UNIVERZA V MARIBORU

FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE

UPORABA MOLEKULSKIH MARKERJEV PRI DOLOČEVANJU KULTIVARJEV IN SLEDENJU HIPOTETIČNIH STARODAVNIH GENOTIPOV MALIN

DOKTORSKA DISERTACIJA

MOLECULAR MARKERS USED FOR DETERMINATION OF RED RASPBERRY CULTIVARS AND TRACING HYPOTHETICAL MEDIEVAL GENOTYPES

Ph. D. THESIS

Maribor, 2015 Vesna NOVAK POPRAVKI:

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. II Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Doktorska disertacija je bila opravljena v okviru podiplomskega študija Kmetijstva na Fakulteti za kmetijstvo in biosistemske vede Univerze v Mariboru.

Senat Univerze v Mariboru je na 32. redni seji, dne 17. 6. 2014, potrdil temo doktorske disertacije. Za mentorja je imenoval izr. prof. dr. Metko ŠIŠKO, za somentorja pa doc. dr. Andreja ŠUŠKA.

Komisija za zagovor in oceno doktorske disertacije:

Mentor: izr. prof. dr. Metka ŠIŠKO

Somentor: doc. dr. Andrej ŠUŠEK

Član: red. prof. dr. Anton IVANČIČ

Član: izr. prof. dr. Zlata LUTHAR

Lektorica: Tina Polajžer, prof.

Datum zagovora: 28.1. 2015

Vesna NOVAK Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. III Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju hipotetičnih starodavnih genotipov malin

UDK: 631.524.01:631.526:575:643.711(054.3) =163.6

Naša raziskava je imela dva dela. V 1. delu smo proučevali genetske odnose med malinjaki (Rubus idaeus L.), zbranimi okoli nekaterih karakterističnih srednjeveških gradov, kartuzijanskih samostanov in v bližnjih vaseh. V 2.delu smo enako raziskavo opravili s sedmimi novejšimi kultiviranimi sortami, ki izvirajo iz Bolgarije, Francije, Slovenije in Švice, in z metodo s prstnimi odtisi s pomočjo mikrosatelitskih markerjev identificirali sorte. Predvidevali smo, da bi genotipe hipotetičnih srednjeveških malinjakov lahko zasledili ob ostankih srednjeveških naselij. Ti genotipi so preživeli v naravnih razmerah brez generativnega razmnoževanja vsaj 3 stoletja. Analiza je temeljila na mikrosatelitskih markerjih. Identificirali smo 155 alelov, povezanih z 18 mikrosatelitskimi lokusi. Dendrogram je razvrstil analizirane genotipe iz 1. dela raziskave v 7 glavnih skupin. Analize so pokazale, da sta bila najverjetnejša srednjeveška genotipa zbrana blizu 2 kartuzijanskih samostanov: Žiče in Jurklošter. Morfološko sta si bila podobna, primitivne in bujne rasti, vendar ne povsem divja genotipa. Iz podatkov, ki bazirajo na velikosti alelov, smo izbrali specifične mikrosatelitske lokuse (6 ali 7 izbranih lokusov), za vsako od 7-ih proučevanih sort. S kombinacijo uporabljenih mikrosatelitskih lokusov, smo dobili sortno specifičen »prstni odtis« za posamezne sorte, ki je omogočil njihovo identifikacijo.

Ključne besede: identifikacija sort, molekulski markerji, mikrosateliti, rdeči malinjak, Rubus idaeus,

hipotetski srednjeveški genotipi

Delo vključuje: 120 strani, 15 preglednic, 40 slik, 135 virov literature Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. IV Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

KEY WORDS DOCUMENTATION

Molecular markers used for determination of red raspberry cultivars and tracing hypothetical medieval genotypes

UDK: 631.524.01:631.526:575:643.711(054.3) =163.6

Our investigation was based on a molecular study of genetic relationships amongst red raspberry (Rubus idaeus L.) genotypes collected around selected medieval castles, Carthusian monasteries and nearby villages. We assumed that the hypothetical medieval raspberry genotypes could be traced to isolated medieval settlements that used to be highly prosperous during the feudal era but were later abandoned. These genotypes survived in natural conditions without seed multiplication for at least three centuries. The molecular genetic analysis was based on micro-satellite data. We detected a total of 155 alleles on 18 microsatellite loci. The clustering method grouped the analysed genotypes into seven main clusters. The analyses indicated that the most probable medieval genotypes had been collected close to two Carthusian monasteries: Zice and Jurkloster. They were morphologically similar, vigorous, and primitive but obviously not wild genotypes. In the second part of our investigation, the molecular approach based on microsatellite data was used for the identification of seven selected raspberry varieties from different countries (Bulgaria, France, Slovenia and Switzerland). From the completed data (allele sizes) obtained with 19 optimized SSR primers, we selected the most specific microsatellite loci for each of the seven cultivars. For the identification of individual cultivars, we used six or seven selected microsatellite loci in order to obtain a variety specific fingerprint for each cultivar.

Key words: cultivar identification, hypothetical medieval cultivars, microsatellites, molecular markers, red

raspberry, Rubus idaeus

The thesis includes: 120 pages, 15 tables, 40 figures, 135 references

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. V Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

KAZALO VSEBINE

1 UVOD ...... 1

1.1 Pomembnost in proizvodnja malin ...... 1

1.2 Genetski vidiki ...... 2

1.3 Namen doktorske disertacije ...... 4

2 PREGLED OBJAV ...... 6

2.1 Sistematika in filogeneza ...... 6

2.1.1 Botanična klasifikacija malinjakov ...... 6

2.2 Ekologija in biologija rdečega malinjaka ...... 16

2.2.1 Razširjenost ...... 16

2.2.2 Morfološke lastnosti ...... 17

2.3 Rast in razvoj rdečega malinjaka...... 20

2.3.1 Rast ...... 20

2.3.2 Okoljske zahteve...... 22

2.4 Razmnoževanje ...... 23

2.4.1 Generativno razmnoževanje ...... 23

2.4.2 Vegetativno razmnoževanje ...... 24

2.5 Ekonomska pomebnost malinjakov ...... 25

2.5.1 Zgodovina in izvor malinjakov ...... 25

2.5.2 Uporabnost malinjakov ...... 25

2.5.1.1 Pomembna sadna vrsta ...... 25

2.5.1.2 Prehrambene značilnosti malin ...... 26

2.5.3 Proizvodnja ...... 28

2.6 Registracija in zaščita sort ...... 29 Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. VI Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

2.7 Vrednotenje genetske variabilnosti ...... 30

2.7.1 Uporaba fenotipskih markerjev ...... 30

2.7.2 Uporaba molekulskih markerjev ...... 31

2.7.3 Mikrosateliti ...... 33

2.8 Vrednotenje genetske variabilnosti z mikrosatelitnimi markerji ...... 38

2.9 Postopek določevanja genetske variabilnosti z mikrosateliti ...... 39

2.9.1 Izolacija DNA ...... 39

2.9.2 Verižna reakcija s polimerazo (PCR) ...... 41

2.9.3 Elektroforeza mikrosatelitskih markerjev ...... 43

2.9.3.1 Agarozna elektroforeza...... 43

2.9.3.2 Kapilarna elektroforeza ...... 44

3 MATERIAL IN METODE DELA ...... 45

3.1 Material ...... 45

3.1.1 Rastlinski material ...... 45

3.1.1.1 Novejše kultivirane in lokalne sorte ...... 45

3.1.1.1.1 Osnovni podatki o nekaterih proučevanih kultiviranih sortah ...... 48

3.1.1.2 Pol-divji, divji in primitivni genotipi ...... 52

3.1.1.3 Opis lokacij ...... 58

3.1.2 Laboratorijska oprema ...... 61

3.2 Metode dela ...... 62

3.2.1 Izolacija DNA ...... 62

3.2.2 Merjenje koncentracije DNA...... 63

3.2.3 Agarozna elektroforeza...... 63

3.2.4 Mikrosatelitski markerji ...... 65

3.2.5 Kombinacije začetnih oligonukleotidov za starodavne malinjake ...... 67 Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. VII Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

3.2.6 Kombinacije začetnih oligonukleotidov za določanje sort ...... 68

3.2.7 Verižna reakcija s polimerazo (PCR) in optimizacija protokola namnoževanja 70

3.2.7.1 Optimizacija začetnih oligonukleotidov ...... 72

3.2.7.1.1 Gradientna optimizacija ...... 72

3.2.7.1.2 Optimizacija števila ciklov...... 73

3.2.8 Določanje velikosti alelov s kapilarno elektroforezo ...... 74

3.2.9 Statistična obdelava podatkov ...... 76

3.2.9.1 Vrednotenje polimorfizma in genetske sorodnosti ...... 76

4 REZULTATI Z RAZPRAVO ...... 78

4.1 Sledenje starodavnim genotipom ...... 78

4.1.1 Izolacija DNA ...... 78

4.1.2 Koncentracije izolirane DNA ...... 79

4.1.3 Namnoževanje mikrosatelitskih lokusov ...... 79

4.1.4 Določanje velikosti alelov ...... 80

4.1.5 Vrednotenje polimorfizma ...... 87

4.1.6 Vrednotenje genetske sorodnosti starodavnih malinjakov ...... 90

4.2 Uporaba mikrosatelitskih markerjev za identifikacijo sort ...... 93

5 SKLEPI ...... 101 6 POVZETEK ...... 103

6.1 Povzetek ...... 103

6.2 Summary ...... 105

7 VIRI ...... 107 8 ZAHVALA ...... 120 9 PRILOGE ...... 121

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. VIII Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Sistematični prikaz klasifikacije rdečega malinjaka (Rubus idaeus L.) . .... 6

Preglednica 2: Podrodovi in pomembnejše vrste rodu Rubus ter značilnosti

pomembnejših podrodov ali vrst ...... 7

Preglednica 3: Pomembnejše sorte rdečega malinjaka, razvrščene po rodnosti,

začenši z najbolj produktivno ...... 21

Preglednica 4: Proizvodnja malin v svetu v letu 2012 (Factfish Raspberries 2013)...... 29

Preglednica 5: Kultivirane sorte malinjakov, vključene v molekulske analize in njihov

izvor...... 46

Preglednica 6: Pol-divji, divji in primitivni genotipi malinjakov, njihov izvor, lokacija,

mikrolokacija ter opis vključeni v molekulske analize...... 53

Preglednica 7: Lokacije vzorčenja na osnovi zemljevida (Slika 20) ...... 59

Preglednica 8: 19 SSR začetnih oligonukleotidov uporabljenih v molekulskih analizah. 66

Preglednica 9: Osnovne kombinacije začetnih oligonukleotidov...... 68

Preglednica 10: Kombinacije začetnih oligonukleotidov za določevanje posameznih sort.69

Preglednica 11: Pogoji in potek PCR reakcije...... 71

Preglednica 12: Gradientni pogoji PCR reakcije...... 72

Preglednica 13: Optimizacija začetnih oligonukleotidov glede na število ciklov...... 73

Preglednica 14: Seznam velikosti alelov in frekvenc, dobljenih z uporabo 18 ...... 88

Preglednica 15: Parametri genetske variabilnosti posameznih mikrosatelitskih lokusov: .. 89

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. IX Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

KAZALO SLIK

Slika 1: Rdeči malinjak (Rubus idaeus subsp. vulgatus) (Foto: Novak 2014)...... 10

Slika 2: Rdeči malinjak (Rubus idaeus subsp. strigosus) (www.wildflower.org)...... 11

Slika 3: Črni malinjak (Rubus occidentalis) (www.goodearthfoodalliance.com)...... 12

Slika 4: Rumeni malinjak (Rubus ellipticus) (www.botanicalgarden.ubc.ca)...... 13

Slika 5: Vijolični malinjak (Rubus × neglectus) (www.agristarts.com)...... 13

Slika 6: Razširjenost rdečega malinjaka v Sloveniji (Jogan in sod. 2011)...... 16

Slika 7: Steblo (A) in list (B) rdečega malinjaka (Foto: Novak 2014)...... 17

Slika 8: Cvetovi rdečega malinjaka (Foto: Novak 2014)...... 18

Slika 9: Birna plodova rdečega malinjaka (Foto: Novak 2014)...... 19

Slika 10: Semeni rdečega malinjaka (Foto: Novak 2014)...... 19

Slika 11: Namnoževanje mikrosatelitskih lokusov (Schmidt 2009)...... 35

Slika 12: Verižna reakcija s polimerazo - PCR (Medchrome 2014)...... 42

Slika 13: Sorta 'Tulameen' (trajnice-carniola.com 2013)...... 48

Slika 14: Sorta 'Glen Ample' (Hargreave plants 2014)...... 49

Slika 15: Sorta 'Autumn Bliss' (About garden 2013)...... 50

Slika 16: Sorta 'Heritage' (Poljoprivredni saveti 2013)...... 51

Slika 17: Sorta 'Polka' (OMAFRA 2013)...... 51

Slika 18: Sorta 'Himbo' ali 'Himbo Top' (OMAFRA 2013)...... 52

Slika 19: Genska banka malin FKBV: A – malinjaki, posajeni na črni foliji;

