný obrázek.

Obr. 18. Srovnání lokalizace genové sekvence 45S rDNA A. ursinum a 25S rDNA L. esculentum na chromozomech A. ursinum. A) chromozomy A. ursinum; B) sonda pro genovou oblast 45S rDNA A. ursinum; C) sonda pro 25S rDNA L. esculentum; D) kombinovaný obrázek.

5.2. Genomová in situ hybridizace (GISH)

Mezi druhy A. ursinum a A. cepa byla provedena vzájemná GISH v kombinaci se sondou pro 45S rDNA. Cílem tohoto experimentu bylo zjistit, zda je telomerická sekvence těchto dvou druhů shodná a zda 45S rDNA je lokalizována na koncích chromozomů, nebo je mezi 45S rDNA lokusem a fyzickým koncem chromozomů další sekvence. Z výsledků provedených pokusů (Obr. 19 až 21) je patrné, že celogenomová sonda připravená z gDNA A. cepa hybridizuje na chromozomech A. ursinum. Na chromozomech, kde je lokalizována 45S rDNA sekvence, se signál celogenomové sondy překrývá se signálem sondy pro 45S rDNA, a vytváří hlavní detekovatelné signály. Signály celogenomové sondy je ovšem možné detekovat i na chromozomech, na kterých 45S rDNA lokalizována není. V tomto případě je signál sondy slabší, než je tomu v případě 45S rDNA, ale je lokalizován v telomerické/subtelomerické oblasti všech zbývajících chromozomů. Na základě těchto dat je možné říct, že se v genomu A. cepa vyskytuje sekvence, která je lokalizována na koncích chromozomů A. ursinum, a pravděpodobně se jedná telomerickou, nebo subtelomerickou sekvenci.

Obr. 19. GISH A. cepa a A. ursinum. A) chromozomy A. ursinum; B) celogenomová sonda A. cepa; C) kombinovaný obrázek.

Obr. 20. GISH A. cepa a A. ursinum. A) chromozomy A. ursinum; B) celogenomová sonda A. cepa; C) sonda pro 45S rDNA sekvenci Arabidopsis thaliana; D) kombinovaný obrázek.

Obr. 21. GISH A. cepa a A. ursinum. A) chromozomy A. ursinum; B) celogenomová sonda A. cepa; C) sonda pro 45S rDNA sekvenci Arabidopsis thaliana; D) kombinovaný obrázek.

5.3. Lokalizace 45S rDNA a A. cepa

Při vyhodnocování výsledků GISH mezi druhy A. cepa a A. ursinum byla zjištěna variabilita v počtu 45S rDNA lokusů na chromozomech A. cepa. Sondy pro sekvence 45S rDNA A. thaliana a 25S rDNA L. esculentum sloužily při GISH pro srovnání lokalizace sekvence 45S rDNA a sekvencí testované gDNA a také jako kontrolní sonda pro stanovení správného průběhu reakce. Ze získaných dat je patrné, že počet pozorovaných 45S rDNA lokusů se pohybuje od čtyř do šesti, zatímco v dostupné literatuře bylo doposud popsáno pouze pozorování čtyř a pěti lokusů. Pro potvrzení těchto výsledků bylo vyhodnoceno minimálně patnáct mitóz nesoucích příslušnou početní varietu.

Obr. 22. Detekce čtyř lokusů 45S rDNA A. cepa (varieta Snowball). A) chromozomy A. cepa; B) sonda 25S rDNA L. esculentum; C) kombinovaný obrázek.

Obr. 23. Detekce pěti signálů 45S rDNA A. cepa (varieta Snowball). A) chromozomy A. cepa; B) sonda 45S rDNA A. thaliana; C) kombinovaný obrázek.

Obr. 24. Detekce šesti lokusů 45S rDNA A. cepa (varieta Stuttgart). A) chromozomy A. cepa; B) sonda 25S rDNA L. esculentum; C) kombinovaný obrázek.

Obr. 25. Opakované detekce šesti lokusů 45S rDNA A. cepa (varieta Stuttgart). A) chromozomy A. cepa; B) sonda 25S rDNA L. esculentum; C) kombinovaný obrázek.

Obr. 26. Opakované detekce šesti lokusů 45S rDNA A. cepa (varieta Stuttgart). A) chromozomy A. cepa; B) sonda 25S rDNA L. esculentum; C) kombinovaný obrázek.

5.4. Lokalizace kandidátních telomerických sekvencí na chromozomech Allium cepa

Na základě bioinformatických dat, získaných celogenomovým sekvenováním gDNA A. cepa, byly s pomocí programu RepeatExplorer vybrány satelitní sekvence, u kterých existoval předpoklad, že by mohly představovat hledanou telomerickou sekvenci. Následně byla provedena hybridizace sond odvozených od kandidátních sekvencí s chromozomy A. cepa s cílem objasnit lokalizaci těchto sekvencí. Primární snahou bylo zjistit, zda nevykazují lokalizaci typickou pro telomerické sekvence. Sekvence označovaná jako Cl20 vykazuje lokalizaci v distální oblasti osmi z celkových šestnácti chromozomů a vyskytuje se i na zbývajících chromozomech (Obr. 27). Bylo hodnoceno patnáct mitóz a u všech byla lokalizace této sondy stejná.

Obr. 27. Lokalizace sekvence Cl20 na chromozomech A. cepa. A) chromozomy A. cepa; B) sonda Cl20; C) kombinovaný obrázek

V případě sekvence označované jako Cl37 se podle získaných dat jedná o tandemovou repetici vyskytující se na všech chromozomech (Obr. 28). U žádné z patnácti hodnocených mitóz nebyla prokázána telomerická lokalizace této sondy a to ani na jednom chromozomovém konci.

Obr. 28. Lokalizace sekvence Cl37 na chromozomech A. cepa. A) chromozomy A. cepa; B) sekvence Cl37; C) kombinovaný obrázek

V případě sekvence označované jako Cl39 se jedná taktéž o tandemovou repetici vyskytující se na všech chromozomech (Obr. 29). Ani v tomto případě nebyla prokázána telomerická lokalizace testované sekvence. Hodnoceno bylo dvanáct mitóz.

Obr. 29. Lokalizace sekvence Cl39 na chromozomech A. cepa. A) chromozomy A. cepa; B) sekvence Cl39; C) kombinovaný obrázek

6. Diskuze 6.1. Telomery rodu Allium 6.1.1. Hypotézy plynoucí z literatury Jak již bylo uvedeno v teoretické části, i přes mnohaletý výzkum na poli rostlinné cytogenetiky a genomiky nebylo doposud podáno jasné vysvětlení struktury a způsobu udržování telomer u rodu Allium. Jednou z možností, jak jsou konce chromozomů těchto rostlin chráněny a zároveň udržovány, je převzetí role telomer sekvencí 45S rDNA. Tato hypotéza byla poprvé diskutována v návaznosti na zjištění, že chromozomy A. cepa jsou ukončeny blokem heterochromatinu, který je tvořen 375 bp dlouhou tandemově uspořádanou repetitivní sekvencí, specificky lokalizovanou v distální části chromozomů, ovšem na chromozomech, kde se nachází 45S rDNA sekvence, 375 bp tandemová repetice chybí, případně je s 45S rDNA kombinován. Proto byl navržen model, podle kterého na některých chromozomech přebírá roli telomer rDNA (Pich a Schubert, 1998). Tento model se podobá dříve popsanému modelu založenému na 340 bp telomerické repetici tvořící telomeru chromozomů pakomárů rodu Chironomus (Cohn a Edstrom, 1992a). Rod Chironomus byl prvním, u kterého byla zjištěna existence telomer více různých typů v rámci jednoho organismu, ale ne jediným. U „HAATI“ kvasinek bylo potvrzeno převzetí role telomer ribozomální DNA jako reakce na vyřazení klasického (na telomeráze závislého) systému udržování telomer, a to buďto na všech chromozomech, nebo v kombinaci s jinou heterochromatinovou sekvencí. Rod Allium se tedy jevil jako hypoteticky třetí známá skupina organismů s telomerou tvořenou na různých chromozomech různými sekvencemi. Otázkou ovšem je, zda je možné tento model aplikovat na celý rod Allium. Během následných studií bylo totiž zjištěno, že repetitivní sekvence 375 bp je přítomna pouze u sekce Cepa (Stevenson et al., 1999). Na základě těchto dat a údajů získaných studiem telomer rodu Allium je možné formulovat následující hypotézy: a) 45S rDNA u sekce Cepa tvoří telomery společně s 375bp repeticí. Pokud by se potvrdila platnost této hypotézy, znamenalo by to, že evoluce telomer řádu Asparagales je mnohem komplikovanější a uvnitř rodu Allium existují minimálně dva různé typy telomer a možná i dva odlišné mechanismy jejich udržování. Zároveň by také vyvstala otázka, zda je u ostatních zástupců rodu Allium telomera tvořena pouze 45S rDNA, kombinací 45S rDNA a doposud neznámé tandemové

repetice, nebo zda mimo sekci Cepa 45S rDNA nehraje ve vztahu k telomerám žádnou roli a telomery jsou zde tvořeny doposud neznámou sekvencí. b) Tandemová repetitivní sekvence 375 bp není sekvencí telomerickou, ale je pouze součástí subtelomerického heterochromatinu. Za tohoto předpokladu tvoří 45S rDNA telomeru některých chromozomů, zatímco ostatní chromozomy jsou zakončeny doposud neznámou sekvencí. Tato sekvence pak s určitou pravděpodobností může tvořit i telomery u zástupců rodu Allium mimo sekci Cepa. c) 45S rDNA není sekvencí telomerickou, ale pouze subtelomerickou. Z dostupných dat není možné s jistotou určit, zda 45S rDNA je opravdu sekvencí terminální a představuje fyzický konec chromozomu. Pokud by tomu opravdu tak bylo, podporovalo by to nepřímo možnost, že se v rámci celého rodu Allium nachází jednotná telomerická sekvence. Stále by však existovala možnost, že 45S rDNA je důležitou součástí udržování délky telomer, například procesu rekombinace. S cílem objasnit otázky uvedené v předchozích odstavcích, byly v rámci této práce provedeny pokusy zaměřené a) na srovnání jaderného genomu evolučně vzdálených zástupců rodu Allium; b) popis lokalizace 45S rDNA sekvence a jejích podjednotek u A. ursinum, které je charakteristické vysokou četností 45S rDNA lokusů ve svém genomu; c) na lokalizaci kandidátních telomerických sekvencí vybraných na základě sekvenačních dat.

