POLSKIE ■ TOWARZYSTWO BIOCHEMICZNE

Advances in Biochemistry

TOM 43. NR 2.1997

Nobel 1996 dla immunologów . . 66 Synerg¡styczne efekty MDP i in­ nych immunoterapeutyków .... 73 Episjalina (MUC 1 ) ...... 80 Uszkodzenia DNA a cykl komór­ kowy ...... 85 Ubikwitynacja u drożdży 91 Koordynacja syntezy DNA .... 98 Transaktywujące i onkogenne wła­ ściwości białka XHBV ...... 105 Białka wiążące ATP ...... 111 Miozyna w chorobach serca . . .120

http://rcin.org.pl Kwartalnik ,,Postępy Biochemii " wydawany z pomocą finansową Komitetu Badań Naukowych oraz Instytutu Biologii Doświadczal­ nej im. M. Nenckiego PAN

http://rcin.org.pl SPIS TREŚCI CONTENTS

WYDAWCA Editor Nobel nierychliwy, ale sprawiedliwy: odkrycie restrykcji POLSKIE TOWARZYSTWO M HC nagrodzone po 22 latach (Nagroda Nobla w dziedzi­ BIOCHEMICZNE Polish Biochemical Society nie fizjologii lub medycyny w roku 1991) ul. Pasteura 3 Better late than never: Discovery of MHC restriction awarded with * 02-093 Warszawa Poland Nobel Prize after twenty two years (Nobel Prize in Physiology or E-mail — ptbioch @ nencki gov. pl. Medicine for 1 996)

Drukarnia Naukowo-Techniczna PIOTR KUŚNIERCZYK...... 66 Mińska 65 03-828 Warszawa Synergistyczne efekty immunomodulatorów typu mura- REDAKCJA mylopeptydów i innych leków stosowanych wspólnie Editorial Board REDAKTOR NACZELNY w chemioterapii Editor in chief Synergistic effect of immunomodulators of muramyl peptides type ZOFIA ZIELIŃSKA with other medicines tel. 831-24-03 REDAKTORZY KRYSTYNA DZIERZBICKA, MAGDALENA GOZDOWSKA, Editors ALEKSANDER M. KOŁODZIEJCZYK...... 73 GRAŻYNA PALAMARCZYK tel. 658-47-02 ANDRZEJ JERZMANOWSKI Episjalina — nowopoznany składnik glikokaliksu i błony tel. 659-70-72 w. 3234 komórkowej komórek nabłonkowych ANNA SZAKIEL Episialin — a new recognized component of glycocalyx and cell tel. 23-20-46 JOLANTA GRZYBOWSKA membrane of epithelial cells tel. 13-05-15 ANDRZEJ GINDZIEŃSKI, KRZYSZTOF ZWIERZ...... 80 HANNA LASKOWSKA pon. i czw. 14-16 tel. 659-85-71 w. 441 W pływ uszkodzeń DNA na regulację cyklu komórkowego The influence of DNA damage on cell cycle regulation RECENZENCI ZESZYTU PIOTR W ID Ł A K ...... 85 Referees of this issue BARBARA GRZELAKOWSKA- -SZTABERT System ubikwitynacji i jego rola u drożdży Saccharomy- (Warszawa) ces cerevisiae KATARZYNA JAGUSZTYN- -KRYNICKA The ubiquitin conjugation system and its role in the yeast (Warszawa) Saccharomyces cerevisiae ANNA JAKUBIEC-PUKA ANNA TOBIASZ, TERESA ŻOŁĄDEK...... 91 (Warszawa) ANDRZEJ KASPRZAK (Montpellier) Koordynacja syntezy nici prowadzącej i opóźnionej DNA IRENA KĄKOL w widełkach replikacyjnych (Warszawa) MAŁGORZATA MANTEU- Coordination of the leading and lagging DNA strand synthesis FFEL-CYMBOROWSKA IWONA J. FIJAŁKOWSKA, PIOTR JOŃCZYK...... 98 (Warszawa) MARIAN MORDARSKI (Wroclaw) ,,X" ostatnia niewiadoma wirusa zapalenia wątroby typu GRAŻYNA PALAMARCZYK B? Transaktywujące i onkogenne własności białka XHBV (Warszawa) „X ” the last unknown of hepatitis B virus? Transactivating and WOJCIECH RODE (Warszawa) oncogenic properties of X protein ADAM SZEWCZYK MAŁGORZATA SIDORKIEWICZ...... 105 (Warszawa) GRZEGORZ WĘGRZYN (Gdańsk) Wewnątrzkomórkowe białka wiążące ATP IWONA ŻAK Intracellular ATP-binding proteins (Katowice) JOANNA BANDOROWICZ-PIKUŁA I SŁAWOMIR PIKUŁA . . 111 ADRES REDAKCJI Address Zmiany w domenie regulatorowej główki miozyny obser­ REDAKCJA KWARTALNIKA wowane w niektórych chorobach serca „POSTĘPY BIOCHEMII” POLSKIE TOWARZYSTWO Changes in the regulatory domain of myosin head observed in BIOCHEMICZNE some heart diseases ul. Pasteura 3 02-093 Warszawa ANNA MOCZARSKA...... 120 tel. (2) 659-85-71 w. 441 poniedzałki, czwartki 1400-1600 fax (22) 22-53-42 http://rcin.org.pl ARTYKUŁY

Nobel nierychliwy, ale sprawiedliwy: odkrycie restrykcji MHC nagrodzone po 22 latach (Nagroda Nobla w dziedzi­ nie fizjologii lub medycyny w roku 1996)

Better late than never: Discovery of MHC restriction awarded with Nobel Prize after twenty two years (Nobel Prize in Physiology or Medicine for 1996)

PIOTR KUŚNIERCZYK*

Spis treści: Contents:

I. Wstęp I. Introduction II. Co wiedziano przed odkryciem Doherty’ego i Zin- II. What was known before Doherty’s and Zinkernagel’s kernagla discovery II-l. Limfocyty B i T II-L Lymfocytes B and T II-2. Główny kompleks zgodności tkankowej (MHC) II-2. Major histocompatibility complex (MHC) II-3. Biologiczna rola MHC II-3. Biological role of MHC III. Krótkie życiorysy laureatów III. Short C.V.’s of laureates IV. Odkrycie restrykcji MHC IV. The discovery of MHC restriction V. Konsekwencje odkrycia Zinkernagla i Doherty’ego: V. Consequences of Zinkernagel’s and Doherty’s discove­ Dalszy rozwój badań nad rozpoznawaniem antygenu ry: Futher advances in studies on antigen recognition by przez limfocyty T T lymphocytes VI. Zakończenie VI. Epilogue

Wykaz stosowanych skrótów: H-2 — główny kompleks wicie Doherty i Zinkernagel stwierdzili, że zgodności tkankowej myszy (histocompatibility-2); Ir — zdol­ zabijanie mysich komórek zakażonych wirusem przez ność do odpowiedzi odpornościowej (immune response); limfocyty uczulone (tzn. pobrane od myszy zakażo­ LCMV — wirus limfocytarnego zapalenia splotu naczynio­ nych tym samym wirusem) zachodzi tylko wtedy, gdy wego i opon mózgowych; MHC — główny kompleks zgodności tkankowej (major histocompatibility complex): limfocyty mogą rozpoznać na zabijanych komórkach TCR — receptor limfocytu T (T celi receptor). nie tylko wirus, lecz także własne cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC, od Major 1. Wstęp Histocompatibility Complex) [2, 3]. Wkrótce okazało się, że mechanizm ten, polegający na jednoczesnym 10 grudnia 1996 r. w Sztokholmie Peter C. D o h e - rozpoznaniu cząsteczki obcej (antygenu) i własnej r t y (obecnie profesor na Wydziale Nauk Medycznych (MHC), nie ogranicza się do odporności przeciw- na Uniwersytecie Stanu Tennessee) i Rolf M. Zin- wirusowej, lecz stanowi powszechny mechanizm roz­ k e r n a g e 1 (obecnie dyrektor Instytutu Immunologii poznawania obcych i własnych struktur przez lim­ na Uniwersytecie w Zurychu) odebrali Nagrodę Nobla focyty T. Rozpoznanie obcego antygenu wyłącznie w dziedzinie fizjologii lub medycyny [1]. W ten sposób w „kontekście” własnej cząsteczki MHC nazwano po 22 latach uhonorowano tym najbardziej prestiżo­ restrykcją MHC (MHC restriction) [4], wym odznaczeniem odkrycie, jak układ odpornoś­ ciowy rozpoznaje komórki zakażone wirusem. Miano- II. Co wiedziano przed odkryciem Doher­ ty’ego i Zinkernagla

* Doc. dr hab., Laboratorium Immunogenetyki, Zakład II-I. Limfocyty B i T Immunologii Klinicznej, Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej im. Ludwika Hirszfelda, PAN, ul. Weigla 12, 53-114 Wrocław; E-mail: [email protected] Limfocyty T, o których była mowa wyżej, stanowią

66 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 bardzo ważny element odporności organizmu. Odpor­ czone w płynach ciała bądź znajdujące się na powierz­ ność ta objawia się tym, że większość z nas na ogół chni obcych komórek, np. bakteryjnych. Każdy lim­ pozostaje w dobrym zdrowiu mimo, iż żyjemy w środo­ focyt B posiada tylko jeden rodzaj receptora (im­ wisku pełnym zarazków, pasożytów itp. Rozróżniamy munoglobuliny) o określonej swoistości, tj. rozpo­ odporność wrodzoną i nabytą [5]. Odporność wro­ znający dany antygen, lecz nie reagujący z innymi, dzona jest nieswoista i nie wiąże się bezpośrednio niespokrewnionymi antygenami. Zapobiega to zaan­ z tematem tego artykułu. Stanowi ona pierwszą zaporę gażowaniu się wszystkich lub bardzo wielu komórek dla intruzów i w większości wypadków skutecznie B w odpowiedź na dany patogen, co groziłoby szkod­ broni nas przed zakażeniem. liwymi skutkami ubocznymi nadmiernego odczynu Zdarza się jednak, że w sprzyjających dla siebie odpornościowego. Komórki o tej samej swoistości warunkach patogenny drobonustrój (wirus, bakteria, immunoglobulin wywodzące się z tej samej komórki grzyb) lub pasożyt (robak) przełamie bariery odporno­ wyjściowej nazywamy klonem komórkowym. Proce­ ści wrodzonej, wtargnie do ustroju, zacznie namnażać sem, który doprowadza do powstania receptora o da­ się i atakować tkanki. Wówczas, z pewnym opóź­ nej swoistości jest rearanżacja genów immunoglobuli- nieniem, „rusza do ataku” odporność nabyta. Opóź­ nowych2, za której odkrycie [9] Susumu Tonega- nienie wynika z faktu, że struktury intruza (antygeny) w a otrzymał Nagrodę Nobla w 1987 r. (patrz Tab. 1). odmienne od własnych składników ustroju muszą Tak więc, wytwarzając przeciwciała wydzielane do zostać rozpoznane jako obce przez limfocyty (wyspec­ płynów ciała (głównie do osocza krwi), limfocyty jalizowane komórki posiadające odpowiednie swoiste B stanowią główny element swoistej, nabytej odporno­ receptory). Następnie limfocyty te muszą się namnożyć ści humoralnej (gr. humor = płyn). Odporność taką przez szereg podziałów komórkowych, a wreszcie można przenieść z osobnika na osobnika za pomocą przejść w stadium dojrzałe, zdolne do unieczynnienia surowicy (np. bierne uodpornienie ludzi za pomocą lub likwidacji patogenu. surowicy przeciwtężcowej [5, 10]). Od lat sześćdziesiątych znano dwie, funkcjonalnie Z kolei limfocyty T są odpowiedzialne za swoistą odmienne, grupy limfocytów: komórki B, dojrzewające odporność komórkową, tj. taką, którą można prze­ w szpiku kostnym u ssaków, a w kaletce Fabrycjusza nieść z jednego organizmu do drugiego nie za pomocą u ptaków, oraz komórki T, dojrzewające w grasicy [5, surowicy, lecz przez przeniesienie komórek (a ściślej 6]. Komórki B produkują przeciwciała (immuno- limfocytów T). Wiedziano, że limfocyty T bardzo silnie globuliny) uwalniane do osocza krwi i niektórych odpowiadają na niezgodne (inne niż ich własne) anty­ innych płynów ciała. Immunoglobuliny tkwią także geny głównego kompleksu zgodności tkankowej,

Tabela 1. Nagrody Nobla przyznane w dziedzinie fizjologii lub medycyny za osiągnięcia w badaniach immunologicz­ nych

Rok Laureaci Osiągnięcia

1901 E. A. v. Behring (Niem cy) Bierne uodpornienie surowicą odpornościową 1908 1.1. Mieczników (Rosja) i P. Ehr- Mieczników: komórkowa teoria odporności (fagocyty); lich (Niemcy) Ehrlich: pierwsze ogólne teorie odporności swoistej i autotolerancji 1913 C. R. Richet (Francja) Pierwsze doświadczalne wykazanie anafilaksji 1919 J. Bordet (Belgia) Hemoliza z udziałem przeciwciał i dopełniacza 1930 K. Landsteiner (Austria) Układ grup krwi AB0 i prosty test do ich określania przed transfuzją 1951 M. Theiler (USA) Szczepionka przeciw żółtej febrze 1960 F. M. Burnet (Australia) i P. B. Burnet: teoria selekcji klonalnej i tolerancji; Medawar: Madawar (W. Brytania) doświadczalne potwierdzenie tych teorii 1972 G. M. Edelm an (U SA ) i R. R. Budowa cząsteczki immunoglobiny Porter (W. Brytania) 1980 B. Benacerraf (USA), J. Dausset Główny kompleks zgodności tkankowej myszy (H-2) (Francja) i G. D. Snell (USA) i człowieka (HLA) 1984 N. K. Jerne (W. Brytania), G. J. F. Jerne: teorie rozwoju i regulacji układu odpornoś­ Koehler (RFN) i C. Milstein (Ar­ ciowego; Koehler i Milstein: produkcja przeciwciał gentyna) monoklonalnych 1987 S. Tonegawa (Japonia) Genetyka immunoglobulin 1996 P. C. Doherty (Australia) i R. M. Restrykcja MHC Zinkernagel (Szwajcaria)

Opracowano wg [26] i Encyklopedii Powszechnej PWN, t. 3, 1975 i t. 5, 1988.

w błonie komórkowej limfocytów B, stanowiąc ich 7“ ; : , , , , . . T • r Rearanżacja genów immunoglobulinowych została ostat- receptory rozpoznające antygen. Limfocyty B mogą nj0 wielokrotnie omówiona w piśmiennictwie polskim rozpoznawać antygeny w postaci natywnej, rozpusz- [5, 7, 8].

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 67 MHC. Oprócz testów in vivo, stosowanych od kilku­ wic pozwoliło również wyizolować cząsteczki MHC dziesięciu lat do badania odporności komórkowej, i scharakteryzować je biochemicznie jako glikoprotei- takich jak odrzucanie przeszczepów nowotworowych ny [4]. oraz przeszczepów skóry i innych tkanek prawi­ dłowych, wprowadzono już w owym czasie metody in II-3. Biologiczna rola MHC vitro. Należą do nich: test mieszanej hodowli lim­ focytów, w którym mierzy się odpowiedź proliferacyj- Do czasu odkrycia przez Doherty’ego i Z i n - ną limfocytów jednego osobnika (lub szczepu wsob­ k e r n a g 1 a zjawiska restrykcji MHC rola biologicz­ nego zwierząt doświadczalnych, w którym wszystkie na tego kompleksu i znaczenie jego polimorfizmu nie osobniki są teoretycznie jednakowe) na antygeny (zwa­ były znane. Główne zjawisko obserwowane w związku ne alloantygenami) drugiego osobnika (lub szczepu z MHC, bezpośredni powód jego odkrycia — od­ wsobnego) oraz test cytotoksyczności komórkowej, rzucanie przeszczepów odmiennych genetycznie od mierzący zabijanie (lizę) komórek docelowych przez gospodarza — jest sytuacją sztuczną. Wiedziano już limfocyty T cytotoksyczne [4]. Poza bezpośrednią wprawdzie, że zdolność ustroju, a ściślej jego lim­ funkcją tzw. efektorową, czyli efektem cytotoksycznym focytów T, do odpowiedzi na proste syntetyczne (zabijaniem komórek docelowych) limfocyty T speł­ antygeny peptydowe, a nawet na niektóre natywne niają ważne funkcje regulujące działanie układu od­ antygeny białkowe, jest regulowana przez geny sprzę­ pornościowego. Przede wszystkim limfocyty T okazały żone z MHC, tzw. geny zdolności do odpowiedzi się niezbędne (jako tzw. komórki T wspomagające, odpornościowej, Ir (Immune response) [4], lecz nie helper T cells) dla wytwarzania przeciwciał przez znano mechanizmu tej regulacji. limfocyty B przeciw ogromnej większości antygenów W ciągu dziesięciolecia poprzedzającego doświad­ [5, 6]. Wiadomo było, że podobnie jak limfocyty B, czenia Zinkernagla i Doherty’ego inni ba­ limfocyty T cechuje klonalnie rozdzielona swoistość dacze wielokrotnie byli już o krok od dokonania wobec rozpoznawanych antygenów, choć molekularne odkrycia restrykcji MHC, lecz za każdym razem podłoże tej swoistości nie było jeszcze znane. obowiązujące w owym czasie teorie powstrzymywały ich przed postawieniem „kropki nad i”. Pierwszym II-2. Główny kompleks zgodności tkankowej takim momentem było odkrycie wspomnianych już (MHC) genów Ir (odpowiedzi odpornościowej). Nawet wy­ krycie najważniejszych genów Ir w obrębie MHC nie Główny kompleks zgodności tkankowej (MHC), pozwoliło immunologom skojarzyć tych faktów i wy­ który już kilkakrotnie tu wspomniano, został opisany sunąć hipotezy, że geny Ir i geny MHC są tym samym. u myszy, człowieka, innych ssaków oraz innych kręgo­ Przeciwnie, wysuwano nawet teorię, że geny Ir kodują wców, nie wyłączając płazów i ryb [4, 11, 20, 27, 28]. receptor antygenu na limfocycie T [4], Jest to zespół ściśle sprzężonych ze sobą genów, Drugim momentem było spostrzeżenie, że odpor­ kodujących cząsteczki występujące na powierzchni ność niektórych szczepów myszy na pewne wirusy komórek. Podstawą do identyfikacji antygenów kodo­ chorobotwórcze jest związana z MHC. Trzecim — wy­ wanych przez MHC była przede wszystkim reakcja kazanie, że współpraca limfocytów T z innymi komór­ odrzucania przeszczepu in vivo (najpierw przeszczepów kami układu odpornościowego (makrofagami, lim­ komórek nowotworowych, później także przeszcze­ focytami B), konieczna dla rozwoju wielu typów pów skóry i innych tkanek i narządów), a następnie jej odpowiedzi humoralnej i komórkowej, wymaga zgod­ odpowiedniki in vitro (jak już wspomniano wyżej, ności w MHC [4]. mieszana hodowla limfocytów i cytotoksyczność ko­ W wielu dyscyplinach nauki świetnych odkryć mórkowa). Jednocześnie zaczęto produkować surowi­ dokonali badacze, którzy dopiero wkroczyli do danej ce odpornościowe, pozwalające określać antygeny dziedziny i nie myśleli według schematów narzuconych zgodności tkankowej w serologicznym teście cytotok­ przez aktualnie obowiązujące teorie, tak jak ludzie sycznym z udziałem dopełniacza — metodzie znacznie pracujący na tym polu od lat [12]. Podobnie było szybszej i tańszej niż metody komórkowe. Testy sero­ w naszym przypadku: Zinkernagel i Doherty logiczne i komórkowe wykazały ogromną różnorod­ byli młodymi ludźmi tuż po doktoracie, byli jeszcze ność (polimorfizm) antygenów MHC; stwierdzono to obaj nowicjuszami w immunologii, a w dodatku u myszy, ludzi i większości innych zbadanych gatun­ pracowali w wielkim geograficznym oddaleniu od ków kręgowców. Polimorfizm ten polega na występo­ głównych ośrodków naukowych. waniu w obrębie gatunku bardzo wielu allelicznych form genu kodującego daną cząsteczkę MHC, przy III. Krótkie życiorysy laureatów czym każdy z tych alleli występuje w populacji osob­ ników tego gatunku ze względnie niską częstością. Np. Peter C. D o h e r t y, Australijczyk, ukończył medy­ mysi MHC, zwany H-2, występuje w bardzo wielu cynę weterynaryjną i po krótkiej praktyce w stanowej postaciach allelicznych oznaczanych małymi literami uczelni weterynaryjnej w Brisbane wyjechał na stypen­ alfabetu, np. H-2b, H-2d, H -2k itd. Zastosowanie suro­ dium doktoranckie do Instytutu Badawczego More-

68 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 dun w Edynburgu (Szkocja). Uzyskał tam stopień H-2d, lecz nie H-2k. Wyniki te były pozornie zgodne doktora za badania nad wirusowymi chorobami z panującą wówczas teorią, że do oddziaływań między owiec, problemem o ogromnym znaczeniu dla gos­ komórkami układu odpornościowego niezbędna jest podarki australijskiej. Następnie powrócił do Austra­ identyczność ich MHC („like-like interaction” = od­ lii, gdzie uzyskał zatrudnienie w Szkole Badań Medy­ działywanie poprzez podobieństwo lub „intimacy mo­ cznych im. Johna Curtina w Canberra. Tam też del” = oddziaływanie przez bliski kontakt). Jednakże wkrótce przybył, do tego samego laboratorium, sty­ następne doświadczenia Zinkernagla i Dohe- pendysta Zinkernagel i wówczas zaczęli praco­ r t y ’ e g o opublikowane w pół roku później [3] wać razem. wykazały, że jest inaczej, a więc teoria podobieństwa Rolf M. Zinkernagel, Szwajcar, ukończył me­ nie jest prawdziwa. Wyniki te uzyskano w skom­ dycynę w Bazylei, zamierzając pierwotnie zostać chi­ plikowanym doświadczeniu z przenoszeniem komórek rurgiem. Jednakże po kilkumiesięcznym stażu w klini­ (Ryc. 1B): myszom pierwszego pokolenia mieszańców ce chirurgicznej odstąpił od tego zamiaru i zrobił kurs (F,) dwóch szczepów o różnym MHC, mianowicie immunologii. Po doktoracie, zainteresowany choroba­ H-2k i H-2b, wstrzyknięto domózgowo LCMV. Po mi zakaźnymi, złożył podanie o staż podoktorski tygodniu od tych myszy pobrano komórki śledziony w Szkole im. Johna Curtina, uzyskał stypendium i po i przeniesiono je do innych myszy, napromieniowa­ przyjeździe do Australii nawiązał współpracę z D o - nych (czyli ze zniszczonym własnym układem odpor­ h e r t y m [4]. nościowym) i zakażonych LCMV. Myszy-biorcy miały różne antygeny H-2 (H-2k, H-2b lub H-2d). Celem tego IV. Odkrycie restrykcji MHC

Wkrótce po rozpoczęciu wspólnej pracy Doher­ ty i Zinkernagel przeczytali artykuł donoszący, że odporność na wirusa limfocytarnego zapalenia splotu naczyniowego i opon mózgowych (LCMV = Lymphocytic ChorioMeningitis Virus) u myszy jest związana z genem Ir sprzężonym z MHC. LCMV jest zasadniczo nieszkodliwy dla myszy, o ile nie wstrzyk­ nie się go bezpośrednio do mózgu. Wówczas zakaża komórki wyścielające jamy mózgu i rdzenia i powodu­ je śmierć zwierzęcia. Bezpośrednim powodem śmierci nie jest jednak sam wirus, lecz wywołana przezeń komórkowa odpowiedź odpornościowa: cytotoksycz- ne limfocyty T zabijają zakażone komórki rozpoznając na nich antygeny wirusa. W ten sposób zniszczona zostaje bariera krew-mózg i następuje brak równowagi osmotycznej w płynach otaczających mózg [4]. Zinkernagel i Doherty postanowili spraw­ dzić, czy odporność na zakażenie LCM V jest związana ze zdolnością (lub jej brakiem) do wytwarzania cyto- toksycznych limfocytów T skierowanych przeciw temu wirusowi. W tym celu zakażali domózgowo wirusem różne dostępne im szczepy myszy, a po tygodniu pobierali od nich limfocyty śledziony i sprawdzali in vitro ich zdolność do zabijania zakażonych LCMV komórek fibroblastycznej linii L, znakowanych chro­ mem 51 (były to jedyne komórki docelowe stosowane w owym czasie w tamtejszym laboratorium). Myszy wszysikich badanych szczepów, niezależnie jakie po­ siadały MHC, ginęły wskutek zakażenia wirusem (czyli nie potwierdziło się pierwotne doniesienie). Ale ku zaskoczeniu Zinkernagla i Doherty’ego za­ ^ LCMV ^ napromieniowanie całego ciała każone komórki L (H-2k) były zabijane wyłącznie przez limfocyty od zakażonych myszy ze szczepów + liza komórek docelowych — brak lizy posiadających H-2k, ale nie przez limfocyty od szcze­ pów o innym H-2 [2] (Rye. 1A). W tej samej pracy Ryc. 1. Schematy doświadczeń Zinkernagla i Doher­ ty ’ e g o, które doprowadziły do odkrycia restrykcji MHC. autorzy wykazali, że zakażone LCM V makrofagi H-2d A — doświadczenia opisane w pierwszym doniesieniu [2]. były zabijane przez limfocyty od zakażonych myszy B — doświadczenia opisane w drugim doniesieniu [3].

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 69 przenoszenia komórek była ich restymulacja anty­ antygeny wirusa i potwierdzeniu natychmiast tego genami wirusa u myszy o różnym H-2. Gdyby teoria zjawiska w odpowiedzi na inne antygeny, nastąpił podobieństwa była prawdziwa, wówczas limfocyty bujny rozwój immunologii. Tutaj wyliczymy tylko te H-2k/H-2b (tzn. posiadające zarówno H-2k jak i H-2b) dalsze odkrycia, które są bezpośrednio związane z rolą restymulowane wirusem u myszy H-2b zabijałyby cząsteczek MHC w rozpoznawaniu antygenów przez komórki H-2k tak samo wydajnie, jak limfocyty re­ limfocyty T. stymulowane u myszy H-2k. Tak jednak nie było (Ryc. a) Dwie klasy cząsteczek MHC: odkryto, że oprócz IB): tylko komórki T restymulowane wirusem w śro­ znanych już cząsteczek MHC (nazywanych obecnie dowisku H-2k były w stanie zabić komórki docelowe cząsteczkami klasy I), prezentujących obce antygeny H-2k. Z wyniku tego Doherty i Zinkernagel limfocytom T cytotoksycznym, istnieją cząsteczki wyciągnęli wniosek, że przeciwwirusowe limfocyty T, MHC klasy II [4, 5, 14, 20, 27]. Mają one inną budowę aby zabić zakażoną wirusem komórkę docelową, i odgrywają rolę w przedstawianiu antygenu lim­ oprócz antygenu wirusa muszą na niej rozpoznać focytom T, zwanym pomocniczymi, przez makrofa- cząsteczkę MHC i to tę samą, którą rozpoznały przy gi, limfocyty B i inne komórki układu odpornoś­ poprzednim kontakcie z tym antygenem. Doherty ciowego nazwane komórkami prezentującymi antygen i Zinkernagel zaproponowali wówczas, że lim­ [4-6, 14]. focyty T rozpoznają „zmienione własne” („altered self’) b) Dwie subpopulacje limfocytów T: równocześnie antygeny H-2, a czynnikiem zmieniającym może być odkryto, że właściwości cytotoksyczna i wspomagają­ wirus, modyfikacja chemiczna itp. Zgodnie z tą hipo­ ca nie są funkcją tych samych limfocytów T zależnie od tezą, silna reakcja na obce antygeny (alloantygeny) okoliczności, lecz dwu odrębnych ich subpopulacji, MHC miała być również następstwem rozpoznania oznaczanych dziś jako komórki CD 8+ (cytotoksyczne) zmienionych (w tym przypadku genetycznie) własnych i CD 4+ (wspomagające) [14-16]. Obecne na powierz­ cząsteczek MHC [3, 13]. Chociaż autorzy ci nie znali chni tych komórek cząsteczki CD8 i CD4 odgrywają oczywiście molekularnego mechanizmu tej zmiany, również ważną rolę w dojrzewaniu limfocytów możemy z perspektywy 22 lat powiedzieć, że ich T w grasicy [ 17]3. ówczesny pogląd był zasadniczo słuszny. Postaramy c) Każda z tych subpopulacji limfocytów T rozpo­ się to wykazać w dalszej części tego artykułu. znaje antygeny prezentowane przez inną klasę cząs­ Publikacja opisująca omówione wyżej wyniki [3] teczek MHC: klasę I rozpoznają komórki CD8 + , klasę podziałała jak grom z jasnego nieba: inni badacze II — komórki C D 4+ [14, 16, 17]. swoistości limfocytów T natychmiast zreinterpretowa- d) Przeciwciała monoklonalne [5, 8, 18] przeciw li swoje dotychczasowe wyniki i podjęli dalsze eks­ MHC umożliwiły izolowanie tych cząsteczek w czystej perymenty dla sprawdzenia słuszności teorii restrykcji postaci i ich scharakteryzowanie biochemiczne. MHC w ich układach doświadczalnych. Okazało się, e) Krystalizacja czystych cząsteczek MHC i ich że zjawisko opisane przez Zinkernaglai Dohe­ analiza rentgenowska pozwoliła na dokładne poznanie rty ’ e g o występuje również w innych badanych budowy cząsteczek obu klas [19, 20]. Najważniejszym układach i jest ogólną zasadą rozpoznawania anty­ dla restrykcji MHC fragmentem cząsteczki jest część genu przez limfocyt T. Jest ono również wytłumacze­ dystalna (najdalsza od powierzchni komórki), zawiera­ niem roli genów Ir (choć zrozumienie tego, że to jąca bruzdę, która może wiązać antygeny. właśnie cząsteczki MHC są produktami „genów Ir”, f) Dzięki zbadaniu ich struktury odkryto, że cząste­ przyszło w parę lat później). „Pokazywanie” obcego czki MHC nie wiążą na ogół całych białek, lecz antygenu limfocytowi T przez cząsteczkę MHC na peptydy powstałe z ich częściowej degradacji proteoli­ powierzchni innej komórki nazwano „prezentacją an­ tycznej [5, 20,21], Aminokwasy peptydu nie schowane tygenu” (antigen presentation). w bruździe MHC, lecz wystające z niej na zewnątrz Nie ulega oczywiście wątpliwości, że gdyby Zin­ mogą wchodzić w kontakt z TCR, za którego pośred­ kernagel i Doherty nie odkryli restrykcji nictwem limfocyt T jednocześnie rozpoznaje cząstecz­ MHC, zjawisko to zostałoby wcześniej lub później kę MHC i związany przez nią peptyd. Kompleks poznane przez innych, którzy już byli tego bardzo MHC-peptyd jest to właśnie „zmodyfikowane własne bliscy. Dlatego słyszy się głosy niektórych immunolo­ M HC” postulowane 22 lata temu przez Doher­ gów, że Nagroda Nobla nie należała się Doher- ty’ego i Zinkernagla. ty’emu i Zinkernaglowi lub nie tylko im. g) Izolowanie, oczyszczanie i sekwencjonowanie Tym niemniej, to właśnie ci dwaj młodzi wówczas peptydów naturalnie związanych w komórce przez ludzie dokonali tego odkrycia i ich zasługa jest niepod­ ważalna. 3 Za oba wspomniane cykle prac: odkrycie podziału lim­ focytów T na subpopulacje CD 8+ i CD 8- (= CD4 + ) oraz udowodnienie roli cząsteczek CD8 i CD4 w selekcji lim­ V. Konsekwencje odkrycia Zinkernagla focytów T w grasicy, prof. Paweł Kisielów z Instytutu i Doherty’ego Immunologii i Terapii Doświadczalnej im. L. Hirszfelda PAN we Wrocławiu, pracujący obecnie w Bazylejskim Instytucie Immunologii, otrzymał w 1993 r. Nagrodę im. Po odkryciu restrykcji MHC w odpowiedzi na Jurzykowskiego, zwaną „polskim Noblem”.

70 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 cząsteczki MHC obu klas doprowadziły do określenia w pewnych, niekorzystnych dla ustroju okolicznoś­ reszt aminokwasowych niezbędnych dla związania ciach własne peptydy mogą zostać rozpoznane jako peptydu przez daną cząsteczkę MHC czyli do ustalenia rzekomo obce i wywołać reakcję autoagresywną. Pro­ tzw. motywów aminokwasowych peptydów wiąza­ wadzi to do rozwoju choroby autoimmunizacyjnej. nych przez poszczególne cząsteczki obu klas [21 ]4. Ma Dokładne poznanie molekularnych mechanizmów le­ to ogromne potencjalne znaczenie praktyczne dla żących u podłoża tego rodzaju chorób może pomóc opracowania szczepionek immunizujących (np. przy w znalezieniu skutecznych sposobów ich leczenia. chorobach zakaźnych i nowotworach) lub odczulają­ Próby takie są już obecnie podejmowane. cych (przy chorobach autoimmunizacyjnych). W razie zakażenia ustroju zarazek wytwarza sam h) Odkrycie i zsekwencjonowanie genów obu łań­ swoje białka lub zmusza komórki gospodarza do ich cuchów polipeptydowych receptora antygenu limfocy­ produkcji. Peptydy wywodzące się z tych białek poja­ tów T [22] spowodowało następny przełom w bada­ wiają się na powierzchni komórek gospodarza dzięki niach nad swoistością limfocytów T. M.in. przeniesie­ prezentującym je cząsteczkom MHC. Stanowi to syg­ nie (transfekcja) genów receptora antygenu z jednego nał dla układu odpornościowego, że pojawiło się coś klonu limfocytów T do drugiego pozwoliło wykazać, obcego. Rozpoczyna się wówczas swoista reakcja że ten sam receptor wystarcza dla rozpoznania zarów­ odpornościowa przeciw patogennemu drobnoustrojo­ no cząsteczki MHC jak i prezentowanego przez nią wi. Poznanie restrykcji MHC i jej molekularnego antygenu [23]. Dokładne krystalograficzne zbadanie mechanizmu umożliwia racjonalne poszukiwanie bez­ budowy receptora antygenu limfocytów T [24, 25] piecznych, syntetycznych szczepionek przeciw wielu pozwoli na ostateczne zdefiniowanie jego regionów patogenom. kontaktujących się z cząsteczką MHC i z peptydem. Powyższy przegląd nie wyczerpuje listy osiągnięć VI. Zakończenie immunologii, będących następstwem zrozumienia re­ strykcji MHC. Chcieliśmy tu tylko zasygnalizować Na zakończenie ceremonii wręczenia zeszłorocz­ najważniejsze z nich. Można przypuścić z dużym nych Nagród Nobla odbył się bankiet, w czasie prawdopodobieństwem, że wiele z wymienionych wy­ którego jeden z laureatów każdej Nagrody musiał żej odkryć również zostanie nagrodzonych „Noblem” wygłosić toast. Rolf C. Zinkernagel, przemawia­ i to w niedalekiej przyszłości. Lista nagród Nobla jąc w imieniu swoim i Petera M. Doherty’eg o, w dziedzinie fizjologii lub medycyny przyznanych podzielił pracowników nauki na zbieraczy, klasyfika­ w ostatnich kilkudziesięciu latach za odkrycia im­ torów, poszukiwaczy, rzemieślników, artystów, po­ munologiczne (Tab. 1) świadczy o wielkim i wciąż etów nauki, filozofów oraz mistyków i wyznał, że Peter rosnącym znaczeniu tej gałęzi nauk biomedycznych. należy do kategorii mistyków, a on sam do zbieraczy. Tak więc odkryta przez Zinkernagla i Do- Jak widać, połączenie żmudnego zbieracza danych herty’ego restrykcja MHC polega, jak wiemy z „mistykiem” umiejącym dojrzeć możliwość ich inter­ dzięki zasygnalizowanym tu odkryciom, na molekula­ pretacji przeoczoną do owej pory przez innych bada­ rnych mechanizmach obróbki i prezentacji antygenu czy przyniosło znakomity owoc w postaci ujawnienia przez komórki zwane prezentującymi oraz rozpozna­ restrykcji MHC — mechanizmu prezentacji i swois­ niu tego antygenu przez limfocyty T. Peptydy po­ tego rozpoznawania antygenu we wszystkich odczy­ chodzące z proteolitycznej degradacji białek są wiązane nach wykonywanych lub nadzorowanych przez lim­ przez cząsteczki MHC i transportowane na powierzch­ focyty T, czyli w niemal wszystkich reakcjach układu nię komórki, gdzie mogą być rozpoznane przez te odpornościowego. limfocyty T, które posiadają receptor o odpowiedniej swoistości. Rozpoznawany jest zarówno peptyd, jak Artykuł otrzymano 20 lutego 1997 r. i „przedstawiająca” go cząsteczka MHC. W jednoczes­ Zaakceptowano do druku 25 lutego 1997 r. ne rozpoznanie obu tych cząsteczek zaangażowany jest ten sam receptor limfocytu T. Piśmiennictwo W zdrowym, nie zakażonym organizmie cząsteczki

MHC wiążą i „przedstawiają” limfocytom T peptydy Ze względu na ograniczenie objętości pracy wymieniono tylko pochodzące przeważnie z własnych białek ciała. najważniejsze pozycje piśmiennictwa, starając się podawać polskie W prawidłowych warunkach peptydy te nie wywołują podręczniki i prace przeglądowe tam, gdzie informacje w nich zawarte lub cytowana przez nie literatura przedmiotu wystarczy odczynów odpornościowych, ponieważ podczas roz­ zainteresowaniu czytelnikowi do rozszerzenia wiedzy. woju limfocytów T potencjalnie autoreaktywne ich klony są eliminowane lub unieczynniane. Jednakże 1. Nobelfoersamlingen, Karolińska Institutet, Press release, Oc­ tober 7, 1996 2. Zinkernagel RM, Doherty PC (1974) Nature (Lond) 248: 701-702 4 Za te badania prof. Hans-Georg Rammensee, obecnie na 3. Zinkernagel RM, Doherty PC (1974) Nature (Lond) Uniwersytecie Tuebingen, otrzymał szereg prestiżowych 251: 547-548 nagród niemieckich, m.in. im. G. W. Leibnitza i im. P. 4. Klein J (1986) Natural History of the Major Histocom­ Ehrlicha. patibility Complex, Wiley, New York

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 71 5. Jakóbisiak M (1995) w: Immunologia, Wydawnictwo 19. Bjoerkman PJ.Saper M A.Samraoui B, B e n n e 11 Naukowe PWN, Warszawa WS, Strominger JL, Wiley DC (1987) Nature (Lond) 6. Nossal G J V (1993) Świat Nauki 11: 21-29 329: 506-512 7. Janusz M (1992) Kosmos 41: 383-400 20. Falkiewicz B, Liberek B ( 1 996) Post Biochem 42: 41-48 8. Rudnicka W (1992) Kosmos 41: 413-428 21. Rammensee H-G, Friede T, Stevanovic (1995) 9. Tonegawa S (1983) Nature (Lond) 302: 575-581 Immunogenetics 41: 177-228 10. Hyde RM (w druku) Immunologia, Wydawnictwo Medyczne 22. Hedrick SM, Cohen D I, Nielsen E A, Davis MM Urban & Partner, Wrocław (1984) Nature (Lond) 308: 149-153 11. Salter-Cid L, Flajnik MF (1995) Crit Rev Immunol 15: 23 Dembic Z, Haas W, Weiss S, McCubrey J, Kiefer 31-75 H.von Boehmer H, Steinmetz M (1988) Nature (Lond) 12. Beveridge W I B (1960) Sztuka badań naukowych, PZWL, 320: 232-238 W arszawa 24 Bentley GA, Boulot G, Karjalainen K, Mariuz- 13. Doherty PC, Zinkernagel (1975) Lancet (June 28): za R A (1995) Science 267: 1984-1987 1406-1409 25. Fields BA, Ober B, Malchiodi EL, Lebedeva MI, 14. Kuśnierczyk P (1992) Kosmos 41: 349-369 Braden BC, Ysem X, Kim J-K, Shao X, Ward ES, 15. Kisielów P, Hirst JA, Shiku H, Beverly PCL, Mariuzza RA (1995) Science 270: 1821-1824 Hoffman MK, Boyse EA, Oettgen HF (1975) Nature 26. Nobel award for Doherty and Zinkernagel (Lond) 253: 219-220 (1996) Immunol Today 17:541-542 16. Kisielów P (1984) Post Hig Med Dośw. 38: 577-599 27. Falkiewicz B, Liberek B (1996) Post Biochem 42: 17. v o n Boehmer H, Kisielów P (1991) Świat Nauki 12: 340-349 48-56 28. Plytycz B, Seljelid R (1996) Central- Europ J. Immunol 21: 18. Paprocka M (1993) Kosmos 43: 273-284 3-11

Zarząd Główny Polskiego Towarzystwa Biochemicznego zaprasza do udziału w Konkursie na najlepszy wykład akademicki w roku 1 997

Regulamin nagrody

1. Intencją nagrody jest popularyzacja bioche­ niejawnie, a protokół z obrad i inne materiały mii i biologii molekularnej oraz pozyskanie pozostają w dokumentacji Towarzystwa. Na­ materiałów dydaktycznych. grodę uzyska osoba, która otrzyma największą liczbę punktów. Nazwisko zwycięzcy Konkursu 2. Warunkiem wzięcia udziału w Konkursie jest zostanie podane do wiadomości Członków Pol­ przygotowanie wykładu na wybrany temat skiego Towarzystwa Biochemicznego w „Po­ uwzględniający najnowsze osiągnięcia w tej stępach Biochemii” oraz w „Listach” . dziedzinie oraz ilustrujących go materiałów w postaci maszynopisu, rysunków i kom­ Materiały konkursowe: maszynopis wykładu, pletu przezroczy. Termin nadsyłania materia­ rysunki, przezrocza i programy komputerowe łów mija 30.04.1997 r. stają się własnością Polskiego Towarzystwa Biochemicznego i będą rozpowszechniane Zarząd Główny Polskiego Towarzystwa Bio­ w placówkach naukowych i dydaktycznych chemicznego zorganizuje sesję, na której zo­ jako wykłady autorskie nagrodzonych osób, staną wygłoszone konkursowe wykłady. Mak­ rekomendowane przez Oddziały Polskiego T o­ symalny czas wystąpienia 2 x 45 minut. warzystwa Biochemicznego. Wymagana jest W 1997 roku sesja odbędzie się na początku pisemna zgoda na przekazanie materiałów na czerwca. Nagroda Główna i wyróżnienia zo­ własność Towarzystwa. Towarzystwo zastrzega staną przyznane w dniu Konkursu. sobie prawo do zakupu materiałów nienagro- dzonych. Członkowie Zarządu Głównego tworzą Komisję Konkursową. Ocenią oni prezentację, wartość Niniejsza wersja regulaminu została uchwalona merytoryczną i dydaktyczną wykładów przyz­ przez Zarząd Główny Polskiego Towarzystwa nając od 0 do 10 punktów. Komisja obraduje Biochemicznego w dniu 5 listopada 1 990 roku.

