UM VIRAR DE PÁGINA NA HISTÓRIA DAS ÁGUAS MINERAIS NATURAIS... UM NOVO CAPÍTULO SE ESCREVE: O CÓDIGO HIDROBIÓMICO DAS ÁGUAS.
Paula Sá Pereira
1º estudo científico com significado histórico - 1726 pelo doutor Francisco da Fonseca Henriques - “Aquilégio Medicinal” - levantamento das “caldas com virtudes medicinais, dignas de “particular memória”..
Francisco Tavares (1750-1812), professor da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra, responsável pela primeira Farmacopeia oficial portuguesa, mas também pelo estudo dedicado à Hidrologia Médica. Em 1791 publica a obra “Advertências sobre os abusos, e legítimo uso das águas minerais das Caldas da Rainha” Historia das águas minerais naturais
António Herculano de Carvalho Charles Lepierre (1899 – 1986) (1867-1945)
…“No momento da infiltração no subsolo, tem início um processo lento e complexo de filtração natural que se encarregará de eliminar os microorganismos e as substâncias em suspensão”… (cit. Livro Branco, 2017) Microbiologia da água ≈ Qualidade da água …….microbismo normal
Portaria 1220/2000 de 29 de Dezembro ? Decreto-Lei n.º 156/98 Artigo 4.º Características microbiológicas 1 - À saída da captação, o teor total de microrganismos susceptíveis de se desenvolverem nas águas minerais naturais deve corresponder ao seu microbismo normal e revelar uma protecção eficaz da captação contra qualquer contaminação. 3 - Na captação os teores totais em microrganismos não devem ultrapassar, respectivamente, 20 por mililitro a 20ºC-22ºC às setenta e duas horas e 5 por mililitro a 37ºC às vinte e quatro horas. 5 - Quer na captação quer na comercialização, as águas minerais naturais devem apresentar-se isentas de: a) Parasitas e microrganismos patogénicos; b) Escherichia coli e outros coliformes e de estreptococos fecais, em 250 ml de amostra analisada; c) Anaeróbios esporolados sulfito-redutores, em 50 ml de amostra examinada; d) Pseudomonas aeruginosa, em 250 ml de amostra examinada. Estudo do Microbismo Natural das Águas Minerais Naturais
Contrato Nº 2017/ SGME/0118
Paula Sá Pereira Coordenadora Científica Objetivos gerais do estudo 2017 a 2019 (26 meses) 80 AMN - 1 amostragem no inicio do ano hidrológico e 1 amostragem no fim do ano hidrológico, 2 anos, para validação dos resultados
Estudo edafo-climático da envolvente associada a cada captação – transferência dos dados para Sistema de Informação Geográfica – Delimitação dos perímetros de proteção das captações – Zonas de risco
Caracterização do microbioma associado a cada água mineral natural em estudo
Estudo do metatranscriptoma de algumas águas minerais naturais • ISO 9308-1:2014 e Amd 2016 para a análise das bactérias coliformes e Escherichia coli; • ISO 7899-2:2000 para a análise de Enterococos; • ISO 16266:2006 para a análise de Pseudomonas aeruginosa; • NP EN 26461-2:1994 (versão portuguesa da norma ISO 6461-2:1986) para a análise de anaeróbios esporulados sulfito-redutores)
Verificação de todos os isolados por métodos de biologia molecular
Foi avaliado o de cada água mineral natural, cultiváveis em laboratório de acordo com os métodos de referência, e em condições experimentais.
• ISO 6222:1999 - contagem do número de colónias de microrganismos viáveis – número de colónias a 22 e a 37°C.
Em todas as condições, e em todas as amostras conforme, nas 4 fases de colheita, que cumpriram a legislação, foi feito o isolamento, caracterização microbiológica e identificação de microrganismos cultiváveis em laboratório. A validação final foi efectuada por sequenciação de Sanger
Sequenciação de Nova Geração Preparação de bibliotecas
Produção de clusters
Sequenciação Illumina Caracterização das comunidades bacterianas de águas minerais naturais de acordo com o quimismo Gammaproteobacteria Fusobacteria Clostridia Dehalococcoidetes 33 Deltaproteobacteria Chthonomonadetes 30 Betaproteobacteria Aquificae 27 Alphaproteobacteria 24 Methanomicrobia 21 Actinobacteria 18 Brocadiae 15 Nitrospira 12 Oscillatoriophycideae 9 Bacili 6 Nostocophycideae 3 Epsilonproteobacteria 0 Thermobacula Deinococci
Opitutae Anaerolineae
Thermodesulfobacteria Flavobacteria
Planctomycetia Sphingobacteriia Acidobacteria Thermotogae Ignavibacteria Methylacidiphilae UnclassifiedBacteroidia MollicutesSpirochaetes Gammaproteobacteria Spartobacteria 10 Clostridia Solibacteres 9 Deltaproteobacteria 8 Fimbriimonadetes 7 Betaproteobacteria 6 Caldithrixae 5 Alphaproteobacteria 4 3 Holophagae 2 Actinobacteria 1 0 Thermobacula Bacili
Planctomycetia Sphingobacteriia
Epsilonproteobacteria Nitrospira
Pedosphaerae Spirochaetes Acidobacteria Unclassified Thermotogae Ktedonobacteria Clostridia Synergistia 14 Deltaproteobacteria 13 Synechococcophycideae 12 Betaproteobacteria 11 Nitriliruptoria 10 Alphaproteobacteria 9 8 Brachyspirae 7 Nitrospira 6 5 4 Ignavibacteria 3 Gammaproteobacteria 2 1 0 Holophagae Actinobacteria
Thermotogae Bacili
Thermoleophilia Sphingobacteriia
Brocadiae Thermodesulfobacteria Mollicutes Deinococci Planctomycetia Unclassified Gammaproteobacteria Acidimicrobiia 10 Clostridia Brachyspirae 9 Betaproteobacteria 8 Aquificae 7 Alphaproteobacteria 6 5 Caldithrixae 4 Deltaproteobacteria 3 2 Holophagae Actinobacteria 1 0 Thermobacula Nitrospira
Ktedonobacteria Bacili
Thermotogae Deinococci
Methanomicrobia Spirochaetes Mollicutes Unclassified Epsilonproteobacteria Gammaproteobacteria Chlorobia 3 Clostridia
Brocadiae 2 Deltaproteobacteria
Ignavibacteria 1 Alphaproteobacteria
0 Deinococci Actinobacteria
Planctomycetia Nitrospira
Thermotogae Unclassified
Bacili Betaproteobacteria Conclusões As Betaproteobacteria são a classe que predomina em todas as famílias químicas de águas minerais naturais estudadas, à exceção das águas cloretadas
Nas águas sulfúreas são encontra-se ainda bem representadas as Gammaproteobacteria
Nas águas hipossalinas, encontram-se as classes Alphaproteobacteria, Clostridia e Actinobacteria como predominantes
Nas águas bicarbonadatas as Alphaproteobacteria são igualmente dominantes, assim como a Clostridia e Nitrospira
Nas águas gasocarbónicas encontra-se igualmente em maioria as Gammaproteobacteria e as Deltaproteobacteria
Nas águas cloretadas as Alphaproteobacteria são dominantes seguidas das Deltaproteobacteria, Nitrospira, Actinobacteria, Gammaproteobacteria e Clostridia. Diversidade de géneros e espécies de bactérias mais significativas nas águas minerais naturais estudadas (> 1000 Hits)
Nº de Aguas n=10 Nº de Aguas n=4 Nº de Aguas n=10 Nº de Aguas n=35 Nº de Aguas n=14 águas Gasocarbónicas >1000 Hits águas Cloretadas >1000 Hits águas Hipossalinas >1000 Hits águas Sulfúreas >1000 Hits águas Bicarbonatadas >1000 Hits (%) (%) (%) (%) (%)
Methylobacterium Thermodesulfovibrio Thermodesulfovibrio Rhodoferax 4 40 3 75 Methylobacterium 7 70 13 37,1 7 50 radiotolerans aggregans aggregans Thermodesulfovibrio Rhodoferax antarcticus 4 40 Desulfosarcina ovata 2 50 Oxalobacter vibrioformis 5 50 Thiovirga sulfuroxydans 13 37,1 6 42,9 thiophilus Methyloversatilis Acidovorax temperans 3 30 Methylobacterium 2 50 Azospirillum 4 40 10 28,6 Methyloversatilis universalis 5 35,7 universalis Methylobacterium Gallionella 3 30 Pseudomonas 2 50 4 40 Thiofaba 10 28,6 Azoarcus 3 21,4 mesophilicum Methylobacterium Nitrosovibrio 3 30 Pseudomonas plecoglossicida 2 50 4 40 Sulfuritalea 9 25,7 Chondromyces pediculatus 3 21,4 radiotolerans Thermodesulfovibrio Rhodoferax ferrireducens 3 30 2 50 Moorella glycerini 4 40 Sulfuricurvum kujiense 8 22,9 Dechloromonas 3 21,4 aggregans Thermodesulfovibrio Thermodesulfovibrio 3 30 2 50 Gallionella 3 30 Thiovirga 7 20 Dechloromonas hortensis 3 21,4 aggregans thiophilus Denitratisoma Burkholderia ubonensis 2 20 Acinetobacter oleivorans 1 25 Paucibacter 3 30 6 17,1 Oxalobacter vibrioformis 3 21,4 oestradiolicum Giesbergeria 2 20 Anaerospora 1 25 Pseudomonas 3 30 Sulfurospirillum 6 17,1 Sphingobium amiense 3 21,4 Methyloversatilis Thermodesulfovibrio 2 20 Aquabacterium 1 25 3 30 Thiobacillus 6 17,1 Sphingomonas panni 3 21,4 universalis thiophilus Propionivibrio Thermodesulfatator 2 20 Azoarcus evansii 1 25 Bradyrhizobium 2 20 Thiothrix 6 17,1 3 21,4 dicarboxylicus atlanticus Ectothiorhodospira Schlegelella aquatica 2 20 Azospira restricta 1 25 Burkholderia 2 20 5 14,3 Zoogloea resiniphila 3 21,4 imhoffii Thermodesulfovibrio Sulfuricurvum kujiense 2 20 Azovibrio 1 25 Burkholderia bryophila 2 20 5 14,3 Candidatus Scalindua brodae 2 14,3 thiophilus Candidatus Tammella Sulfurospirillum 2 20 Bifidobacterium bombi 1 25 2 20 Thermus 5 14,3 Chromatium weissei 2 14,3 caduceiae Uliginosibacterium 2 20 Blautia coccoides 1 25 Chondromyces pediculatus 2 20 Thiomonas intermedia 5 14,3 Desulfobulbus elongatus 2 14,3 gangwonense Zoogloea oryzae 2 20 Chlorobaculum limnaeum 1 25 Cupriavidus basilensis 2 20 Acinetobacter johnsonii 4 11,4 Gallionella 2 14,3 Acinetobacter Methylobacterium Bifidobacterium bombi 1 10 Chondromycespediculatus 1 25 Gallionella ferruginea 2 20 4 11,4 2 14,3 tjernbergiae mesophilicum Methylobacterium Brachyspira ibaraki 1 10 Clostridium 1 25 Haliangium 2 20 Desulfomonile tiedjei 4 11,4 2 14,3 radiotolerans CONSOLIDAÇÃO DE HIDROGENOMAS Estabilidade nos índices de diversidade de microrganismos e estrutura das populações nas amostras estudadas – F1, F3, F75, F7
Famílias Químicas % Consolidação Sulfúreas 80 Hipossalinas 0,1 Bicarbonatadas 85,7 Gasocarbónicas 70 Cloretadas 100 Fatores que, putativamente, possam ter influenciado não consolidação dos hidrogenomas, a variação na diversidade de microrganismos e estrutura das populações nas amostras, além de outros são:
Condições climatéricas que ocorreram imediatamente antes e durante o período de recolha. Fenómenos extremos perturbadores, como os incêndios florestais Variações de caudal em cada amostragem Intervenções nos furos e/ou sistemas de adução da água entre amostragens
Alterações estruturais
Outros fatores não tangíveis
Identificação de espécies exclusivas nas águas em que, em simultâneo, apresentam os hidrogenomas consolidados, ou seja, sem variação significativa da diversidade genética entre amostragens
Concessão Género Espécie
9 Desulfotomaculum luciae 9 Dictyoglomus thermophilum 25 Deinococcus geothermalis 30 Leucobacter luti 34 Desulfovibrio marinisediminis 46 Mycoplasma sualvi 47 Clostridium cellulolyticum Concessão Género Espécie
58B Azospirillum melinis 58B Tenacibaculum skagerrakense 65 Hymenobacter actinosclerus 65 Desulfovibrio aespoeensis 65 Cellulomonas denverensis 65 Leucobacter iarius 65 Thalassospira profundimaris 65 Sagittula stellata
Algumas das spécies representativas, identificadas por metagenómica, em cada AMN, apresentam caracteristicas funcionais* que se podem correlacionar, putativamente, com as características físico- químicas e indicações terapeuticas.