6.1.2 Role 45S rDNA při formování telomer rodu Allium Z výsledků FISH provedených se sondou specifickou pro 25S rDNA a následně i sondami specifickými pro IGS a genovou oblast 45S rDNA sekvence A. ursinum vyplynulo, že sekvence 45S rDNA je lokalizována na dvanácti z celkových dvaceti osmi konců chromozomů A. ursinum, což je výrazně více, než například u A. cepa, a neexistuje rozdíl v lokalizaci IGS a genové oblasti 45S rDNA. Dané poznatky je možné shrnout tak, že 45S rDNA u A. ursinum nesplňuje předpoklad lokalizace na všech chromozomových koncích, což by byl dobrý znak telomerické sekvence, na druhou stranu pokud tvoří telomeru jen některých chromozomů, tvoří ji celá 45S rDNA sekvence a nikoliv pouze její část, například některá z repetic uvnitř IGS. Na základě dostupných dat nelze vyloučit, že je tato sekvence telomerickou, ale nelze tento předpoklad ani potvrdit. Jednou z možností, jak by bylo možné roli 45S rDNA objasnit, je porovnání úbytku 45S rDNA sekvence po působení enzymu BAL-31. Tato nukleáza štěpí konce chromozomů a je možné pozorovat úbytek telomerických sekvencí. Navíc je tento

úbytek přímo úměrný času, po který nukleáza BAL-31 na chromozomy působí. Pokud by byl v případě působení exonukleázy detekován úbytek 45S rDNA sekvencí a tento úbytek se s prodlužující se délkou štěpení zvyšoval, byl by to důkaz, že 45S rDNA je telomerickou sekvencí. Pokud by úbytek nastal až po určitém čase, znamenalo by to, že za sekvencí 45S rDNA se nachází ve směru k distální části chromozomu další sekvence, telomerická. Problém v provedení tohoto experimentu spočívá hlavně v množství kopií 45S rDNA, které se v genomu rostlin rodu Allium nacházejí. Při takovémto rozsahu může být stanovení, zda k úbytku 45S rDNA sekvence dochází již od započetí štěpení, nebo až s postupujícím časem, značně obtížné. Navíc při velikosti, jakou 45S rDNA sekvence má, je vysoce pravděpodobné, že v průběhu izolace DNA bude v této části s určitou pravděpodobností docházet i k náhodné fragmentaci DNA, což bude mít na hodnocení výsledků negativní vliv. Jedno z možných řešení, jak se vyrovnat s tímto problémem, představuje hodnocení úbytku sekvencí 45S rDNA nikoliv podle úbytku sekvencí v daný čas, ale hodnocením relativních úbytků během následných odběrů v čase. Pokud by výsledná křivka měla lineární charakter, případně by na začátku byl úbytek výraznější než v pozdější fázi, znamenalo by to, že je 45S rDNA štěpena již od počátku a je tedy sekvencí telomerickou. V případě, že by na začátku byl úbytek 45S rDNA nižší než v pozdější fázi experimentu, znamenalo by to, že jsou v první fázi štěpeny pouze sekvence, které jsou terminálními jen v důsledku zlomů vznikajících během izolace DNA. V takovémto případě by se jednalo o důkaz, že 45S rDNA není sekvencí telomerickou. Tento experiment by mohl pomoci vyřešit otázku týkající se role 45S rDNA. Jediná další možnost, která by tuto otázku vyřešila, je hybridizace chromozomů rostlin rodu Allium s telomerickou sekvencí. Pokud by tato sekvence, potvrzená na základě FISH a BAL-31 štěpení hybridizovala na všech chromozomech, znamenalo by to, že 45S rDNA není sekvencí telomerickou. Pokud by hybridizovala pouze s chromozomy, které nenesou 45S rDNA sekvenci, byl by to dílčí důkaz telomerické úlohy 45S rDNA. V současnosti však tato sekvence není známa.

6.1.3. GISH A. cepa a A. ursinum – společná telomerická sekvence? Za účelem objasnit, zda A. cepa a A. ursinum sdílí shodné sekvence na koncích chromozomů, byla provedena GISH mezi těmito druhy. Pokud jsou dva rostlinné druhy dostatečně evolučně vzdálené, pozitivní výsledek experimentu GISH poskytuje už jen několik málo typů repetic: rDNA, někdy centromery a hlavně telomery (Markova a Vyskot, 2009). Z výsledků (Obr. 19 až 21) vyplývá, že rostliny A. cepa a A. ursinum, nesdílí vysoký počet

86 stejných repetitivních sekvencí repetic s dostatečnou homologií pro obdržení signálů pokrývajících chromozomy pomocí GISH, i přesto, že oba genomy jsou bohaté na repetitivní sekvence a jsou to druhy patřící do stejného rodu. Sdílejí však stejnou sekvenci hybridizující v oblasti rDNA a na koncích všech chromozomů A. ursinum. Fakt, že tyto dva druhy sdílí sekvenci hybridizující v oblasti 45S rDNA, není, vzhledem k sekvenční konzervovanosti této sekvence na úrovni druhů i vyšších taxonomických skupin, překvapivý. Důležité ovšem je, že tyto druhy sdílí sekvenci lokalizovanou na všech koncích chromozomů A. ursinum. Na chromozomech nesoucích lokus 45S rDNA není možné určit, zda je hybridizující sekvencí pouze 45S rDNA, nebo společně s ní hybridizuje i sekvence jiná. Na těchto chromozomech signály sondy pro 45S rDNA překrývají se signály sondy pro celogenomovou DNA A. cepa a žádný velký signál nacházející se „za“ 45S rDNA sekvencí už detekován nebyl. Nicméně délka telomerové sekvence může ležet pod potřebnou rozlišovací hranicí pro porovnávání dvou sousedních signálů (v tomto případě specifická sonda pro rDNA a DAPI pro přítomnost jiné telomerové DNA). Opět tedy nelze vyloučit roli 45S rDNA sekvence při ochraně konců chromozomů u rostlin rodu Allium. Na chromozomech bez lokusu 45S rDNA je však jisté, že nesou ve své terminální (distální) části sekvenci totožnou, nebo velmi blízce příbuznou sekvenci nacházející se v genomu A. cepa. S největší pravděpodobností se jedná o sekvenci telomerickou, nicméně pouhou cytogenetickou analýzou nelze neprokázat telomerickou funkci kandidátní sekvence. Za jiných okolností by uvedená pozorování byla přirozeným rozvinutím poznatků o telomerické roli tandemové repetitivně sekvence 375 bp u rodu Allium (Pich et al., 1996, Pich a Schubert, 1998). Zjištění, že tato sekvence je charakteristická pouze pro sekci Cepa (Stevenson et al., 1999), však vrhá na tyto poznatky poněkud jiné světlo. Druh A. ursinum, přestože on samotný na přítomnost tandemové repetice 375 bp testován nebyl, patří do sekce Arctoprasum a je tedy možné s vysokou pravděpodobností říci, že tandemová repetice 375 bp není obecnou telomerickou sekvencí rodu Allium. Stále existuje možnost, že sekvence 375 bp plní roli telomer pouze v rámci sekce Cepa. To by znamenalo, že u A. ursinum za a) je telomerická sekvence odlišná, než u A. cepa, ale v genomu A. cepa se nachází, nebo za b) se nachází subtelomerická sekvence totožná se sekvencí nesenou genomem A. cepa a tyto dva druhy nesou odlišnou telomerickou sekvenci. Pro potvrzení hypotézy, že rostliny A. cepa a A. ursinum sdílejí stejnou telomerickou sekvenci, která je, díky evoluční vzdálenosti těchto druhů uvnitř rodu Allium, pravděpodobně přítomna i u dalších zástupců tohoto taxonu, by bylo nutné provést GISH i v obráceném

87 uspořádání, tedy hybridizovat gDNA A. ursinum na chromozomy A. cepa. Tento experiment byl proveden, ovšem bez průkazných výsledků.

6.1.4. Kandidátní telomerické sekvence – vyhodnocení a možnosti jejich predikce Získaná data (Obr. 27, 28, 29) ukazují, že žádná ze sond připravených pro detekci kandidátních telomerických sekvencí, které byly vytipovány pomocí programu RepeatExplorer, nevykazuje očekávanou telomerovou lokalizaci na všech chromozomových koncích. Z tohoto pohledu lze tyto kandidátní sekvence vyloučit jako telomerické. Pouze u sondy Cl 20 byla pozorována lokalizace v koncové části šesti chromozomů, vždy však pouze na jednom konci. Pouze v jednom případě vykazovala sonda Cl 20 lokalizaci na obou koncích téhož chromozomu. Sekvenování rozsáhlých a na repetitivní sekvence bohatých genomů, jaké můžeme nalézt u všech zástupců rodu Allium, je obecně obtížné. Výhodou, kterou skýtá studium telomer je předpoklad, že hledaná telomerická sekvence je repeticí. V případě, že by telomery rodu Allium byly tvořeny „náhodnou sekvencí“, hypoteticky třeba dosud neznámou terminální transferázou, která může prodlužovat DNA o náhodně zařazené nukleotidy, pak by pro tento systém bylo nutné zvolit zcela jiný přístup prokazování vzniku telomerové sekvence než byly přístupy použité v této práci. Doposud však všechny známé telomerické sekvence jsou repetice a od předpokladu „náhodných telomer“ jsem ve své práci upustil. Pro vyhledávání repetitivních sekvencí se v současné době využívají postupy založené na sekvenování genomu nové generace při nízkém pokrytí, které z principu nahodilosti při „shot-gun sekvenaci“ preferenčně zachytává právě repetitivní sekvence. Zjednodušeně řečeno, čím častější repetice, tím častěji bude přečtena. To, zda bude telomerová repetice tímto postupem zachycena závisí na tom, jak velké procento genomu taková repetice tvoří a získáme-li dostatečné pokrytí pro její zachycení. Jinými slovy, je-li četnost telomerové sekvence v genomu nad/pod detekčním limitem metody. Telomerické sekvence mohou tvořit pouze malou část celého genomu a jejich odhalení mezi širokým spektrem repetitivních sekvencí může být značně obtížné. Je důležité si totiž uvědomit, že i přesto, že telomerické sekvence jsou zpravidla tandemové repetice s repetitivní jednotkou o délce několika nukleotidů, existují i výjimky, jako jsou například telomerické transpozony D. melanogaster a také při studiu telomer rodu Allium je nutno brát tuto alternativu v potaz. Další možností, jak vyhledávat kandidátní telomerické sekvence, je příprava BAC (Bacterial Artificial Chromosome) knihoven nesoucích jadernou DNA. Z těchto BAC klonů mohou být následně připraveny sondy pro FISH a vybrány BAC klony vykazující lokalizaci

88 v terminální části chromozomů. Takovéto BAC klony mohou být následně sekvenovány a na základě získaných dat může být popsána telomerická sekvence. Ovšem u genomů, jako mají zástupci rodu Allium, je popisovaný přístup, pro jejich velikost, značně obtížný a časově i finančně náročný. Jako vhodná alternativa celogenomové DNA se při přípravě knihovny BAC jeví B-chromozomy, krátké chromozomy tvořené heterochromatinem nacházející se u dvaceti sedmi zástupců rodu Allium (Jones a Rees, 1982). Pomocí průtokové cytometrie je možné B-chromozomy izolovat a připravit knihovnu BAC pouze pro B-chromozom. Tím by se výrazně snížilo celkové množství klonů BAC a také finanční a časová náročnost celého experimentu (Gray et al., 1975; Métézeau et al., 1993). Další alternativní cesta studia neznámých telomer rodu Allium je opět založena na přítomnosti B-chromozomů u zástupců tohoto taxonu. Tyto chromozomy nesou podle dostupných informací ve své struktuře centromeru a je tedy možné tuto sekvenci využít pro tzv. „primer walking“. Tento postup je ovšem značně diskutabilní, neboť dlouhé tandemové repetice ve struktuře chromozomu mohou představovat závažný problém. Existuje riziko, že PCR nebude schopna amplifikovat dostatečně dlouhý úsek chromozomu, aby byla pokryta celá repetice a mohla být připravena nová sada primerů (Ochman et al., 1988; Volpicella et al., 2012). Neméně zajímavou je jistě i možnost využití mikrodisekce, kdy je cíleně pomocí laserového paprsku odebrána terminální část chromozomu a následně může být tato část chromozomu sekvenována (Scalenghe et al., 1981).

6.2. Variabilita v délce IGS oblasti sekvence 45S rDNA A. ursinum

Další zajímavou skutečností, zjištěnou v průběhu zpracování této diplomové práce, je variabilita v délce produktů polymerázové řetězové reakce s primery specifickými oblast 45S rDNA sekvence A. ursinum. Pro A. ursinum existuje v závislosti na teplotě nasedání primerů v průběhu PCR několik produktů pro IGS oblast a dva produkty pro oblast genovou. Pokud jsou totožné primery využity v reakci s A. cepa, je výsledkem vždy pouze jeden produkt pro každou sadu použitých primerů. Pokud bychom vzali v potaz pouze délku výsledných produktů, zjistíme, že není patrná žádná pravidelnost, která by nasvědčovala tomu, že se jedná o tandemově repetitivní uspořádání. Navíc by v takovém případě bylo množství jednotlivých produktů nezávislé na teplotě nasedání primerů, ale jak je patrné z výsledků (Obr. 12, 13 a 15), množství produktů jednotlivých délek je na teplotě nasedání primerů závislé. Ze vztahu teplota reakce/převažující typ produktu je dále patrné, že zatímco některé produkty převládají u reakcí prováděných za nižších teplot, při vyšších teplotách reakce množství těchto produktů klesá a naopak, produkty produkované při nižších teplotách pouze v malém měřítku jsou při vyšších teplotách produkty majoritními. Tento fakt odporuje předpokladu, že variabilita v délce produktů v závislosti na teplotě nasedání primerů je zapříčiněna existencí sekvencí vykazujících částečnou homologii k sekvenci použitých primerů uvnitř cílových sekvencí. Pokud by variabilita 45S rDNA sekvence A. ursinum vycházela z tohoto faktu, bylo by možné s rostoucí teplotou reakce detekovat přítomnost produktů nespecifického nasedání primerů v průběhu PCR, ale nevysvětlovalo by to úbytek produktů přítomných při nižších teplotách reakce. Na základě dostupných dat není tedy možné odvodit konkrétní závěr vysvětlující tuto variabilitu. Jako nejpravděpodobnější se ovšem jeví existence více variant IGS oblasti v rámci druhu A. ursinum. Tento fakt může být dán do spojitosti s existencí vysokého počtu lokusů 45S rDNA u tohoto druhu ve srovnání například s A. cepa. Tento předpoklad by mohl být otestován za použití širšího spektra rostlin rodu Allium s různým počtem 45S rDNA lokusů. S použitím známých primerů pro PCR by následně bylo možné zhodnotit, zda je rostoucí počet lokusů 45S rDNA spojen i s variabilitou v délce IGS sekvence. Následně by bylo možné jednotlivé PCR produkty v kombinacích hybridizovat s chromozomy A. ursinum a zjistit, zda jsou jednotlivé varianty chromozomově specifické, či nikoliv. Významným krokem směrem k objasnění variability plynoucí z odlišné teploty používané při PCR by bylo i srovnání sekvencí jednotlivých produktů. Tato data však prozatím nejsou k dispozici. 90

6.3. Variabilita v počtu lokusů 45S rDNA A. cepa a A. ursinum

Při studiu 45S rDNA A. ursinum byla odhalena zajímavá skutečnost týkající se 45S rDNA lokusů A. cepa. U tohoto druhy byl vždy uváděn počet NOR, resp. 45S rDNA lokusů, roven čtyřem (Ricroch et al., 1991). Následně pak byla popsána existence pátého lokusu (Panzera et al., 1996), která však nebyla v pozdějších pracích potvrzena. Vysvětlením bylo pravděpodobné použití odlišných odrůd (Hasterok a Maluszynska, 2000). Na základě údajů získaných během zpracování této práce je patrné, že počet detekovatelných lokusů 45S rDNA u A. cepa je variabilní a pohybuje se v rozpětí od čtyř do šesti (Obr. 22 až 26). Tato variabilita byla pozorována u dvou používaných odrůd A. cepa a to Stuttgart a Snowball. U variety Snowball byla prokázána přítomnost čtyř a pěti lokusů, zatímco u variety Stuttgart byla prokázána existence čtyř, pěti a šesti lokusů. Počty pozorovaných lokusů byly shodné vždy pro všechny mitózy téhož preparátu, tedy pro všechny buňky použité kořenové špičky. Jelikož použité kořenové špičky pocházely z různých rostlin a byly skladovány společně, není možné určit, zda tato variabilita je specifická pouze pro danou kořenovou špičku, nebo pro celou rostlinu. V dostupné literatuře je popsáno postupné zeslabování signálu sond pro sekvenci 45S rDNA A. cepa v závislosti na ontogenetickém vývoji rostliny. Není však jasné, zda se jedná o ontogenezi celé rostliny, nebo pouze kořene (Hasterok a Maluszynska, 2000). Kořeny použité při zpracování této práce pocházely ze vzrostlých rostlin stejného stáří a rozdíl ve stáří jednotlivých kořínků činil maximálně jeden den (sběr kořenových špiček byl prováděn jednou za dvacet čtyři hodin). Pro detailnější objasnění této problematiky by bylo možné vybrat linie příslušných odrůd A. cepa nesoucí čtyři, pět, nebo šest lokusů 45S rDNA a sledovat, zda se v průběhu vývoje rostliny a případně i mezigeneračně, počty detekovatelných lokusů mění. Zároveň by vzájemné křížení jednotlivých linií bylo důkazem, že počty 45S rDNA lokusů jsou pro rostlinu fixní a variabilita v počtu detekovatelných lokusů má jiný původ, než pouze ontogenetické umlčování. Analýzou širšího spektra odrůd A. cepa a srovnáním jejich fylogenetického stromu by pak bylo možné určit, u kterých odrůd se jednotlivé počty 45S rDNA lokusů vyskytují. Existence variability v počtu rDNA lokusů je možné vysvětlit snahou eliminovat v průběhu evoluce nadbytečné NOR (45S rDNA lokusy) a snížit jejich počet pouze na jeden na haploidní genom (Garrido et al., 1994; Roa a Guerra, 2012). Druhou variantou vedoucí

91 naopak k nárůstu celkového počtu 45S rDNA lokusů jsou chromozomové aberace vedoucí k navýšení počtu 45S rDNA lokusů. Stejně jako u A. cepa, i u A. ursinum byla pozorována variabilita v počtu 45S rDNA lokusů. V tomto případě se počet detekovaných lokusů pohyboval od desíti do šestnácti. Nejvyšší zastoupení měly mitózy s dvanácti detekovatelnými lokusy. Vyšší variabilita byla pozorována při detekci sondou specifickou pro sekvenci 25S rDNA L. esculentum zatímco při použití sond specifických pro sekvenci 45S rDNA A. ursinum byla, až na výjimky, potlačena a počet detekovaných lokusů se pohyboval mezi desíti a dvanácti. Je tedy možné, že pozorovaná variabilita je následkem použití sondy pro 25S rDNA L. esculentum. Na druhou stranu je tato sekvence mezidruhově vysoce konzervativní a počet různých kořenových špiček (nikoliv mitóz) hodnocených pomocí sondy specifické pro sekvenci 45S rDNA A. ursinum byl výrazně nižší, než v případě sondy pro 25S rDNA L. esculentum. To může být důvod, proč byla variabilita v počtu 45S rDNA lokusů při použití sond pro 45S rDNA A. ursinum nižší.

7. Souhrn

Náplní této diplomové práce bylo studium možné telomerické role 45S rDNA u rostlin rodu Allium na modelových organismech A. cepa a A. ursinum a dále pak testování vybraných kandidátních sekvencí. První cíl, tedy objasnění role 45S rDNA při formování telomer rodu Allium, se podařilo splnit jen částečně. Byl potvrzen vysoký počet terminálních lokusů 45S rDNA na chromozomech A. ursinum, ale žádná z použitých sond nepotvrdila lokalizaci této sekvence, případně některé z jejích strukturních podjednotek, na koncích všech chromozomů. Naopak, při použití sond specifických pro genovou a IGS oblast této sekvence byla zjištěna jejich společná lokalizace na všech lokusech, což s vysokou pravděpodobností vylučuje možnost, že by se na formování telomer podílela pouze některá z podjednotek sekvence 45S rDNA. Hypotéza o funkci 45S rDNA jakožto telomerické sekvence je reálná pouze v případě, že rod Allium nemá jedinou telomerickou sekvenci, ale různé chromozomy mají telomeru tvořenou různými sekvencemi. Kandidátní sekvence, které byly v rámci zpracování zadaného tématu testovány, nevykazovaly při FISH znaky pro telomerické sekvence typické. Pokud hybridizovaly na koncích chromozomů, tak pouze u jednoho či dvou párů chromozomů. Důležitým zjištěním byla lokalizace neznámé sekvence pocházející z gDNA A. cepa v koncové oblasti všech chromozomů A. ursinum. Uvedené pozorování vyplývá z výsledků GISH provedené mezi těmito druhy. S ohledem na fylogenetické postavení těchto druhů by shodná telomerická sekvence byla pravděpodobně konzervativní pro celý studovaný rod. Při provádění předešlých experimentů byla pozorována různorodost v počtu 45S rDNA lokusů u A. cepa. Počet pozorovaných lokusů dosahoval počtu čtyři, pět a šest, zatímco dosavadní publikace hovoří pouze o čtyřech a pěti lokusech. Zda mají tyto dvě pozorované variability vzájemnou spojitost, není jasné.

8. Summary

In this diploma thesis was studied the possible telomeric role of 45S rDNA in plants of genus Allium and tested some predicted candidate telomeric sequences. First aim, to clarify the role of 45S rDNA as telomere in genus Allium, was partially successful. High number of terminal 45S rDNA loci on the chromosomes of A. ursinum was confirmed, but none of the probes that we used confirmed the localization of this sequence or its structural subunit at the ends of all chromosomes. When we performed experiment with probe specific for gene subunit of 45S rDNA and probe specific for intergenic spacer of 45S rDNA, co-localization of both probes was detected. Based on this result we can, we can state that if 45S rDNA acts as a telomere then this role would not be restricted to its subunits. Hypothesis about the telomeric function of 45S rDNA in genus Allium can be valid, only in case that 45S rDNA is present with other telomeric sequence. Tested candidate telomeric sequences did not show localization typical for telomeric sequence. In most cases these predicted sequences were interspred repetitions without localization at the ends of chromozomes. Only one predicted sequence was localized at the end of two chromosome pairs. An important result is the detection of unknown sequence from genomic DNA of A. cepa which during genomic in situ hybridization localized at both ends of all chromosomes A. ursinum. This unknown sequence could probably be telomeric. In this case and according to the phylogenetic distance of both species within genus Allium it could be common for whole genus. During the genomic in situ hybridization between A. cepa and A. ursinum, variability in number of 45S rDNA loci in genome of A. cepa was detected. Previous publications showed the presence of four and five loci in A. cepa whereas we have observed four, five and six loci. Variability in the number of 45S rDNA was also observed in A. ursinum. Whether these variabilities within A. cepa and A. ursinum are connected is still unknown.

9. Literatura

Abad, J.P., de Pablos, B., Osoegawa, K., de Jong, P.J., Martin-Gallardo, A., Villasante, A. 2004. TAHRE, a novel telomeric retrotransposon from Drosophila melanogaster, reveals the origin of Drosophila telomeres. Mol Biol Evol 21: 1620-1624.

Adams, S.P., Hartman, T.P.V., Lim, K.Y., Chase, M.W., Bennett, M.D., Leitch, I.J., Leitch, A.R. 2001. Loss and recovery of Arabidopsis-type telomere repeat sequences 5 '-

(TTTAGGG)(n)-3 ' in the evolution of a major radiation of flowering plants. P Roy Soc B-Biol Sci 268: 1541-1546.

Adams, S.P., Leitch, I.J., Bennett, M.D., Leitch, A.R. 2000. Aloe L. - a second plant family without (TTTAGGG)(n) telomeres. Chromosoma 109: 201-205.

Allshire, R.C., Dempster, M., Hastie, N.D. 1989. Human telomeres contain at least 3 types of G-rich repeat distributed non-randomly. Nucleic Acids Res 17: 4611-4627.

Allsopp, R.C., Harley, C.B. 1995. Evidence for a critical telomere length in senescent human fibroblasts. Exp Cell Res 219: 130-136.

APG III. 2009. An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG III. Bot J Linn Soc 161: 105-121

Baird, D.M., Coleman, J., Rosser, Z.H., Royle, N.J. 2000. High levels of sequence polymorphism and linkage disequilibrium at the telomere of 12q: Implications for telomere biology and human evolution. Am J Hum Genet 66: 235-250.

Barnes, S.R., James, A.M., Jamieson, G. 1985. The organization, nucleotide-sequence, and chromosomal distribution of a satellite DNA from Allium cepa. Chromosoma 92: 185-192.

Bennett, M.D. 1972. Nuclear DNA content and minimum generation time in Herbaceous plants. Proc R Soc Ser B-Bio 181: 109-135.

Bennett, M.D. 1987. Variation in genomic form in plants and its ecological implications. New Phytol 106: 177-200.

Bennett, M.D., Bhandol, P., Leitch, I.J. 2000a. Nuclear DNA amounts in angiosperms and their modern uses - 807 new estimates. Ann Bot-London 86: 859-909.

Bennett, M.D., Johnston, S., Hodnett, G.L., Price, H.J. 2000b. Allium cepa L. cultivars from four continents compared by flow cytometry show nuclear DNA constancy. Ann Bot- London 85: 351-357.

Bennett, M.D., Leitch, I.J. 1997. Nuclear DNA amounts in angiosperms - 583 new estimates. Ann Bot-London 80: 169-196.

Bennett, M.D., Leitch, I.J. 2011. Nuclear DNA amounts in angiosperms: targets, trends and tomorrow. Ann Bot-London 107: 467-590.

Benoit, M., Layat, E., Tourmente, S., Probst, A.V. 2013. Heterochromatin dynamics during developmental transitions in Arabidopsis - a focus on ribosomal DNA loci. Gene 526: 39-45.

Bernards, A., Michels, P.A.M., Lincke, C.R., Borst, P. 1983. Growth of chromosome ends in multiplying trypanosomes. Nature 303: 592-597.

Bilaud, T., Brun, C., Ancelin, K., Koering, C.E., Laroche, T., Gilson, E. 1997. Telomeric localization of TRF2, a novel human telobox protein. Nat Genet 17: 236-239.

Bilaud, T., Koering, C.E., BinetBrasselet, E., Ancelin, K., Pollice, A., Gasser, S.M., Gilson, E. 1996. The telobox, a Myb-related telomeric DNA binding motif found in proteins from yeast, plants and human. Nucleic Acids Res 24: 1294-1303.

Birnstiel, M.L., Wallace, H., Sirlin, J.L., Fischberg, M. 1966. Localization of the ribosomal DNA complements in the nucleolar organizer region of Xenopus laevis. Natl Cancer Inst Monogr 23: 431-447.

Blackburn, E.H., Gall, J.G. 1978. Tandemly repeated sequence at termini of extrachromosomal ribosomal-RNA genes in tetrahymena. J Mol Biol 120: 33-53.

Bougourd, S.M., Parker, J.S. 1976. Nucleolar organizer polymorphism in natural populations of Allium schoenoprasum. Chromosoma 56: 301-307.

Bremer, B., Bremer, K., Chase, M.W., Fay, M.F., Reveal, J.L., Soltis, D.E., Soltis, P.S., Stevens, P.F., Anderberg, A.A., Moore, M.J., Olmstead, R.G., Rudall, P.J., Sytsma, K.J., Tank, D.C., Wurdack, K., Xiang, J.Q.Y., Zmarzty, S., Grp, A.P. 2009. An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG III. Bot J Linn Soc 161,: 105-121.

Bryan, T.M., Englezou, A., DallaPozza, L., Dunham, M.A., Reddel, R.R. 1997. Evidence for an alternative mechanism for maintaining telomere length in human tumors and tumor- derived cell lines. Nat Med 3: 1271-1274.

Bryan, T.M., Englezou, A., Gupta, J., Bacchetti, S., Reddel, R.R. 1995. Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity. Embo J 14: 4240- 4248.

Bucholc, M., Buchowicz, J. 1995. An extrachromosomal fragment of telomeric DNA in wheat. Plant Mol Biol 27: 435-439.

Campo, D., Machado-Schiaffino, G., Horreo, J.L., Garcia-Vazquez, E. 2009. Molecular organization and evolution of 5S rDNA in the genus Merluccius and their phylogenetic implications. J Mol Evol 68: 208-216.

Carmo-Fonseca, M., Mendes-Soares, L., Campos, I. 2000. To be or not to be in the nucleolus. Nat Cell Biol 2: 107-112.

Carmona, M.J., Morcillo, G., Galler, R., Martinezsalas, E., Delacampa, A.G., Diez, J.L., Edstrom, J.E. 1985. Cloning and molecular characterization of a telomeric sequence from a temperature-induced Balbiani ring. Chromosoma 92: 108-115.

Casacuberta, E., Pardue, M.L. 2003a. HeT-A elements in Drosophila virilis: Retrotransposon telomeres are conserved across the Drosophila genus. P Natl Acad Sci USA 100: 14091-14096.

Casacuberta, E., Pardue, M.L. 2003b. Transposon telomeres are widely distributed in the Drosophila genus: TART elements in the virilis group. P Natl Acad Sci USA 100: 3363-3368.

Cavalier-Smith, T. 2009. Predation and eukaryote cell origins: A coevolutionary perspective. Int J Biochem Cell B 41: 307-322.

Cohen, H., Sinclair, D.A. 2001. Recombination-mediated lengthening of terminal telomeric repeats requires the Sgs1 DNA helicase. P Natl Acad Sci USA 98: 3174-3179.

Cohen, S., Mechali, M. 2002. Formation of extrachromosomal circles from telomeric DNA in Xenopus laevis. Embo Rep 3: 1168-1174.

Cohn, M., Edstrom, J.E. 1992a. Chromosome ends in Chironomus pallidivittatus contain different subfamilies of telomere-associated Repeats. Chromosoma 101: 634-640.

Cohn, M., Edstrom, J.E. 1992b. Telomere-associated repeats in Chironomus form discrete subfamilies generated by gene conversion. J Mol Evol 35: 114-122.

Cong, Y.S., Wright, W.E., Shay, J.W. 2002. Human telomerase and its regulation. Microbiol Mol Biol R 66: 407-425.

Counter, C.M., Avilion, A.A., Lefeuvre, C.E., Stewart, N.G., Greider, C.W., Harley, C.B., Bacchetti, S. 1992. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. Embo J 11: 1921-1929.

Croy, J.E., Wuttke, D.S. 2006. Themes in ssDNA recognition by telomere-end protection proteins. Trends Biochem Sci 31: 516-525.

Do, G.S., Seo, B.B. 2000. Phylogenetic relationships among Allium subg. Rhizirideum species based on the molecular variation of 5S rRNA genes. Korean Journal of Biological Sciences 4: 77-85 de la Herran, R., Cunado, N., Navajas-Perez, R., Santos, J.L., Rejon, C.R., Garrido- Ramos, M.A., Rejon, M.R. 2005. The controversial telomeres of lily plants. Cytogenet Genome Res 109: 144-147. de Lange, T. 2005. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Gene Dev 19: 2100-2110.

De Sarker, D., Johnson, M.A.T., Reynolds, A., Brandham, P.E. 1997. Cytology of the highly polyploid disjunct species, Allium dregeanum (Alliaceae), and of some Eurasian relatives. Bot J Linn Soc 124: 361-373.

Dellaporta, S.L., Wood, J., Hicks, J.B. 1983. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol. Biol. Rep. 1: 19-21

Dunham, M.A., Neumann, A.A., Fasching, C.L., Reddel, R.R., 2000. Telomere maintenance by recombination in human cells. Nat Genet 26: 447-450.

Eickbush, T.H., Eickbush, D.G. 2007. Finely orchestrated movements: Evolution of the ribosomal RNA genes. Genetics 175: 477-485.

Ellis, T.H.N., Lee, D., Thomas, C.M., Simpson, P.R., Cleary, W.G., Newman, M.A., Burcham, K.W.G. 1988. 5s ribosomal-RNA aenes in Pisum - sequence, long-range and chromosomal organization. Mol Gen Genet 214: 333-342.

Fernandes, T., Madalena, C.R.G., Gorab, E. 2012. Cloning and characterisation of a novel chromosome end repeat enriched with homopolymeric (dA)/(dT) DNA in Rhynchosciara americana (Diptera: Sciaridae). Chromosome Res 20: 435-445.

Flavell, R.B., Bennett, M.D., Smith, J.B., Smith, D.B. 1974. Genome size and proportion of repeated nucleotide sequence DNA in plants. Biochem Genet 12: 257-269.

Flynn, R.L., Zou, L. 2010. Oligonucleotide/oligosaccharide-binding fold proteins: a growing family of genome guardians. Crit Rev Biochem Mol 45: 266-275.

Friesen, N., Fritsch R.M., Blattner, F.R. 2006. Phylogeny and new intrageneric classification of Allium (Alliaceae) based on nuclear ribosomal DNA ITS sequences. Aliso 22: 372-395

Fritsch, R.M., Friesen, N. 2002. Evolution, Domestication and Taxonomy. In: Rabinowitch, H.D., Currah, L. (eds). Allium Crop Science: Recent Avances New York, CABI Publishing, 5-31

Frydrychova, R., Grossmann, P., Trubac, P., Vitkova, M., Marec, F.E. 2004. Phylogenetic distribution of TTAGG telomeric repeats in insects. Genome 47: 163-178.

Frydrychova, R., Marec, F. 2002. Repeated losses of TTAGG telomere repeats in evolution of beetles (Coleoptera). Genetica 115: 179-187.

Fuchs, J., Brandes, A., Schubert, I. 1995. Telomere sequence localization and karyotype evolution in higher plants. Plant Syst Evol 196: 227-241.

Fujiwara, H., Osanai, M., Matsumoto, T., Kojima, K.K. 2005. Telomere-specific non-LTR retrotransposons and telomere maintenance in the silkworm, Bombyx mori. Chromosome Res 13: 455-467.

Fulnečková, J., Hasíková, T., Fajkus, J., Lukešová, A., Eliáš, M., Sýkorová, E. 2012. Dynamic evolution of telomeric sequences in the green algal order Chlamydomonadales. Genome Biol Evol 4: 248-264.

Gallego, M.E., White, C.I. 2001. RAD50 function is essential for telomere maintenance in Arabidopsis. P Natl Acad Sci USA 98: 1711-1716.

Garcia, S., Kovarik, A. 2013. Dancing together and separate again: gymnosperms exhibit frequent changes of fundamental 5S and 35S rRNA gene (rDNA) organisation. Heredity 111: 23-33.

100

Garrido-Ramos, M.A., Jamilena, M., Lozano, R., Rejon, C.R., Rejon, M.R. 1992. A cytogenetical and molecular analysis of the ribosomal cistrons of Allium sphaerocephalon L (Liliaceae). Heredity 69: 43-49.

Garrido, M.A., Jamilena, M., Lozano, R., Rejon, C.R., Rejon, M.R., Parker, J.S. 1994. rDNA site number polymorphism and nor inactivation in natural populations of Allium schoenoprasum. Genetica 94: 67-71.

Goff, S.A., Ricke, D., Lan, T.H., Presting, G., Wang, R.L., Dunn, M., Glazebrook, J., Sessions, A., Oeller, P., Varma, H., Hadley, D., Hutchinson, D., Martin, C., Katagiri, F., Lange, B.M., Moughamer, T., Xia, Y., Budworth, P., Zhong, J.P., Miguel, T., Paszkowski, U., Zhang, S.P., Colbert, M., Sun, W.L., Chen, L.L., Cooper, B., Park, S., Wood, T.C., Mao, L., Quail, P., Wing, R., Dean, R., Yu, Y.S., Zharkikh, A., Shen, R., Sahasrabudhe, S., Thomas, A., Cannings, R., Gutin, A., Pruss, D., Reid, J., Tavtigian, S., Mitchell, J., Eldredge, G., Scholl, T., Miller, R.M., Bhatnagar, S., Adey, N., Rubano, T., Tusneem, N., Robinson, R., Feldhaus, J., Macalma, T., Oliphant, A., Briggs, S. 2002. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp japonica). Science 296: 92-100.

Goldsbrough, P.B., Ellis, T.H.N., Cullis, C.A., 1981. Organization of the 5s RNA genes in flax. Nucleic Acids Res 9: 5895-5904.

Gonzalez-Melendi, P., Wells, B., Beven, A.F., Shaw, P.J. 2001. Single ribosomal transcription units are linear, compacted Christmas trees in plant nucleoli. Plant J 27: 223- 233.

Gray, J.W., Caranno, A.V., Steinmetz, L.L., Van Dilla, M.A., Moore II, D.H., Mayall, B.H., Mendelsohn, M.L. 1975. Chromosome measurement and sorting by flow system. Proc Natl Acad Sci USA 72: 1231-1234

Greider, C.W., Blackburn, E.H. 1985. Identification of a specific telomere terminal transferase-activity in Tetrahymena extracts. Cell 43: 405-413.

Greilhuber, J., Volleth, M., Loidl, J. 1983. Genome size of man and animals relative to the plant Allium cepa. Can J Genet Cytol 25: 554-560.

101

Griffith, J.D., Comeau, L., Rosenfield, S., Stansel, R.M., Bianchi, A., Moss, H., de Lange, T. 1999. Mammalian telomeres end in a large duplex loop. Cell 97: 503-514.

Grime, J.P., Shacklock, J.M.L., Band, S.R. 1985. Nuclear-DNA contents, shoot phenology and species co-existence in a limestone grassland community. New Phytol 100: 435-445.

Hasterok, R., Maluszynska, J. 2000. Different rRNA gene expression in primary and adventitious roots of Allium cepa L. Folia Histochem Cyto 38: 181-184.

Hayflick, L., Moorhead, P.S. 1961. Serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res 25: 585-621.

Heaphy, C.M., Subhawong, A.P., Hong, S.M., Goggins, M.G., Montgomery, E.A., Gabrielson, E., Netto, G.J., Epstein, J.I., Lotan, T.L., Westra, W.H., Shih, L.M., Lacobuzio-Donahue, C.A., Maitra, A., Li, Q.K., Eberhart, C.G., Taube, J.M., Rakheja, D., Kurman, R.J., Wu, T.C., Roden, R.B., Argani, P., De Marzo, A.M., Terracciano, L., Torbenson, M., Meeker, A.K. 2011. Prevalence of the alternative lengthening of telomeres telomere maintenance mechanism in human cancer subtypes. Am J Pathol 179: 1608-1615.

Hemleben, V., Grierson, D. 1978. Evidence ghat in higher plants 25S and 18S Ribosomal- RNA genes are not ntierspersed with genes for 5S Ribosomal-RNA. Chromosoma 65: 353- 358.

Hemleben, V., Werts, D. 1988. Sequence organization and putative regulatory elements in the 5S ribosomal-RNA genes of 2 higher plants (Vigna radiata and Matthiola incana). Gene 62: 165-169.

Heslop-Harrison, J.S. 2000. Comparative genome organization in plants: From sequence and markers to chromatin and chromosomes. Plant Cell 12: 617-635.

Houghtaling, B.R., Cuttonaro, L., Chang, W., Smith, S. 2004. A dynamic molecular link between the telomere length regulator TRF1 and the chromosome end protector TRF2. Curr Biol 14: 1621-1631.

102

Huang, P.H., Pryde, F.E., Lester, D., Maddison, R.L., Borts, R.H., Hickson, I.D., Louis, E.J. 2001. SGS1 is required for telomere elongation in the absence of telomerase. Curr Biol 11: 125-129.

Chase, M.W., Reveal, J.L., Fay, M.F. 2009. A subfamilial classification for the expanded asparagalean families Amaryllidaceae, Asparagaceae and Xanthorrhoeaceae. Bot J Linn Soc 161: 132-136.

Chen, C.M., Wang, C.T., Ho, C.H. 2001a. A plant gene encoding a Myb-like protein that binds telomeric GGTTTAG repeats in vitro. J Biol Chem 276: 16511-16519.

Chen, C.H., Chen, R.J. 2011. Prevalence of telomerase activity in human cancer. J Formos Med Assoc 110: 275-289.

Chen, Q.J., Ijpma, A., Greider, C.W. 2001b. Two survivor pathways that allow growth in the absence of telomerase are generated by distinct telomere recombination events. Mol Cell Biol 21: 1819-1827.

Chung, M.C., Lee, Y.I., Cheng, Y.Y., Chou, Y.J., Lu, C.F. 2008. Chromosomal polymorphism of ribosomal genes in the genus Oryza. Theor Appl Genet 116: 745-753.

Ingle, J., Timmis, J.N., Sinclair, J. 1975. Relationship between satellite deoxyribonucleic- acid, ribosomal ribonucleic-acid gene redundancy, and genome size in plants. Plant Physiol 55: 496-501.

Jain, D., Hebden, A.K., Nakamura, T.M., Miller, K.M., Cooper, J.P. 2010. HAATI survivors replace canonical telomeres with blocks of generic heterochromatin. Nature 467: 223-227.

Jamilena, M., Rejon, C.R., Rejon, M.R. 1990. Variation in the heterochromatin and nucleolar organizing regions of Allium subvillosum L (Liliaceae). Genome 33: 779-784.

103

Johnson, F.B., Marciniak, R.A., McVey, M., Stewart, S.A., Hahn, W.C., Guarente, L. 2001. The Saccharomyces cerevisiae WRN homolog Sgs1p participates in telomere maintenance in cells lacking telomerase. Embo J 20: 905-913.

Jones R. N., Rees H. 1982. B Chromosomes. New York, Academic Press

Kamnert, I., Lopez, C.C., Rosen, M., Edstrom, J.E. 1997. Telomeres terminating with long complex tandem repeats. Hereditas 127: 175-180.

Karamysheva, Z.N., Surovtseva, Y.V., Vespa, L., Shakirov, E.V., Shippen, D.E. 2004. A C-terminal Myb extension domain defines a novel family of double-strand telomeric DNA- binding proteins in Arabidopsis. J Biol Chem 279: 47799-47807.

Karlseder, J., Smogorzewska, A., de Lange, T. 2002. Senescence induced by altered telomere state, not telomere loss. Science 295: 2446-2449.

Kim, S.H., Kaminker, P., Campisi, J. 1999. TIN2, a new regulator of telomere length in human cells. Nat Genet 23: 405-412.

Kirk, K.E., Blackburn, E.H. 1995. An unusual sequence arrangement in the telomeres of the germ-line micronucleus in Tetrahymena thermophila. Gene Dev 9: 59-71.

Kiss, T., Kis, M., Solymosy, F. 1989. Nucleotide-sequence of a 25S Ribosomal-RNA gene from Tomato. Nucleic Acids Res 17: 796-796.

Knoll, A.H., Javaux, E.J., Hewitt, D., Cohen, P. 2006. Eukaryotic organisms in Proterozoic oceans. Philos T R Soc B 361: 1023-1038.

Krahulec F., Duchoslav M. 2010. Alliaceae J. AGARDH. In: Štěpánková J. (eds). Květena České republiky, díl 7. Praha, Academia, 647-677.

Kubo, Y., Okazaki, S., Anzai, T., Fujiwara, H. 2001. Structural and phylogenetic analysis of TRAS, telomeric repeat-specific non-LTR retrotransposon families in Lepidopteran insects. Mol Biol Evol 18: 848-857.

104

Kuo, H.F., Olsen, K.M., Richards, E.J. 2006. Natural variation in a subtelomeric region of Arabidopsis: Implications for the genomic dynamics of a chromosome end. Genetics 173: 401-417.

Lansdorp, P.M., Verwoerd, N.P., van de Rijke, F.M., Dragowska, V., Little, M.T., Dirks, R.W., Raap, A.L., Tanke, H.J. 1996. Heterogeneity in telomere length of human chromosomes. Hum Mol Genet 5: 685-691.

Lapitan, N.L.V., Ganal, M.W., Tanksley, S.D. 1991. Organization of the 5S Ribosomal RNA genes in the genome of Tomato. Genome 34: 509-514.

Le, S., Moore, J.K., Haber, J.E., Greider, C.W. 1999. RAD50 and RAD51 define two pathways that collaborate to maintain telomeres in the absence of telomerase. Genetics 152: 143-152.

Levy, M.Z., Allsopp, R.C., Futcher, A.B., Greider, C.W., Harley, C.B. 1992. Telomere end-replication problem and cell aging. J Mol Biol 225: 951-960.

Li, B.B., Oestreich, S., de Lange, T. 2000. Identification of human Rap1: Implications for telomere evolution. Cell 101: 471-483.

Li, Q.Q., Zhou, S.D., He, X.J., Yu, Y., Zhang, Y.C., Wei, X.Q. 2010. Phylogeny and biogeography of Allium (Amaryllidaceae: Allieae) based on nuclear ribosomal internal transcribed spacer and chloroplast rps16 sequences, focusing on the inclusion of species endemic to China. Ann Bot 106: 709-733.

Lima-de-Faria, A. 1976. Chromosome field 1. Prediction of location of ribosomal cistrons. Hereditas 83: 1-22.

Liu, D., Safari, A., O'Connor, M.S., Chan, D.W., Laegeler, A., Qin, J., Zhou, S.Y. 2004. PTOP interacts with POT1 and regulates its localization to telomeres. Nat Cell Biol 6: 673- 680.

105

Loidl, J., Greilhuber, J. 1983. Structural changes of Ag-stained nucleolus organizing regions and nucleoli during meiosis in Allium flavum. Can J Genet Cytol 25: 524-529.

Lopez, C.C., Nielsen, L., Edstrom, J.E. 1996. Terminal long tandem repeats in chromosomes form Chironomus pallidivittatus. Mol Cell Biol 16: 3285-3290.

Lundblad, V., Blackburn, E.H. 1993. An alternative pathway for yeast telomere maintenance rescues Est1- senescence. Cell 73: 347-360.

Lundblad, V., Szostak, J.W. 1989. A mutant with a defect in telomere elongation leads to senescence in yeast. Cell 57: 633-643.

Macgillivray, C.W., Grime, J.P. 1995. Genome size predicts frost-resistance in British herbaceous plants - Implications for rates of vegetation response to global warming. Funct Ecol 9: 320-325.

Madalena, C.R.G., Amabis, J.M., Gorab, E. 2010. Unusually short tandem repeats appear to reach chromosome ends of Rhynchosciara americana (Diptera: Sciaridae). Chromosoma 119: 613-623.

Madalena, C.R.G., Gorab, E. 2005. A chromosome end satellite of Rhynchosciara americana (Diptera: Sciaridae) resembling nematoceran telomeric repeats. Insect Mol Biol 14: 255-262.

Makarov, V.L., Hirose, Y., Langmore, J.P. 1997. Long G tails at both ends of human chromosomes suggest a C strand degradation mechanism for telomere shortening. Cell 88: 657-666.

Mandakova, T., Joly, S., Krzywinski, M., Mummenhoff, K., Lysak, M.A. 2010. Fast diploidization in close mesopolyploid relatives of Arabidopsis. Plant Cell 22: 2277-2290.

Mandáková, T., Marhold, K., Lysak, M.A. 2013. The widespread crucifer species Cardamine flexuosa is an allotetraploid with a conserved subgenomic structure. New Phytologist 2013: doi: 10.1111/nph.12567.

106

Maringele, L., Lydall, D. 2004. Telomerase- and recombination-independent immortalization of budding yeast. Gene Dev 18: 2663-2675.

Markova, M., Vyskot, B. 2009. New horizons of genomic in situ hybridization. Cytogenet Genome Res 126: 368-375.

Martinez-Guitarte, J.L., Diez, J.L., Morcillo, G. 2008. Transcription and activation under environmental stress of the complex telomeric repeats of Chironomus thummi. Chromosome Res 16: 1085-1096.

Mártonfi P. 2007. Systematika cievnatých rastlín. Košice. Vydavateľstvo UPJŠ Košice

Mason, J.M., Biessmann, H. 1995. The unusual telomeres of Drosophila. Trends Genet 11: 58-62.

Mason, J.M., Frydrychova, R.C., Biessmann, H. 2008. Drosophila telomeres: an exception providing new insights. Bioessays 30: 25-37.

McClintock, B. 1934. The relation of a particular chromosomal element to the development of the nucleoli in Zea mays. Zeitschrift für Zellforschung und Mikroskopische Anatomie 21: 294-326.

McClintock, B. 1942. The fusion of broken ends of chromosomes following nuclear fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 28: 458- 463.

McCormick-Graham, M., Haynes, W.J., Romero, D.P. 1997. Variable telomeric repeat synthesis in Paramecium tetraurelia is consistent with misincorporation by telomerase. Embo J 16: 3233-3242.

Memariani, F., Joharchi, M.R., Arjmandi, A.A. 2012. Allium aladaghense (Amaryllidaceae, Allieae), a new species of section Asteroprason from northeast of Iran. Phytotaxa 56: 28-34.

107

Meselson, M., Stahl, F.W. 1958. The replication of DNA. Cold Spring Harb Sym 23: 9-12.

Métézeau, P., Schmitz, A., Frelat, G. 1993. Analysis and sorting of chromosomes by flow cytometry: New trends. Biol Cell 78: 31-39.

Meyers, B.C., Tingley, S.V., Morgante, M. 2001. Abundance, distribution, and transcriptional activity of repetitive elements in the maize genome. Genome Res 11: 1660- 1676.

Meyne, J., Ratliff, R.L., Moyzis, R.K. 1989. Conservation of the human telomere sequence

(TTTAGGG)n among Vertebrates. P Natl Acad Sci USA 86: 7049-7053.

Mitton-Fry, R.M., Anderson, E.M., Hughes, T.R., Lundblad, V., Wuttke, D.S. 2002. Conserved structure for single-stranded telomeric DNA recognition. Science 296: 145-147.

Moon, I.K., Jarstfer, M.B. 2007. The human telomere and its relationship to human disease, therapy, and tissue engineering. Front Biosci 12: 4595-4620.

Morcillo, G., Barettino, D., Carmona, M.J., Carretero, M.T., Diez, J.L., 1988. Telomeric DNA-sequences differentially activated by heat-shock in 2 Chironomus subspecies. Chromosoma 96: 139-144.

Moyzis, R.K., Buckingham, J.M., Cram, L.S., Dani, M., Deaven, L.L., Jones, M.D., Meyne, J., Ratliff, R.L., Wu, J.R. 1988. A highly conserved repetitive DNA-sequence,

(TTTAGGG)n, present at the telomeres of human chromosomes. P Natl Acad Sci USA 85: 6622-6626.

Mozgova, I., Mokros, P., Fajkus, J. 2010. Dysfunction of Chromatin Assembly Factor 1 induces shortening of telomeres and loss of 45S rDNA in Arabidopsis thaliana. Plant Cell 22: 2768-2780.

Mravinac, B., Mestrovic, N., Cavrak, V.V., Plohl, M. 2011. TCAGG, an alternative telomeric sequence in insects. Chromosoma 120: 367-376.

108

Muller, H.J. 1938. The remaking of chromosomes. Collecting Net 13: 181-198.

Nakamura, T.M., Cooper, J.P., Cech, T.R. 1998. Two modes of survival of fission yeast without telomerase. Science 282: 493-496.

Natarajan, S., McEachern, M.J. 2002. Recombinational telomere elongation promoted by DNA circles. Mol Cell Biol 22: 4512-4521.

Neves, N., Delgado, M., Silva, M., Caperta, A., Morais-Cecilio, L., Viegas, W., 2005. Ribosomal DNA heterochromatin in plants. Cytogenet Genome Res 109: 104-111.

Nielsen, L., Edstrom, J.E., 1993. Complex telomere-associated repeat units in members of the genus Chironomus evolve from sequences similar to simple telomeric repeats. Mol Cell Biol 13: 1583-1589.

Oganesian, L., Moon, I.K., Bryan, T.M., Jarstfer, M.B. 2006. Extension of G-quadruplex DNA by ciliate telomerase. Embo J 25: 1148-1159.

Ohri, D., Pistrick, K. 2001. Phenology and genome size variation in Allium L. - a tight correlation? Plant Biology 3: 654-660.

Ochman, H., Gerber, A.S., Hartl D.L. 1988. Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction. Genetics 120: 621-623.

Okazaki, S., Ishikawa, H., Fujiwara, H. 1995. Structural-snalysis of Tras1, a novel family of telomeric repeat-associated retrotransposons in the Silkworm, Bombyx mori. Mol Cell Biol 15: 4545-4552.

Okazaki, S., Tsuchida, K., Maekawa, H., Ishikawa, H., Fujiwara, H. 1993. Identification of a pentanucleotide telomeric sequence, (TTAGG)n, in the Silkworm Bombyx mori and in other insects. Mol Cell Biol 13: 1424-1432.

Olovnikov, A.M. 1971. Principle of Marginotomy in template synthesis of polynucleotides. Dokl Akad Nauk SSSR: 201, 1496-1499.

109

Osanai, M., Kojima, K.K., Futahashi, R., Yaguchi, S., Fujiwara, H. 2006. Identification and characterization of the telomerase reverse transcriptase of Bombyx mori (silkworm) and Tribolium castaneum (flour beetle). Gene 376: 281-289.

Palm, W., de Lange, T. 2008. How shelterin protects mammalian telomeres. Annu Rev Genet 42: 301-334.

Panzera, F., Gimenez-Abian, M.I., Lopez-Saez, J.F., Gimenez-Martin, G., Cuadrado, A., Shaw, P.J., Beven, A.F., Canovas, J.L., De la Torre, C. 1996. Nucleolar organizer expression in Allium cepa L. chromosomes. Chromosoma 105: 12-19.

Pardue, M.L., Danilevskaya, O.N., Lowenhaupt, K., Slot, F., Traverse, K.L. 1996. Drosophila telomeres: New views on chromosome evolution. Trends Genet 12: 48-52.

Pasolini, P., Costagliola, D., Rocco, L., Tinti, F. 2006. Molecular organization of 5S rDNAs in Rajidae (Chondrichthyes): Structural features and evolution of piscine 5S rRNA genes and nontranscribed intergenic spacers. J Mol Evol 62: 564-574.

Pearce, S.R., Pich, U., Harrison, G., Flavell, A.J., HeslopHarrison, J.S.P., Schubert, I., Kumar, A. 1996. The Ty1-copia group retrotransposons of Allium cepa are distributed throughout the chromosomes but are enriched in the terminal heterochromatin. Chromosome Res 4: 357-364.

Peska, V. 2011. Neobvyklé telomery (Disertační práce), Brno, Masarykova univerzita

Peska, V., Schrumpfova, P.P., Fajkus, J. 2011. Using the telobox to search for plant telomere binding proteins. Curr Protein Pept Sc 12: 75-83.

Pich, U., Fritsch, R., Schubert, I. 1996. Closely related Allium species (Alliaceae) share a very similar satellite sequence. Plant Syst Evol 202: 255-264.

Pich, U., Schubert, I. 1998. Terminal heterochromatin and alternative telomeric sequences in Allium cepa. Chromosome Res 6: 315-321.

110

Prescott, J., Blackburn, E.H.: 1997. Telomerase RNA mutations in Saccharomyces cerevisiae alter telomerase action and reveal nonprocessivity in vivo and in vitro. Gene Dev 11: 528-540.

Prochazkova Schrumpfova, P., Vychodilova, I., Dvorackova, M., Majerska, J., Dokladal, L., Schorova, S., Fajkus, J. 2014. Telomere repeat binding proteins are functional components of Arabidopsis telomeres and interact with telomerase. Plant J 77: 770-781.

Prokopowich, C.D., Gregory, T.R., Crease, T.J. 2003. The correlation between rDNA copy number and genome size in eukaryotes. Genome 46: 48-50.

Prowse, K.R., Greider, C.W. 1995. Developmental and tissue-specific regulation of mouse telomerase and telomere length. P Natl Acad Sci USA 92: 4818-4822.

Pruitt, R.E., Meyerowitz, E.M. 1986. Characterization of the genome of Arabidopsis thaliana. J Mol Biol 187: 169-183.

Ranjekar, P.K., Lafontaine, J.G., Pallotta, D. 1978. Analysis of plant genomes. V. Comparative study of molecular properties of DNAs of 7 Allium species. Biochem Genet 16: 957-970.

Rashkova, S., Karam, S.E., Kellum, R., Pardue, M.L. 2002. Gag proteins of the two Drosophila telomeric retrotransposons are targeted to chromosome ends. J Cell Biol 159: 397-402.

Ricroch, A., Brown, S.C. 1997. DNA base composition of Allium genomes with different chromosome numbers. Gene 205: 255-260.

Ricroch, A., Peffley, E.B., Baker, R.J. 1991. Chromosomal location of rDNA in Allium - in situ hybridization using biotin-labeled and fluorescein-labeled probe. Theor Appl Genet 83: 413-418.

Ricroch, A., Yockteng, R., Brown, S.C., Nadot, S. 2005. Evolution of genome size across some cultivated Allium species. Genome 48: 511-520.

111

Rigby, P.W., Dieckmann, M., Rhodes, C., Berg, P. 1977. Labeling deoxyribonucleic acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase I. J Mol Biol 113: 237-251.

Richards, E.J., Ausubel, F.M. 1988. Isolation of a higher eukaryotic telomere from Arabidopsis thaliana. Cell 53: 127-136.

Ritossa, F.M., Spiegelman, S. 1965. Localization of DNA complementary to ribosomal RNA in nucleolus organizer region of Drosophila melanogaster. P Natl Acad Sci USA 53, 737-745

Roa, F., Guerra, M. 2012. Distribution of 45S rDNA sites in chromosomes of plants: Structural and evolutionary implications. Bmc Evol Biol 12: 225

Rodriguez-Enriquez, M.J., Grant-Downton, R.T. 2013. A new day dawning: Hemerocallis (daylily) as a future model organism. AoB PLANTS 5: pls055; doi:10.1093/aobpla/pls055.

Rogers, S.O., Bendich, A.J. 1987. Ribosomal-RNA genes in plants - variability in copy number and in the intergenic spacer. Plant Mol Biol 9, 509-520.

Rosen, M., Castillejo-Lopez, C., Edstrom, J.E. 2002a. Telomere terminating with centromere-specific repeats is closely associated with a transposon derived gene in Chironomus pallidivittatus. Chromosoma 110: 532-541.

Rosen, M., Edstrom, J.E. 2002. Chromosome ends in Chironomus tentans do not have long single-stranded overhangs characterizing canonical telomeres. Chromosome Res 10: 21-31.

Rosen, M., Kamnert, I., Edstrom, J.E. 2002b. Extrachromosomal RNA-DNA complex containing long telomeric repeats in chironomids. Insect Mol Biol 11: 167-174.

Rossato, R.M., Madalena, C.R.G., Gorab, E. 2007. Unusually short tandem repeats in the chromosome end structure of Rhynchosciara (Diptera: Sciaridae). Genetica 131: 109-116.

Roth, C.W., Kobeski, F., Walter, M.F., Biessmann, H. 1997. Chromosome end elongation by recombination in the mosquito Anopheles gambiae. Mol Cell Biol 17: 5176-5183.

112

Rotkova, G., Sklenickova, M., Dvorackova, M., Sykorova, E., Leitch, A.R., Fajkus, J. 2004. An evolutionary change in telomere sequence motif within the plant section Asparagales had significance for telomere nucleoprotein complexes. Cytogenet Genome Res 107: 132-138.

Ruckova, E., Friml, J., Schrumpfova, P.P., Fajkus, J. 2008. Role of alternative telomere lengthening unmasked in telomerase knock-out mutant plants. Plant Mol Biol 66: 637-646.

Sasaki, T., Fujiwara, H. 2000. Detection and distribution patterns of telomerase activity in insects. Eur J Biochem 267: 3025-3031.

Scalenghe, F., Turco, E., Edström, J.E., Pirrota, V., Melli, M. 1981. Microdissection and cloning of DNA from a specific region of Drosophila melanogaster polytene chromosomes. Chromosoma 82: 205-216

Shibata, F., Hizume, M. 2002. Evolution of 5S rDNA units and their chromosomal localization in Allium cepa and Allium schoenoprasum revealed by microdissection and FISH. Theor Appl Genet 105: 167-172.

Shigyo, M., Tashiro, Y., Isshiki, S., Miyazaki, S. 1996. Establishment of a series of alien monosomic addition lines of Japanese bunching onion (Allium fistulosum L) with extra chromosomes from shallot (A. cepa L Aggregatum group). Genes Genet Syst 71: 363-371.

Schubert, I., Wobus, U. 1985. In situ hybridization confirms jumping nucleolus organizing regions in Allium. Chromosoma 92: 143-148.

Signon, L., Malkova, A., Naylor, M.L., Klein, H., Haber, J.E. 2001. Genetic requirements for RAD51- and RAD54-independent break-induced replication repair of a chromosomal double-strand break. Mol Cell Biol 21: 2048-2056.

Smith, F.W., Feigon, J., 1992. Quadruplex structure of Oxytricha telomeric DNA oligonucleotides. Nature 356: 164-168.

113

Sousa, A., Silva, A.E.B.E., Cuadrado, A., Loarce, Y., Alves, M.V., Guerra, M. 2011. Distribution of 5S and 45S rDNA sites in plants with holokinetic chromosomes and the "chromosome field" hypothesis. Micron 42: 625-631.

Stajner, D., Igic, R., Popovic, B.M., Malencic, D. 2008. Comparative study of antioxidant properties of wild growing and cultivated Allium species. Phytother Res 22: 113-117.

Stevenson, M., Armstrong, S.J., Jones, G.H., Ford-Lloyd, B.V. 1999. Distribution of a 375 bp repeat sequence in Allium (Alliaceae) as revealed by FISH. Plant Syst Evol 217: 31-42.

Swift, H. 1950. The constancy of deoxyribose nucleic acid in plant nuclei. P Natl Acad Sci USA 36: 643-654.

Sykorova, E., Fajkus, J., Meznikova, M., Lim, K.Y., Neplechova, K., Blattner, F.R., Chase, M.W., Leitch, A.R. 2006a. Minisatellite telomeres occur in the family Alliaceae but are lost in Allium. Am J Bot 93: 814-823.

Sykorova, E., Lim, K.Y., Chase, M.W., Knapp, S., Leitch, I.J., Leitch, A.R., Fajkus, J. 2003a. The absence of Arabidopsis-type telomeres in Cestrum and closely related genera Vestia and Sessea (Solanaceae): first evidence from eudicots. Plant J 34: 283-291.

Sykorova, E., Lim, K.Y., Kunicka, Z., Chase, M.W., Bennett, M.D., Fajkus, J., Leitch, A.R. 2003b. Telomere variability in the monocotyledonous plant order Asparagales. P Roy Soc B-Biol Sci 270: 1893-1904.

Sykorova, E., Rowland, A., Leitch, A.R., Fajkus, J. 2006b. Asparagales telomerases which synthesize the human type of telomeres. Plant Mol Biol 60: 633-646.

Tatsuke, T., Sakashita, K., Masaki, Y., Lee, J.M., Kawaguchi, Y., Kusakabe, T. 2010. The telomere-specific non-LTR retrotransposons SART1 and TRAS1 are suppressed by Piwi subfamily proteins in the silkworm, Bombyx mori. Cell Mol Biol Lett 15: 118-133.

114

Teng, S.C., Chang, J., McCowan, B., Zakian, V.A. 2000. Telomerase-independent lengthening of yeast telomeres occurs by an abrupt Rad50p-dependent, Rif-inhibited recombinational process. Mol Cell 6: 947-952.

Teng, S.C., Zakian, V.A. 1999. Telomere-telomere recombination is an efficient bypass pathway for telomere maintenance in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 19: 8083- 8093.

Tomaska, L., McEachern, M.J., Nosek, J. 2004. Alternatives to telomerase: keeping linear chromosomes via telomeric circles. Febs Lett 567: 142-146.

Tomaska, L., Nosek, J., Makhov, A.M., Pastorakova, A., Griffith, J.D. 2000. Extragenomic double-stranded DNA circles in yeast with linear mitochondrial genomes: potential involvement in telomere maintenance. Nucleic Acids Res 28: 4479-4487.

Tucker, S., Vitins, A., Pikaard, C.S. 2010. Nucleolar dominance and ribosomal RNA gene silencing. Curr Opin Cell Biol 22: 351-356.

Vitkova, M., Kral, J., Traut, W., Zrzavy, J., Marec, F. 2005. The evolutionary origin of insect telomeric repeats, (TTAGG)(n). Chromosome Res 13: 145-156.

Volpicella, M., Leoni, C., Costanza, A., Fanizza, I., Placido, A., Ceci, L.R. 2012. Genome walking by next generation sequencing approaches. Biology 2013: 495-507. doi: 10.3390/biology1030495.

Walmsley, R.M., Chan, C.S.M., Tye, B.K., Petes, T.D. 1984. Unusual DNA sequences associated with the ends of yeast chromosomes. Nature 310: 157-160.

Watson, J.D. 1972. Origin of concatemeric T7 DNA. Nature-New Biol 239: 197-201.

Watson, J.M., Bulankova, P., Riha, K., Shippen, D.E., Vyskot, B. 2005. Telomerase- independent cell survival in Arabidopsis thaliana. Plant J 43: 662-674.

115

Weiss-Schneeweiss, H., Riha, K., Jang, C.G., Puizina, J., Scherthan, H., Schweizer, D. 2004. Chromosome termini of the monocot plant Othocallis siberica are maintained by telomerase, which specifically synthesises vertebrate-type telomere sequences. Plant J 37: 484-493.

Weiss, H., Scherthan, H. 2002. Aloe spp. - plants with vertebrate-like telomeric sequences. Chromosome Res 10: 155-164.

Yang, Q., Zheng, Y.L., Harris, C.C. 2005. POT1 and TRF2 cooperate to maintain telomeric integrity. Mol Cell Biol 25: 1070-1080.

Ye, J.Z.S., Hockemeyer, D., Krutchinsky, A.N., Loayza, D., Hooper, S.M., Chait, B.T., de Lange, T. 2004. POT1-interacting protein PIP1: a telomere length regulator that recruits POT1 to the TIN2/TRF1 complex. Gene Dev 18: 1649-1654.

Yeager, T.R., Neumann, A.A., Englezou, A., Huschtscha, L.I., Noble, J.R., Reddel, R.R. 1999. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. Cancer Res 59: 4175-4179.

Yu, J., Hu, S.N., Wang, J., Wong, G.K.S., Li, S.G., Liu, B., Deng, Y.J., Dai, L., Zhou, Y., Zhang, X.Q., Cao, M.L., Liu, J., Sun, J.D., Tang, J.B., Chen, Y.J., Huang, X.B., Lin, W., Ye, C., Tong, W., Cong, L.J., Geng, J.N., Han, Y.J., Li, L., Li, W., Hu, G.Q., Huang, X.G., Li, W.J., Li, J., Liu, Z.W., Li, L., Liu, J.P., Qi, Q.H., Liu, J.S., Li, L., Li, T., Wang, X.G., Lu, H., Wu, T.T., Zhu, M., Ni, P.X., Han, H., Dong, W., Ren, X.Y., Feng, X.L., Cui, P., Li, X.R., Wang, H., Xu, X., Zhai, W.X., Xu, Z., Zhang, J.S., He, S.J., Zhang, J.G., Xu, J.C., Zhang, K.L., Zheng, X.W., Dong, J.H., Zeng, W.Y., Tao, L., Ye, J., Tan, J., Ren, X.D., Chen, X.W., He, J., Liu, D.F., Tian, W., Tian, C.G., Xia, H.G., Bao, Q.Y., Li, G., Gao, H., Cao, T., Wang, J., Zhao, W.M., Li, P., Chen, W., Wang, X.D., Zhang, Y., Hu, J.F., Wang, J., Liu, S., Yang, J., Zhang, G.Y., Xiong, Y.Q., Li, Z.J., Mao, L., Zhou, C.S., Zhu, Z., Chen, R.S., Hao, B.L., Zheng, W.M., Chen, S.Y., Guo, W., Li, G.J., Liu, S.Q., Tao, M., Wang, J., Zhu, L.H., Yuan, L.P., Yang, H.M., 2002. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp indica). Science 296: 79-92.

116

Zellinger, B., Akimcheva, S., Puizina, J., Schirato, M., Riha, K. 2007. Ku suppresses formation of telomeric circles and alternative telomere lengthening in Arabidopsis. Mol Cell 27: 163-169.

Zhang, Y.J., Kamnert, I., Lopez, C.C., Cohn, M., Edstrom, J.E. 1994. A Family of complex tandem DNA repeats in the telomeres of Chironomus pallidivittatus. Mol Cell Biol 14: 8028-8036.

Zhong, Z., Shiue, L., Kaplan, S., Delange, T. 1992. A mammalian factor that binds telomeric TTTAGGG repeats in vitro. Mol Cell Biol 12: 4834-4843.

Zonneveld, B.J.M. 2010. New record holders for maximum genome size in eudicots and monocots. Journal of Botany [online]. DOI:10.1155/2010/527357.

Zvereva, M.I., Shcherbakova, D.M., Dontsova, O.A. 2010. Telomerase: Structure, functions, and activity regulation. Biochemistry-Moscow 75: 1563-1583.

117

Příloha 1: Fylogenetický strom Monocotyledonae

Příloha 1. Fylogenetický strom Monocotyledonae. Upraveno podle (APG III, 2009)

Příloha 2: Fylogenetické členění řádu Asparagales

Příloha 2. Fylogenetické členění řádu Asparagales. Upraveno podle (Rodriguez-Enriquez a Grant-Downton, 2013).

Příloha 3: Fylogenetické uspořádání rodu Allium

Druh Sekce Podrod

Příloha 3. Fylogenetické uspořádání rodu Allium. Převzato z podle (Li et al., 2010)