B – rastline, pritrjene s plastičnimi sponkami (Foto: Novak 2012)...... 58

Slika 20: Lokacije pobiranja vzorcev (Foto: Novak 2014)...... 59

Slika 21: Mesta vzorčenja: A – znotraj ali zelo blizu gradu ali ob stenah samostana, B – 100–200 m od gradu ali samostanske stavbe, C – naselje do 2 km od gradu ali Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. X Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

samostanske zgradbe (Foto: Novak 2014)...... 60 Slika 22: A – priprava vzorcev DNA; B – nanašanje vzorcev na elektroforezo (Foto:

Novak 2012) ...... 64 Slika 23: Kapilarna elektroforeza v UKC Maribor znamke Beckman Coulter

CEQ 8000 (Foto: Novak 2012)...... 75

Slika 24: Izolirana DNA malinjakov 18 vzorcev divjih in pol-divjih genotipov pobranih ob srednjeveških gradovih ter 4 standardnih kultiviranih sort (Foto: Novak 2013) ……………………………………………………..78 Slika 25: Namnoženi fragmenti osmih vzorcev za 4 različne mikrosatelitske lokuse

(Foto: Novak 2013) ...... 80

Slika 26: Velikosti alelov 1. skupine začetnih oligonuleotidov – CE1 (vzorec 94)...... 81

Slika 27: Velikosti alelov 2. skupine začetnih oligonukleotidov – CE2 (vzorec 89)...... 82

Slika 28: Velikosti alelov 3. skupine začetnih oligonuleotidov – CE3 (vzorec 92)...... 83

Slika 29: Velikosti alelov 4. skupine začetnih oligonukleotidov – CE4 (vzorec 105). .... 84

Slika 30: Velikosti alelov 5. skupine začetnih oligonukleotidov– CE5 (vzorec 122)...... 85

Slika 31: Velikosti alelov 6. skupine začetnih oligonukleotidov – CE6...... 86

Slika 32: Velikosti alelov 7. skupine začetnih oligonukleotidov – CE7 (vzorec 122). .... 87

Slika 33: NJ dendrogram, narejen na osnovi MS podatkov in Diceovih koeficientov .... 91

Slika 34: Kombinacija začetnih oligonukleotidov, uporabljenih za identifikacijo

kultivarja 'Glen Ample'...... 94 Slika 35: Kombinacija začetnih oligonukleotidov, uporabljenih za identifikacijo

kultivarja 'Tulameen'...... 95

Slika 36: Kombinacija začetnih oligonukleotidov, uporabljenih za identifikacijo

kultivarja 'Meeker'...... 96

Slika 37: Kombinacija začetnih oligonukleotidov, uporabljenih za identifikacijo

kultivarja 'Polka'...... 97 Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. XI Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Slika 38: Kombinacija začetnih oligonukleotidov, uporabljenih za identifikacijo

kultivarja 'Rose de Core'...... 98

Slika 39: Kombinacija začetnih oligonukleotidov, uporabljenih za identifikacijo

kultivarja 'Sicoly'...... 99

Slika 40: Kombinacija začetnih oligonukleotidov, uporabljenih za identifikacijo

kultivarja 'Dieffenbach'...... 100

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 1 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

1 UVOD

Malinjaki (Rubus idaeus L.) so pomembna kultivirana rastlinska vrsta, razširjena v vseh zmernih območjih sveta. Z namenom, da jih razlikujemo med seboj, uporabljamo natančnejše nazive kot npr. rdeči malinjak ali evropski malinjak. V običajnem govoru ljudje ponavadi uporabljajo izraz malina. Danes med najpomembnejše in najštevilčnejše malinjake spada rdeči malinjak, ki izvira iz Evrope, Azije in Severne Amerike (Graham in sod. 1995). Rdeče malinjake gojijo v nasadih, predvsem v gričevnatih in gorskih območjih do nadmorske višine 1000 m (Jazbec in sod. 1995).

1.1 Pomembnost in proizvodnja malin

Največja pridelovalka rdečih malin je Rusija. Sledijo ji Poljska, Združene države Amerike in Srbija. V svetu letno pridelajo okrog 598.000 t malin. Proizvodnja se iz leta v leto povečuje. Na trgu se maline pojavljajo sveže, hitro zamrznjene ali pa v pridelavi za različne živilske proizvode kot so džemi, marmelade in sokovi. Zdravilne učinke malin s pridom uporabljata tako farmacevtska kot kozmetična industrija. Vsebujejo veliko vitamina A in so tudi izredno bogate z vitaminom C. Maline delujejo kot antioksidanti predvsem zaradi vsebnosti elegične kisline, kvercetina, galne kisline, antocianov, katehinov, kaempferola in salicilne kisline (Kalt 1999). Antociani kot pomembna skupina fenolnih spojin, flavonoidov imajo tudi zaščitno vlogo. Njihova prisotnost v plodovih malin je eden od dejavnikov, ki vpliva na aktivnost antioksidantov, kar se odraža v nevtralizacijski aktivnosti prostih radikalov (Pellegrini in sod. 2003).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 2 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

1.2 Genetski vidiki

Malinjaki (rod Rubus L.) spadajo v družino Rosaceae (rožnice). Rod je zelo obširen in obsega približno 500 vrst. Zanje je značilna zelo velika variabilnost v številu kromosomov, ki je v razponu od diploidnega (2n = 2x = 14), do dodekaploidnega (2n = 12x = 84), kar je odvisno predvsem od vrste. Tetraploidija je pri rdečem malinjaku redka, še redkeje pa se pojavlja triploidija (Jennings 1988, Thompson 1995, Naruhashi in sod. 2002).

Zaradi vedno večjega povpraševanja po malinah nastajajo nove sorte, ki omogočajo doseganje višjih pridelkov, imajo večje in bolj aromatične plodove z višjo vsebnostjo antioksidantskih molekul ter odpornejše na bolezni in škodljivce.

Ohranjanje starodavnih avtohtonih sort je velikega pomena, saj te sorte predstavljajo pomemben genski material za potrebe žlahtnjenja. Prav tako avtohtone sorte omogočajo socialno in ekonomsko varnost ter tudi višjo stopnjo samooskrbe. Sorte malinjakov, ki so se uspele obdržati desetletja na našem ozemlju, so odlično prilagojene na talne in podnebne razmere, odporne so proti boleznim in škodljivcem ter imajo želeno kemijsko sestavo. Stare sorte, ki so se ohranile do danes, so v glavnem manj produktivne in se ne uporabljajo v množični proizvodnji. Njihovi sadeži so praviloma manjši, vendar so bolj aromatični od novih sort.

V okolici srednjeveških gradov in samostanov lahko najdemo primitivne ali delno požlahtnjene malinjake, ki se razlikujejo od divjih in tudi od kultiviranih tipov malinjakov. Divje, primitivne, delno požlahtnjene, verjetno pa tudi požlahtnjene oblike malinjakov so poznali že stari Grki in Rimljani. V 11. stoletju so se začela organizirana verska romanja in intenzivno širjenje samostanov po Evropi in tudi na Slovenskem. S prihodom Kartuzijanov in z njihovim znanjem o gojenju rastlin so se razmere v kmetijstvu začele izboljševati, razvijati pa se je začela tudi trgovina oz. trgovske poti (Gruden 1912, Jacobus 1938). Na naših tleh se je začelo gojenje malinjakov množično pojavljati šele v 16. stoletju, ko se je s kmetijstvom ukvarjalo do 94 % prebivalstva (Božič 1969, Gestrin 1991). Ker se malinjaki v naravi razmnožujejo v glavnem vegetativno, na naše klimatske razmere pa so zelo dobro Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 3 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

prilagojeni, lahko predpostavimo, da so nekateri genotipi preživeli v naravnih pogojih, brez razmnoževanja s semeni, vsaj 3 stoletja.

Vsaka sorta mora biti registrirana in je pod okriljem Evropske direktive (92/34/EEC; direktiva o trženju razmnoževalnega materiala sadik sadnih rastlin in sadik sadnih rastlin, namenjenih za pridelavo sadja) (FURS 2010), ki zagotavlja pridelovalcem, da so sadike, ki jih prejmejo, zdrave in dobre kvalitete ter enake po izvoru. Kontrola vključuje identifikacijo sorte na osnovi morfoloških lastnosti in odsotnost pomembnih virusov. Sorta se zaščiti z žlahtniteljsko pravico, ki jo pridobi žlahtnitelj, ki sorto vzgoji, odkrije ali razvije sam ali skupaj z drugimi fizičnimi osebami. Za zaščito intelektualne lastnine in žlahtniteljskih pravic je zelo pomembno, da razpolagamo z metodo, ki omogoča hitro in natančno določitev sorte. Genetsko variabilnost lahko vrednotimo na več načinov.

Za malinjake je značilna zelo velika genetska variabilnost, zato je na osnovi morfoloških lastnosti oz. morfoloških markerjev zelo težko določiti genetsko sorodnost malinjakov. Med drugim tudi zato, ker ima na fenotipsko variabilnost vpliv tudi okolje. Prav tako je njihova uporaba povezana s številnimi metodološkimi težavami. Novejše tehnike, kot so npr. molekulski markerji, nam omogočajo določanje sorte na molekulskem nivoju. Prednost molekulskih markerjev pred opisovanjem morfoloških lastnosti je njihova neodvisnost od okolja. Prav tako nismo odvisni od razvojnega stadija rastline in lahko proučujemo variabilnost tudi v fiziološkem mirovanju (npr. po zimi).

Za določanje kultivarjev in genetsko analizo starodavnih tipov malinjakov lahko uporabimo več različnih molekulskih markerjev, ki se razlikujejo po svojih lastnostih, informativnosti, ceni in zahtevnosti uporabe. Mikrosatelitski markerji so lokusno specifični, pogosto so polimorfni, kar omogoča identifikacijo sort in izdelavo unikatnih alelnih profilov. Mikrosatelitska zaporedja so ponavadi dolga manj kot 100 baznih parov (bp) in so vgrajena v odseke DNA (Tautz 1989). Tehnike mikrosatelitskih markerjev se od tehnik AFLP in RAPD razlikujejo v tem, da se namesto naključnih lokusov, v PCR namnožujejo znani lokusi, ki so definirani z nukleotidnim zaporedjem para specifičnih Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 4 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

začetnih nukleotidov. Če poznamo pravo kombinacijo začetnih oligonukleotidov in natančno izmerjeno dolžino alelov na posameznem lokusu, lahko identificiramo želen kultivar. Zaporedje polimorfizmov izbranega izseka DNA uporabljajo tudi v kazenskih zadevah, civilnih sporih in za določitev starševstva, kjer se uporablja bolj poznana metoda »fingerprinting« oziroma metoda s prstnimi odtisi, s katero se lahko določi identiteta osebe iz biološkega vzorca.

1.3 Namen doktorske disertacije

Namen raziskave v okviru doktorske disertacije je bil proučiti uporabo mikrosatelitnih molekulskih markerjev za identifikacijo kultivarjev in sledenju hipotetičnih starodavnih genotipov rdečih malinjakov.

V 1. delu predlagane doktorske disertacije smo v okviru mednarodnega projekta imeli za cilj poiskati kombinacije različnih začetnih oligonukleotidov, s pomočjo katerih smo želeli identificirati 7 poznanih kultiviranih sort malinjakov ('Glen Ample', 'Tulameen', 'Meeker', 'Polka', 'Rose de Core', 'Sicoly', 'Dieffenbach').

V 2. delu smo se osredotočili na srednjeveške rdeče malinjake, kjer je bil naš cilj s pomočjo polimorfizma in genetske variabilnosti poskusiti ugotoviti ter ovrednotiti genetsko sorodnost med starodavnimi tipi rdečih malinjakov. Pri genotipih, ki smo jih vzorčili na specifičnih lokacijah, (poudarek je bil na zapuščenih samostanih in gradovih) smo sistematično ugotavljali genetsko sorodnost. V analize pa smo vključili povsem divje genotipe in različne tradicionalne in moderne sortne materiale, ki se gojijo danes. Eden od ciljev je bil tudi ugotoviti, ali malinjaki, pobrani ob zapuščenih gradovih, predstavljajo genetsko ločene skupine in ali se le-te razlikujejo od divjih, pol-divjih ter od kultiviranih malinjakov.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 5 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Teze doktorske naloge:

 Med populacijami divjih in kultiviranih genotipov malinjakov obstajajo genetske razlike.

 Predvidevamo, da bi lahko z določenimi kombinacijami mikrosatelitskih markerjev določili genotip oz. sorto malinjaka.