72 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 Synergistyczne efekty ¡mmunomodulatorów typu mura- mylopeptydów i innych leków stosowanych wspólnie w che­ mioterapii

Synergistic effect of immunomodulators of muramyl peptides type with other medicines

KRYSTYNA DZIERZBICKA1 MAGDALENA GOZDOWSKA2 ALEKSANDER M. KOŁODZIEJCZYK3

Spis treści: Contents:

I. Wstęp I. Introduction II. Muramylodipeptyd — MDP II. Muramyl dipeptide — M D P III. Synergistyczne oddziaływanie muramylopeptydów z an­ III. Synergistic effect of muramyl peptides with antibiotics tybiotykami III-l. Treatment of bacterial infections III-I. Leczenie infekcji bakteryjnych 1II-2. Treatment of fungal infections II1-2. Leczenie infekcji grzybiczych II1-3. Treatment of parasitic infections II1-3. Leczenie infekcji pasożytniczych III-4. Treatment of viral infections III-4. Leczenie infekcji wirusowych IV. Synergistic effect of muramyl peptides with other IV. Synergistyczne oddziaływanie muramylopeptydów z in­ immunomodulators nymi immunomodulatorami IV-1. Synergistic effect of muramyl peptides with treha­ IV-1. Synergistyczne oddziaływanie muramylopepty­ lose diesters dów z diestrami trehalozy IV-2. Synergistic effect of muramyl peptides with en­ IV-2. Synergistyczne oddziaływanie muramylopepty­ dotoxins dów z endotoksynami IV-3. Synergistic effect of muramyl peptides with cyto­ IV-3. Synergistyczne oddziaływanie muramylopepty­ kines dów z cytokinami IV-4. Synergistic effect of muramyl peptides with tuft­ IV-4. Synergistyczne oddziaływanie muramylopepty­ sin dów z tuftsyną V. Synergistic effect of muramyl peptides with cytostatics V. Synergistyczne oddziaływanie muramylopeptydów z cy­ VI. Muramyl peptides adjuvant components for vaccines tostatykami VII. Possibility of clinical applications VI. Muramylopeptydy, adiuwantowe składniki szczepionek VII. Możliwość zastosowań klinicznych

Wykaz stosowanych skrótów: A-l71 monosacharydowy hage colony stimulating factor): GM D — /i-i, 4- N-acetylo- syntetyczny analog Lipidu A (Lipid A Rye. 1) zawierający glukozamylo-MDP; HLA-DR antygeny kodowane przez w poz. C-2 i C-3 (R)-3-hydroksytetradekanoilo- lub (R)-3- -(hydroksytetradekanoiloksylo)-tetradekanoilo-4-fosforano- -glukozaminę; A-172 — monosacharydowy syntetyczny ana­ log Lipidu A zawierający w poz. C-2 i C-3 ( R)-3-(hydroksytet- radekanoiloksyloj-tetradekanoilo- lub (R)-3-tetradekanoilo- ksy-tetradekanoilo-4-fosforano-glukozaminę; A-506 disa- charydowy analog Lipidu A; B30-MDP — 6-0-(2-tetra- decyloheksadekanoilo)-MDP; CGP19835 — zob. MTP-PE; CSF - czynnik stymulujący kolonizację (colony stimulating factor): ED50 — 50-procentowa dawka efektywna (50% effective dose): FCA — kompletny adiuwant Freuda (Freud's complete adjuvant): FUdR — 5-fluoro-2'-dezoksyurydy- na; 5FU — 5-fluorouracyl; G-CSF — czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów (granulocyte colony stimu­ lating factor): GM-CSF — czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów i makrofagów (granulocyte-macrop-

‘Dr inż., 2mgr inż., 3prof. dr hab. inż., Katedra Chemii Organicznej. Politechnika Gdańska, ul. Narutowicza 11/12, Ryc. 1. Lipid A. R1 — reszta laurylowa, R2 — reszta mirystylowa, 80-952 Gdańsk R3 — H

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 73 region DR u człowieka (I-region-associated antigens in man)', kompletny adiuwant Freuda (FCA), nie był immuno- IgG — immunoglobulina klasy G; IL-la — interleukina la; genem, a przede wszystkim był niskotoksyczny i po­ LPS — lipopolisacharyd; LI8-MDP — 6-O-stearoilo-MDP; zbawiony wielu efektów ubocznych, które uniemoż­ MAF — czynnik aktywujący makrofagi (macrophage ac­ tivating factor)', M DP — muramylodipeptyd (N-acetylomu- liwiały kliniczne zastosowanie kompletnego adiuwan- ramylo-L-alanylo-D-izoglutamina); M-CSF — czynnik sty­ ta Freuda [3]. W poszukiwaniu analogów bardziej mulujący wzrost kolonii makrofagów (macrophage-colony selektywnych, o dłuższym czasie działania i wyższej stimulating factor); MDP-Lys(L18) — N 2 (A-acetylo-mura- aktywności zsyntezowano kilkaset analogów MDP. mylo-L-alanylo-D-izoglutamylo)-A6-stearoilo-L-lizyna; Modyfikacje, miały na celu otrzymanie pochodnych MTP-PE — A-acetylo-muramylo-L-alanylo-D-izoglutamy- lo-L-alanylo-2-( 1 2'-dipalmitoilo-sn-glicerolo-3'-hydroksy- M DP o zwiększonej lipofilowości, zarówno poprzez -fosforyloksy)-etyloamid; Murabutide — ester n-butylowy zmiany reszty cukrowej kwasu muraminowego, składu N-acetylomuramylo-L-alanylo-D-glutaminy; nor-MDP — aminokwasowego muramylodipeptydu, jak też po­ analog M DP nie zawierający grupy metylowej w łańcuchu przez modyfikację C-końcowej grupy karboksylowej. bocznym kwasu muraminowego; r-IFN-y — rekombinowa- Tabela 1 przedstawia 9 lipofilowych pochodnych ny interferon gamma; 6-O-stearoilo-fAbu1] MDP — A-acetylo-6-O-steroilo-muramylo-L-a-aminobutyrylo- MDP, które ze względu na swoje właściwości bio­ -D-izoglutamina; TCF — hipoteza immunologicznej kon­ logiczne zostały poddane badaniom klinicznym [4]. troli wzrostu (tissue coding factor); TDM — 6,6'-dimykolilo- -a, a'-D-trehaloza; TNF — czynnik martwicy nowotworu III. Synergistyczne oddziaływanie muramylo- (tumor necrosis factor). peptydów z antybiotykami

I. Wstęp W 1980 r. zauważono, że immunomodulatory typu M DP zwiększają aktywność antybiotyków wywołując Współczesna immunologia jest ukierunkowana głó­ niekiedy addytywny, a często synergistyczny efekt. wnie na stosowanie syntetycznych, chemicznie czys­ Mimo to, większość początkowo prowadzonych ba­ tych związków. Stwierdzenie to dotyczy również adiu- dań eksperymentalnych z udziałem MDP skoncent­ wantów stosowanych w syntetycznych szczepionkach rowana była na wykorzystywaniu immunomodulacyj- nowej generacji. Opisano serie takich związków jak: nych właściwości muramylopeptydów, jako prepara­ muramylopeptydy, pochodne kwasów nukleinowych, tów wzmacniających system odpornościowy organiz­ pochodne zawierające siarkę (np. Levamisol), różne mów w zwalczaniu różnego rodzaju infekcji [5, 6]. polimery (np. kopolimery piranowe, siarczan dekst­ Dopiero w ostatnich latach wykazano, że łączne ranu), glikolipidy (np. lipid A), retinol i inne. Należy podawanie immunomodulatorów typu MDP z róż­ jednak pamiętać, ze związki te stosowane jako im­ nymi chemioterapeutykami jest korzystne w leczeniu munomodulatory wzmagają działanie nie tylko szcze­ niektórych chorób zakaźnych, ponieważ takie podej­ pionek odpornościowych, ale mogą również być stoso­ ście powoduje nie tylko osłabienie układu chorobo­ wane w terapii wielolekowej dając efekty synergistycz- twórczego (patogennego), ale zapewnia również wzma­ ne. W tej publikacji skupimy się na synergistycznym cnianie systemu obronnego organizmu gospodarza. działaniu M DP i jego analogów z różnymi lekami. Poniżej przedstawiamy kilka eksperymentalnych W ostatnich latach pochodne M DP są intensywnie przykładów leczenia infekcji bakteryjnych, grzybi­ badane, ponieważ silnie stymulują odporność humora- czych, pasożytniczych i wirusowych, opartych na syne- lną, komórkową i niespecyficzną organizmu. rgicznym współdziałaniu immunomodulatorów typu MDP i antybiotyków. II. Muramylodipeptyd — MDP III-l. Leczenie infekcji bakteryjnych W 1945 r. Freud opisał możliwość wzmagania odpowiedzi immunologicznej indukowanej za pomocą Profilaktyczne podawanie M DP lub nor-M DP (10 różnych antygenów. Stosowane antygeny rozpuszczo­ mg/kg, 24 godz. przed infekcją i w czasie infekcji) ne lub zawieszone w wodzie, a następnie zemulgowane z prątkami kwasoopornymi w oleju mineralnym dają W zór I. M D P emulsję wodno-olejową zwaną kompletnym adiuwan- tem Freuda (FCA) [1]. Preparat ten, postrzegany jako jeden z najsilniej działających immunostymulatorów, H3C ma ograniczone zastosowanie kliniczne, spowodowa­ H,OH ne licznymi objawami ubocznymi na organizm ludzki. W 1974 r. E 11 o u z i wsp. [2] opisali syntezę A-ace- i ^ c : o N H 2 tylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminy (muramylo- -dipeptyd, MDP, Wzór I), najmniejszej adiuwantowo czynnej cząsteczki otrzymanej na wzór naturalnego COOH fragmentu ściany komórkowej Mycobacterium. Oka­ zało się, że M DP wykazywał dłuższe działanie niż Mur i Ala ! D-izoGln

74 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 Tabela 1. Lipofilowe analogi MDP.

Profil R 1 R4 R6 R biolog.*

OH H — C O C H (C 14H 29)2 OH BT OH H am inoacylo OH AB OH c 5h u c o - C 5H n C O — OH TV p-S-alkanoilo H H H A OH H H L— Lys— s — C O C 17H 35 BTV OH H H L—Ala—OCH2CHCH,OCOC15 BTV

o c o c 15h 31 OH H H L—Ala—cholesterylo—(3) ATV OH H H L—Ala—dipalmitoilo— kefalina ATV (MTP—PE) OH H H GlnOnBu zamiast izoGln A

* A: aktywność adiuwantowa; B: aktywność przeciwbakteryjna; T: aktywność przeciwnowotworowa; V: aktywność przeciwwirusowa skutecznie redukowało 50% efektywną dawkę (ED50) wykorzystywane w terapii antybiotykowej w przypad­ antybiotyku cefroksadyny, u myszy zainfekowanych kach infekcji bakteryjnych, ponieważ wpływają na Klebsiella pneumoniae, Pasteurella multocida, Salmo­ produkcję czynnika stymulującego kolonizację (CSF nella typhimurium, Staphylococcus aureus lub Strep- [12, 13], M-CSF [14], GM-CSF [15], G-CSF [16]). tococus pyogenes, natomiast nie miało wpływu na myszy zainfekowane Streptococcus pneumoniae [7], I1I-2. Leczenie infekcji grzybiczych W doświadczeniach, w których myszom wcześniej podano jedną z dwu lipofilowych pochodnych MDP: W szeregu prac oceniano zdolność licznych pochod­ L18-MDP [8] lub MDP-Lys (L18) (100 pg na mysz, 24 nych M DP (np. nor-MDP, 6-0-stearoilo[Abu']MDP) godz. przed infekcją), zauważono 7-krotną redukcję do redukowania 50% dawki efektywnej (ED50) am- ED 50 cefazołiny (przy infekcji E. coli), gentamycyny foterycyny B, flucytozyny, papulakandyny i innych (przy infekcji Pseudomonas aeruginos) i aminopenicyli- antybiotyków stosowanych do zwalczania infekcji ny (przy infekcji S. aureus), w porównaniu z myszami grzybiczych [17]. Na przykład dawka 0,1 mg/kg kontrolnymi, którym nie podawano muramylopep- pochodnej MDP podana 24 godz. przed infekcją tydów. redukowała ED 50 amfoterycyny B 3-krotnie, nato­ Profilaktyczne dawki M DP zmniejszają śmiertel­ miast wzrost dawki pochodnej MDP do 10 mg/kg ność myszy z zapaleniem otrzewnej wywołanym przez prowadził do 10-krotnej redukcji ED 50 amfoterycyny wewnątrzotrzewnowe wstrzyknięcie mieszanej kultury B. Możliwość obniżania terapeutycznych dawek anty­ bakterii [10]. Całkowitą ochronę (100% przeżycie biotyków przeciwgrzybiczych ma ogromne znaczenie zainfekowanych szczurów) zapewniało profilaktyczne praktyczne, z uwagi na ich wysoką toksyczność dla podanie M DP przed infekcją i leczenie antybiotykiem organizmów wyższych. cefoksytyną, w trakcie infekcji [10]. W przypadku zapalenia płuc wywołanego u myszy (lub szczura) III-3. Leczenie infekcji pasożytniczych przez K. pneumoniae przeżywało 36%, którym poda­ wano sam antybiotyk, cefmenoksym; 60% którym Muramylopeptydy wielokrotnie zwiększają efekt podawano cefmenoksym i MDP-Lys(L 18) przed infek­ działania Glucantime (lek zawierający antymon) w le­ cją, podczas gdy spośród zwierząt nieleczonych, prze­ czeniu leiszmaniozy u myszy i chomików. Zarówno żywało tylko 8% (kontrola) [11]. Glucantime (37,5 mg/kg dziennie po infekcji przez 8-11 Sugeruje się, zatem że muramylopeptydy mogą być dni), jak i M DP (3 mg/kg dziennie 4 i 2 dni przed

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 75 infekcją) oddzielnie były mało skuteczne w leczeniu tej ochrony zwierząt (pawianów) traktowanych MDP choroby, a w połączeniu w podobnych dawkach + TDM przed zarażeniem Schistosoma mansoni i S. prowadziły do całkowitego wyleczenia [18]. haematobium [28]. Nie wykluczono, że wynik ten mógł być spowodowany zastosowaniem nieodpowiednich III-4. Leczenie infekcji wirusowych dawek badanych adiuwantów.

Do nielicznych prac opisujących łączne stosowanie IV-2. Synergistyczne oddziaływanie muramylopep- pochodnych M DP z czynnikiem przeciwwirusowym tydów z endotoksynami należy leczenie myszy z zapaleniem płuc wywołanym przez wirus opryszczki zwykłej typu 1. Podawano im W 1993 r. przeprowadzono badania, które wykaza­ zawarty w liposomach analog MTP-PE (w 3 dniu po ły, że M DP w połączeniu z LPS aktywował uwalnianie infekcji) w połączeniu z lekiem przeciwirusowym, TNF przez psie monocyty. Komórki te, inkubowane 0 nazwie ribavirin. Terapia ta spowodowała wzrost z MDP lub MDP-I-LPS, wykazywały cytostatyczną przeżywalności myszy do 80%, co było sukcesem, aktywność przeciw psim komórkom kostniakomięsa- ponieważ podawanie każdego czynnika z osobna nie ka [29]. Martwica włókniakomięsaka u myszy było skuteczne (MTP-PE — 20%; ribavirin — 0%; BALB/c wzrastała po równoczesnym dożylnym poda­ kontrola — 0%) [19, 20]. niu M DP i LPS [30]. Łączne działanie LPS z MDP było mniej toksyczne, niż samego lipopolisacharydu. IV. Synergistyczne oddziaływanie muramylo- LPS powodował wzrost produkcji interferonu-y u my­ peptydów z innymi immunomodulatorami szy, którym wstępnie podawano M DP [30, 31], Lipid A jest jednym z głównych składników ścian W wielu układach doświadczalnych infekcji badano komórkowych bakterii Gram-ujemnych. Przypisuje synergistyczne oddziaływanie MDP (i jego pochod­ się mu odpowiedzialność za silne, toksyczne właściwo­ nych) z innymi naturalnymi lub syntetycznymi im­ ści lipopolisacharydów bakteryjnych. W ubiegłym munomodulatorami, takimi na przykład jak: TDM dziesięcioleciu położono duży nacisk na prace prowa­ (diestry trehalozy), LPS (lipopolisacharydy), lipid A, dzące do otrzymania analogów lipidu A pozbawio­ czy cytokiny. nych toksycznych efektów przejawianych przez prepa­ raty naturalne. Otrzymane syntetyczne monosachary- IV-1. Synergistyczne oddziaływanie muramylopep- dowe analogi A -l71 i A-172 są 500-1000 razy mniej tydów z diestrami trehalozy toksyczne od naturalnego LPS [32]. W 1991 r. badano aktywność przeciwnowotworową syntetycznych mo- Synergistyczne oddziaływanie MDP z TDM, stymu­ nosacharydowych analogów lipidu A (A-l71) i A-l72) lujące zarówno bakteryjną odporność niespecyficzną, w stosunku do włókniakomięsaka. Komórki włók­ jak i aktywność przeciwnowotworową i przeciwwiru- niakomięsaka (5 x 105) były wszczepione podskórnie sową, stwierdzono na wielu układach eksperymental­ myszom BALB/c (dzień O), a po 7 dniach podano nych in vitro i in vivo [21-23], takich jak rak wątroby dożylnie syntetyczny analog A-172 (50 pg/mysz) i 10 jag świnek morskich, czy grypa lub gruźlica myszy. Wyka­ MDP. Zauważono wyraźne nasilenie hamowania roz­ zano na przykład, że 75 pg TDM plus 150 pg lipo- woju nowotworu przez syntetyczny analog mono- filowej pochodnej B-30MDP lub 6-O-stearoilo-MDP, sacharydowy A-172 we współdziałaniu z MDP (70% wstrzyknięte dożylnie, chronią myszy przeciwko wiru­ w porównaniu do 49% bez MDP). Mimo że aktyw­ sowi grypy w znacznie większym stopniu niż sam ność przeciwnowotworową disacharydowego syntety­ M D P [24]. M DP w połączeniu z TDM nasila reakcję cznego analogu lipidu A (A-506), czy naturalnego LPS, nadwrażliwości typu późnego (DTH) i miano przeciw­ we współdziałaniu z M DP jest wyższa niż syntetycz­ ciał swoistych dla albuminy jaja u szczurów. Wykaza­ nych monosacharydowych analogów lipidu A (A-l71 no doświadczalnie, że w wyniku zastosowania miesza­ i A -l72) i MDP, to stosowanie tych pierwszych jest niny TDM z MDP jako adiuwanta występuje nasilenie ograniczone ze względu na ich silniejsze działanie odpowiedzi immunologicznej przeciwko białkom ścia­ uboczne. ny komórkowej B. abortus [25]. Zarówno MDP jak TDM stymulują rozmaite funk­ IV-3. Synergistyczne oddziaływanie muramylopep- cje makrofagów [26]. Stymulowanie przez M DP mak- tydów z cytokinami rofagów płucnych, a przez TDM makrofagów otrzew­ nowych, przyczynia się do nasilenia odpowiedzi im­ Opisano synergistyczne stymulowanie makrofagów munologicznej u zwierząt zakażonych donosowo A. in situ w mysich pęcherzykach płucnych przez M DP culbertseni lub doustnie T. goudii [26]. MDP, jak podany w liposomach razem z MAF [33]. Praw­ 1 TDM, osobno pośredniczą w stymulowaniu cytotok- dopodobnie makrofagi wymagają wcześniejszego kon­ syczności komórek naturalnych zabójców (NK), od­ taktu z MAF, a MDP stanowi sygnał dodatkowy grywających ważną rolę obronną w przypadku zaka­ wyzwalający/wzmacniający reakcję. Wielokrotne żeń wirusowych [27]. Nie udały się jednak próby wstrzyknięcie liposomów zawierających M DP + MAF

76 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 powodowało zahamowanie przerzutów guza do płuc doniesienia literaturowe na temat łącznego działania i węzłów chłonnych i zapewniało przeżywanie 50% M DP i tuftsyny pojawiły się w 1993 r. Dotyczyły one myszy. W innych badaniach opisano wzrost przeciw- między innymi niezdolnych do hamowania wewnątrz­ nowotworowej aktywności zwierzęcych makrofagów komórkowej replikacji Brucella abortus makrofagów i ludzkich monocytów po podaniu M DP łącznie z sutka wołowego. Podanie tuftsyny i M DP przy­ z interferonem-y (IFN-y) [34], Stymulacja taka była wracało makrofagom tę właściwość. Współdziałanie swoista gatunkowo. I w tym wypadku MDP wzmac­ syntetycznej pochodnej M DP (GMDP), o wysokiej niał stymulację zapoczątkowaną interferonem-y, a wy­ aktywności adiuwantowej, z tuftsyną wykazano w tes­ rażoną w postaci wzrostu ekspresji HLA-DR i recep­ tach immunologicznych, stwierdzając stymulację pro­ tora fragmentu Fc przeciwciał, wzmożonego metaboli­ dukcji przeciwciał przeciw albuminom jaja, stymulację zmu utleniającego oraz wzrostu aktywności przeciw- reakcji nadwrażliwości typu późnego (DTH) i stymula­ wirusowej i przeciwnowotworowej. Okazało się jed­ cję fagocytozy [43]. Mieszanina G M D P z tuftsyną nak, że podawanie zamkniętej w liposomach mieszani­ i GMDP połączony wiązaniem kowalencyjnym z tuft­ ny r-IFN-y z MDP, zapewniało dużą aktywność syną podawana w soli fizjologicznej wykazywała wyso­ i znosiło swoistość gatunkową aktywowania cytotok- ką, porównywalną z IFA (niekompletnym adiuwan- sycznej funkcji makrofagów i monocytów przez inter- tem Freuda), aktywność adiuwantową. feron-y [35]. Monocyty ludzi zdrowych stymulowane hydrofilową pochodną nor-MDP jednocześnie z IFN- V. Synergistyczne oddziaływanie muramylo- -y uwalniają TCF odpowiedzialny za własności cyto- peptydów z cytostatykami lityczne w stosunku do komórek zmienionych nowo- tworowo [36], Natomiast lipofilowa pochodna MTP- Liczne badania potwierdziły, że makrofagi wątroby -PE podana razem z IFN-y zwiększa ekspresję anty­ mogą być aktywowane in vitro, w wyniku inkubacji genów zgodności tkankowej MHC klasy I i II, powo­ z różnymi immunomodulatorami, takimi jak MDP, dując jednocześnie obniżenie ilości antygenów CD 14 MTP-PE, czy lipopolisacharydy [44-46]. Sprawdzano [37]. W warunkach in vitro IL-2 + M DP (1-lOpg/ml) też ewentualne efekty działania leków cytostatycznych wzmaga produkcję przeciwciał, a IL-4 + M DP (1- w aktywowaniu makrofagów wątroby [47], Oceniano -10pg/ml) powoduje wzrost proliferacji preaktywowa- efekt działania 5-fluorouracylu (5FU) i 5-fluoro-2'-dezo- nych limfocytów B [38, 39]. ksyurydyny (FłJdR) na makrofagi wątroby uprzednio W 1992 r. przeprowadzono eksperymenty [40], któ­ aktywowane immunomodulatorami, w tym MDP rych celem było zbadanie czy współdziałanie pochodnej w liposomach. Nie wykazano by 5FU czy FUdR M DP (CGP19835) z interferonem-y lub IL-2 może wpływały na aktywność makrofagów, natomiast w po­ zahamować przerzuty do płuc myszy komórek nowo­ łączeniu z M DP aktywność fagocytarna wzrastała, co tworowych nerkowego gruczolakoraka. Po 10 dniach może świadczyć o efekcie synergistycznym. od wszczepienia myszom BALB/c nerkowych komórek gruczolakoraka usunięto im chirurgicznie nerkę z lokal­ VI. Muramyłopeptydy, adiuwantowe nym nowotworem, po czym dożylnie podawano lipo- składniki szczepionek somy, zawierające pochodną MDP i interferon-y lub interleukinę-2. Podawanie systemowe liposomalnej Syntetyczne muramylopeptydy nie wywołują szkod­ C G P 19385 łącznie z interferonem-y lub interleukiną-2 liwych efektów ubocznych cechujących kompletny znacznie redukowało liczbę płucnych przerzutów no­ adiuwant Freuda, w tym dolegliwości autoimmuniza- wotworu u myszy z wyciętą nerką. Wyniki te zdają się cyjnych. Bada się więc ich aktywność adiuwantową sugerować, że podawanie liposomów zawierających zwiększającą skuteczność szczepionek uodparniają- syntetyczne aktywatory makrofagów, takie jak pochod­ cych. Co więcej, aktywność adiuwantową muramylo- ne MDP, w połączeniu z cytokinami typu interferonu-y, peptydów można zwiększyć poprzez ich kowalencyjne czy interleukiny-2 może okazać się skuteczne w zwal­ przyłączenie do antygenu. Skórnej leiszmaniozie u my­ czaniu choroby. Ciekawe, że muramylopeptydy właśnie, szy BALB/c zapobiegano przez stosowanie odpowied­ zarówno w badaniach in vitro jak i in vivo [4,41, 15, 16], nio oczyszczonego antygenu i MDP. Ludzkich ochot­ stymulują różnicowanie komórek produkujących cyto- ników udało się uodparniać na tę infekcję przez kiny jak i produkcję samych cytokin. dodawanie do szczepionek apirogennego Murabutide jak adiuwanta [48], IV-4. Synergistyczne oddziaływanie muramylopep- Jednym z najbardziej obiecujących adiuwantów jest tydów z tuftsyną „Syntex adjuvant formulation” (SAF), zawierający M DP [Thr] w emulsji ze skwalenem i Tween 80 Tuftsyna jest naturalnie występującym tetrapepty- stosowany w szczepionkach przeciwko wirusowi ko­ dem (Thr-Lys-Pro-Arg), aktywującym wiele funkcji ciej białaczki. Zapoczątkowano też próby kliniczne ze makrofagów i granulocytów, takich jak fagocytoza, szczepionkami zawierającymi SAF przeciwko nastę­ pinocytoza, ruchliwość, chemotaksja, aktywność bak­ pującym infekcjom: wirusem małpiego zespołu nabyte­ teriobójcza i przeciwnowotworowa [42]. Pierwsze go niedoboru odporności (SAIDS), wirusami grypy,

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 77 wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV), wirusem nomodulatorów typu M D P musi być szczegółowo Epstein-Barra (EBV) i wirusem opryszczki zwykłej określony ich toksykologiczny profil mimo, że pochod­ (HSV) [49], ne M D P uważane są za mało toksyczne [57]. Synergis- Jednym ze znacznych osiągnięć immunologii klini­ tyczne oddziaływanie immunomodulatorów typu cznej są tzw. szczepionki II generacji, wolne od niebez­ M D P z innymi lekami chemioterapii jest nadal szero­ piecznych zanieczyszczeń pochodzenia biologicznego. ko badane w warunkach in vitro i in vivo pod kątem ich W miejsce zdezaktywowanych bakterii, wirusów, czy potencjalnych możliwości w leczeniu zakażeń i nowo­ pasożytów, całych lub ich fragmentów, stosuje się tworów. określone peptydy będące naturalnymi determinan­ tami antygenowymi różnych mikroorganizmów cho­ Podziękowanie Pani dr Małgorzacie Stachowiak, która robotwórczych. Same antygeny peptydowe wykazują sprawdzała manuskrypt pod kątem terminologii medycznej, bardzo słabą aktywność immunizacyjną, można ją Komitetowi Badań Naukowych za finansowanie pracy w ra­ mach projektu badawczego Nr 6P206001 07. jednak zwiększyć przez przyłączenie ich do okreś­ lonych nośników. Dalszy wzrost antygenowości moż­ Artykuł otrzymano 12 czerwca 1996 r. na osiągnąć przez równoczesne podawanie typowych Zaakceptowano do druku 2 stycznia 1997 r. adiuwantów, najczęściej pochodnych M DP lub M DP chemicznie połączonych z układem hapten-nośnik [50]. Przykładem może być szczepionka antykoncep­ Piśmiennictwo cyjna przebadana na 30 australijskich kobietach. Skła­ da się ona z syntetycznego peptydu, odpowiadającego 1. Freud I, Sommer M, Walter (1945) Science 102: 200-202 2. Ellouz F, Adam A, Ciorbarn R, Lederer E (1974) fragmentowi 109-145 części ß podjednostki ludzkiej Blochem Biophys Res Commun 59: 1317-1325 gonadotropiny kosmówkowej, związanego z inakty- 3. Chedid L, Lederer (1978) Blochem Pharmacology 27: wowaną toksyną (toksoid) dyfterytu, emulgowanego 2183-2186 4. Baschang G (1989) Tetrahedron 45: 6331-6360 w mieszaninie skwalen-Arlacel i zawierającego nor- 5. Dukor P, Schumann G (1987) W: M ajde JA (red) -M DP jako adiuwant [51]. Immunopharmacology of Infections Diseases: Vaccine Adju­ Podejmowane są próby otrzymywania szczepionek vants and Modulators of Non-Specific Resistance. Alan R. Liss, New York, str 255-265 zawierających kopolimery więcej niż jednego anty­ 6. Par ant M (1987) W: Majde JA (red) Immunopharmacology genowego determinanta z adiuwantem, co może umoż­ of Infections Diseases: Vaccine Adjuvants and Modulators of liwić otrzymanie szczepionek poliwalentnych. Przetes­ Non-Specific Resistance. Alan R. Liss, New York, str 235-244 7. Dietrich FM,Sackmann W, Zak O, Dukor P (1979) towano, między innymi, szczepionkę tetrawalentną In: Nelson JD, Grassi C, eds current Chemotherapy and wywołującą w obecności Murabutide wytwarzanie infections disease. Proceedings of the 11th International Cong­ przeciwciał dla czterech antygenów inaktywowanych resses of Chemotherapy and the 19th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Vol 2. Washington, paciorkowców oraz zarazków takich chorób, jak: DC: American Society for Microbiology, str 1730-1732 dyfteryt, malaria, zapalenie wątroby [52]. Wykazano 8. Osada Y, Mitsuyama M,Une T (1982) Infect Immun 37: także wysoką przydatność adiuwantową fosforowej 292-300 9. OtaniT, UneT, Osada Y (1988) Arzneimittelforschung 38: pochodnej M DP (MTP-PE) między innymi w szcze­ 969-976 pionce przeciwko wirusowi typu I (HIV-1) oraz 10. Dunn CW, Horton J W, Walker OB (1989) Am J Surg w szczepionce (IW ) przeciwko grypie [53, 54]. 157: 548-551 11. Tatara O, N a k a h a m a C, S o ej i m a R, et al. (1989) In: Rubinstein R, Adam D, eds. Recent advances in chemotherapy. VII. Możliwość zastosowań klinicznych Proceedings of the 16th International Congress of Chemot­ herapy. Vol 1. E. Lewin-Epstein, Jerusalem 34: 1-2 12. Yamaguchi F, Akasaki M, Tsukada W (1988) Arz­ Muramylopeptydy oraz ich syntetyczne analogi neimittelforschung 38: 980-983 znajdujące się w trakcie zaawansowanych badań klini­ 13. Galelli A, Chariot B, Phillips NC, Chedid cznych, dają obiecujące wyniki. W tabeli 1 wymieniono L (1989) Cancer Res 49: 810-815 14. Akahane K , Yamaguchi F, Kita Y, Une T, Osada pochodne M DP szczególnie ważne z punktu widzenia Y (1990) Arzneimittelforschung 40: 179-183 farmakologii. Z dotychczasowych doświadczeń wyni­ 15. Brondy VC, Kaushansky K, Shoemaker S G, A g - ka, że połączona chemioterapia z udziałem M DP jest garwal BB, Adamson J W (1990) J Immunol 40: 3789- -3794 najczęściej skuteczna wtedy, gdy M DP jest podawany 16. Shimoda K, Okamura O, Kawasaki C, Omori F, profilaktycznie (24 godz. lub więcej przed infekcją). Matsuguchi T, Niho Y (1990) Int J Immunopharmacol 7: Optymalna kombinacja stosowanych czynników po­ 25729-736 17. Sackmann W, Dietrich FM (1981) In: Periti P, G rassi winna uwzględniać profilaktycznie działającą dawkę GG, eds. Current chemotherapy and immunotherapy. Proce­ immunomodulatora, czas jego podania i właściwą edings of the 12th International Congress of Chemotherapy. Vol dawkę chemioterapeutyku [55, 56]. Wysuwa się suges­ 2. Washington, DC: American Society for Microbiology, str 1162-1164 tie, że kliniczne stosowanie immunostymulujących 18. Adinolfi LE, Bonventre PF, Vander Pas M, dawek MDP, w połączeniu z terapią antybiotykową, Eppstein DA (1985) Infect Immun 48: 409-416 może dać dobre rezultaty w osłanianiu grup wysokiego 19. Dietrich FM, Hochkeppel HK, Lukas B (1986) Int J Immunopharmacol 8: 931-942 ryzyka, szczególnie pacjentów z neutropenią. Jednak 20. GangemiJD, Nachtigal M, Barnhart D, Krech L, przed rutynowym powszechnym stosowaniem immu- Jani P (1987) J Infect Dis 155: 510-517

78 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 21. Yarkoni E, Lederer E, Rapp H (1981) Infect Immun 32: 40. Dinney CPN, Utsugi T, Fidler IJ, von Eschen­ 273-276 bach AC, Killion JJ (1992) Cancer Research 52: 1155-1161 22. McLanghlin CA, et al. (1980) Science 208: 415-416 41. Dinarello CA, Krueger JM (1986) FASEB J 45: 23. Masihi KN, Brenmer W, Azuma I, Lange W, 2545-2548 Muller S (1984) Infect Immun 43: 233-237 42. Price RE, Templeton J W, Smith R, Adams LG 24. Masihi KN, Brehmer W, Lange W, Ribi E, (1993) Veterinary Immunology and Immunopathology 36: 265-279 Schwartzman S (1984) J Biol Resp Modif 3: 663-671 43. Titov VM, Meshcheryakova E A, Balashova TA, 25. Lederer E (1986) Int J Immunotherapy 4: 267-278 et al. (1995) Int J Peptide Protein Res 45: 348-355 26. Masihi KN, Bhaduri CR, Werner H, Janitschke 44. Kemeny N (1983) Semin Oncol 10: 148-158 K, Lange W (1986) Int Archs Allergy appl Immun 81: 112-117 45. Daemen T, Veninga A, Dijkstra J, Scherphog 27. Masihi KN, Lange W, Rhode-Schulz B (1987) G L (1989) J Immun 142: 2469-2474 Cancer Immunol Immunother 24: 19-24 46. Daemen T, Veninga A, Roerdiuk FH, Scherphof 28. Sturrock R. F, Cottrell BJ, Mahmond A A F, Che­ G L (1989) Biochem Biophys Acta 991: 145-151 did L, Kimani R (1985) Parasitology 90: 101-104 47. Daemen T, Regts J, Morselt H, Scherphof GL 29. Kurzman ID, Shi FE, MacEwen G (1993) Veterinary (1992) Int J Immunopharmac 14: 857-864 Immunology and Immunopathology 38: 45-56 48. Vouldoukis 1, Ogunkolade BSW, Frommei D, 30. Bloksma N, Hofhuis F M A, Wi Ilers JMN (1984) Alier N, Monjour L (1988) Experienta 44: 56-57 Cander Letter 32: 159-162 49. Allison AC, Byars NE, Waters RV (1986) W: N ervig 31. Bloksma N, Hofhuis F M A, Willers JMN (1984) RM et al (red) Advances in carriers and adjuvants for veterinary Cancer Immunol Immunother 17: 154-157 biologies Ames Iowa: Iowa State University Press, str 91-103 32. Shimizu T, O h t s u k a Y, Y a n a g h a r a Y, et al. (1991) 50. Chedid L (1986) W: Chedid L, Hadden JW, Spreafico F, Immunopharmac 13: 605-611 Dukor P, Willoufhby D (red) Advances in immunopharmacolo- 33. Sone D, Fidler IJ (1981) Cell Immunol 57: 42-45 gy 3 Pergamon Press, Oxford, str 329-336 34. Sone S, Lopez-Berestein G, Fidler I (1986) CancerJones51. WR, Judd S J, I n g RMYetal (1988) Lancet 2: Immunol Immunother 21: 93-99 1295-1298 35. Fidler I, Fogler W,Kleinerman E,Saiki I (1985) 52. Kołodziejczyk AM, Kołodziejczyk AS (1987) Post J Immunol 135: 4289-4296 Bioch 33: 203-229 36. Pace JL, Russell SW, Torres BA, Johnson HM, 53. Wintsch J, et al (1991) J Infect Dis 162: 219-225 Gray PW (1983) J Immunol 130: 2011-2013 54. Keitel W, Couch R, B o n d N , et al (1993) Vaccine 11: 37. Landmann R, Wesp M, Dukor P (1988) Cell Immunol 909-913 117:45-55 55. Z a k O, O ’Reilly T (1990) Eur J Clin Microbiol Infect Dis 9: 38. Souvannavong V, Adam A (1988) J Chromatogr 440: 472-478 95-103 ' 56. Z a k O, O ’Reilly T (1991) Antimicrob Agents Chemother 35: 39. Souvannavong V, Brown S, Adam A (1988) Molec 1527-1531 Immunol 25: 385-391 57. Ichihara N, Kanazawa R, Saski S, et al (1988) Arzneimittelforschung 38: 1043-1069

Uprzejmie zawiadamiamy PT Koleżanki i PT Kolegów o przeniesieniu siedziby Zarządu Głównego Polskiego Towarzystwa Bioehemicznego na teren Instytutu Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego pokój 632 i 633

Obecny adres:

Polskie Towarzystwo Biochemiczne ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa Tel. bezpośredni 658 2099 Tel. przez centralę 659 85 71 w. 352 Fax 22 5342

Dyżury biura Zarządu odbywają się jak dotychczas we wtorki w godz. 12-18

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 79 Episjalina — nowopoznany składnik glikokaliksu i błony komórkowej komórek nabłonkowych

Episialin — a new recognized component of glycocalyx and cell membrane of epithelial cells

ANDRZEJ GINDZIEŃSKI1, KRZYSZTOF ZWIERZ2

Spis treści: Contents:

I. Wstęp I. Introduction II. Struktura episjaliny i lokalizacja genu episjaliny w geno­ II. Structure of episialin and localization of the gene in human mie człowieka genome III. Biosynteza episjaliny III. Biosynthesis of episialin IV. Nadekspresja i patologiczne formy episjaliny IV. Overexpression of episialin and its pathological forms V. Cechy antygenowe patologicznych form episjaliny V. Antigenic properties of pathological forms of episialin

Wykaz stosowanych skrótów: NANA — kwas N-acetyloneu- czy epitektyna [13,18, 19]. We współczesnym piśmien­ roaminowy. nictwie najczęściej używane są nazwy: episjalina, MUC1 lub PEM. I. Wstęp II. Struktura episjaliny i lokalizacja genu epis­ Episjalina jest nabłonkową glikoproteiną, zlokalizo­ jaliny w genomie człowieka waną na szczytowej powierzchni błony komórek na­ błonka gruczołowego, komórek endotelialnych w węz­ Otrzymanie cDNA rdzenia białkowego episjaliny łach chłonnych, oraz powierzchniach komórek wy­ pozwoliło na uzyskanie szeregu informacji dotyczą­ ściełających jamy ciała (mésothélium) i zwróconych do cych jej budowy i lokalizacji genu episjaliny w genomie ich światła [1], Cząsteczkom episjaliny przypisuje się [20-23]. Episjalina jest produktem genu oznaczonego funkcję antyadhezyjną i zdolność wiązania patogenów symbolem MUC1, który w genomie człowieka jest (antygenów], co utrudnia ich dostęp do receptorów7 zlokalizowany w chromosomie 1 q2!-24 [24-28]. Gen komórkowych [2, 3]. Materiałem z którego izoluje się episjaliny zawiera 7 egzonów, z których w drugim episjalinę jest mleko lub siara człowieka [4-8] lub znajdują się sekwencje nukleotydowe kodujące po­ zwierząt [9-12], dokąd przechodzi wraz z błoną ko­ wtarzające się 20-aminokwasowe tandemy [29], za­ mórkową w formie otoczki kuleczek mleka, oderwana jmujące 2/3 cząsteczki rdzenia białkowego. Każdy allel od komórki w procesie laktacji [13], genu zawiera zmienną liczbę powtarzających się tan­ Wczesne obserwacje dotyczące występowania w su­ demów, co jest przyczyną znacznego polimorfizmu rowicy krwi antygenu związanego z komórkami gru­ cząsteczki. Determinantę antygenową rozpoznawaną czołu piersiowego i tłuszczowymi osłonkami kuleczek przez monoklonalne przeciwciała stanowią konser­ mleka pochodzą z pierwszej połowy lat osiemdziesią­ watywne 7-aminokwasowe struktury peptydowe tych [14-17]. Antygen ten był wykrywany w surowicy PDTRPAP, zlokalizowane pomiędzy glikozylowany- u kobiet z rakiem piersi, szczególnie po pojawieniu się mia tandemami [20, 22, 30-32]. Episjalinę wyizolowa­ przerzutów. Antygen stanowi mucyno-podobna sub­ no również z ludzkiej surowicy, częściowo oczyszczono stancja, określana przez różnych autorów mianem oraz zidentyfikowano immunologicznie jako polimor- PAS-0, MAM-6, episjalina, non-penetrating glycop­ ficzną glikoproteinę o masie cz. ok. 400 kDa [33, 34], rotein (NPG), epithelial membrane antigen (EMA), Episjalina występuje w formie związanej z błoną polimorphic epithelial mucin (PEM), antygen CA 15-3, komórkową i od mucyn wydzielniczych, których właś­ ciwości były przedmiotem odrębnego artykułu [35] 1 Dr hab., Zakład Chemii Ogólnej i Organicznej, Akade­ różni się mniejszą masą cząsteczkową, mniejszą gęstoś­ mia Medyczna w Białymstoku, ul. Mickiewicza 2, 15-230 cią 0-glikozylacji, brakiem grup -SH umożliwiających Białystok 2 dr hab., Zakład Biochemii Farmaceutycznej, Akademia Medyczna w Białymstoku, ul. Mickiewicza 2, powstawanie disiarczkowych oligomerów, oraz i tym, 15-230 Białystok że nie tworzy żelu. Na rycinie 1A przedstawiony jest

80 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 HB- ■Domena wbudowana do bbony kom órkow ej IS33I Domena o strukturze czynnika Von Willebranda Obszary intensywnie glikozylowane y Sialowane Irańcuchy o-glikozydowe

Ryc. 1. Schemat budowy episjaliny (A) i mucyny wydzielniczej (B) (wg [36], zmodyfikowany). Na rycinie zaznaczono N- i C-końcowe zakończenia łańcuchów polipeptydowych. schemat budowy cząsteczki episjaliny z zaznaczeniem domeny wbudowanej do błony komórkowej w pobliżu C-końca cząsteczki. Rycina IB przedstawia budowę podjednostki mucyny wydzielniczej. Wbudowana do błony komórkowej cząsteczka epis­ jaliny jest złożona z wielkiej zewnątrzkomórkowej domeny zawierającej od 1000 do 2200 aminokwasów, domeny błonowej i z domeny cytoplazmatycznej za­ wierającej 69 aminokwasów [20-23], (Ryc. 2). Na podstawie struktury cDNA ustalono, że w domenie zewnątrzkomórkowej każda z 20-aminokwasowych powtarzających się sekwencji zawiera liczne reszty seryny i treoniny (stanowiące 5 potencjalnych miejsc Łańcuchy O-glikozydowe 0-glikozylacji), oraz reszty proliny. Genetycznie uwa­ runkowana liczba powtórzeń waha się od 30 do 90, co wyraża się różną długością zewnątrzkomórkowej do­ Łańcuchy N-glikozydowe meny. Z powodu licznych reszt prolinowych w łań­ cuchu polipeptydowym, w cząsteczce episjaliny domi­ Glikokaliks nuje struktura typu beta, ulegająca dodatkowo uszty­ B ło n a plazmafyczna wnieniu wskutek dość gęstego rozmieszczenia łań­ cuchów oligosacharydowych. Przyjmując za J e n t o - Ryc. 2. Episjalna i jej usytuowanie w błonie komórkowej. Strzałką zaznaczono miejsce niekowalencyjnego oddziaływania po­ ftem [43], że intensywnie 0-glikozylowany 28-ami- między podjednostkami (wg [2], zmodyfikowany). nokwasowy peptyd ma długość 7 nm, mucyno-podob- na domena episjaliny wystaje na 200-700 nm ponad (Ryc. 3A) którego masa cząsteczkowa już po 4 min. błonę komórkową (Ryc. 2). Łańcuchy oligosacharydo- ulega zmniejszeniu jeszcze w retikulum endoplazmaty- we stanowiące ok. 50% masy cząsteczki mają skład cznym wskutek odcięcia od C-końca cząsteczki frag­ typowy dla mucyn, z nieco większą zawartością galak- mentu o masie 20 kDa (Ryc. 3B). Mimo tego obie części tozy i NANA. Wykazano również występowanie poje­ cząsteczki tworzą stabilny kompleks; C- końcowy dynczych łańcuchów oligosacharydowych połączo­ peptyd ma charakter hydrofobowy i zostaje wbudowa­ nych N-glikozydowo [5, 10]. ny do błony komórkowej, w której pełni rolę kotwicy dla większej podjednostki [20-22, 41], (Ryc. 3C). Do I I I . Biosynteza episjaliny większej podjednostki, reprezentującej mucynopodob- ną domenę N-końcową, podczas wewnątrzkomórko­ Biosynteza episjaliny w hodowlach tkankowych wej wędrówki w kierunku błony komórkowej dobudo- mutantów komórkowych badana była przez kilka wują się liczne 0-glikozydowe łańcuchy oligosachary- zespołów [37-40]. W pierwszym etapie powstaje dowe (Ryc. 3C). Dalszy etap biosyntezy to dobudowy- N-glikozylowany prekursor białkowy (ok. 200 kDa) wanie reszt kwasu sjalowego, które stanowią zakoń-

