Nantenainarindrah SN MAST

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO FACULTE DES SCIENCES DOMAINE DES SCIENCES ET TECHNOLOGIE MENTION : BIOLOGIE ET ECOLOGIE VEGETALES Mémoire pour l’obtention du diplôme de MASTER en « Sciences et Technologies mention Biologie et Ecologie végétales » Parcours : Diagnostique, Suivi Ecologique et Aménagement des Ecosystèmes et Environnement (DIASE)

INFLUENCE DES FACTEURS ECO-BIOLOGIQUES ET DES

TRAITEMENTS DES ECHANTILLONS DE Sigesbeckia orientalis L. SUR LA PRODUCTION DE DARUTOSIDE DANS LA REGION ALAOTRA MANGORO

(CAS D’ANJIRO)

Présenté par : Rindra Harilanto NANTENAINA

Soutenu publiquement le 26 mai 2016 devant le jury composé de :

Président : Professeur Bakolimalala RAKOUTH

Rapporteur : Docteur Edmond ROGER

Examinateurs : Docteur Verohanitra RAFIDISON

Docteur Alain LOISEAU UNIVERSITE D’ANTANANARIVO

FACULTE DES SCIENCES DOMAINE DES SCIENCES ET TECHNOLOGIE MENTION : BIOLOGIE ET ECOLOGIE VEGETALES

Mémoire pour l’obtention du diplôme de MASTER en « Sciences et Technologies mention Biologie et Ecologie végétales» Parcours : Diagnostique, Suivi Ecologique et Aménagement des Ecosystèmes et Environnement (DIASE)

INFLUENCE DES FACTEURS ECO-BIOLOGIQUES ET DES TRAITEMENTS DE S ECHANTILLONS DE Sigesbeckia orientalis L. SUR LA PRODUCTION DE

DARUTOSIDE DANS LA REGION ALAOTRA MANGORO

(CAS D’ANJIRO)

Présenté par : Rindra Harilanto NANTENAINA

Soutenu publiquement le 26 mai 2016 devant le jury composé de :

Président : Professeur Bakolimalala RAKOUTH

Rapporteur : Docteur Edmond ROGER

Examinateurs : Docteur Verohanitra RAFIDISON

Docteur Alain LOISEAU

Photo de Sigesbeckia orientalis sur la page de couverture : © Yves Rocher, 2014 REMERCIEMENTS

Le présent mémoire n’a pu aboutir sans le soutien et la contribution de nombreuses personnes. Nous adressons nos vifs remerciements plus particulièrement à :

- Professeur Bakolimalala RAKOUTH, Enseignant-Chercheur au Département de Biologie et Ecologie Végétales de l’Université d’Antananarivo, qui a accepté d’assurer la présidence du jury de ce mémoire; - Docteur Edmond ROGER, Enseignant-Chercheur au Département de Biologie et Ecologie Végétales de l’Université d’Antananarivo, qui a accepté d’être rapporteur de ce mémoire, et surtout pour son encadrement, ses multiples suggestions pour les travaux sur terrain et ses précieux conseils pour la rédaction ; - Docteur Verohanitra RAFIDISON, Enseignant-Chercheur au Département de Biologie et Ecologie Végétales de l’Université d’Antananarivo, qui a bien voulu examiner ce mémoire et apporté ses aides précieux pour sa réalisation ; - Docteur Alain LOISEAU, chimiste de la Société SOTRAMEX d’Antananarivo, qui a aimablement accepté d’être le second examinateur ; - La Société Yves Rocher Paris, qui a soutenu financièrement ce mémoire ; - Monsieur Christian LUBRANO, Responsable du Pôle Innovation du Végétal et Madame Bénédicte PORTET, Responsable du Laboratoire de Phytochimie de la Direction des Sciences du végétales de la société Yves Rocher Paris, qui nous a appuyé à l’aide des documents sur leurs recherche ; - Toutes les équipes de la société SOTRAMEX : Mr Mamy ANDRIAMANDROSO (chimiste), Mr Rolland RANDRIANAIVOARISOA (chimiste), Mr Solofonirina RAHERINIAINA (botaniste), Mr Maxime RAKOTONANAHARY (chimiste), pour leurs aides durant les travaux de laboratoire effectué à Itaosy Antananarivo ; - Monsieur Jemisa RAROJOSON, chef du Laboratoire de pédologie de FOFIFA Tsimbazaza, avec ses équipes : Mr Mamy et Mme Solo pour leur différents conseils et soutiens pendant l’analyse pédologique ; - Docteur Harison RABARISON, Enseignant-Chercheur au Département de Biologie et Ecologie Végétales de l’Université d’Antananarivo, pour ses nombreuses critiques et conseils pour améliorer ce mémoire et aussi ses encouragements ; - Monsieur Basil RAKOTOANADAHY, technicien au Département de Biologie et Ecologie végétales de l’Université d’Antananarivo, qui nous a beaucoup assisté durant les travaux de terrain, pour ses encouragements, ses conseils et ses aides ; - Madame Mihajamalala Andotiana ANDRIAMANOHERA, mon binôme, pour sa gentillesse, ses aides et ses réconforts ; - Missionnaire Chrétien Rebaliha MANOVONKERINDRAINY, qui m’a aidé dans la traduction du résumé en anglais et pour ses aides morales et spirituelles ; - Monsieur Feno Sitraka ANDRIAMAMPIANINA pour son aide sur la réalisation de la carte ; - Docteur Voninavoko RAHAJANIRINA, pour ses aides techniques ; - Tous les professeurs enseignants du Département du Domaine des Sciences et Technologies, Mention Biologie et Ecologie Végétales, pour leurs encouragements ; - Les guides sur terrains, qui nous ont aidé durant nos travaux sur terrains (Mr Jacob, Mr Njaka, Quartier mobile) ; - Monsieur le Maire et les villageois de la Commune rurale d’Anjiro et ses environs pour leurs accueils et leurs accords ; - Toute ma famille, mes proches, mes amis, pour leurs soutiens moraux, techniques et financier ; - Tous ceux qui ont collaboré directement ou indirectement à la réalisation de cette étude.

Table des matières

Liste des Figures ...... iii

Liste des Photos ...... iii

Liste des Tableaux ...... iv

Liste de Carte ...... iv

Liste des Annexes ...... iv

Abréviations et acronymes ...... v

INTRODUCTION ...... 1

I. MILIEU D’ETUDE ...... 3

I.1 Situation géographique ...... 3

I.2 Milieu abiotique ...... 3

I.3 Milieu biotique ...... 5

I.3.1 Végétation et flore ...... 5

I.3.2 Faune ...... 5

I.3.3 Population et ses activités ...... 7

II. MATERIELS ET METHODES ...... 8

II.1 Matériels biologiques ...... 8

II.1.1 Description de Sigesbeckia orientalis L...... 8

II.1.2 Composants hétérosidiques de Sigesbeckia orientalis ...... 9

II.2 Méthodes ...... 10

II.2.1 Etudes préliminaires ...... 10

II.2.1.1 Etude bibliographique ...... 10

II.2.1.2 Prospection du site d’étude ...... 10

II.2.1.3 Consultation des spécimens d’herbier ...... 10

II.2.2 Collecte des données ...... 11

II.2.2.1 Récolte des échantillons de plantes : ...... 11

II.2.2.2 Séchage des échantillons de plantes collectés ...... 12

II.2.2.3 Extraction des échantillons séchés de Sigesbeckia orientalis ...... 13

II.2.2.4 Chromatographie sur couche mince de l’extrait sec ...... 15

II.2.2.5 Analyse pédologique ...... 18

II.2.2.6 Autres paramètres relatives aux sites de récoltes ...... 19

II.2.3 Analyse et traitement statistiques des données collectées ...... 20

II.2.3.1 Analyse de variance (ANOVA) ...... 20

II.2.3.2 Analyse en composantes principales (ACP) ...... 20

III. RESULTATS ET INTERPRETATIONS ...... 21

III.1 Echantillons collectés ...... 22

III.2 Séchages des échantillons collectés et codages ...... 23

III.3 Résultat d’extraction ...... 24

III.4 Analyse chromatographique sur couche mince ...... 26

III.4.1 Lecture visible ...... 26

III.4.2 Lecture sous scanner ...... 27

III.5 Résultats de l’analyse pédologique ...... 28

III.6 Résultats de relevé des autres paramètres ...... 29

III.7 Détermination des conditions favorables pour une meilleure teneur en Darutoside . 29

III.7.1 Variation de la teneur en Darutoside selon le type d’organe et le mode de séchage 29

III.7.2 Variation de la teneur en Darutoside selon les périodes de récolte ...... 31

III.7.3 Variation de la teneur en Darutoside selon les caractéristiques de l’habitat ...... 31

IV. DISCUSSIONS ...... 35

CONCLUSION ...... 37

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...... 38

WEBOGRAPHIE ...... 40

ANNEXES ...... I

Liste des Figures

Figure 1 : Courbe ombrothermique de Moramanga, d’après la méthode de GAUSSEN ...... 3 Figure 2 : Structure chimique du Darutoside ...... 10 Figure 3 : Structure chimique de l’Alpha Hédérine ...... 10 Figure 4: Etapes de l’extraction des échantillons secs ...... 15 Figure 5: Etapes de la chromatographie sur couche mince (CCM) des extraits secs ...... 17 Figure 6 : Schéma des différentes étapes de l’analyse pédologique ...... 19 Figure 7 : Cercle de corrélation ...... 21 Figure 8 : Histogramme de la variation de la teneur en Darutoside selon le type d’organe et le mode de séchage ...... 30 Figure 9 : Histogrammes montrant la variation de la teneur en Darutoside selon les périodes de récolte...... 31 Figure 10 : Corrélation entre les variables ...... 32