 Predvidevamo, da bi lahko s primerjavo velikosti namnoženih mikrosatelitskih markerjev ovrednotili genetsko sorodnost.

 Med tipi malinjakov, ki rastejo v okolici ostankov starodavnih naselij in kultiviranimi sortami malinjakov, obstajajo morfološke in genetske razlike.

 Rastline primitivnega videza, ki rastejo ob ruševinah zapuščenih samostanov ali gradov, so zaradi kontinuiranega vegetativnega razmnoževanja verjetno ostale bolj ali manj genetsko nespremenjene. Zaradi tega jih lahko imamo za hipotetične starodavne oz. srednjeveške genotipe. Spremembe, ki so nastale (to so spremembe, ki omogočajo lažje preživetje v težkih razmerah) so najverjetneje posledica postopne akumulacije mutacij in epigenetske spremembe.

 Mikro-lokacije, predvsem s svojimi ekstremnimi ekološkimi razmerami, lahko vplivajo na genetsko spreminjanje starodavnih genotipov malinjakov.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 6 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

2 PREGLED OBJAV

2.1 Sistematika in filogeneza

2.1.1 Botanična klasifikacija malinjakov

Malinjaki spadajo v red Rosales, družino Rosaceae (rožnice), poddružino Rosoideae in rod Rubus L. (Preglednica 1) (Hegi 2003, United States Department of Agriculture 2013, The plant list 2012, Martinčič in sod. 1999).

Preglednica 1: Sistematični prikaz klasifikacije rdečega malinjaka (Rubus idaeus L.) . Table 1: Systematic classification of red raspberry (Rubus idaeus L.).

Klasifikacija Poimenovanje

Kraljestvo Plantae (rastline)

Deblo Magnoliophyta (kritosemenke)

Razred Magnoliopsida (dvokaličnice)

Red Rosales (šipkovci)

Družina Rosaceae (rožnice)

Poddružina Rosoideae

Rod Rubus

Podrod Idaeobatus

Vrsta Rubus idaeus L. (rdeči malinjak) Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 7 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Rod Rubus je zelo obširen in zavzema okrog 500 vrst. Deli se na 12 podrodov (Preglednica 2). Med najbolj razširjene podrodove rodu Rubus prištevamo Idaebatus, Cylactis in Anoplobatus (Krüssmann 1986, Nikolić in Milivojević 2010). Podrod Idaeobatus ima 200 vrst malinjakov (Graham in sod. 2002). Vrste se med seboj razlikujejo tako po morfoloških kot po genetskih značilnostih (Haskell 1960, Jennings 1988).

Preglednica 2: Podrodovi in pomembnejše vrste rodu Rubus ter značilnosti pomembnejših podrodov ali vrst (United States Department od Agriculture 2010, Alice in Champbell 1999, Focke 1881, Martinčič in sod. 1999). Table 2: Subgenera and species of the genus Rubus with crucial phenotypical characteristics (United States Department od Agriculture 2010, Alice and Champbell 1999, Focke 1881, Martinčič et al. 1999).

Podrod Pomebnejše vrste Značilnosti podrodov in vrste R. idaeus

Rubus aboriginum, R. aliceae, R. deliciosus, R. koehleri, Anoplobatus Rastline nimajo trnov, listi so R. neomexicanus, R. odoratus, R. parviflorus enostavni; 3 do 5-krpi. Večletni listi so škrlatne barve.

Chamaebatus R. calycinus, R. hayata-koidzumii, R. nivalis, R. pectinellus Pritlikave rastline z enodelnimi srčastimi listi, pokritimi z dlačicami. Posamezen birni plod, rdeče barve.

Chamaemorus R. chamaemorus, R. pseudochamaemorus Dvodomne rastline, z mehkimi 5 do 7 krpastimi in pecljatimi listi. Tvorijo 5-25 plodov, svetlordeče barve, ki dozorijo v začetku jeseni.

Comaropsis R. geoides

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 8 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje Table 2: (cont.)

Podrod Pomebnejše vrste Značilnosti podrodov in vrste R. idaeus

Cylactis R. arcticus, R. fockeanus, R. humulifolius, R. lasiococcus, Zelne trajnice, s pokončnimi R. pedatus, R. saxatilis, R. xanthocarpus poganjki, ter jalovimi in poleglimi pritlikami s trojnimi listi in do 6 plodičev zraslih v birni plod.

Diemenicus R. gunnianus

Dalibardastrum R. amphidasys, R. nepalensis, R. tricolor, R. tsangiorum Gosto grmičevje z redkimi trni. Listi so preprosti, v bližini listnega peclja so široki in deljeni. Cvet je dvospolen, plod v grozdih ali posamezen.

Idaeobatus R. acuminatissimus, R. adenophorus, R. alexeterius, R. Plodovi so rdeči, redko rumeni ali alpestris, R. amabilis, R. apetalus, R. archboldianus, R. belkasti, nikoli črni. Venčni listi so aurantiacus, R. biflorus, R. chingii, R. cockburnianus, R. ponavadi enako dolgi kot čašni listi, columellaris, R. copelandii, R. corchorifolius, R. coreanus, lahko tudi krajši. R. crataegifolius, R. croceacanthus, R. ellipticus, R. eustephanos, R. flosculosus, R. fraxinifolius, R. glabricarpus, R. grayanus, R. hawaiensis, R. hirsutus, R. hoffmeisterianus, R. hypargyrus, R. idaeus, R. illecebrosus, R. innominatus, R. inopertus, R. irritans, R. komarovii, R. lasiostylus, R. leucodermis, R. ludwigii, R. R. idaeus lutescens, R. macilentus,R. macraei, R. mesogaeus,R. Steblo je redko poraslo s microphyllus, R. minusculus, R. niveus, R. occidentalis, R. ščetinastimi dlakami. Listi so palmatus, R. parvifolius, R. peltatus, R. pentagonus R. pernati (5 do 7 lističev) ali tri-delni. phoenicolasius, R. pileatus, R. pinfaensis, R. Venčni listi so beli in pokončni. pinnatus,Rubus probus, R. pungens, R. parvifolius, R.

peltatus, R. pentagonus, R. phoenicolasius, R. pileatus, R. pinfaensis, R. queenslandicus, R. racemosus, R. rigidus, R. rosifolius, R. sachalinensis, R. simplex, R. spectabilis, R. stans, R. strigosus, R. suavissimus, R. subornatus, R. sumatranus, R. teledapos, R. thibetanus, R. trianthus, R. trifidus, R. vernus

Lampobatus R. acanthophyllos, R. adenothallus, R. adenotrichos, R. Bodičasto zimzeleno grmičevje. betonicifolius, R. bogotensis, R. briareus, R. bullatus, R. Listi so usnjati, ponavadi choachiensis, R. coriaceus, R. costaricanus, R. eggersii, R. sestavljeni, redko enostavni. Cvet je eriocarpus, R. fagifolius, R. florulentus, R. gachetensis, R. dvospolen. giganteus, R. glabratus, R. glaucus, R. hondurensis, R. imperialis, R.irasuensis, R. macvaughianus, R. megalococcus, R. nubigenus, R. peruvianus, R. roseus, R. sapidus, R. shankii, R. trichomallus, R. turquinensis

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 9 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje Table 2: (cont.)

Podrod Pomebnejše vrste Značilnosti podrodov in vrste R. idaeus

Malachobatus R. acuminatus, R. alceifolius, R. assamensis, R. Bodičasto grmičevje, redko zelišče. bambusarum, R. buergeri, R. chroosepalus, R. Listi preprosti, kompaktni, chrysophyllus, R. elongatus, R. fairholmianus, R. ponavadi pernati, 3-5 sestavljeni. flagelliflorus, R. fockei, R. formosensis, R. gardnerianus, Cvet je dvospolen. Lahko so v R. glomeratus, R. henryi, R. hunanensis, R. ichangensis, R. šopih ali posamezni. Plod se drži irenaeus, R. kawakamii, R. lambertianus, R. lineatus, R. cvetišča. moluccanus, R. multibracteatus, R. paniculatus, R. parkeri, R. pseudosieboldii, R. pyrifolius, R. rolfei, R. rugosus, R. setchuenensis, R. sieboldii, R. splendidissimus, R. swinhoei, R. tephrodes, R. tiliaceus, R. wardii, R. xanthoneurus

Micranthobatus R. australis, R. cissoides, R. moorei, R. nebulosus, R. Drevesasta oblika, ima dolga stebla parvus, R. schmidelioides, R. squarrosus in palmovo listje. Dvodomne rastline, ki imajo pomožna socvetja.

Orobatus R. loxensis Grmičaste rastline. Veje so brez dlak. Cvet, steblo in peclji so kosmati. Listi so ovalni do ovalno- suličasti. Stranski listi so dolgi do 1 cm. Cvetovi so ovalne oblike, rahlo dlakavi, vijolične barve in so veliki 10 do 15 cm.

V rodu Rubus obstaja zelo velika variabilnost v številu kromosomov, ki se giblje od 2n = 2x = 14, do 2n = 12x = 84. Tetraploidija je pri rdečem malinjaku redka, triploidnost pa se pojavi še redkeje (Fedorov 1969, Jennings 1988, Thompson 1995, Naruhashi in sod. 2002). Kljub temu, da so malinjaki skoraj zmeraj diploidi, je dednost (glede rodnosti in kvalitete plodov) pri njih dokaj zapletena. Barvo plodov, število poganjkov in dvodomnost določa večje število genov, medtem ko trnavost, gostoto dlačic, voščeno prevleko na mladih poganjkih in barvo listov določa 1par genov. Rdeča barva plodov in poganjkov se deduje dominantno. Hibridi R. idaeus × R. arcticus se odlikujejo z 83 % pravilnih redukcionalnih delitev. Medvrstni hibridi R. idaeus × (R. coreanus, R. kuntzeanus, R. parvifolius, R. spectabilis) so se izkazali za delno plodne (Nikolić in Milivojević 2010). Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 10 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Hegi (2003) navaja, da se v Evropi in Sibiriji pojavlja podvrsta R. idaeus L. subsp. idaeus, (syn. Rubus idaeus L. subsp. vulgatus Arrhenius (1839)), v Severni Ameriki in Kanadi pa se rdeči malinjaki pojavljajo kot križanec Idaeus × strigosus – Rubus idaeus L. subsp. strigosus Michx. (1803), ki jo ponekod imenujejo kar Rubus strigosus Focke (1911) – ameriški rdeči malinjak. Podvrsti se med seboj razlikujeta.

Med pogostimi vrstami podrodu Idaeobatus se pojavljajo tudi črni (Rubus occidentalis L.), vijolični (Rubus negletus Peck.) (USDA 2006) in rumeni malinjaki (Rubus ellipticus L.) (Štampar in sod. 2005).

Evropski rdeči malinjak sodi med trajnice z 2-letnimi poganjki. Rastlina spomladi požene mlade poganjke, ki v tekočem letu zrasejo do 2 m višine, z veliko listne mase. Naslednjo pomlad se na teh poganjkih razvijejo cvetovi ter v poletnih mesecih plodovi (Slika 1). Listi so gladki, na hrbtni strani pa belkasti in hrapavi. Plodovi so temno rdeči in polokrogli do stožčasti (Krüssmann 1986, Nikolić in Milivojević 2010). Za uspešno rast potrebujejo malinjaki vlažne klimatske pogoje (900–1000 mm vodne kapacitete) ter povprečno letno temperaturo 7–8 °C (Nikolić in Milivojević 2010).

Slika 1: Rdeči malinjak (Rubus idaeus subsp. vulgatus) (Foto: Novak 2014). Figure 1: Red raspberry (Rubus idaeus subsp. vulgatus) (Photo: Novak 2014).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 11 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Podvrsta Rubus idaeus L. subsp. strigosus (Slika 2) se nahaja predvsem v Severni Ameriki in Kanadi. Od evropske se razlikuje po tem, da so stebla malinjakov nežna in pokrita z dlačicami, listi so ožji in tanjši, plod pa svetlo rdeč. Prav tako je odporna na nizke temperature in na sušo (Nikolić in Milivojević 2010). Razlikujeta se tudi po odsotnosti žlez v pecljih in socvetju (Hegi 2003).

Slika 2: Rdeči malinjak (Rubus idaeus subsp. strigosus) (www.wildflower.org). Figure 2: Red raspberry (Rubus idaeus subsp. strigosus) (www.wildflower.org).

Črni malinjak (Rubus occidentalis L.) (Slika 3) pripada podrodu Idaeobatus. Od rdečega malinjaka se razlikuje po barvi in obliki plodov ter rasti. Močni poganjki so pogosto trnasti, temno rdeči, prekriti z modrikasto sivim poprhom. Plod je črn, z odtenkom vijolične barve in prekrit s poprhom. Je okrogel, majhen, trden in zelo obstojen. Okus je prijeten in aromatičen (Štampar in sod. 2005).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 12 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Slika 3: Črni malinjak (Rubus occidentalis) (www.goodearthfoodalliance.com). Figure 3: Black raspberry (Rubus occidentalis) (www.goodearthfoodalliance.com).