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 81 A B C D

Ryc. 3. Etapy biosyntezy episjaliny (wg [2], zmodyfikowany). A — N-glikozylowany prekursor episjaliny B — kompleks N-glikozylowanego prekursora z podjednostką transbłonową C — prekursor po O-glikozylacji D — prekursor po sialilacji E — oddysocjowanie episjaliny od podjednostki transbłonowej.

czenie łańcuchów oligosacharydowych, co łącznie dzeniem tego może być fakt, że cząsteczki episjaliny zwiększa masę cząsteczkową episjaliny do ok. 400 kDa w których liczba powtarzających się sekwencji uległa (Ryc. 3D). Większa podjednostką pozostaje czasowo zredukowaniu i których długość jest mniejsza niż 90 zakotwiczona w błonie komórkowej poprzez interak­ nm, tracą swe anty-adhezyjne właściwości. Można cję z podjednostką C-końcową [38]. Kilka godzin po sądzić, że pojawienie się episjaliny pomiędzy komór­ zakończeniu syntezy i wbudowaniu episjaliny do bło­ kami zmniejsza zależne od integryny i kadheryny ny komórkowej, obecność O-glikozylowanej podjed­ E oddziaływania międzykomórkowe wskutek oddzie­ nostki episjaliny można wykazać w medium hodow­ lenia od siebie warstw receptorowych sąsiadujących lanym (Ryc. 3E). Nie zostało dotąd wyjaśnione, czy jest komórek [42, 44]. Interesujące jest, że obecność epis­ to skutkiem dysocjacji czy też kolejnej modyfikacji jaliny na powierzchni transformowanych komórek nie proteolitycznej produktu biosyntezy. Czas półtrwania blokuje wiązania przeciwciał antyintegrynowych [44, glikozylowanej podjednostki w formie związanej z bło­ 46], prawdopodobnie z powodu większej elastyczności ną komórkową wynosi 18-24 godziny. Sugeruje się, że ligandów nie związanych z błoną komórkową. proces odrywania się większej podjednostki od błony Innym skutkiem nadekspresji episjaliny na powierz­ komórkowej może zachodzić również in vivo [42]. chni transformowanych komórek jest obniżenie ich zdolności do koniugacji z cytotoksycznymi limfocyta­ IV. Nadekspresja i patologiczne formy mi. Wykazano na przykład, że liza przez limfocyty episjaliny LAK transfekowanych komórek czerniaka A375 była znacznie wolniejsza niż liza rewertantów tych komórek W badaniach przeprowadzonych na hodowlach lub docelowych dla limfocytów LAK komórek K-562 komórkowych wykazano, że właściwości komórek [47]. Ochronną rolę episjaliny przed immunodestruk- transfekowanych cDNA episjaliny ulegają wyraźnej cją komórek potwierdzają badania na myszkach, któ­ zmianie. Kilka linii komórek po transfekcji wykazywa­ rym do żyły ogonowej wprowadzano episjalino-pozy- ło, w porównaniu z komórkami w hodowli kontrolnej, tywne komórki A375 lub ich rewertanty. Stwierdzono, obniżenie interakcji z podłożem i wzrost w formie że liczba guzków przerzutowych w płucach myszek po zawiesiny [2, 42, 44]. Episjalina ulega podwyższonej injekcji tych pierwszych była znacznie większa. Mimo ekspresji w komórkach transformowanych i uważa się, że w hodowli rewertantów którymi szczepiono myszki, że wskutek nadekspresji genu MUC1 episjalina poja­ komórki episjalino-pozytywne stanowiły tylko 1%, to wia się na całej powierzchni błony komórkowej, także w masie guzków przerzutowych ich odsetek wzrastał i w warstwie pomiędzy komórkami, zaburzając adhe­ do 25%. Potwierdza to wysoki potencjał przerzutowy zję komórkową [2, 15, 44, 45]. Antyadhezyjne właś­ komórek pokrytych episjaliną [42]. ciwości episjaliny nie mają związku ani z jej polimor- ficzną strukturą ani też z odpychającym działaniem V. Cechy antygenowe patologicznych form ujemnie naładowanych reszt NANA. Decydujące zna­ episjaliny czenie wydaje się mieć mechaniczne rozdzielenie warstw receptorowych sąsiadujących komórek. Przy W stanach patologicznych u człowieka episjalina szerokości tej warstwy rzędu 10 nm, wskutek pojawie­ może ulegać nadekspresji w komórkach w których nia się episjaliny, komórki zostają oddzielone od siebie fizjologicznie występuje, co uwidacznia się w nasilaniu na odległość setek nanometrów (Ryc. 2). Potwier­ reakcji histochemicznych tych komórek z monoklona-

82 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 lnymi przeciwciałami [2] oraz pojawieniu się episjaliny wotnym, wskazuje na możliwość pośredniczenia selek­ w surowicy krwi [48,49], Badania episjaliny w surowi­ tyny E w powstawaniu przerzutów [67,68], Wykazano cy krwi zostały zainicjowane przez BurchelTa [50] bowiem, że oczyszczone preparaty episjaliny niosące iHilkensa [51]. W surowicy zdrowego człowieka antygeny sjalo-Lewisa i sjalo-Lewisx hamują adhezję antygen episjaliny jest także wykrywalny, szczególnie komórek HL-60 -sjalo-Lewisx — pozytywnych do u kobiet w ciąży, u palaczy i osób starszych [52, 53]. selektyny E [69]. Jak wykazano z użyciem monoklonalnych przeciwciał Należy jednak zauważyć, że wystandaryzowanie skierowanych przeciwko rdzeniowi białkowemu epis­ testów służących do wykrywania antygenów występu­ jaliny, ekspresja episjaliny w komórkach raka gruczołu jących na cząsteczce episjaliny łączy się z poważnymi piersiowego wzrasta około 10-krotnie [42], trudnościami. Jest to spowodowane zmienną liczbą Do uzyskiwania anty-episjalinowych przeciwciał epitopów wynikającą z heterogenności cząsteczki, monoklonalnych używa się nie glikozylowanego biał­ a także maskowaniem epitopów przez obecne w suro­ ka, pochodzącego z komórek transfekowanych cDNA wicy własne przeciwciała. Szczególnym przykładem episjaliny, stąd przeciwciała wykazują swoistość w sto­ takiej sytuacji jest wrzodziejące zapalenie jelit, w któ­ sunku do jej polipeptydowego rdzenia. Powtarzające rym wykrywa się znaczny poziom tych przeciwciał [70, się sekwencje aminokwasowe rdzenia mają silne właś­ 71]. Oprócz wykorzystywania episjaliny w diagnos­ ciwości antygenowe [54], To że antygenowa deter­ tyce, trwają badania nad zastosowaniem w lecznictwie minanta episjaliny jest w cząsteczce powtarzana wielo­ syntetycznych antygenów o strukturze episjaliny. Pew­ krotnie, może mieć znaczenie zarówno w skuteczniej­ ne nadzieje co do możliwości wykorzystania episjaliny szej immunizacji jak też i w łatwiejszym wiązaniu do innego celu niż diagnostyka, można wiązać z donie­ przeciwciał. Zwiększona wykrywalność episjaliny w tes­ sieniami o próbach użycia syntetycznych antygenów tach z przeciwciałami przeciwko domenom peptydo- o strukturze episjaliny do immunizacji pacjentów wym może wynikać nie tylko z nadekspresji ale też chorych na chorobę nowotworową [72-74], z większej dostępności polipeptydowych epitopów wskutek niepełnej glikozylacji, co jest cechą charak­ Artykuł otrzymano 19 listopada 1996 r. terystyczną glikoprotein pochodzących ze zmutowa­ Zaakceptowano do druku 25 lutego 1997 r. nych tkanek [1, 55-57]. Dotychczas do stałej praktyki klinicznej wszedł tylko test CA 15-3 wprowadzony do Piśmiennictwo diagnostyki raka gruczołu piersiowego przez T o - biasa [58]. 1. Zotter S, Hageman PC, Lossnitzer A, Mooi WJ, W diagnostyce rzadziej są wykorzystywane właś­ H ilgcrs J (1988) Cancer Rev 11-12: 55-101 ciwości antygenowe oligosacharydowej części epi­ 2. Hilkcns J, Ligtenbcrg MJL, Vos HL, Litvinov SV (1992) TIBS 17: 359-363 sjaliny, z powodu jej wielkiej zmienności. Nie mniej 3. LessuffleurT, ZweibaumA, RealFX (1994) Crit Rev w ostatnich latach pojawiły się nowe testy immunolo­ Oncol Hematol 17: 153-180 giczne wykrywające ze zwiększoną czułością niektóre 4. Shimizu M,Yamauchi K, Miyauchi Y, SakuraiT, Tokugawa K, Mcllhinney RAJ (1986) Biochem J 233: antygeny związane ze strukturami oligosacharydowy- 725-730 mi [53]. W celach diagnostycznych do rozpoznawania 5. Shimizu M, Yamauchi K (1982) Biochem J 91: 515-524 patologicznych antygenów próbuje się również wyko­ 6. Sekine H, Ohno T, Kufe DW (1985) J Immunol 135: 3610— 3615 rzystywać przeciwciała i lektyny, rozpoznające produ­ 7. GendlerSJ, BurchellJM, DuhingT, Lamport D, kty niekompletnej glikozylacji białkowego rdzenia White R, Parker M, Taylor-Papadimitriou episjaliny, jak antygeny Tn i sjalo-Tn [59]. Z transfor­ J (1987) Proc Natl Acad Sei USA 84: 6060-6064 8. Hanisch G, Uhlenbruck G, Dienst C, Stottrop macją nowotworową związane jest wytępowanie oli- M, Hippauf E (1985) Eur J Biochem 149: 323-330 gosacharydowych antygenów sialo-Lewisa i sialo-Le- 9. Cawston TE, Anderson M,Cheeseman GC (1976) wisx [60]. Obecność sjalo-Lewisa w strukturze epis­ Dairy Res 43: 401-409 10. Snow L D, Colton DG, Carraway KL (1977) Arch jaliny jest wynikiem indukcji alfa-2,3-sjalotransferazy Biochem Biophys 179: 690-697 [61], wykazującej kilkakrotnie większą aktywność 11. Campana WM, Josephson VR, Patton S (1992) w komórkach transformowanych [62]. Antygen ten, Comp Biochem Physiol 103B: 261-266 12. Johnson VG, Greenwalt DE, Madara PJ, Mat­ fizjologicznie występujący w żółci i ślinie [63], pojawia he r I H (1988) Biochem J 251: 507-514 się wraz z antygenem sjalo-Lewisx w surowicy chorych 13. Patton S, Gendler S J, Spicer AP (1995) Biochim z rakiem trzustki i jelit [64, 65]. W raku okrężnicy, Biophys Acta 1241: 407-424 14. Burchell J, Durbin H, Taylor-Papadimitriou w ponad 90% przypadków, cząsteczki episjaliny mają J (1983) J Immun 131: 508-513 wbudowany do struktur oligosacharydowych antygen 15. Hilkens J, Buijs F, Hilgers J, Hagemann P h, sjalo-Lewisx, nie występujący w episjalinie ze zdrowych Calafat J, Sonnenberg A, van der Valk M (1984) Int J Cancer 34: 197-206 tkanek [66]. Antygen sjalo-Lewisx występuje także na 16. Price MR, Edwards S, Owainati A, Bullock JE, powierzchni leukocytów i komórek HL-60, i jest Ferry B, Robins R A, Baldwin RW (1985) I nt J Cancer ligandem dla śródbłonkowej selektyny E. Obecność 36: 567-574 17. L a n M S , Bast RC, Colnaghi MI, Knapp RC, znacznie większej liczby komórek sjalo-Lewisx — po­ Colcher D, Schlom J, Metzgar RS (1987) Int J Cancer zytywnych w guzach przerzutowych niż w guzie pier­ 39: 68-72

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 83 18. Nguyen PL, Niehans GA, Cherwith DL, Kim Y S , J (1984) Int J Cancer 34: 763-768 Ho SB (1996) Tumor Biol 17: 176-192 51. Hilkens J, Kroezen V, Bonfrer J M, De BJM, 19. Girling A, Bartkova J, Bure he II J, Gendler S, Brüning PF (1986) Cancer Res 46: 2582-2587 Gillet C, Taylor-Papadimitriou J (1989) Int 52. M c Guckin M A, Ramm LE, Joy GJ, Devine PL, J Cancer 43: 1072-1076 Ward BG (1993) Clin Chim Acta 214: 139-151 20. Gendler SJ, Lancaster C A, Taylor-Papadimit­ 53. Layton G T, G older J, Johnston S, McGuckin riou J, Duhing T, Peat N, Burchell J, Pemberton M A, Ward B, LoT, Williams P, Bishop JF, Jeal P, L, Lalani E-N, Wilson D (1990) 7 Biol Chem 265: Francis P, Xing P-X, McKenzie IFC (1991)7 Tumor 15286-15293 Marker Oncol 6: 1-8 21. Lan MS, Batra SK, Qi W-N, Metzgar RS, Hollin­ 54. Gendler SJ, Taylor-Papadimitriou J, Duhing gsworth MA (1990) 7 Biol Chem 265: 15294-15299 T, Rothbard J, Burchell J (1988) 7 Biol Chem 263: 22. Ligtenberg MJL, Vos HL, Gennissen AMC, Hil- 12820-12823 kens J (1990) 7 Biol Chem 265: 5573-5578 55. Hilkens J, Buijs F, Ligtenbrg M(1989) Cancer Res 49: 23. Wreschner DH, Hareuveni M,Tsarfaty 1, Smo- 786-793 rodinski N, Horev J, Zaretsky J, Kotkes P, Weiss 56. Burchell J, Gendler S, Taylor-Papadimitrou J, M, Lathe R, Dion A, Keydar 1 (1990) Eur 7 Biochem 189: Grilling A, Lewis A, Millis R, Lamport D (1987) 463-473 Cancer Res 47: 5476-5482 24. Swallow DM, Gendler S, Griffiths B, Kearney A, 57. Hull SR, Bright A, Garraway KL, Abe M, Hayes Povey S, Sheer D, Palmer RW, Taylor-Papadi- D F, K ufe D W (1989) Cancer Commun 1: 261-267 mitriou J (1987) Ann Hum Genet 51:289-294 58. Tobias R, Rotwell C, Wagner J, Green A, Liu YS 25. Middleton-Price H, Gendler S, Malcolm S (1988) (1985) Clin Chem 31: 986 Ann Hum Genet 52: 273-278 59. Lisowska E (1995) Acta Biochim Polon 42: 11-18 26. Gendler S, Taylor-Papadimitriou J, Duhing T, 60. UgorskiM,KlopockiAG(l 996) Post Hig Med Dośw 50: Rothbard J, Burchell J (1988) 7 Biol Chem 263: 12820- 209-231 -12823 61. Magnani J L, Nilsson B, Brockhaus M, Zopf D, 27. Swallow DM, Gendler S, Griffiths B, Corney G, Steplewski Z, Koprowski H, Ginsburg V (1982) Taylor-Papadimitriou J, Bramwell ME (1987) 7 Biol Chem 257: 14365-14369 Nature (Lond) 328: 82-84 62. Brockhausen I, Yang Y-M, Burchell J, White- 28. Swallow D, Gendler S, Griffiths B, Kearney A, house C, Taylor-Papadimitriou J (1995) Eur J Bio­ Povey S, Sheer D, Palmer RW, Taylor-Papadi­ chem 233: 607-617 mitriou J (1987) Ann Hum Genet 51: 289-294 63. Zopf D, Hansson GC (1988) Adv Exp Med Biol 228: 29. Lancaster CA, Peat N, Duhing T, Wilson D, 657-676 Taylor-Papadimitriou J, Gendler SJ (1990) Bio­ 64. Magnani JL, Steplewski Z, Koprowski H, Gins­ chem Biophys Res Comm 173: 1019-1029 burg V (1983) Cancer Res 43: 5489-5492 30. Price MR, Hudecz F, O’S u 11 i v a n C, B a 1 d w i n R W, 65. Kannagi R, Fukushi Y, Tashikawa T, Noda A, Edwards PM, Tendier SJB (1990) Mol Immununol 27: Shin S, Shigeta K, Hirauia N, Fukuda Y, Inamo- 795-802 to T, Hakomori S, Imura H (1986) Cancer Res 46: 31. Burchell J, Taylor-Papadimitriou J, Boshel M, 2619-2626 Gendler S, Duhing T (1989) Int 7 Cancer 44: 691-696 66. Hański C, Dreschler K,Hanisch F-G, Sheehan J, 32. Price MR, Pugh JA, Hudecz F, Griffiths W, Ja­ Manske M, Ogórek D, Klussmann E, Hanski cobs E, Symonds IM, Clarke AC, Chan W, Bald­ M-L, Blank M,Xing P-X, McKenzie IFC, Devine win RW (1990) Br 7 Cancer 61: 681-686 PL, Riecken E-O (1993) Cancer Res 53: 4082-4088 33. Price MR, Sekowski M, Tendier SJB (1991) 7 Im­ 67. Matsushita Y, Cleary KR, Ota DM, Hoff SD, munol Meth 139: 83-90 I r i m u r a T (1990) Lab Invest 63: 780-791 34. Price MR, Clarke A J, Robertson JFR, O’S u 11 i - 68. Matsusako T, Muramatsu H, Shirahama T, Ohi van C, Baldwin RW, Blarney RW (1990) Cancer Y (1991) Biochem Biophys Res Commun 181: 1218-1222 Immunol Immunother 31: 269-272 69. Zhang K, Baeckstrom D, Brevinge H, Hansson 35. Gindzienski A, Zwierz K (1991) Post Biochem 37: G C (1996) 7 Cell Biochem 60: 538-549 146-153 70. Gourevitch MM, von Mensdorff-Poulilly S, 36. G um J R (1995) Biochem Soc Trans 23: 795-799 Litvinov SV, Kenemans P, van Kamp G J, Verst- 37. Hilkens J, Buijs F (1988)7 Biol Chem 263: 4215-4222 raeten AA, Hilgers J (1995) Brit J Cancer 72: 934-938 38. Ligtenberg MJL, Kruijshaar L, Buijs F, van 71. Hinoda Y, Nakagawa N,Nakamura H, M a k i g i- Meijer M, Litvinov S V, Hilkens J (1992) 7 Biol Chem chi Y, Itoh F, Adachi M,YabanaT, Imai K, Yachi 267: 6171-6177 A (1993) Immunol Lett 35: 163-168 39. Linsley PS, KallestadJC, Horn D (1988) 7 Biol Chem 72. Graham R A, Burchell JM, Taylor-Papadimit­ 263: 8390-8397 riou J (1996) Cancer Immunol Immunother 42: 71-80 40. Abe M, K ufe D (1989) Cancer Res 49: 2834-2839 73. MacLean GD, Reddish MA, Koganty RR, Lon­ 41. G u m JR,Byrd J C, Hicks JW, Toribara NW, Lam­ genecker BM (1996) 7 Immunother 19: 59-68 port TD, Kim YS (1989) 7 Biol Chem 264: 6480-6487 74. Agrawal B, Reddish M A, Longenecker BM (1996) 42. Hilkens J, Wesseling J, Vos HL, Storm J, Boer B, 7 Immunol 157: 2089-2095 van der Valk SW, Maas MCE (1995) Biochem Soc Trans 23: 822-826 43. J e n t o f t N (1990) Trends Biochem Sei 15: 291-294 44. Wesseling J, van der Valk SW, Hilkens J (1996) Molec Biol Cell 7: 565-577 45. Ligtenberg MJL, Buijs F, Vos HL, Hilkens J (1992) Cancer Res 52: 2318-2324 46. Wesseling J, van der Valk SW, Vos HL, Sonnen- berg A, Hilkens J (1995) 7 Cell Biol 129: 255-265 47. Van de Viel-Van Kemenade E, Ligtenberg MJL, de Boer A J, Buijs F, Vos HL, Melief CJM, Hilkens J, Figdor CG (1993) 7 Immunol 151: 767-776 Prenumerata „Postępów Biochemii” 48. Tondini C, Hayes DF, Gelnam R, Henderson IC, w 1997 r. Kufe DW (1988) Cancer Res 48: 4107-4112 Prenumerata dla instytucji — 60 zł 49. H i 1 k e n s J (1992) W: Sell S (red) Serological Cancer Markers, Humana Press, Totowa, NJ, str 260-281 Indywidualna — 30 zł 50. Burchell J, Wang D, Taylor-Papadimitriou 50% zniżki dla członków PTBioch.

84 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 Wpływ uszkodzeń DNA na regulację cyklu komórkowego

The influence of DNA damage on celi cycle regulation

PIOTR WIDŁAK*

Spis treści: Contents:

I. Regulacja cyklu komórkowego I. Regulation of the cell cycle II. Blokada w fazie G1 — decydująca rola białka p53 II. Cell cycle arrest in G l; involvement of p53 III. Blokada cyklu komórkowego w fazie G2 III. Cell cycle arrest in G2 IV. Mechanizmy rozpoznawania uszkodzeń IV. Mechanisms of damage recognition V. Cykl komórkowy a naprawa DNA V. Cell cycle and DNA repair VI. Apoptoza a uszkodzenia DNA VI. DNA damage and apoptosis VII. Uwagi końcowe VII. Concluding remarks

Wejście w cykl podziałowy komórek zawierających kontrolny” Gl/S), a procesy decydujące o wejściu uszkodzony DNA wiąże się z niebezpieczeństwem komórki w fazę M mają miejsce w fazie G2 („punkt wprowadzenia błędów do zapisu informacji genetycz­ kontrolny” G2/M). W komórce funkcjonują również nej. Obecność uszkodzeń DNA (indukowanych na mechanizmy kontrolujące prawidłowość przebiegu fa­ przykład przez fizyczne czy chemiczne genotoksyczne zy S i M. O rozpoczęciu kolejnej fazy cyklu komór­ czynniki środowiskowe) może wywołać zablokowanie kowego decydują zarówno czynniki endogenne jak kompleksu replikacyjnego lub spowodować nieprawi­ i czynniki pochodzące spoza komórki (np. czynniki dłowe odczytanie informacji kodowanej przez uszko­ wzrostowe — mitogeny). Stwierdzono, że jednym dzony fragment. Efektem uszkodzeń może więc być z czynników mających decydujące znaczenie dla regu­ powstanie różnorodnych mutacji. W komórkach eu­ lacji cyklu komórkowego jest aktywność kinaz biał­ kariotycznych odpowiedzią na uszkodzenie DNA jest kowych zależnych od cyklin, CDK (ang.: cyclin-depen- zainicjowanie naprawy DNA i zablokowanie cyklu dent kinase). W komórkach ssaków wykryto obecność komórkowego do czasu, kiedy uszkodzenia zostaną kilku białek CDK (oznaczanych jako Cdk z kolejnym usunięte z genomu, a w przypadku niemożliwości numerem). Białka CDK obecne są w jądrze w ciągu usunięcia uszkodzeń, skierowanie komórki na drogę całego cyklu komórkowego, natomiast ich aktywność apoptozy. regulowana jest przez przyłączenie do podjednostki katalitycznej białkowego aktywatora — odpowiedniej I. Regulacja cyklu komórkowego cykliny. Cykliny są białkami, których synteza i poziom zależy od fazy cyklu komórkowego [przeg. w: 4], Cykl życiowy komórki eukariotycznej został opisa­ W komórkach kręgowców o przejściu granicy Gl/S ny w roku 1953 przez Howarda i Pelca [1] jako decyduje aktywność kompleksów cyklina D/Cdk4 powtarzające się zjawisko mitozy i okresu między- i cyklina E/Cdk2, oraz cyklina A/Cdk2. Wydaje się, że mitotyczngo (podzielonego na fazę Gl, fazę S i fazę jednym z najważniejszych substratów dla kinaz CDK G2). Zdarzenia zachodzące w cyklu komórkowym i efektorem dla „zegara” cyklu komórkowego w fazie zorganizowane są w taki sposób, że inicjacja każdego Gl jest białko pRB (kodowane przez gen zmutowany etapu możliwa jest po prawidłowym zakończeniu w komórkach siatkówczaka — retinoblastomy). Biał­ etapu poprzedzającego. Mechanizmy takiej regulacji ko pRB tworzy kompleks z czynnikiem transkrypcyj- zależne są od specyficznych genów i noszą nazwę nym E2F — kompleks będący represorem transkrypcji punktów kontrolnych (ang.: checkpoints). Kontrola genów zależnych od E2F. Fosforylacja białka pRB (i cyklu uniemożliwia podział niekompletnie powielone­ prawdopodobnie E2F) przez kompleks cyklina go materiału genetycznego, a także powielanie i po­ D/Cdk4 lub cyklina E/Cdk2 inicjuje rozpad komplek­ dział materiału genetycznego zawierającego uszkodze­ su pRB/E2F i aktywację genów zależnych od czynnika nia [2, przeg. w: 3]. Procesy decydujące o wejściu E2F [przeg. w: 5]. Aktywacja kinaz CDK, obok komórki w fazę S mają miejsce w fazie G l („punkt wiązania odpowiedniej cykliny, następuje dzięki fos­ forylacji przez kompleks kinazy Cdk7 z cykliną H (CAK; ang.: CDK activating kinase). Aktywność kinaz Cdk4 i Cdk2 hamowana jest przez wiązanie * Dr; Zakład Biologii Nowotworów, Instytut Onkologii, ul. białkowych inhibitorów — białek CDKI (ang.: CDK Wybrzeże Armii Krajowej 15, 44-100 Gliwice inhibitor). Należące do tej grupy białka pi6INK4A MTSI

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 85 oraz p 15INK4BMTS2 Są prawdopodobnie kompetytorami stymuluje szybkość naprawy DNA [23]. cyklin D (a więc są inhibitorami specyficznymi dla Udział białka p53 w regulacji cyklu może również kinaz zależnych od cykliny D). Dwa inne białka wynikać ze zdolności do tworzenia kompleksów z in­ z grupy CDKI, p21WAF1/ciPi oraz p27KIPI5 Są inhibitora­ nymi białkami. Białko p53 tworzy kompleks z biał­ mi mniej specyficznymi, hamującymi aktywność więk­ kiem TBP (ang. TATA box-binding polypeptide), będą­ szości kompleksów cyklina/CDK [przeg. w: 6, 7]. cym podjednostką generalnego czynnika transkryp­ Czynnikiem mającym decydujące znaczenie dla roz­ cyjnego TFIID. Związanie p53 z TBP hamuje trans­ poczęcia mitozy jest aktywność kompleksu MPF (ang.: krypcję genów nie posiadających tzw. “p53-response mitosis-promoting factor). W komórkach ssaków MPF element” (np. onkogeny c-fos i c-jun) [24, 25]. Tak więc tworzony jest przez cyklinę B i kinazę Cdc2 (białko p53 mogłoby oddziaływać na cykl komórkowy rów­ Cdc2 oznaczane jest również Cdkl). Aktywność M PF nież działając jako represor transkrypcji genów nie­ zależna jest od poziomu cykliny B oraz od fosforylacji zbędnych do jego przebiegu. Białko p53 ma także i defosforylacji kinazy Cdc2 (w której, poza CAK, zdolność wiązania się z białkami biorącymi udział bierze udział kinaza Weel i fosfataza Cdc25) [przeg. w: w regulacji replikacji, na przykład z białkiem RP-A. 8]. Powyższy skrót jedynie sygnalizuje złożoność me­ Oddziaływanie p53 z białkiem RP-A uniemożliwia chanizmów regulacji cyklu komórkowego. Pełny prze­ jego wiązanie z jednoniciowym DNA (co jest niezbęd­ gląd zagadnień dotyczących regulacji cyklu komór­ ne do powstania kompleksu replikacyjnego) [26]. kowego można znaleźć w licznych pracach opubliko­ Wydaje się, iż białko p53 gra centralną rolę w prze­ wanych w ciągu ostatnich kilku lat [7-12]. kazywaniu sygnału inicjującego zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie Gl, przynajmniej w komórkach II. Blokada w fazie G1 — decydująca rola z uszkodzonym DNA (schemat niektórych powiązań białka p53 prawidłowego białka p53 przedstawiony jest na rycinie 1). Możliwe jest również, że niektóre typy uszkodzeń W ciągu ostatnich 3-4 lat opublikowano ogromną DNA inicjują zatrzymanie cyklu w fazie G 1 niezależnie liczbę prac dotyczących mechanizmów zahamowania od p53 [27], Co ciekawe, w komórkach drożdży gdzie wzrostu komórek poddanych działaniu czynników wydajnie funkcjonuje punkt kontrolny Gl/S, nie uszkadzających DNA. Dane doświadczalne zgodnie stwierdzono obecności białka p53 (ale ekspresja ludz­ wskazują, że dla zablokowania cyklu komórkowego kiego p53 w komórkach drożdży hamuje ich prolifera­ w fazie G1 decydujące znaczenie ma aktywność białka cję [28]). Niektóre dane sugerują, że białko p53 p53, a dokładniej, indukowana czynnikami genotok- mogłoby brać udział w kontroli cyklu komórkowego sycznymi akumulacja prawidłowego (niezmutowane- w fazie G2 i M [29, 30]. Jest również prawdopodobne, go) białka p53 w jądrze komórkowym [13-16]. Aku­ że p53 (za pośrednictwem p21) bierze udział w regulacji mulacja białka p53 nie jest wynikiem transkrypcji genu następstwa faz S i M [31]. Szczegółowe dane na temat de novo. Postuluje się, że nagromadzenie tego białka roli białka p53 w regulacji cyklu komórkowego można może być wynikiem między innymi: odmiennej obrób­ znaleźć w innych pracach przeglądowych [17, 32-34]. ki transkryptów (alternatywny “splicing”), stabilizacji w wyniku obróbki potranslacyjnej (fosforylacja, oligo- III. Blokada cyklu komórkowego w fazie G2 meryzacja, tworzenie kompleksów z innymi białkami), czy też redystrybucji w obrębie komórki [przeg. w: 17], Powstanie hipotezy dotyczącej mechanizmów “celi Przypuszcza się, że udział białka p53 w blokadzie cycle checkpoints” związane jest z odkryciem genu cyklu komórkowego związany jest z jego oddziaływa­ RAD9. Gen ten odpowiada za indukowaną promie­ niem w charakterze czynnika transkrypcyjnego niowaniem jonizującym blokadę cyklu komórkowego z DNA. Do genów aktywowanych przez p53 należy drożdży Saccharomyces cerevisiae w fazie G2. Stwier­ WAF1/CIP1. Gen ten koduje białko p21, które jest dzono, że produkt genu RAD9 kontroluje rozpoczęcie inhibitorem kinaz cyklino-zależnych [18-20]. Białko fazy M w komórkach, w których nie zakończyła się p21 tworzy kompleksy również z białkiem PCNA, prawidłowo synteza DNA. Sygnałem do blokady będącym podjednostką polimerazy 5 DNA. Powstanie cyklu mogą być zaburzenia replikacji będące wynikiem kompleksu p21/PCNA blokuje replikacyjną syntezę uszkodzeń DNA oraz braku ligazy DNA [35, 2]. DNA, lecz nie blokuje syntezy reperacyjnej DNA [21, Sugeruje się, że białko Rad9 bierze udział w blokadzie 22]. Tak więc, białko p21 może zablokować cykl cyklu również w fazie Gl [36]. Funkcja białka Rad9 komórkowy poprzez dwa niezależne mechanizmy, zależna jest od produktów genów RAD 17, RAD24, z których jeden (przynajmniej potencjalnie) umożliwia MEC1 i RAD53, jednak nie jest znany szczegółowy zablokowanie replikacji uszkodzonego DNA w komór­ mechanizm działania wszystkich tych białek [przeg. w: kach, które już weszły w fazę S. Innym genem akty­ 37], Do tej pory nie jest również znany homolog białka wowanym przez białko p53 jest GADD45 (ang. growth Rad9 w komórkach kręgowców. Do genów zaan­ ąrrest and DNA damage-inducible). Białko Gadd45, gażowanych w kontrolę cyklu komórkowego w fazie podobnie jak p21, wiąże się z PCNA. Stwierdzono, że G2 u drożdży Schizosaccharomyces pombe należą Gadd45 blokuje wejście komórek w fazę S i jednocześnie między innymi radl i rad3 [przeg. w: 38], Stwierdzono,

86 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 Ryc. 1. Schemat opisanych w tekście związków prawidłowego białka p53 z regulacją cyklu komórkowego (i innymi procesami metabolicznymi). Odpowiednimi symbolami zaznaczono: (->) — mechanizmy aktywacji, (—ii) — mechanizmy inaktywacji, (?) — mechanizmy potencjalne lub o niejasnym znaczeniu. Skróty nazw tak jak w tekście.

że produkt genu radl blokuje cykl komórkowy po­ tej hipotezy przemawia fakt, że uszkodzenia obecne przez inaktywację mitotycznego kompleksu kinazy w genach transkrybowanych stymulują akumulację Cdc2, działając za pośrednictwem kinazy Weel i fos­ białka p53 silniej niż uszkodzenia DNA nie trans- fatazy Cdc25 [39]. Również w komórkach ssaków krybowanego [43]. inaktywacja kompleksu M PF poprzez deregulację Większość danych o tym jak przebiega przekazanie fosforylacji kinazy Cdc2 jest jednym z mechanizmów sygnału dotyczy blokady cyklu komórkowego zależnej blokady cyklu komórkowego w fazie G2 [40, 41]. od białka p53. Wydaje się, że uniwersalnym (niezbęd­ Wydaje się, że ten mechanizm blokady cyklu komór­ nym i wystarczającym) czynnikiem inicjującym aku­ kowego jest niezależny od białka p53 [42]. mulację białka p53 są pęknięcia nici DNA (ang.: strand brake). Akumulację białka p53, niezależną od replikacji IV. Mechanizmy rozpoznawania uszkodzeń i naprawy DNA, wywołują czynniki bezpośrednio powodujące pęknięcia DNA (promieniowanie jonizu­ Mechanizmy regulujące przebieg cyklu komórko­ jące, inhibitory topoizomerazy II, bleomycyna, a także wego w komórkach zawierających uszkodzony DNA nukleazy). Inne czynniki indukują akumulację p53 można podzielić (przynajmniej formalnie) na trzy w sposób pośredni, zależny od replikacji i naprawy grupy: 1) rozpoznające uszkodzenie DNA; 2) przeka­ DNA (na przykład produkty naprawy uszkodzeń in­ zujące sygnał; 3) mające bezpośredni udział w regulacji dukowanych przez UV). Dodatkowym powodem pęk­ cyklu (efektorowe). W tej chwili stosunkowo najmniej nięć DNA mogą być procesy przebiegające w jądrze wiadomo o tym, jak rozpoznawane są uszkodzenia naturalnie (np.: rekombinacja) [44]. Mechanizm detek­ i jak przepływa sygnał inicjujący blokadę cyklu. Wyda­ cji uszkodzeń jest bardzo czuły, umożliwia reakcję na je się, że uszkodzenia DNA mogą być rozpoznawane śladowe ilości czynników genotoksycznych (na przy­ przez „czujniki” specyficzne dla cyklu komórkowego. kład promieniowanie jonizujące w dawkach wywołu­ Możliwe jest również, że sygnał inicjujący pochodzi jących jedno lub kilka uszkodzeń na komórkę [45]). spoza wąsko rozumianego układu regulacji cyklu; Zakłada się, że detektorami pęknięć nici DNA są takim sygnałem mogłoby być zablokowanie trans­ enzymy, których aktywność zależna jest od tego typu krypcji (lub replikacji) wywołane obecnością uszko­ struktur, i które mogłyby modyfikować białko p53. dzeń, czy też rozpoczęcie naprawy DNA. Na korzyść Jednym z enzymów aktywowanych przez pęknięcia

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 87 nici i wolne końce DNA jest polimeraza poliADP- szczególnych fazach cyklu komórkowego są jedynie -rybozy (PARP). Stwierdzono jednak, że u zwierząt fragmentaryczne. Stwierdzono, że po naświetleniu ko­ transgenicznych z wyłączonym genem PARP funkc­ mórek promieniowaniem UV naprawa DNA aktyw­ jonuje indukowana czynnikami genotoksycznymi blo­ nego transkrypcyjnie przebiega na podobnym pozio­ kada cyklu komórkowego. Tak więc, aktywność tego mie w trakcie faz S i G2, natomiast szybkość naprawy białka prawdopodobnie nie jest związana z regulacją DNA nieaktywnego wzrasta w trakcie fazy S [57], cyklu komórkowego [przeg. w: 46, 47]. Innym en­ Może to mieć związek z czasowym zanikiem struktury zymem aktywowanym przez przerwane nici i wolne nukleosomowej w trakcie replikacji, i w konsekwencji końce DNA jest kinaza białkowa zależna od DNA ułatwionym dostępem kompleksu naprawczego do (DNA-PK), której jednym z substratów (przynajmniej uszkodzeń. Wiadomo również, że preferencyjna na­ in vitro) jest p53 [przeg. w: 48]. Obecnie wiadomo, że prawa nici transkrybowanej funkcjonuje podobnie białko DNA-PK bierze udział w rekombinacji i na­ w fazie G1 i fazie G2 [58], prawie pęknięć nici DNA. Nie ma natomiast bezpo­ Jest prawdopodobne, że mechanizmy regulujące średnich dowodów na jego związek z regulacją cyklu przebieg cyklu komórkowego mogą bezpośrednio komórkowego [przeg. w: 47, 49]. Ostatnio wykryto wpływać na przebieg naprawy DNA. Czynnikiem liczne białka drożdży i kręgowców o dużej homologii wiążącym mechanizmy regulacji cyklu komórkowego do DNA-PK, co pozwoliło na identyfikację odrębnej i naprawy DNA jest (jakże inaczej) białko p53. Stwier­ rodziny białek. Wiele z nich związanych jest z regulacją dzono, że w komórkach ze zmutowanym genem p53 cyklu komórkowego. Jednym z takich białek jest pro­ (na przykład pochodzących od pacjentów z syndro­ dukt genu ATM, zmutowanego w większości przypad­ mem Li-Fraumeni) upośledzona jest naprawa uszko­ ków syndromu ataxia telangiectasia. Do tej pory (dru­ dzeń indukowanych przez promieniowanie UV (zależ­ ga połowa roku 1996), nie jest jednak znany szczegóło­ ność dotyczy więc mechanizmu naprawy przez wycina­ wy mechanizm działania białka ATM i innych białek nie — NER; ang. nucleotide excision repair") [59], należących do tej rodziny [przeg. w: 50, 51]. Zaobserwowano, że defekt nie dotyczy preferencyjnej Białko p53 również wiąże się z DNA. Domena naprawy nici transkrybowanej [60]. Możliwe jest , że odpowiedzialna za wiązanie ze specyficznymi sekwenc­ białko p53 wpływa na NER poprzez bezpośrednie jami DNA zlokalizowana jest w centralnej części oddziaływania z kompleksem naprawczym. Wynika to białka. Natomiast w części C-końcowej zlokalizowana z faktu, że może ono tworzyć kompleksy z helikazami jest domena odpowiedzialna za „niespecyficzne” wią­ XPD, XPB i CSB biorącymi udział w naprawie DNA, zanie DNA [przeg. w: 52]. Wykazano, że C-końcowa oraz modulować ich aktywność [59, 61]. Helikazy domena p53 wiąże się preferencyjnie z jedno- i dwu- XPB i XPD są składnikami czynnika transkrypcyj- niciowymi końcami DNA (również indukowanymi nego TFIIH, aktywnego zarówno w procesach trans­ promieniowaniem jonizującym), oraz katalizuje rena- krypcji, jak i naprawy DNA. Co ciekawe, składnikami turację DNA [53, 54], Stwierdzono również, że kompleksu TFIIH są również cyklina H i Cdk7, białka C-końcowa domena p53 wiąże się specyficznie ze źle tworzące CAK (przeg. w: 62]. Defekty NER stwier­ sparowanymi fragmentami DNA (błędy typu “inser­ dzono również w komórkach z nieaktywnym genem tion/deletion mismatches”) [55]. Dane te wskazują, że WAF1/CIP1 [63]. Jest więc możliwe, że p53 wpływa białko p53 mogłoby uczestniczyć w szlaku prowadzą­ na naprawę DNA za pośrednictwem białka cym do blokady cyklu komórkowego nie tylko jako p2 jWAn/ciPi (oraz^ o CZym była mowa wcześniej, za element przekazujący sygnał, ale również jako czynnik pośrednictwem białka Gadd45 [23]). rozpoznający uszkodzenia DNA. Hipotezę tę potwier­ Białko p53 wydaje się być związane również z in­ dza obserwacja, że wiązanie krótkich jednoniciowych nymi mechanizmami naprawy DNA. Stwierdzono, że fragmentów DNA przez C-końcową domenę p53 p53 oddziałuje in vivo z białkiem Rad51, które jest zwiększa wydajność wiązania centralnej domeny biał­ jednym z białek katalizujących proces rekombinacji. ka ze specyficznym “p53-response element” genu Może to wskazywać na związek p53 z procesami GADD45 [56], rekombinacji oraz rekombinacyjnej naprawy dwuni- ciowych pęknięć DNA [64]. Stwierdzono również, że V. Cykl komórkowy a naprawa DNA białko p53 wykazuje aktywność 3’ -> 5’ egzonukleazy [65]. Otworzyło to pole do spekulacji na temat udziału Generalnie zakłada się, że odwracalne zablokowa­ p53 w procesie “mismatch repair" i w korekcyjnej nie cyklu komórkowego ułatwia naprawę DNA po­ aktywności polimeraz DNA. przez wydłużenie czasu jaki komórki mają na usunięcie uszkodzeń (zanim nastąpi powielenie i podział mate­ VI. Apoptoza a uszkodzenia DNA riału genetycznego). W związku z tym, blokadę cyklu komórkowego przedstawia się czasem jako integralny Wiele genotoksycznych czynników środowisko­ składnik mechanizmów naprawy DNA. Wiadomo, że wych może — poza blokadą cyklu komórkowego procesy naprawy zahamowane są w trakcie mitozy. — inicjować apoptozę, czyli zaprogramowaną śmierć Jednak dane dotyczące wydajności naprawy w po­ komórki (CPD; ang.: programmed cell death) [przeg. w:

88 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 66, 67]. Obecność prawidłowego białka p53 jest, centralny element mechanizmów blokady cyklu ko­ przynajmniej w większości typów komórek, niezbędna mórkowego w obecności czynników uszkadzających dla przebiegu apoptozy wywołanej czynnikami usz­ DNA. Uszkodzenia genu p53 stwierdzono w ponad kadzającymi DNA [68, 69]. Tym niemniej, w nie­ połowie przypadków nowotworów u ludzi. Większość których komórkach (np. w stymulowanych do prolife­ mutacji genu p53 znosi funkcje białka związane z blo­ racji limfocytach T) indukowane przez czynniki geno- kadą cyklu komórkowego i apoptozą. Prawdopodob­ toksyczne blokada cyklu komórkowego lub apoptoza nie ta cecha p53 sprawia, że utrata lub uszkodzenie mogą przebiegać niezależnie od p53 [70]. Do tej pory genu p53 jest czynnikiem silnie stymulującym proces nie są znane szczegóły mechanizmów regulujących nowotworzenia. Jednocześnie, wskazuje to na znacze­ apoptozę i rola jaką odgrywa w niej p53. Przypuszcza nie jakie dla ochrony informacji genetycznej mają się, że p53 może działać jako aktywator genów stymu­ mechanizmy uniemożliwiające powielenie i podział lujących apoptozę (na przykład bax [71]), lub jako uszkodzonego DNA. Przegląd współzależności po­ represor genów hamujących apoptozę (na przykład między regulacją cyklu komórkowego a procesami bcl-2 [72]). Możliwe jest również, że p53 wpływa na nowotworzenia można znaleźć między innymi w: apoptozę w sposób niezależny od transkrypcji [73]. [11,77-79]. Wydaje się, że apoptoza jest sposobem w jaki komórki odpowiadają na uszkodzenia DNA w sytuacji, kiedy Artykuł otrzymano 10 czerwca 1996 r. niemożliwe jest zablokowanie cyklu komórkowego Zaakceptowano do druku 2 stycznia 1991 r. i efektywna naprawa DNA. Nie wiadomo jednak, czy i w jaki sposób, powiązane są funkcje białka p53 Piśmiennictwo w blokadzie cyklu komórkowego i apoptozie. Jedna z hipotez zakłada, że w odpowiedzi na uszkodzenia 1. Howard A, Pelc SC (1953) Heredity (Suppl) 6: 261-273 DNA białko p53 uruchamiałoby mechanizmy prowa­ 2. Hartwell LH, Weinert TA (1989) Science 246: 629-634 3. Kaufmann WK, Paules RS (1996) FASEBJ 10: 238-247 dzące do blokady cyklu komórkowego, zaś jednoczes­ 4. Sherr CJ (1993) Celi 73: 1059-1065 na obecność czynników wymuszających kontynuację 5. Weinberg RA (1995) Celi 81: 323-330 cyklu (takich jak onkoproteiny czy brak białka pRB) 6. Morgan DO (1995) Nature (Lond) 374: 131-134 7. Sherr CJ (1994) Celi 79: 551-555 prowadziłaby do apoptozy [74, 75]. Możliwe jest 8. King R W, Jackson PK, Kirschner MW (1994) Celi również, że związane z p53 mechanizmy apoptozy oraz 79: 563-571 blokady cyklu komórkowego funkcjonują niezależnie 9. Nurse P (1994) Celi 79: 547-550 10. Heichman K A, Roberts JM (1994) Celi 79: 557-562 od siebie, a wybór jednej z dwu możliwości zależy od 11. Hunter T, Pines J (1994) Celi 79: 573-582 rodzaju komórki lub wpływu środowiska [33]. Na 12. Wójcik C (1993) Post Biol Kom 20: 331-352 korzyść tego drugiego modelu przemawia to, że ko­ 13. Maltzman W, Czyzyk L (1984) M o /C e //B to / 4: 1689- -1694 mórki z niektórymi mutacjami genu p53 zachowują 14. Kastan MB, Onyekwere O, Sidransky D, Vogel- zdolność do blokady cyklu komórkowego, natomiast stein B, Craig RW (1991) Cancer Res 51: 6304-6311 tracą zdolność do apoptozy [76], 15. Kuerbitz SJ, Plunkett BS, Walsh WV, Kastan M B (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 7491-7495 16. Kastan MB, Zhan Q, El-Dei r y WS, Carrier F, VII. Uwagi końcowe Jacks T, Walsh WV, Plunkett BS, Vogelstein B, Fo r nace A J (1992) Cell 71: 587-597 17. C o x L S , Lane DP (1995) Bio Essays 17: 501-508 Dzielące się komórki eukariotyczne zawierające 18. El-Deiry WS, Tokino T, Velculescu VE, Levy uszkodzony DNA realizują strategię polegającą na DB, Parsons R, Trent JM, Lin D, Mercer E, Kinz- zablokowaniu cyklu komórkowego do czasu usunięcia ler KW, Vogelstein B (1993) Cell 75: 817-825 19. El-Deiry WS, Harper JW, O’Connor PM, Vel­ uszkodzenia, lub uśmierceniu komórki jeśli nie da się culescu VE, Canman CE, Jackman J, Pietenpol zapobiec powieleniu i podziałowi uszkodzonego mate­ J A, Burrell M, Hill DE, Wang Y, Wiman KG, riału genetycznego. Taka strategia umożliwia zacho­ Mercer E, Kastan MB, Kohn K W, El ledge SJ, Kin z 1er KW, Vogelstein B (1994) Cancer Res 54: wanie integralności materiału genetycznego, pomimo 1169-1174 powstających stale uszkodzeń DNA. Przebieg procesu 20. Dulić V, Kaufmann WK, Wilson SJ, Tlsty TD, nowotworzenia uzależniony jest od nagromadzenia się Lees E, Harper JW, Elledge SJ.Reed SI (1994) Cell 76: 1013-1023 licznych niezależnych mutacji. Każda zmiana metabo­ 21. Waga S, Hannon G J, Beach D, Stillman B (1994) lizmu komórki zwiększająca tempo powstawania i na­ Nature (Lond) 369: 574-578 gromadzania mutacji zwiększa więc prawdopodobień­ 22. L i R, Waga S, Hannon GJ, Beach D, Stillman B (1994) Nature (Lond) 371: 534-537 stwo powstania nowotworu. Dotyczy to również zabu­ 23. Smith ML, Chen I - T, Zhan Q, Bae I, Chen C-Y, rzeń regulacji cyklu komórkowego, a szczególnie me­ Gilmer T M, Kastan M B, O ’C o n n o r P M , Fornace chanizmów związanych z „punktami kontrolnymi”. AJ (1994) Science 266: 1376-1380 24. Seto E, Usheva A, Zambetti GP, Momand J, Większość białek zaangażowanych w regulację cyklu Horikoshi N, Weinmann R, Levine AJ, Shenk komórkowego (w tym białek CDK, CDKI i cyklin) T (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 12028-12032 kodowana jest przez geny wykazujące cechy onkoge- 25. L iu X, M i 11 e r C W, K o e f f 1 e r P H, B e r k A J (1993) Mol Cell Biol 13: 3291-3300 nów lub genów supresorowych nowotworów. Genem 26. Dut ta A, Rupert JM, Aster JC, Winchester supresorowym jest również gen kodujący białko p53, E (1993) Nature (Lond) 365: 79-82

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 89 27. Zhan Q, Carrier F, Fornace AJ (1993) Moll Cell Biol 55. L e e S,Elenbaas B,Levine A, Griffith J (1995) Cell 13: 4242-4250 81: 1013-1020 28. Nigro JM, Sikorski R, Reed SI, Vogelstein 56. Jayaraman L, Prives C (1995) Cell 81: 1021-1029 B (1992) Mol Cell Biol 12: 1357-1365 57. RussevG, BoulikasT (1992) Eur J Biochem 204: 267-272 29. Stewart N, Hicks GG, Paraskevas F, Mowat 58. Petersen LN, Orren DK, Bohr VA (1995) Mol Cell M (1995) Oncogene 10: 109-115 Biol 15: 3731-3737 30. Cross SM, Sanchez CA, Morgan CA, Schimke 59. WangXW, Yeh H, S c h a e f f e r L, Roy R, Moncollin MK, Ramel S, Idzerda RL, Raskind WH, Reid BJ V, Egly JM, Wang Z, Freidberg EC, Evans MK, (1995) Science 267: 1353-1356 Taffe B G, Bohr VA, Weeda G, Hoe ij makers JHJ, 31. Waldman T, Lengauer C, Kinzler KW, Vogel- Forrester K, Harris CC (1995) Nat Genet 10: 188-195 stein B (1996) Nature (Lond) 381: 713-716 60. Ford J M, H ana wait PC (1995) Proc Natl Acad Sei USA 32. E 11 e d g e R M, L e e W H (1995) BioEssays 17: 923-930 92: 8876-8880 33. Bates S, Vousden KH (1996) Curr Opin Genet Dev 6: 12-19 61. Wang XW, Forrester K, Yeh H, Feitelson MA, 34. Szumiel I (1996) Post Biol Kom 23: 49-61 Gu J-R, Harris CC (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91: 35. Weinert T A, Hartwell LH (1988) Sc/cncc 241: 317-322 2230-2234 36. Siede W, Friedberg AS, Friedberg EC (1993) Proc 62. Nigg EA (1996) Cur Opin Cell Biol 8: 312-317 Natl Acad Sei USA 90: 7985-7989 63. McDonald ER, Wu GS, Waldman T, El-Deiry 37. Lydall D, Weinert T (1996) Curr Opin Genet Dev 6: 4-11 W S (1996) Cancer Res 56: 2250-2255 38. Murray AW (1995) Curr Opin Genet Dev 5:5-11 64. Sturz, becher HW, Donzelmann B, Henning W, 39. Rowley R, Subramani S, Young PG (1992) EM BO Knippschild U, Buchhop S (1996) EM BO J 15: 1992- J 11: 1335-1342 -2002 40. Lock R B, R o s s W E (1990) Cancer Res 50: 3761-3766 65. Mummenbrauer T, Janus F, Muller B, Wiesmul- 41. O’Connor PM, Ferris DK, White GA, Pines J, ler L, Deppert W, Grosse F (1996) Cell 85: 1089-1099 Hunter T, Longo D L, Kohn KW (1992) Cell Growth 66. Bellamy COC, Malcomsom RDG, Harrison DJ, Differ 3: 43-52 Wyllie AH (1995) Sem Cane Biol 6: 3-16 42. Herzinger T, Funk JE, Hillmer E, Eick D, Wolf 67. Kroemer G, Petit P, Zamzami N, Vayssiere JL, DA, Kind P (1995) Oncogene 11: 2151-2156 Mignotte B (1995) EASEB J 9: 1277-1287 43. Yamaizumi M, Sugano T (1994) Oncogene 9: 2775-2784 68. Clarke A R, PurdieC A, Harrison DJ, Morris RG, 44. Nelson WG, Kastan MB (1994) Mol Cell Biol 14: Bird CC, Hooper ML, Wyllie AH (1993) Nature 1815-1823 (Lond) 362: 849-852 45. DiLeonardo A, Linke S P, Clark in K, Wahl GM 69. Lowe SW, Ruley HE, Jacks T, Hous man DE (1993) (1994) Genes Dev 8: 2540-2551 Cell 74: 957-967 46. Lindahl T, Satoh MS, Poirier GG, Klungland 70. Strasser A, Harris AW, Jacks T, Cory S (1994) Cell A (1995) Trends Biochem Sei 20: 405-411 79: 329-339 47. Jackson SP (1996) Curr Opin Genet Dev 6: 19-25 71. Miyashita T, Reed JC (1995) Cell 80: 293-299 48. Anderson CW (1993) Trends Biochem Sei 18: 433-437 49. Jackson SP, Jeggo PA (1995) Trends Biochem Sei 20: 72. Miyashita T, Harigai M, Hanada M, Reed JC 412-415 (1994) Cancer Res 54: 3131-3135 50. Zakian VA (1995) Cell 82: 685-687 73. CaellesC, Helmberg A, Karin M (1994) /Varure(Lond) 51. Keith CT, Schreiber SL (1995) Science 270: 50-51 370: 220-223 52. Prives C (1994) Cell 78: 543-546 74. Fisher DE (1994) Cell 78: 539-542 53. Bakalkin G, Yakovleva T, Selivanova G, M a g - 75. White E (1994) Nature (Lond) 371: 21-22 nusson KP, Szekely L, Kiseleva E, Klein G, 76. Rowan S, Ludwig RL, Haupt Y, Bates S, Lu X, Terenius L, Wiman KG (1994) Proc Natl Acad Sei USA Oren M, Vousden KH (1996) EM BO J 15: 827-838 91: 413-417 77. Lane DP (1992) Nature (Lond) 358: 15-16 54. Reed M, Woe lk er B, Wang P, Wang Y, Anderson 78. Kamb A (1995) Trends Genet 11: 136-140 ME, Tegtmeyer P (1995) Proc Natl Acad Sei USA 92: 79. Harper JW, Elledge SJ (1996) Curr Opin Genet Dev 6: 9455-9459 56-64

Przypominamy o zmianie numeru konta prenumeraty POSTĘPÓW BIOCHEMII Nowy numer: PBK XIII O/Warszawa, 370044-1225-2720-3-69

Z przyjemnością informujemy, że od stycznia 1997 Redakcja Postępów Biochemii dysponuje własnym numerem poczty komputerowej, e-mail: Postępy @ nencki.gov.pl Od kwietnia br. w poniedziałki i czwartki odbywać się będą w godz. 1 400-1 600 w siedzibie Zarządu Głównego P.T.Bioch., pokój nr 632, dyżury naszej Redakcji, tel. 659-8571 w. 441.

Adres Redakcji: Polskie Towarzystwo Biochemiczne, Redakcja Kwartalnika „Postępy Biochemii” , ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa

90 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 System ubikwitynacji i jego rola u drożdży Saccharomyces cerevisiae

The ubiquitin conjugation system and ist role in the yeast Saccharomyces cerevisiae

ANNA TOBIASZ1, TERESA ŻOŁĄDEK2

Spis treści: Contents:

I. Wstęp I. Introduction II. Geny ubikwityny i ich ekspresja II. Ubiquitin genes and their expression III. Sposoby wiązania ubikwityny z białkami III. Types of ubiquitin-protein conjugates IV. Enzymy systemu ubikwitynacji u drożdży IV. Enzymes of ubiquitin-conjugation system of the yeast IV-Í. Enzymy aktywujące — El IV-1. Ubiquitin-activating enzymes — El IV-2. Enzymy koniugujące — E2 IV-2. Ubiquitin-conjugating enzymes — E2 1V-3. Ligazy ubikwitynowo-białkowe — E3 IV-3. Ubiquitin-protein ligases — E3 V. Degradacja białek i recyrkulacja ubikwityny V. Protein degradation and ubiquitin recycling VI. Rola modyfikacji białek ubikwityną VI. Function of ubiquitin conjugation VII. Uwagi końcowe VII. Concluding remarks

I. Wstęp Ubikwityną jest zatem najbardziej konserwatywnym z białek. Cząsteczka ubikwityny ma globularną budo­ Ubikwityną, zbudowane z 76 aminokwasów białko, wę, odporną na wysoką temperaturę, zmiany pH wchodzi w skład uniwersalnego systemu modyfikowa­ i zmiany polarności. Jej obecność, w formie wolnej lub nia białek u eukariontów. System ten, zwany systemem związanej z białkami, stwierdzono w cytoplazmie, ubikwitynacji składa się, oprócz ubikwityny, z układu jądrze i na powierzchni komórki u wszystkich organiz­ enzymatycznego katalizującego proces przyłączenia jej mów eukariotycznych [2]. do białek. Ubikwityną odgrywa podstawową rolę W artykule przedstawiono informacje na temat w proteolizie białek nieprawidłowych oraz białek mechanizmu degradacji białek przy udziale ubikwity­ regulacyjnych o krótkim okresie półtrwania. Zaan­ ny oraz procesów, w które zaangażowana jest ubi- gażowana jest także w regulację ekspresji genów, kwitynacja. Bliższe informacje o cząsteczce ubikwityny reperację DNA, transformację nowotworową, regula­ są opublikowane w Postępach Biochemii [6]. cję cyklu komórkowego, wpływa na aktywność chro- matyny, bierze także udział w powstawaniu ryboso­ II. Geny ubikwityny i ich ekspresja mów i peroksysomów [1-3]. Jednakże nie jest jasne czy we wszystkich tych procesach modyfikacja ubikwityną U drożdży istnieją cztery geny — U BI, kodujące służy jako sygnał do degradacji czy też pełni inne ubikwitynę, wśród których wyróżnia się dwie ich funkcje nie związane bezpośrednio z proteolizą [4], Drożdże Saccharomyces cerevisiae są idealnym mo­ delem w badaniach nad funkcją i mechanizmem ubi­ kwitynacji, ze względu na łatwość stosowania metod genetyki klasycznej i molekularnej [5]. Wprawdzie są one organizmami jednokomórkowymi, ale pod wzglę­ dem złożoności budowy nie różnią się od komórek wyższych organizmów. Natomiast charakteryzuje je U B 14 I 1 I 1 1 ~ l krótki czas generacji. Ponadto porównanie sekwencji Rye. 1. Organizacja gcnow kodujących ubikwitynę aminokwasowej ubikwityny drożdży i człowieka wy­ Opis ryciny: białymi prostokątami oznaczono elementy kazało identyczność 73 z 76 jej reszt aminokwasowych. kodujące ubikwitynę, czarnymi i szarymi prostokątami — elementy kodujące białka fuzyjne lub aminokwas ochron­ ny. G eny UBII i UBI2 zawierają identycznie usytuowane 1 Mgr, 2 dr Zakład Genetyki, Instytut Biochemii i Biofizyki introny, zaznaczone linią łamaną, wewnątrz elementów PAN, ul. Pawińskiego 5A, 02-106 Warszawa kodujących ubikwitynę.

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 91 podstawowe klasy (Ryc. 1) [7]. Do pierwszej klasy rozgałęzione, połączone z białkiem, które nazwano zaliczono poligen — U BI4, w którym jednostka kodu­ multiubikwityną. jąca 76 aminokwasów ubikwityny powtarza się pięcio­ Znanych jest wiele rozmaitych białek modyfikowa­ krotnie. Na końcu 3’ genu znajduje się kodon amino­ nych jedną cząsteczką ubikwityny (Ryc. 2A). Rola kwasu, nie występującego w dojrzałej ubikwitynie. monoubikwitynacji nie jest do końca jasna. Przyłącze­ Zadaniem tego aminokwasu jest ochrona C-końca nie ubikwityny do N-końca białka rybosomalnego (Ryc. niedojrzałej ubikwityny przed koniugacją z białkiem. 2A), pełni rolę regulatorową — zwiększa wydajność W procesie dojrzewania zostaje on odcięty. Na końcu wbudowywania białka rybosomalnego do podjednostki 5’ poligenu znajduje się nieulegająca transkrypcji sek­ rybosomu [8]. Białka multiubikwitynowane możemy wencja regulatorowa, odpowiedzialna za ekspresję podzielić na kilka grup (Ryc. 2C, 2D, 2E). Niektóre w warunkach stresu termicznego. histony i receptory w błonie komórkowej, nie pod­ Do drugiej klasy należą geny fuzyjne: UBI1, U BI 2, legające proteolizie, zawierają kilka pojedynczo pod­ U BI 3, które składają się z pojedynczej sekwencji DNA stawionych cząsteczek ubikwityny (Ryc. 2C). Przyłącze­ kodującej ubikwitynę, przedłużonej na końcu 3’ sek­ nie multiubikwitynowego łańcucha nierozgałęzionego wencjami nukleotydowymi kodującymi białka rybo- do białka jest sygnałem do jego degradacji (Ryc. 2D). somalne. Zidentyfikowano dwa rodzaje białek rybo- Multiubikwitynacja łańcuchami rozgałęzionymi (Ryc. somalnych występujących w fuzji z ubikwityną [8]. 2E), z udziałem Lys-29 i Lys-63 prawdopodobnie Pierwsze — to białko o 52 aminokwasach, które występuje w odpowiedzi komórki na stres [11]. w dojrzałej (pozbawionej ubikwityny) formie wchodzą do większej podjednostki rybosomu. Białko drugiego rodzaju ma długość 76 aminokwasów i jest elementem mniejszej podjednostki rybosomu. Ekspresja genów obu klas jest w cyklu życiowym ściśle regulowana. W warunkach szybkiego wzrostu i podziałów komórkowych, a więc w okresach wzmo­ żonej biosyntezy białka, indukowane są przede wszyst­ kim geny kodujące ubikwitynę połączoną z białkami rybosomalnymi. W warunkach głodu, w szoku ciepl­ nym i w okresach stacjonarnego wzrostu komórek w hodowli, ekspresji ulega głównie gen poliubikwity- nowy [9]. Nie stwierdzono obecności w komórkach poliubik- wityny, to jest białka, w którym C-koniec jednego monomeru łączyłby się z N-końcem następnego. Naj­ prawdopodobniej tworząca się poliubikwityna jest szybko, być może równocześnie z translacją, hydro- lizowana do ubikwityny. Podobnie rzecz się ma z ubi­ kwityną sprzężoną z genami kodującymi białka rybo- somalne [9]. Ryc. 2. Sposoby wiązania się ubikwityny z białkiem. III. Sposoby wiązania ubikwityny z białkami Opis ryciny: linią prostą oznaczono cząsteczkę białka, z zaznaczeniem jego N- i C-końca, uczestniczącego w proce­ sie ubikwitynacji, szarymi kwadratami cząsteczki ubikwity­ Centrum aktywne ubikwityny znajduje się na jej ny. Dalszy opis w tekście. karboksylowym końcu. W procesie modyfikacji białek ubikwityną (patrz roz. IV) grupa karboksylowa glicyny IV. Enzymy systemu ubikwitynacji u drożdży z C-końca ubikwityny łączy się wiązaniem izopep- tydowym z grupą s-aminową lizyny koniugowanego Przyłączenie ubikwityny do białek przebiega wielo­ białka. Obiektem modyfikacji może też być sama etapowo. Jest to kaskada transestryfikacji (Ryc. 3), ubikwityną, która in vivo jest już połączona z białkiem. w której powstają wysokoenergetyczne tioestry przy Głównym miejscem akceptorowym w cząsteczce ubi­ udziale cząsteczki cysteiny w centrum aktywnym en- kwityny jest jedna z siedmiu reszt lizynowych, Lys-48 zmów i C-końcowej glicyny w cząsteczce ubikwityny [10]. Zaobserwowano jednak, że w sytuacjach gdy [13]. Proces ligacji ubikwityny z białkiem katalizują lizyna-48 jest związana lub zamieniona na inny amino­ trzy klasy enzymów: kwas, reszty Lys-29 i Lys-63 też mogą tworzyć koniu- El lub Uba — enzymy aktywujące (ang. Ubiąuitin- gaty. Takie wiązanie poprzez Lys-63 jest ważne w od­ -activating enzyme) powiedzi komórki na stres [11] oraz w procesie E2 lub Ubc — enzymy koniugujące (ang. Ubiquitin- naprawy DNA [12]. W ten sposób powstają struktury -conjugating enzyme) ubikwitynowe prostoliniowe i prawdopodobnie także E3 lub Ubr — enzymy rozpoznające, ligazy ubi-

92 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1 997 teinę, która jest niezbędna do jego funkcjonowania to jednak dotychczas nie udało się wykazać dla niego aktywności El [16]. Geny UBA1 i UBA2 są niezbędne dla życia komórki. Białko Ubal jest zlokalizowane w cytoplazmie i jądrze a białko Uba2 w jądrze. Uba2p nie komplementuje braku Ubalp w komórce, i od­ wrotnie, nawet gdy lokalizacja komórkowa tych białek zostanie zmieniona przez mutagenezę [16].

IV-2. Enzymy koniugujące — E2

U drożdży jest znanych 12 genów kodujących enzymy E2 (Tab. 1) [2, 3, dane nieopublikowane]. Porównanie sekwencji wszystkich znanych enzymów E2 wykazało istnienie konserwatywnej, centralnie po­ łożonej domeny (UBC), złożonej z ~ 150 aminokwa­ sów, zawierającej resztę cysteinową w centrum aktyw­

produkt nym, niezbędną do wytworzenia wiązania tioestrowe­ (ubikwitynowany substrat) go z ubikwityną. Zgodność sekwencji różnych E2 Ryc. 3. Przyłączanie ubikwityny do białka. osiąga w tym rejonie co najmniej 35% [2]. Enzymy E2 Opis ryciny: Ubikwityna (Ub) jest aktywowana przy udziale można podzielić na trzy klasy: jedne zbudowane są enzymu aktywującego — El w obecności ATP. W wyniku tej reakcji powstaje tioester El~Ub. Zaktywowana ubi­ prawie wyłącznie z domeny UBC, inne przedłużone są kwityna jest przekazana z El na specyficzną grupę tiolową na końcu karboksylowym lub aminowym domeny enzymu koniugującego — E2. Efektem tej reakcji jest centralnej dodatkowymi odcinkami łańcucha białko­ powstanie następnego tioestru E2 ~ Ub. E2 albo bezpośred­ nio przenosi ubikwitynę na substrat, albo za pośrednictwem wego [2], Rola tych końcowych odcinków polega na E3 — właściwej ligazy ubikwitynowo-białkowej. Enzym E3 interakcji enzymu E2 z E3, rozpoznawaniu substratu tworzy kolejny tioester z ubikwityną. Substrat może być białkowego bez udziału E3 [17] oraz na lokalizacji mono- lub multiubikwitynowany. enzymów E2 w różnych kompartmentach komórki kwitynowo-białkowe (ang. Ubiguitin recognition, Ubi- [18], Wydaje się, że regulacja aktywności enzymów E2 ąuitin-protein ligase) [14]. oraz ich interakcja z białkami jest kontrolowana przez Proces rozpoczyna połączenie ubikwityny z enzy­ odwracalną fosforylację [19], mem aktywującym — El. Jest to reakcja dwuetapowa. Enzymy E2 determinują specyficzność substratową Najpierw C-terminalna glicyna ubikwityny jest ak­ ubikwitynacji. Mutacje w różnych genach kodujących tywowana przez ATP z utworzeniem adenylo-ubi- E2 powodują różne fenotypy mutantów. Cztery en­ kwityny i uwolnieniem AMP a następnie przenoszona zymy E2 (Ubc4, Ubc5, Ubc6, Ubc7) biorą udział jest na grupę tiolową cysteiny w centrum aktywnym E 1 w degradacji czynnika transkrypcyjnego MAToc2 dro­ z utworzeniem wiązania tioestrowego [1]. W procesie żdży [20], a niektóre z nich biorą także udział w innych ubikwitynacji białka jest to jedyny etap, który wymaga procesach. Różne E2 mogą tworzyć heterooligomery- energii. czne kompleksy co prowadzi do zmiany ich specyficz­ Z El ubikwityna zostaje przekazana na białko ności [20], Dalsze rozszerzenie specyficzności zacho­ koniugujące — E2. E2 przenosi ubikwitynę bezpośred­ dzi przypuszczalnie na skutek interakcji z E3 [3]. nio na substrat, w obecności albo za pośrednictwem białka E3, ligazy ubikwitynowo- białkowej. Enzymy IV-3. Ligazy ubikwitynowo-białkowe — E3 E2 i E3 występują w komórce jako rodziny białek i wydaje się, że różne kombinacje kompleksu E2-E3 U drożdży pierwszym poznanym genem kodującym determinują ich specyficzność substratową. ligazę ubikwitynowo-białkową jest UBR1 (Tab. 1) [21], Białko Ubrl ma zdolność rozpoznawania amino­ IV-1. Enzymy aktywujące — El kwasu na N-końcu substratu i tworzenia połączonego z substratem łańcucha multiubikwitynowego. Badania Enzymy El odznaczają się dużym stopniem konser- nad P-galaktozydazą, w której N-końcową metioninę watywności w obrębie miejsca aktywacji, w pobliżu zastąpiono innymi aminokwasami wykazały, że rodzaj cysteiny niezbędnej do tworzenia wiązania tioestrowe­ aminokwasu N-końcowego decyduje o długości okre­ go oraz w obrębie miejsca wiązania ATP [15, 16], su półtrwania białka w komórce. Prawidłowość tę Enzymy El mogą tworzyć kompleks z E2. Dotychczas nazwano zasadą N-końca (ang. N-end rule) [22]. sklonowano u drożdży gen UBA1 kodujący enzym El Mutanty, w których brak jest genu UBR1 rosną [15] oraz gen UBA2 wysoce homologiczny do U B A 1. normalnie ale nie degradują syntetycznych substratów Wprawdzie U BA2 koduje białko zawierające sekwen­ podlegających zasadzie N-końca [21] oraz nie są cję wiążącą ATP i posiadające konwerwatywną cys­ zdolne do importu dwu- i trójpeptydów [23]. Ubrlp

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 93 T abela 1. Komponenty systemu ubikwitynowego u drożdży

Enzym y G eny Funkcja i regulacja

E l UBAI — aktywacja C-końcowej reszty ubikwityny — gen niezbędny do życia komórki

UBA2 — gen niezbędny do życia komórki — przypuszczalnie pełni funkcję El lub E2

E2 UBC1 — uczestniczy w regulacji cyklu życiowego komórki wraz z UBC4 i UBC5, szczególnie w sporulacji i rozwoju — indukuje fazę G0

UBC2/RAD6 — uczestniczy w reperacji DNA, indukowany przez mutagenezę — wiąże się z histonami przez kwaśny koniec — niezbędny w sporulacji — represja retrotranspozonów — uczestniczy wraz z UBR1 w degradacji białek podlegających zasadzie N-końca (ang. N-end rule pathway) — indukowany przez czynniki uszkadzające DNA

UBC3/CDC34 — niezbędny w regulacji cyklu komórkowego G ^ S , replikacji DNA, kształtowaniu wrzeciona podziałowego — współdziała z CDC4 i CDC53

UBC4 — degradacja białek o krótkim okresie życia i białek nieprawid­ UBC5 łow ych — uczestniczy w cyklu życiowym komórki wraz z UBC1 — niezbędny w warunkach stresu (termicznego, obecności kadmu, analogów aminokwasowych) — degradacja fuzji ubikwityna-P-galaktozydaza — niezbędny w sporulacji — degradacja MATa2, receptora Ste2 — supresor wielokopijny mutacji sekrecyjnej secól — indukowany w warunkach stresu termicznego i obecności kadmu — gen zawiera introny

UBC6 — białko wchodzące w skład błony retikulum endoplazmatycznego — degradacja MATa2 i białka błony retikilulm endoplazmatycz­ nego S ecól — supresor wielokopijny mutacji sekrecyjnej secól

UBC7 — powoduje oporność na kadm — degradacja MATa2 i białka błony retikulum endoplazmatycz­ nego S ecól — indukowany w obecności kadmu

UBC8 — gen zawiera introny

UBC9 — niezbędny w regulacji cyklu komórkowego G 2—>M — degradacja cyklin CLB2, CLB5 — gen zawiera introny

UBC10/PAS2 —- biogeneza peroksysomów

E3 UBR1 — współdziała z UBC2 — uczestniczy w degradacji białek poprzez rozpoznawanie N-koń- cowego aminokwasu (ang. N-end rule pathway)

RSP5 — uczestniczy w degradacji permeaz (Gaplp, Fur4p) — wpływ na lokalizację komórkową Mod5p-I

enzym DOA4 — recyrkulacja ubikwityny deubikwitynu- — reperacja DNA jący — kontrola wzrostu komórki

http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 kontroluje aktywność plazmatycznego transportera Nadal nie jest jasne, co decyduje o losie ubikwityno- peptydów Ptr2p, przypuszczalnie między innymi po­ wanego białka. Postulowano, że białko zawierające przez kierowanie go do degradacji [24]. Jedynym jedną lub kilka pojedynczo ubikwitynowanych reszt znanym Fizjologicznym substratem u drożdży, którego lizynowych, takie jak histony, kalmodulina i niektóre degradacja zależy od Ubrl jest podjednostka a białka receptory w błonie komórkowej, są trwałe i nie pod­ G kodowana przez GPA1 [25], Działanie Ubrl wyma­ legają proteolizie [2]. Degradacji ulegają natomiast ga obecności Ubc2, Ubrl współdziała również i Fizycz­ białka podstawione prostym lub rozgałęzionym łań­ nie łączy się z enzymami zmieniającymi N-koniec cuchem cząsteczek multiubikwityny. Coraz częściej białek: N-terminalną amidazą kodowaną przez NTA1 podkreśla się, że decydująca o losach koniugatu jest i transferazą Arg-tRNA-białkową kodowaną przez konformacja łańcucha multiubikwityny. Poza tym ATE1 [24]. sama sekwencja aminokwasowa i konformacja sub- Genem kodującym ligazę ubikwitynowo-białkową stratu białkowego decyduje o budowie koniugatu jest również RSP5 [26], Białko Rsp5 jest wysoce i jego dalszych losach [36]. Na przykład, w N-końcu homologiczne do ludzkiej ligazy ubikwitynowo-biał- łańcucha polipeptydowego cyklin mitotycznych B, kowej E6-AP, niezbędnej do degradacji białka p53. wykazano obecność fragmentu destrukcyjnego (ang. Homologia występuje w C-końcu, w obrębie domeny destruction box), niezbędnego do proteolitycznej de­ wielkości ~350 aminokwasów, która jest odpowie­ gradacji cyklin, przy udziale systemu ubikwitynacji dzialna za aktywność enzymatyczną. W domenie tej [37, 38], Permeaza uracylowa także zawiera sekwencję znajduje się cysteina, niezbędna do tworzenia wiązania podobną do fragmentu destrukcyjnego. Mutacja w je­ tioestrowego z ubikwityną [26]. Białko Rsp5 efektyw­ go obrębie powoduje odporność na degradację w wa­ nie oddziałuje z enzymem UbcH5, który jest ludzkim runkach stresu [39]. Inne cykliny: CLN1, CLN2, homologiem drożdżowego Ubc4, a słabo z innymi CLN3, akumulujące się pod koniec fazy Gl, zawierają badaniami E2 [27]. Rsp5p występuje w komórce sekwencję PEST (bogatą w prolinę, kwas glutamino­ zasocjowane z innymi białkami (jednym z nich jest wy, serynę i treoninę) [40], obecną również w innych Buli) tworząc duże kompleksy [28]. szybko degradowanych białkach, np. czynniku trans- Ligaza ubikwitynowo-białkowa Rsp5 jest niezbędna krypcyjnym Gcn4 [41]. Usunięciejej powoduje stabili­ do ubikwitynacji, inaktywacji, endocytozy i degradacji zację białek, brak degradacji i ich akumulację. permeazy aminokwasowej Gaplp oraz permeazy ura- Proces ubikwitynacji białek jest procesem bardzo cylowej Fur4p [29, 30]. Permeazy te, odmiennie od precyzyjnym. Bezpośrednio przed ubikwitynacją może większości ubikwitynowanych białek degradowanych zajść fosforylacja cząsteczki białka katalizowana przez przez proteasom 26S, są degradowane przez proteazy kinazy białkowe, co stwierdzono dla receptora Ste2p wakuolarne (patrz poniżej). Białko Rsp5 jest również u drożdży [42] oraz białek z komórek ludzkich [43], niezbędne do prawidłowej cytoplazmatyczno-mito- Fosforylacja może wpływać na przyłączenie ubikwity­ chondrialnej lokalizacji Mod5p-I, enzymu modyFiku- ny, poprzez zmianę konformacji białek np. przez jącego tRNA [31]. W mutantach mdpl/rsp5 pula odsłonięcie domen rozpoznawanych przez właściwe mitochondrialna Mod5p-I jest zmniejszona przy wyż­ enzymy katalizujące proces ubikwitynacji. szym poziomie całkowitym [32], co potwierdza wnio­ W przemiany jakim może podlegać koniugat ubi- sek z badań in vitro nad mitochondriami szczura [33, kwitynowo-białkowy zaangażowane są też hydrolazy 34], że ubikwitynacja ma wpływ na import białek do C-końca (Ubp). U drożdży znane są trzy Ub-specyFicz- mitochondrów. Interesujące jest, że Rsp5p jest również ne proteazy Ubpl-Ubp3 [44] oraz znaleziono dal­ aktywatorem transkrypcji a funkcja ta nie zależy od szych kilkanaście genów, które przypuszczalnie kodu­ zdolności wiązania ubikwityny przez cysteinę [35]. ją białka o tej funkcji [3]. Usuwanie ubikwityny z ko­ niugatu zmienia prawdopodobieństwo rozpoznawania V. Degradacja białek i recyrkulacja go przez proteasom 26S. Przypuszcza się, że szybkość ubikwityny degradacji specyFicznych białek może być ściśle regulo­ wana przez enzymy usuwające ubikwitynę [3]. Ubikwitynowane białka mogą wejść na jeden z kilku Koniugaty, które weszły na szlak prowadzący do szlaków metabolicznych. Cząsteczki ubikwityny mogą degradacji, ulegają proteolizie przy udziale zależnego być usunięte z koniugatu przez hydrolazy C-końca od ATP kompleksu proteazowego, proteasomu 26S. ubikwityny zwane też proteazami ubikwityno-specyFi- To wielkie białko zbudowane jest z trzech zasoc- cznymi (Ubp, ang. uhiquitin-specific processing protea­ jowanych czynników: dwóch o stałej sedymentacji 19S se). Jeżeli ubikwityną nie zostanie usunięta białka (u wyższych eukariontów CF-1 i CF2) i jednego o stałej mogą zostać zdegradowane przy udziale proteasomu sedymentacji 20S (u wyższych eukariontów CF-3) [45, 26S lub trwale pozostać w komórce. Ubikwitynowane 46]. Do degradacji białka związanego z ubikwityną białka błony plazmatycznej mogą ulec endocytozie konieczna jest asocjacja wszystkich trzech czynników. i zostać skierowane do wakuoli (odpowiednik lizoso- Hydroliza ATP towarzyszy dwóm odrębnym reak­ mów u wyższych eukariontów) gdzie są degradowane cjom: połączeniu się składników kompleksu proteazo­ przez proteazy wakuolarne. wego w formę aktywną i samej proteolizie. Na szcze­

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 95 Formowanie Wiązanie Odłączenie łańcucha Rozpad łańcucha koniugatu koniugatu z 26S ubikwityny od białka ubikwityny ubikwityna-białko proteosomem i jego rozwijanie i degradacja białka

Ryc. 4. Hipotetyczny mechanizm degradacji białka przy udziale proteasomu. Opis ryciny: Proces degradacji białka przy udziale proteasomu rozpoczyna się od formowania koniugatu ubikwityny (oznaczono czarnymi kulkami) z białkiem. Następnie, zmodyfikowane ubikwityną białko wiąże się z 26S proteasomem (rdzeń katalityczny 20S oznaczono jasnoszarym cylindrem, czynniki o stałej sedymentacji 19S na końcach katalitycznego rdzenia 20S oznaczono ciemnoszarymi cylindrami). Po związaniu się koniugatu z proteasomem następuje odłączenie łańcucha ubikwityny, rozwinięcie białka i jego wejście do rdzenia katalitycznego, gdzie następuje degradacja białka, (wg [48] za pozwoleniem Celi Press)

gólną uwagę zasługuje kompleks białkowy o stałej regulacja aktywności enzymu [53], czy translokacja sedymentacji 20S stanowiący rdzeń katalityczny kom­ białka z cytoplazmy do błony [54]. pleksu, nazwanym w literaturze proteasomem 20S [47]. Jego obecność stwierdzono w jądrze i cytoplaz- VI. Rola modyfikacji białek ubikwityną mie. Jest to cylindryczna cząsteczka zbudowana z 4 współosiowych pierścieni, z których każdy składa Enzymy uczestniczące w modyfikowaniu białek ubi­ się z 7 podjednostek białkowych [48], Na obu końcach kwityną, kodujące je geny oraz ich funkcje przed­ rdzenia katalicznego znajdują się czynniki o stałej stawiono w tabeli 1 [2, 4, 11, 16, 18, 29, 31, 37, 52, sedymentacji 19S. Każdy z nich składa się co najmniej 55-57], Rolę procesu ubikwitynacji przedstawiono na z 15 podjednostek [45]. Większość genów kodujących rycinie 5. Podsumowując zauważyć można, że ubi­ podjednostki proteasomu S. cerevisiae jest zidentyfiko­ kwitynacja białek towarzyszy wielu procesom metabo­ wana i większość jest niezbędna do życia komórki [2, licznym. 45, 49]. Hipotetyczny mechanizm degradacji białka 1. Kieruje białka o krótkim czasie życia oraz białka przy udziale proteasomu przedstawiono na rycinie 4. nieprawidłowe do degradacji przez proteasom 26S. Składnikiem systemu ubikwitynowego jest także 2. Modyfikacja ubikwityną niektórych białek błono­ enzym deubikwitynujący, u drożdży Doa4p, który jest wych jest sygnałem do ich endocytozy i kierowania do związany z proteasomem 26S [50]. Jego rolą jest wakuolarnego systemu degradacji [42, 51], odcinanie od degradowanego białka cząsteczek ubi­ 3. Bierze udział w tworzeniu organelli komórkowych kwityny, która ponownie służy do ubikwitynacji in­ oraz wpływa na lokalizację komórkową białek, po­ nych białek. Delecja genu DOA4 powoduje zahamo­ przez udział w transporcie przez błonę peroksysomal- wanie proteolizy niektórych substratów podlegających ną [56], błonę retikulum endoplazmatycznego [18] ubikwitynacji (np. MATa2) i akumulację multiubi- kwitynowanych białek. Tak więc Doa4p wraz z hydro- lazami C-końca odgrywa rolę w recyrkulacji ubi­ kwityny. INNE FUNKCJE Ostatnie badania nad białkami błony plazmatycznej E 1 -E 2 -E 3 U b \ u drożdży wskazują na nową rolę jaką może pełnić ATP /U b modyfikacja ubikwityną. Związanie czynnika oc do Ub U b \ ENDOCYTOZA Ub jego receptora, białka Ste2, stymuluje endocytozę kompleksu receptor-ligand co kieruje go do wakuoli, ENZYM gdzie ulega degradacji. Równocześnie stymulowana DEUBIKWITYNUJĄCY DEGRADACJA PRZY UDZIALE jest ubikwitynacja końca cytoplazmatycznego Ste2p. PROTEASOMU

Ubikwitynacja ta jest niezbędna do zajścia endocytozy Ryc. 5. Rola procesu ubikwitynacji białka. kompleksu [42], Ubikwitynacja służy więc jako sygnał Opis ryciny: Substrat białkowy jest modyfikowany ubi­ do endocytozy i degradacji białka w wakuoli. Podobną kwityną (Ub) przy udziale enzymów: El, E2, E3 (patrz Ryc. 3). Substrat może być monoubikwitynowany lub rolę odgrywa ubikwitynacja transportera aminokwa­ multiubikwitynowany. Ubikwityną jest odcinana od sub- sów Gapi [29], permeazy uracylu [30], transportera stratu przy udziale enzymu deubikwitynującego. Modyfika­ Pdr5 [51] i transportera Ste6 [52], Badania na innych cja białek ubikwityną jest sygnałem do degradacji przy udziale proteasomu, albo sygnałem do endocytozy, albo organizmach dostarczają dowodów, że modyfikacja odgrywa inną funkcję metaboliczną, (wg [36] za pozwole­ ubikwityną może pełnić jeszcze inne funkcje, takie jak niem Celi Press)

96 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 oraz w imporcie białek do mitochondriów [31, 33, 34]. Kolarov J, Goffeau A, Varshavsky A (1995) J Biol Chem 270: 18099-18109 4. Ubikwitynacja jest zaangażowana w reperację 17. Gosink MM, Vierstra RD (1995) Proc Natl Acad Sci DNA [12], w procesy uruchamiane w czasie stresu USA 92: 9117-9121 [11], w oporności na różne związki chemiczne, trans­ 18. Sommer T, Jentsch S (1993) Nat ure (Lond) 365: 176-179 19. Goebl MG, Goetsch L, Byers B ( 1 994) Mol Cell Biol 14: krypcję, kontrolę cyklu komórkowego a u ssaków 3022-3029 także transformację nowotworową, spermatogenezę 20. Chen P, Jonson P, Sommer T, Jentsch S, Hoch­ i infekcje wirusowe. strasser M (1993) Cell 74: 357-369 21. Bartel B, Wunning I, Varshavsky A (1990) EMBO 5. Rola monoubikwitynacji białek, takich jak np. J 9: 3179-3189 histony czy receptory błonowe jest nieznana. 22. Varshavsky A (1992) Cell 69: 725-735 23. Alagramam K, Naider F, Becker JM (1995) Mol Microbiol 15: 225-234 VII. Uwagi końcowe 24. Varshavsky A (1995) W: Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, t. LX, Cold Spring Harbor Laboratory Modyfikacja białek ubikwityną, odgrywa kluczową Press, st 461-478 25. Madura K, Varshasky A (1994) Science 265: 1454-1458 rolę w procesach regulacyjnych komórki. Mimo znacz­ 26. Huibregtse JM, Scheffner M, Beaudenon S, H o­ nego postępu jaki dokonał się w ostatnich latach wl ey PM (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92: 2563-2567 w zrozumieniu roli ubikwitynacji białek, nadal jej 27. Nuber U, Schwarz S, Kaiser P, Schneider R, Scheffner M (1996) J Biol Chem 271: 2795-2800 funkcja biologiczna jest znana tylko fragmentarycznie. 28. Yashiroda H, Oguchi T, Yasuda Y, Toh-e A, Najlepiej poznanym procesem, w którym uczestniczy K i k u c h i Y (1996) Mol Cell Biol 16: 3255-3263 ubikwityną jest proces degradacji białek. Jednak przy­ 29. Hein C, Springael J-Y, Volland C, Haguenauer- -Tsapis R, André B (1995) Mol Microbiol 18: 77-87 toczone przykłady uzmysławiają ogromną złożoność 30. Galan JM, Moreau V, André B, Volland C, Hagu- procesów, towarzyszących degradacji białek. Ważną enauer-Tsapis R (1996) J Biol Chem 271: 10946-10952 staje się odpowiedź na pytanie, co decyduje o wejściu 31. Żołądek T, Tobiasz A, Va du va G, Bogu ta M, Martin NC, Hopper AK (1997) Genetics 145: 595-603 ubikwitynowanego białka na określony szlak metabo­ 32. Żołądek T, Vaduva G, Hunter LA, B o g u t a M, Go liczny. Czy ubikwityną, która jest zaangażowana w tak BD, Martin NC, Hopper AK (1995) Mol Cell Biol 15: wiele procesów, odgrywa w nich tylko rolę degradacyj- 6884-6894 33. Zhaung Z, McCauley R (1989) J Biol Chem 264: 14594- ną, czy też regulacyjną? Ostatnie badania wskazują, że -14596 rola degradacyjna ubikwityny jest tylko jedną z wielu 34. Zhaung Z,,Marks B, McCauley R (1989) J Biol Chem możliwych ról jaką pełni to białko. 267: 591-596 35. Imhof MO, McDonnell DP (1996) Mol Cell Biol 16: 2594-2605 Praca autorów jest wspierana przez Komitet Badań Nauko­ 36. Hochstrasser M (1996) Cell 84: 813-815 wych — grant nr 6P04A 026028. 37. Schwob E, Nasmyth K (1993) Genes Develop 7: 1160-1175 38. Grzelakowska-Sztabert B (1993) Post Biochem 39: Artykuł otrzymano 18 grudnia 1996 r. 16-25 39. Galan JM, Volland C, Urban-Grimal D, Hague- Zaakceptowano do druku 14 lutego 1997 r. nauer-Tsapis R (1994) Biochem Biophys Res Commun 201 : 769-775 40. Barrai Y, Jentsch S, Mann C (1995) Genes Develop 9: 399-409 Piśmiennictwo 41. Kornitzer D, Raboy B, Kulka R G, Fink GR (1994) EMBO J 13: 6021-6030 1. F i n 1 e y D (1992 W: Jones EW, Pringle JR, Broach JR (red) 42. Hicke L, Riez man H (1996) Cell 84: 277-287 The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces: 43. DiDonato J, Mercurio F, Karin M (1995) Mol Cell Gene Expression. Cold Spring Harbor Laboratory Press, str. Biol 15: 1302-1311 539-581 44. Baker R T, Tobias JW, Varshavsky A (1992) J Biol 2. Jentsch S (1992) Annu Rev Genet 26: 179-207 Chem 267: 23364-23375 3. Hochstrasser M (1995) Curr Opin Cell Biol 7: 215-223 45. Fischer M, Hilt W, Richter-Ruoff B, G o n e n H, 4. Ciechanover A (1994) Cell 79: 13-21 Ciechanover A, Wolf DH (1994) FEBS Lett 355: 69-75 5. Rytka J, Palamarczyk G (1993) Post Biochem 39: 46. Wójcik C (1995) Post Biol Kom 22: 295-315 152-155 47. Eytan E, Ganoth D, Armon T, Hershko A (1989) 6. Piotrowska U (1993) Post Biochem 39: 8-16 Proc Natl Acad Sci USA 86: 7751-7755 7. Ózkaynak E, Finley D, Solomon MJ, Varshavs­ 48. Jentsch S, Schlenker S (1995) Celi 82: 881-884 ky A (1987) EMBO J 6: 1429-1439 49. D e Marini DJ, Papa F R, Swaminathan S, Ur sie 8. Finley D, Bartel B, Varshavsky A (1989) Nature D, Rasmussen TP, Culbertson MR, Hochstras­ (Lond) 338: 394-401 ser M (1995) Mol Celi Biol 15: 6311-6321 9. Monia BP, Ecker DJ, Crooke ST (X996) Bio/techno­ 50. Papa F R, Hochstrasser M (1993) Nature (Lond) 366: logy 8: 209-215 313-319 10. Chen Z, Pickart CM (1990) J Biol Chem 265: 21835-21842 51. Egner R, Kuchler K (1996) FEBS Lett 378: 177-181 11. Arnason T, Ellison MJ (1994) Mol Cell Biol 14: 7876- 52. Kölling R, Hollenberg CP (1994) EMBO J 13: 3261- -7883 -3271 12. Spence J, Sadis S, Haas A L, Finley D (1995) Mol Cell 53. Chen ZJ, Parent L, ManiatisT (1996) Cell 84: 833-862 Biol 15: 1265-1273 54. Wang Y, Yeung Y G, Langdon W Y, Stanley ER 13. Scheffner M, Nuber U, Huibregtse JM (1995) (1996) J Biol Chem 271: 17-20 Nature (Lond) 373: 81-83 55. Seufert W, Futscher G, Jentsch S (1995) Nature 14. Hershko A (1991) Trends Biochem Sci 16: 265-268 (Lond) 373: 78-81 15. McGrath JP, Jentsch S, Varshavsky A (1991) 56. Wiebel FF, Kunau WH (1992) Nature (Lond) 359: 73-76 EMBO J 10: 227-236 57. Biederer T, Volk wein C, Sommer T (1996) EMBO 16. Dohmen RJ, Stappen R, McGrath JP, Forrova H, J 15: 2069-2076

97 POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl Koordynacja syntezy mci prowadzącej i opóźnionej DNA w widełkach replikacyjnych

Coordination of the leading and lagging DNA strand synthesis

IWONA J. FIJAŁKOWSKA1, PIOTR JOŃCZYK2

Spis treści: Contents:

I. Wstęp I. Introduction II. Polimerazy prokariotyczne II. The prokaryotic polymerases II-l. Budowa holoenzymu polimerazy III DNA II-l. The structure of DNA polymerase III holoenzyme II-2. Koordynacja replikacji nici prowadzącej i opóź­ II-2. Coordination of leading and lagging strand syn­ nionej thesis III. Porównanie holoenzymu polimerazy III D N A z innymi III. Comparison of DNA polymerase III holoenzyme to replikazami other replicases IV. Podsumowanie IV. Conclusions

Wykaz stosowanych skrótów: PCNA — jądrowy antygen widełek, w postaci krótkich fragmentów (tzw. fragmen­ proliferujących komórek; Pol III — Polimeraza III DNA; ty Okazaki) łączonych następnie w jedną, ciągłą nić. RF-C — czynnik replikacyjny C; SSB — białka wiążące się Nić potomna syntetyzowana w sposób ciągły, zgodnie do jednoniciowego DNA. z ruchem widełek nosi nazwę nici prowadzącej (ang. leading strand), a nić syntetyzowana w sposób nieciągły I. Wstęp — nici opóźnionej (ang. lagging strand) [1] (Ryc. 1). Tematem tego artykułu jest przedstawienie mechaniz­ Podstawowe mechanizmy replikacji DNA, podob­ mów umożliwiających równoczesną syntezę obu nici nie jak inne mechanizmy syntezy makrocząsteczek są DNA w widełkach replikacyjnych. wysoce konserwowane wśród organizmów żywych. Dane genetyczne, biochemiczne, krystalograficzne Dotyczy to reakcji chemicznych i kierunku syntezy oraz analiza komputerowa sekwencji aminokwasowej DNA, udziału primerów RNA, mechanizmu nieciągłej polimeraz prokariotycznych i eukariotycznych wska­ replikacji DNA na nici opóźnionej przy użyciu frag­ zują, że większość polimeraz posiada charakterystycz­ mentów Okazaki [1]. Replikacja chromosomalnego ne, wysoce konserwowane motywy tworzące centra DNA rozpoczyna się w ściśle określonym miejscu, aktywne polimeraz [3], Badania te wykazały podobny zwanym miejscem startu (ang. origin of replicatioń). plan budowy polimeraz, opisywany jako zgodny z re­ Molekularne mechanizmy inicjacji replikacji DNA gułą „prawej ręki” [4], Replikazy często zbudowane są w bakteriach E. coli były tematem niedawno opub­ z wielu podjednostek i oddziaływują podczas syntezy likowanego w Postępach Biochemii artykułu przeglą­ nici potomnej z wieloma białkami [ 1 ]. dowego [2]. W miejscu startu syntezy DNA, roz­ Najlepiej poznanymi genetycznie i biochemicznie dzielające się łańcuchy rodzicielskiego DNA tworzą replikazami są: polimeraza III DNA z Escherichia coli widełki replikacyjne. Dwie nici rodzicielskie zorien­ oraz polimeraza faga T4. Holoenzym polimerazy III towane są w przeciwnych kierunkach. Przeciwna z Escherichia coli służy jako prototyp kompleksu orientacja nici DNA w dupleksie powoduje różny replikacyjnego biorącego udział w syntezie DNA. mechanizm syntezy obu nici potomnych. Wszystkie Stanowi on znakomity obiekt badań, pozwalający na znane replikazy DNA wymagają do rozpoczęcia poli­ zrozumienie zasad replikacji również w innych or­ meryzacji wolnego końca 3’-OH. Synteza DNA obu ganizmach. nici przebiega tylko w kierunku 5’->3\ Powoduje to, że jedna z nici potomnych jest kopiowana w sposób II. Polimerazy prokariotyczne ciągły, zgodnie z ruchem widełek, natomiast druga jest syntetyzowana w kierunku przeciwnym do ruchu II-l. Budowa holoenzymu polimerazy III DNA

1 Dr, 2 dr, Pracownia Mutagenezy i Reperacji DNA, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, ul. Pawińskiego 5A, 02-106 W komórkach Escherichia coli, holoenzym poli­ Warszawa merazy III DNA jest głównym enzymem odpowiedzia-

98 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 Ryc. 1. Schemat budowy widełek replika- cyjnych w komórce E. coli. Strzał­ kami oznaczono kierunek syntezy DNA na nici prowadzącej i opóź­ nionej.

HEUKAZA \

NIĆ OPÓŹNIONA NIĆ ROWADZĄCA lnym za syntezę potomnego DNA. [1], Uważa się że za funkcję korektorską (ang. proofreading). Egzonuk- holoenzym polimerazy III DNA składa się co najmniej leaza 3" —> 5’ usuwa z końca 3’OH włączone w trakcie z 10 podjednostek [5, 6] Badania biochemiczne syntezy DNA nieprawidłowe zasady [11, 12]. Białka i fizykochemiczne wskazują na dimeryczną, asymet­ kodowane przez poszczególne geny zostały oczysz­ ryczną budowę polimerazy (Ryc. 2). Również wielkość czone i podjęte zostały próby rekonstrukcji holoen­ holoenzymu (lMDa) i dane stechiometryczne zymu polimerazy III DNA in vitro. Holoenzym poli­ wskazują na tworzenie asymetrycznego dimeru: merazy III DNA w zależności od składu podjednost- (ac0)2x2y255’xvl/(P2)2 [7, 8]. Dimeryczną budowa holo­ kowego możeny podzielić na kilka strukturalnych enzymu umożliwia zsynchronizowaną replikację nici form. Rdzeń polimerazy zbudowany jest z 3 podjed­ prowadzącej i opóźnionej [1, 9], nostek, które są połączone ze sobą liniowo ot-e-0 [13], Rola poszczególnych podjednostek w procesie re­ Dwa rdzenie połączone są dimerem i tworząc Pol IIP plikacji jest wciąż tematem badań. Poznane są geny [14], Taka struktura umożliwia zsynchronizowaną kodujące poszczególne podjednostki (Tab. 1). Na replikacje obu nici DNA (prowadzącej i opóźnionej) przykład podjednostka ot, kodowana przez gen dnaE, [9]. Pol III* zawiera Pol IIP (rdzeń z i) i kompleks zawiera aktywność polimerazy DNA [10], a podjed­ y [5], do pełnego holoenzymu brakuje jedynie podjed­ nostka e, kodowana przez gen dnaQ (inna nazwa nostki P [15] (Tab. 1). Podjednostka p, zwana „śliz­ mutD), jest 3’ -> 5’ egzonukleazą i odpowiedzialna jest gającą się klamrą” (ang. sliding clamp) formuje pier­

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 99 ścień otaczający DNA, przez co umożliwia efektyw­ niejsze przyłączenie holoenzymu do DNA. Powoduje to znaczne zwiększenie procesywności polimerazy [16]. Procesywność polimerazy określa ilość nukleo- tydów replikowanych podczas jednokrotnego przyłą­ czenia się polimerazy do matrycy DNA. Procesywność samego rdzenia polimerazy III DNA wynosi jedynie 10-15 nukleotydów, natomiast procesywność całego holoenzymu Pol III określa się na kilkaset tysięcy nukleotydów [1]. Kompleks y [5, 6], składa się z 5 różnych podjednostek (y255’xvl/) [17, 18]. Umoż­ liwia on w obecności ATP, ulokowanie pierścienia P w miejscu startu nowego fragmentu Okazaki.

11-2. Koordynacja replikacji nici prowadzącej i opóźnionej

W widełkach replikacyjnych E. coli duplex DNA jest progresywnie rozwijany przez helikazę DNA (białko DnaB) [1]. Helikaza DnaB jest heksamerem zbudowa­ nym z sześciu identycznych podjednostek. In vitro, wolna helikaza odwija DNA z szybkością 35 nuk- lotydów na sekundę. Wiadomo natomiast, że szybkość syntezy DNA w widełkach replikacyjnych wynosi Ryc. 2. Schemat asymetrycznej budowy dimeru holoenzymu poli­ około 1000 nukleotydów na sekundę. Musi więc istnieć merazy III D N A F.. coli. mechanizm koordynujący szybkość odwijania DNA z szybkością replikacji. Ostatnio wykazano, że istnieje plikacyjnych, konieczny jest tylko jeden startujący interakcja pomiędzy podjednostką t holoenzymu poli­ primer RNA, który podlega ciągłej elongacji przez merazy III DNA, a białkiem DnaB [19]. Interakcja polimerazę III DNA. Na nici opóźnionej syntetyzowa­ x-DnaB powoduje prawdopodobnie zmianę konfor­ nych jest wiele primerów zapoczątkowujących syntezę macji DnaB, co zwiększa ponad 10-krotnie szybkość fragmentów Okazaki. Krótkie primery RNA (10-14 odwijania DNA przez DnaB [20]. Podjednostką i jest zasad) syntetyzowane są przez primazę (białko DnaG) odpowiedzialna za połączenie obu rdzeni wchodzą­ [1]. Długość fragmentów Okazaki zależy od częstości cych w skład holoenzymu polimerazy III DNA. Dzięki powstania primerów RNA. Natomiast częstość po­ temu następuje połączenie polimerazy syntetyzującej wstawania primerów zależy od interakcji pomiędzy DNA na nici prowadzącej z polimerazą nici opóź­ primazą DnaG i helikazą DnaB [23]. Tak więc, nionej [14, 2 1 , 22 ]. helikaza jest białkiem oddziaływującym zarówno z pri­ Budowa widełek replikacyjnych i stały kierunek mazą jak i z podjednostką i holoenzymu. Znaczenie tej 5’ -» 3’ replikacji wymusza dwa różne mechanizmy interakcji DnaB-i prawdopodobnie polega na przeka­ replikacji nici prowadzącej i nici opóźnionej (Ryc. 1). zywaniu informacji polimerazie nici opóźnionej, że Ponieważ polimeryzacja nici prowadzącej zachodzi primer został zsyntetyzowany i można rozpoczynać zgodnie z kierunkiem przesuwania się widełek re- syntezę nowego fragmentu Okazaki. Model taki po­

Tabela 1. Podjednostki holoenzymu polimerazy 111 DNA

Podjednostką Kodujący gen Funkcja a dnaE polimeraza DNA e dnaQ(mutD) 3’— 5' egzonukleaza funkcja edytorska (a-l-8 + 0) rdzeń polimerazy 0 holE funkcja nieznana X dn aX łączy dwie cząsteczki rdzenia dimeryzacja holoezymu, oddziałowuje z helikazą, osłania połączenie a z P w trakcie polimeryzacji Y dnaX wiązanie ATP, łączy się z t 5 holA łączy się z P 5’ holB stymuluje umiejscowienie P na końcu primera kompleks y (y + 5 + 8’ + x + Ó) X holC łączy się z SSB Y holD łączy x z Y P dnaN zwiększa procesywność polimerazy oddziałowuje z a i kompleksem y, przyłącza się do 3’OH końca primera pierścień P

100 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 twierdzają wyniki z pracowni 0 ’Donnella [19], uwalniane z końca 3’ zsyntetyzowanego fragmentu wskazujące na interakcję pomiędzy DnaB a podjed­ Okazaki. Uwolniony pierścień (3 może znów przyłą­ nostką i wchodzącą w kontakt z częścią holoenzymu czyć się do kompleksu y i wziąć udział w replikacji polimerazy III DNA syntetyzującą nic opóźnioną. następnego fragmentu Okazaki [8, 25]. Przedsta­ Replikacja nici ciągłej następuje z wysoką procesyw- wiony powyżej mechanizm, zaproponowany przez nością [21]. Wysoka procesywność jest spowodowana 0 ’ D o n n e 11 a [8], nie jest w pełni udowodniony, oddziaływaniem rdzenia polimerazy ze „ślizgającą się jednakże wiele wyników doświadczeń wskazuje, że jest klamrą” (zbudowaną z dwóch podjednostek (3), utrzy­ on wysoce prawdopodobny. Wykazano, że kompleks mującą polimerazę na matrycy DNA. Replikacja w Es- y specyficznie rozpoznaje koniec 3’ primera RNA cherichia coli przeprowadzona jest z szybkością ~ 1000 1 umieszcza tam pierścień [3, w reakcji, w której zasad na sekundę [24], Replikacja nici opóźnionej następuje hydroliza ATP. Ustalono, że podjednostką zachodzi w kierunku przeciwnym do kierunku przesu­ odpowiedzialną za oddziaływanie pierścienia (3 z kom­ wania się widełek replikacyjnych, dlatego też, synteza pleksem y jest podjednostką 5 wchodząca w skład nici opóźnionej wymaga ciągłych dysocjacji i reasoc- kompleksu y [31]. Wykazano, że kompleks y ma jacji polimerazy. Chromosom E. coli zawiera 4,4 aktywność DNA-zależnej ATPazy [6, 18]. Wciąż nie miliony par zasad. Przyjmując, że długość fragmentu jest znany mechanizm umieszczania pierścienia [3 na Okazaki wynosi około 1-2 Kb [1], można obliczyć, że DNA. Następnym etapem wymagającym wyjaśnień polimeraza DNA musi ulegać dysocjacji i reinicjować jest połączenie rdzenia polimerazy z pierścieniem (3. około 2 do 4-ech tysięcy razy na nici opóźnionej [25], W nieobecności DNA rdzeń wykazuje niskie powino­ W komórce znajduje się około 10 do 20 cząsteczek wactwo do pierścienia (3. Po przyłączeniu do końca holoenzymu Pol III DNA [26,27], dlatego też, w trak­ primera RNA, powinowactwo pomiędzy rdzeniem cie replikacji genomowego DNA każda cząsteczka jest a P znacznie wzrasta [35]. Jest to związane ze zmianą używana wielokrotnie. Po ukończeniu syntezy jednego konformacji części C-terminalnej podjednostki fragmentu Okazaki jest przenoszona na miejsce rozpo­ a w obecności DNA [35, 40], Miejsce wiązania częcia następnego fragmentu [15, 28, 29] (Ryc. 1). P z rdzeniem i kompleksem y zachodzą na siebie W ciągu ostatnich lat opublikowano szereg prac (C-terminalna część podjednostki P), tak więc, rdzeń [30-35] mających na celu wyjaśnienie mechanizmu i kompleks y nie mogą równocześnie oddziaływać umożliwiającego jednoczesną replikację obu nici z pierścieniem p. Dlatego też, podczas syntezy DNA, DNA. Badano mechanizm przemieszczania się poli­ stabilny i wysoce procesywny kompleks P-a nie po­ merazy do nowego primera RNA, po ukończeniu zwala na połączenie P z kompleksem y i przerwanie syntezy poprzedniego fragmentu Okazaki w trakcie syntezy DNA [8,41]. Funkcję ochraniającą połączenie replikacji nici opóźnionej [36, 37, 20, 22], P-a pełni również podjednostką x. Podjednostką Jak wspomnieliśmy, holoenzym poi III DNA ma x przeciwdziała usuwaniu z DNA podjednostki p przez budowę asymetryczną (Ryc. 2). Wchodzący w skład kompleks y. Przy braku podjednostki x, długość holoenzymu kompleks y umieszcza przy nowopow­ syntetyzowanego DNA na nici prowadzącej jest pro­ stającym primerze RNA pierścień (3, który zamyka się porcjonalna do stężenia podjednostki p, a odwrotnie wokół DNA jak koralik [38, 39], Po zamknięciu proporcjonalna do stężenia kompleksu y. Wskazuje to, pierścienia wokół DNA, oddziaływanie (3 z komplek­ że x jest wymagane do tworzenia wysoce procesywnego sem y maleje, natomiast wzrasta oddziaływanie z pod­ kompleksu nici prowadzącej [22], Na nici opóźnionej, jednostką a rdzenia i następuje replikacja nowego silne oddziaływanie pomiędzy polimerazą a podjed­ fragmentu Okazaki (Ryc. 3). Po zakończeniu replikacji nostką p, słabnie po ukończeniu fragmentu Okazaki fragmentu Okazaki, następuje odłączenie holoenzymu i polimeraza oddysocjowuje, pozostawiając pierścień od pierścienia (3. Ilość podjednostek (3 w komórce jest P [25]. Nieznany jest mechanizm dysocjacji poli­ ściśle określona (około 300 dimerów), dlatego też aby merazy od matrycy po ukończeniu fragmentu Okaza­ mogły być ponownie wykorzystane, pierścienie (3 są ki. Niejasny jest również, mechanizm uwalniania pier-

polimę^raza^ podjednostką p / ATP

/ ADP, Ryc. 3. Schemat umieszczania pierścienia kompleks y polimeraza fączy |3 na końcu 3’-OH primera. się z p

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 101 ścienią (3 od DNA po zakończeniu syntezy fragmentu tu replikacji wirusa SV-40. Jest to modelowy system Okazaki. Badania in vitro wskazują, że odłączenie pozwalający prześledzić udział poszczególnych białek pierścienia P od DNA może nastąpić w obecności w replikacji organizmów eukariotycznych. Wiadomo, kompleksu y [22, 25, 35], że do inicjacji replikacji DNA potrzebny jest antygen To, czy kompleks y umieszcza, czy odłącza pierścień T i cały kompleks białek inicjacyjnych. Antygen T po­ P od DNA jest prawdopodobnie zależne od danej siada również funkcję helikazy. Kompleks Antygen struktury DNA i od oddziaływania pomiędzy pier­ T-RP-A (komórkowe białko replikacyjne A), łączy się ścieniem p, podjednostką x a rdzeniem polimerazy. z polimerazą c l [47]. Polimeraza c l posiada dwie aktywności: polimerazy i primazy [1]. Polimeraza III. Porównanie holoenzymu polimerazy ca syntetyzuje w miejscu startu replikacji primer RNA. III D N A Escherichia coli z innymi Również polimeraza c l rozpoczyna z primera RNA replikazami syntezę krótkiego (około 34 nukleotydów) odcinka DNA. Następnie RF-C (ang. replication factor C) [48, Jak opisano wyżej, efektywne funkcjonowanie holo­ 49], odpowiednik kompleksu y, przyłącza się do końca enzymu polimerazy III DNA podczas replikacji chro­ 3’OH nowopowstającego DNA i umieszcza tam pier­ mosomu bakteryjnego zależy od współdziałania trzech ścień PCNA (ang. Proliferating Cell Nuclear Antigen), funkcjonalnych elementów: 1 ) rdzenia polimerazy, odpowiednik pierścienia (3 [50]. Dalszą syntezę DNA odpowiedzialnego za syntezę DNA, 2) pierścieni przejmuje inna polimeraza replikacyjna. Dwie poli­ P zwiększających procesywność holoenzymu poprzez merazy eukariotyczne, polimeraza 8 i polimeraza utrzymywanie stałego kontaktu pomiędzy polimerazą 8 uważane są za polimerazy replikacyjne [patrz artykuł DNA a matrycą, oraz z 3) kompleksu y, odpowiedzial­ przeglądowy 51, 52], Jednakże dane uzyskane in vitro, nego za umieszczanie pierścienia P na DNA. Okazuje przy użyciu systemu replikacji wirusa SV40 wskazują, się, że te same funkcjonalne elementy biorą udział że polimeraza 8 może syntetyzować obie nici DNA, podczas replikacji DNA zarówno w organizmach prowadzącą i opóźnioną [53, 54]. W przeciwieństwie prokariotycznych jak i w eukariotycznych. do holoenzymu polimerazy III DNA, polimeraza 8 nie W polimerazie faga T4, rdzeniem polimerazy DNA tworzy dimeru łączącego replikację obu nici w wideł­ jest produkt genu 43 (g43p), a funkcję pierścienia kach replikacyjnych. Nie posiada również odpowied­ P pełni białko genu 45 (g45p). Za ukierunkowywanie nika podjednostki x. Uważa się, że RF-C nie jest i przyłączanie g45p do matrycy DNA odpowiedzialny związany z polimerazą 8, choć ostatnio [55], wyizolo­ jest kompleks dwóch białek g44p i g62p — funkcjonal­ wano z komórek grasicy cielęcej kompleks zawierający

ny odpowiednik kompleksu y [42]. W E. coli te trzy polimerazę c l, polimerazę 8 i białka RF-C. Badania składniki replikazy są łączone razem poprzez podjed- przeprowadzone przez Tsurimoto i Stillman a nostkę x. Wiadomo, że podjednostka x odgrywa istot­ [56] wskazują, że przełączenie z replikacji przez poli­ ną rolę koordynując szybkość replikacji DNA z szyb­ merazę c l, na replikację prowadzoną przez polimerazę kością rozwijania DNA przez helikazę, utrzymując 8 następuje w wyniku zmiany stężenia białek RP-A w ten sposób ciągłość syntezy DNA. Do tej pory nie (odpowiednik prokariotycznego SSB) wiążących się odnaleziono analogu podjednostki x w replikacji faga z jednoniciowym DNA. Badania te wskazują, że T4. Jednakże, polimeraza faga T4, podobnie jak faga wysokie stężenie RP-A, oraz obecność RF-C i PCNA T7, oddziaływuje bezpośrednio z helikazą. Dlatego też powodują zablokowanie ponownego przyłączenia się wydaje się, że nie potrzebna jest obecność analogu polimerazy c l po rozpoczęciu syntezy fragmentu Oka­ białka x, w replikacji faga T4 [43, 44], zaki [56, 57], Długość fragmentu, syntetyzowanego Organizmy eukariotyczne, od drożdży do człowie­ przez polimerazę c l jest więc określona jedynie procesy- ka, replikują DNA według tej samej strategii. (Tab. 2). wnością tej polimerazy [58]. Tak więc, krótki fragment Opracowano [45, 46] system in vitro, do badania DNA syntetyzowany przez polimerazę c l jest następnie replikacji plazmidów DNA zawierających miejsce star­ wydłużany przez polimerazę 8 przy współudziale RF-

Tabela 2. Trzy główne komponenty struktury różnych replikaz

K om ponent E. coli Fag T4 Eukarionty

I. rdzeń 3 podjednostki l podjednostka 2 podjednostki polimeraza/3’— 5’ egzonukleaza (Ot + E + 0) g43p polimeraza 8 (polimeraza e?) II. kom pleks ładujący pierścień kompleks y 5 podjed­ kompleks g44/62p 2 podjed­ kompleks RF-C 5 podjednostek nostek nostki

y g44p p 128 5 ’ p37 S g62p p40 X p38, p36 III. pierścień p g45p PCNA

102 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 Ryc. 4. Schemat budowy pierścieni fi i PCNA. Pierścień p składa się z dwóch protomerów natomiast pierścień PCNA tworzą trzy pro- tomery PCNA. Wielkość obu pier­ ścieni jest identyczna [61].

pierścień (3^ pierścień pcna ^ O -C i PCNA [45]. Fakt, że in vitro replikacja wirusa u organizmów eukariotycznych wymagają dalszych, SV40 zachodzi bez udziału polimerazy e, a jedynie intensywnych badań. Choć powszechnie przyjęty jest w obecności polimerazy 5 sugeruje, że polimeraza Sjest mechanizm nieciągłej syntezy DNA na nici opóźnionej główną polimerazą, przynajmniej w systemie wiruso­ oraz ciągłej na nici prowadzącej, jednakże, publikowa­ wym. Jednakże, synteza chromosomalna jest znacznie ne były również prace postulujące, że synteza DNA na bardziej skomplikowanym procesem, w którym poli­ obu niciach może być nieciągła tak jak proponował meraza e może odgrywać ważną rolę. w swoich pracach O k a z a k i [62, 63]. Kompleks RF-C [59, 49], składa się z 5-ciu podjed­ nostek podobnie jak kompleks y z E. coli. Podjednos- Podziękowanie tki y i 5 z E. coli wykazują homologię z podjednostkami Serdecznie dziękujemy Panu Prof. dr hab. Zygmuntowi ludzkiego kompleksu RF-C jak również z białkami Cieśli za wnikliwe przeczytanie i wszystkie uwagi dotyczą­ ce tej pracy. Praca finansowana w ramach gruntu KBN g44/62p faga T4 [60]. 6 P04A 043 09. Pomimo, że nie wykazano podobieństwa sekwencji aminokwasowej pomiędzy (3, g45p czy PCNA jednak­ Artykuł otrzymano 10 stycznia 1997 r. że pokazano, że struktura przestrzenna tych trzech Zaakceptowano do druku 12 stycznia 1997 r. białek jest szalenie podobna [61]. W przypadku E. coli pierścień zbudowany jest z dwóch podjednostek (3. W podjednostce (3 można wyróżnić trzy charakterys­ tyczne domeny o identycznej topologii (Ryc. 4). Pod- Piśmiennictwo jednostki pierścienia PCNA i g45p są o 1/3 mniejsze od 1. Kornberg A, Baker TA (1992) DNA replication. New podjednostki p. Dlatego też, aby zachować podobień­ York, Freeman. 2ed stwo struktury pierścienia nie tworzą dimeru lecz 2. Marszałek J (1994) Post Biochem 40: 200-210 3. Delaruc M, Poch O, Tordo N, Mo ras D, Argos trimer. Badania biochemiczne i krystalograficzne P (1990) Protein Eng. 3: 461-467 P i PCNA potwierdziły podobieństwo struktury oraz 4. Joyce CM,Steitz TA (1994) Annu Rev Biochem 63: 777-822 podobieństwo funkcjonowania pierścieni. 5. McHenry CS, Kornberg A (1977) J Biol Chem 252: 6478-6484 6. Maki S, Kornberg A (19988) J Biol Chem 263: 6561-6569 IV. Podsumowanie 7. Maki H, Maki S, Kornberg A (1988) J Biol Chem 263: 6570-6578 8. Kelman Z, O'Donnell M (1995) Annu Rev Biochem 64: Proces replikacji chromosomalnego DNA wymaga 171-200 koordynacji przestrzennej i czasowej wydarzeń za­ 9. S i n h a N K , Morris CF, Alberts BM (1980) J Biol chodzących w widełkach replikacyjnych. Następuje to Chem 225: 4290-4303 10. Maki H.KornbergA (1985) J Biol Chem 260:12987-12992 dzięki odpowiedniej sekwencji interakcji białko-białko 11. DeFrancesco R, Bhatnagar S K, Brown A, B e s- jakie mają miejsce w trakcie syntezy obu nici matrycy s m a n M J (1984) J Biol Chem 259: 5567-5573 DNA przez kompleks replikacyjny. Około 20 białek 12. Scheuermann RH, Echols H (1985) Proc Natl Acad Sci USA 81: 7747-7751 uczestniczy w procesie replikacji DNA w komórce E. 13. McHenry CS, Crow W (1979) J Biol Chem 254: 1748-1753 coli. Ich wzajemne interakcje indukują określone ak­ 14. McHenry CS (1982) J Biol Chem 257: 2657-2663 tywności, rekrutują odpowiednie białka do kompleksu 15. Burgers PM J, Kornberg A (1982) J Biol Chem 257: 11474-11478 replikacyjnego oraz powodują rearanżacje architek­ 16. Stukenberg PT, Studwell-Vaughan PS, O ’D o n ­ tury tego kompleksu. Obecnie znamy główne etapy nell M (1991) J Biol Chem 266: 7550-7557 umożliwiające szybką, wierną i skoordynowaną syn­ 17. Wick ner S (1976) Proc Natl Acad Sci USA 73: 3511-3515 18. O'Donnell M (1987) J Biol Chem 262: 16558-16565 tezę DNA nici prowadzącej i opóźnionej. Jednakże, 19. Yuzhakov A, Turner J, O’Donnell M (1996) Celi 86: molekularne mechanizmy tego procesu, szczególnie 877-886

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 103 20. K im S, Dallmann HG, McHenry CS, Marians 40. Kim DR, McHenry CS (1996) J Biol Chem 271: 20699- K J (1996) C ell 84: 643-650 -20704 21. Studwell-Vaughan PS, O’Donnell M (1991) J Biol 41. Herendeen DR, Kelly TJ (1996 C ell 84: 5-8 Chem 266: 19833-19841 42. Young MC, Redd MK, vonHippcl PH (1992) Bio­ 22. Kim S, Dallmann HG, McHenry CS, Marians chem istry 31: 8675-8690 K H (1996) J Biol Chem 271: 4315-4318 43. Nakai H, Richardson CC (1986) J Biol Chem 261: 23. Taugu K, Peng H, Marians KJ (1994) J Biol Chem 269: 15208-15216 4675-4682 44. Richardson CC, Nosal NG (1989) J Biol Chem 264: 24. Chandler M, Bird R E, Caro L (1975) J M ol Biol 94: 4732-4739 127-131 45. W a g a S, S t i 11 m a n B (1994) N ature (L ondon) 369: 207-212 25. StukenbergPT, Turner I, O’Donnell M (1994) Cell 46. Waga S, Hannon G J, Beach D, Stillman B (1994) 78: 877-887 N atu re (London) 369: 574-578 26. McHenry CS, Kornberg A (1981) Enzym es, vol 14 (ed. 47. Conzen SD, Cole CN (\994) Semin Virol 5: 349-356 Boyer, P.D.) pp 39-50 Academic Press, Orlando, FL 48. Burgers PM J (1991) J Biol Chem 266: 22698-22707 27. Wu Y H, Franden MA, Hawker JR, McHenry 49. Uhlmann F, Cai J, Flores-Rozas H, Dean F B, C S (1984) J Biol Chem 259: 12117-12122 Finkelstein J. O’Donnell M,HurwitzJ (1996) Proc 28. O ’Donnell M, Kornberg A (1985) J Biol Chem 260: Natl Acad Sei USA 93: 6521-6526 12875-12883 50. Kuriyan J, O’Donnell M (1993) J M ol Biol 234: 915-925 29. Johanson KO, McHenry CS (1982) J Biol Chem 257: 51. Sugino A (1995) TIBS 20: 319-323 12310-12315 52. S i e d 1 e c k i J A, N o w a k R (1995) Post Biochem 41: 326-331 30. Ornust R, Finkelstein J, Naktinis V, Turner J, 53. Weinberg DH, Kelly TJ (1989) Proc Natl Acad Sei USA Fang L, O ’Donnell M (1995) J Biol Chem 270: 13348- 86: 9742-9746 -13357 54. L e e S-H, Kwong AD, Pan Z-Q, Hurwitz J (1991) 31. Naktinis V, Onrust R, Fang L, O ’Donnell J Biol Chem 266: 594-602 M (1995) J Biol Chem 270: 13358-13365 55. Maga G, Hubscher U (1996) Biochemistry 35: 5764-5777 32. Onrust R, Finkelstein J, Turner J, Naktinis V, 56. Tsurimoto T, Stillman B (1990) Proc Natl Acad Sei O ’Donnell M (1995) J Biol Chem 270: 13366-13377 USA 87: 1023-1027 33. Xiao H, Naktinis V, O’Donnell M (1995) J Biol Chem 57. L e e M Y W T, Jiang Y, Zhang SJ, Toomey NL (1991) 270: 13378-13383 J Biol Chem 266: 2423-2429 34. Stukenberg PT, O’Donnell M (1995) J Biol Chem 270: 58. MatsumotoT, EkiT, Hurwitz J (1990) Proc Natl Acad 13384-13391 Aci USA 87: 9712-9716 35. Naktinis V, Turner J, O ’Donnell M (1996) Cell 84: 59. Downey KM, Tan C-K, So AG (1990) B ioE ssavs 12: 137-145 231-236 36. Reems J A, Wood S, McHenry CS (1995) J Biol Chem 60. O ’Donnell M, Onrust R, Dean FB, Chen M, Hur­ 270: 5606-5613 witz J (1993) Nucleic Acids Res 21: 1-3 37. Dallmann HG, Thimming R L, McHenry CS 61. Kelman Z, O ’Donnell (1995) Nucleic Acids Res 23: (1995) J Biol Chem 270: 29555-29562 3613-3620 38. Stuckenberg PT, Studwell-Vaughan PS, 62. Okazaki R, Okazaki T, Sakabe K, Sugimoto K, O ’Donnell M (1991) J Biol Chem 266: 11328-11334 Sigino A (1968) Proc Natl Acad Sei USA 59: 598-605 39. Kong X-P, Onrust R, O ’Donnell M, Kuriyan 63. Wang T-Ch V, Chen S-H (1994) Bioch Bioph Res J (1992) Cell 69: 425-437 Commun 198: 844-849

Do członków Polskiego Towarzystwa Biochemicznego

Zarząd P.T.Bioch. uprzejmie prosi wszystkich członków o wpłatę zaległych i bieżących składek członkowskich. Zachęcamy także do zaprenumerowania „Postępów Biochemii” .

104 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 „X” — ostatnia niewiadoma wirusa zapalenia wątroby typu B? Transaktywujące i onkogenne własności białka X HBV

„X” — the las unknown of hepatitis B virus? Transact!vating and oncogenic properties of X protein

MAŁGORZATA SIDORKIEWICZ*

Spis treści: Contents:

I. Wstęp I. Introduction II. O RF X a onkogeny retrowirusów II. ORF X and retroviral oncogens III. Białko X jako transaktywator III. X protein as transactivator III-l. Mechanizm transaktywacji III-l. Mechanism of transactivation IV. Własności onkogenne białka X IV. Oncogenic properties of X protein IV-1. Modele biologiczne IV-1. Biological models IV-2. Integracja genu X z genomem gospodarza IV-2. Integration of X gene into host genome IV-3. pX kontra p53 IV-3. pX contra p53 V. Uwagi końcowe V. Concluding remarks

Wykaz stosowanych skrótów: HBV — wirus zapalenia wątro­ z transformacją nowotworową komórek wątrobo­ by typu B; O RF — otwarta ramka odczytu; pX — białko X; wych, będącą następstwem zakażenia HBV [4]. CAT — acetylotransferaza chloramfenikolowa; ENH — en- hancer; XRE — sekwencja odpowiadająca na białko X. II. ORF X a onkogeny retrowirusów I. Wstęp Replikacja HBV zachodzi podobnie (choć nie iden­ Większość wirusów onkogennych zawiera geny ko­ tycznie) jak replikacja retrowirusów, wykazujących dujące transaktywatory transkrypcji. W czasie infekcji zdolność do ekspresji polipeptydów aktywujących wirusowej produkty tych genów wpływają na regulację transkrypcję. Pewne podobieństwa w sposobie re­ transkrypcji zarówno genów własnych jak i komór­ plikacji i organizacji genetycznej (Rye. 1) retrowirusów kowych. Ma to istotne znaczenie dla przebiegu zakaże­ i HBV [5] sugerowały, że produkt ekspresji genu nia. W przypadku wirusa zapalenia wątroby typu X HBV jest analogiczny do produktu genu tat po­ B (HBV) czynnikiem wykazującym własności transak­ chodzącego z HIV. Jednak w przeciwieństwie do tywujące jest białko X, będące produktem ekspresji białka tat, rola białka X w procesie replikacji nie jest genu X HBV [1]. udowodniona, potwierdzona została natomiast w wie- Specyficzną cechą zakażenia HBV jest możliwość LTR GAG POL SRC LTR rozwoju przewlekłego zapalenia wątroby, które charak­ teryzuje się różnym stopniem uszkodzenia wątroby oraz stałą obecnością antygenów wirusowych w surowicy zakażonych osób. Podobny obraz utrzymuje się po integracji HBV DNA z genomem hepatocytów, dzięki której kontynuowana jest transkrypcja antygenów wi­ rusowych. Od dawna obserwuje się ścisłą zależność pomiędzy przewlekłym zapaleniem wątroby a rozwo­ C PRE-S S X jem pierwotnego raka wątroby. Chorzy z przewlekłym zapaleniem wątroby zapadają na raka wątroby [2] 100 POL częściej niż osoby niezakażone [3]. Obecnie postuluje Rye. 1. Porównanie organizacji genetycznej HBV i retrowirusów. się, że funkcje transaktywujące białka X są związane Przedstawiono schematy zlinearyzowanych genomów wiru­ sa zapalenia wątroby typu B (HBV) i dwóch retrowirusów: silnie onkogennego wirusa mięsaka Rousa (RSV) i słabo onkogennego wirusa ludzkiej białaczki limfocytów T. Gen * Dr, I Zakład Biochemii, IFiB Akademii Medycznej w Ło­ X zajmuje pozycję analogiczną do onkogenu src RSV oraz dzi, 90-131 Łódź, ul. Lindleya 6 do kodującego aktywator transkrypcyjny genu tax HTLV.

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 105 lu badaniach jego rola w procesie aktywacji transkryp­ DNA [27], Wykazano, że białko X aktywuje trans­ cji [ 1 , 6], krypcję poprzez jądrowy czynnik kappa B (NFkB) [11, Porównanie sekwencji nukleotydowej i aminokwa- 16, 21, 28], czynniki C/EPB [28] i AP-1, AP-2 [9], sowej wykazało, że ORF X, podobnie jak onkogeny Promotory zawierające zmutowane miejsce wiązania wirusowe, zawiera kodony charakterystyczne dla ge­ tych czynników nie są aktywowane przez białko X. nów komórek eukariotycznych, a nie wirusów atakują­ Prawdopodobnie pX może oddziaływać poprzez di- cych te komórki. Wydaje się, że podobnie jak on­ meryzację z innymi białkami. W przypadku kilku kogeny retrowirusowe gen X mógł zostać przeniesiony białek np.: p53 [29], podjednostki RPB5 eukariotycz­ stosunkowo niedawno z genomu komórkowego [5], nej polimerazy RNA [30], UV-DDB [31] stwierdzono Białko X nie działa tak jak białka onkogenów tworzenie in vitro heterodimerów z pX. Nie przesądza retrowirusowych. W swym działaniu przypomina ono to oczywiście faktu czy takie wiązanie ma miejsce in bardziej transaktywatory kodowane przez wirusy lu­ vivo i czy rzeczywiście ma wpływ na aktywację trans­ dzkiej białaczki limfocytów T (HTLV) typu I i II. krypcji. Białka te nie zachowują się jak klasyczne białka Zdolność bezpośredniego oddziaływania pX z ko­ onkogenne, ale zakażenie produkującymi je wirusami mórkowymi czynnikami transkrypcyjnymi wykazano jest związane z procesem nowotworzenia. w badaniach in vitro dla czynników: CREB i ATF2 [32]. Rozpoznają one w DNA element CRE o charak­ III. Białko X jako transaktywator terystycznej sekwencji TGACGTCA. Bardzo zbliżoną sekwencję do powyższej (TGACGCAA) zawiera en­ Oddziaływanie aparatu transkrypcyjnego HBV hancer I HBV. W normalnych warunkach wymienione i białka X przedstawiono w I części artykułu pt.: „Gen czynniki nie rozpoznają jednak tej sekwencji i nie X i produkty jego ekspresji”. W obrębie enhancera wiążą się z nią. W obecności pX zarówno CREB jak I HBV zidentyfikowana została krótka sekwencja i ATF-2 w postaci kompleksu z białkiem X [32] reagująca na białko X tzw. XRE (ang. X -response rozpoznają tę sekwencję. Wynika z tego, że białko element). Mutacja typu zmiany ramki odczytu w rejo­ X może zmieniać specyficzność wiązania tych czyn­ nie ORF X genomu HBV powoduje zmniejszenie ników i prawdopodobnie innych czynników trans­ poziomu transkrypcji genów wirusowych zależnych od krypcyjnych w komórkach zakażonych przez HBV. enhancera I [7, 8]. Wrażliwość na białko X wykazują Dzięki temu zwiększa się liczba genów komórkowych, też sekwencje innych wirusów np. sekwencje wiążące które mogą zostać zaktywowane przez wirusowy czynnik API i AP2 w enhancerze SV40 [9] czy też, transaktywator w następstwie zakażenia HBV. pochodząca z rejonu ETR HIV1, sekwencja wiążąca Skomplikowany mechanizm transaktywacji dobrze czynnik NFkB, [10], Podobną wrażliwość wykazują ilustrują wzajemne oddziaływania pomiędzy białkiem komórkowe sekwencje promotorowe genów: ß-inter- X i czynnikiem NFkB. NFkB związany jest z ekspresją feronu, [1], MHC I [11], MHC II [12] c-myc [13], genów, które zwykle tylko przejściowo są aktywowane c-jun [14], c-fos [15]. Dotychczasowe obserwacje w komórce w odpowiedzi na zewnętrzną stymulację wskazują, że białko X transaktywuje geny w różnych (czynniki wzrostu, estry forbolu). Jednym z takich typach komórek poprzez różne sekwencje typu XRE. genów jest gen interleukiny-8 (IL-8). IL-8 jest cytokiną Przykładem takiego zróżnicowania może być sekwen­ związaną z odpowiedzią zapalną. Nie jest produkowa­ cja wiążąca AP2, która odpowiada na białko X w ko­ na konstytutywnie lecz po indukcji przez inne cytokiny mórkach CV-1 [9], ale nie w komórkach HepG2 [16], albo pod wpływem estrów forbolu. Wykazano, że gen Z kolei sekwencja wiążąca NFkB funkcjonuje jako IL-8 jest również aktywowany w komórkach trans­ XRE dla LTR HIV 1 w komórkach HepG2 [10, 16], fekowanych genem X [28], Estry forbolu i niektóre ale nie dla enhancera SV40 w komórkach CV-1 [9]. cytokiny uczestniczą również w aktywacji czynników Wynika z tego, że w stosunku do danego genu transkrypcyjnych (NFkB, AP-1) poprzez bezpośrednią podatność na transaktywację białkiem X zależy w du­ aktywację kinazy białkowej C (PKC). Stosując in­ żej mierze od użytej linii komórkowej [16]. W różnych hibitory PKC udowodniono, że aktywacja NFkB liniach komórkowych pX oddziałuje prawdopodobnie może odbywać się pod wpływem białka X bez udziału z różnymi czynnikami komórkowymi [17]. Wyniki PKC [33]. W innych badaniach okazało się jednak, że badań nad zdolnością białka X do aktywacji trans­ białko X może także aktywować kinazę C, co wykaza­ krypcji w różnych komórkach podsumowano w tabeli 1. no na przykładzie genów, których ekspresja jest zależ­ na od czynnika transkrypcyjnego AP-1 [25]. Wynika III-l. Mechanizm transaktywacji z tego, że aktywacja czynników transkrypcyjnych przez białko X może odbywać się na drodze zależnej Wyniki dotychczasowych badań sugerują, że białko i niezależnej od kinazy białkowej C (Ryc. 2). W przypad­ X, poprzez oddziaływania typu białko-białko z komór­ ku omawianej wcześniej aktywacji NFkB niezależnej kowymi czynnikami regulatorowymi wpływa na ak­ od PKC ważną rolę odgrywać może aktywność kinazy tywację przekaźników sygnału komórkowego [25, 26] serynowo-treoninowej przypisywana białku X [34], oraz na wiązanie czynników transkrypcyjnych do Aktywacja NFkB wymaga bowiem oddysocjowania

106 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 Tabela 1. Wpływ białka X na sekwencje regulatorowe pochodzenia wirusowego i komórkowego w różnych komórkach. Przypadki braku aktywacji oznaczono znakiem minus

lp. Docelowy rejon regulatorowy Gen reporterowy Rodzaj komórek Efekt Piśmiennictwo

1 HBV promotor rdzeniowy/ENH II C A T (RNA) H uH 7 + Colgrove i wsp. [7]

2 HBV promotor CAT (RNA) H epG 2 + Koike i wsp. [8] preSl/ENH I + ENH II H uH 7 + Rossner i wsp. [18] Levrero i wsp. [19]

3 HBV promotor X/ENH I X CC113 + Wollersheim i wsp. [4] H epG 2 + Siddiqui i wsp. [10] HeLa + Balsano i wsp. [13] Vero - Twu i Schlomer [1]

4 SV40 wczesny promotor/enhancer CAT H epG 2 + Takada i Koike [20] Koike i wsp. [8] Siddiqui i wsp. [10] eos Spandau i Leee [6]

5 SV40 późny promotor/H BV ENH I CAT H epG 2 ■ Levrero i wsp. [21]

6 RSV LTR CAT CV1 + Spandau i Lee [6] Vero - Twu i Schloemer [22]

7 H IV I LTR CAT H-9 + Twu i wsp. [16] H epG 2 + Seto i wsp. [17] CAT, lucyferaza H epG 2 + Twu i Robinson [23] Siddiqui i wsp. [10]

8 HTLV I LTR CAT H epG 2 + Levrero i wsp. [19] CC113 + Wollersheim i wsp. [4] Vero - Twu i Schloemer [1]

9 sekw. wiążąca AP2 CAT CV1 + Seto i wsp. [9] H epG 2 - Twu i wsp. [16]

10 promotor al-antytrypsyny/ENH I CAT H epG 2 + Lee i wsp. [24]

11 promotor ß-INF CAT Vero + Twu i Schloemer [1] H epG 2 - Zhou i wsp. [11]

12 promotor MHC I CAT H epG 2 + Zhou i wsp. [11]

13 promotor MHC II CAT (RNA) H epG 2 + Hu i wsp. [12] H uH 7 +

14 promotor c-myc CAT H epG 2 + Balsano i wsp. [13] HeLa +

inhibitora IkB z nieaktywnego kompleksu (Rys. 2), co rynowych traci własności transaktywujące. Białko zachodzi pod wpływem fosforylacji inhibitora. X bezpośrednio oddziałuje z wątrobowymi proteazami Inny mechanizm, który może wyjaśniać transak- serynowymi: tryptazą TLI i TL2 i jest ich inhibitorem tywujące działanie białka X związany jest z jego [36], Wskazuje to na możliwość aktywacji transkryp­ podobieństwem do inhibitorów proteaz serynowych cji poprzez inhibicję proteaz serynowych, które nor­ [35]. Białko X zmutowane w obrębie domen przypo­ malnie uczestniczą w procesie degradacji czynników minających domenę Kunitz’a inhibitorów proteaz se- transkrypcyjnych. Zahamowanie proteolizy tych czyn­

czynmki wzrostu ^ cytokiny

Ryc. 2. Potencjalne możliwości wpływu białka X na transkrypcję. Oddziaływanie odbywać się może poprzez aktywację wtór­ nych przekaźników sygnału w komórce i/lub przez bezpo­ średnie oddziaływanie pX z czynnikami transkrypcyjnymi. Zastosowane oznaczenia: G — białko G, PCL — fosfolipaza C, PIP — fosfatydyloinozytolo-bisfosforan, DAG — diacylo- glicerol, PKC n/a (nie-) aktywna forma kinazy białkowej C, ROI — reaktywne formy tlenu, PKA — białkowa kinaza A.

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 107 ników prowadzić może do wzrostu ich stężenia w ko­ wątroby białko X jest również wykrywane immunolo­ mórce i co za tym idzie wzrostu aktywności transkryp- gicznie tylko w niektórych hepatocytach [41]. Prze­ cyjnej. ciwstawne wyniki, czyli brak zmian nowotworowych uzyskano w innych badaniach, w których wykorzy­ stywano transgeniczne myszy zawierające gen X pod IV. Własności onkogenne białka X kontrolą wątrobowo-specyficznego promotora dla al- -anty-trypsyny [24], Główna różnica między opisywa­ Prawie dwadzieścia lat temu zaobserwowano zależ­ nymi doświadczeniami dotyczyła promotorów, które ność pomiędzy występowaniem zapalenia wątroby regulowały ekspresję białka X. Endogenny promotor typu B i raka wątroby w tych samych rejonach genu X jest dodatnio auto-regulowany przez białko geograficznych [2]. Bardziej przekonujące dowody na X [42] co wpływało w doświadczeniu na stały, wysoki związek między HBV i rakiem wątroby uzyskano poziom pX. W drugim przypadku, w którym za­ dzięki szeroko zakrojonym badaniom epidemiologicz- stosowano promotor al-anty-trypsyny, poziom pX nym [3], które wykazały, że ryzyko rozwoju raka zmniejszył się wraz ze wzrostem myszy. Wyniki te wątroby u nosicieli wirusa jest ponad 100 razy wyższe wskazują, że do transformacji komórkowej niezbędna niż u nienosicieli oraz, że to właśnie przewlekła postać jest stała, wysoka ekspresja białka X. zapalenia wątroby, a nie samo zakażenie HBV zwięk­ sza ryzyko rozwoju raka (następuje to często po 30-40 IV-2. Integracja genu X z genomem gospodarza latach od rozwoju zapalenia przewlekłego). Dodatkowym potwierdzeniem roli HBV w rozwoju Zintegrowane DNA HBV wykrywa się w ponad raka wątroby było wykrycie w większości wątrobo­ 90% przypadków raka wątroby związanych z zakaże­ wych nowotworów i pochodzących od nich linii ko­ niem HBV. W postaci zintegrowanej najczęściej znaj­ mórkowych zintegrowanego DNA HBV. O znacze­ dowane są sekwencje DNA HBV obejmujące gen niu białka X w transformacji nowotworowej wnios­ X (2/3 analizowanych próbek pierwotnego raka wątro­ kować można z obserwacji, że jest ono jedynym by) i często preS/S [20, 43]. Praktycznie nie obserwuje spośród białek HBV, które zawsze ulega ekspresji się specyficznych, stałych miejsc integracji DNA HBV w nowotworach związanych z wcześniejszym zakaże­ [44], Analiza miejsc integracji DNA HBV wskazuje, że niem HBV. ma ona charakter przypadkowy. Każdy z chromo­ somów może zawierać zintegrowany genom wirusowy. Integracja DNA HBV następuje z udziałem krótkich IV-1. Modele biologiczne (11 pz), powtórzonych sekwencji DR1 i DR2, które położone są w obrębie genu X, przy 5’ końcu genomo- Wyniki licznych badań biologicznych wskazują, że wych nici DNA. Insercji DNA HBV towarzyszy re­ HBV ma zdolność transformacji komórkowej. DNA aranżacja zarówno wirusowego jak i komórkowego HBV transformuje nienowotworowe fibroblasty DNA, co objawia się w postaci inwersji, duplikacji, (NIH3T3) w taki sposób, że komórki te użyte do delecji oraz translokacji chromosomalnych [45], Po­ szczepienia bezgrasicznych myszy powodują u nich równanie zintegrowanego DNA HBV z komórek powstanie nowotworu [37]. W hodowli hepatocytów nowotworowych i z normalnych hepatocytów po­ pochodzących od transgenicznych myszy zawierają­ chodzących od tych samych pacjentów wykazało cych gen dla antygenu T SV40, transfekowanych obecność w komórkach nowotworowych odwróco­ genomem HBV [38], komórki wykazywały zmieniony nych, powtórzonych sekwencji złożonych z fragmen­ typ wzrostu, a przeszczepione na bezgrasiczne myszy tów genomu HBV oraz komórkowego a-satelitarnego powodowały powstanie u nich nowotworu. Taki sam DNA [46], Sugeruje się, że taka integracja DNA HBV efekt uzyskano transformując tę linię komórkową może wpływać na stabilność struktury chromosomów, fragmentem wirusowego DNA zawierającym tylko gdyż tandemowo powtarzające się sekwencje a-sateli­ gen X i sekwencję enhancerową pochodzącą z genomu tarnego DNA są za nią odpowiedzialne. Bardzo rzad­ HBV [39], ko dochodzi do spowodowanej insercją DNA HBV W bezpośrednich badaniach nad onkogennym po­ aktywacji protoonkogenów lub genów związanych ze tencjałem białka X wykorzystano transgeniczne myszy wzrostem komórek. Jest to natomiast charakterystycz­ zawierające gen X HBV pod kontrolą własnego pro­ na cecha zakażeń wywoływanych przez WHV (Hepa- motora. U myszy tych w ciągu 3-4 miesięcy rozwinęły danawirus zakażający świstaki), w których specyficzna się różnorodne zmiany hepatocytarne typu gruczola- integracja DNA WH V występuje w sekwencjach regu­ ków, a w ciągu 15 miesięcy u 80% myszy stwierdzono latorowych lub kodujących genów c-myc i N-myc powstanie nowotworu [40]. Białko X nie uległo eks­ [47], W przeciwieństwie do modelu WHV, tylko presji we wszystkich hepatocytach, co sugeruje, że w kilku przypadkach zakażenia HBV zaobserwowano ekspresja tego białka in vivo może być ograniczona do insercję DNA HBV w sąsiedztwie genów komór­ komórek będących prawdopodobnie w określonym kowych, które mogą mieć wpływ na proliferację hepa­ stanie zróżnicowania. W przewlekłych zapaleniach tocytów. W jednym przypadku integracja dotyczyła

108 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 sekwencji homologicznej do genu receptora steroido­ tnego raka wątroby [51], szczególnie u osób eks­ wego, która okazała się kodować receptor dla kwasu ponowanych na aflatoksynę. Dodatkowo wykazano in retinowego [48]. W innym przypadku zintegrowane vitro, że taka mutacja tj. transwersja G -> T może być DNA HBV znaleziono w sekwencji genu kodującego indukowana przez aflatoksynę. Jednak u pacjentów cyklinę A, białko odpowiedzialne za regulację mitozy z rakiem wątroby związanym HBV i nie eksponowa­ [49]. Integracja DNA HBV w rejon genu cykliny nych na aflatoksynę, nie stwierdza się tego typu A odpowiedzialny za degradację tego białka może mutacji, co sugeruje, że mutacje p53 nie odgrywają mieć bezpośredni wpływ na regulację podziałów ko­ pierwszoplanowej roli w rozwoju pierwotnego raka mórkowych. Pojedyncze przypadki cis aktywacji ge­ wątroby związanego z samym zakażeniem HBV [52, nów komórkowych przez insercję DNA HBV nie 53]. Wydaje się natomiast, że dla transformacji nowo­ tłumaczą jednak wszystkich przypadków transforma­ tworowej istotne może być wzajemne oddziaływanie cji nowotworowej komórek zakażonych HBV. pomiędzy p53 i pX. Białko p53 powoduje zahamowa­ Inne światło na znaczenie integracji genomu HBV nie transkrypcji genu X [54], przy czym represja ta w rozwoju raka wątroby rzuciło odkrycie transak- znoszona jest w przypadku jednoczesnej ekspresji tywujących własności białka X [1], Wykazano, że białka X. Wynika z tego, że obecność białka X może wiele promotorów wirusowych i komórkowych ulega likwidować supresorowe funkcje p53. Również obser­ transaktywacji przez białko X in vitro. Potwierdzeniem wowane in vitro w obecności p53 zahamowanie re­ możliwości analogicznego działania białka X in vivo plikacji HBV i aktywności promotora genu C, który jest wynik badania aktywności białkowego produktu odpowiada za tworzenie pregenomowego RNA, zno­ genu X pochodzącego ze zintegrowanego z genomem szone jest w obecności białka X. Stosunek pX do p53 gospodarza DNA HBV. W większości wypadków wydaje się być istotnym czynnikiem określającym zintegrowana z genomem sekwencja genu X pozba­ szybkość replikacji HBV [55]. W badaniach in vitro wiona jest 3’ końca, czyli fragmentu kodującego kar­ wykazano, że białko X wiąże się bezpośrednio z p53 boksylowy koniec białka. Mimo to ekspresja tej sek­ [29] i hamuje jego swoiste wiązanie z DNA oraz wencji prowadzi do powstania funkcjonalnego trans- wiązanie z czynnikami transkrypcyjnymi. Białko aktywującego białka X [43]. Jeśli obcięty gen X ulega X blokuje również związany z p53 proces apoptozy ekspresji ze zintegrowanego DNA HBV to powinien komórek [56]. W obecności pX zahamowana zostaje powstawać fuzyjny transkrypt, w którym właściwy zależna od p53 ekspresja genów związanych z proce­ koniec karboksylowy podstawiony jest przez domenę sem apoptozy (p21WAF1, Bax, Fas). Ponieważ gen pochodzenia komórkowego. Wykazano, że sekwencje X ulega integracji i ekspresji, zahamowanie apoptozy zintegrowanego DNA HBV wyizolowane z komórek zależnej od p53 może prowadzić we wczesnej fazie nowotworowych i sklonowane są zdolne do stymulacji rozwoju raka wątroby do klonalnej selekcji hepatocy- transkrypcji [4, 20], Wskazuje to, że ten rodzaj zmiany tów zdolnych do ekspresji genów wirusowych. strukturalnej daje w efekcie funkcjonalny aktywator. Zmiana C-końcowej domeny zwiększa często aktyw­ V. Uwagi końcowe ność białka X powyżej aktywności „dzikiego” genu X. Obserwacja ta sugeruje, że proces integracji genomu Z różnego rodzaju badań zaprezentowanych powy­ HBV z genomem gospodarza może stanowić mecha­ żej wynika, że na rozwój raka wątroby w populacji nizm zwiększający aktywność białka X. osób zakażonych HBV mogą mieć wpływ różne czyn­ niki, ale podstawową rolę w tym procesie odgrywa IV-3. pX kontra p53 prawdopodobnie integracja genomu wirusa z geno­ mem hepatocytów. Mutacje insercyjne związane z in­ Aktywność produktów genów supresorowach ta­ tegracją zachodzą w przypadku HBV sporadycznie kich jak: p53 czy pRB105 jest często hamowana przez i nie mają większego znaczenia klinicznego. Obecnie powstawanie mutantów lub przez interakcje z biał­ wydaje się, że aktywacja ekspresji genów komórko­ kami transaktywującymi pochodzącymi od wirusów wych przez produkt zintegrowanego genu X HBV ma onkogennych. Antygen T wirusa SV40, białka Ela, podstawowe znaczenie w transformacji nowotworo­ Elb adenowirusa czy też E6, E7 wirusów z grupy wej, przy czym transaktywacyjne działanie białka brodawczaków wiążą się i unieczynniają p53 i pRB105 X jest niezależne od miejsca integracji. Aktywacja w zakażonych komórkach lub aktywują mechanizm transkrypcji przez produkt genu X może być z jednej ich degradacji. Białko p53 pełni w komórce szereg strony związana z uruchamianiem wtórnych przekaź­ istotnych funkcji takich jak: kontrola transkrypcji ników na terenie cytoplazmy, z drugiej zaś, z bezpo­ (poprzez wiązanie się do specyficznych sekwencji DNA średnim wpływem pX na wiązanie czynników trans­ lub do czynników transkrypcyjnych), udział w procesie krypcyjnych do miejsc regulujących ekspresję genów replikacji i naprawy DNA [50]. Mutacje w obrębie w jądrze komórkowym. genu p53 znaleziono w wielu typach ludzkich nowo­ tworów. Wykazano, że gen p53 ulega często mutacji Artykuł otrzymano 30 grudnia 1996 r. w trzeciej pozycji kodonu 249 w przypadkach pierwo­ Zaakceptowano do druku 6 marca 1997 r.

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 109 Piśmiennictwo 29. Wang XW, Forrester K, Yeh H, Feitelson MA, Gu JR, Harris CC (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 2230-2234 1. Two JS, Schloemer RH (1987) J Virol 61: 3448-3453 30. Cheong J H, Yi MK, Li9n Y, Murakami S (1995) 2. Szmuness W (1978) Prog M ed Virol 24: 40-69 E M B O J 14: 143-150 3. Beasley RP (1982) H epatology 2: 21-26 31. Lee T H, Elledge S J, Butel JS (1995) J Virol 69 4. Wollersheim M, Debelka U, Hofschleider PH 1107-1114 (1988) Oncogene 3: 545-552 32. Maguire HF, HoefflerJP, Siddiqui A (1991) Science 5. Miller RH, Robinson WS (1986) Proc Natl Acad Sci 252: 842-844 USA 83: 2531-2535 33. Lucito R, Schneider RJ (1992) 7 Wra/ 66: 938-991 6. Spandau FD, Lee CH (1988) J Virol 62: 427-434 34. W j J, Zhou ZY, Judd A, Cartwiright C A, Robin­ 7. Colgrove R, Simon G, Gamem D (1989) J Virol 63: son WS (1990) Cell 63: 687-695 4019-4026 35. Takada S, Koike K (1990) Jpn J Cancer Res 81: 1191-1194 8. Koike K, Shirikata Y, Yaginuma K, Arii M, 36. Takada S, Kido H, Fukutomi A, Mori T, Koike Takada S, Nakamura I, Hay as hi Y, Kawada M, K (1994) Oncogene 9: 341-348 Kobayasjo M (1989) Mol Biol Med 6: 151-160 37. Shirakata Y, Kawada M, Fujiki Y, Sano H, Oda 9. Seto E, Michell P J, Yen TSB (1990) N ature (Lond) 344: M, Yaginuma K, Kobayashi M, Koike K (1989) Jpn 72-74 J Cancer Res 80: 617-621 10. Siddiqui A, Gayner R, Srinivasan A, Mapoles J, 38. Hohne M, Schaefer S, Seifer M, Feitelson MA, Farr R W (1989) Virology 169: 479-484 Paul D, Gerlich WH (1990) EM B O J 9: 1137-1145 11. Zhou DX, Taraboulos A, Ou J H, Yen TS (1990) 39. Seifer M,Hohne M,Schaefer S,Gerlich WH (1991) J Virol 64: 4025-4028 J H epatol 13(s.4): s61-s65 12. H u K Q , Vierling JM, Siddiqui A (1990) Proc N atl 40. Kim C, Koike K,Saito 1, Miyamura T, Jay G (1991) Acad Sci USA 87: 7140-7144 N ature (Lond) 351: 317-320 13. Balsano C, Avantaggianti ML, Natoli G, De 41. Wang WL, London WT, Lega L, Feitelson MA Marcio E, Will H, Perricaudet M, Levrero (1991) H epatology 14: 29-37 M (1991) Biochem Biophys Ress Commun 176: 985-9992 42. Blum HE, Zhang ZS, Galun E, von Waizsacker F, 14. T w u JS , L a i M Y , Chen DS, Robinson WS (1993) Garner B, Liang TJ, Wands JR (1992) J Virol 66: Virology 192: 346-350 1223-1227 15. Avantaggiaci ML, Natoli G, Balsano C, Chiril- 43. Schlüter V, Meyer M, Hofschneider PH, Koshy lo P, Artini M, DeM, Collepardo D, Levrero R, Caselmann WH (1994) Oncogene 9: 3335-3344 M (1993) Oncogene 8: 1567-1574 44. Tokino T, Matsubara K (1991)7 Virol 65: 6761-6764 16. TwuJS, ChuK, Robinson WS (1989) Proc N atl A cad Sci 45. Tokino T, Fukushige T, Nakamura T, Nagaya T, USA 86: 5168-5172 Muritsu T, Shiga N, Aoki N, Matsubara K (1987) 17. Seto E, Zhou D X, Peterlin B M, Yen TSB (1989) 7 Virol 61: 3848-3854 Virology 173: 764-766 46. Ogata N, Tokino T, Kamimura T, Asakura 18. Rossner MT, Jackson RJ, Murray K (1990) Pro H (1990) H epatology 11: 1017-1022 R Soc Lond B Biol Sci 241: 51-58 47. Buendia MA (1992) Semin Cancer Biol 3: 309-320 19. Levrero M, Jean Jean O, Balsano C, Will H (1990) 48. Dejean A, Bougueleret I, Grzeschik KH, Tiol- Virology 174: 299-304 lais P (1986) Nature (Lond) 322: 70-72 20. Takada S, Koike K (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87: 49. Wang J, Chenivesse X, Henglein B, Brechot 5628-5632 C (1990) N ature (Lond) 343: 555-557 21. Levrero M, Balsa no C, Natoli G, Avantaggiati 50. Seto E, Usheva A, Zambetti GP, Momand J, M L, E 1 f a s s i E (1990) J Virol 64: 3082-3083 Horikoshi N, Weinmann R, Levine A, Shenk 22. Twu JS, Schloemer RH (1989) J Virol 63: 3065-3071 T (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 12028-12032 23. TwuJS, Robinson WS(1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 51. Hsu 1C, Metcalf R A, Sun T, Welsh JA, Wang NJ, 2046-2050 Harris CC (1991) N ature (Lond) 350: 427-428 24. Lee TH, Finegold MJ, Shen RF, DeMayo JL, 52. Hayward NK. Walker GJ, Graham W, Cooksley Woo SL, Butel JS (1990) J Virol 64: 5939-5947 E (1991) N ature (Lond) 352: 764 25. Kekule AS, Lauer U, Weiss L, Luber B, Hofsch- 53. Hosono S, Chou M-J, Lee C-S, Shih C (1993) neider PH (1993) N ature (Lond) 361: 742-745 Oncogene 8: 491-496 26. Benn J, Schneider RJ (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 54. Takada S, Kaneniwa N, Tsuchida N, Koike 10350-10354 K (1996) Virology 216: 80-89 27. Natoli G, Avantaggiati ML, Chirillo P, Cos- 55. L e e H,Lee Y - H, Huh Y - S, M o o n H, Y u n Y (1995) tanzo A, Artini M, Balsano C, Levrero M (1994) 7 Biol Chem 270: 31405-31412 Mol Cell Biol 14: 989-998 56. Wang XW, Gibson MK, Vermeulen W, Yeh H, 28. Mahe Y, Mukaida N, Kuno K (1991)7 Biol Chem 266: Forrester K, Sturzbecher H - W, Hoeijm^kers 13759-137632 JHJ, Harris CC (1995) Cancer Res 55: 6012-6016

Wydawca prosi o kontakt tych, którzy Please contact the Editors if you wish chcieliby wykorzystać łamy „Postę­ to advertise in „Postępy Biochemii" pów Biochemii" do reklamowania the products and services related to swych produktów i usług związanych biochemistry, molecular biology and z biochemią, biologią molekularną cell biology. i biologią komórki. n o http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 Wewnątrzkomórkowe białka wiążące ATP

Intracellular ATP-binding proteins

JOANNA BANDOROWICZ-PIKUŁA1 SŁAWOMIR PIKUŁA2

Spis treści: Contents:

I. ATP jako wewnątrzkomórkowy ligand I. ATP as an intracellular ligand II. Klasyfikacja białek wiążących nukleotydy adeninowe II. Classification of adenine nucleotide-binding proteins III. Czy aneksyny wiążą nukleotydy? III. Do annexins bind nucleotides? IV. Kanały jonowe regulowane przez ATP IV. ATP-regulated ion channels V. Aktyna, heksokinaza i białka pokrewne białkom szoku V. Actin, hexokinase and heat shock cognate proteins termicznego VI. Concluding remarks VI. Uwagi końcowe

Wykaz stosowanych skrótów: ADP — adenozynodifosforan; katalizowanych przez specyficzne difosfokinazy. ATP — adenozynotrifosforan; cAMP — cykliczny 3’,5’ W wyniku tych reakcji z ATP i przykładowo GDP -adenozynomonofosforan; CFTR (ang. cystic fibrosis trans­ powstaje ADP i GTP. Wynienione reakcje oraz fakt, że membrane regulator) — produkt genu zwłóknienia torbielo­ watego (mukowiscydozy); CDP — cytydynodifosforan; CTP w cząsteczce ATP występują dwa bezwodnikowe wią­ — cytydynotrifosforan; dADP, dATP, dGDP, dGTP — deo- zania fosforanowe sprawia, że nukleotyd jest znakomi­ ksynukleotydy; ER(SR) — retikulum endo(sarko)plazmaty- tym nośnikiem energii w komórkach [2]. Podczas czne; FAD — dinukleotyd flawino-adeninowy; G D P — gua- hydrolizy ATP z każdego wiązania fosforanowego nozynodifosforan; GTP — guanozynotrifosforan; Hsc (ang. uwalnia się znaczna ilość wolnej energii (AG°’ — 50 heat shock cognate protein) — białko pokrewne białkom szoku termicznego; IP3 — inozytolotrisfosforan; KATP ka­ kJ/mol), wykorzystywanej w innych reakcjach bio­ nał potasowy regulowany przez ATP; NAD — dinukleotyd chemicznych. W stanie normy stężenie ATP w cyto- nikotynoamido-adeninowy; NADP — fosforan dinukleoty- plazmie (2-10 mM) jest kilkukrotnie wyższe niż innych du nikotynoamido-adeninowego; PLC — fosfolipaza C; PS nukleotydów zawierających rybozę (0,05-2 mM), co — fosfatydyloseryna; RyR — receptor rianodynowy; TNP- zależy od stanu metabolicznego i typu tkanki [3]. -ATP — trinitrofenyloadenozynotrifosforan; UDP — urydy- nodifosforan; UTP — urydynotrifosforan. W wyniku uszkodzenia komórek, na skutek głodzenia, niedotlenienia lub obecności związków toksycznych, poziom ATP w cytoplazmie może znacznie spaść. Co One of a cell biologist’s favorite occupations więcej, zmiany stężenia nukleotydów lub odpowied­ is to discover the proteins that perform newly described functions in the cell. nich zasad w płynach ustrojowych również wpływają Ken C. Holmes i wsp., 1993 [1] na stężenie nukleotydów wewnątrz komórki. Do zna­ cznych zmian stężenia trifosfodeoksyrybonukleoty- dów dochodzi także w trakcie cyklu komórkowego, I. ATP jako wewnątrzkomórkowy ligand szczególnie w fazie S [3], Oprócz wymienionych funkcji, ATP może odgrywać Adenozynotrifosforan, stanowiący uniwersalne źró­ rolę zewnątrzkomórkowego przekaźnika informacji, dło energii, występuje powszechnie w świecie ożywio­ działając za pośrednictwem purynoreceptorów P2. nym łącząc procesy oddychania, w których energia jest ATP uwalniany jest z zakończeń komórek nerwowych, wytwarzana, z procesami takimi jak aktywny trasport w czasie agregacji płytek krwi, z komórek kory nadner­ łub skurcz mięśni, w których energia jest zużywana. czy oraz komórek nabłonkowych i z komórek, w któ­ W komórkach występują wprawdzie związki fosfora­ rych zachodzą procesy zapalne [4]. W tym przypadku nowe bardzo podobne pod względem budowy do ATP, jego stężenie na zewnątrz komórki może być regulowa­ lecz obecność w ATP i jego pochodnych adenozyny ne przez specyficzną hydrolazę ATP, tzw. ektoATPazę, nadaje tej grupie związków właściwości unikalne (Ryc. której centrum aktywne znajduje się po ekstracyto- 1). Końcowe grupy fosforanowe ATP mogą być prze­ plazmatycznej stronie błony komórkowej [5, 6], kazywane na 5’-difosforany nukleozydów w reakcjach Adeninowe i rybozylowe grupy funkcyjne ATP pozwalają na jego wiązanie z różnymi białkami en­ 1 Dr, 2 doc. dr hab., Pracownia Biochemii Lipidów, Zakład Biochemii Komórki, Instytut Biologii Doświadczalnej im. zymatycznymi, regulacyjnymi i strukturalnymi, dzięki M. Nenckiego PAN, ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa. czemu związek ten okazał się być ważnym wewnątrz-

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 111 Ryc. 1. Domena wiążąca ATP (lub GTP) rejon odpowiadający w białkach oddziałujących z nuk- leotydami. Motyw Walkera A: zmianą konformacyjną B-X4-G-X4-G-K-T-X5-L(lub V); M otyw B: R(lub K )-X 3-G -X 3-L- na hydrolizę ATP -H4-D, gdzie X oznacza dowolny aminokwas, B — aminokwas zasa­ dowy, H — aminokwas hydrofo­ bowy, G — glicynę, K — lizynę, T — treoninę, L — leucynę, freszta Asp lub Glu V — walinę i D — kwas asparagi­ nowy.

h 2o " ° - C o/y

komórkowym ligandem. Sprzyja temu stosunkowo gółowiej omówione zostaną aneksyny, kanały jonowe wysoka stabilność chemiczna w środowisku wodnym, regulowane prze ATP oraz aktyna, heksokinaza i biał­ dzięki czemu ulega on jedynie powolnej hydrolizie. ko Hsc70. Białka wiążące ATP (w tym ATPazy biorące udział w aktywnym transporcie jonów nieorganicznych, biał­ II. Klasyfikacja białek wiążących nukleotydy ka oporności wielolekowej, niektóre białka aparatu adeninowe kurczliwego i kinazy białkowe) odznaczają się obec­ nością w ich cząsteczkach domeny wiążącej ATP Wykrycie w strukturze pierwszorzędowej białek o sekwencji aminokwasowej, określanej w literaturze powtarzających się motywów czy domen, będących przedmiotu mianem motywu Walkera A i B [7-9] (Ryc. rodzajem znaków rozpoznawczych tych makrocząs­ 1). Białka takie hydrolizują ATP. Znane są również teczek, pozwoliło na funkcjonalne wyodrębnienie grup białka, które wiążą ATP, ale nie jest to w każdym białek oddziałujących z nukleotydami [8, 9]. Wśród przypadku połączone z hydrolizą nukleotydu. Są to: nich jako pierwsze opisano dehydrogenazy, które mitochondrialna translokaza nukleotydów adenino- wiążą dinukleotyd NAD oraz białka wiążące NADP wych i transporter ATP-Mg/Pj [10], F-aktyna [11], i FAD [18]. Obecność innego motywu stwierdzono regulowane przez ATP kanały jonowe [12], transpor­ w cząsteczkach cyklazy adenylowej i białek wiążących ter CFTR [13, 14], żelzolina [15], białka szoku mononukleotydy, takich jak kinaza adenylowa, mito­ termicznego [1] ianeksyny [16,17]. Niektóre z wymie­ chondrialna F0Fr ATPaza, miozyna, dyneina, oraz nionych białek nie zawierają w cząsteczce motywu białka wiążące GTP (czynnik wzrostowy EF-Tu i pro­ Walkera. W niniejszym artykule przeglądowym szcze­ dukt genu H-rus-białko p21ras) [7]. Jeszcze inny typ

112 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 motywu, zidentyfikowany najwcześniej w cząsteczce W wielu organach ssaków, jak łożysko, mózg, heksokinazy, został rozpoznany dzięki metodom ana­ wątroba lub nadnercza, obserwuje się wysoki poziom lizy krystalograficznej między innymi w cząsteczkach ekspresji aneksyn (1-2% wszystkich białek). Ich funk­ aktyny [19] i białka Hsc70 [20]. Wydaje się, że do tej cja nie jest jednak dokładnie poznana. Wśród badaczy samej grupy można zaliczyć również kinazę glicerolo- przeważa opinia, że aneksyny ulegają przekształceniu wą [ 1], z formy nieaktywnej, występującej w cytosolu, w formę aktywną biologicznie, po związaniu z błonami w od­ III. Czy aneksyny wiążą nukleotydy? powiedzi na zmiany stężenia Ca2 + w komórce z 50-100 nM w stanie spoczynku do 1-10 pM w pobudzonej Aneksyny stanowią przykład grupy białek rozpusz­ komórce [25]. Wiązanie aneksyn z fosfolipidami bło­ czalnych, które oddziałują z ATP nie hydrolizując tego nowymi w obecności Ca2+ wywołuje różne zmiany związku [17]. Aneksyny tworzą zróżnicowaną funk­ strukturalne w błonie [26, 27], modyfikujące jej właś­ cjonalnie rodzinę makrocząsteczek wiążących się z fos­ ciwości, np. wzrost przepuszczalności dla Ca2+ [25]. folipidami błon komórkowych. Wiązanie aneksyn Zaobserwowano również, że aneksyny in vitro tworzą z błonami zależy od stężenia jonów wapnia i jest kanały wapniowe w błonach [22-25]. Aneksyny biorą specyficzne w stosunku do fosfolipidów anionowych. ponadto udział w fuzji błon w procesach endo- i eg- Dotychczas wyizolowano 13 białek należących do tej zocytozy, w wydzielaniu hormonów np. insuliny, neu- rodziny oraz wiele swoistych gatunkowo lub tkan­ rotransmiterów i żółci oraz w inicjacji syntezy DNA, kowo izoform [21-23]. Wszystkie aneksyny charak­ modulują oddziaływania składników cytoszkieletu teryzuje podobny schemat budowy, składają się bo­ z błoną plazmatyczną i regulują aktywność enzymów, wiem z rejonu rdzeniowego o zachowanej w ewolucji w tym fospolipazy A2 [23, 28]. sekwencji aminokwasowej i regulatorowej domeny Niektóre izoformy aneksyn pozostają związane N-końcowej. Rejon rdzeniowy tworzą powtarzające z błonami, nawet jeśli stężenie jonów wapnia w cyto- się domeny zbudowane z 72 reszt aminokwasowych, plazmie spadnie do poziomu spoczynkowego [29, 30]. w obrębie których znajdują się siedemnastoamino- A zatem nie tylko zmiany stężenia Ca2 + , ale być może kwasowe sekwencje odpowiedzialne za wiązanie anek­ inne czynniki wpływają na charakter oddziaływań syn z fosfolipidami i Ca2 + . Aneksyny oznaczone aneksyn z błoną. Wydaje się, że takim czynnikiem liczbami porządkowymi I-V i VII-XIII mają cztery mogłyby być nukleotydy. Na korzyść takiej hipotezy takie domeny, a aneksyna VI osiem [21, 22] (Ryc. 2). przemawiają następujące obserwacje. W obecności W cząsteczce aneksyn brak jest klasycznych miejsc ATP w stężeniach milimolowych wzrasta wiązanie o strukturze ”EF-hand”, które występują w takich aneksyny VI z błoną hepatocytu [31]. ATP i cAMP białkach wiążących Ca2+ , jak kalmodulina, parwal- wiążą się in vitro z aneksyną I, co wpływa na zdolność bumina i troponina C [24]. Rejon N-końcowy w cząs­ tego białka do agregacji liposomów i granul sekrecyj- teczce aneksyn ma różną długość i zróżnicowaną nych z komórek chromochłonnych oraz na właściwo­ sekwencję. Znajdują się w nim reszty aminokwasowe ści kanałów wapniowych tworzonych przez aneksynę ulegające fosforylacji przez różne kinazy białkowe oraz I [16]. Wykazano również, że aneksynę VI można miejsce odpowiedzialne za wiązanie aneksyn z innymi oczyścić stosując chromatografię powinowactwa na białkami, np. aktyną [22]. ATP-agarozie [17, 32]. Ponadto, aneksyny z komórek

Aneksyny I - V, VIII - X, XII i XIII m.cz. 32 - 36 kDa NH H COOH

Aneksyna VI m.cz. 68 kDa

nh2- - COOH

Aneksyny VII i XI Ryc. 2. Porównanie domenowej budowy aneksyn I-XIII. Prostokąty odpowiadają domenom wiążącym m.cz. 47 - 56 kDa jony wapnia i fosfolipidy w cząsteczkach aneksyn.

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 113 Ryc. 3. Wpływ ATP na procesy zachodzące w he- patocytach, w których zaangażowana jest aneksyna VI. 1 — nukleotyd moduluje agregację i fuzję endosomów (e) wywoływaną przez anek- synę (AnxVI); 2 — ATP stymuluje wiąza­ nie aneksyny z rejonem błony plazmatycz- nej (krb) otaczającym kanalik żółciowy (kż); 3 — ATP moduluje aktywność kana­ łów Katp; 4 — nukleotyd stymuluje ak­ tywność Ca2 + -ATPazy z błony plazmaty- cznej (PMCA); 5 — ATP i AnxVI regulują aktywność kanałów uwalniających Ca2 + z błon endoplazmatycznego retikulum (ER); 6 — ATP moduluje oddziaływanie aneksyny z F-aktyną; 7 — ATP powstaje w m itochondriach (m); 8 — aneksyna może wpływać na homeostazę wapnia w matriks mitochondriów, a tym samym regulować metabolizm tych organelli; ATP moduluje aktywność mitochondrial- nych kanałów KATP; 9 — nukleotyd wpły­ wa na procesy endocytozy (end), w któ­ rych biorą również udział aneksyny; 10 — ATP reguluje procesy egzocytozy (egz). kukurydzy okazały się zdolne do hydrolizy ATP. waniu. Pozwala to na autoradiograficzną identyfikację Warunki reakcji były odmienne od warunków wy­ właściwych peptydów. W ten sposób zbadano od­ maganych przez ATPazy transportujące kationy działywanie ATP z Na + , K + -ATPazą, cyklazą adeny- (Ca2 +-ATPaza, ATPaza mitochondrialna i ATPaza lową oraz zależną od kalmoduliny i Ca2+ kinazą z błony wakuoli), zaś podobne do warunków optymal­ białkową typu II [36-38], a także z aneksynami nych dla ATPazy miozynowej [33], Aneksyny z komó­ z wątroby wieprzowej [17]. W tym ostatnim przypad­ rek pomidora wykazują aktywność fosfodiesterazy ku okazało się, że znakowaniu ulega tylko aneksyna nukleotydów o szerokiej specyficzności substratowej. VI. Pochodna fluorescencyjna ATP, TNP-ATP, rów­ Zaobserwowano, że po związaniu aneksyn przez fos­ nież wiązała się z tym białkiem [17], TNP-ATP po folipidy w obecności jonów wapnia, aktywność ta wzbudzeniu światłem o długości fali 412 nm, charak­ ulegała zahamowaniu [34]. Porównanie sekwencji teryzuje się widmem emisyjnym z maksimum przy aminokwasowych pewnych rejonów w cząsteczce ane­ długości fali 550 nm [39]. W obecności aneksyny VI ksyn z odpowiednimi sekwencjami rejonów w cząs­ intensywność fluorescencji TNP-ATP znacznie wzras­ teczkach białek wiążących cAMP i transporterów tała, czemu towarzyszyło przesunięcie maksimum wid­ błonowych (CFTR), odpowiedzialnych za wiązanie ma emisyjnego nukleotydu ku falom krótszym nukleotydów [16, 35], potwierdziło, że aneksyny są (535 nm) [17], Podobnymi właściwościami odznaczają białkami wiążącymi nukleotydy. W badaniach z za­ się ATPazy [31], transportery zależne od ATP [40, stosowaniem fotoczułych i fluorescencyjnych pochod­ 41], kinazy białkowe [42] i F-aktyna [11]. Jest bardzo nych ATP wykazano, że niektóre aneksyny wiążą prawdopodobne, że ATP gra rolę ligandu, który in vivo nukleotydy. Białka wiążące nukleotydy w obecności wpływa na funkcje także aneksyny VI (Ryc. 3). Anek­ fotoczułej pochodnej ATP, 8-azydo-[y-32P]ATP, ule­ syna VI po związaniu ATP zmienia swoje właściwości, gają po naświetleniu UV kowalencyjnemu wyznako­ jak wiązanie z fosfolipidami błonowymi i oddziaływa­

114 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 nie z F-aktyną [17, 27, 43, 44]. Jest ona wprawdzie wych funkcji zależą od ścisłej kontroli stężenia jonów białkiem wiążącym jony wapnia, ale różni się od białek, wapnia w cytosolu [52, 53], w której biorą udział różne które zdolne są do odpowiedzi na zmiany stężenia Ca2 + białka transportujące i regulatorowe. W komórkach w komórce w zakresie 0.1-1 pM, takich jak kal- niepobudliwych, jak erytrocyty, hepatocyty i komórki modulina, izoformy kinazy białkowej C lub zależne od nabłonkowe, obecne są układy transportujące Ca2 + Ca2+ enzymy proteolityczne — kalpainy [24, 45, 46], zależne od IP3. W komórkach tych są obecne recep­ Wyniki badań wskazują, że oddziaływania anek- tory o różnej strukturze i właściwościach. Jedne od­ syny VI z ATP odgrywają ważną rolę w chondrocytach działują z białkami G, inne zawierają domeny o aktyw­ [47], Komórki te pobierają jony wapnia i gromadzą je ności kinazy tyrozynowej. Receptory związane z biał­ w specjalnych pęcherzykach wydzielniczych, biorą­ kami G aktywują fosfolipazę PLCp, zaś receptory cych udział w mineralizacji tkanki łącznej. Z błoną o aktywności kinazy tyrozynowej aktywują fosfolipazę pęcherzyków wydzielniczych wiążą się wewnątrz ko­ PLCy. Wymienione fosfolipazy katalizują rozpad fos- mórki cząsteczki kolagenów II i X, które w niepoznany fatydylo-inozytolo-4,5-bisfosforanu do IP3 i diacylo- dotąd sposób stymulują akumulację jonów wewnątrz glicerolu. IP3 wiąże się z receptorem w błonach ER, pęcherzyków. Wiązanie kolagenów z błoną pęcherzy­ który jest jednocześnie kanałem uwalniającym jony ków jest modulowane przez aneksyny II, V i VI, wapnia z błon ER do cytosolu [54, 55]. Ca2+ napływa występujące w dużych ilościach w chondrocytach [48, do komórek niepobudliwych przez kanały wapniowe 49]. Komórki te wydzielają także ATP, który deter­ niezależne od potencjału błonowego [55], zaś usuwany minuje rodzaj związków mineralnych produkowanych jest z cytosolu przez ATPazy transportujące Ca2 + , przez te komórki [50]. Jeśli, jak wspomniano wcześ­ obecne w błonach ER [56] i błonie plazmatycznej [57]. niej, aneksyny tworzą kanały wapniowe oraz wiążą W komórkach pobudliwych, jak neurony czy komórki kolageny i kwaśne fosfolipidy, to można przypuszczać, mięśniowe, oprócz omówionych układów transpor­ że proces egzocytozy pęcherzyków wydzielniczych tujących występują kanały wapniowe zależne od po­ zawierających fosforany wapnia w chondrocytach, tencjału błonowego, dzięki którym następują duże prowadzący do mineralizacji tkanki łącznej, regulowa­ zmiany stężenia wapnia w cytosolu. Jony wapnia ny jest, być może, przez aneksyny [47], ATP z kolei napływające przez te kanały mogą bezpośrednio ak­ miałby odgrywać rolę dodatkowego czynika wpływa­ tywować kanały uwalniające Ca2+ z błon SR [52, 55]. jącego na wiązanie aneksyn z białkami i kwaśnymi Wewnątrzkomórkowe kanały uwalniające jony wa­ fosfolipidami [51], pnia występują również w błonach SR komórek mięśni szkieletowych (typ 1, RyR1) i mięśnia sercowego (typ 2, IV. Kanały jonowe regulowane przez ATP RyR2) [58], Trzeci typ kanałów RyR (RyR3) [59] zlokalizowano w błonach ER komórek wątroby, ne­ Przeżywalność komórek i regulacja ich podstawo­ rek, płuc, żołądka i trzustki [60]. Kanały te od-

Receptor dihydropirydyny czujnik potencjału błonowego

Błona kanalika T

ATP Cytosol adenozyna cADP-ryboza C a 2+— ► ADP-ryboza kofeina kalmodulina

Błony SR

Wnętrze pęcherzyka SR aneksyna Vl/Ca RyR

Ryc. 4. Czynniki modulujące aktywność kanału uwalniającego jony wapnia (Ry R) z błon sarkoplazmatycznego retikulum. Plusem oznaczono stymulujący wpływ na aktywność kanału, a minusem hamowanie aktywności kanału.

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 115 powiedzialne są za wzrost stężenia jonów wapnia tora IP3 reguluje właściwy ligand (IP3) oraz kinazy w cytoplazmie po stymulacji komórek (bodźce elek­ białkowe zależne od cAMP, od Ca2+/kalmoduliny tryczne, hormony, neurotransmitery lub inne) [61]. 1 kinaza białkowa C [78-80]. Kanał może podlegać W komórkach mięśni szkieletowych kanał RyRl jest również autofosforylacji [81]. Jako najważniejsze mo­ otwierany prawdopodobnie dzięki elektro-mechanicz- dulatory kanału działają jony wapnia, wpływające nemu sprzężeniu białka kanałowego i receptora dihy- zarówno od strony cytosolowej, jak i od strony światła dropirydyny, występującego w błonie kanalika sys­ kanalika błon ER [81]. Inny ważny ligand, ATP, wiąże temu T [62, 63]. Być może jednak działa jakiś inny, się z dwoma miejscami w domenie cytosolowej białka, dotąd nie wykryty wtórny przekaźnik, który aktywuje odpowiedzialnymi za przekazywanie zmian konfor- kanał (ang. Ca2 + -influx factor, CIF) [64]. macyjnych w cząsteczce kanału po przyłączeniu IP3. Kanały RyRl i RyR2 są heterotetramerami o m.cz. Wiązanie nukleotydu z receptorem IP 3 zachodzi jed­ 4x564 kDa [65-67], Geny RyRl i RyR2 zostały nak w niższych stężeniach ATP niż występujące w cy- sklonowane, zaś białka kodowane przez te geny wyka­ tosolu [79, 82, 83]. Fakt ten skłonił badaczy do zują 6 6 % wzajemnego podobieństwa [60]. Kanały te wysunięcia hipotezy, że stężenie ATP w cytoplazmie różnią się wrażliwością na działanie efektorów i powi­ spada w wyniku jego hydrolizy przez Ca2 + -ATPazę nowactwem w stosunku do roślinnego alkaloidu, ria- [79]. Ostatecznie stwierdzono, że wpływ ATP na nodyny [65]. Po wbudowaniu receptorów do lipo- receptor IP 3 jest bardziej złożony: w stężeniach poniżej somów i ich aktywacji okazało się, że stają się one 2 mM nukleotyd aktywuje kanał, zaś powyżej 4 mM przepuszczalne dla jonów wapnia [65, 66]. Napływ hamuje [54]. jonów wapnia przez kanały RyRl i RyR2 jest sty­ Białkiem kanałowym zależnym od ATP jest także mulowany od strony cytoplazmatycznej błon SR kanał transportujący Ca2+ i Na+ w komórkach mięśni przez kofeinę, jony wapnia i ATP, a hamowany przez gładkich [84] oraz regulowane przez ATP kanały jony magnezu i czerwień rutenową [54, 55, 68], potasowe z błony plazmatycznej [85] i mitochon- ADP-ryboza, cADP-ryboza, i |3-NAD aktywują wy­ driów [86, 87], Kanały KATP uważa się za odrębną pływ jonów wapnia przez wymienione kanały [69] klasę wśród innych kanałów potasowych, ze względu (Ryc. 4). Tylko jeden z poznanych ligandów wiąże się na ich właściwości fizykochemiczne oraz wrażliwość z kanałem RyRl od strony światła pęcherzyków SR in na związki farmakologicznie czynne. Kanały te ziden­ vitro. Jest nim aneksyna VI [70]. Inne ligandy wiążą się tyfikowano w błonie plazmatycznej komórek mięśni do domen kanału eksponowanych po cytoplazmatycz­ sercowego, szkieletowych i gładkich, w komórkach nej stronie błon SR [64, 69]. W cząsteczkach kanałów (3 wysepek Langerhansa w trzustce oraz w błonie RyRl i RyR2 występują miejsca wiążące Ca2+ i kal- komórek nerwowych [88, 89]. Wewnątrzkomórkowy modulinę oraz reszty aminokwasowe fosforylowane ATP w stężeniach fizjologicznych hamuje aktywność przez kinazy białkowe zależne od Ca2+/kalmoduliny tych kanałów (K; < 70 pM). Oddziaływanie ATP i cAMP. W przypadku RyR2 fosforylacja białka przez z białkiem kanałowym nie ma związku z procesami kinazę zależną od cAMP aktywuje kanał [71], zaś fosforylacji oraz hydrolizą nukleotydu. Inne nukleo- w przypadku RyRl hamuje transport Ca2+ [72], tydy, takie jak GDP i GTP, znoszą jego efekt. ADP Kalmodulina po związaniu z białkami kanałowymi w niskich stężeniach aktywuje transport K +, zaś RyRl i RyR2, hamuje transport Ca2+ i zmniejsza w stężeniach > 500 pM hamuje go, co można tłuma­ prawdopodobieństwo otwarcia kanału [69, 73]. ATP czyć obecnością dwóch miejsc wiążących nukleotydy wywołuje wzrost wypływu jonów wapnia z błon SR w cząsteczce białka kanałowego [88, 89]. w komórkach mięśni szkieletowych i mięśnia ser­ Kanałom KATP w błonie plazmatycznej przypisuje cowego; w fizjologicznych stężeniach nukleotydu się udział w kontroli potencjału błonowego. Opisano wzrasta prawdopodobieństwo otwarcia kanałów to najlepiej w przypadku wydzielania insuliny w ko­ RyRl i RyR2 [65, 74, 75]. Dodatkowo adenozyna i jej mórkach (3. Wzrost poziomu glukozy we krwi prowa­ analogi aktywują RyR2 [76]. Rejon w pobliżu argininy dzi do wzrostu jej stężenia w tych komórkach i jedno­ 615 w cząsteczkach RyRl i RyR2, odpowiedzialny za cześnie do wzrostu poziomu ATP. ATP, wiążąc się wiązanie ATP, jest homologiczny z miejscem wiążą­ z kanałem KATP hamuje jego aktywność, co powoduje cym IP 3 w receptorze IP3 [77], depolaryzację błony i wzrost potencjału błonowego Receptory IP3 stanowią odrębną klasę wewnątrz­ z wartości -60- -70 mV w stanie spoczynku do -30 mV. komórkowych kanałów uwalniających Ca2 + . Wystę­ Wzrost ten aktywuje zależne od potencjału błonowego pują powszechnie w komórkach wszystkich typów [60, kanały wapniowe, wywołując napływ Ca2 + do komór­ 63,64]. Są homotetramerami o m.cz. 4x315 kDa. Dwa ki, wzmożoną fosforylację określonych białek, przesu­ rejony cząsteczki receptora IP3, eksponowanej na wanie się pęcherzyków zawierających insulinę i jej stronę cytoplazmatyczną błony, wiążą przekaźniki wydzielenie w procesie egzocytozy na zewnątrz komór­ drugiego rodzaju, dzięki czemu kanał uwalniający ki [90]. Kanały KATP odgrywają podobną rolę w wy­ Ca2+ ulega otwarciu [63]. Receptor IP3 kodowany dzielaniu niektórych neurotransmiterów i hormonów jest przez cztery geny, co prowadzi do ekspresji przysadki mózgowej [85], zaś w komórkach mięśnia zróżnicowanych izoform kanału [63]. Funkcję recep­ sercowego wpływają na czas trwania potencjału czyn-

116 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 nościowego [91]. ko w białkach biorących udział w skurczu mięśni, ale Kanały KATP zostały również zidentyfikowane w we­ także w glikolizie i translokacji białek przez błony [ 1 , wnętrznej błonie mitochondriów komórek wątroby 93]. Podobne pod względem mechanizmu wiązania i mięśnia sercowego oraz w komórkach drożdży nukleotydów co aktyna, są: białka szoku termicznego [92-95]. Mitochondrialny kanał KATP jest hamowany i pokrewne im białka towarzyszące (np. Hsc70), uczest­ przez ATP (IC50 0,8 mM), a nie jest hamowany przez niczące w procesach przywracania właściwej struktury ADP [92]. GTP i GDP aktywują kanał w obecności białkom po szoku termicznym, tworzenia złożonych 0,5 mM ATP, przypuszcza się więc, że w regulacji kompleksów białek oligomerycznych, a także w trans­ aktywności kanału biorą również udział nukleotydy lokacji białek przez błony w czasie ich syntezy oraz guaninowe [96]. Mitochondrialnym kanałom KATP w utrzymywaniu ich natywnej konformacji [103]. przypisuje się podwójną rolę: regulacji poziomu K + Białko Hsc70 wiąże się z innymi polipeptydami przed w matriks, co kontroluje ciśnienie osmotyczne we­ przyjęciem przez nie właściwej konformacji [104], wnątrz mitochondriów, oraz regulacji objętości mito­ Białko to wiąże ATP i katalizuje hydrolizę nukleotydu chondriów [97], co wpływa na ich metabolizm [98] w obecności tzw. białkowych czynników wymieniają­ i tworzenie siły protonomotorycznej [99]. Może to cych nukleotydy. Białka te stymulują aktywność hyd- tłumaczyć zaangażowanie mitochondrialnych kana­ rolityczną Hsc70 i powodują dysocjację kompleksu

łów Katp w procesach zależnych od potencjału trans- Hsc70/nukleotyd/inny polipeptyd. Zarówno aktyna, membranowego, jak uniport Ca2+ i transport nukleo- jak i białko Hsc70 przypominają heksokinazę, a także tydów adeninowych oraz w procesach zależnych od kinazę glicerolową pod względem budowy domeny ApH, jak transport fosforanu i pirogronianu [86, 87]. wiążącej nukleotydy [105]. Przypuszcza się, że „przod­ kiem” tej grupy białek był polipeptyd posiadający V. Aktyna, heksokinaza i białka pokrewne tylko jedną domenę, o strukturze heksokinazy w stanie białkom szoku termicznego rozplecionym, charakteryzujący się niewielkim powi­ nowactwem w stosunku do ATP. W wyniku zaś dupli­ Niektóre białka wiążące ATP katalizują wprawdzie kacji genu i fuzji doszło do powstania dimerycznej reakcję hydrolizy ATP, ale wiązanie nukleotydów cząsteczki posiadającej dwie subdomeny, dzięki czemu wywołuje w ich cząsteczkach dodatkowo funkcjonalne wiązanie ATP stało się bardziej efektywne [1, 18]. zmiany konformacyjne. Aktyna jest typowym przy­ kładem takiego białka. Aktyna wiąże jedną cząsteczkę VI. Podsumowanie ATP lub ADP, zawiera jedno miejsce wiążące Mg2 + lub Ca2+ z wysokim powinowactwem oraz szereg Do opublikowania pracy Johna Walkera miejsc wiążących kationy dwuwartościowe z niskim i w s p . w EM BO Journal [7] na temat podobieństw powinowactwem [93, 94], Tworzeniu się filamentów struktury pierwszorzędowej białek wiążących ATP aktynowych towarzyszy hydroliza ATP [93, 100, 101]. minęło piętnaście lat i, co zrozumiałe, poglądy badaczy Polimeryzacja monomerycznej aktyny jest kontrolo­ na ten temat uległy znacznej ewolucji. Stwierdzono wana przez wyspecjalizowane białka wiążące aktynę, przede wszystkim, że istnieją białka wewnątrzkomór­ Te zaś regulowane są przez sygnały docierające z błony kowe, które wprawdzie wiążą nukleotydy adeninowe, plazmatycznej, na skutek pobudzenia określonych ale ich nie hydrolizują. Oprócz klasycznego spojrzenia receptorów błonowych i zainicjowania całej kaskady na ATP jako na nośnik energii niezbędny w procesach zdarzeń wewnątrzkomórkowych [1, 93], Aktyna od­ metabolicznych i transporcie [106], pojawiły się po­ działuje również z wieloma innymi białkami jak miozy­ glądy przypisujące ATP rolę wtórnego przekaźnika na, żelzolina, profilina lub kaldesmon [ 10 2 ]. informacji [4-6] lub fizjologicznego ligandu modulują­ W cząsteczce aktyny występuje charakterystyczne cego funkcję białek [9, 16, 17, 92], czemu poświęcony zwinięcie struktury trzeciorzędowej odpowiedzialne za jest również niniejszy artykuł przeglądowy. W miarę wiązanie nukleotydów. W obecności Ca2+ lub Mg2 + wzrostu liczby dostępnych informacji na temat struk­ następuje przeniesienie grupy fosforanowej ATP na tury białek i kodujących je genów okazało się, że grupę hydroksylową odpowiedniej reszty aminokwa- motyw Walkera A i B występuje wprawdzie bardzo sowej. Struktura odpowiedzialna za wiązanie nukleo­ powszechnie, ale w różnych białkach znaleziono co tydów składa się z dwóch subdomen a i |3. Subdomeny najmniej osiem innych, powtarzających się sekwencji te mają skomplikowaną strukturę, na którą składają aminokwasowych, które są odpowiedzialne za wiąza­ się a-heliksy otaczające łańcuchy peptydowe przyj­ nie nukleotydów [9], W dodatku, nie tylko niewielkie mujące konformację (3-zgięcia. Pomiędzy subdomena- odcinki łańcucha polipeptydowego o zachowanej mi znajduje się hydrofobowa kieszeń, gdzie wiążą się w trakcie ewolucji sekwencji aminokwasowej, ale całe grupy adeninowe ATP lub ADP [1, 94], podczas gdy moduły czy domeny o określonej, również zachowanej określona sekwencja w subdomenie ot odgrywa rolę ewolucyjnie, strukturze trzecio- i czwartorzędowej, w wiązaniu grup fosforanowych nukleotydu [1, 94], odgrywają istotną rolę w wiązaniu nukleotydów [8], Występowanie takiej jak w aktynie struktury trze­ W literaturze przedmiotu moduły te określane są jako ciorzędowej wiążącej nukleotydy stwierdzono nie tyl­ „molekularne przełączniki” [107, 108], gdyż ich zna­

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 117 czenie dla pełnionej przez białko funkcji jest pod­ 30. Wang L, lida H, Shi bat a Y (1993) Cardiovasc Res 27: stawowe. Zatem badania struktury białek w oparciu 1855-1862 31. Tagoe CE, Boustead CM, Higgins SJ, Walker o metody krystalograficzne, biologii molekularnej i in­ J H (1994) Biochim Biophys Acta 1192: 272-280 ne, mogą w przyszłości zaowocować nie tylko okreś­ 32. Burgoyne RD, GeisowMJ (1989) Cell Calcium 10: 1-10 33. McClung AD, Carroll D, Battey NH (1994) Bio­ leniem budowy nowych miejsc wiążących nukleotydy chem J 303: 109-112 w cząsteczce białka i opisaniem mechanizmu ich 34. Calvert CM, Gant S J, Bowles DJ (1996) Plant Cell 8: działania, ale przede wszystkim przypisaniem właś­ 333-342 35. Chap H, Fauvel J, Gassama-Diagne A, Raga b- ciwej funkcji tym białkom. -Thomas J, Simon M (1991) M ed Sci 7: 8-9 36. Churn SB, Sankaran B, Haley BE, DeLorenzo Podziękowanie RJ (1993) Biochem Biophys Res Commun 193: 934-940 Praca dofinansowana z grantu KBN 4 P05A 065 08. 37. Castets F, Bail 1 at G, Mirzoeva S, Mabrouk K, Garin J, d’A layer J, Monneron A (1994) Biochemistry 33: 5063-5069 Artykuł otrzymano 10 marca 1997 r. 38. Tran ChM, Farley RA (1996) Biochemistry 35: 47-55 Zaakceptowano do druku 1 kwietnia 1997 r. 39. Thomas PJ, Pedersen PL(1993) J Bioenerg Biomemhr 25: 11-19 40. Baubichon-Cortay H, Baggetto LG, Dayan G, D i Pietro A (1994) J Biol Chem 269: 22983-22989 41. Pikuła S, Hayden J B, Awasthi S, Awasthi YC, Piśmiennictwo Z i m n i a k P (1994) J Biol Chem 269: 27566-27573 42. Cheng K, Koland JG (1996) J Biol Chem 271: 311-318 1. Holmes KC, Sander C, Valencia A (1993) Trends 43. Bandorowicz J, Pikuła S, Sobota A (1992) Biochim Cell Biol 3: 53-59 Biophys Acta 1105: 201-206 2. Lehninger AL (1965) Bioenergetics. The molecular basis 44. Bandorowicz-Pikula J, Sobota A (1996) Cell M ol of biological energy transformation. WA Benjamin, Inc, New Biol L ett 1: 17-23 York, Amsterdam 45. Bandorowicz-Pikula J (1995) Post Biochem 41: 247- 3. Zu bay G (1993): Biochemistry. Wm C Brown Publishers; -257 Dubuque, Iowa, Melbourne, Australia, Oxford, England 46. Celio M R, Pauls T, Schwaller B (red) (1996) Guide to 4. Zimmermann H (1994) Trends Neurosci Sei 17: 420-426 the calcium-binding proteins. A Sambrook & Tooze Pub­ 5. Edwards FA (1994) Curr Opin Neurohiol 4: 347-352 lication at Oxford University Press, Oxford 6. Conigrave AD, Jiang L (1995) Cell Clacium 17: 111-119 47. W u t h i e r R E (1993) J N utr 123 (2 suppl): 301-309 7. W a 1 k e r J E, Saraste M, Runswick M J, Gay NJ 48. KirschT, Wuthier RE (1994) J Biol Chem 269: 11462- (1982) E M B O J 1: 945-951 -11469 8. Schultz GE (1992) Curr Opin Struct Biol 2: 61-67 49. Wu LN, Yoshimori T, Genge BR, Sauer GR, 9. Traut TW (1994) Eur J Biochem 222: 9-19 Kirsch T, Ishikawa Y, Wuthier RE (1993) J Biol 10. A p rille JR (1993) J Bioenerg Biomemhr 25: 473-481 Chem 268: 25084-25089 11. Hambly BD, Kiessling P, dos Remedios CG 50. H a t o r i M, Teixeira C C, Debolt K, Pacifici M, (1994) Adv Exp Med Biol 358: 25-34 Shapiro I M (1995) J Cell Physiol 165: 468-474 12. Inoue I, Higuti T (1994) W: Peracchia DC (red) Handbo­ 51. W u L N , Ishikawa Y, Sauer GR, Genge BR, ok of Membrane Channels: Molecular and Cellular Physiolo­ Mwale F, Mishima H, Wuthier RE (1995) J Cell gy. Academic Press, San Diego, CA, str 549-554 Biochem 57: 218-237 13. v a n Kuijck M A, van Aubel R A, Busch A E, Lang 52. Makowska A, Duszyński J (1996) Post Biochem 42: F, Russel FG, Bindels R J, van Os CH, Dcen PM 146-153 (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93: 5401-5406 53. Petersen OH (1996) News Physiol Sci 11: 13-17 14. Al-Awqati Q (1995) Science 269: 805-806 54. Ehrlich BE, Kaftan E, Bezprozvanny S, Bez- 15. Laham LE, Way M,Yin H L, Janmey PA (1995) Eur prozvannaya I (1994) Trends Pharmacol Sci 15: 145-149 J Biochem 234: 1-7 55. Clapham DE (1995) Cell 80: 259-268 16. Cohen BE, Lee G, Arispe N, Pollard HB (1995) 56. Pikuła S (1997) K osm os (w druku) FEBS L ett 377: 444-450 57. C a rafo li E (1994) FA SEB J 8: 993-1002 17. Bandorowicz-PikułaJ, Awasthi YC (1997) FEBS 58. Fleischer S, Inui M (1989) Annu Rev Biophys Chem 18: L ett (w druku) 333-364 18. Kabasch W, Holmes KC (1995) F A SE B J 9: 167-174 59. Giannini G, Clement i E, Ceci R, Marziali G, 19. Kabsch W, Manneherz HG, Suck D, Pai EF, Sorrentino V (1992) Science 257: 91-94 Holmes KC (1990) N ature (Lond) 347: 37-44 60. Sorrentino V, V o 1 p e P (1993) Trends Pharmacol Sci 14: 20. Flaherty KM, DeLuca-FlahertyG, McKay DB 98-103 (1990) N ature (Lond) 346: 623-628 61. Berridge MJ (1993) N ature (Lond) 361: 315-325 21. BandorowiczJ, PikulaS (1993) Acta Biochim Polon 40: 62. Tanabe T, Beam KG, Adams BA, Niidome T, 281-293 N u m a S (1990) N ature (Lond) 346: 567-569 22. Raynal P, Pollard HB (1994) Biochim Biophys Acta 63. Pozzan T, Rizzuto R, V o 1 p e P, Meldolesi J (1994) 1197: 63-93 Physiol Rev 74: 595-636 23. Bandorowicz-Pikula J (1996) Post Biol Korn 23: 64. Fasolato C, Innocenti B, Pozzan T (1994) Trends 151-167 Pharmacol Sci 15: 77-83 24. Swairjo M A, Seaton BA (1994) Annu Rev Biophys 65. Henderson JS, Meissner G (1987) J Biol Chem 262: Biomol Struct 23: 193-213 3065-3073 25. Kaetzel MA, Dedman JR (1995) News Physiol Sei 10: 66. Lai FA, Erickson HP, Rousseau E, Lin Q-Y, 171-176 Meissner G (1988) N ature (Lond) 331: 315-319 26. Sobota A, Bandorowicz J, Jezierski A, Sikor­ 67. Ogawa Y (1994) Crit Rev Biochem Mol Biol 29: 229-274 ski A F (1993) FEBS L ett 315: 178-182 68. Petersen OH,Petersen CC H, Kasai H (1994) Annu 27. Bandorowicz-Pikula J, Sikorski AF, Białko­ Rev Physiol 56: 297-319 wska K, Sobota A (1997) Mol Membr Biol 13: 241-250 69. Sitsapesan R, McGarry J, Williams AJ (1995) 28. Pikuła S, Bandorowicz-Pikuła J (1996) Cell M ol Trends Pharmacol Sci 16: 386-391 Biol L ett 1: 119-128 70. Diaz-Muńoz M, Hamilton SL, Kaetzel MA, 29. Bianchi R, Giambanco I, Ceccarelli P, Paula Hazarika P, Dedman JR (1990) J Biol Chem 265: G, Donato R (1992) FEBS L ett 296: 158-162 15894-15899

118 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 71. Witcher DE, Strifler BA, Jones LR (1992) J Biol P-O, Bertorello AM, Bokvist K, Chibalin A, Chem 267: 4963-4967 Denney JT, Flatt P R, G a b e 1 J, Gromada J, Lars- 72. Wang J, Bert PM (1992) N ature (Lond) 359: 739-741 son O, Lindstróm P, Rhodes CJ, Rorsman 73. Smith JS, Rousseau E, Meissner G (1989) C irc Res K (1996) Science 271: 813-815 63: 352-359 91. Lynch J J, S a n g u i n e 11 i MC, Kimura S, Bassett 74. Rousseau E, Smith JS, Henderson JS, Meissner A L (1992) F A SEB J 6: 2952-2960 G (1986) Biophys J 50: 1009-1014 92. Inoue I, Nagase H, Kishi K, Higutti T (1991) 75. MacLennan DH, Phillips MS (1992) Science 256: N ature (Lond) 352: 244-247 789-794 93. Kabsch W, Vanderkerckhove J (1992) Annu Rev 76. McGarry SJ, Williams AJ (1994) J Membr Biol 137: Biophys Biomol Struct 21: 49-76 169-177 94. Hennesey ES, Drummond DR, Sparrow JC 77. Mignery GA, Newton CL, Archer BT 3rd, (1993) Biochem J 282: 657-671 Südhof TC (1990) J Biochem 265: 12679-12685 95. Szewczyk A, Wójcik G, Lobanov NA, Nałęcz 78. Nakagawa T, Okano H, Furuichi T, A ruga J, M J (1997) Biochem Biophys Res Commun 230: 611-615 M i h o s h i b a K (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88: 6444- 96. G a r 1 i d M (1994) J Bioenerg Biomemhr 26: 537-542 -6448 97. Szewczyk A, Pikuła S, Wojtczak L, Nałęcz MJ 79. Ferris CD, Snyder SH (1992) J Neurochem 12: 1567- (1994) W: Forte M, Colombini M (red) Molecular Biology of -1574 Mitochondrial Transports Systems. Springer-Verlag, Berlin, 80. Divecha N, Rhee S-G, Letcher J, Irvine RF (1993) str. 221-228 Biochem J 289: 617-620 98. Halestrap AP (1994) Biochem Soc Trans 22: 522-529 81. Ferris CD, Cameron AM, Bredt D S, Huganir 99. Czyż A, Szewczyk A, NałęczMJ, Wojtczak RL, Snyder SH (1992) J Biol Chem 267: 7036-7041 L (1995) Biophys Biochem Res Commun 210: 98-104 82. Spat A, Eberhardt I, Kiesel L (1992) Biochem J 287: 100. M a r s t o n S (1995) Int J Biochem Cell Biol 27: 97-108 335-336 101. Oosawa F (1995) J Biochem 118: 863-870 83. Bezprozvanny I, Ehrlich BE (1993) Neuron 10: 102. Pollard T D, Almo S, Quirk S, Vinson V, L a t - 1175-1184 t m a n EE (1994) Annu Rev Cell Biol 10: 207-249 84. Ben ham CD, Tsien RW (1987) N ature (Lond) 328: 103. Hartl FU, Martin J, Neupert W (1992) Annu Rev 275-278 Biophys Biomol Struct 21: 293-322 85. Szewczyk A (1995) W : Konarska L (red) Molekularne 104. Beckmann RP, Mizzen LA, Welch WJ (1990) mechanizmy przekazywania sygnałów w komórce. PWN, Science 248: 850-854 Warszawa, str 190-200 105. Hurley J H, Faber HR, Worthylake D, Meadow 86. Szewczyk A (1996) Acta Biochim Polon 43: 713-720 ND, Roseman S, Pettigrew DW, Remington SJ 87. Szewczyk A (1997) Biochem Pharmacol 53 (w druku) (1993) Science 259: 673-677 88. Ashcroft SJH, Ashcroft FM (1988) Cell Signalling 2: 106. DeMeis L (1993) Arch Biochem Biophys 306: 287-296 198-217 107. Yoshida M, Amano T (1995) FEBS L ett 359: 1-5 89. Lazdunski M (1994) J Cardiovascul Pharmacol 24: S1-S5 108. Noji H, Amano T, Yoshida M (1996) J Bioenerg 90. Eliasson L, Renstöm W, Ämmälä C, Berggren Biomemhr 28: 451-457

NOWE WYDAWNICTWA PTBIOCH.:

1) „HORMONY GLIKOPROTEINOWE — Struktura, biosynteza i funkcja ich oligosacharydów” Monografia biochemiczna nr 41 cena 5,- zł autor Iwona Żak i Marian Drożdż rok wydania 1996

2) „WŁODZIMIERZ MOZOŁOWSKI 1895—1975 w 100-lecie urodzin” cena 25,- zł Wydawca Oddział Gdański PTBioch. r. 1995 pod red. Wiesława Makarewicza praca zbiorowa

;POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 119 Zmiany w domenie regulatorowej główki miozyny obser­ wowane w niektórych chorobach serca

Changes in the regulatory domain of myosin head observed in some heart diseases

ANNA MOCZARSKA*

Spis treści: Contents:

I. Wstęp I. Introduction II. Kardiomiopatia rozstrzeniowa o nieznanym pochodzeniu II. Idiopathic Dilated Cardiomyopathy (IDC) and myosin (IDC) i lekkie łańcuchy regulujące miozyny regulatory light chains III. Lekkie łańcuchy istotne miozyny, a niektóre wrodzone III. Myosin essential light chains and some congenital heart wady serca diseases IV. „Ogłuszony” mięsień sercowy, a zmiany w domenie IV. “Stunned” myocardium and changes in the regulatory regulatorowej główki miozyny domain of myosin head V. Podsumowanie V. Summary

Wykaz stosowanych skrótów: LC1 — lekki łańcuch istotny łańcuch istotny (LC1) i regulujący (LC2) (Ryc. 1). miozyny-izoforma dłuższa; LC3 — lekki łańcuch istotny Łańcuch regulujący ulega fosforylacji przez zależną od miozyny - izoforma krótsza; LC2 — lekki łańcuch regulujący kalmoduliny i wapnia kinazę lekkich łańcuchów mio­ miozyny; IDC — kardiomiopatia rozstrzeniowa o niezna­ zyny, a także wiąże jony wapnia lub magnezu [6, 7], nym pochodzeniu; ALC1 — lekki łańcuch istotny miozyny- -izoforma występująca w przedsionku serca; VLC1 — lekki Wymienione procesy zmieniają konformację tego biał­ łańcuch istotny miozyny-izoforma występująca w komorze ka, co być może, wpływa na strukturę całej główki serca. miozynowej i jej oddziaływania z aktyną w procesie skurczu [8]. Umiejscowienie obu lekkich łańcuchów I. Wstęp w domenie regulatorowej główki pozwala sądzić, że ich główną funkcją jest stabilizowanie oc-heliksu ciężkiego W wielu chorobach serca zaburzenia jego funkcji łańcucha i wzmacnianie efektów zmian konformacyj- skurczowej połączone są ze zmianami w aparacie nych wynikających z procesów wiązania i uwalniania kurczliwym. Badania prowadzone w różnych ośrod­ nukleotydu [5], Hipotezy oparte na modelu struktury kach na świecie wykazały, że jednym z białek pod­ główki miozyny zakładają, że zmiany konformacjne legających tym zmianom jest miozyna — podstawowy zachodzące w domenie motorycznej, a związane z pro­ składnik filamentu grubego. cesami wiązania i hydrolizy ATP, przenoszone są do Miozyna zbudowana jest z 6 łańcuchów polipep- domeny regulatorowej główki miozynowej. Pewną tydowych wśród których wyróżnia się dwa łańcuchy rolę w tym procesie odgrywa lekki łańcuch istotny [9]. ciężkie tworzące pałeczkę i dwie główki w ich Jednocześnie, w obrębie domeny regulatorowej wy­ N-końcowej części, oraz połączone niekowalencyjnie miana jonów magnezu na wapń w łańcuchu regulu- ze strukturą główki dwa rodzaje lekkich łańcuchów jącm i fosforylacja tego łańcucha mają wpływ na [1-3]. Główki miozyny zawierają miejsce wiązania oddziaływanie główki miozyny z aktyną. Zjawiska te nukleotydu oraz aktyny, a zatem spełniają warunki mogą ulec zaburzeniu gdy jeden lub oba lekkie łań­ niezbędne do generowania ruchu. Badania krystalicz­ cuchy zostaną uszkodzone lub zmodyfikowane [ 10 ], nej struktury główki miozyny uzyskanej z mięśnia Dotychczasowe wyniki badań miozyny, uzyskanej szkieletowego kurczęcia [4, 5] pozwoliły wyróżnić z serc z różnymi wadami rozwojowymi, lub też zmie­ w niej dwie domeny: motoryczną z centrum katalitycz­ nionych w wyniku innych chorób układu naczyniowe­ nym i miejscem wiązania aktyny, oraz domenę regula­ go, wskazują, że domena regulatorowa główki miozy­ torową zawierającą dwa lekkie łańcuchy miozyny: ny, a w szczególności jej komponenty — lekki łańcuch istotny i łańcuch regulujący, pełnią ważną rolę w regu­ lowaniu oddziaływania miozny z aktyną, a zatem * Dr, Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN, Zakład Biochemii Mięśni Pasteura 3, 02-093 War­ funkcji skurczowej mięśnia sercowego, która w warun­ szawa kach choroby ulega często istotnym zmianom.

120 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 5 OkD

II. Kardiomiopatia rozstrzeniową o niezna­ Filamenty formowane z miozyny mięśnia sercowego nym pochodzeniu (IDC) i lekkie łańcuchy pacjentów z kardiomiopatią rozstrzeniową są zdecy­ regulujące miozyny dowanie krótsze i grubsze od tych prawidłowych. Ich długość wynosi od 0.35 do 0.5 pm [20], Jest inte­ Lekkie łańcuchy miozyny — szczególnie łańcuch resujące, że podobne zaburzenia struktury syntetycz­ regulujący (LC2) są bardzo wrażliwe na obecność nych filamentów obserwuje się też w miozynie po­ enzymów proteolitycznych. Badania miozyny uzyska­ chodzącej z serc kontrolnych po skróceniu jej lekkich nej z serc pacjentów cierpiących na kardiomiopatię łańcuchów regulujących jedynie o N-końcowy frag­ rozstrzeniową o nieznanym pochodzeniu (idiopathic ment [21]. Obecność zgrubień na powierzchni filamen- dilated cardiomyopathy — IDC) wykazały istotną tu wskazuje na możliwość zlepiania się główek miozy- redukcję zawartości jej lekkich łańcuchów regulują­ nowych (Ryc. 2). Jest prawdopodobne, że zmiany cych. struktury miofilamentów powstałe w następstwie cał­ IDC jest chorobą o nieznanej dotąd etiologii [11, kowitej lub tylko częściowej degradacji łańcuchów 12]. Preparaty histologiczne chorych serc wykazują regulujących mogą być ostatecznie przyczyną zmienio­ rozsiane zwłóknienia i w niektórych przypadkach nych właściwości kurczliwych serca. ogniskowe blizny [13]. W przeciwieństwie do kardio- Dalsze badania miozyny uzyskanej z serc pacjentów miopatii hypertroficznej, w której nie ma uderzających cierpiących na kardiomiopatię rozstrzeniową wykaza­ zmian w strukturze i aktywności białek kurczliwych ły, że obserwowana tu znaczna redukcja zawartości [14], w sercach IDC obserwuje się spadek zawartości lekkich łańcuchów regulujących spowodowana jest miofibryli w miocytach [15, 16], a także obniżenie obecnością proteazy, która być może w czasie choroby aktywności miofibrylarnej ATPazy [17, 18]. Postęp syntetyzowana jest de novo lub też aktywowana z jej choroby od początku zaobserwowania jej objawów do nieaktywnej formy obecnej wcześniej w tkance. Wzmo­ krańcowego zniszczenia mięśnia sercowego jest u wielu żone działanie proteazy nie zostało ostatecznie wyjaś­ pacjentów zróżnicowany. W pewnych przypadkach nione i pozostaje kwestią sporną. Jednak możliwość jej trwa to miesiące w innych lata z tymi samymi koń­ aktywacji wydaje się być bardzo prawdopodobną, cowymi objawami poważnego uszkodzenia serca [19]. ponieważ niewielkie ilości tego enzymu wykryto w pre­ Analiza zawartości lekkich łańcuchów istotnych paratach serc kontrolnych [20]. W sercach IDC jego i regulujących w miozynie uzyskanej z serc pacjentów aktywność wzrastała 3-5 razy. Omawiana proteaza z kardiomiopatią rozstrzeniową i w miozynie serc charakteryzuje się wysoką specyficznością w stosunku kontrolnych wykazała istotne różnice. W zdrowym do LC2 miozyny serca ludzkiego. Jej inkubacja z mio­ sercu stosunek LC1 /LC2 wynosi 1:1, w sercach pacjen­ zyną z mięśnia sercowego psa czy też z mięśni szkieleto­ tów z IDC proporcje tych łańcuchów były wyraźnie wych królika powoduje niewielkie tylko uszkodzenie zmienione i wynosiły od 1:0.69 do 1:0.1. Zaobser­ lekkich łańcuchów regulujących, natomiast w miozy­ wowano również całkowitą degradację LC2 [20]. nie z serca ludzkiego łańcuchy te ulegają całkowitej Badania mikroskopowe filamentów syntetycznych wy­ degradacji [20]. Zatem, bez względu na to jaki mecha­ kazały, że redukcja zawartości lekkich łańcuchów nizm odpowiedzialny jest za zwiększoną aktywność regulujących miozyny pochodzącej z serc miopatycz- proteazy w sercach IDC, jej pojawianie się może nych, prowadzi do tworzenia się nieprawidłowych tzw. stanowić krytyczny etap w rozwoju choroby prowa­ „karłowatych” filamentów o guzowatych tępych koń­ dzący ostatecznie do degradacji lekkich łańcuchów cach. Syntetyczne filamenty formowane z miozyny regulujących miozyny. Obserwowany w kardiomiopa- uzyskanej z kontrolnego mięśnia sercowego człowieka tii rozstrzeniowej defekt w domenie regulatorowej mają długość wahającą się w granicach 0.7-2.0 pm. główki miozyny jest także przyczyną spadku jej aktyw-

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 121 Ryc. 2. Syntetyczne filamenty formowane z mio­ ■ V 'W * ».¡y.y- ■ ,"<, , . . ,A., zyny z mięśnia sercowego królika, w któ­ rej działaniem chymotrypsyny skrócono lekki łańcuch regulujący. Strzałki pokazu­ ją charakterystyczne zgrubienia będące wynikiem zlepiania się główek miozyno- wych [21]. ności enzymatycznej, co przejawia się obniżeniem miozynowej są lekkie łańcuchy istotne miozyny. Ich szybkości wiązania i hydrolizy ATP, a także spadkiem fizjologiczna rola pozostaje wciąż słabo poznana. powinowactwa do aktyny [20]. Należy przypuszczać, Miozyna pochodząca z szybkich mięśni szkieletowych że obecność nienaruszonych lekkich łańcuchów regu­ zawiera dwie izoformy lekkich łańcuchów istotnych lujących niezbędna jest dla formowania prawidłowych określane jako formy LC1 i LC3. Forma LC1 jest filamentów oraz stabilizacji struktury główek miozy- dłuższa od LC3 o 41 reszt aminokwasowych w N- nowych. Ich brak obserwowany w IDC może być -końcowej części lekkiego łańcucha istotnego (Ryc. 3) przyczyną destabilizacji sarkomeru, co ostatecznie [22, 23]. Miozyna z mięśnia sercowego zawiera tylko doprowadzi do załamania się funkcji skurczowej mięś­ dłuższą formę — LC1, która występuje w postaci nia sercowego. dwóch izoform: przedsionkowej i komorowej. Łań­ cuchy istotne miozyny przedsionków serca różnią się III. Lekkie łańcuchy istotne miozyny od łańcuchów miozyny komór ciężarem cząsteczko­ a niektóre wrodzone wady serca wym (m.cz. ALC1 — 28 kDa; VLC1 — 27 kDa) i punktem izoelektrycznym. Są one produktami dwu Innym elementem domeny regulatorowej główki różnych genów (Ryc. 4) [24. 25]. 10 20 30 LC1 PKKNN/KKPAA AAAPAPKAPA PAPAPAPAPK LC3

40 50 60 LC1 E E K I D L S A I K IEFSKEQQDE FKEAFLLYDR LC3 SFSADQIAE FKEAFLLYDR

70 80 90 LC1 T G D S K T L S Q V G D V L R AL G T N P T N A E V K K V LC3 T G D S K i T L S Q VGDVLRALGT N PT N A E V K K V

100 110 120 LC1 LGNPSDEQMN A K K I E F E Q F L P M L Q A S N N K LC3 LGNPSDEQMN AKKI E F E Q F L P M L Q A S N N K

DO 140 150 LC1 D Q G T Y E D F V E G LR V F D K E G O T V GM G A E L R H LC3 D Q G T Y E D F V E G L R V F D K E G D T V G M G A E L R H

160 170 180 LC1 V L A T L G E K M K E E E V E A L M A G Q E D S N G C I N Y LC3 VLATLGEKMK E E E V E A L M A G Q E D S N G C l N Y

190 Ryc. 3. Sekwencje aminokwasowi izolormy dłuz- szej (LC1) i krótszej (LC3) lekkich łań­ LC1 E A F V K H M S I cuchów istotnych miozyny mięśnia szkie­ LC3 E A FV K H M S i letowego szybkiego królika (wg bazy da­ nych SWISS-PROT).

122 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 ...... 10 s .... x ... x . , V 2 0 ^ ... , 3 0 ALC1 A P K K P E P K K E AAKPAPAPAP APAPAPAPAP VLC1 A P K K P E P K K D DAKAAPKAAP APAPPPEPER

40 50 60 ALC1 EAPKEPAFDP KSVK I DFTAD Q I E E F K E A F S VLC1 PKEVE'FDASK I K I E F T P E Q I E E F K E AF M L F

70 80 90 ALC1 LFDRTPTGEM KI TYGQCGDV LRALGQNPTN VLC1 DRTPKCEMK I TYGQCGDVLR ALGQNPTQAE

100 110 120 ALC1 AEVLRVLGKP KPEEMNVKML DFETFLP I LQ VLC1 VLRVLGKPRQ EELNTKMMDF ETFLPMLQH I

130 140 150 ALC1 H I SRNKEQGT Y E DF V E G L R V F D K E S N G T V M VLC1 SKNKDTGTYE D FV E GL R V F D K E G NG T V M G A

160 i 70 180 ALC1 GA HV LA T L G EK M T Ej V EQLLAGQEDA VLC1 EL LAT L G E RLTED E K LMAGOEDSNG Ryc. 4. Sekwencje aminokwasowe izoformy 190 196 przedsionkowej (ALC1) i komorowej ALC1 NG Y EAF V K H I MS G (VLC1) lekkich łańcuchów istotnych miozyny mięśnia sercowego człowieka VLC1 C I AFVK H I MSS (wg bazy danych SWISS-PROT).

N-koniec lekkiego łańcucha istotnego może uczest­ tę potwierdziły wyniki dalszych badań, w których niczyć w oddziaływaniach miozyny z aktyną [26, 27], wykazano wzrost ekspresji przedsionkowych form Jego rola w tym procesie nie została ostatecznie lekkich łańcuchów istotnych miozyny w komorach poznana. Badania kurczliwości włókien izolowanych pacjentów cierpiących na pewne wrodzone wady serca. z mięśnia szkieletowego oraz analiza ruchliwości in Mięsień sercowy zawiera izoenzymy miozyny wyka­ vitro wykazały, że utrata przez izoformę LC1 jej zujące różne poziomy aktywności ATPazowej. Eks­ N-końcowego fragmentu przyczynia się do wzrostu presja określonej izoformy jest związana z kurczliwoś- maksymalnej szybkości skracania się włókien i ruchu cią mięśnia i jego energetycznym zachowaniem [34]. filamentów [28-31], Inne wyniki badań sugerują też, że Proporcje izoenzymów w poszczególnych częściach w szybkim mięśniu szkieletowym oddziaływania elek­ serca zmieniają się w zależności od wieku, stanów trostatyczne pomiędzy dodatnio naładowanym boga­ patologicznych i regulowane są na poziomie trans­ tym w prolinę N-końcem LC1 i ujemnie naładowany­ krypcji. Miocyty przedsionka i komory serca mogą mi resztami na powierzchni aktyny są przyczyną adaptować się do zmienionych warunków zwiększone­ wolniejszego ruchu filamentów [32]. Mora no go mechanicznego obciążenia przez zmianę wzoru i w s p. [33] przeprowadzili badania z zastosowaniem izoform ciężkich i lekkich łańcuchów w tych częściach syntetycznego peptydu odpowiednika N-końcowego serca. Podczas rozwoju płodowego w prawidłowo fragmentu lekkiego łańcucha istotnego miozyny ko­ rozwijającym się mięśniu sercowym człowieka zarów­ mory mięśnia sercowego człowieka. Peptyd ten zawie­ no w przedsionkach jak i w komorach serca występują rał reszty aminokwasowe 5-14 i wiązał się do C-końca przedsionkowe formy lekkich łańcuchów istotnych aktyny, uniemożliwiając w ten sposób oddziaływanie miozyny (ALC1). Pierwotne sercowe komory pojawia­ N-końcowego fragmentu natywnego lekkiego łańcu­ ją się już w pierwszych kilku tygodniach życia płodo­ cha z aktyną. Oddziaływania takie blokowano również wego i funkcjonują w nieobecności kontroli układu stosując przeciwciała monoklonalne skierowane prze­ nerwowego. Sugeruje się, że pewną rolę w deter­ ciwko N-końcowemu fragmentowi natywnego lekkie­ minowaniu typu syntetyzowanych lekkich łańcuchów go łańcucha istotnego miozyny. W obu przypadkach w rozwijających się komorach serca mogą odgrywać zaobserwowano wzrost kurczliwości włókien mięśnia zróżnicowane gradienty ciśnienia [24]. Wkrótce po sercowego. Wysunięto zatem wniosek, że oddziaływa­ urodzeniu zawartość przedsionkowych form LC1 nia lekkiego łańcucha istotnego z aktyną lub brak w komorach stopniowo obniża się do niewykrywal- takich oddziaływń mogą w istotny sposób regulować nych poziomów, a na ich miejsce pojawiają się właś­ produkcję siły, a przez to kurczliwość serca. Hipotezę ciwe formy komorowe, obserwowane tam przez całe

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 123 T abela 1. wencji podwyższonej ekspresji form przedsionkowych Podstawowe cechy analizowanych wrodzonych wad serca łańcuchów istotnych miozyny w komorach serca,

Rodzaj wady serca Podstawowe cechy choroby przeprowadzono badania szybkości maksymalnego skracania się włókien oraz pomiary połowicznego • zwężenie ujścia tętnicy płucnej • ubytek przegrody międzykomorowej czasu rozwoju napięcia w pozbawionych błony włók­ Czwórzespół • przesunięcie w prawo tętnicy głównej nach izolowanych z serc pacjentów z analizowanymi Fallota • przerost prawej komory (zjawisko wtór­ wcześniej wadami (Tab. 1). Ekspresja ALC1 w prawej ne) komorze serc tych pacjentów wahała się w granicach • rozlany masywny przerost mięśnia drogi od 0 do 27%. Pokazano, że włókna komory zawierają­ Zwężenie odpływu prawej komory (zwężenie stoż­ ce największe ilości ALC1 (20% i więcej) wykazywały podzastawkowe ka komory) lub obecność okrężnego pier­ wyższą szybkość maksymalnego skracania się i niższy prawego ujścia ścienia włóknistego lub mięśniowego połowiczny czas rozwoju napięcia niż włókna nie tętniczego w odległości około 1 cm przed zastawką tętnicy płucnej zawierające przedsionkowej formy LC1 lub zawierają­ ce bardzo małe jej ilości [39]. Inne badania wykazały, • tętnica płucna umiejscowiona jest prawi­ dłowo a przemieszczona aorta znajduje że zwiększona ekspresja ALC1 w komorach serc się po prawej stronie tętnicy płucnej miopatycznych skorelowana jest z podwyższoną wraż­ Odejście obu • zastawki obu tętnic leżą na tym samym liwością na wapń aparatu kurczliwego prawdopodob­ dużych tętnic z poziom ie nie na skutek różnic w składzie aminokwasowym prawej komory • ubytek w przegrodzie międzykomorowej N-końców obu form LC1 [25, 40]. Wyniki te sugerują, serca stanowi jedyną drogę odpływu krwi z le­ wej komory serca że obecność przedsionkowej formy lekkich łańcuchów • możliwa obecność zwężenia ujścia tętnicy istotnych miozyny w hypertroficznych komorach ma płucnej wpływ na kinetykę cyklu mostków poprzecznych regulując w ten sposób kurczliwość komór serca. dalsze życie [24, 35, 36]. U pacjentów z niektórymi Pomimo, że jedynie w N-końcowym odcinku obu wrodzonymi wadami serca takimi jak: czwórzespół lekkich łańcuchów występują wspólne sekwencje ami- Fallota; podzastawkowe zwężenie prawego ujścia tęt­ nokwasowe, to jednak i tu obserwuje się niewielkie niczego, czy też odejście obu dużych tętnic z prawej różnice (Ryc. 4). Należy zatem przypuszczać, że różnice komory serca (Tab. 1), proces ten przebiega odmiennie. w składzie aminokwasowym N-końcowych fragmen­ Tu bowiem związany z rozwojem zanik form przed­ tów lekkich łańcuchów istotnych miozyny komór sionkowych LC1 w komorach serca jest znacznie i przedsionków serca, są przyczyną odmiennych od­ spowolniony i u dorosłych pacjentów oprócz komoro- działywań tych łańcuchów z aktyną. Zatem funkcja wych form lekkich łańcuchów istotnych występują skurczowa mięśnia sercowego może być regulowana także formy przedsionkowe [35-37], których zawar­ w zależności od składu izoenzymów miozyny. tość nie przekracza jednak 30% całkowitej ilości Pewne badania sugerują też, że fosforylacja lekkich lekkich łańcuchów istotnych w miozynie komór serca. łańcuchów regulujących (LC2) katalizowana przez Spowolnienie procesu zaniku ekspresji przedsionko­ kinazę zależną od Ca2+ i kalmoduliny zwiększa zależ­ wych form łańcuchów istotnych miozyny w komorach ną od jonów wapnia siłę skurczu zarówno w mięśniach serc dotkniętych wrodzoną wadą, tłumaczy się ob­ szkieletowych jak i w mięśniu sercowym [41, 42]. Co ciążeniem wywołanym przez wysokie ciśnienie krwi prawda w omawianych wadach serca nie obserwowa­ spowodowane utrudnionym jej odpływem z prawej no żadnych różnic w ekspresji komorowych form komory serca, oraz rozwojem prawokomorowej hype- lekkich łańcuchów regulujących miozyny, a także rtrofii, która jest zjawiskiem wtórnym we wszystkich badana miozyna zawierała całkowicie zdefosforylowa- wyżej wymienionych wadach serca. Podobnie, u doro­ ne LC2, to nie można jednak wykluczyć, że również słych pacjentów z chorobą zastawek serca obserwuje zmiana wzoru izoform lekkich łańuchów regulujących się korelację, pomiędzy przeciążeniem serca przez miozyny związana jest z modyfikacją enzymatycznej podwyższone ciśnienie krwi, a ekspresją przedsion­ aktywności miozyny i szybkości kurczenia się włókien kowych form LC1 w lewej komorze serca. Normaliza­ serca. cja parametrów hemodynamicznych po operacyjnej Obserwowany we wrodzonych wadach serca wymianie zastawek istotnie redukuje hypertrofię i eks­ wzrost ekspresji przesionkowej formy łańcuchów istot­ presję ALC1 [38]. nych miozyny jest przejawem adaptacji mięśnia ser­ Badania proporcji lekkich łańcuchów istotnych cowego do jego zmienionych funkcjonalnych wyma­ (LC1) i łańcuchów regulujących (LC2) w miozynie serc gań. Zatem część regulatorowa główki miozyny ma pacjentów z wrodzonymi wadami nie wykazały różnic istotny wpływ na prawidłową funkcję skurczową serca. w porównaniu z miozyną pochodzącą z serc kontrol­ nych, co oznacza, że zwiększonej ekspresji form przed­ IV. „Ogłuszony” mięsień sercowy a zmiany sionkowych LC1 w komorach towarzyszy spadek w domenie regulatorowej główki miozyny ekspresji form komorowych lekkich łańcuchów istot­ nych [39]. W celu wyjaśnienia funkcjonalnych konsek­ Badania zjawiska „serca ogłuszonego”, definiowa­

124 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 nego jako odwracalne zaburzenie jego kurczliwości, tyna, co ma niewątpliwy wpływ na obserwowane które pojawia się, gdy następuje reperfuzja po krótkim w różnych chorobach serca zaburzenia jego funkcji okresie ischemii, wskazują, że także i w tym przypadku skurczowej. zmiany w aparacie kurczliwym mogą być przyczyną dysfunkcji mięśnia sercowego w nieobecności jakich­ Artykuł otrzymano 25 lutego 1997 r. kolwiek oznak nekrozy czy też poważnych zmian Zaakceptowano do druku 1 kwietnia 1997 r. ultrastrukturalnych [43, 44]. Utrzymujące się często przez kilka dni zaburzenie funkcji skurczowej serca Piśmiennictwo sugeruje, że procesy odbudowy jego upośledzonej 1. Harrington W F, Rodgers ME (1984) Annu Rev Bio­ czynności wiążą się z koniecznością naprawy uszko­ drem 53: 35-73 dzonego aparatu kurczliwego. Analiza składu biał­ 2. Weeds AG, Pope B (1971) N ature (Lond) 234: 85-88 3. Warrick HM, Spudich JA (1987) Annu Rev Cell Biol 3: kowego miofibryli uzyskanych z biopsji pobranych 379-421 z krótko niedokrwionych obszarów serca świni wyka­ 4. Rayment I, Rypniewski WR, Schmidt-Baase K, zała częściową degradację lekkich łańcuchów istot­ Smith R, Tomchick DR, Benning MM, Winkel- mann DA, Wesenberg G & Holden HM (1993) nych miozyny. W celu określenia jakie zmiany właś­ Science 261: 50-58 ciwości miozyny może pociągać za sobą obserwowana 5. Rayment 1, Holden HM (1994) TIBS 19: 129-134 częściowa degradacja tych białek badano właściwości 6. Collins JH (1976) Nature (Lond) 259: 699-700 7. Matsuda G (1983) Adv Biophys 16: 185-218 miozyny zawierającej skrócony działaniem papainy 8. Alexis NN, Gratzer WB (1978) Biochemistry 17: 2319- lekki łańcuch istotny. Okazało się, że skrócenie LC1 -2325 ma wyraźny wpływ na oddziaływanie miozyny z ak­ 9. Fisher AJ, Smith CA, Thoden J, Smith R, Sutoh K, Holden HM, Rayment I (1995) Biophys J 68: 19s-28s tyną. Miozyna taka wykazywała bowiem wzrost powi­ 10. Moczarska A, Kąkol I (1995) Blochem and Mol Biol nowactwa do aktyny. Stężenie aktyny potrzebne dla Intern 37: 765-772 uzyskania połowy maksymalnej aktywności Mg2 + 11. Abelman W H, Lorell BH (1989) J Am Coll Cardiol 13, 1219-1239 ATPazy, dla miozyny zawierającej skrócony łańcuch 12. Bender JR (1991) Circulation 83: 704-706 LC1 wynosiło 0.19 pM + 0.05 natomiast dla miozyny 13. O a k 1 y C M (1978) Postgrad Med J 54: 440 natywnej 0.35 pM + 0.04. Jednocześnie czułość na 14. SchierJJ, Adelstein RS (1982) J Clin Invest 69: 816-825 15. Hammond EH, Menlove RL, Anderson JL (1987) wapń miozyny ze skróconym LC1 była obniżona [10, Am H eart J 114: 1055-1065 21]. Można więc przypuszczać, że obserwowana pod­ 16. SchaperJ, Freole R, St Hein MD, Buck A, Has- czas niedokrwienia niewielka nawet degradacja lek­ hizume H, Speiser B, Briedl A, Bleese N (1991) Circulation 83: 504-514 kich łańcuchów istotnych pociąga za sobą zmiany 17. Pagani ED, Alousi AA, Grant AM, Older TM, w oddziaływaniu miozyny z aktyną, co wyjaśniałoby Dziuban S W J r, Allen PD (1988) Circ Res 63: 380-385 utrzymującą się przez kilka dni zmianę parametrów 18. Alousi AA, Grant AM, Et z er JR, Cofer BR, Van der Bel-Kahn J, Melvin D (1990) Mol Celi Blochem 96: skurczu obserwowaną w „ogłuszonym” mięśniu ser­ 79-88 cowym. 19. Silver MM, Silver MD (1983) W: MD Silver (red) Cardiovascular Pathology t 1. Churchill Livingstone Inc, New York, str. 492-498 V. Podsumowanie 20. Margossian SS, White HD, Caulfield J B, Nor­ ton O, Taylor S, Slayter HS (1992) Circulation 85: Na podstawie przedstawionych, niektórych tylko, 1720-1733 21. Moczarska A (1995) Praca doktorska wykonana w In­ wyników badań miozyny w różnych stanach patologi­ stytucie Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego, Warszawa cznych serca można sądzić, że obserwowane zaburze­ 22. Matsuda G, MaitaT &UmeganeT(1981) FEBS L ett nia jego funkcji skurczowej związane są ze zmianami 126: 111-113 23. NabeshimaY, Fuji-KuriyamaY, Muramatsu M, właściwości układu kurczliwego. Prowadzą one często Ogata K (1984) N ature (Lond) 308: 333-338 do nieodwracalnych zaburzeń pracy serca, ale mogą 24. Price KM, Litter W A, Cummins P (1980) Biochem też stanowić mechanizm obronny przystosowujący J 191: 571-580 25. Kurabayashi M, Komoro J, Tsuchimochi F, T a - przynajmniej na pewien okres czasu mięsień sercowy kaku F, Yazaki Y (1988) J Biol Chem 263: 13930-13936 do narzuconych mu przez chorobę nowych funk­ 26. Sutoh K (1982) Biochemistry 21: 3654-3661 cjonalnych wymagań. Naturalnie, omawiane zmiany 27. Trayer JP, Trayer HR, Levine BA (1987) Eur J Bio­ chem 164: 259-266 w układzie kurczliwym mogą być różne i dotyczyć nie 28. Greaser ML, Moss RL, Reiser PJ (1988)7 P hvsiol 406: tylko filamentu grubego. Wiele danych wskazuje bo­ 85-98 wiem, że częstą przyczyną zmienionych właściwości 29. Sweeney HL, Kushmeric MJ, Mabuchi K, Sreter F A, G e r g e 1 y J (1988) J Biol Chem 263: 9034-9039 kurczliwych serca prowadzącą niejednokrotnie do 30. Lowey S, Waller GS, Trybus KM (1993) J Biol Chem śmierci są także obok miozyny zaburzenia białek 268:20414-20418 regulujących np. a-tropomiozyny czy troponiny 31. Bottinelli R, Betto R, Schiaffino S, Reggiani C (1994) J Muscle Res Cell Motil 15: 413-419 T związanych z filamentem cienkim [45]. Omówione 32. Sweeney HL (1995) Biophys J 68: 112s-119s wyżej wyniki badań dotyczyły jednak tylko białka 33. Morano I, Ritter O, Bonz A, Timek T, V a h 1 ChF, filamentu grubego — miozyny. Wynika z nich, że Michel G (1995) Circ Res 76: 720-725 34. Swynghedauw B (1986) Physiol Rev 66: 710-771 [zmiany w domenie regulatorowej główki miozyny są 35. Auckland LM, Lambert Ś J & Cummins P (1986) [przyczyną zmienionych oddziaływań miozyna — ak­ Cardiovasc Res 20: 828-863

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 125 36. Cummins P & Lambert SJ (1986) Cire Res 58: 864-858 41. Morano I, H o f m a n n F,Zimmer M & Rüegg JC 37. Schaub MC, Tuchschmid CR, Srihari T&Hirzel (1986) FEBS L ett 189: 221-224 H O (1984) Eur Heart J 5: (suppl F) 85-93 42. Morano I, Bachle-StolzC, KatusH & Rüegg JC 38. Sütsch G, Brunner LIT, V o n Schulthess C, H i - (1988) Basic Res Cardiol 83: 350-359 rzel HO, Hess OM, Turina M, Krayemnbuchl 43. Kloner R A, De Boer LWV, Darsee JR, Ingwall HP & Schaub MC (1992) C ire Res 70: 1035-1043 J S, Haie S, TumasJ, Braunwald E (1981) Am J Physiol 39. Morano M, Zacharzowski U, Maier M, Lange 241: H591-H599 PE, Alexi-Meskishvili V, H aase H (1996) J Clin 44. Kloner RA, Ellis S G, Lange R, Braunwald Invest 98: 467-473 E (1983) Circulation 68 (suppl I) 1-8-1-15 40. Morano J, Hädicke K, Böhm M, Erdmann E (1993) 45. Yamauchi-Takihara K, Nakajima-Taniguchi J Mol Cell Cardiol 25 (II): 131 Abstract Ch, Matsui H, Fujio Y, Kunisada K, Nagata S, Kishimoto T (1996) H eart 76: 63-65

SPRAWOZDANIE z działalności Zarządu Głównego Polskiego Towarzystwa Biochemicznego w roku 1996

Działalność organizacyjna:

1. Skład osobowy Zarządu Głównego: Prezydium: Prezes — prof, dr hab. Liliana Konarska wiceprezes — doc. dr hab. Jolanta Barańska sekretarz — doc. dr hab. Małgorzata Balińska skarbnik — prof, dr hab. Zofia Porębska

Członkowie Prezydium Zarządu: prof, dr hab. Stanisław Bielecki prof, dr hab. Edward Bańkowski prof, dr hab. Roman Tarnawski

Członkowie Zarządu: prof, dr hab. Jan Głogowski prof, dr hab. Teresa Jakubowicz prof, dr hab. Aleksandra Kubicz doc. dr hab. Piotr Laidler prof, dr hab. Maciej J. Nałęcz prof, dr hab. Ryszard Oliński prof, dr hab. Jerzy Popinigis prof, dr hab. Tomasz Twardowski dr Teresa Wesołowska

Komisja Rewizyjna: prof, dr hab. Magdalena Fikus — Przewodnicząca prof. dr hab. Anna Brańczyk-Kuźma prof, dr hab. Maria Stryjecka-Zimmer

Zarząd Główny działa poprzez Oddziały Terenowe usytuowane:

w Gdańsku — przewodniczący dr M. Woźniak w Toruniu — przewodniczący dr A. Leźnicki w Krakowie — przewodniczący prof, dr hab. Z. Żak w Katowicach — przewodnicząca doc. dr hab. I. Żak w Lublinie — przewodnicząca dr M. Sanecka-Obacz w Łodzi — przewodnicząca prof, dr hab. W. Krajewska w Olsztynie — przewodniczący prof. dr hab. J. Głogowski we Wrocławiu — przewodnicząca prof. dr hab. M. Malicka-Błaszkiewicz w Warszawie — przewodnicząca prof. dr hab. B. Grzelakowska-Sztabert w Białymstoku — przewodniczący dr hab. J. Pałka w Poznaniu — przewodniczący prof, dr hab. W. Walerych w Szczecinie — przewodniczący dr T. Ogoński Kierownik Biura Zarządu Głównego — Weronika Kamińska

126 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 Zarząd Główny współpracując z Zarządami Oddziałów prowadził działalność statutową Towarzystwa poprzez Sekcje, Komisje i Zespoły powołane do zadań szczegółowych. Jak co roku odbyły się, zgodnie ze statutem, cztery plenarne posiedzenia Zarządu Głównego. Dyżury członków Prezydium odbywały się we wtorki w biurze Zarządu Głównego w małym budynku Instytutu Biologii Doświadczalnej, PAN im. M. Nenckiego, ul. Pasteura 3, pokój 633, telefon 658-20-99, fax 22-53-42, e-mail: [email protected].

Ważniejsze uchwały Zarządu Głównego:

1. Powołanie Sekcji Kwasów Nukleinowych, której przewodniczącym został prof, dr hab. Jan Barciszewski z Poznania. 2. Przeniesienie redakcji „Postępów Biochemii” do nowego lokalu, tj. p. 632 w małym budynku Instytutu Biologii Doświadczalnej, PAN im. M. Nenckiego, ul. Pasteura 3, telefon 659-85-71 wew. 441, fax 22-53-42, e-mail: [email protected]. 3. Decyzja nawiązania kontaktów naukowych z biochemikami lwowskich placówek naukowych, organizacja wspólnej polsko-ukraińskiej konferencji naukowo-wspomnieniowej poświęconej Jakubowi K. Parnasowi we Lwowie, wykonanie tablicy pamiątkowej ze składek biochemików polskich. W roku sprawozdawczym w poczet członków PTBioch przyjęto 57 osób, w tym 27 osób otrzymało status członka studenta. W grudniu 1996 r. liczba członków naszego Towarzystwa, płacących składki, wynosiła 1126 osób oraz 11 członków honorowych i 78 członków-emerytów zwolnionych z opłaty członkowskiej. 547 osób utraciło członkostwo w PTBioch. ze względu na wieloletnie zaległości w płaceniu składek.

Działalność organizacyjno-naukowa Towarzystwa a. Doroczny Zjazd Towarzystwa odbył się w Krakowie w dniach 17-20 września 1 996 r. z udziałem około 800 uczestników z kraju i z zagranicy. Szczegółowe sprawozdanie z obrad ukazało się w „Postępach Biochemii” nr 1, t. 43, 1997. b. Zarząd Główny zorganizował we Lwowie w dniach 8-11 września I Polsko-Ukraińską Konferencję Biochemiczną poświęconą pamięci prof. Jakuba Karola Parnasa, połączoną z wmurowaniem w budynku, w którym pracował J. K. Parnas, tablicy pamiątkowej ufundowanej ze składek polskiej społeczności biochemicznej. Obszerne sprawozdanie z tej Konferencji ukaże się w jednym z tegorocznych numerów „Postępów Biochemii” .

Działalność wydawnicza

1. Kwartalnik „ Postępy Biochemii" Wydano 4 zeszyty „Postępów Biochemii” z pomocą finansową Komitetu Badań Naukowych. Czasopismo drukuje artykuły przeglądowe z różnych działów biochemii i dziedzin pokrewnych i redagowane jest przez zespół: prof, dr Z. Zielińska (redaktor naczelny), prof. dr G. Palamarczyk, prof, dr A. Jerzmanowski, dr A. Szakiel. Drugi numer „Postępów Biochemii” dedykowany był prof, dr Zofii Zielińskiej, redaktorowi naczelnemu kwartalnika, z okazji 80-lecia urodzin. 2. Kwartalnik ..Acta Biochimica Polonica " Drukuje oryginalne prace doświadczalne w języku angielskim. Wydano 4 zeszyty, w tym numer pierwszy dedykowany prof. dr Davidowi Shugarowi z okazji 80-lecia urodzin. Pismo jest wydawane przez Polskie Towarzystwo Biochemiczne wspólnie z Komitetem Biochemii i Biofizyki PAN z pomocą finansową KBN i jest indeksowane w Biochemistry and Biophysics Citation Index, BIOSIS, Chemical Abstract, Excerpta Medica, Medline Current Contents. 3. Monografie Biochemiczne W roku 1996 wydano dwa kolejne tomy monografii: nr 40 p.t. „Włodzimierz Mozołowski 1895-1975 w 100-lecie urodzin” jest to praca zbiorowa pod redakcją prof. W. Makarewicza nr 41 p.t. „Hormony glikoproteinowe: struktura, biosynteza i funkcje ich oligosacharydów", autorzy Iwona Żak i Marian Drożdż, redaktor Liliana Konarska 4. „ Listy do członków PTBioch Biuletyn jest redagowany przez dr Teresę Wesołowską w Szczecinie. W roku sprawozdawczym ukazały się 4 listy.

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl 127 Nagrody Towarzystwa

1. Nagrodę im. J. K. Parnasa za najlepszą pracę doświadczalną wykonaną w Polsce przyznano Maciejowi Żyliczowi i Alicji Wawrzynów za pracę p.t. „Divergent effects of ATP on binding of the DnaK and DnaJ chaperones to each other, or to their various native and denaturated protein substrates” opublikowaną w J. Biol. Chem. 270 (33), 19300-19306, 1995. 2. Nagrodę im. B. Skarżyńskiego za najlepszy artykuł przeglądowy opublikowany w „ Postępach Biochemii" otrzymała Barbara Grzelakowska-Sztabert za pracę p.t. „Regulacja cyklu komórkowego — udział białkowych inhibitorów kinaz cyklino-zależnych” opublikowaną w numerze 2 (tom 41), 1995. 3. W pierwszej edycji konkursu im. A. Dmochowskiego za wybitne osiągnięcia dydaktyczne w dziedzinie biochemii nagrodę otrzymała Leokadia Kłyszejko-Stefanowicz za książkę p.t. „Cytobiochemia” wydaną w 1 995 roku przez PWN, a wyróżnienie Grzegorz Bartosz za książkę p.t. „Druga twarz tlenu” wydaną w 1995 roku przez PWN. 4. W konkursie na najlepszy wykład akademicki w roku 1 996 dwie równorzędne nagrody uzyskali: Zygmunt Pojda za wykład p.t. „Cytokiny w regulacji i odpowiedzi układu krwiotwórczego” i Hanna Czeczot za wykład p.t. „Biochem ia nasienia” . 5. Nagrodę im. W. Mozołowskiego za najlepszą pracę przedstawioną na dorocznym Zjeździe PTBioch przez młodego biochemika (do lat 30) otrzymała dr Ewa Missol za prezentację pracy p.t. „Wykorzystanie liposomów kationowych do wprowadzenia in vivo samobójczego genu dezaminazy cytozyny z E. c o li". Przyznano także dwa wyróżnienia: dr Alicji Węgrzyn za prezentację pracy p.t. „Mechanizm rozpadu kompleksu replikacyjnego bakteriofaga po szoku termicznym” oraz mgr Mariuszowi Więckowskiemu za prezentację pracy p.t. „Rola nośników mitochondrialnych w rozprzęgającym działaniu kwasów tłusz­ czowych” . 6. Nagrodę im. J. Opieńskiej-Blauth za najlepszą pracę studencką prezentowaną na dorocznym Zjeździe PTBioch. otrzymał Maciej Wiznerowicz za prezentację pracy p.t. „Konstrukcja dwucistronowych wektorów retrowirusowych dla celów terapii genowej nowotworów u ludzi” , a wyróżnienie Borys Wróbel za dwie prezentacje: „Amplifikacja plazmidów w komórkach E. coli w warunkach niedoboru aminokwasów” i „Degradacja DNA w podwyższonej temperaturze po amplifikacji plazmidów głodzonych komórkach E. c o li".

Staże naukowe

Zarząd Główny popiera krajowe i zagraniczne staże naukowe. W roku 1996 w stażach i kursach szkoleniowych oraz konferencjach organizowanych przez FEBS wzięło udział 12 osób.

Wszystkim, którzy w minionym roku 1996 poświęcili swój czas i energię włączając się w działalność Polskiego Towarzystwa Biochemicznego, składam serdeczne podziękowania.

Prezes Zarządu Głównego Liliana Konarska

Uprzejmie informujemy, że nasze pismo Acta Biochimica A cta Polonica jest indeksowane przez Biochemistry & Biophy­ sics Citation Index (ISI, U.S.A.), BIOSIS (U.S.A.), C hem i­ B iochimica cal Abstract (Columbus, U.S.A.), Current Awareness in P o lónica Biological Sciences (England), Excerpta Medica (Else­ vier, Holland), Medline (U.S.A.).

128 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 Zachęcamy do czytania i prenumerowania Acta Biochemica Polonica Prenumerata roczna wynosi: indywidualna 40 zł dla instytucji wynosi 80 zł

Vol. 44 No. 1/1997 Acta QUARTERLY PL ISSN0001-527X Biochim ica 31 11 13 Polonica

Plant biochemistry Reviews Nodulation genes in the R h izo b iu m — plant signal exchange Zbigniew Lorkiewicz 1 -1 2 Nuclear extrachromosomal DNA of higher plants Jerzy Buchowicz 13-20

Galactolipase and chilling sensitivity of plants Zbigniew Kaniuga 21-30

Regular papers Isolation and classification of a family of cyclin gene homologues in Lupinus luteus Joanna Deckert, Joanna Jeleńska, Żaneta 37-42 Zaborowska and Andrzej B. Legocki

UDP-glucose:solasodine glucosyltransferase from eggplant (Solatium melongena L.) leaves: Partial pu­ rification and characterization Cezary Pączkowski, Małgorzata Kalinowska and 43-54 Zdzisław AWojciechowski

Reversibility of the oleanolic acid monoglycosides transport across the tonoplast in vacuoles isolated from Calendula officinalis leaves Anna Szakiel and Wirginia Janiszowska 55-GO Purification and some properties of a novel dsRNA degrading nuclease bound to rye germ ribosomes Maria A. Siwecka G1-G8 Studies on the translation mechanism of subgenomic RNA of potato leafroll virus Marek Juszczuk, Włodzimierz Zagórski-Ostoja and GO-78 Danuta Maria Hulanicka

Short Autonomous replication of a wheat DNA sequence in communications isolated wheat nuclei Blanka Szurmak and Jerzy Buchowicz 70-82

The influence of polyamines on polymerase chain reaction (PCR) Paweł Fiedorow and Zofia Szweykowska-Kulińska 83-33

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl Enzyme kinetics Regular paper The enthalpimetric determination of inhibition con­ stants for the inhibition of urease by acetohydrox- amic acid Wiesława Zaborska, Maciej Leszko, Mirosława Kot «0-011 and Adam Juszkiewicz Clinical biochemistry

Regular papers Changes in red blood cell membrane structure in patients with chronic renal failure Krzysztof Gwoździński, Magdalena Janicka, 99-108 Joanna Brzeszczyńska and Marek Luciak Activity of cancer procoagulant (CP) in serum of patients with cancer of lung, breast, oesophagus and colorectum Monika Rucińska, Marian Furman, Zdzisław Skrzydlewski and Ewa Zaremba The activities and subcellular localization of cathep- sin B and cysteine proteinase inhibitors in human ovarian carcinoma Halina Haczyńska, Jerzy Gerber, Jerzy Osada and 113-120 Maria Warwas The application of a flow cytometric assay for evalu­ ation of phagocytosis of neutrophils Małgorzata Zielińska and Władysław Fenrych 121-126

Short Silybin and silydianin diminish the oxidative meta­ communication bolism of human polymorphonuclear neutrophils Ewa Ignatowicz, Hanna Szaefer, Małgorzata 127-130 Zielińska, Izabela Korczowska and Władysław Fenrych Oxidation states Regular papers Changes in ATP level and iron-induced ultra-weak photon emission in bull spermatozoa, caused by membrane peroxidation during thermal stress Maria Gumińska, Teresa Kędryna, Andrzej 131-13» Laszczka, Marek Godlewski, Janusz Sławiński, Barbara Szczęśniak-Fabiańczyk, Teresa Kwiecińska, Zenon Rajfur, Dorota Wierzuchowska Liver and serum antioxidant status after methanol intoxication in rats Elżbieta Skrzydlewska and Ryszard Farbiszewski 130-140

http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 Clinical biochemistry

Short Identification of a microsatellite region composed of communications a long homopurine/homopyrimidine tract sur* rounded by AT-rich sequences upstream of the rat stress-inducible hsp70.1 gene Katarzyna Lisowska, Tomasz Loch, Anna 147-152 Fiszer-Kierzkowska, Dorota Ścieglińska and Zdzisław Krawczyk

Characterization of the Escherichia coli gene encod­ ing a new member of the short-chain dehydro­ genase/reductase (SDR) family Agnieszka Sirko, Anna Węgleńska Monika 153-158 Hryniewicz and Danuta M. Hulanicka

Index of authors

Brzeszczyńska, J. 99 Jeleńska, J. 37 Siwecka, M.A. 61 Buchowicz , J. 13, 79 Juszczuk, M. 69 Skrzydlewska, E. 189

Deckert, J. 37 Juszkiewicz, A 89 Skrzydlewski, Z. 109 Farbiszewski, A. 189 Kalinowska, M. 43 Szaefer, H. 127 Fenrych, W. 127 Kaniuga, Z. 21 Szakiel, A. 55 Fenrych, Wł. 121 Korczowska,I. 127 Szweykowska-Kulińska, Z. 83 Fiedorów, P. 83 Kot, M. 89 Szczęśniak-Fabiańczyk, B. 131 Fiszer-Kierzkowska, A. 147 Krawczyk, Z. 147 Szurmak, B. 79 Furman, M. 109 Kwiecińska, T. 131 Ścieglińska, D. 147 Gerber, J. 113 Laszczka, A. 79 Kędryna, T. 153 Godlewski, M. 131 Legocki, A B. 37 Węgleńska, A. 153 Gumińska, M. 131 Leszko, M. 89 Warw as, M. 113 Gwoździński, K. 99 Lisowska, K. 147 Wierzuchowska, D. 131 Haczyńska, H. 113 Loch, T. 147 Wojciechowski, Z.A. 43

Hryniewicz, M. 153 Lorkiewicz, Z. 1 Zaborowska, Ż 37 Hulanicka, D.M. 69 Luciak, M. 99 Zaborska, W. 89 Hulanicka, D.M. 153 Osada, J. 113 Zagórski-Ostoja, Wł. 69 Ignatowicz, E. 127 Pączkowski, C. 43 Zaremba, E. 109 Janicka, M. 99 Rajfur, Z. 131 Zielińska, M. 121, 127 Janiszowska, W. 55 Rucińska, M. 109 Sławiński, J. 37 Sirko, A. 153

POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl i ewentualnie fax, adresy prywatne autorów, tytuł artykułu w języku polskim i angielskim oraz — w prawym dolnym rogu Wskazówki — liczbę tabel, rycin, wzorów i fotografii oraz skrót tytułu pracy dla autorów (do 25 znaków). Strona 1 (tytułow a zawiera imiona i nazwiska autorów, tytuł pracy w języku polskim i angielskim, rzeczowy spis treści też w obu językach, tytuł naukowy każdego z autorów i ich miejsce pracy z adresem pocztowym oraz wykaz stosowanych skrótów. Kolejno numerowane dalsze strony obejmują tekst pracy, piśmiennictwo, tabele, podpisy i objaśnienia rycin, wzorów i fotografii. Wydawany przez Polskie Towarzystwo Biochemiczne kwar­ talnik „Postępy Biochemii" publikuje prace przeglądowe oma­ wiające bieżące osiągnięcia, koncepcje i kierunki badawcze w dziedzinie biochemii i nauk pokrewnych; publikuje też noty PIŚMIENNICTWO: Wykaz piśmiennictwa obejmuje prace z historii biochemii, zasady polskiego słownictwa biochemi­ w kolejności ich cytowania w tekście, zaznacza się je liczbami cznego, recenzje nadesłanych książek oraz sprawozdania ze porządkowymi ujętymi w nawiasy kwadratowe, np. [3,7,9— 26]. zjazdów, konferencji i szkół, w których biorą udział członkowie Odnośniki bibliograficzne winny mieć nową uproszczoną formę. Towarzystwa. Sposób cytowania czasopism (1), monografii (2), rozdziałów Prace przeznaczone do publikacji w „Postępach Biochemii" z książek jednotomowych (3), rozdziałów z tomów serii opraco­ mogą mieć charakter artykułów monograficznych (do 20 stron wanej przez tych samych redaktorów (4), rozdziałów z tomów tekstu licząc piśmiennictwo i tabele), minireviews (do 10 stron serii opracowanych przez różnych redaktorów (5) wskazują tekstu), oraz krótkich not o najnowszych osiągnięciach i po­ poniżej podane przykłady: glądach (do 5 stron tekstu). 1. Hildenbrandt GR, Aronson NN (1980) Biochim Biophys Acta 6 3 1 : 499-502 Autorzy artykułu odpowiadają za prawidłowość i ścisłość poda­ 2. Bostock CJ, Sumner AT (1978) The Eukaryotic Chromo­ wanych informacji oraz poprawność cytowania piśmiennictwa. some, Elsevier, N o rth -Holand, Amsterdam Ujęcie prac winno być syntetyczne, a przedstawione zagadnienie 3. Norberth T, Piscator M (1979) W: Friberg L, Nordberg GF, zilustrowane za pomocą tabel, rycin, (wykresy, schematy, reak­ Von VB (red) Handbook on the Toxicology of Metals. cje), wzorów i fotografii. Elsevier, North-Holland, Amsterdam, str. 541-553 Wskazany jest podział artykułów monograficznych na rozdziały 4. Delej J, Kesters K (1975) W: Florkin M, Stotz EH (red) i podrozdziały, których rzeczowe tytuły tworzą spis treści. Zgod­ Comprehensive Biochemistry t 29B. Elsevier, North-Hol­ nie z przyjętą konwencją rozdziały noszą cyfry rzymskie, podroz­ land Amsterdam, str. 1 -77 działy odpowiednio rzymskie i arabskie np. 1-1, I-2, Poprawność 5. Franks NP, Lieb WR (1981) W: Knight CG (red) Research logiczna i stylistyczna tekstu warunkuje jego jednoznaczność Monographs in Cell and Tissue Physiology, t 7. Elsevier, i czytelność. Autorzy przeto winni unikać składni obcojęzycznej, North-Holland, Amsterdam, str. 243-272 gwary laboratoryjnej, a także ograniczać stosowanie doraźnie tworzonych skrótów, nawet jeżeli bywają używane w pracach specjalistycznych. Każda z nadesłanych do Redakcji prac podlega ILUSTRACJE: Ryciny winny być gotowe do reprodukcji. Foto­ ocenie specjalistów i opracowaniu redakcyjnemu. Redakcja grafie czarno-białe (kontrastowe), powinny być wykonane na zastrzega sobie możliwość skrócenia tekstu i wprowadzenie papierze matowym. Po porozumieniu z Redakcją można propo­ zmian nie wpływających na treść pracy, deklaruje też gotowość nować reprodukcję fotografii barwnych. Pozostałe ryciny należy konsultowania tekstu z Autorami. wykonać tuszem na białym papierze lub kalce technicznej. Wskazane jest, aby ryciny były dwukrotnie większe od przyszłej reprodukcji, tj. w skali 2:1. Cyfry i litery służące do opisu rysunku Przekazanie artykułu do redakcji jest równoznaczne z oświad­ pow inny mieć wysokość nie mniejszą niż 5 mm. Na rysunkach nie czeniem, że nadesłana praca nie była i nie będzie publikowana należy umieszczać opisów słownych, lecz posługiwać się skróta­ w innym czasopiśmie, jeżeli zostanie ogłoszona w „Postępach mi. Osie wykresów winny być opatrzone napisem łatwo zro­ Biochemii". W przypadku, gdy Autor(zy) zamierza(ją) włączyć zumiałym. Decyzję o stopniu zmniejszenia ryciny podejmuje do swego artykułu ilustracje publikowane przez autorów prac wydawca. Ilustracji nie należy włączać w tekst maszynopisu, lecz cytowanych, należy uzyskać i przekazać nam odpowiednią zgodę odpowiednio ponumerować: tabele i ryciny noszą cyfry arabskie, na przedruk. wzory zaś rzymskie. Na marginesie tekstu należy zaznaczyć ołówkiem preferowane miejsce umieszczenia tabeli, ryciny czy wzoru. Tabele odpowiednio porubrykowane, winny być opat­ rzone jednoznacznym tytułem i ewentualnie także niezbędnymi objaśnieniami. Słowne objaśnienia znaków graficznych można Redakcja prosi Autorów o przestrzeganie następujących umieścić w podpisie pod ryciną, rysunkowe zaś jedynie na wskazówek szczegółowych: planszy ryciny. Tytuły i objaśnienia rycin sporządza się w postaci oddzielnego wykazu. Ilustracje należy podpisać nazwiskiem pierwszego z autorów i pierwszym słowem tytułu pracy oraz TEKST: Maszynopis powinien być napisany jednostronnie oznaczyć „góra-dół" (ołówkiem, na odwrocie). Ze względu na czcionką wielkości standartowej, z podwójną interlinią, z lewym wewnętrzną spoistość artykułu wskazane jest konstruowanie marginesem ok. 4 cm. oryginalnych rycin i zbiorczych tabel na podstawie danych W tekście nie należy stosować żadnych podkreśleń, ani roz­ z piśmiennictwa. strzelonego druku. Ewentualne sugestie co do charakteru czcion­ ki drukarskiej mogą Autorzy zaznaczyć ołówkiem na marginesach maszynopisu. W przypadku stosowania w tekście liter alfabetu Maszynopis i załączniki (w dwu egzemplarzach), właściwie greckiego trzeba na marginesie wpisać ołówkiem ich fonetyczne zabezpieczone przed uszkodzeniem w czasie transportu, należy brzmienie. przesłać na adres:

Strona informacyjna maszynopisu jest nienumerowana, za­ Redakcja kwartalnika „Postępy Biochemii" wiera imiona i nazwisko (a) autora (ów), nazwy, adresy wraz Polskie Towarzystwo Biochemiczne z numerem telefonu zakładów (w języku polskim i angielskim), ul. Pasteura 3, w których pracują autorzy, adres do korespondencji, nr telefonu 02-093 Warszawa

132 http://rcin.org.pl POSTĘPY BIOCHEMII 43(2), 1997 http://rcin.org.pl http://rcin.org.pl