Resultados y discusión 1

Otros grupos de Aunque este estudio estuvo dirigido hacia el grupo limata, la inclusión de ejemplares de otras especies permite explorar la composición y las relaciones de otros grupos de Crematogaster Neotropicales.

En las hipótesis filogenéticas obtenidas una de las observaciones más interesantes es la separación del grupo crinosa (como se define en la literatura, p.e. Longino 2003) en dos clados. Por un lado se encuentra un clado crinosa s. str. (Clado C Figura 1-4, Bootstrap = 99, PP = 1.0), compuesto por las especies Crematogaster ampla, C. crinosa, C. rochai y C. torosa. Estas especies presentan unos pocos pelos remiformes engrosados en el promesonoto y pelos recostados a lo largo de todo el tegumento (Figura 1-8).

Figura 1-8: Fotografías de las especies que componen el grupo crinosa C. ampla, C. crinosa, C. rochai y C. torosa (Fuente of Costa Rica web page).

Crematogaster ampla Crematogaster crinosa

Crematogaster torosa Crematogaster rochai

El segundo clado comprende las especies Crematogaster crucis, C. erecta y C. moelleri, inicialmente ubicadas dentro del grupo crinosa, junto a C. stolli (la cual conformaba como única especie el grupo stolli y se diferencia de las demás Crematogaster porque es la única que anida en troncos vivos Longino, 2003), en un clado propuesto aquí como grupo erecta (Clado B Figura 1-4 Bootstrap = 91, PP = 0.91). Estas especies, se diferencian de las especies del grupo crinosa, por la presencia de pelos filiformes en el promesonoto (Figura 1-9). 2 Filogenia molecular de las hormigas del complejo limata de Crematogaster

Figura 1-9: Fotografías de las especies que componen el grupo erecta C. crucis, C. erecta, C. moelleri y C. stolli (Fuente Ants of Costa Rica web page).

Crematogaster crucis Crematogaster erecta

Crematogaster moelleri Crematogaster stolli

Por otro lado, se presenta una separación de especies del grupo sumichrasti (hormigas pequeñas de tegumento delgado y color amarillo), en dos clados compuestos de la siguiente manera: Por un lado se encuentra C. flavomicrops, C. sumichrasti y C. wardi (Bootstrap = 87, PP = 1.0) muestras colectadas en el centro de América y por el otro C. flavomicrops cf. y C. sp. Sumichrasti (Bootstrap = 100, PP = 1.0) muestras colectadas en Sur América. Estas especies son morfológicamente idénticas y la única separación, de momento, es geográfica; la convergencia puede ser extrema en el caso de este grupo que, de acuerdo a este estudio, no es natural.

La evolución convergente, definida como el origen independiente de fenotipos similares en distintos linajes como respuesta a presiones de selección similares, puede tener múltiples explicaciones (Libbrecht & Kronauer, 2014). La convergencia puede ser el resultado de cambios genéticos similares vistos de dos maneras: la evolución de mutaciones idénticas o similares en linajes independientes (evolución paralela) y la evolución en linajes independientes de alelos que son compartidos a lo largo de las poblaciones -introgresión- (evolución genética colateral) (Stern, 2013). Uno de los hallazgos encontrados a partir de las nuevas filogenias moleculares es que la convergencia es mucho más común de lo que se había apreciado antes, como se muestra en la Tabla 1-3, existen ejemplos en filogenias de hormigas con caracteres moleculares en donde se observa convergencia entre los grupos de estudio (Ward, 2014).

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Tabla 1-3: Ejemplos de convergencia en estudios filogenéticos de hormigas (Modificado de Ward, 2014).

SUBFAMILIA GÉNERO COMENTARIOS Evolución independiente en el Neotrópico y en el Dorylinae Sphinctomyrmex Paleotrópico Formicinae Camponotus Subgénero Colobopsis es un linaje independiente Evolución independiente de granívoras en la región Messor Neártica y en el Viejo Mundo Especies en los grupos destructor y scabriceps Myrmicinae Monomorium forman linajes independientes

Se ha evidenciado que ciertas características morfológicas de hormigas han evolucionado repetidamente en diferentes linajes, como la formación del postpeciolo, la pérdida del aguijón, la reducción de los segmentos antenales y la evolución de mandíbulas especializadas (Bolton et al., 2006; Hölldobler & Wilson, 1990). Sin embargo, para los dos clados del grupo sumichrasti aún no se puede aseverar la razón de la convergencia reconstruida aquí. Para poder encontrar el por qué de este caso, haría falta complementar la filogenia con más muestras del grupo y además en lo posible realizar un estudio de poblaciones para Centro y Sur América.