Rumeni malinjak (Rubus ellipticus L.) (Slika 4) je nastal z mutacijo vrst R. idaeus, R. strigosus in R. occidentalis. Rast in rodnost rumenih malinjakov sta srednje bujni. Plodovi so bledo do zlato rumeni, zelo trdni, vendar se pogosto drobijo oz. razpadejo na posamezne plodiče, ki sestavljajo birni plod. Po okusu so rumeni malinjaki zelo podobni rdečim. Večina rumenih sort je 2 x rodnih (Štampar in sod. 2005).

Vijolični malinjak (Rubus × neglectus Peck.) (Slika 5) je križanec med ameriškim rdečim in črnim malinjakom (Štampar in sod. 2005). Razširjen je v Severni Ameriki in se goji od leta 1835. Rastlina je tipičen hibrid. Po izgledu je podobna črnemu malinjaku. Je trnav, listi so prsati ali perjasti. Vijolični malinjak je zelo roden. Plod je svetlo vijolične barve. Okus je podoben ameriški rdečemu malinjaku (Nikolić in Milivojević 2010). 'Glen Coe' je posebna nova sorta z intenzivno obarvanimi vijoličnimi plodovi in je brez trnov. Sorta 'Glen Coe' je samooplodna, rast je bolj grmičasta in manj močna kot pri rdečem malinjaku (Sorte malin 2014).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 13 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Slika 4: Rumeni malinjak (Rubus ellipticus) (www.botanicalgarden.ubc.ca). Figure 4: Yellow raspberry (Rubus ellipticus) (www.botanicalgarden.ubc.ca).

Slika 5: Vijolični malinjak (Rubus × neglectus) (www.agristarts.com). Figure 5: Purple raspberry (Rubus × neglectus) (www.agristarts.com).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 14 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

2.1.2 Filogenetski odnosi

Pri rodu Rubus je taksonomska problematika zelo zapletena in težavna, saj pri večini vrst nastajajo semena na nespolni način (agamospermija) (Martinčič in sod. 1999). Pri podrodu Idaeobatus je večja genetska variabilnost, saj število kromosomov niha. Zaradi velike sorodnosti je samo na osnovi fenotipskih značilnostih morfoloških markerjev težko ugotavljati sorodstveno povezanost malinjakov. Med drugim tudi zato, ker na variabilnost vpliva tudi okolje.

Genetsko variabilnost sta dokazovala Alice in Campbell (1999), ki sta s pomočjo »notranjega prepisovalnega distančnega nukleotidnega zaporedja« (ITS – internal transcribed spacer) ugotovila, da so sekvence Rubusa najbolj informativne med podrodovi, ter da je med sorodnimi vrstami majhna variabilnost. Njuna analiza je pokazala, da sta rodova Rubus in Dalibarda povezana, ter da Dalibarda močno podpira vejo D. repens. Prav tako sta ugotovila, da je R. ursinus hibrid med bližnjim sorodnikom R. macraei (podrod Idaeobatus) ter še ene neznane podvrste rodu Rubus. ITS nukleotidna zaporedja so na splošno skladna z biogeografijo in ploidijo. Vendar pri pomembnih morfoloških znakih, kot sta struktura stebla in oblika listov, lahko ITS nukleotidna zaporedja omejujejo filogenetske vrednosti za rod Rubus.

Alice in sod. (2001) so uporabili ITS nukleotidna zaporedja pri analizi staršev in potomcev v procesu hibridizacije tetraploidnega ribeza Rubus caesius Dewberry in diploidnih rdečih malinjakov. Obe vrsti sta razširjeni v Evropi. Domnevali so, da je hibridizacija povod za številne vrste, vključno z R. maximiformis Weber in R. picticaulis Weber. Ugotovili so, da se R. caesius razlikuje od R. idaeus na 20 nukleotidnih mestih. Domnevni hibridi teh nukleotidov in polimorfizem za večino teh ni možen, ker ni genskega pretoka med R. caesius in R. idaeus. Na podlagi ITS zaporedja so ugotovili, da se starševske generacije razlikujejo na 3 mestih, ter da je imel samo 1 posameznik nedotaknjena starševska ITS zaporedja, ki so se kazala v F1 generaciji, medtem ko so bili ostali mešanice starševskih in svojih nukleotidnih zaporedij. Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 15 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Z mikrosatelitskimi markerji so Dossett in sod. (2010) naredili raziskavo sorodnosti za črne malinjake (podrod Idaeobatus). Ugotovili so, da na sorodnost pri R. occidentalis vpliva povprečna skupna razdalja alelov (4 divji genotipi od vseh 16 genotipov), ki je bila 0,62, medtem ko je bila povprečna skupna razdalja alelov med 12-imi sortami polovico manjša (0,29). To kaže na dejstvo, da za črni malinjak ni značilna genetska reprezentativna raznolikost.

Filogenetske odnose med črnim in rdečim malinjakom so proučevali tudi Bushakra in sod. 2012. Njihove raziskave dajejo nov vpogled v evoluciji genoma malinjaka s stališča domnevnega skupnega prednika Rosaceae. Za vrste rodu Rubus so naredili genske karte na podlagi pomnoženih fragmentov dolžine polimorfizma. F1 generacijo, ki se je razvila s križanjem R. occidentalis (96395S1) in R. idaeus 'Latham', so uporabili za gradnjo nove genetske karte, sestavljene iz nukleotidnega zaporedja markerjev DNA. Karta je vključevala 131 ortolognih markerjev. 60 markerjev je bilo razvitih za malinjake. Za kartiranje so uporabili primarne pare za Rubus, Fragaria vesca 'Hawai 4', Malus domestica × 'Zlati delišes' in Prunus persica 'Lovell'. S pomočjo razdalj v genski karti so ugotovili, da imajo genomi Rubus in Fragaria visoko stopnjo sistematičnosti in da sistematičnost pada s filogenetsko razdaljo.

Yang in sod. 2012 so za filogenetske analize Rubusa primerjali gene iz listov rastlin in z nukleotidnimi zaporedji razkrili filogenetske odnose prej nerazrešenega taksona in uporabnost markerja namesto ITS zaporedij. Ugotovili so, da korejski Rubus evolucijsko izhaja od zeliščnih do lesnatih rastlin, da imajo rastline sestavljen ali enostaven list, ter da cvet prehaja od roza do bele barve.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 16 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

2.2 Ekologija in biologija rdečega malinjaka

2.2.1 Razširjenost

Rdeči malinjak je zelo razširjena vrsta in obsega divje, primitivne in kultivirane genotipe. Najdemo jih v vzhodni in južni Aziji, na Madagaskarju, vzhodni in južni Afriki, Avstraliji, na Havajih, v Severni in Južni Ameriki ter po vsej Evropi. Uspeva vse do 1000 m nadmorske višine (Jazbec in sod. 2005), na severu pa sega vse do severnega povratnika (Krüssmann 1986).

V Sloveniji je rdeči malinjak razširjen v severnem, zahodnem, jugozahodnem in južnem delu ter severnem delu osrednje Slovenije. Manj je razširjen v severovzhodnem in vzhodnem delu (Slika 6).

Slika 6: Razširjenost rdečega malinjaka v Sloveniji (Jogan in sod. 2011).

Figure 6: Distribution of red raspberries in Slovenia (Jogan in sod. 2011).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 17 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

2.2.2 Morfološke lastnosti

Morfološko se malinjaki razlikujejo po listih, barvi ter obliki plodov. Okolje ima lahko velik vpliv na morfološke značilnosti rastline (Ryabova 2007). Malinjak je večletna polgrmičasta rastlina. 2-letni poganjki so oleseneli, medtem ko so 1-letni poganjki zeleni. Stebla so bolj ali manj obrasla z bodicami (Slika 7A). Poganjki imajo drobne trne, ki se radi lomijo. Nekatera stebla novejših sort malinjakov so celo brez bodic (Nikolić in Milivojević 2010).

Listi malinjaka so sestavljeni, pernati in so 3–5-delni. Zgornja stran lista je zelene barve, spodnja, hrbtna stran, je belkaste barve in je na dotik robata (Slika 7B) (Krüssmann 1986, Nikolić in Milivojević 2010).

Slika 7: Steblo (A) in list (B) rdečega malinjaka (Foto: Novak 2014). Figure 7: Stem (A) and leaves (B) of red raspberry (Photo: Novak 2014).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 18 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Malinjak ima kratka socvetja na koncih stranskih poganjkov. Cveteti začne pozno pomladi. Cvet je dvospolen (hermafroditen) in polisimetričen (apokarpen). Sestavljen je iz 5 čašnih listov zelene barve, 5 belih cvetnih listov, iz veliko prašnikov (60–90) in veliko karpel (20– 200). Cvet ima približno 1 cm premera (Slika 8).

Slika 8: Cvetovi rdečega malinjaka (Foto: Novak 2014). Figure 8: Flowers of red raspberry (Photo: Novak 2014).

Iz cveta se razvije birni plod rdeče barve, za katerega je značilno, da so okrog osrednjega jedra razvrščene manjše jagode (20–200) (Slika 9). Te so nanizane v grozdiče ali so posamič razvrščene na rodni vejici. Pri malinjakih se jagode ločijo od jedra, tako da imamo votel sadež, medtem ko se pri robidah in v večini drugih vrst rodu Rubus, jagode držijo jedra (Blamey in Grey-Wilson 1989). Večino posameznega ploda sestavlja meso in zavzema 94–97 % skupne mase ploda. Ostanek pripada kožici in semenu. Divji rdeči malinjaki imajo plod težak 0,9–1,7 g, plodovi kultiviranih, gojenih pa so težki med 1,7–8,4 g (Mišić 1998).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 19 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Slika 9: Birna plodova rdečega malinjaka (Foto: Novak 2014). Figure 9: Fruits of red raspberry (Photo: Novak 2014).

Seme malinjaka se razvije po dvojni oploditvi iz zarodkove vrečice. Slika 10 nam prikazuje seme v velikosti približno 3 mm (v povprečju so velika 3–4 mm). Ima trdo semensko lupino, je nagubano in svetlo rumene barve. V plodu je veliko drobnih semen. Seme kali pri nizki temperaturi in vlažnem okolju. Glavni deli semena so kalček, hranilno tkivo in semenska lupina (Nikolić in Milivojević 2010).

Slika 10: Semeni rdečega malinjaka (Foto: Novak 2014). Figure 10: Seeds of red raspberry (Photo: Novak 2014). Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 20 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

2.3 Rast in razvoj rdečega malinjaka

2.3.1 Rast

Življenjsko obdobje rdečega malinjaka je navadno zelo dolgo. V juvenilnem obdobju, ki traja 1–2 leti, se razvijejo 2–4 poganjki, ob koncu tega obdobja pa se začnejo oblikovati cvetni brsti, cvetovi, plodovi in semena. V obdobju zrelosti, ki traja 10–12 let, se vzpostavi ravnotežje med številom poganjkov in rodnostjo, ki je v tem obdobju navadno največja. Ko rastline ostarijo, začne rodnost upadati. Takrat je potrebno nasade malinjakov obnoviti (Nikolić in Milivojević 2010, Štampar in sod. 2005). V vegetativni dobi je optimalna temperatura za rast 13–15 °C (Vulić in sod. 1999).

Malinjake po rodnosti delimo na 1 x rodne in 2 x rodne sorte. Pri 1 x rodnih sortah se začnejo cvetni brsti razvijati septembra in oktobra na 1-letnih poganjkih. Iz njih se spomladi prihodnje leto razvijejo cvetovi in plodovi. Pri 2 x rodnih malinah se začnejo cvetni brsti na vrhovih poganjkov razvijati že v začetku poletja. Ti brsti zacvetijo in obrodijo v začetku jeseni (Štampar in sod. 2005). Med 1 x rodnimi so najbolj pogoste sorte 'Willamette', 'Meeker', 'Tulameen', 'Glen Ample' in 'Rubaca'. 2 x rodne sorte, ki se najbolj pogosto pojavljajo na tržišču, so 'Autumn Bliss', 'Polka', 'Himbo Top', 'Heritage' (Preglednica 3) (Nikolić in Milivojević 2010).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 21 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 3: Pomembnejše sorte rdečega malinjaka, razvrščene po rodnosti, začenši z najbolj produktivno (Weber 2012, Sorte malin – Predikat 2014). Table 3: The most important varieties of raspberries listed according to the level of productivity, starting with the most productive variety (Weber 2012, Sorte malin – Predikat 2014).

Enkrat rodne sorte rdečega malinjaka Dvakrat rodne sorte rdečega malinjaka

'Bolgarski rubin' 'Erika'

'Cascade Delight' 'Heritage'

'Glen Ample' 'Himbo Top'

'Iskra' 'Polka'

'Meeker' 'Sicoly'

'Rose de Core' 'Sugana'

'Royalty' 'Autumn Bliss'

'Samodiva'

'Schopska alena'

'Tulamagic'

'Tulameen'

'Willamette'

Malinjak je žužkocvetna (entomofilna) rastlina. Med opraševalci je najpomebnejša čebela. 1 x rodne sorte začnejo cveteti v 2. polovici maja. 2 x rodne cvetijo še v septembru. Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 22 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Uspešno opraševanje je predpogoj za oploditev. Pri malinjakih je pomembno, da oploditev in oprašitev potekata skoraj istočasno ter da je oplojen celotni cvet. Do dvojne oploditve ponavadi pride približno dan po oprašitvi (Nikolić in Milivojević 2010).

2.3.2 Okoljske zahteve

Je rastlina zmernega kontinentalnega podnebja. Na rast in razvoj vplivajo zlasti svetloba, toplota, voda in hranila v tleh. Rdeče sorte najbolje uspevajo na nadmorski višini 300– 1100 m. Za malinjake so ugodni tereni z blagim nagibom (3–5 %), kjer ni velikega izpiranja zemlje (erozije) (Nikolić in Milivojević 2010).

Rdeči malinjak je heliofit, rastlina sonca. Nima rad prevelike pripeke, prav tako ne sence. Divji rdeči malinjak navadno raste na gričevnatih pobočjih ter na obronkih gozdov. Malinjak je potrebno saditi kot samostojno kulturo, ne pa kot subkulturo ostalega sadja. Priporoča se špalirski način gojenja na legi sever-jug, tako se omogoči maksimalno izkoriščanje svetlobe v procesu fotosinteze (Nikolić in Milivojević 2010).

Temperatura je pomemben dejavnik, ki določa o razporeditvi vrst in sort malinjaka. Rdeči malinjak je odporen na mraz, prenese tudi do –26 °C pod snegom oz. do –14 °C na prostem. Na mraz so občutljivejše 2-rodne sorte. Vročino in sušo v času zorenja plodov malinjak zelo slabo prenaša (Nikolić in Milivojević 2010). Najbolje uspeva v območjih z zmerno hladnim in vlažnim poletjem ter z ne preveč ostrimi zimami, kjer je povprečna letna temperatura 8–10 °C, v vegetativni dobi pa 13–15 °C (Vulić in sod. 1999).

Najbolje uspeva na področjih, kjer je 700–1000 mm padavin letno, v rastni dobi pa polovico manj. Največje količine vode potrebuje v času intenzivne rasti poganjkov ter razvoja plodov, to je v mesecu maju in juniju. Preobilica vode lahko povzroči različne bolezni korenin kot npr. puhasto plesen (Phytophthora fragariae var. Rubi) in Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 23 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

traheoverticiliozo (Verticillim albo-atrum in V. dahliae) (Nikolić in Milivojević 2010), pri plodovih pa lahko prevelika vlažnost povzroča gnilobo (Botrytis cinerea) (Tanović 2010).

Paziti je potrebno pri izboru lege nasada malin. Malinjake je potrebno zaščititi pred pogostimi, suhimi, hladnimi, vročimi in zelo močnimi sunki vetra. Ledeni veter lahko povzroči, da poganjki, brsti ali celotna rastlina pozebe. Močni in zelo topli vetrovi lahko otežujejo opraševanje in oploditev malinjakov. Prav tako lahko polomijo poganjke in rodne brste. Blagi vetrič je koristen, saj obnavlja zrak in nenehno prinaša nove količine CO2, ki je potreben za fotosintezo.

Za malinjak so primerna globoka, rahla, prepustna ter slabo kisla (pH 5,5–6,5) ter rodovitna tla s 3–5 % humusa. Slabo prenaša plitka, lahka, zelo kisla ali bazična ter težka in zbita tla (Nikolić in Milivojević 2010).

2.4 Razmnoževanje

2.4.1 Generativno razmnoževanje

V srednji Evropi je rod Rubus sestavljen iz številnih poliploidnih apomiktičnih vrst (izjema je nekaj diploidov, ki kažejo normalno spolno razmnoževanje, na primer R. canescensin in R. ulmifolius). Spolno razmnoževanje se pojavi občasno (ni velike razlike med kloni) in prispeva k ohranjanju genetskih variacij v naravnih populacijah (Christen 1950, Berger 1953, Czapik 1981).

Young in Young (2009) sta ugotovila, da imajo semena večine vrst Rubus nizko kalivost zaradi trdnega semenskega ovoja, ki predstavlja mehansko oviro za penetracijo vode in zraka, kar zavira rast. V naravnih pogojih se mirovanje semena prekine zaradi kombinacije večih dejavnikov: spreminjanja temperature, izmeničnega mokrega in suhega obdobja ter Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 24 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

dejavnosti različnih mikroorganizmov na površini semenske lupine (Wada in Reed 2011). Pri rdečih malinjakih semena kalijo zelo dolgo (120 dni in več). Imajo tudi lažja semena kot ostale vrste (R. odoratus – 1.090 semena/g, R. idaeus – 720 semena/g). Črni malinjaki, ki cvetijo maja in junija, imajo najtežja semena (R. procerus – 320 semena/g, R. flagellaris – 290 semena/g) (Young in Young 2009).

V naravnih pogojih seme kali zelo počasi in neenakomerno. Kalitev lahko traja 6–8 mesecev, lahko tudi več. Enakomerna kalitev se lahko doseže z ustrezno obdelavo semena (skarifikacija in stratifikacija). Stratifikacija lahko poteka v naravnem okolju (v tleh na odprtem) ali v hladilniku. Pomembno je, da se semena vzdržujejo vsaj 3 mesece na mokrih pogojih (mokra zemlja ali pesek) in pri nizki temperaturi, navadno 2–8 °C (Wada in Reed 2011).

2.4.2 Vegetativno razmnoževanje

Nespolno (vegetativno) razmnoževanje je razmnoževanje, ki temelji na kontinuirani mitozi in ne vključuje rekombiniranje genetskega materiala. Potomci takšnega razmnoževanja, če ne pride do mutacij, so genetsko povsem enaki matični (izhodiščni) rastlini. Rastline, ki izvirajo iz ene same matične rastline, imenujemo klon.

Poznamo več načinov vegetativnega razmnoževanja (Bohanec 1992, Trček-Kovše 2005):

 Razmnoževanje s potaknjenci. Iz poganjka rastline se razvije nov, celoten osebek, ki se v zemlji ukorenini.

 Razmnoževanje z grobanicami. Grobanico naredimo tako, da mladiko upognemo v zemljo, kjer se ukorenini. Ko je grobanica ukoreninjena, jo odrežemo od matičnega grma in posadimo kot samostojno rastlino. Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 25 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

 Razmnoževanje z delitvijo grmov. Grm z več mladikami lahko razdelimo na več delov in posadimo vsakega zase. Pri tem pazimo, da ima vsak del dovolj korenin in da ne poškodujemo brstov rastline.

 Razmnoževanje s tkivnimi kulturami. Za hitro razmnožitev določene sorte se uporablja tehnika mikropropagacije.

2.5 Ekonomska pomebnost malinjakov

2.5.1 Zgodovina in izvor malinjakov

Divjo obliko rdečega malinjka so poznali že stari Grki in Rimljani. Uporabljali so jih tako za hrano kot za zdravilo. V letih 23–79 n.š. bi naj rdeče malinjake zasledili na planini Ida na severo-zahodu Male Azije, v bližini mesta Troja, po katerem so tudi dobili ime Rubus idaeus. Nasade malinjakov so zasledili že v zgodovini Rusije, v času Jurija Vladimirovića Dolgorokega (1090–1157), vrtovi malinjakov so se pojavili v Angliji od leta 1548. Prvi zapisi o malinjakih so bili objavljeni v poglavju v knjigi »V sončnem zemeljskem raju«, J. Parkinsona (1629). Leta 1826 je izšel katalog sadja hortikulturnega društva v Londonu, kjer je bilo opisanih 23 sort malinjakov (Nikolić in Milivojević 2010).

2.5.2 Uporabnost malinjakov

2.5.1.1 Pomembna sadna vrsta

Že v času starih Grkov in Rimljanov, so plodove malinjakov (maline) uporabljali v prehrambene in zdravilne namene (Nikolić in Milivojević 2010). Tudi danes je rdeči malinjak pomembna sadna vrsta, saj se maline zaradi vsebnosti vitamina C, antocianov ter drugih zdravilnih in pozitivnih učinkovin uporabljajo tako v prehrambeni, kozmetični kot tudi v farmacevtski industriji (Pellegrini in sod. 2003, Kalt in sod. 1999). Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 26 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Na trgu se maline pojavljajo sveže, hitro zamrznjene ali pa v pridelavi za različne živilske proizvode kot so džemi, marmelade, sokovi (Michelis 2003). Zaradi svoje arome in svežine se uporabljajo v kulinariki za različne slaščice, torte, sladolede, jogurte, mueslije. Zaradi vsebnosti vitamina C so plodovi priljubljen sadni čaj. V farmaciji promovirajo maline zaradi vsebnosti antioksidantov, v kozmetiki pa za različna masažna olja, šampone, gele za prhanje, rdečila za ustnice ipd. V kozmetični industriji se uporabljajo tudi semena malin. Ta delujejo kot naravni eksfoliant oz. kot odstranjevalec mrtve kože. Semena lahko uporabimo še za izdelavo naravnih mil in pilingov (www.tovarnaorganika.si).

2.5.1.2 Prehrambene značilnosti malin

Plodovi imajo hranljivo in zdravilno vrednost, ki bazira na bogati biokemijski sestavi. Te se med seboj razlikujejo in so odvisne od sorte, rodnosti, zrelosti plodov, ekoloških in pridelovalnih dejavnikov. Maline vsebuje veliko vode (81,7–89,9 %). V vodi so raztopljene razne hranljive, organoleptične in zdravilne sestavine. Prisotni so najrazličnejši monosaharidi (glukoza in fruktoza), v manjši količini pa je prisoten tudi disaharid (saharoza) (Nikolić in Milivojević 2010). Vsebnost organskih kislin znaša 0,30–0,50 mg/g sveže mase ploda. Največ je citronske kisline, sledita jabolčna in jantarna kislina (Milutinović in sod. 2008). V majhnih količinah so prisotne tudi mineralne sestavine. Največ je kalija, sledijo še fosfor, kalcij, magnezij in žveplo. Plod maline vsebuje malo količino energije (2.240 kJ/kg) (Nikolić in Milivojević 2010). Vitamin C, ki je pomemben antioksidant, predstavlja 6 % skupne aktivnosti antioksidantov v malinah (Kalt in sod. 1999). V plodu ga je 17–53 mg/100 g. Rdeče maline vsebujejo sorazmerno veliko vitamina A in biotina (B7).

Glede vsebnosti antioksidantov sodijo v sam vrh med sadnimi vrstami in imajo izredno zdravilno moč. Delujejo kot antioksidanti predvsem zaradi vsebnosti elagne kisline, kvercetina, galne kisline, antocianov, cianidina, pelagonidin glikozida, katehinov, kempferola in salicilne kisline. Antociani so naravni pigmenti, ki dajejo plodu maline rdečo barvo. Najštevilčnejši antociani so cianidin-3-glukozid in cianidin 3-soforozid. Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 27 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Vsebnost antocianov v sorti 'Meeker' znaša 55 %, kar pomeni 0,656 g/l, pri sorti 'Willamette' pa 0,912 g/l (Vukosavljević 2006).

Vsebnost antioksidantov v plodovih malinjakov je odvisna od večih faktorjev, in sicer od sorte, klimatskih razmer, tehnologije pridelave in raznih interakcij med omenjenimi faktorji. Večina sort malinjakov, ki so prisotne na trgu, vsebujejo relativno nizke vsebnosti antioksidantov v primerjavi z divjimi genotipi malin, borovnicami in robidami (Kalt in sod. 1999).

Poleg antioksidantov imajo pri malinah pomembno vlogo tudi fenoli in fenolne spojine. Na kakovost plodov in vsebnost fenolov in fenolnih spojin vpliva genotip, intenzivnost osvetlitve v času zrelosti, lastnosti tal in oskrba rastlin (Anttonen in Karjalainen 2005). Koncentracija fenolnih spojin se najbolj spreminja v času zrelosti.

Antociani kot pomemben razred fenolnih spojin, flavonoidov, imajo tudi zaščitno vlogo. Njihova prisotnost v malinah je eden od dejavnikov, ki vpliva na aktivnost antioksidantov, kar se odraža v nevtralizacijski aktivnosti prostih radikalov (Pellegrini in sod. 2003). Podatki kažejo, da višja vsebnost skupnega fenola, flavonoidov in antocianov iz rdeče maline prispeva k večjemu antioksidativnemu delovanju (Liu in sod. 2002, Wang in Lin 2000).

Maline delujejo odvajalno, čistijo črevesje, pomagajo pri težavah z mehurjem in ledvicami in odpravljajo zaprtost. Pretekle in trenutne študije dokazujejo pozitivne učinke rednega konzumiranja malin za preprečevanje kardiovaskularnih bolezni, sladkorne bolezni, raka in s starostjo povezanih bolezni. Dokazali so, da antioksidanti zmanjšujejo pojav teh bolezni (Kalt in sod. 1999).

Maline predstavljajo raznolik vir potencialno zdravilnih antioksidantov, vendar jih je potrebno pravilno skladiščiti. Za daljše skladiščenje (do 16 dni), se priporoča temperatura Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 28 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

0-4,5 °C, do 8 dni se skladišči pri temperaturi 20 °C (Robbins in Moore 1990). Pobrati jih je potrebno pri 50 % zrelosti, saj takrat dosežejo boljšo raven sladkorjev, antocianov, fenolov, antioksidantov in dejavnosti med skladiščenjem, kot tiste, ki so pobrane pri polni zrelosti (Wang in sod. 2009).

2.5.3 Proizvodnja

V letu 2012 so v svetu pridelali 597.917 t malin (Factfish Raspberries 2013). Poleg jagod in ribeza so maline najpogosteje gojeno jagodičevje na svetu. Podatki iz Preglednice 4 se nanašajo na celotno proizvodnjo znotraj ali zunaj kmetijskega sektorja, kar pomeni, da vključuje ne-komercialno proizvodnjo in proizvodnjo iz vrtov. Ocenjuje se, da proizvodnja malin doseže okrog 100 g malin na prebivalca na svetu. Največja pridelovalka malin je Rusija, saj prideluje maline na površini 17.098.240 km2 (Factfish Raspberries 2013). Sledita ji Poljska in Združene države Amerike. Na 4. mestu je Srbija (Preglednica 4). Poleg naštetih imajo na trgu velik vpliv tudi države, kot so Nova Zelandija in Kitajska, ki oskrbujejo trg s svojimi izdelki tudi v zimskem času. Cene na trgu variirajo 1–7 € za kg, maloprodajne pa 7–10 € za kg. Prodaja malin dosega visoko vrednost na globalnem trgu kmetijskih pridelkov. Vsako leto se proizvodnja malin na svetu poveča.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 29 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 4: Proizvodnja malin v svetu v letu 2012 (Factfish Raspberries 2013). Table 4: World production of raspberries in 2012 (Factfish Raspberries 2013).

Države Proizvodnja v tonah % od skupne prodaje

Rusija 133.000 23,7

Poljska 127.055 22,6

ZDA 100.775 17,9

Srbija 96.078 17,1

Ukrajina 30.300 5,4

Mexiko 17.009 3,0

Velika Britanija 15.100 2,7

Španija 13.100 2,3

Azerbejdžan 11.600 2,1

Kanada 10.870 1,9

Ostale države 43.030 1,3

Skupno 597.917 100,00

2.6 Registracija in zaščita sort

Zaradi vedno večjega povpraševanja po malinah nastajajo nove sorte, ki morajo omogočati doseganje višjih pridelkov, imeti večje in bolj aromatične plodove z višjo vsebnostjo antioksidantskih molekul ter biti odporne na bolezni in škodljivce.

Vsaka sorta mora biti registrirana in je pod okriljem Evropske direktive (92/34/EEC; direktiva o trženju razmnoževalnega materiala sadik sadnih rastlin in sadik sadnih rastlin, namenjenih za pridelavo sadja) (FURS 2010), ki zagotavlja pridelovalcem, da so njihove Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 30 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

sadike zdrave, dobre kvalitete in da so navedeni podatki v deklaraciji točni. Kontrola proizvodnje in prodaje sortnega materiala vključuje identifikacijo sorte ter preverjanje odsotnosti pomembnih bolezni in škodljivcev. Vsaka sorta predstavlja intelektualno lastnino in je zaščitena z žlahtniteljsko pravico, ki si jo pridobi(jo) žlahtnitelj(i) oz. kreator(ji) sorte. Za zaščito intelektualne lastnine oz. žlahtniteljskih pravic je zelo pomembno, da je na razpolago metoda, ki omogoča hitro in natančno določitev oz. diferenciacijo sort. Zaščitijo se lahko sorte večine rastlinskih vrst, vključno z medrodovnimi in medvrstnimi križanci.

2.7 Vrednotenje genetske variabilnosti

Genetsko variabilnost lahko vrednotimo na več načinov. Najpomembnejša sta 2: na fenotipski ravni s pomočjo morfoloških deskriptorjev ali pa na molekulski ravni s pomočjo molekulskih markerjev. Za malinjake je značilen zelo velik razpon fenotipske variabilnosti (predvsem zato, ker ima na fenotipsko variabilnost vpliv tudi okolje) in zato je na osnovi morfoloških lastnosti oz. morfoloških ali fenotipskih markerjev zelo težko zanesljivo določiti genetsko sorodnost. Prav tako je njihova uporaba povezana s številnimi metodološkimi težavami (npr. vezanost na posamezne fenofaze razvoja).

2.7.1 Uporaba fenotipskih markerjev

Med najpogosteje opisane fenotipske značilnosti (deskriptorje) sodijo: značilnosti habitusa, razrast in velikost poganjkov, karakteristike stebla (čvrstost, barva, trnavost in voskavost), barva, struktura in število listov ter značilnosti socvetij, cvetov in plodu (velikost, oblika, barva, struktura in opaznost plodov ter velikost semen) (Agriculture and Agri-Food Canada 2014).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 31 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

2.7.2 Uporaba molekulskih markerjev

Novejše tehnike, kot so npr. molekulski markerji, nam omogočajo določanje genetske variabilnosti na molekulskem nivoju. Prednost molekulskih markerjev pred opisovanjem morfoloških lastnosti je njihova neodvisnost od okolja. Prav tako nismo odvisni od razvojnega stadija rastline in lahko proučujemo variabilnost tudi v času fiziološkega mirovanja (npr. pozimi).

Marker je fragment DNA, ki je značilen za določeno mesto v genomu. Lahko označuje katerokoli zaporedje DNA, ki ga lahko odkrijemo ter spremljamo njegovo dedovanje. DNA zaporedja ponavadi potekajo v smeri 5–3 in ponazarjajo vrstni red nukleotidov v DNA s pomočjo baz (adenina, gvanina, citozina in timina). Danes je na razpolago kar nekaj molekulskih markerjev, ki se razlikujejo po svojih lastnostih, informativnosti, ceni razvoja markerskega sistema in zahtevnosti tehnike. Po namenu preučevanja organizma lahko izbiramo med hibridizacijskimi markerji (RFLP) in PCR tehnikami (markerji RAPD, AFLP in mikrosateliti – SSR).

Polimorfizem dolžine restrikcijskih fragmentov (angleško poimenovanje – Restriction Fragment Length Polymorphism – RFLP) je najstarejši markerski sistem, ki je omogočil odkrivanje polimorfizma na nivoju DNA. Sama tehnika temelji na razrezu DNA z restricijskimi encimi. Nato se ti razrezani fragmenti DNA elektroforetsko ločijo ter se prenesejo na membrano. Sledi zaznavanje specifičnih fragmentov s pomočjo hibridizacije z radioaktivno sondo. Razlike fragmentov se opazijo na podlagi mutacij nukleotidnega zaporedja, kar spremeni restricijsko mesto (Karp in Edwards 1995).

Tehnika naključno namnoženega polimorfizma DNA (angleško poimenovanje – Randomly Amplified Polymorphic DNA – RAPD) je enostavna, saj ne vključuje hibridizacije. Temelji na namnoževanju neznanih predelov DNA z uporabo 1 začetnega oligonukleotida s poljubnim nukleotidnim zaporedjem v verižni reakciji s polimerazo (PCR). Razlike med Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 32 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

osebki se kažejo s prisotnostjo ali odsotnostjo določenega RAPD fragmenta ali markerja. Uporabljajo se pri molekulski karakterizaciji, identifikaciji sort in preučevanju filogenetskih odnosov sadnih vrst (Rafalski in Tingey 1993).

Polimorfizem dolžine namnoženih fragmentov (angleško poimenovanje – Amplified Fragment Length Polymorphism – AFLP) je tehnika, zasnovana na selektivnem namnoževanju restricijskih fragmentov, dobljenih z razrezom DNA z restricijskimi endunukleazami (Vos in sod. 1995). Prednost AFLP tehnike je velika ponovljivost rezultatov, velik polimorfizem AFLP markerjev, veliko število istočasno analiziranih lokusov v poskusu, uporabnost pri kompleksnih genomih ter možnost namnoževanja potencialno neskončnega števila markerjev brez predhodnega poznavanja nukleotidnega zaporedja preučevanega organizma (Rafalski 2002).

Enostavna ponovljiva zaporedja se imenujejo mikrosateliti (Simple Sequence Repeat – SSR) (Karp in Edwards 1995). Tehnike mikrosatelitskih markerjev se od tehnik AFLP in RAPD razlikujejo v tem, da se namesto naključnih lokusov, v PCR namnožujejo znani lokusi, ki so definirani z nukleotidnim zaporedjem para specifičnih začetnih nukleotidov. Namnoženi aleli se ločijo z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu visoke ločljivosti. Za vizualizacijo se uporablja rentgensko slikanje ali barvanje s srebrom. Za genotipiziranje DNA z mikrosatelitskimi markerji je popularna tudi uporaba fluroscentno označenih začetnih oligonukleotidov in zaznavanje namnoženih alelov z avtomatsko lasersko napravo, ki omogoča hitro nadaljnjo obdelavo rezultatov (Kozjak in sod. 2001).

Tradicionalne tehnike za razvoj SSR markerjev so navadno dolgotrajne in delovno intenzivne (Huang in sod. 2011, Hwang in sod. 2011, Wöhrmann in Weising 2011). Razvili so alternativno strategijo za prepoznavanje SSR markerjev, ki se uporablja za metode primerjalne genomike in se označujejo kot Expressed sequence tag – Simple sequence repeat EST – SSR. Ključna prednost EST – SSR markerjev je, da so pogosto bolj prenosljivi pri tesnih povezavah med rodovi glede na anonimni SSR pri neprevedenih regijah (UTRs) ali nekodiranju zaporedij (Pashley in sod. 2006, Chapman in sod. 2009). Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 33 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Poveča se tudi možnost prenosljivosti markerja preko meja med vrstami (Chabane in sod. 2005, Varshney in sod. 2005). Predvidevajo, da se razkrijejo enake stopnje polimorfizma v UTRs, najverjetneje zaradi evolucijskega trenda 3 nukleotidnih ponovitev v teh kodirnih regijah. EST – SSR so fizično povezani z izraženimi geni, zato predstavljajo potencialno funkcionalne markerje (Chabane in sod. 2005).

2.7.3 Mikrosateliti

Mikrosateliti so tandemsko kratka ponavljajoča zaporedja, ki so dolga 2–5 bp in se razlikujejo glede na dolžino razmeroma enakomerno razporejenih evkariontskih genomov in lahko služijo kot informativni polimorfni markerji (Roizes 1976, Hagelberg in sod. 1991, Armour in sod. 1994). Hamada in sod. (1982) so ugotovili, da se pri evkariontskih genomih število zaporedij spreminja. Giblje se od 100 bp pri nižjih evkariontih (kvasovkah) ter tja do več 10.000 pri višjih evkariontih, kar je pomemben podatek pri evolucijskem ohranjanju vrste. Z metodo izolacije so odkrili v človeškem genomu 24 polimorfnih mikrosatelitnih lokusov, s pomočjo katere so jih lahko oblikovali (Hagelberg in sod. 1991, Armour in sod. 1994).

Termin mikrosatelit je v začetku označeval samo ponovitve dinukleotidnega in trinukleotidnega motiva. Raziskave so pokazale, da se tip AT ponovitve najpogosteje pojavlja in sestavlja kar 74 % vseh dinukleotidnih mikrosatelitov. S 24 % zastopanostjo je sledila ponovitev GT/AC, medtem ko je ponovitev AC/GT sestavljala samo 1 %. Dinukleotidna ponovitev CG ni bila zasledena. Med trinukleotidnimi ponovitvami sta bila motiva TAT in TCT najpogostejša (Weber in May 1989). Beritze (1980) in Roizes (1976) sta ugotovila, da obstaja kinetična zapletenost teh nukleotidnih frakcij, ki se razlikuje med posameznimi sateliti.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 34 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Poznamo različna poimenovanja mikrosatelitov: STR (angl. Short Tandem Repeats – kratke tandemske ponovitve), SSR (angl. Simple Sequence Repeats – enostavna ponovljiva zaporedja), SSLP (angl. Simple Sequence Length Polymorphism – polimorfizem dolžin enostavnih zaporedij) in VNTR (angl. Variable Number of Tandem Repeats - spremenljivo število tandemskih ponovitev).

Glede na tip ponovitve osnovnega motiva so Tauzt in sod. (1986) poimenovali mikrosatelite:

 Popolne (sestavljeni so iz 1 osnovne ponovitve, ki se ponavlja brez prekinitve npr.: ctctctctctctctctctct).

 Nepopolne (1 ali več ponovitev vsebuje bazo, ki ni enaka osnovnemu motivu ponovitve npr.: ctctctctgtctctct).

 Prekinjene (angl. interrupted pure microsatellite) – osnovni motiv, prekinjen z insercijo 1 nukleotida ali več baznih parov, ki se razlikujejo od osnovnega motiva,

npr. (CA)4TA(CA)7 ali ctctctctgggctctct.

 Sestavljene (angl. compound microsatellite) – vključujejo 2 ali več mikrosatelitov, ki se med seboj razlikujejo po tipu ali motivu ponovitve npr.: ctctctctgatgatgatgat

ali (CT)22(CA)6.

Armour in sod. (1999) so mikrosatelite razdelili glede na dolžino osnovnega motiva v 3 skupine:

 Sateliti: sestavljeni so iz osnovnega nukleotidnega zaporedja, v dolžini do 200bp. Več teh baznih parov tvori skupaj satelit, ki ima dolžino nekaj megabaznih parov in predstavlja nekaj odstotkov genoma.

 Minisateliti: vsebujejo osnovno zaporedje, ki je sestavljeno iz več kot 10-ih nukleotidov. Ta zaporedja lahko dosežejo dolžino 0,5–30 kbp.

 Mikrosateliti: osnovno zaporedje je kratko in na posameznem lokusu tvori bloke. Dolgo je 20–100 bp. Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 35 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Analiza sekvenc je pokazala, da mikrosatelitni lokus prikazuje obsežno homoplazmo, kjer delci enakih velikosti razstavljajo drugačno strukturo zaporedja (Yoshimoto in sod. 1999). Naključno izbrani SSR lokusi z različnimi nukleotidi v sestavi in iz različnih vrst kažejo obsežno dolžino polimorfizmov. Ta preprosta zaporedja polimorfizmov je mogoče koristno izkoristiti za testiranje in ugotavljanje identitete, za populacijske študije in kartiranje genoma. Primer PCR pomnoževanja s SSR lokusom 3 genotipov diploidnih rastlin (P1, P2 in F1(P1xP2) prikazuje Slika 11. Rezultat amplifikacije (namnoževanje kratkih sekvenc DNA) so lise na gelski elektroforezi, ki nam prikazujejo mesto amplifikacije oz. dolžino fragmenta. Z računalniškim modeliranjem so prikazali oblike molekul satelitnih oligonukleaz, ki kažejo superhelično strukturo tandemskih ponovitev (Fann in sod. 2001).

Slika 11: Namnoževanje mikrosatelitskih lokusov (Schmidt 2009). Figure 11: Microsatellite amplification (Schmidt 2009).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 36 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Prednosti mikrosatelitov

 So lokusno specifični.

 Detekcija je enostavna s PCR namnoževanjem in elektroforetskim ločevanjem namnoženih fragmentov.

 Pogosto so polimorfni, kar omogoča identifikacijo sort in izdelavo unikatnih alelnih profilov.

 Zaradi velike gostote v genomu predstavljajo teoretično neomejeno število markerjev.

 Dedujejo se kodominantno, kar omogoča ločevanje homozigotov od heterozigotov in restrukcijsko križanje ter izdelavo rodovnikov.

 Ponujajo možnost avtomatizacije ter standardizacije določevanja dolžin alelov.

 Izolirani začetni oligonukleotidi iz 1. vrste so uporabni tudi pri 2. vrsti oz. pri ozko sorodnih vrstah znotraj rodu in v določenih primerih tudi med rodovi znotraj družine.

 Multipleksen PCR omogoča pomnoževanje do 5 lokusov v 1 sami PCR reakciji. Pri zelo optimiziranih sistemih z avtomatsko detekcijo je mogoče sočasno analizirati do 15 lokusov pri 1 vzorcu (Kozjak 2001).

 Uporabni so v najrazličnejših aplikacijah molekulske biologije, pri uporabi genetskih kart za identifikacijo posameznika ter za zgodnje študije populacije (Tautz 1989).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 37 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Slabosti mikrosatelitov

 Slaba prenosljivost mikrosatelitnih lokusov med različnimi vrstami rodu ali znotraj družine.

 Pojav nepovezanih izsekov amplifikacije, ki so posledica naključne homologije iz oligonukleotidov na drugih lokacijah (Tautz 1989).

 Identifikacija mikrosatelitskih lokusov posameznega organizma zahteva izdelavo in pregledovanje genomskih knjižnic, kar je dolgotrajen in cenovno drag postopek.

 Potrebno je optimizirati PCR reakcijo za vsak par začetnih oligonukleotidov oz. za vsak lokus posebej.

 Pri genotipizaciji z mikrosatelitnimi markerji se pojavljajo problemi, povezani s PCR pomnoževanjem. Določeni aleli se zaradi substitucij, insercij in delecij na mestih prileganja začetnih oligonukleotidov ne pomnožujejo. Te alele označujemo kot ničte alele.

 Zaradi zdrsa Taq polimeraze v času sinteze mikrosatelitov, predvsem pri pomnoževanju mono in dinukleotidnih mikrosatelitov, nastanejo številni PCR produkti različnih dolžin, kar otežuje določanje alelov (Schoetterer 2000).

 Nestabilnost mikrosatelitskih lokusov in posledično velika variabilnost mikrosatelitskih markerjev sta prispevala k popularnosti markerskega sistema in njegove uporabe v mnogih evolucijskih in genetskih študijah. Velik polimorfizem je posledica sprememb v številu ponovitev osnovnega motiva, za kar sta odgovorna predvsem 2 mehanizma, ki se verjetno dopolnjujeta (Eisen 1999).

 Pri mikrosatelitih igra veliko vlogo Taq polimeraza. Taq polimeraza je pomembna pri osvetljevanju neponovljive DNA kot tudi za dopolnitev celotnega mikrosatelita in ohranjanje specifičnosti števila alelov ponavljajočih se enot (Jeffreys 1988). V večih primerih pride do variabilnosti zaradi zdrsa DNA polimeraze in posledično nepravilnega parjenja med replikacijo (SSM – Slipped – Strand Mispairing) ter neučinkovitega DNA replikacijskega popravljalnega mehanizma (Tautz in sod. 1986). Mikrosatelitske ponovitve se zlahka izvijejo iz vijačnice v obliki zank. Nova Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 38 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

sintetizirana veriga bo tako v naslednjih replikacijah spremenila svojo dolžino, pri mikrosatelitu se to kaže v nastanku ali izgubi 1ali več ponovitev.

 Genomi iz različnih vrst so bili vpleteni v vrsto funkcij, vključno s predpisi in genskimi signali za pretvorbo gena in rekombinacijo ter replikacijo telomeraz. Mislili so, da se kopičijo zaradi zdrsa DNA med replikacijo in rekombinacijo. Želeli so sistematizirati obseg preprostosti DNA in genetsko naravo regij in tako računalniško izvedli iskanje knjižnic DNA zaporedja. Pokazali so, da so se skoraj vsi preprosti motivi pojavljajo 5–10 x pogosteje kot enakovredni naključni. Poleg tega je novi računalniški algoritem razkrival visoko stopnjo pojava novega kodiranja DNA. Univerzalni obstoj preprostih monotonih DNA zaporedij od spremenljivih permutacij do razmeroma kratkotrajnih zaporedij kažejo, da so zdrs DNA in podobni mehanizmi glavni vir genetske variabilnosti v vseh regijah genoma, ki niso predvidljive s klasičnim postopkom mutacij (Tautz in sod. 1986). Z in vitro raziskavami so dokazali, da je zdrs DNA polimeraze pogost pojav ter da je mutacijska stopnja večja v in vitro kot pa pri in vivo pogojih (Levinson in Gutman 1987, cit. po Štajner 2010). Na njen nivo vpliva število ponovitev in nukleotidno zaporedje osnovnega motiva, dolžina ponavljajoče se enote, DNA- zaporedje obrobnih regij, prekinitve v mikrosatelitu, stopnja rekombinacije in transkripcije (Schloetterer 2000).

2.8 Vrednotenje genetske variabilnosti z mikrosatelitnimi markerji

Mikrosatelitske markerje so uporabili pri številnih rastlinskih vrstah. Primer so kitajske krizanteme (Chrysanthemum morifolium Ramat.), kjer so jih uporabili za identifikacijo sort. Uporabili so 20 mikrosatelitskih začetnih oligonukleotidov pri 480 vzorcih ter na podlagi polimorfizma določili 5 specifičnih začetnih oligonukleotidov za posamezno sorto. To je pripomoglo k boljši identifikaciji in klasifikaciji krizantem. Z metodo grupiranja so raziskovali tudi genetsko variabilnost. Ugotovili so, da so bile izbrane sorte v skladu s hortikulturno razvrstitvijo. Na dendrogramu je bilo ugotovljenih 19 skupin (Zhang in sod. Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 39 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

2014). Metodo s prstnimi odtisi oziroma fingerprinting za identifikacijo sort so uporabili tudi Terzi in sod. (2005) na zrnih žit.

V literaturi so omenjeni tudi primeri uporabe mikrosatelitskih markerjev pri borovnicah (Hong in sod. 2014), različnih citrusih (Yildiz in sod. 2013), pri rodu Anthurium (Wang in Chuan 2013), vinski trti (Meredith in sod. 1999, Zulini in sod. 2005).

Pri malinjakih so mikrosatelitske markerje uporabljali: Pool in sod. (1981), Graham in sod. (2002), Graham in sod. (2004), Stafne in sod. (2005), Debnath (2007), Sargent in sod. (2007), Woodhead in sod. (2008), Graham in sod. (2009), Castillo in sod. (2010), Fernandez in sod. (2011), Woodhead in sod. (2013).

2.9 Postopek določevanja genetske variabilnosti z mikrosateliti

Postopek določevanja genetske variabilnost z mikrosateliti je sestavljen iz več faz med katere sodijo: izolacija deoksiribonukleinske kisline (DNA), verižna reakcija s polimerazo (Polymerase Chain Reaction – PCR) s katero namnožujemo fragmente ter elektroforeza mikrosatelitskih markerjev, ki vključuje agarozno in kapilarno gelsko elektroforezo, s katero ločimo namnožene fragmente in jim določimo dolžino.

2.9.1 Izolacija DNA

Evkariontske celice imajo jedro, ki na kromosomih vsebuje glavni dedni zapis organizma v obliki DNA. Poznamo 3 različne DNA (jedrno, mitohondrijsko in kloroplastno) (Lip in sod. 1999, 2001).

Jedrna DNA kodira večino genoma pri evkariontih in je ključna pri oblikovanju genotipov. Nahaja se v kromosomih, od katerih polovica izvira od matere, polovica pa od očeta. Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 40 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Izjema so le organizmi, ki se razmnožujejo s samooplojevanjem. Mitohondrijska in kloroplastna DNA se dedujeta le po materi (Wicke 2011).

Za določevanje genetske variabilnost je potrebno imeti kvalitetno DNA. Čeprav je postopek izolacije DNA iz rastlinskih tkiv dokaj dodelan, pa lahko obstajajo še vedno številni problemi, ki zahtevajo velike izkušnje in odgovarjajočo opremo (Varma in sod. 2007).

Poznamo različne metode izolacije DNA s klasično ekstrakcijo z heksadeciltrimetil amonijevim bromidom (CTAB metoda) in razne metode s kiti, kot sta npr. Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega) in Total DNA Purification Kit (Invitrogen) ter avtomatsko metodo izolacije z napravo QIAcube (Qiagen).

Ekstrakcija DNA z heksadeciltrimetil amonijevim bromidom (CTAB metoda)

Murray in Thompson (1980) sta razvila izvirno metodo CTAB za izolacijo DNA iz rastlinskega materiala dolžine 50 kbp in več, in sicer jedrne, kloroplastne in mitohondrijske. Lipp in sod. (1999, 2001) so odkrili, da jo je mogoče uporabiti tudi pri izolaciji DNA iz živil v postopku odkrivanja vsebnosti gensko spremenjenih organizmov (GSO). CTAB metoda se lahko uporablja kot referenčna metoda, ki olajša težavnost izolacije DNA iz rastlinskega materiala.

Doyle in Doyle (1990) sta predstavila postopek odstranjevanja nečistoč iz DNA, kot so npr. polisaharidi s CTAB metodo. DNA izolirana po CTAB metodi je zadovoljivo očiščena snovi, kot so polisaharidi in polifenoli, ki so načeloma težko odstranljivi in lahko motijo delovanje uporabljenih restrikcijskih endonukleaz. Metoda je v osnovi sestavljena iz 3 faz: lize celične membrane, ekstrakcije genomske DNA in njenega obarjanja. CTAB je kationski reagent, ki ga vsebuje začetni ekstrakcijski pufer. Ker ima podobno sestavo, reagent ujame proteine in lipide membrane v svojo strukturo in s tem lizira jedrno Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 41 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

membrano in membrano rastlinske celice. Pri pogojih nizke koncentracije soli, tvori CTAB netopen kompleks z nukleinskimi kislinami, če pa je koncentracija visoka, se kompleks z DNA raztaplja. Pufrsko kapaciteto raztopine zagotavlja Tris HCl, EDTA (etilendiamintetra ocetna kislina) pa veže magnezijeve ione (Mg2+) in s tem zmanjša aktivnost prisotnih encimov DNaz (encimi iz družine nukleaz), ki katalizirajo hidrolizo fosfordiesterskih vezi v DNA. Njihova naloga je kataliza razgradnje poškodovanih, postaranih ali odvečnih nukleinskih kislin pri celičnih procesih, ki razgrajujejo DNA. Za lažjo ekstrakcijo se lahko doda v 1. fazi izolacije tudi 10 µl destilirane vode. Nečistoče se odstranijo v fazi izpiranja s kloroformom, ki denaturira proteine in pospeši ločevanje vodne in organske faze. Pri pogojih nizke koncentracije soli, ko so nečistoče odstranjene in so v supernatantu, je DNA vezana v kompleksu s CTAB. V zadnji fazi se DNA pri pogojih zvišane koncentracije soli sprosti z detergenta in se ob dodatku izopropanola obori. Ostanki soli se odstranijo s spiranjem s 70 % etanolom (Murray in Thompson 1980).

2.9.2 Verižna reakcija s polimerazo (PCR)

Verižna reakcija s polimerazo je in vitro metoda, s katero logaritemsko pomnožujemo fragmente DNA s pomočjo encima DNA-polimeraze. S to metodo lahko kloniramo DNA, ne da bi za to potrebovali žive celice. Razvil jo je Kary Mullis leta 1983, za katero je leta 1993 prejel tudi Nobelovo nagrado za kemijo. Verižno reakcijo s polimerazo v osnovi sestavljajo 3 stopnje, ki se ponavljajo: denaturacija, prileganje začetnih oligonukleotidov in podaljševanje DNA (McPherson in Moller 2006), kar nam prikazuje Slika 12.

PCR ima prednost pred klasičnim kloniranjem s pomočjo bakterijskih celic, ker omogoča namnožitev specifičnega fragmenta DNA v samo nekaj urah. Pomnoževanje odsekov DNA poteka tako, da uporabimo 2 kratki molekuli DNA, ki sta komplementarni začetnemu in končnemu delu segmenta, ki ga želimo pomnožiti z dodatkomk encima, pufra in deoksiribonukleotidov (gradnike DNA). Reakcija poteka verižno; to pomeni, da se ciklično ponavlja. Pri vsaki ponovitvi se število kopij pomnoženega odseka podvoji, tako lahko po 20 ponovitvah reakcije dobimo iz 1 kopije DNA teoretično več kot milijon kopij. Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 42 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Temperatura reakcije se mora kontrolirano spreminjati. Za vezavo kratkih molekul DNA (začetnih oligonukleotidov) je namreč nujno, da je DNA fragment, ki ga namnožujemo v enoverižni obliki (DNA je običajno dvoverižna molekula), to pa dosežemo tako, da DNA za kratek čas segrejemo na 92 °C ali več (to stopnjo imenujemo denaturacija DNA). Da pride do prileganja začetnih oligonukleotidov na matrico je potrebno temperaturo ponovno znižati (37–55 °C), nato pa spet prilagoditi pogojem, ki so optimalni za delovanje DNA polimeraze (Brown 2007, McPherson in Moller 2006).

PCR poteka v posebnih aparatih, v katerih je mogoče programirati temperaturo, čas trajanja posamezne faze in število ponovitev posameznih ciklov itd. Reakcije potekajo v volumnih 20–100 μl. Pri klasični izvedbi, ki je še vedno najbolj pogosta, po končani reakciji produkte analiziramo z elektroforezo v agaroznem gelu (Brown 2007, McPherson in Moller 2006).

Slika 12: Verižna reakcija s polimerazo - PCR (Medchrome 2014). Figure 12: Polymerase chain reaction – PCR (Medchrome 2014). Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 43 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

2.9.3 Elektroforeza mikrosatelitskih markerjev

Za določevanje genetske variabilnosti z mikrosateliti se uporabljata agarozna gelska elektroforeza, pri kateri lahko optično določimo ločene fragmente ter kapilarna gelska elektroforeza, katera poleg natančne ločljivosti fragmentov prikaže tudi dolžine posameznih fragmentov.

2.9.3.1 Agarozna elektroforeza

Agarozna elektroforeza DNA je analitska metoda, s katero ločujemo, prepoznavamo in čistimo molekule DNA glede na njihovo velikost. DNA molekule, ki jih hočemo analizirati, damo v viskozni gel, ki otežuje njihovo gibanje. Za gel se uporablja agaroza – linearni polisaharid, ki je topen v vroči vodi oz. v ustreznem pufru, pri ohlajanju pa polimerizira in tvori gel. Prednost gela je enostavna uporaba. Ponavadi uporabljamo gele z 0,7–3 % agarozo (Szoke in sod. 1999). Gel je priključen na električno napravo, s katero ustvarimo električno polje, pod vplivom katerega se začnejo zaradi negativnega naboja fosfatne skupine na verigi DNA fragmenti pomikati proti pozitivnemu polu. Ločitev teh fragmentov dosežemo z izkoriščanjem različne mobilnosti različno velikih molekul. Daljše molekule potujejo skozi gel dlje časa, ker se soočajo z večjo silo trenja (Tiselius 1964, Gross in sod. 1995, Garcia in sod. 1998). Po določenem času električni tok prekinemo in analiziramo ločene fragmente DNA. Različno velike fragmente DNA nato obarvamo s fluorescentnim barvilom, kot je npr. etidijev bromid (EtBr) ali novejši SYBR green. Na gelu vidimo različne proge, ki predstavljajo različne skupine molekul z različnimi molekulskimi masami (Szoke in sod. 1999).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 44 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

2.9.3.2 Kapilarna elektroforeza

Kapilarna elektroforeza je separacijska analizna metoda, kjer poteka ločitev analitov v stekleni kapilari, napolnjeni z elektroforeznim gelom, ob priključitvi visoke napetosti. Zaradi razlike v napetosti med anodo in katodo začnejo delci z nabojem potovati. Na njihovo potovanje vpliva še elektroosmozni tok, ki nastane zaradi negativnega naboja silanolnih skupin ob steni kapilare in privlači katione, ki se zaradi elektroosmoznega toka gibljejo neodvisno od naboja v isto smer. Molekule, ki se ločijo, na koncu kapilare preidejo skozi detektor, kar nam da signale, ki se zapišejo na elektroforegramu (Gros in sod. 1995, Garcia in sod. 1998). Hayashi in sod. (2005) so napisali protokol za kapilarno elektroforezo, ki temelji na CEQ operativnemu sistemu. Sistem CEQ povezuje vzorce iz grafov, ki so nato vidni na sliki za analizo rezultatov (Gross in sod. 1995, Garcia in sod. 1998). Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 45 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

3 MATERIAL IN METODE DELA

3.1 Material

3.1.1 Rastlinski material

V raziskavo smo vključili 161 genotipov malinjakov, iz katerih smo izolirali DNA (Priloga 1). Ker so se nekateri vzorci ponovili, smo na osnovi (najvišje) izmerjene koncentracije DNA izbrali 117 vzorcev, ki smo jih uporabili za molekulske analize. V prvem delu je bilo novejših kultiviranih in lokalnih sort (31), ter pol-divji in divji genotipi malinjakov (86). V drugem delu, smo pa od kultiviranih in lokalnih sort (31) odbrali samo 7. Rastlinski material smo zbirali v letih 2010–2013 ob ostankih različnih srednjeveških naselbin, na kmečkih vrtovih in naravnih rastiščih na različnih lokacijah v severovzhodni Sloveniji, del materiala pa smo dobili iz genskih bank tujih držav ter od pridelovalcev in prodajalcev sadilnega materiala.

Za molekulske analize smo pobirali mlade in zdrave liste, ki smo jih v hladilni torbi prenesli v laboratorij, kjer smo iz njih isti ali naslednji dan izolirali DNA. Zaradi večje preglednosti in možnosti naknadnega preverjanja smo vzorčene genotipe posadili tudi na polje genske banke na posestvu Fakultete za kmetijstvo in biosistemske vede.

3.1.1.1 Novejše kultivirane in lokalne sorte

Od novejših kultiviranih sort smo DNA izolirali iz 'Glen Ample' (2 različna izvora), 'Tulameen', 'Meeker' (2 različna izvora), 'Polka' (3 različni izvori), 'Samodiva', 'Schopska alena' (2 različna izvora), 'Iskra' (2 različna izvora), 'Latham', 'Bolgarski rubin', 'Eva', 'Elida', 'Tula magic', 'Willamette', 'Cascade Delight', 'Heritage', 'Himbo Top' (2 različna izvora), 'Nr 26 TR', 'Royalty', 'Rose de Core', 'Sicoly', 'Dieffenbach', 'Sugana' ter 'Autumn Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 46 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Bliss' (Preglednica 5). Analizirane kultivirane sorte izvirajo iz različnih držav (Bolgarija, Francija, Slovenija in Švica).

Preglednica 5: Kultivirane sorte malinjakov, vključene v molekulske analize, in njihov izvor. Table 5: The list of cultivated varieties of red raspberries included in molecular studies, and their origin.

Vzorec za analizo Kultivar / Genotip Lokacija / Izvor

R1 'Glen Ample ' ** Predikat*(Slovenija)

R2 'Tulameen' ** Predikat

R3 'Meeker' ** Predikat

R4 'Polka' ** Predikat

R10 'Iskra' Bolgarija

R11 'Samodiva' ''

R12 'Schopska alena' ''

R13 'Latham' ''

R14 'Iskra' Švica

R15 'Bolgarski rubin' ''

R16 'Schopska alena' ''

R17 'Eva' ''

R18 'Elida' ''

R19 'Cascade Delight' Švica

R20 'Glen Ample' ''

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 47 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 5: se nadaljuje: Table 5: (cont.)

Vzorec za analizo Kultivar / Genotip Lokacija / Izvor

R21 'Tula magic' ''

R22 'Willamette' ''

R23 'Meeker' ''

R44 'Polka' ''

R45 'Heritage' ''

R46 'Himbo' ''

R47 'Nr 26 TR' ''

R55 'Royalty' Francija

R56 'Rose de Core'** Francija

R60 'Sicoly' ** Francija

R61 'Dieffenbach' ** Švica

R62 'Himbo Top' ''

R63 'Sugana' ''

R64 'Autumn Bliss' ''

R65 'Heritage' ''

R66 'Polka' ''

*slovensko privatno podjetje (Zdole pri Brežicah), ki se ukvarja s trženjem sadilnega materiala jagodičevja

** sorte, ki so bile vključene v identifikacijo sort z mikrosatelitskimi markerji (2.del raziskave)

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 48 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

3.1.1.1.1 Osnovni podatki o nekaterih tržno najbolj zanimivih proučevanih kultiviranih sortah

'Tulameen' je sorta, ki izvira iz Kanade, kjer ja gojijo že od leta 1990. Je križanec med 'Nootka' × 'Glen Prosen'. Zoreti začne v 2. polovici junija ter zori zelo dolgo in daje visok pridelek. Plodovi so zelo veliki, sočni in okusni ter svetlo rdeči (Slika 13). Ta sorta je dovzetna za sadno gnilobo (Monilinia fructigena), sivo plesen (Botrytis cinerea) in malinov ožig (Elsinoe veneta). Občutljiva je tudi na mraz in sušico malin (Didymella applanate). Odporna pa je na virus malinovega mozaika, ki ga prenašajo listne uši (Aphis idaei in Amphorophora rubi) (OMAFRA 2013, Martin in sod. 2013).

Slika 13:Sorta 'Tulameen' (trajnice-carniola.com 2013). Figure 13: The variety 'Tulameen' (trajnice-carniola.com 2013).

'Glen Ample' so začeli gojiti na Škotskem leta 1998. Izhaja iz sort 'Glen Prosen' in 'