The Effect of Icing Treatment on Recovery Process of Damaged Muscle in the Rat

体力科学第66巻第 5 号 345-354（2017） DOI：10.7600/jspfsm.66.345 原著

アイシング処置がラット損傷筋の回復過程に及ぼす影響

池崎和海 1，芝口翼 2，杉浦崇夫 3，宮田浩文 1

The effect of icing treatment on recovery process of damaged muscle in the rat

Kazumi Ikezaki 1, Tsubasa Shibaguchi 2, Takao Sugiura 3 and Hirofumi Miyata 1

1 山口大学大学院創成科学研究科生物機能科学，〒753-8515 山口市吉田1677-1 (Biological Sciences, Graduate School of Sciences and Technology for Innovation, Yamaguchi University, 1677-1 Yoshida, Yamaguchi 753-8515, Japan) 2 金沢大学国際基幹教育院，〒920-1192 金沢市角間町 (International backbone Education, Kanazawa University, Kakuma- cho, Kanazawa 920-1192, Japan) 3 山口大学教育学部スポーツ健康科学，〒753-8513 山口市吉田1677-1 (Health and Sports Sciences, Faculty of Education, Yamaguchi University, 1677-1 Yoshida, Yamaguchi 753-8515, Japan)

Received: May 9, 2017 / Accepted: July 18, 2017

Abstract Although icing treatment has been well accepted as aftercare in sports fields, the detailed mechanisms of the treatment is not fully understood. In this study, we investigated the effect of icing treatment on the recovery process of rat plantaris muscles with artificially induced muscle damage. Sixty male Wistar rats (8-weeks-old) were randomly assigned to three groups; control (CTL), bupivacaine-injected (BPVC), and icing treatment after BPVC (ICE). Icing treatment was applied for 20 min immediately after BPVC, and the treatment was used once per day for 3 days. The plantaris muscles were removed at 3, 7, 15, and 28 days after the muscle damage, then immunohistochemical and real time RT-PCR analysis were performed. In histochemical analysis, although significant changes were found in the relative muscle weight, cross-sectional area of muscle fiber, percentage of muscle fiber with central nuclei, and expressed immature myosin heavy chain isoforms after muscle damage, as compared to the CTL group, no differences were found between BPVC and ICE groups. In mRNA expression analysis, the ICE group had a significantly lower value of MyoD than the BPVC group at 3 days after the damage. Expression of IL-6 mRNA, which relates to muscle inflammation, indicated significantly higher value in BPVC, but not in ICE, than CTL groups at 7days after the damage.

Furthermore, BKB2 receptor, which relates to acute muscle soreness, indicated a significantly higher expression in BPVC than ICE groups at 3 days after the damage. These results suggest that icing treatment is effective to suppress muscle inflammation and soreness at an early stage of recovery from damage, but not effective for muscle regeneration at a later stage. Jpn J Phys Fitness Sports Med, 66(5): 345-354 (2017) Keywords : mRNA, muscle regeneration, sourness

グ群と比較して，絶対筋重量が軽く中心核を有する線維緒言の面積が小さいことを示した．さらに，筋損傷後のアイアイシングは，激運動後の応急処置として，スポーツシングにより，コラーゲンが過剰沈着することも報告さ領域で広く用いられている．一般的に，アイシングによっれている 4,6）．このように，アイシングは一般的な治療とて期待される効果として，筋損傷後の痛みの緩和，筋緊して広く普及しているけれども，その効果および作用機張の抑制，代謝，血流量，炎症，浮腫の低下が挙げられ序に関しては十分に理解されていない部分もある．る 1-3）．しかし近年，アイシングが筋再生過程において中アイシングに期待される効果の中で，特に痛みの軽減心的な役割を果たすサテライトセルの増殖・分化を遅延はリハビリテーションやアスリートの早期競技復帰のたさせることが報告されている 4）．またItoら 5）は，cardio- めに重要である．これまで，アイシングが痛みの軽減に toxinにより筋損傷を誘発したマウス前脛骨筋において，関しては，神経伝達速度が低下すること，痛みを感じる 20分間アイシング（冷水浸水）を施した群は非アイシン閾値が上昇すること 7）および遅発性筋痛（DOMS）が緩 346 池崎，芝口，杉浦，宮田

和されること 8）などが報告されている．これらの効果は，麻酔を施し，体重を測定した後，脂肪と結合組織を取りアイシングによって鎮痛作用を持つβ-endorphinの発現除いて足底筋を摘出し，筋重量を測定した．筋を生体内が増大することに起因すると解釈されている 7,9）．の至適な長さでコルク上に固定し，液体窒素で冷却した骨格筋の痛みを誘引する分子およびその関連分子としイソペンタン中で凍結させ，分析まで－80℃で保存した．て，cyclooxygenase 2（COX-2），Interleukin 6（IL-6）

およびbradykinin B1/B2（BKB1/2）receptorなどが知免疫組織化学的分析足底筋の筋腹付近から厚さ10 µm

られている．BKB1 receptorは通常骨格筋には存在せの連続横断切片を作成し，スライドガラスに貼り付けた．ず，組織損傷時に発現し慢性的な炎症に寄与する．一その後，室温で30分風乾し，－20℃で100%メタノール