Por último, las muestras de las especies de los grupos curvispinosa y acuta (actualmente definidos por caracteres morfológicos) se observan a lo largo de los árboles conformando distintos clados con especies de otros grupos, sugiriendo que estos dos complejos o grupos de especies definidos por morfología, no son grupos naturales y se hace necesario completar el muestreo de especies para la definición de los mismos dentro de la filogenia del género de hormigas Crematogaster en el Neotrópico.

Gracias a la inclusión de muestras de los grupos no limata de la región Neotropical para la realización de la filogenia, en el presente trabajo se presenta una propuesta para la redefinición de 3 de los 7 grupos hasta hoy propuestos para el género Crematogaster (Figura 1-11). Por una parte, el grupo limata queda redefinido excluyendo a las especies C. nigropilosa y C. sotobosque, que se encuentran en clados muy distantes del clado que contiene la mayoría de especies del grupo limata y a la especie C. limata por lo que se mantiene el nombre. Por otro lado, el grupo crinosa queda dividido en dos, un primer grupo que incluye la especie C. crinosa y mantiene el nombre y otro al que se propone el nombre de erecta y que además incluye la especie C. stolli, por lo que el grupo stolli desaparece.

Figura 1-10: Propuesta de redefinición de grupos basada en la hipótesis filogenética de Crematogaster con énfasis en el grupo limata (Resaltado verde = grupo limata, resaltado azul = grupo crinosa, resaltado rojo = grupo erecta). En los nodos se indican los valores de 4 Filogenia molecular de las hormigas del complejo limata de Crematogaster probabilidades posteriores/Bootstrap/Número de sinapomorfias, en los que no se señala ningún valor se alcanzó el máximo valor para los casos de PP y Bootstrap.

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6 Filogenia molecular de las hormigas del complejo limata de Crematogaster

Conclusiones

El uso de los marcadores moleculares ArgK, CAD, COI, LwRh y Wg y la realización de una filogenia molecular de Crematogaster para el Neotrópico permite concluir:

1. El grupo limata no es natural tal como se conoce en la literatura; aparece 3 veces en las hipótesis filogenéticas, por lo que se propone redefinir el grupo compuesto por las especies: Crematogaster brasiliensis, C. carinata, C. egregior, C. levior, C. limata, C. longispina y C. tenuicola.

2. La especie C. nigropilosa, que hacia parte del grupo limata, conforma un clado con especies del grupo Curvispinosa. Se sugiere la inclusión de más muestras de éste grupo para la definición del mismo.

3. C. sotobosque conforma como única especie un clado hermano del resto de hormigas del Neotrópico, a excepción de las especies del grupo de Sumichrasti y Curvispinosa que conforman un clado con las dos especies del subgénero Orthocrema del Viejo Mundo.

4. El grupo Crinosa se presenta como dos clados distantes en las hipótesis filogenéticas, lo que sugiere que debe ser dividido en, C. ampla, C. crinosa, C. rochai y C. torosa por un lado y C. erecta, C. crucis, C. moelleri y C. stolli por el otro.

5. Las especies de los grupos Acuta, Curvispinosa y Sumichrasti, conformaron distintos clados a lo largo de las tres hipótesis filogenéticas presentadas, lo cual sugiere que estos grupos tampoco son naturales pero se deben incluir más especies para la definición de los mismos.

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Recomendaciones y perspectivas

Se sugiere, después de la presentación de las hipótesis filogenéticas de las hormigas del género Crematogaster para la región Neotropical, con énfasis en el grupo limata, la ampliación del muestreo de especies de los grupos no limata (Acuta, Crinosa, Curvispinosa, Distans y Sumichrasti) y del número de marcadores moleculares utilizados o la realización de una filogenia basada en ambos tipos de caracteres (moleculares y morfológicos), para la correcta definición de los grupos o complejos de especies de este género, ya que como se observa en los árboles obtenidos, ninguno de los grupos muestra ser natural.

De igual manera se propone la revisión taxonómica de los distintos grupos que se encuentran en la región Neotropical, pues con la presentación de la hipótesis filogenética se puede iniciar la taxonomía de grupos como limata, crinosa y erecta y la exploración con grupos del sur de Sur América, los cuales apuntan a tener aun más problemas en su definición.

Al mismo tiempo se recomienda realizar un estudio para Crematogaster con UCEs, los cuales han demostrado ser de gran utilidad en la estimación de los tiempo de divergencia. En cuanto al caso de la convergencia de las especies del grupo Sumichrasti se propone para el futuro realizar un estudio genético-poblacional que incluya muestras de distintas poblaciones de Centro y Sur América.

8 Filogenia molecular de las hormigas del complejo limata de Crematogaster

Anexos

Anexo 1. Protocolo para la extracción de ADN de hormigas usando el kit Qiagen DNEasy, método destructivo (Traducido de Portugués a Español, Lina Pedraza)

1. Secar la hormiga en papel filtro y transferirla a un tubo eppendorf de 1,5mL. Macerar con un pistilo estéril.

2. Adicionar 180µL de Buffer de digestión (mezclar) y 20µL de Proteinasa K y homogenizar.

- Incubar a 55ºC durante toda la noche con agitación a 300rpm.

3. Centrifugar a 1200rpm por 3 minutos y transferir el sobrenadante a un tubo eppendorf de 1,5mL nuevo.

4. Adicionar 20µL de RNAse A, homogenizar y esperar por 2 minutos.

5. Adicionar 200µL de Buffer de lisis de unión y homogenizar.

6. Adicionar 200µL de etanol absoluto y pipetear todo el contenido para una columna.

7. Centrifugar a 100rpm por 1 minuto. Descartar el tubo colector y colocar la columna en un nuevo tubo.

8. Adicionar 500µL de Buffer de lavado 1.

9. Centrifugar a 100rpm por 1 minuto. Descartar el tubo colector y colocar la columna en un nuevo tubo.

10. Adicionar 500µL de Buffer de lavado 2.

11. Centrifugar a 120rpm por 3 minutos. Descartar el tubo colector y colocar la columna en un tubo eppendorf de 1,5mL nuevo.

12. Adicionar 100µL de Buffer de elución. Esperar por 1 minuto y centrifugar a 130rpm por 1 minuto. Dejar las muestras por toda la noche a 4ºC y almacenar las muestras a - 20ºC.

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Anexo 2. Protocolo para la extracción de ADN de hormigas usando el kit Qiagen DNEasy, método no destructivo (Traducido de Portugués a Español, Lina Pedraza)

1. Retirar los especímenes del etanol, secarlos en un papel toalla y colocarlos en un tubo eppendorff de plástico de 1,5 mL. El alcohol debe ser completamente evaporado de los tejidos en cámara de vacío.

2. Adicionar 180µL de solución ATL y 20µL de proteinasa K, mezclar bien en vortex.

3. Incubar las muestras en cámara a 55ºC, sobre una plataforma de agitación constante durante 12-18 horas. Después del periodo de incubación, retirar las especímenes de la mezcla y ponerlos en alcohol al 95% para interrumpir el efecto de la enzima en los tejidos.

4. A cada tubo agregar 200µL de solución AL y 200µL de alcohol absoluto, agitar los frascos suavemente.

5. Transferir el contenido para las correspondientes columnas “Dneasy Mini Spin Columns” y centrifugar a 8.000rpm durante un minuto. Descartar el tubo colector con el líquido.

6. Adicionar 500µL de solución AW1 y centrifugar la muestra a 8.000rpm durante un minuto. Descartar el tubo colector con el líquido.

7. Adicionar 500µL de solución AW2 y centrifugar la muestra por 3 minutos a 13.000rpm. Descartar el tubo colector con el líquido.

8. Adicionar 50µL de solución AE directamente en la membrana de la columna, centrifugar a 8.000rpm durante un minuto y guardar el extracto centrifugado. Repetir el mismo procedimiento una segunda vez y guardar. Combinar los productos de los últimos dos pasos, este es el extracto genómico que va a ser utilizado para las amplificaciones de los genes.

10 Filogenia molecular de las hormigas del complejo limata de Crematogaster

Anexo 3. Condiciones de PCR utilizadas

Condiciones Oligos Tºm Secuencia 3’-5’ Referencia PCR GTT GAY GCY GCY GTT YTG GAY (Ward et 95ºC 2min AK4F2 64,4 AA al., 2010) 1X; 95ºC 45seg, 55ºC 45seg, 72ºC (Ward et AK461R 63,5 GT GCT RGA YAC YTT CTC YTC CAT 1 min 35X; al., 2010) 72ºC 5 min 1X GGY ACC GGR CGT TGY TAY ATG (Ward et 95ºC 2min CD892F 67,1 AC al., 2010) 1X; 95ºC 45seg, 56ºC 45seg, 72ºC GCC GCA RTT NAG RGC RGT YTG (Ward et CD1491R 70,5 1 min 35X; YCC al., 2010) 72ºC 5 min 1X HCO 53,0 TAA TCA GGG TGA CCA AAA ATC A PieLab 95ºC 2min 1X; 92ºC 30seg, 48ºC GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA 30seg, 68ºC LCO 48,0 PieLab TTG G 30seg 35X; 68ºC 2 min 1X (Ward & 95ºC 2min GAC AAA GTK CCA CCR GAR ATG LR143F 63,7 Downie, 1X; 95ºC CT 2005) 45seg, 58ºC 45seg, 72ºC (Ward & 1 min 35X; LR639ER 59,6 YTTAC CG RTT CCA TCC RAA CA Downie, 72ºC 5 min 2005) 1X TGC ACN GTG AAR ACY TGC TGG (Ward et 95ºC 2min Wg578F 68,8 ATG CG al., 2010) 1X; 95ºC 45seg, 58ºC 45seg, 72ºC (Ward et Wg1032R 62,4 AC YTC GCA GCA CCA RTG GAA 1 min 35X; al., 2010) 72ºC 5 min 1X

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Concentraciones de reactivos:

Reactivo Concentración Inicial Concentración Final Buffer 10X 1X

MgCl2 50mM 2,5mM dNTPs 25mM 0,4µM Primers 25µM 0,6µM BSA - 1:100 Taq polimerasa 5U/µL 1,25U VOLUMEN TOTAL - 25µL

12 Filogenia molecular de las hormigas del complejo limata de Crematogaster

Anexo 4. Base de datos de las muestras de Crematogaster de la región Neotropical, utilizadas en la inferencia filogenética

CODIGO PAIS LOCALIDAD FECHA ID CR032 Perú Cusco ago-13 C. carinata CR033 Perú Cusco ago-13 C. levior CR037 Perú Cusco ago-13 C. stolli CR039 Perú Cusco ago-13 C. egregior cf. CR041 Perú Cusco ago-13 C. sp1 Limata CR042 Perú Cusco ago-13 C. sotobosque CR044 Perú Cusco ago-13 C. limata CR048 Colombia Norte de Santander dic-13 C. sp2 Limata CR051 Perú Cusco ago-13 C. sp. Sumichrasti CR069 Perú Cusco ago-13 C. carinata cf. CR098 Brasil Amazonas ago-10 C. levior CR145 Perú Puerto Maldonado ago-12 C. limata CR299 Colombia Guaviare oct-12 C. limata CR302 Colombia Guaviare oct-12 C. brasiliensis CR500 Colombia Cundinamarca feb-07 C. nigropilosa cf. CR602 Colombia Magdalena oct-11 C. obscurata CR691 Colombia Magdalena sept-13 C. carinata CR696 Colombia Magdalena sept-13 C. carinata CR725 Ecuador Pichincha ene-11 C. nigropilosa CR780 Venezuela Rio Cuyuní ene-82 C. flavomicrops CR785 Venezuela Rio Cuyuní ene-82 C. tenuicola CR803 Venezuela Rio Cuyuní ene-82 C. brasiliensis CR816 Colombia Meta feb-13 C. montezumia cf. CR917 Colombia Nariño mar-15 C. erecta CR937 Ecuador Zamora oct-14 C. nigropilosa CR939 Ecuador Zamora oct-14 C. sotobosque CR941 Nicaragua Matagalpa may-15 C. brasiliensis CR942 Costa Rica Alajuela mar-10 C. bryophilia CR943 Guatemala Izabal may-09 C. carinata CR944 Honduras Gracias a Dios jun-10 C. crinosa Región Autónoma del Atlántico CR945 Nicaragua jun-11 C. curvispinosa Sur CR946 Costa Rica Puntarenas mar-10 C. erecta CR947 Costa Rica Heredia abr-07 C. flavomicrops CR948 Costa Rica Alajuela mar-04 C. jardinero Región Autónoma del Atlántico CR949 Nicaragua jun-11 C. limata Sur 13

CR950 Costa Rica Alajuela dic-13 C. longispina CR952 Nicaragua Chontales abr-11 C. nigropilosa CR953 Costa Rica Heredia feb-04 C. raptor CR954 Nicaragua Granada ene-11 C. rochai CR955 Nicaragua Matagalpa may-11 C. snellingi CR956 Nicaragua Matagalpa may-11 C. sotobosque CR957 Nicaragua Matagalpa may-11 C. sumichrasti CR958 Costa Rica Puntarenas may-14 C. tenuicola CR959 Costa Rica Puntarenas jun-14 C. torosa CR960 Nicaragua Jinotega may-11 C. wardi CR961 Costa Rica Heredia mar-05 C. moelleri CR963 Brasil Rodonia jul-13 C. carinata CR966 Brasil Rodonia abr-13 C. abstinens CR967 Brasil Rodonia may-13 C. evallans CR968 Brasil Rodonia jun-13 C. nigropilosa CR969 Brasil Rodonia jun-13 C. erecta cf. CR972 Sur África - feb-99 C. liengmei CR973 Malasia - ago-10 C. gavapiga cf. CR974 Malasia - ago-10 C. reticulata CR975 Malasia - ago-10 C. ocharea cf. CR976 Malasia - ago-10 C. rogenhoferi cf. CR979 China - jul-11 C. ferrarii cf. CR980 España - may-12 C. scutellaris CR982 Colombia Huila oct-14 C. crucis CR983 Colombia Huila oct-14 C. ampla CR985 Brasil Campus Itaperi-UECE feb-15 C. abstinens

14 Filogenia molecular de las hormigas del complejo limata de Crematogaster

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