Atividade metabólica/Bioatividade Água Mineral Espécie
Aeróbios estritos, mesofilo com crescimento a pH neutro, 4 Nevskia soli metaboliza o glicogénio Bactéria termotolerante fototrópica, evidenciando a habilidade 4 Rhodoplanes cryptolactis de produção de carotenoides 5, 28 Bactérias não sulfurosas, levemente psicrofílicas, crescendo Rhodoferax antarcticus otimamente a 15-18 °C, contêm bacterioclorofila 9,33 Thermus scotoductus Termofílica produtora de pigmentos 16, 20, 56 Oxalobacter vibrioformis bactérias anaeróbias que fermentam oxalato (litiase enzimática) anaeróbios termofílicos extremos - quebra de pontes 18, 32 Fervidobacterium islandicum dissulfureto também são responsáveis pela completa degradação da queratina das penas. (doenças da pele)
*As matrizes sobre as quais foram estudadas estas espécies não são AMN, pelo que este estudo é apenas indicativo. Atividade metabólica/Bioatividade Água Mineral Espécie
atividade enzimática - fosfatase alcalina, gelatinase, 22 Actinoallomurus luridus pirazinamidase (doenças da pele)
4 Bactéria termotolerante fototrópica, evidenciando a habilidade Rhodoplanes cryptolactis de produção de carotenoides produz violaceína, um composto com propriedades antibióticas 24 Janthinobacterium lividum e antivirais que é tóxico para células eucarióticas 25, 58B Chondromyces pediculatus Myxobacterium - produção de Ciclopéptidos Antifúngicos termofílica, estritamente anaeróbica, quimiorganotrófica - 60ºC, 25 Caldithrix palaeochoryensis pH 7, cresce em biofilme, capacidade de degradar substratos proteicos 27 Brevundimonas olei Controle biológico de Fusarium Atividade metabólica/Bioatividade Água Mineral Espécie
efeitos inibitórios sobre o vírus do mosaico do tabaco (TMV) 35, 37 Acinetobacter antiviralis Q / 9 como principal quinona respiratória.
Betaproteobactéria desnitrificante, degrada 17-beta-estradiol 35 Denitratisoma oestradiolicum (atividade estrogenica) anaeróbio formador de esporos que produz ácido propiónico 35, 36 Propionispora hippei (atividade anti-inflamatória e analgésica) Usado como um concentrador ou biopurificante de substancias 36, 40 Ralstonia detusculanense radioativas (destoxificante) bactéria anaeróbia, moderadamente termofílica, sintrófica, 37 Tepidanaerobacter syntrophicus degradadora de álcool e lactato (doenças musculo-esqueléticas) Caldanaerobacter 41 Produtora de glicosil hidrolases (doenças da pele) hydrothermalis Atividade metabólica/Bioatividade Água Mineral Espécie
produz violaceína, um composto com propriedades antibióticas 43 Janthinobacterium lividum e antivirais que é tóxico para células eucarióticas
43 Tepidimonas taiwanensis bactéria produtora de protease alcalina
47, 62, 65 Sphingomonas pseudosanguinis Produz predominantemente ubiquinona Q-10 produzindo moléculas ativas e superficiais conhecidas como bioemulsificantes 59 Acinetobacter bouvetii biorremediação de solo e água contaminados com hidrocarbonetos. 59, 71 Pseudomonas parafulva Produz o ácido antibiótico fenazina-1-carboxílico - antagonista espécies pectinolíticas, tem uma ampla gama de hospedeiros 59 Pseudomonas viridiflava entre plantas Atividade metabólica/Bioatividade Água Mineral Espécie
Algumas estirpes de V. paradoxus são litoautotróficas facultativas, outras são quimiorganotróficas. Muitos deles estão 63 Variovorax paradoxus associados a importantes processos catabólicos, incluindo a degradação de compostos químicos tóxicos e / ou complexos bactéria halófila, quitinolítica Gram-negativa. Estritamente 68 Halanaerobacter chitinivorans anaeróbico. Quimio-organotrófico
PP31 Burkholderia ubonensis Atividade antagonista Produção de um polissacarídeo polar, o "holdfast", um adesivo PP33 Caulobacter crescentus biológico
O metatranscriptoma de cada uma das AMN poderá ajudar a construir um catálogo de funcionalidades putativas das águas através do conhecimento das mensagens transcritas do mRNA extraído, por associação à funções anotadas de cada transcrito.
Apenas a farmacogenómica poderá conduzir a resultados que permitam elencar algumas das propriedades terapêuticas das águas. Sendo a água um fármaco com indicações terapêuticas, terá se ser estudada a variação genética entre diferentes indivíduos e suas respostas a ação de cada AMN. Obrigada pela vossa atenção