方，BKB2 receptorは骨格筋に恒に発現し，急性的な炎で固定した．切片を0.1 M phosphate buffer saline（PBS）症に関与すると考えられている 10-12）．Muraseら 13）は，で洗浄した後，室温で 1 %（w/v）blocking reagent

DOMSを発生させる伸張性収縮後の筋痛が，BKB1 re- （Roche）を用いてブロッキングを行った．次に，1 %（w/ ceptorアンタゴニストでは抑制されなかったが，運動前 v）blocking regentで希釈した一次抗体を切片上に滴下

のBKB2 receptorアンタゴニストの皮下注射処理によりし， 8 ℃でオーバーナイトした．一次抗体には，MHC 抑制されたことを報告している．その他，痛みに関わるの同定のためにDestsche Sammlung von Mikrrorganis- 分子としてprostaglandin（PGE）2があり，その産生経 men and Zellkulturneより購入したハイブリドーマか路にあるCOX-2とPGE合成酵素も関連が深い．ら作成したBA-D5（anti-MHC I），SC-71（anti-MHC

これらの報告から，BKB1/2 receptorおよびCOX-2を IIa），BF-35（anti-MHC I, IIa and IIb）およびBF-F3 介したPGE2産生は筋痛の発生に関連することが推察さ（anti-MHCIIb）を用いた．さらに，MHC-embryonicおれているが，アイシングが痛み関連分子の発現に影響をよびneonatalの同定にanti-MHC-developmentalを用い及ぼすか否かは明らかではない．そこで本研究は，ラッた．0.1 M PBSで洗浄した後，25℃で 2 時間，1 %（w/v）ト足底筋において，アイシングが筋損傷後の筋再生なら blocking regentで希釈したCy3-conjugated goat anti- びに痛み分子の発現に及ぼす影響について調査した． mouse IgG，Alexa fluor 488 goat anti-mouseIgG1， Alexa flour 594 goat anti-mouse IgMを用いて二次抗体方法反応を行った．0.1 M PBSで洗浄後に風乾し，mounting 実験動物本実験は，国立大学法人山口大学の動物実験 medium（Vector laboratories）で封入した（Fig. 1）．委員会によって承認され（承認番号174），「動物実験指針」横断面積の測定と筋線維の同定のために，一次抗体にに基づいて全ての実験および筋サンプルの採取が行われ anti-lamininおよびanti-desmin抗体を用いてlamininおた．ラットは室温24±1℃，湿度50－60%，12時間明暗よびdesiminを染色した．二次抗体にはFITCおよびCy3 サイクルの部屋で飼育され，標準固形食および水は自由をそれぞれ用いた．その際，上記のプロトコルに加えて摂取とした．メタノール固定前に室温での 4 %（w/v）paraformalde- hyde固定を行い0.1 M PBSで洗浄した．さらに，メタノー実験デザイン 8 週齢の雄性Wistar系ラット60匹を 1 ル固定後に0.1 M PBSで洗浄した後に室温で10分間，週間の予備飼育した後，実験に供した．体重が等しく 1 %（v/v）Triton X-100を含む0.1 M PBSで透過処理なるようコントロール群（CTL），ブピバカイン注入群し，0.1%（v/v）Triton X-100を含む0.1 M PBSでリン（BPVC）およびブピバカイン注入＋冷却群（ICE）の 3 スした．封入にはmounting medium with DAPI（Vector 群（各群20匹）に割り当てた． laboratories）を用い，同時に核染色を行った（Fig. 1）． BPVCおよびICE群のラットは，ソムノベンチル（共顕微鏡デジタルカメラ（DS-Ri2, Nikon）を用い，染色立製薬）麻酔下（ペントバルビタールナトリウム50 mg/ した切片を撮影した．倍率200倍（対物20倍×接眼10倍） kg体重, 腹腔内注射）において後肢を剃毛し0.5%ヒビテで， 1 つの切片当たり 5 カ所（中央および左右の対角線ン（大日本住友製薬）で消毒した後，皮膚を切開して両の 4 カ所）を重複しないように撮影し，画像統合ソフト後肢の足底筋を露出させた．そして，0.5%ブピバカインウエア（NIS-Elements D, Nikon）によって画像をコン（マーカイン, アストラゼネカ）を足底筋の近位，筋腹おピュータに取り込んだ． 1 標本当たりの測定筋線維本よび遠位部に0.2 mlずつ注入し損傷を誘発した．注射後数の平均値は，CTL群の損傷後 7 日は625本，14日後はすみやかに皮膚を縫合し，0.5%ヒビテンで再度消毒した． 544本，28日後は477本，BPVC群の損傷 7 日後は1047 冷却は，麻酔下で筋損傷直後とその後 3 日間の明期に，本，14日後は909本，28日後は560本，ICE群の損傷 7 日 0 ℃のアイスパックを後肢に20分間当てた 4,6）．CTLおよ後は1237本，14日後は814本，28日後は705本であった．びBPVC群には，損傷後 3 日間は麻酔のみ施した．ブピ筋線維横断面積は，LamininおよびDesminを染色したバカイン注入後 3 日， 7 日，15日，28日後にラットに過切片を用いImage J（NIH）により測定した．MHCの同損傷筋に対するアイシングの効果 347

Fig. 1 Typical photomicrographs of serial transverse sections of plantaris muscle stained for Laminin + DAPI（up - per panel） and Laminin + MHC isoforms（neonatal + embryonic）（lower panel） in control（CTL: left panel）, bupivacaine-injected（BPVC: middle panel）, and icing treatment after BPVC（ICE: right panel） at 7 days after the damage. White arrows indicate central nuclei. Each white bar indicate 50 µm.

定には画像編集プログラムGIMPを用いた． Biosystems Japan）で設計され，オリゴヌクレオチドは FASMAC（Kanagawa, Japan）で作成した．リアルタイムRT-PCR分析 Total RNAをTRIZOL reagent（Invitrogen, Carlsbad, CA）により抽出した．統計解析体重，筋重量および組織化学的分析から得 Total RNAの精製度と収率は260 nmおよび280 nmの波られたデータは，One way-ANOVAおよびBonferroni 長の吸光度を測定することで決定した．そして，Total adjusted t-testにより分析した．各mRNAの発現量につ RNAをTURBO DNase（Ambion-Life Technologies, いては，Wilcoxon’s singed-rank testを用いて比較した． Austin, TX）で37℃30分間処理し，サンプルからゲノ全ての結果は平均±標準誤差（SEM）で示し，統計的有ムDNAを除去した．DNase-treated RNA（0.5 µg）から，意性はP<0.05とした． Exscript RT reagent kit（TaKaRa Bio, Otsu, Japan）を結果用いて一本鎖cDNAを合成した．その後，cDNA産物を StepOne Real-Time PCR System（Applied Biosystems 体重・筋重量および筋線維横断面積体重は，実験前 Japan, Tokyo, Japan）によるSYBR-Green PCR Master （CTL; 354±5, BPVC; 334±9, ICE; 333±6 g）および Mixプロトコルを使用して分析した．実験後（損傷28日後, CTL; 444±10, BPVC; 443±14, 増幅プログラムは，95℃で10分間の初期分解段階お ICE; 443±7 g）において群間の有意差は認められなかっよび95℃で 3 分間の分解と58℃で 1 分間のアニーリンた．一方，体重に対する相対筋重量は，損傷 3 日後ではグ／進展の40サイクルで構成されている．Glyseralde- CTL群（0.97±0.01 mg/g）とBPVC群（0.96±0.04 mg/g） hyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）mRNA量およびICE群（0.86±0.07 mg/g）との間に有意差は見らを内在性コントロールに設定した．各遺伝子のmRNA れなかったが，損傷 7 日後において，BPVC群（0.77±0.06 （Table 1）は，遺伝子ターゲットのcycle threshold（Ct） mg/g）およびICE群（0.77±0.10 mg/g）の相対筋重量の値からGAPDHのCtを差し引くことで標準化した（Δ はCTL群（0.99±0.04 mg/g）よりも有意に低下した（Fig. Ct（target））．ターゲット遺伝子の相対発現量をCTLの 2a）．また，損傷15日後では，BPVC群（0.84±0.08 mg/g）値に対する相対量（RQ）として算出した．相対発現に続の相対筋重量はCTL群（1.05±0.08 mg/g）と比較してき，分解曲線分析はcDNAサンプル中にいかなる非特異低値のままであった．的増幅も検出しなかった．平均筋線維横断面積は損傷 7 日と15日後において，プライマーはPrimer Express software（v3.0, Applied BPVC（723±77, 1174±152 µm2）およびICE群（528± 425 348 池崎，芝口，杉浦，宮田

426 Table.1 Real time RT-PCR primer sequences Table 1. Real time RT-PCR primer sequences

Forward Reverse

GAPDH GCTCTCTGCTCCTCCCTGTTC GAGGCTGGCACTGCACAA

MHC-embryonic CTTCAAACTGAAAAACGCCTATGA GTTCTAAGTTCTTATTCTCTCGCTTCACA

MHC-neonatal ATCAGTGCCAATCCCTTGCT CCAAAGCGAGGAGTTGTCA

Pax7 AAAAGATTGAGGAGTATAAGAGGGAGAA GCCGGTCCCGGATTTC

MyoD GACGGCTCTCTCTGCTCCTTT AGTCGAAACACGGATCATCATAGA

Myogenin GACCCTACAGGTGCCCACAA CCGTGATGCTGTCCACGAT

IL-6 CCCACCAGGAACGAAAGTCA GCGGAGAGAAACTTCATAGCTGTT

COX-2 GGCAAAGGCCTCCATTGAC GCGTTTGCGGTACTCATTGA

BKB1 receptor CGAGGCTTGGCACTTTGC GGGAGGAGGAAACCCAAAAC

BKB2 receptor GAGCTTGAAGCATCCTAGGGAAT CGCTTATGCCGTGAGACAAGA

GAPDH; glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase, MHC; Myosin heavy chain, Pax7; paired box transcrip- 427 tionGAPDH; factor-7, glMyoD;yceraldehy myogenicdes-3- determinationphosphate factor,dehy drogIL-6;en Interleukin-6,ase, MHC; COX-2; Myosin cyclooxygenase heavy chai 2,n, BKBPax7;1/2 ; bradykinin B1/B2 receptor

428 paired box transcription factor-7, MyoD; myogenic determination factor, IL-6; Interleukin-6,

84, 1246±162 µm2）はCTL群（1772±90, 2034±146 でCTL群と有意差が認められた（Fig. 3b）．しかし， 429 COX-2; cyclooxygenase 2, BKB1/2; bradykinin B1/B2 receptor µm2）と比較して有意に低い値を示した（Fig. 2b）．しかし， BPVC群とICE群の間に有意差は認められなかった． BPVC群とICE群との間に差異は認められなかった．損430 なお，損傷 3 日後においては筋線維基底膜が崩壊し，傷28日後において，BPVC（1812±120 µm2）およびICE 筋線維を同定することができなかったためデータが欠損群（1690±309 µm2）の筋線維横断面積はCTL群（2324 している． ±164 µm2）よりも小型であったが有意差は認められなかった． MHC mRNA発現量各タイムポイントのCTLの発現量を 1 とした相対値で表すMHC-embryonicおよびneona- 中心核線維・未熟MHC発現線維中心核を有する線維 tal mRNAの発現量は，ブピバカイン注入によって損傷の割合は，CTL群では 1 ～ 3 %であったが，ブピバカイ 3 日後に有意に増大した（MHC-embryonic: BPVC 498.7 ンによる損傷後 7 日後には30%前後の値を示し，28日 ±134.8, ICE 399.6±48.6倍, MHC-neonatal: BPVC 36.5± 後までほぼ維持された（Fig. 3a）．また， 7 日～28日後 9.6, ICE 30.3±4.2倍）（Fig. 4a, b）．MHC-embryonicのにおいて，BPVC群とICE群の間に有意差は認められな mRNA発現量はMHC-neonatalより早く増大し，損傷後かった． 3 日で著しい増大が観察された．また，MHC-embryonic MHC-embryonicまたはneonatalを発現する線維割合およびneonatal mRNA発現のピークは損傷 7 日後であは，CTL群ではほとんど見られなかったが，BPVC群り（MHC-embryonic: BPVC 659.5±98.3, ICE 864.2± とICE群の損傷後 7 日で最も高値（79.6±10.7, 87.3± 108.6倍, MHC neonatal: BPVC 1300.5±148.4, ICE 1528.8 10.8%）を示し，損傷後15日（8.0±4.9, 12.8±8.1%）ま ±112.6倍），免疫組織化学的分析の結果と一致した．両 439 損傷筋に対するアイシングの効果 349

(a) Relative muscle weight (mg/g) (b) CSA(µm2) CTL 1.4 3000 BPVC lce 1.2 2500 1 2000 0.8 1500 0.6 1000 0.4 0.2 500 0 0 3d 7d 15d 28d 3d 7d 15d 28d

Fig. 2 Time course changes in relative muscle440 weight to body weight（mg/g）（a） and Cross sectional area（µm 2）（b） in rat plantaris muscles after muscle damage induced by a bupivacaine injection. White, gray, and black bars indicate CTL, BPVC, and ICE groups, respectively. Data were not presented for 3 day 441 Figin the 2. panelTime（b）, course because chan muscleges fibersin relati wereve notmu identifiedscle weight by histochemical to body weight staining (m afterg/g) muscle (a) and damage. Cross Values are means ± standard errors. *: significant differences（P<0.05） as compared to each CTL value.

2 442448 sectional area (µm ) (b) in rat plantaris muscles after muscle damage induced by a bupivacaine

443 injection. White, gray, and black bars indicate CTL, BPVC, and ICE groups, respectively. Data (a) Central nuclei (%) (b) embryonic and/or neonatal ber (%) 60 120 444 were not presented for 3 day in the panel (b), because muscle fibers were not identifiedCTL by 50 100 BPVC lce 40 445 histochemical staining after muscle damage. 80 30 60 446 20Values are means standard errors. *: sign40ificant differences (P<0.05) as compared to 10 20 447 each0 CTL value. 0 3d 7d 15d 28d 3d 7d 15d 28d

449 Fig. 3 Time course changes in percentages（%） of muscle fiber with central nuclei（a） and muscle fiber expressed immature myosin heavy chain（MHC） isoforms（b） after the muscle damages. Data were not presented for 3 day in the panel（b）, because muscle fibers were not identified by histochemical staining 450 Fiafterg 3. muscle Time cdamage.ourse changes in percentages (%) of muscle fiber with central nuclei (a) and muscle Values are means ± standard errors. *: significant differences（P<0.05） as compared to each CTL value. 451 fiber expressed immature myosin heavy chain (MHC) isoforms (b) after the muscle damages. Data

457 452 were not presented for 3 day in the panel (b), because muscle fibers were not identified by (a) MHC-embryonic (b) MHC-neonatal 1200 1800 453 histochemical staining after muscle damage. CTL 1600 1000 BPVC 1400 lce 454 Valu800es are means standard errors. *: significant1200 differences (P<0.05) as compared to each 1000 600 800

455 CT change Fold L400 value. change Fold 600 400 200 200 456 0 0 3d 7d 15d 28d 3d 7d 15d 28d

458 Fig 4. Time course changes in relative expression of MHC-embryonic a and neonatal (b) Fig. 4 Time course changes in relative expression of MHC-embryonic（a） and neonatal（b） mRNA. The mRNA expression of each time point was calculated as x-fold change from each CTL value. 459 ValuesmRNA. are meansThe mR ± standardNA expres errors.sion *: ofsignificant each ti medifferences point （P<0.05） was calcul asat compareded as x- foldto each chan CTLge value.from each

460 CTL value.

461 Values are means standard errors. *: significant differences (P<0.05) as compared to

462 each CTL value.

463 350 池崎，芝口，杉浦，宮田

MHC mRNA発現量は損傷15日後において，BPVCおよ IL-6 mRNA発現量（Fig. 6a）は，損傷 3 日後において，びICE群はCTLよりも有意に高い値であったが，著しく CTL群よりもBPVC（14.0±3.1倍）およびICE群（8.6±2.6 低下した．いずれのタイムポイントにおいても，BPVC 倍）において発現量が有意に増大した．損傷 7 日後では群とICE群に有意差は認められなかった． ICE群（2.1±1.0倍）はCTL群と同じレベルまで低下したのに対し，BPVC群（5.8±6.4倍）のみがCTL群と比 Pax7，MyoDおよびMyogenin mRNA発現量サテラ較して有意な高値を示した．イトセルのマーカーであるPax7 mRNA発現量は，損傷 COX-2 mRNA発現量（Fig. 6b）も，BPVC群および 3 日後でCTL群よりもBPVC（10.7±3.8倍）およびICE ICE群ともに損傷後 3 日（14.6±6.7, 12.0±3.1倍）および群（5.1±1.4倍）の値が有意に増大し，損傷15日後まで 7 日後（4.6±5.3, 3.7±2.2倍）で有意な増大が確認された CTL群よりもBPVC群とICE群で高い値であった（Fig. が，BPVC群とICE群の間に差異は認められなかった．

5a）．損傷28日後では，BPVC群（1.8±0.2倍）のみCTL BKB1 レセプター mRNA発現量（Fig. 6c）は，BPVC よりも有意に高い値を示した．およびICE群の両者ともに損傷後 3 日（59.4±28.4, 50.1 MyoD mRNA発現は，損傷 3 日後から 7 日後まで， ±13.6倍）から 7 日（10.9±5.3, 12.1±13.6倍）までCTL CTL群と比較してBPVC群とICE群が有意に増大した群よりも高い値であった．

（Fig. 5b）．その中で，損傷 3 日後において，ICE群（3.7±1.3 同様に，BKB2 レセプター mRNA発現（Fig. 6d）もブ倍）はBPVC群（10.9±4.6倍）と比べて有意に低値を示ピバカイン注入により増大し，BPVCおよびICE群で損した．損傷15日以降は 3 群間に差異は認められなかった．傷 3 日後（13.0±8.4, 7.1±4.1倍）から 7 日後（5.9±3.0, Myogenin mRNA発現は，損傷 3 日後でCTL群より 5.0±4.6倍）までCTL群よりも高い値であった．損傷 3

もBPVC（90.1±27.6倍）およびICE群（71.4±16.4倍）の日後において，ICE群のBKB2 レセプター mRNA発現が値が有意に増大した（Fig. 5c）．その後急激に発現量は BPVC群よりも有意に低い値を示した．低下したが，BPVCは損傷15日後まで，ICE群は損傷28 考察日後まで有意に高い値を示した．本研究は，ラット足底筋においてブピバカインによる

痛み関連分子mRNA発現（BKB1/2 レセプター, IL-6, 筋損傷後のアイシングが筋再生および痛み関連分子の COX-2） 4 つの痛み関連分子のmRNA発現量は，損傷 mRNA発現に及ぼす影響について検討した．アイシン後15日以降はすべてCTL群と同じレベルまで低下したグは筋線維横断面積，中心核を有する線維数，MHC- ため，記載を省略した． embryonic/neonatalタンパク質およびmRNA発現に有

(a) Pax7 (b) MyoD 16 18 CTL 14 16 BPVC 12 14 lce 12 10 10 8 8 6 Fold change Fold change Fold 6 4 4 2 2 0 0 3d 7d 15d 28d 3d 7d 15d 28d

(c) Myogenin 464 140 120 465 100 80 Fig. 5 Time course changes in relative expression of Pax7 60 466 （a）, MyoD（b） and Myogenin（c） mRNA. The mRNA expres- Fold change Fold 40 sion of each time point was calculated as x-fold change from each CTL value. 20 467 Values are means ± standard errors. *: significant differences 0 （P<0.05） as compared to each CTL value. #: significant dif- 3d 7d 15d 28d ferences（P<0.05） as compared to each BPVC value.

468 469 Fig 5. Time course changes in relative expression of Pax7 a , MyoD (b) and Myogenin (c)

470 mRNA. The mRNA expression of each time point was calculated as x-fold change from each

471 CTL value.

472 Values are means standard errors. *: significant differences (P<0.05) as compared to

473 each CTL value. # : significant differences P<0.05 as compared to each BPVC value.

474 損傷筋に対するアイシングの効果 351

(a) IL-6 (b) COX-2 CTL 20 25 BPVC 18 16 20 lce 14 12 15 10 8 10 Fold change Fold 6 change Fold 4 5 2 0 0 3d 7d 3d 7d

(c) BKB1receptor (c) BKB2receptor 100 25 90 80 20 70 60 15 50 40 10 Fold change Fold Fold change Fold 30 20 5 10 0 0 3d 7d 3d 7d

475

Fig. 6 Time course changes in relative expression of IL-6（a）, COX-2（b）, BKB1 receptor（c） and BKB2 receptor（d） mRNA. The mRNA expression of each time point was calculated as x-fold change from each CTL value. 476 FigValues 6. Ti meare meanscourse ± chan standardges inerrors. rela ti*:ve significant expression differences of IL（P<0.05）-6 a , asCOX- compared2 (b), to BK eachB1 CTLrecep value.tor (c) #: significant differences（P<0.05） as compared to each BPVC value.

477 and BKB2 receptor (d) mRNA. The mRNA expression of each time point was calculated as 意な影響を及ぼさなかった．しかし，筋特異的転写調節さらに，IL-6 mRNAも損傷 7 日後において，BPVC 478因子の x-1foldつであるMyoDのmRNA発現量は，損傷 change from each CTL value. 3 日群はCTL群よりも有意に高い発現量を示したが，ICE群後においてICE群がBPVC群よりも有意な低値を示しはCTL群と差異が認められないレベルまで発現が低下

479た．また，損傷 Values 3are日後におけるBKB means stan2dardレセプター errors. mRNA*: significanしており，アイシングによってIL-6t differences (P<0.05) as comp aredmRNA発現が抑制 to 発現量は，BPVC群と比較してICE群が有意に低値を示される可能性が示唆された．IL-6は多くの機能を持つサ 16） 480し，IL-6 each mRNA発現量は，損傷 CTL value. # : signific7ant日後においてBPVC differences P<0.05 イトカインであり，筋肥大as compared to each BPVCあるいは筋損傷後の再生過 value. 群だけがコントロール群よりも有意に高い値を示した．程 17）において，サテライトセルの機能に影響を及ぼすこ以上の結果から，ラット足底筋における筋損傷後のアイとが示唆されている．筋損傷時のIL-6は，サテライトセ 481 シングは，一部の筋特異的転写調節因子のmRNAの発ル自身あるいは単球やマクロファージといった炎症細胞現量を低下させるが，組織レベルでの筋再生に影響を及から分泌される 17,18）．加えて，これまで，筋損傷後のアぼさないことが示された．一方，損傷後のアイシングはイシングがマクロファージの浸潤を遅延させる，あるい 4,19） BKB2 レセプターあるいはIL-6のmRNA発現を抑制しは抑制することが報告されている．したがって本研て，筋痛を軽減する可能性が示唆された．究の結果から，アイシングによるサテライトセル活性化・増殖・分化の抑制によって，あるいはマクロファージの筋再生過程に及ぼすアイシングの効果アイシングは，浸潤の抑制によって，IL-6 mRNA発現量が低下する可筋再生過程において中心的な役割を果たすにサテライト能性が示唆されるが，本研究ではサテライトセルおよびセルの増殖・分化を遅延させることが報告されている 4）．マクロファージについて，直接的な定量をしていないた本研究では，損傷 3 日後にMyoD mRNA発現がICE群め推測の域を出ない．において低値を示し，サテライトセルの増殖，分化が抑一方，体重に対する足底筋重量は筋損傷 7 日後におい制されている可能性が示唆された．しかし，MyoDはサてBPVC群はCTL群よりも低値を示したが，BPVC群とテライトセルだけでなく筋核においても発現し 14），ミオ ICE群との間に顕著な差異は認められず，損傷28日後にシン重鎖の遺伝子発現などに関与すること 15）から，サテは両損傷群ともにCTLレベルまで戻った．また，筋損傷ライトセル活性化の抑制を明言することはできない．誘発 7 および15日後に筋線維横断面積は低下し，28日 352 池崎，芝口，杉浦，宮田

後にはCTLレベルに戻った．さらに，中心核を有する receptorが重要な機能を担っていると考えられる．さら線維数の割合は，損傷後に有意に増大し，損傷28日後まにMeottiら 21）は，ホルマリン筋注による炎症について，で高値を維持した．しかし，いずれの形態的指標におい Myeloperoxidase活性の上昇から好中球やマクロファーても，アイシングの影響は認められなかった．先行研究ジあるいはそれら両者の遊走と活性化を推察し，TNF- においては，筋損傷直後のアイシングは筋線維横断面積 α，IL-1β，IL-6といった炎症性サイトカインのmRNA

の回復あるいは中心核を有する線維数の低下を妨げるこ発現の増大を示した．そして，BKB1 あるいはB2 recep- とが示唆され，サテライトセルの分化が遅れることによ torアンタゴニストの投与によってMyeloperoxidase活ると推測されている 4,5）．一方で，Ramosら 19）は，アイ性，TNF-α mRNAの上昇が抑えられること，IL-6

シングは中心核を有する線維の割合やMyoD mRNA発 mRNAはBKB2 receptorのみによって発現が抑制され現を変化させず，筋再生過程に影響を及ぼさないことをることを報告した．本研究においても，損傷 7 日後の示した．また，未熟なMHCであるMHC-embryonicお IL-6 mRNA発現量はアイシングによりCTLレベルにま

よびMHC-neonatalについて，ヘビ毒によって筋損傷をで低下しており，BKB2 receptorとの関連が推察される．誘発した後の再生過程において，それぞれ 2 日後と 4 日また，IL-6に関しては，直接IL-6を筋注することによっ後から発現し，21日後，28日後までに消失することが報て筋痛覚過敏が直接誘発されることもラット 22）およびマ告されている 20）．本研究においてもほぼ同様なMHCのウス 23）において報告されており，その発現抑制が筋痛の発現変動が認められたが，アイシングの影響は全く認軽減に寄与すると考えられる．められなかった．横断切片上のタンパク質発現およびこれらの結果から，筋損傷誘発後のアイシングは mRNA発現レベルで，MHC-embryonicおよびneonatal BKB2 receptorあるいはIL-6の発現抑制を介して筋痛をにアイシングの影響は見られなかった．軽減する可能性が示唆された．以上の結果は，ブピバカインによって損傷を誘発したその他の痛み関連因子として，マクロファージ，肥満足底筋において，アイシングはサテライトセルの増殖・細胞そしてサテライトセルにおいて産生されるCOX-2 24,25）分化あるいは筋特異的タンパク質合成に影響する可能性のmRNA発現量を測定した．COX-2はPGE2 産生と

があるものの，組織レベルの筋再生には影響しないこと関連し，PGE2 は侵害受容器の感受性を高め末梢性の痛覚を示唆する．過敏を引き起こすと考えられており，損傷後の痛みや炎症において重要な役割を果たしているとされている26）．痛み関連分子mRNA発現に対するアイシングの影響実際，ラットを用いた伸張性収縮によってDOMSを引本研究で痛み関連分子として，IL-6，COX-2ならびにき起こしたモデル 25），あるいはカラゲナンによって炎 27） BKB1/2 receptorを痛み関連分子として選択し，その症を誘発したモデルにおいて，COX-2が筋痛覚過敏 mRNAの発現量に対するアイシングの影響を調べた．そを制御することが示されている．本研究では，COX-2 の結果，アイシングによって急性的な炎症時に発現する mRNAが損傷後 3 ないし 7 日後において発現量の増大

BKB2 receptorのmRNA発現は，損傷 3 日後において有が認められたが，アイシングによる抑制効果は認められ意に低下したことが示された．これらの結果は，アイシなかった．伸張性収縮によって筋痛覚過敏を誘発したモングは急性の痛みを生ずる過程に関わる分子の発現を抑デルにおいて，COX-2発現の増大は伸張性収縮直後か制することで，筋損傷に伴う痛みを軽減する可能性を示ら数時間がピークであったことから推察すると 25），本研唆する．究において測定した 3 日後以降では，COX-2の顕著な

BKB1 receptorは，正常な組織には存在せず，組織損傷変化を捉えていない可能性がある．同様なことはIL-6

時に発現し，慢性的な炎症に寄与する．他方，BKB2 re- にも当てはまり，直接的な痛み分子であるIL-6および ceptorは恒常的に発現し，急性的な炎症に関与する10-12）． COX-2の発現に対する比較的早期（損傷直後から48時マウス腓腹筋において，ホルマリン筋注によって炎症を間）のアイシング効果が今後検討されるべきである．

誘発すると，BKB1 およびBKB2 receptor mRNA発現がまとめ増大し，その増大による筋痛覚過敏はホルマリン筋注前

のBKB1 あるいはBKB2 receptor のアンタゴニストの腹アイシング（Cryotherapy）は，筋損傷後の応急処置腔内投与によって抑制されることが示されている21）．まとしてスポーツ領域で広く用いられているが，詳細な作た，ラット長指伸筋において伸張性収縮によって誘発用機序は十分には明らかにされていない．そこで本研究

したDOMSは，運動前のBKB2 receptorアンタゴニスは，ラット足底筋において，アイシングが筋損傷後の筋

トの投与によって抑制されるが，BKB1 receptorアン再生ならびに痛み分子の発現に及ぼす影響について調査タゴニストでは抑制されないことが報告されている 13）．した．

これらの結果は，損傷直後はBKB1 receptorよりもB2 ラットを無作為にコントロール群（CTL），ブピバカ損傷筋に対するアイシングの効果 353

イン注入群（BPVC）およびブピバカイン注入＋冷却刺 fects of icing or heat stress on the induction of fibrosis 激群（ICE）の 3 群（ブピバカイン注入後 3 日, 7 日, 15 and/or regeneration of injured rat soleus muscle. J Physiol Sci 66: 345-357, 2016. doi: 10.1007/s12576-015- 日および28日において, 各群n=5/群）に割り当てた．冷 0433-0. 却（ 0 ℃, 20分間）処置は，筋損傷直後とその後 3 日間連 7） Algafly AA, George KP. The effect of cryotherapy on 続して，麻酔下のICE群ラットの下腿に対して実施した． nerve conduction velocity, pain threshold and pain tol- アイシングは筋線維横断面積，中心核を有する線維割 erance. Br J Sports Med 41: 365-369, 2007. 合，MHC-embryonic/neonatalタンパク質およびmRNA 8） Denegar CR, Perrin DH. Effect of transcutaneous elec- 発現線維割合に有意な影響を及ぼさなかった．しかし， trical nerve stimulation, cold, and a combination treatment on pain, decreased range of motion, and strength 損傷 3 日後のMyoD mRNA発現量は，ICE群がBPVC loss associated with delayed onset muscle soreness. J 群よりも有意に低い値を示した．また，損傷 3 日後にお Athl Train 27: 200-206, 1992. けるBKB2 レセプター mRNA発現量は，BPVC群と比較 9） Zagrobelny Z, Halawa B, Negrusz-Kawecka M, Spring してICE群が有意に低値を示し，IL-6 mRNA発現量も， A, Gregorowicz H, Wawrowska A, Rozwadowski G. 損傷 7 日後においてBPVC群だけがコントロール群より Hormonal and hemodynamic changes caused by whole body cooling in patients with rheumatoid arthritis. Pol も有意に高い値を示した． Arch Med Wewn 87: 34-40, 1992. 以上の結果から，ラット足底筋における筋損傷後のア 10） Hall JM. Bradykinin receptors. Gen Pharmacol 28: 1-6, イシングは，一部の筋特異的転写調節因子のmRNA発 1997. 現量を低下させるが，組織レベルでの筋再生に影響を及 11） Marceau F, Bachvarov DR. Kinin receptors. Clin Rev ぼさないことが示された．一方，損傷後のアイシングは Allergy Immunol 16: 385-401, 1998. 12） Couture R, Harrisson M, Vianna RM, Cloutier F. Kinin BKB2 レセプターあるいはIL-6のmRNA発現量を抑制し receptors in pain and inflammation. Eur J Pharmacol て，筋痛の発生を軽減する可能性が示唆された． 429: 161-176, 2001. 13） Murase S, Terazawa E, Queme F, Ota H, Matsuda T, 利益相反自己申告：申告すべきものはなし Hirate K, Kozaki Y, Katanosaka K, Taguchi T, Urai H, Mizumura K. Bradykinin and nerve growth factor play pivotal roles in muscular mechanical hyperalge- 謝辞 sia after exercise（delayed-onset muscle soreness）. J 本研究の一部は文部科学省科学研究費（15K12681および Neurosci 30: 3752-3761, 2010. doi: 10.1523/JNEURO- 24500789）の補助を受け実施された．また，平成29年度日 SCI.3803-09.2010. 本体力医学会中国・四国地方会「若手研究プロジェクト助 14） Ishido M, Kami K, Masuhara M. In vivo expression 成」を受けて出版された． patterns of MyoD, p21, and Rb proteins in myonuclei and satellite cells of denervated rat skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol 287: 484-493, 2004. 参考文献 15） Allen DL, Sartorius CA, Sycuro LK, Leinwand LA. 1） Nadler SF, Weingand K, Kruse RJ. The physiologic Different pathways regulate expression of the skeletal basis and clinical applications of cryotherapy and ther- myosin heavy chain genes. J Biol Chem 276: 43524- motherapy for the pain practitioner. Pain Physician 7: 43533, 2001. 395-399, 2004. 16） Serrano AL, Baeza-Raja B, Perdiguero E, Jardí M, 2） Merrick MA. Secondary injury after musculoskeletal Muñoz-Cánoves P. Interleukin-6 is an essential trauma: a review and update. J Athl Train 37: 209- regulator of satellite cell-mediated skeletal muscle 217, 2002. hypertrophy. Cell Metab 7: 33-44, 2008. doi: 10.1016/ 3） Hubbard TJ, Aronson SL, Denegar CR. Does Cryo- j.cmet.2007.11.011. therapy Hasten Return to Participation? A Systematic 17） Zhang C, Li Y, Wu Y, Wang L, Wang X, Du J. Inter- Review. J Athl Train 39: 88-94, 2004. leukin-6/signal transducer and activator of transcrip- 4） Takagi R, Fujita N, Arakawa T, Kawada S, Ishii N, tion 3（STAT3） pathway is essential for macrophage Miki A. Influence of icing on muscle regeneration after infiltration and myoblast proliferation during muscle crush injury to skeletal muscles in rats. J Appl Physiol regeneration. J Biol Chem 288: 1489-1499, 2013. doi: 110: 382-388, 2011. doi: 10.1152/japplphysiol.01187.2010. 10.1074/jbc.M112.419788. 5） Ito T, Fujiya H, Goto K, Ogura Y, Kurosaka M, Ya- 18） Muñoz-Cánoves P, Scheele C, Pedersen BK, Serrano tabe K, Kishiro S, Yoshida A, Yoshioka H, Terauchi K, AL. Interleukin-6 myokine signaling in skeletal mus- Beppu M, Funabashi T, Akema T, Musha H. Icing at cle: a double-edged sword? FEBS J 280: 4131-4148, early stage depresses skeletal muscle regeneration. J 2013. doi: 10.1111/febs.12338. St Marianna Univ 4: 61-67, 2013. 19） Vieira Ramos G, Pinheiro CM, Messa SP, Delfino GB, 6） Shibaguchi T, Sugiura T, Fujitsu T, Nomura T, Yoshi- Marqueti Rde C, Salvini Tde F, Durigan JL. Cryother- hara T, Naito H, Yoshioka T, Ogura A, Ohira Y. Ef- apy Reduces Inflammatory Response Without Altering 354 池崎，芝口，杉浦，宮田

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