Liste des Photos

Planche photographique 1 : Exemple d'espèces emblématiques de faunes et de flore d’Alaotra Mangoro………………………………………………………………………………………..6

Photo 1 : Rameau fleuri de Sigesbeckia orientalis ...... 8 Photo 2 : Fleurs groupées en inflorescence de Sigesbeckia orientalis ...... 8 Photo 3 : Sigesbeckia orientalis choisie pour la collecte ...... 11 Photo 4: Appareil lyophilisateur ...... 13 Photo 5: Echantillons de feuilles sèches ...... 14 Photo 6 : CAMAG TLC Scanner 3 ...... 18 Photo 7 : Plaque CCM montrant le résultat de la migration des composés chimiques dans chaque échantillon SOR-1505 ...... 26 Photo 8 : Plaque CCM montrant le résultat de la migration des composés chimiques dans chaque échantillon SOR-1510 ...... 26 Photo 9 : Plaque CCM montrant le résultat de la migration des composés chimiques dans chaque échantillon SOR-1550 feuille séchée à l’ombre ...... 27

iii

Liste des Tableaux

Tableau 1 : Résultat de la collecte des échantillons ...... 22 Tableau 2: Codes des échantillons de Sigesbeckia orientalis par rapport à la semaine de collecte, du lieu de collecte, de l’organe collecté et du mode de séchage en 2015 ...... 23 Tableau 3 : Temps de séchage de chaque échantillon ...... 24 Tableau 4 : Rendement d’extraction de chaque échantillon...... 24 Tableau 5 : Temps de séchage et rendement de l’extraction de l’échantillon de feuille récoltée au début de la période pluvieuse (SOR 1550), séché à l’ombre. (2ème résultat) ...... 25 Tableau 6 : Tableau de correspondance : ...... 25 Tableau 7 : Résultats de l'étude pédologique ...... 28 Tableau 8 : Interprétations du résultat de l'étude pédologique ...... 28 Tableau 9 : Distances du champ par rapport au cours d'eau et village ...... 29

Liste de Carte

Carte 1 : Localisation des sites d’étude dans la région Alaotra Mangoro (Anjiro et ses environ) ...... 4

Liste des Annexes Annexe 1 : Tableau des données climatiques de Moramanga (1961-1990)...... I Annexe 2 : Tracks at Wavelength ...... II

Abréviations et acronymes α-H : Alpha-Hédérine

ACP : Analyse en Composante Principale

ANOVA: Analysis Of Variance

APG: Angiosperm Phylogeny Group

CCM: Chromatographie sur Couche Mince

CRCA : Cellule Régionale de Centralisation et d’Analyse

CTA : Centre Technique de coopération Agricole

EtOH : Ethanol

FOFIFA : Foibem-pirenena ho an’ny Fikarohana ampiharina ho Fampandrosoana ny eny Ambanivohitra

H2SO4 : Acide Sulfurique

MetOH: Méthanol

Rf: Right flow

SOTRAMEX: SOciété de TRAnsformation Malgache et d’EXportation

TLC: Thym Layer Chromatography

INTRODUCTION

Introduction

Partout dans le monde, on estime 50 000 à 70 000 espèces végétales connues pour leur usage médical ; dont plus de 120 composés issus de ces plantes sont utilisés en médecine moderne avec plus de 75% à usage traditionnel. Les molécules issues des plantes naturelles sont considérées comme une source très importante de médicaments (SCHIPPMANN & al., 2006, KHELIF & NAAM, 2014). D’un point de vue pharmacologique, les métabolites secondaires des plantes médicinales constituent la fraction la plus active des composés chimiques présents chez les végétaux et actuellement environ un tiers des médicaments sur le marché contiennent au moins une telle substance végétale (NEWMAN & CRAGG, 2012). C’est pour cela qu’en pharmacie, les plantes sauvages spontanées, dites plantes de cueillette, ou les plantes de cultures sont utilisées. Elles peuvent être indigènes, acclimatées, ou exotiques. Un climat toujours chaud, mais avec une saison sèche et une saison humide plus ou moins marquées, dans les pays tropicaux, est propice à la croissance de nombreuses plantes médicinales et aromatiques (PARIS & MOYSE, 1965). Il existe plusieurs domaines où les plantes médicinales sont utilisées. En médecine, elles servent à fabriquer des médicaments pour l’Homme. En agriculture, elles ont des vertus propres à contrôler le développement des insectes et nématodes. En cosmétique, ces plantes sont utilisées pour la fabrication de produit de beauté, de parfum, de produit d’hygiène et autres articles de toilette. De même pour l’alimentation, elles prennent place dans les assaisonnements, dans les boissons et dans les colorants (KHELIF & NAAM, 2014). Depuis l’année 1980, Madagascar exporte 90% de plantes médicinales notamment en

France, en Italie et en Allemagne, le reste en Belgique, Suisse et Espagne. Parmi eux, l’espèce Sigesbeckia orientalis de la famille des ASTERACEAE décrite en 1885 par Lionnel Auffray, a été utilisée comme plante à propriété cicatrisante, en isolant de la plante séchée le Darutoside (www. ravina-sarl.com, 2014). C’est aussi un médicament homéopathique qui peut être utilisé pour combattre divers types d’infection, tels que les plaies ou les cavités purulentes. C’est pour cette raison que, des industries cosmétiques utilisent Sigesbeckia orientalis, comme produit destiné aux peaux sensibles. Par ailleurs, ce remède qui peut être homéopatique est largement utilisé en infectiologie et est extrait d’une plante, qu’on trouve à Madagascar, sur les côtes Australes d’Asie et qui est également cultivée en Europe (www.homéopathie.com, 2015). La Société Yves Rocher Paris, depuis l’année 2004, s’est approvisionnée en plantes provenant de Madagascar. Cette société a étudié Sigesbeckia orientalis, en vue d’une production de gamme de produits, issus de son extrait. Afin d’enrichir leurs données scientifiques, la société Yves Rocher Paris collabore avec le Département de Biologie et

Introduction (Suite)

Ecologie Végétales (DBEV) de l’Université d’Antananarivo Madagascar, pour la recherche écologique relative à l’espèce. Une collaboration étroite avec la société SOTRAMEX à Madagascar a permis de faire l’étude phytochimique. Cette recherche met en valeur l’ « Influence des facteurs écologiques et les traitements de Sigesbeckia orientalis L. sur la production du Darutoside dans la région Alaotra Mangoro (cas d’Anjiro). » A la fin de cette étude, nous allons déterminer les facteurs éco-biologiques et les conditions de séchages favorables permettant une meilleure teneur en Darutoside de Sigesbeckia orientalis. Pour atteindre cet objectif, quatre hypothèses ont été formulées : - la teneur en Darutoside de Sigesbeckia orientalis varie selon le type d’organe récolté ; - la teneur en Darutoside de Sigesbeckia orientalis varie selon le mode et le temps de séchage ; - la teneur en Darutoside de Sigesbeckia orientalis varie selon les périodes de récolte ; - la teneur en Darutoside de Sigesbeckia orientalis varie selon les caractéristiques d’habitats (sol, proximité d’un cours d’eau et d’un village). Dans cette étude nous allons aborder dans la première partie, le milieu d’étude. Notre deuxième partie mentionne les matériels et méthodes, suivi des résultats et interprétations dans la troisième partie. Finalement, la quatrième partie comprend la discussion.

I. MILIEU D’ETUDE

Milieu d’étude

I.1 Situation géographique Cette étude a été faite dans la partie centro-orientale de Madagascar, dans la commune rurale de Sabotsy-Anjiro se trouvant dans la région Alaotra Mangoro, dans le District de Moramanga. Ce site se situe à 36Km de Moramanga et à 78Km d’Antananarivo sur la route nationale RN2. Pendant la troisième république (1992-2001), la commune rurale de Sabotsy- Anjiro a été fractionnée en six communes rurales, telles qu’Antanandava, Vodirina, Anosibe Ifody, Belavabary, Ambohidronono et Sabotsy-Anjiro (T.M.D., 2008). Ces quatre dernières communes ont été choisies pour la réalisation de cette étude (Carte 1).

I.2 Milieu abiotique Dans le domaine climatique, la partie Est de Madagascar est de type climatique perhumide tempéré, avec une assez forte érosivité. Elle est annuellement menacée par des cyclones tropicaux générateurs de fortes pluies (HUMBERT ET COURS- DARNE, 1965).

Les données climatiques sont fournies par le service météorologique d’Ampandrianomby, relevées entre 1961-1990, concernant la caractérisation climatique de la ville de Moramanga. (Annexe I)

La pluviométrie annuelle est de 1430,6 mm. Le mois le plus arrosé est le mois de Décembre. Le mois le moins pluvieux ou mois éco-sec est le mois de Septembre, comme le montre le diagramme ombrothermique de Gaussen (Figure1).

300 150

250 125

C) 200 100 °

150 75

100 50 Température( précipitation(mm) 50 25

0 0

Précipitation (mm) Température (°C)

Figure 1 : Courbe ombrothermique de Moramanga, d’après la méthode de GAUSSEN

Milieu d’étude (Suite)

Carte 1 : Localisation des sites d’étude dans la région Alaotra Mangoro (Anjiro et ses environ)

Milieu d’étude (Suite)

D’après les données climatiques obtenues, la température minimale est de 15,9°C, enregistrée au mois de juillet et la température maximale est de 22,8°C enregistrée au mois de Février. La température moyenne annuelle est proche de 20°C. (RABENARIVO, 2015)

Dans le domaine pédologique, la partie Est de Madagascar est caractérisée par des sols ferralitiques jaunes sur rouges à très faible érodibilité. Dans le domaine agro-écologique, les sols sont faiblement érodibles et sont protégés par une végétation dense. Toutefois, la mise en culture par les défrichements (tavy) et les labours des sols (culture de gingembre) occasionnent de fortes pertes en terre allant jusqu’à 150t/ha/an (ROOSE & SARRAILH, 1972).

La région Alaotra Mangoro possède le plus grand lac de Madagascar, le lac Alaotra,situé au milieu des Districts d’Ambatondrazaka et d’Amparafaravola. La rivière de Mangoro traverse principalement Moramanga et Anosibe An’Ala du Nord au Sud (RABENARIVO, 2015).

I.3 Milieu biotique

I.3.1 Végétation et flore La région Alaotra Mangoro présente des zones appartenant au domaine de l’Est, avec quelques traits du domaine du centre : forêt humide de moyenne altitude (HUMBERT, 1965). Selon FARAMALALA et RAJERIARISON (1990), cette partie est une zone intermédiaire entre la zone écofloristique de basse altitude (0 à 800m) de la série à Anthostema et à MYRISTICACEAE et la zone écofloristique de moyenne altitude (800 à 1800m) de la série à Weinmannia et à Tambourissa. Dans la région, Prunus africana (Kotofihy) est un exemple d’espèce de plante emblématique (Planche photographique 1), qui se trouve dans la partie Nord-Est d’Alaotra Mangoro. Particulièrement, le Parc National de Mantadia de la Région présente des Orchidées endémiques, de Palmier comme le Dypsis sp. et le Ravenea sp., de Pandanus sp., qui est une espèce endémique de Madagascar utilisée localement pour la construction des cases, des grands arbres utilisés pour la construction des meubles telles que le Dalbergia sp., Tambourissa sp. et Weinmannia sp. (www.parcs-madagascar.com, 2016).

I.3.2 Faune Parmi les espèces animales emblématiques de la Région d’Alaotra Mangoro, il existe quatre espèces de faunes telles que : Calumma tarzan (Tanamaitsokely) dans la zone forestière d’Anosibe An’ala, Mantella auriantiaca (Sahona mena) autour du fleuve Mangoro et Marais Torotorofotsy, Rhoedes alaotrensis (Katrana) dans le lac Alaotra, Hapalemur alaotrensis

Milieu d’étude (Suite)

(Bandro) de la Zone humide de Lac Alaotra (C.R.C.A., 2010). Les Photos de ces espèces sont représentées dans la planche photographique 1.

Planche photographique 1 : Exemples d’espèces emblématiques de faunes et de flore d’Alaotra Mangoro

Calumma tarzan Mantella auriantiaca

Milieu d’étude (Suite)

I.3.3 Population et ses activités En 2008, la population de la commune rurale de Sabotsy-Anjiro comptent 17 193 habitants dont 48% (8 253 habitants) sont des hommes et 52% (8 940 habitants) sont des femmes. D’après les statistiques, 75% constituent les locaux composés des Bezanozano, tandis que les migrants représentent plus de 25% de population dont les principaux sont les Merina 1 424, Betsimisaraka 1 054, Sihanaka 753, Betsileo 662, Antaimoro 489. (TMD, 2008). La principale activité des habitants autochtones est la riziculture. La culture vivrière de manioc et de bananier, ainsi que l’élevage de bovin figurent parmi les activités secondaires. Le charbonnage et le travail à la journée ne sont que temporaires. Par contre, les migrants occupent principalement des activités de commerce, de fonctionnariat, d’exploitation forestière et de décortication de riz. En outre, ils pratiquent la riziculture et l’élevage de porcs, avec comme activités temporaires, le charbonnage et le maraîchage.

Par ailleurs, la récolte de plantes médicinales comme Centella asiatica, Aphloia theaformis, Sigesbeckia orientalis et d’autres plantes médicinales et aromatiques, fait partie de l’activité supplémentaire pour la majorité de la population d’Anjiro, depuis la fin du 19ème Siècle.

II. MATERIELS ET METHODES

Matériels et méthodes

II.1 Matériels biologiques

II.1.1 Description de Sigesbeckia orientalis L. Cette espèce appartient à la famille des ASTERACEAE ou COMPOSITAE comprenant 1 528 genres et 22 750 espèces. Cette famille comporte des arbres, des arbustes, des lianes et des herbacées (ALLORGE, 2008). Sigesbeckia orientalis est une espèce rudérale annuelle, herbacée, érigée, de 40 à plus de 100cm de hauteur. Les feuilles sont simples, opposées, dentelées. Le limbe est velu avec des © Yves Rocher. 2014 nervures pourpres (Photo 1). Les fruits sont des Photo 1 : Rameau fleuri© Yves de SigesbeckiaRocher. orientalis2014 akènes minces et rugueux. La reproduction se fait par graines uniquement (graines thérophytes). Les fleurs sont jaunes regroupées en inflorescences (groupes de 3 capitules) soutenues par des feuilles poilues et collantes (Photo 2). La tige est rougeâtre munie d’une racine pivotante. Cette espèce est un adventice qui fréquente des cultures, sur sols relativement riches. (HUSSON & al., 2010).

Classification botanique selon APG III:

CLASSE: EQUISETOPSIDA (C. Agardh)

SUBCLASSE: MAGNOLIIDAE (Novák ex Takht)

SUPER ORDRE: ASTERANAE (Takht)

ORDRE: ASTERALES (Link)

FAMILLE : ASTERACEAE (Bercht. & J. Presl) © Yves Rocher. 2014

GENRE : Sigesbeckia L. Photo 2 : Fleurs groupées en inflorescence de Sigesbeckia orientalis ESPECE : Sigesbeckia orientalis L.

SYNONYME : S. glutinosa

Matériels et méthodes (Suite)

NOMS MALGACHES : Satrikoazamaratra, Tsivadihana, Malemivolo

NOMS FRANÇAIS : Guérit-vite, Herbe divine, Kol-kol

DISTRIBUTION DE L’ESPECE: Plante originaire des Indes, répandue de l’Asie du Sud- Est jusqu'en Australie et en Polynésie, ainsi que sur les îles de la Réunion, Maurice et Madagascar (www.tropicos.org, 2016). UTILISATION LOCALE DE LA PLANTE : Plante cicatrisante appliquée directement sur la plaie après broyage ou mâchage.

II.1.2 Composants hétérosidiques de Sigesbeckia orientalis Lors de la photosynthèse des plantes, les premiers corps produits sont des Glucides (hydrate de carbone ou carbohydrate) de formule générale C n(H20) n, qui représente le groupe le plus important des éléments plastiques et énergétiques des végétaux et de leurs substances de réserve. Ces glucides sont divisés en OSES (sucres simples) et en OSIDES (sucres réducteurs). Les holosides sont formés uniquement par des oses, les hétérosides sont composés d’un ou de plusieurs oses et d’une substance non glucidique appelée « génine » ou « aglycone » (PARIS & MOYSE, 1965).

Plus précisément, les hétérosides résultent de la combinaison, avec élimination d’une molécule d’eau, du groupe réducteur d’un ose avec la substance non glucidique nommée aglycone ou génine. Ce sont des composés très répandus chez les végétaux et qui constituent les principes actifs de beaucoup de plantes médicinales, d’où leur importance en matière médicale (PARIS & MOYSE, 1965).

Les principaux constituants des parties aériennes du Sigesbeckia orientalis extractibles par des solvants sont des métabolites secondaires appartenant à la classe des Terpénoïdes dont le principal représentant est le Darutoside (diterpène glycoside) (Figure 2). Il est isolé au début du 19ème Siècle et il contribue aux propriétés cicatrisantes de la plante. Grâce à ce Darutoside, les feuilles de Sigesbeckia orientalis renferment une importante gomme-résine qui est notamment employée dans le traitement des dermatoses et des brûlures (www.goodguide.com, 2016).

L’alpha hédérine (α-H) (Figure 3) est utilisé comme marqueur et standard de référence pour repérer le Darutoside (principe actif de Sigesbeckia orientalis). La ligne de migration du Darutoside se trouve très proche de celle du standard (α-H). Autrement dit, les Rf (Right flow

Matériels et méthodes (Suite) indique la migration distance qui est la division entre la hauteur du pic et le front du solvant) du Darutoside et du standard α-H sont presque identiques (LAVENIR & FAUGERA, 1965).

Figure 2 : Structure chimique du Darutoside Figure 3 : Structure chimique de l’Alpha Hédérine

L’α-H est une saponine triterpénique (PARIS & MOYSE, 1981). Elle est isolée de la feuille du Hedera helix (STECHER & al., 1968).

II.2 Méthodes

II.2.1 Etudes préliminaires

II.2.1.1 Etude bibliographique L’étude bibliographique permet d’avoir des informations préliminaires sur l’espèce Sigesbeckia orientalis, comme la description botanique de l’espèce, sa préférence écologique et sa classification. Elle a permis aussi de faire le choix du site d’étude. Des renseignements nécessaires pour l’étude chimique ont été rassemblés aussi lors de cette étude bibliographique.

II.2.1.2 Prospection du site d’étude Pour le choix de la méthode adéquate et pour la collection des matériaux nécessaires sur terrain, une prospection du site est indispensable.

II.2.1.3 Consultation des spécimens d’herbier Les herbiers informent quant à la morphologie de l’espèce Sigesbeckia orientalis, sa classification, ses noms vernaculaires, et les lieux où on peut la rencontrer.

Matériels et méthodes (Suite)

II.2.2 Collecte des données Les données brutes proviennent d’échantillons collectés et analysés selon le cheminement suivant :

- Récolte des échantillons de plantes et de sols dans la commune d’Anjiro et ses environs.

- Analyse des échantillons de plantes conférée au laboratoire phytochimique, de la société SOTRAMEX à Antananarivo qui a adopté le même protocole d’analyse qu’Yves Rocher.

- Analyse pédologique réalisée au laboratoire du FOFIFA Tsimbazaza Antananarivo.

II.2.2.1 Récolte des échantillons de plantes : Afin de répondre aux hypothèses présentées en introduction, il a été nécessaire de cueillir les échantillons de plantes à différentes périodes de l’année, c’est-à-dire au début de la période de pluie (mois de décembre), à la période de fortes précipitations (fin du mois de janvier) et à la fin de la période pluvieuse (mois de mars). De préférence, les échantillons de feuilles, plantes entières, et graines, ont été récoltés; la disponibilité des organes lors de la période de récolte détermine ce choix.

La cueillette des plantes a été faite dans les Communes suivantes : Ambohidronono, Anosibe Ifody, Belavabary, Sabotsy Anjiro et Vodirina.

Conditions de sélection des échantillons soumis à l’analyse : des plantes saines (dépourvues de champignons ou moisissures), de couleur verte (les bourgeons foliaires et vieilles feuilles ne sont pas cueillis) (Photo 3).

NANTENAINA. 2015 Photo 3 : Sigesbeckia orientalis choisie pour la collecte 11

Matériels et méthodes (Suite)

II.2.2.2 Séchage des échantillons de plantes collectés Les échantillons collectés ont été séchés de trois façons différentes :

- Séchage par la technique de la lyophilisation : technique de séchage qui consiste à éliminer l’eau d’un produit par congélation rapide suivi d’une sublimation de la glace formée, jusqu’à complète dessiccation (www.larousse.fr, 2015). L’étude est réalisée à l’aide d’un lyophilisateur. (Photo 4). - Séchage solaire : exposer les échantillons (feuille ou plante entière ou graine de Sigesbeckia orientalis) dans un milieu sec, aéré et ensoleillé. - Séchage à l’ombre : mettre les échantillons à l’abri du soleil mais dans un milieu bien aéré et sec.

Les échantillons de plantes de Sigesbeckia orientalis (feuilles, plantes entières et graines) collectés dans chaque commune ont été subdivisés pour ces trois modes de séchage.

Le codage est fait avec mention de l’origine de l’échantillon aux fins de traçabilités. Exemple : SOR 1510-An F/S: échantillon de Sigesbeckia orientalis de l’année 2015, prélevé à la 10ème semaine, collecté à Anjiro (An), mention du type d’organe : F pour feuille et mode de séchage : S pour solaire.

Tous les échantillons cueillis, correspondant aux différents modes de séchage, ont été stockés dans différents sacs pendant une durée maximum de 3h. Le protocole suivant a été adopté suivant le mode de séchage choisi :

- Les échantillons ayant subis un séchage au soleil ont été étalés sur une bâche dans un endroit ensoleillé et bien aéré jusqu’à contexture craquante. Au coucher du soleil, quand ils ne sont pas encore suffisamment secs, ils ont été ramassés avant d’être étalés une seconde fois le lendemain, et ainsi de suite ;

- Les échantillons ayant subis un séchage à l’ombre ont été étalés, jour et nuit, sur une bâche, dans une chambre bien aérée mais à l’abri du soleil, jusqu’à l’état sec ;

- Les échantillons ayant subis une lyophilisation ont été stockés dans un congélateur jusqu’au moment de la lyophilisation.

Matériels et méthodes (Suite)

Remarques :

- Pour quantifier la siccité, le dessiccateur halogène (Sartorius) a été utilisé.

- Le temps de séchage a été noté pour chaque échantillon.

Plaque chauffante

Réglage de la Plateau support température Réseau électrique

Pompe à vide NANTENAINA. 2015

Photo 4: Appareil lyophilisateur

II.2.2.3 Extraction des échantillons séchés de Sigesbeckia orientalis Afin d’obtenir des extraits secs pour la chromatographie sur couche mince, nous avons suivi le protocole suivant (Figure 4):

1- Mesurer l’humidité de l’échantillon

Le test préalable est manuel : seuls les échantillons qui se craquent après une légère pression manuelle sont considérés comme échantillons secs (Photo 5). La mesure de l’humidité résiduelle d’un échantillon requiert l’utilisation d’un dessiccateur halogène (Sartorius). Seuls ceux qui possèdent un taux d’humidité <10% sont considérés comme sec.

2- Mélanger 10g de plantes sèches broyées et mises en suspension dans 100cc d’Ethanol/eau 40% 3- A l’aide d’une rampe d’extraction, soumettre le mélange à reflux pendant 1h et sur une plaque chauffante avec agitation magnétique, pour l’extraction des échantillons.

Matériels et méthodes (Suite)

4- Filtrer à chaud. 5- Evaporer à sec en utilisant un évaporateur rotatif.

A la fin de l’extraction, l’extrait se présente sous forme d’une cire collante, qu’il convient de décoller des ballons et peser à l’aide d’une balance de précision.

NANTENAINA. 2015

Photo 5: Echantillons de feuilles sèches

Matériels et méthodes (Suite)

TEST D’HUMIDITE

PLANTES SECHES BROYEES+ EtOH 40% Dessicateur halogène Sartorius

A REFLUX (1h)

Rampe d’extraction et chauffage électrique FILTRATION

EVAPORATION A SEC

Rotavapor

Figure 4: Etapes de l’extraction des échantillons secs

II.2.2.4 Chromatographie sur couche mince de l’extrait sec Afin de repérer les différents composants chimiques contenus dans l’espèce Sigesbeckia orientalis, la méthode de chromatographie sur couche mince a été utilisée. Cette dernière permet la séparation des différents constituants d’un mélange, basée sur la différence d’adsorption de différentes molécules sur une phase fixe de silice activée (TLC Silica gel

60F254) lors de l’élution des plaques par une phase mobile (JORK & al., 1990). Plusieurs étapes ont été suivies (Figure 5):

Matériels et méthodes (Suite)

1- Mélanger 0,1g d’extrait sec avec 20cc d’éthanol 50% 2- Usage du DEPOSEUR CAMAG TLC SAMPLER 4

Après paramétrage de l’ordinateur, procéder au dépôt automatique de 10µl de chacun des échantillons de Sigesbeckia orientalis et 10µl du standard alpha Hédérine (α-H) sur la plaque chromatographique en place.

3- Après son retrait de l’appareil, la plaque est séchée à 110°C sur une plaque chauffante régulée, pendant quelques minutes, pour faire évaporer le solvant (éluant). 4- Placer ensuite la plaque dans une cuve d’élution pour balayage progressif ascendant par la phase mobile : cette phase est une phase ternaire de chloroforme/Méthanol/Eau 65 :25 :4 (v/v/v) contenant 65ml de chloroforme, 25ml de Méthanol et 4ml d’eau. 5- Evaporation de la phase ternaire à 110°C sur la plaque régulée. 6- Révéler celle-ci par une solution d’acide sulfurique (5ml d’acide sulfurique concentré qsp 100ml Ethanol 96%). 7- Sécher à 110°C sur une plaque chauffante pour la lecture des spots.

Lecture des résultats issus de la chromatographie sur couche mince :

Le résultat de la CCM est interprétable en lumière visible et sous scanner

- Lecture en lumière visible

La présence du Darutoside de l’espèce Sigesbeckia orientalis peut être appréciée dans chaque échantillon. Les spots des molécules migrées de tous les composés chimiques dans l’espèce sont visibles. Le Rf de migration du Darutoside est très proche de celui de l’alpha-Hédérine (α-H) de référence (le Rf Right flow qui est la migration distance, est le rapport entre la hauteur du pic et le front du solvant). Darutoside et standard α-H sont presque identiques (LAVENIR & FAUGERA, 1965).

- Lecture de la plaque CCM sous scanner : CAMAG TLC scanner 3 (Photo 6)

Afin de quantifier la concentration des composés chimiques contenus dans chaque échantillon, on procède à la lecture des taches visible sur la plaque CCM, en utilisant un scanner. Cet appareil permet la traduction des surfaces et des hauteurs de pics d’absorption en des courbes et Tableaux (catalogue international 2013). Ainsi la quantification de la variation

Matériels et méthodes (Suite) du taux des composants chimiques cibles dans l’échantillon SOR, selon le mode de séchage (solaire, ombre et lyophilisation) est rendue possible.

EXTRAIT SEC + EtOH 50%

DEPOT D’EXTRAIT SUR LA PLAQUE CCM

CAMAG TLC sampler 4

SECHAGE à 110°C

Révélation en phase mobile REVELATION EN PHASE MOBILE

(Chloroforme/MétOH/H2O)

SECHAGE à 110°C Révélation par H2SO4

REVELATION par H2SO4

SECHAGE à 110°C Séchage à 110°C

Figure 5: Etapes de la chromatographie sur couche mince (CCM) des extraits secs

Matériels et méthodes (Suite)

©NANTENAINA. 2015

Photo 6 : CAMAG TLC Scanner 3

II.2.2.5 Analyse pédologique Afin de caractériser l’habitat de l’espèce Sigesbeckia orientalis, il est nécessaire de faire une analyse pédologique. Des échantillons de sol ont été prélevés dans chaque site représentatif des quatre communes d’Anjiro (Ambohidronono, Belavabary, Anosibe Ifody et Sabotsy Anjiro) pour l’analyse pédologique. Les racines de Sigesbeckia orientalis ont une longueur de

10 à 12 cm et se développent dans l’humus situé à ce niveau (A0) où Sigesbeckia orientalis puise ses ressources.

L’analyse pédologique a été faite dans le laboratoire de FOFIFA Tsimbazaza Antananarivo Madagascar. Les étapes suivant ont été suivies (Figure 6) :

Matériels et méthodes (Suite)

Séchage des échantillons de sols

Tamisage des sols séchés

Tamis 0,5mm Tamis 2mm

Figure 6 : Schéma des différentes étapes de l’analyse pédologique

Les échantillons de sols récoltés sur terrain ont été séchés puis broyés. Ils ont été tamisés ensuite à l’aide de deux tamis différents :

-tamis de 0,5mm pour l’analyse d’azote N et de carbone C

-tamis 2mm pour l’analyse granulométrique, pH, phosphore P et base échangeable (potassium K).

II.2.2.6 Autres paramètres relatives aux sites de récoltes En plus des données pédologiques, il existe d’autres paramètres qui peuvent caractériser l’habitat de l’espèce Sigesbeckia orientalis:

- Distance du champ par rapport au cours d’eau

- Distance du champ par rapport au village

Ces paramètres ont été relevés sur terrain et enregistrés, pour connaître s’ils peuvent affecter la qualité du Darutoside.

Matériels et méthodes (Suite)

NB : Ces paramètres ont été relevés seulement sur les sites représentatifs de toute la zone d’étude.

II.2.3 Analyse et traitement statistiques des données collectées

II.2.3.1 Analyse de variance (ANOVA) Pour voir si la quantité d’extrait obtenu varie selon le type d’organe et le mode de séchage, mais surtout pour vérifier si la teneur en Darutoside de Sigesbeckia orientalis varie en relation avec les trois paramètres suivants : types d’organe, mode de séchage et période, les données ont été appréciées dans leur significativité par analyse de variance. Cette méthode statistique est basée sur la comparaison des moyennes de plusieurs échantillons. Le principe de l’ANOVA c’est de comparer la variabilité à l’intérieur de chaque échantillon avec les variabilités entre les échantillons (DYTHAM, 2011). Le paramètre statistique utilisé est la probabilité p qui indique le niveau de différence de variable au niveau de confiance de 95%. Si p<0,05, la différence entre les niveaux de variable est constitué comme statistiquement significative.

II.2.3.2 Analyse en composantes principales (ACP) La dernière hypothèse sur la variation de la teneur en Darutoside de Sigesbeckia orientalis selon son habitat, consiste à analyser plusieurs variables stationnels, c’est pour cette raison que l’analyse en composantes principales ACP a été choisie. Elle est très utile pour l’ordination d’objets décrits par des variables environnementales. Très souvent, ces variables étant mesurées dans des unités différentes, les variables sont réduites et centrées avant l’analyse (LEGENDRE & LEGENDRE, 1998).

Selon la variante de calcul choisie, l’ACP privilégie deux types de représentations. Pour la présente étude, seul le cadrage de type 2 « vecteurs propres normes à α », représenté par le cercle de corrélation a été utilisé (Figure 7). Les angles entre descripteurs dans l’espace factoriel représentent la corrélation entre eux.

Matériels et méthodes (Suite)

Figure 7 : Cercle de corrélation

- Si α=0 (Cos α =1): la corrélation est maximale, donc l’affinité est maximale entre les deux descripteurs - Si 0°<α<90° (Cos α >0): la corrélation est positive, donc il y a une affinité entre ces deux variables - Si 90°<α<180° (Cos α <0): la corrélation est négative, donc il y a une affinité négative entre ces deux variables, c’est-à-dire ces deux variables n’agissent pas à la fois - Si α=90° (Cos α =0): la corrélation est nulle.

III. RESULTATS ET INTERPRETATIONS

Résultats et interprétations

III.1 Echantillons collectés Les échantillons de feuilles des zones de la commune de Sabotsy Anjiro (Ambohidronono, Ambodimanga, Anosibe Ifody, Antatabe, Belavabary, Manankasina et Vodiriana) proviennent de la zone de collecte approvisionnant la structure industrielle de la société Yves Rocher. Le principal organe collecté est la feuille, mais pour connaître la répartition de la molécule de Darutoside dans les différents organes, la plante entière et la graine ont été aussi collectées (Tableau 1).

Tableau 1 : Résultat de la collecte des échantillons

Période de Semaine de Mois de Année de Type d’organes récolte collecte collecte collecte collectés

Maximum de - Feuilles 5 Fin de janvier 2015 pluie - Plantes entières

- Feuilles Fin de pluie 10 Mars 2015 - Plantes entières - Graines

Début de Début de pluie 50 2015 - Feuilles décembre

Durant la période de la fin des pluies, les trois types d’échantillons (feuille, plante entière et graine) ont été disponibles et récoltés pour l’analyse phytochimique. Pour la récolte des échantillons du début des pluies, seules les feuilles ont été collectées afin de voir la variation de la teneur en Darutoside suivant la période et de déterminer la corrélation du taux de Darutoside avec les paramètres stationnelles.

1kg de chaque échantillon frais suffit pour réaliser les analyses en laboratoire, sauf pour les graines (~1/4kg). En fait, 10g d’échantillons secs broyés sont nécessaires à l’extraction et permettent la répétition des analyses.

Résultats et interprétations (Suite)

III.2 Séchages des échantillons collectés et codages Chaque échantillon a été classé selon les localités et codé en conséquence. Les codes utilisés lors de toute l’analyse sont figurées dans le tableau 2. La collecte s’est effectuée lors de la 5ème semaine (janvier), la 10ème semaine (mars) et la 50ème semaine (décembre) de l’année 2015.

Tableau 2: Codes des échantillons de Sigesbeckia orientalis par rapport à la semaine de collecte, du lieu de collecte, de l’organe collecté et du mode de séchage en 2015

Mode de Echantillons Semaine de Lieu de Organe séchage des codés collecte collecte collecté échantillons SOR 1505 An F/Lyo 5ème Anjiro Feuille Lyophilisation SOR 1505 An F/S 5ème Anjiro Feuille Solaire SOR 1505 An F/O 5ème Anjiro Feuille Ombre SOR 1505 An Pe/Lyo 5ème Anjiro Plante entière Lyophilisation SOR 1505 An Pe/S 5ème Anjiro Plante entière Solaire SOR 1505 An Pe/O 5ème Anjiro Plante entière Ombre SOR 1510-Ar F/Lyo 10ème Ambohidronono Feuille Lyophilisation SOR 1510-An F/S 10ème Anjiro Feuille Solaire SOR 1510-Af F/O 10ème Anosibe Ifody Feuille Ombre SOR 1510-Ar Pe/Lyo 10ème Ambohidronono Plante entière Lyophilisation SOR 1510-An Pe/S 10ème Anjiro Plante entière Solaire SOR 1510-Bl Pe/O 10ème Belavabary Plante entière Ombre SOR 1510-An Gr/Lyo 10ème Anjiro Graine Lyophilisation SOR 1510-An Gr/S 10ème Anjiro Graine Solaire SOR 1510-An Gr/O 10ème Anjiro Graine Ombre SOR 1550-Ar F/O 50ème Ambohidronono Feuille Ombre SOR 1550-Ma F/O 50ème Manankasina Feuille Ombre SOR 1550-At F/O 50ème Antatabe Feuille Ombre SOR 1550-An F/O 50ème Anjiro Feuille Ombre SOR 1550-Vd F/O 50ème Vodiriana Feuille Ombre SOR 1550-Af F/O 50ème Anosibe Ifody Feuille Ombre SOR 1550-Am F/O 50ème Ambodimanga Feuille Ombre

Résultats et interprétations (Suite)

La durée de séchage de chaque échantillon est présentée dans le tableau 3. Il est rappelé que lors du début des pluies, les échantillons de feuilles seulement ont été collectés.

Tableau 3 : Temps de séchage de chaque échantillon

Temps de Temps de séchage Temps de séchage à Echantillons lyophilisation au soleil l’ombre collectés (h) (h) (h) SOR 1505 F 6 8 172 SOR 1505 Pe 12 12 172 SOR 1510 F 6 8 172 SOR 1510 Pe 12 12 172 SOR 1510 Gr 14 8 172 SOR 1550 F - - 185

Le séchage des feuilles à l’ombre dure au-moins 172h. Tandis que pour les feuilles séchées solaires et celles traitées par la technique de la lyophilisation, la durée de séchage est respectivement de 6h et 8h.

III.3 Résultat d’extraction Le rendement d’extraction issu de 10g de matière sèche est présenté dans le tableau 4. Seul l’échantillon de feuille est commun pour les trois périodes de récoltes. Ainsi, il est utilisé pour voir la comparaison du rendement d’extraction de chaque échantillon par rapport à la période de récolte. Tableau 4 : Rendement d’extraction de chaque échantillon

Rendement de Rendement de Rendement de Echantillons lyophilisation séchage au soleil séchage à l’ombre collectés (%) (%) (%) SOR 1505 F 5,41 3,40 7,92 SOR 1505 Pe 4,57 3,45 5 SOR 1510 F 6,66 7,02 7,84 SOR 1510 Pe 7,08 6,58 5,23 SOR 1510 Gr 6,61 7,58 6,18 SOR 1550 F - - 9,21

Résultats et interprétations (Suite)

Généralement, ce tableau montre que, les feuilles de Sigesbeckia orientalis présentent un rendement optimal d’extraction (≥ 8%). Tandis que les plantes entières et les graines, n’ont qu’un rendement ≤7%.

Remarque

Lors de la dernière analyse chimique, une amélioration de la méthode d’extraction a été effectuée parallèlement. La masse de l’extrait sec est obtenue en enlevant la tare du ballon utilisé. Donc un deuxième résultat a été obtenu, pour chaque échantillon de feuille récoltée au début des pluies (Tableau 5). Cette amélioration a permis d’avoir une quantité d’extrait plus fiable.

Tableau 5 : Temps de séchage et rendement de l’extraction de l’échantillon de feuille récoltée au début de la période pluvieuse (SOR 1550), séché à l’ombre. (2ème résultat)

Temps de séchage Rendement d’extraction Echantillon (h) (%) SOR 1550 F/O 185 11,702

En considérant seulement les feuilles séchées à l’ombre, récoltées au début de pluie :

La moyenne du rendement d’extraction est de 11,702% = 0,11702g d’extrait sec, qui est obtenu à partir de 10g de matière sèche.

Une correspondance des valeurs a été établie dans le tableau 6.

Tableau 6 : Tableau de correspondance :

Feuille fraîche Feuille sèche Extrait sec

100g 10g 1,1702g

1Kg=1000g 100g 11,702g

1T=1000Kg 100 000g 11702g=11,702Kg

Un rendement faible a été observé :

Une Tonne de feuille fraîche contient 11,7Kg d’extrait sec (Rendement~1,1% par rapport à la matière fraiche). Ceci peut être dû au rendement d’extraction qui dépend du solvant utilisé.

Résultats et interprétations (Suite)

III.4 Analyse chromatographique sur couche mince

III.4.1 Lecture visible Les extraits obtenus ont subi, par la suite, la chromatographie sur couche mince (CCM). Trois plaques chromatographiques ont été utilisées et les spots sont représentées dans les Photos 7, 8, 9.

St Fs Fl Fo St Ps Pl Po St Fs Ps St Fo Po St Fl Pl St: standard (alpha Hédérine) ; Fs: échantillon de feuille séchée solaire ; Fl: échantillon de feuille séchée par lyophilisation ; Fo: échantillon de feuille séchée à l’ombre ; Ps: échantillon de plante entière séchée solaire ; Pl: échantillon de plante entière séchée par lyophilisation ; Po: échantillon de plante entière séchée à l’ombre.

Photo 7 : Plaque CCM montrant le résultat de la migration des composés chimiques dans chaque échantillon SOR-1505

Fl: échantillon de feuille séchée par lyophilisation ; Fs: échantillon de feuille séchée solaire ; Fo: échantillon de feuille séchée à l’ombre ; Pl: échantillon de plante entière séchée par lyophilisation ; Ps: échantillon de plante entière séchée solaire ; Po: échantillon de plante entière séchée à l’ombre ; Gl: échantillon de graine séchée par lyophilisation ; Gs: échantillon de graine séchée solaire ; Go: échantillon de graine séchée à l’ombre; St: standard (alpha Hédérine). Photo 8 : Plaque CCM montrant le résultat de la migration des composés chimiques

dans chaque échantillon SOR-1510 26

Résultats et interprétations (Suite)

St Vd Mn Ar Am At An Af St Vd Mn Ar Am At An Af St

St: standard (alpha Hédérine) ; Vd : échantillon de feuille collectée à Vodiriana ; Mn : échantillon de feuille collectée à Manankasina ; Ar : échantillon de feuille collectée à Ambohidronono ; Am : échantillon de feuille collectée à Ambodimanga ; At : échantillon de feuille collectée à Antatabe ; An : échantillon de feuille collectée à Anjiro ; Af : échantillon de feuille collectée à Anosibe Ifody.

Photo 9 : Plaque CCM montrant le résultat de la migration des composés chimiques dans chaque échantillon SOR-1550 feuille séchée à l’ombre

Sur chaque plaque chromatographique, chacune des taches représente un composé chimique. En se référant au standard α-H ou st (le spot apparait le plus sombre dans la plaque), la ligne de migration du composé Darutoside (principe actif dans Sigesbeckia orientalis) se trouve très proche de celui-ci. Pour les trois plaques, les spots (ou taches) de Darutoside apparaissent très sombres pour les échantillons feuilles. Tandis qu’ils apparaissent plus clairs dans les échantillons graines du deuxième plaque (Photo 8). Les échantillons de plantes entières forment des taches de couleur intermédiaires dans la première et deuxième plaque (Photos 7 et 8). Ce qui signifie que, le composé Darutoside se trouve abondamment dans les feuilles (taches intenses), tandis que les plantes entières sont moins riches, et les spots sont peu denses au niveau de la graine.

III.4.2 Lecture sous scanner A l’aide de l’appareil TLC sampler, des « tracks of wavelength » sont obtenus et enregistrés dans l’ordinateur à partir des plaques chromatographiques. Dans ces « tracks », chaque spot (ou tache) se traduit par un pic. Ce dernier correspond à la teneur de chaque composé dans chaque échantillon. Chaque pic est évalué par son aire (Area) et par la hauteur correspondante. Ces « tracks of wavelenght » (tracks de longueur d’onde) obtenus sont présentés en Annexe II. C’est à partir de ces « tracks » que les données concernant l’Area du Darutoside dans l’ACP, sont calculées. 27

Résultats et interprétations (Suite)

III.5 Résultats de l’analyse pédologique Les Tableaux 7 et 8 présentent respectivement les résultats et l’interprétation de l’analyse pédologique réalisée dans le laboratoire pédologique du FOFIFA Tsimbazaza.

Tableau 7 : Résultats de l'étude pédologique

P K C N Arg Lim Sab Site d’étude pH C/N (BrayII) (méq % % % % % ppm /100g) Anosibe Ifody 5,48 2,17 0,154 14,1 83,9 0,44 12 6 82 Ambohidronono 5,16 3,34 0,21 15,9 12,9 0,82 14 10 76 Ambohitsitompo 4,41 0,68 0,056 12,1 0,1 0,09 16 10 74 Manankasina 4,16 3 0,203 14,8 19,1 0,31 22 10 68 Vodiriana 5,35 2,63 0,21 12,5 51,8 1,28 13 12 75 Anjiro 5,22 1,73 0,14 12,4 15,4 0,59 19 24 57 Antatabe 5,44 3,88 0,287 13,5 58,4 0,49 11 10 79 C : Carbone ; N : Azote ; P : Phosphore ; K : Potassium ; Arg : Argile ; Lim : Limon ; Sab : Sable

Tableau 8 : Interprétations du résultat de l'étude pédologique

Site d’étude pH C N C/N P K Granulométrie fortement très limon très Anosibe Ifody Riche Riche Satisfaisant riche acide riche sableux fortement très très limon très Ambohidronono Riche Satisfaisant riche acide riche riche sableux fortement limon très Ambohitsitompo Moyen Moyen Satisfaisant pauvre moyen acide sableux fortement très très limon très Manankasina Satisfaisant riche riche acide riche riche sableux fortement très très limon très Vodiriana Riche Riche Satisfaisant acide riche riche sableux fortement limon très Anjiro Moyen Moyen Satisfaisant riche riche acide sableux fortement très très très limon très Antatabe Satisfaisant riche acide riche riche riche sableux C : Carbone ; N : Azote ; P : Phosphore ; K : Potassium

Résultats et interprétations (Suite)

III.6 Résultats de relevé des autres paramètres Les autres paramètres déterminant l’habitat de Sigesbeckia orientalis sont présentés dans le Tableau 9.

Dans ce dernier, le champ de culture, où Sigesbeckia orientalis s’installe, se trouve à 1-2m des cours d’eau dans les zones d’Ambohidronono, Ambohitsitompo, Anjiro et Vodiriana ; les autres se trouvent loin. Par ailleurs, les villages sont à moins de 5 m du champ, dans toutes les zones d’études. C’est-à-dire qu’il y a une forte probabilité, pour que les villageois fréquentent souvent ces champs.

La contribution de ces différents paramètres tels que, caractéristiques pédologiques, proximité d’un cours d’eau et proximité d’un village, à la variation du taux de Darutoside, sont prises en compte dans l’Analyse en Composantes Principales (ACP).

Tableau 9 : Distances du champ par rapport au cours d'eau et village

Site d’étude DC (m) DV (m) Anosibe Ifody 500 5 Ambohidronono 2 4 Ambohitsitompo 2 1 Manankasina 10 4 Vodiriana 1 3 Anjiro 1 5 Antatabe 500 1 DC (m) : Distance par rapport au cours d’eau ; DV (m) : Distance par rapport au village

III.7 Détermination des conditions favorables pour une meilleure teneur en Darutoside Afin de répondre avec sureté aux différentes hypothèses évoquées dans l’introduction, un complément statistique des données par analyse de variance (ANOVA) et analyse en composante principale (ACP) a été effectué.

III.7.1 Variation de la teneur en Darutoside selon le type d’organe et le mode de séchage A partir des données présentées dans les tracks (Annexe II), les histogrammes dans la Figure 8 sont obtenus. Chaque histogramme exprime la moyenne de l’aire de chaque pic, représentant la quantité du Darutoside mesurée dans Sigesbeckia orientalis, suivant les paramètres modes de séchage et types d’organes.

Résultats et interprétations (Suite)

3000

2500

2000

1500 AREA

1000

500

0 AMBR FL ANJ FS ANF FO AMBR PL ANJ PS BEL PO ANJ GL ANJ GS ANJ GO SOR 1510

AMBR FL : feuilles séchées par lyophilisation, récoltées à Ambohidronono ; ANJ FS : feuilles séchées solaires, récoltées à Anjiro ; ANF FO : feuilles séchées à l’ombre, récoltées à Anosibe Ifody ; AMBR PL : plantes entières séchées par lyophilisation, récoltées à Ambohidronono ; ANJ PS : plantes entières séchées solaires, récoltées à Anjiro ; BEL FO : plantes entières séchées à l’ombre, récoltées à Belavabary ; ANJ GL : graines séchées par lyophilisation, récoltées à Anjiro ; ANJ GS : graines séchées solaires, récoltées à Anjiro ; ANJ GO : graines séchées à l’ombre, récoltées à Anjiro.

Figure 8 : Histogramme de la variation de la teneur en Darutoside selon le type d’organe et le mode de séchage

Après analyse statistique, chaque échantillon de feuille de Sigesbeckia orientalis présente une différence significative au seuil de 95%, en relation avec le mode de séchage utilisé et le type d’organe choisi.

Par rapport au type d’organe choisi, le graphique montre que, ce sont les échantillons de feuilles quels que soient leurs modes de séchages, qui contiennent la quantité abondante de Darutoside dans Sigesbeckia orientalis. Les graines n’en contiennent que très peu, et la plante entière une concentration intermédiaire. Le temps de transport des organes à l’état frais depuis le lieu de collecte jusqu’au laboratoire peut expliquer la perte de Darutoside malgré les précautions de conservation prises entre temps.

Ainsi, en considérant seulement les échantillons de feuilles, le mode de séchage à l’ombre semble préserver dans les meilleures conditions, la concentration en Darutoside.

Résultats et interprétations (Suite)

L’exposition solaire semble être responsable d’une dégradation du Darutoside et en conséquence, un séchage à l’ombre des feuilles semble indispensable pour la préservation du principe actif.

III.7.2 Variation de la teneur en Darutoside selon les périodes de récolte La meilleure période de récolte est évaluée à partir de la teneur en molécules d’intérêt (Darutoside) en tenant compte de la saison de collecte (Figure 9).

3000

2500

2000

1500 AREA 1000 500 0 Début pl Forte pl Fin pl PERIODES DE RECOLTE

pl : pluie Figure 9 : Histogrammes montrant la variation de la teneur en Darutoside selon les périodes de récolte.

En choisissant seulement les feuilles séchées à l’ombre, ces histogrammes présentent la quantité en Darutoside de Sigesbeckia orientalis récoltée à trois différentes périodes, telles que la période de début de pluie, la période de pluie abondante ou forte pluie et la période fin de pluie. Il est montré que les feuilles récoltées pendant la période de fin des pluies présentent la plus haute teneur en Darutoside par rapport aux deux autres périodes.

III.7.3 Variation de la teneur en Darutoside selon les caractéristiques de l’habitat L’analyse en composante principale permet de connaître la corrélation entre la teneur en Darutoside avec les caractéristiques de l’habitat tels que le pH du sol, la teneur en matière minérale (Azote N, Phosphore P et Potassium K) et en matière organique (Carbone C), le rapport C/N, la teneur en argile, limon et sable du sol, la distance par rapport au village du champs de culture (DVm) et la distance par rapport au cours d’eau (DCm). La Figure montre le cercle de corrélation entre ces variables.

Résultats et interprétations (Suite)

Figure 10 : Corrélation entre les variables

La teneur en Darutoside dans Sigesbeckia orientalis est représentée par son « Area » dans le cercle de corrélation de l’ACP. Ce cercle permet de déterminer la corrélation de l’ « Area » avec les autres variables tels que pH, teneur en matière organique (carbone C), teneur en matières minérales (azote N, phosphore P, potassium K), rapport C/N, teneur en Argile, Limon, Sable dans le sol, ainsi la distance par rapport au village (DVm) et la distance par rapport au cours d’eau (DCm) du champ où Sigesbeckia orientalis s’installe.

La teneur en Darutoside dans la feuille de Sigesbeckia orientalis a une:

- corrélation positive avec la teneur en P, le pH, la teneur en C, N, la proximité du champ d’un cours d’eau, la teneur en K et la teneur en sable dans le sol. Plus le sol est acide, riche en matières minérales et en matière organique, plus sabloneux et localisé près d’un cours d’eau, plus la teneur en Darutoside dans la feuille de Sigesbeckia orientalis augmente.

Résultats et interprétations (Suite)

- corrélation négative avec la teneur en limon et en argile. Il y a donc une affinité négative entre ces variables. Une quantité faible de limon et d’argile dans le sol facilite la production en Darutoside dans la feuille de Sigesbeckia orientalis.

- corrélation nulle avec la proximité du champ d’un village.

Il est à noter qu’il y a une corrélation positive entre la teneur en Darutoside de Sigesbeckia orientalis dans les feuilles, à condition que:

- le sol soit très acide, riche en éléments nutritifs N, P, K, rapport C/N satisfaisant

- l’habitat se trouve près d’un cours d’eau assurant une alimentation en eau suffisante

- la texture du sol soit constituée de limon très sableux favorisant l’aération, la rétention d’eau et la présence de substances nutritives.

IV. DISCUSSIONS

Discussions

D’après les résultats obtenus, quelques points méritent d’être discutés.

 Variation de la teneur en Darutoside dans Sigesbeckia orientalis selon le type d’organe La teneur en Darutoside varie en fonction du type d’organe. Le principe actif se trouve abondant dans les feuilles et plus faible dans les graines. Ce résultat est cohérent avec l’étude de BARUAH et al. (1979), qui a mentionné la présence du Darutoside (Glucoside diterpénique) dans la partie aérienne de Sigesbeckia orientalis. En outre, PARIS et MOYSE (1965), ont indiqué que dans certaines espèces la teneur en hétéroside diminue au niveau de la graine ou de la gousse, comme le cas du Rutoside de l’espèce Sophora japonica. Le même cas a été rencontré sur le Darutoside de Sigesbeckia orientalis. Ce phénomène pourrait s’expliquer par la production élevée de glucides, principalement dans la feuille lors de la Photosynthèse et l’utilisation métabolique différenciée de leurs dérivés saponosidiques.  Variation de la teneur en Darutoside de Sigesbeckia orientalis selon le mode et le temps de séchage

La teneur en Darutoside varie en fonction du temps et du mode de séchage de l’échantillon au cours de l’extraction. Les échantillons séchés à l’ombre présentent la teneur la plus élevée en Darutoside. Il semble par conséquent, que l’exposition solaire par sa composante en UV, pourrait avoir une incidence négative relativement à la présence de Darutoside en tant que marqueur et principe actif. En considérant le séchage des feuilles, bien que le temps d’obtention de biomasse sèche soit plus long (plus de 172h), la préservation des principes actifs semble mieux assurée comme en atteste la feuille lyophylisée. Ce temps plus long de séchage peut permettre aux réactions enzymatiques de dégradation d’agir à l’intérieur des organes, mais ce processus est moins destructif que l’exposition solaire. En effet, le mode de séchage solaire, malgré un temps plus court de séchage (seulement de 8h), semble destructeur de l’actif. Mais ce n’est pas le cas pour les autres espèces comme Centella asiatica. Les UV solaires n’ont aucune incidence sur la structure triterpénique de ses principes actifs. D’ailleurs, un séchage à l’ombre favorise la dégradation de ces derniers (SOTRAMEX, 2015).

Discussions (Suite)

 Variation de la teneur en Darutoside de Sigesbeckia orientalis selon la période de pluie Classiquement, la teneur en Darutoside varie en fonction de la saison. Elle est faible en période de forte pluie et élevée à la fin de la saison pluvieuse. Cette variation est observée chez d’autres plantes à terpènes proches du Darutoside (famille des Terpènes). Chez Sigesbeckia orientalis, la teneur en Darutoside, qui est considéré comme substance secondaire, est fonction du cycle biologique de la plante lié aux facteurs extrinsèques, d’où sa faible quantité. Ainsi, le Darutoside semble optimal dans la feuille de Sigesbeckia orientalis vers la fin du mois de mars (période de fin de pluie), alors c’est la meilleure période de récolte de cette plante médicinale. Ce résultat complète l’étude de HAINGOTIANA (2013), qui a établi un calendrier de récolte de Sigesbeckia orientalis, en janvier, février, mars, octobre, novembre et décembre, basé seulement sur l’abondance de cette espèce.

 Variation de la teneur en Darutoside de Sigesbeckia orientalis selon les caractéristiques d’habitats Les facteurs extrinsèques sont très importants tels que la richesse en matières organiques (Carbone C), en matières minérales (Azote N, Phosphore P, Potassium K), l’acidité du sol et la proximité du champ d’un cours d’eau. Ces facteurs contribuent à augmenter la teneur en Darutoside dans la feuille de Sigesbeckia orientalis. La fertilité du sol est donc assurée et favorise le bon développement de l’espèce. ROCHE et ses équipes (1980) apportent une explication sur ce fait. Ils ont mentionné que l’Azote, le Potassium avec d’autres éléments mais en particulier le Phosphore sont des éléments indispensables à la croissance des cultures. En plus, l’eau joue un rôle très important dans la conduction des sèves, d’abord en véhiculant les éléments de la racine jusqu’au niveau de la feuille, puis en élaborant les éléments et les actifs de la feuille vers les autres organes. A cet égard, BENEZECH (1962) a indiqué que l’eau est l’agent d’un très grand nombre de dislocations moléculaires correspondant à la fixation des ions H+ et OH- sur les deux fragments de la molécule disloqué. Ainsi, une teneur élevée en Sable de la texture du sol favorise une aération pour la survie de l’espèce et un bon écoulement des eaux, tandis que la teneur assez faible en limon et argile a un impact sur la rétention en eau et en substances nutritives (C.T.A., 1989).

CONCLUSION

Conclusion

En guise de conclusion, Sigesbeckia orientalis, espèce annuelle de la famille des ASTERACEAE naturalisée à Madagascar est familière des sols riches en humus. Elle est disponible durant toute la saison de pluie. Sa collecte a été faite pendant les trois périodes : début des pluies (en décembre), pleine saison pluvieuse (en janvier, février) et la fin des pluies (depuis le fin mars). La teneur en Darutoside de cette espèce varie selon ces périodes. Nous avons déduit que la période de fin de pluie (mois de mars) était la plus favorable pour avoir une meilleure teneur en Darutoside. En effet, l’hypothèse qui mentionne la variation de la teneur en Darutoside de Sigesbeckia orientalis selon la période climatique est vérifiée. En tenant compte de sa phénologie à la période de pluie maximale (mois de janvier), nous avons procédé à la collecte des différents organes, tels que la feuille, la plante entière et la graine : pour une étude comparative. Le Darutoside se concentre essentiellement dans les feuilles, tandis que les graines en possèdent en une quantité faible ; donc l’hypothèse sur la variation de la teneur en Darutoside de Sigesbeckia orientalis selon le type d’organe est valide. Sachant que, le séchage est l’une des étapes clés de la conservation des actifs à extraire, les conditions de traitement des organes prélevés ont été différenciées. Que ce soient feuilles, ou plantes entières, ou graines, le mode de séchage à l’ombre préserve la teneur en Darutoside. Par contre le séchage solaire, malgré sa durée nécessairement courte, est un facteur négatif destructeur de Darutoside ; l’hypothèse sur la variation du Darutoside de Sigesbeckia orientalis selon le mode et le temps de séchage est aussi confirmée. En outre, l’extraction de feuilles de Sigesbeckia orientalis séchées à l’ombre donne une quantité d’extrait d’environ douze kilos à partir d’une tonne de feuilles fraîches. L’analyse pédologique a montré que la richesse en matière organique (carbone C), la richesse en matière minérale (azote N) dans le sol, la quantité satisfaisante en phosphore et potassium, la texture limon très sableux du sol, le pH plus acide, mais surtout la proximité d’un cours d’eau du champ, favorisent l’augmentation de la teneur en Darutoside au niveau de la feuille de Sigesbeckia orientalis. La dernière hypothèse sur la variation du Darutoside de Sigesbeckia orientalis selon les caractéristiques d’habitats est ainsi vérifiée.

Le rendement optimum en Darutoside des feuilles de Sigesbeckia orientalis est obtenu par un séchage à l’ombre, récoltées vers la période de fin des pluies (à partir du mois de mars), dans un habitat ayant un sol humide, un champ bien riche en humus et fertile. Il est à remarquer que cette étude s’est effectuée seulement sur une année. Les métabolites secondaires tel le Darutoside exercent un rôle majeur dans l’adaptation des végétaux à leur

Conclusion (Suite) environnement, en assurant des fonctions clés dans la résistance aux contraintes biotiques (phytopathogènes, herbivores, etc.) et abiotiques (UV, température, etc.

Nos recommandations seraient de réaliser un suivi annuel et des études complémentaires relatives aux autres conditions écologiques, comme l’étude de la flore associée, l’étude de la relation plante-animal, l’étude sur le stress que la plante peut subir, afin d’optimiser la production de Darutoside par l’espèce Sigesbeckia orientalis.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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ANNEXES

Annexes

Annexe I : Tableau des données climatiques de Moramanga (1961-1990)

Moyenne Mois Jan Fév Mars Avr Mai Juin Juil Août Sep Oct Nov Déc annuelle

Précipitation 253 227,2 173,4 68,2 44,4 68,4 58 50,2 28 60,9 144 255 1 430,6 (mm)

Nombre de jours de pluie 19,7 17,9 21,2 15,1 16,2 16,9 18,8 19 12,8 12,8 15,2 19 185,6 (jours)

Température 22,5 22,8 22 21 19 16,8 15,9 6,1 17,5 19,7 21,3 22,2 19,73 (°C)

Source : Direction de la Météorologie d’Ampandrianomby, 2008

Annexes (suite)

Annexe II : Tracks at Wavelength:

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III

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VII

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VIII

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XII

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XIII

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XIV

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XVI

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XVII

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XVIII

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO FACULTE DES SCIENCES DOMAINE DES SCIENCES ET TECHNOLOGIE MENTION: BIOLOGIE ET ECOLOGIE VEGETALES Parcours : Diagnostique, Suivi Ecologique et Aménagement des Ecosystèmes et de l’Environnement (DIASE) Titre : Influence des facteurs éco-biologiques et des traitements des échantillons de Sigesbeckia orientalis L. sur la production de Darutoside dans la Région Alaotra Mangoro (cas d’Anjiro et ses environs)

Auteur : Rindra Harilanto NANTENAINA

Résumé :

Sigesbeckia orientalis (ASTERACEAE) est une plante médicinale, connue par ses propriétés cicatrisantes. Grâce à l’un de ses principes actifs qui est également un marqueur, le « Darutoside », cette espèce est recherchée par les industries cosmétiques. Cette étude a pour but de déterminer les facteurs éco-biologiques et les conditions de séchage favorables à une meilleure production en Darutoside chez l’espèce Sigesbeckia orientalis. Au cours de la période des pluies, la collecte des échantillons de Sigesbeckia orientalis a été effectuée dans les communes d’Anjiro et de ses environs, où des feuilles, des plantes entières et des graines ont été récoltées. Ces échantillons ont été séchés de trois façons différentes : séchage par la technique de lyophilisation, séchage au soleil et séchage à l’ombre. Lors de l’extraction, douze kilos d’extraits sont obtenus à partir d’une tonne de feuilles fraîches. La chromatographie sur couche mince des extraits montre que les feuilles séchées à l’ombre, récoltées à la fin de la période des pluies, possèdent la teneur la plus élevée en Darutoside. Après analyse pédologique, cette dernière est favorisée par un sol fortement acide, à texture limoneuse très sableuse, riche en Carbone, Azote, Potassium et surtout en Phosphore, mais aussi la proximité de cours d’eau. Cependant, un suivi périodique, une étude de la flore associée et une étude de la relation plante-animale, restent des travaux à approfondir pour une meilleure connaissance de la production de Darutoside chez Sigesbeckia orientalis.

Mots clés : Sigesbeckia orientalis, Darutoside, modes de séchages, période des pluies, type d’organe de plante.

Encadreur: Docteur Edmond ROGER

UNIVERSITY OF ANTANANARIVO FACULTY OF SCIENCES MAJOR FIELD: SCIENCES AND TECHNOLOGY MENTION: PLANT BIOLOGY AND ECOLOGY Option: Diagnose, Ecological Survey and Management of Ecosystems and Environment (DIASE)

Title: Influence of eco-biological factors and treatments of Sigesbeckia orientalis L. samples on Darutoside production in the Region Alaotra Mangoro (case of Anjiro and its surroundings) Author: Rindra Harilanto NANTENAINA

Abstract:

Sigesbeckia orientalis (ASTERACEAE) is a medicinal plant, known for its wound healing property. Because of "Darutoside" (a marker), this species is highly demanded in cosmetic industries. The purpose of this study is to determine the favorable eco-biological factors and drying conditions for a better production of Darutoside in Sigesbeckia orientalis. During the rainy season, the collect of Sigesbeckia orientalis samples was carried out in the communes of Anjiro and its surroundings. Leaves, whole plants and seeds were collected. These samples were dried in three different ways, by the technique of freeze-drying, by sun drying and by in the shade drying. During the extraction, twelve kilos of extracts were obtained from one ton of fresh leaves. Thin layer chromatography of the extracts showed that the leaves dried in the shade, collected at the end of the rainy season, have the highest content of Darutoside. After pedological analysis, this content is enhanced by a strongly acid soil, with a very sandy silt texture, rich in Carbon, Nitrogen, Potassium, especially Phosphorus, but also the proximity of the field to a river. However, a periodic monitoring, a study of the associated flora and a study on plant-animal relation, remain to be undertaken for a better knowledge of the production of Darutoside of Sigesbeckia orientalis. Key words: Sigesbeckia orientalis, Darutoside, drying methods, season, type of plant organs. Advisor: Dr Edmond ROGER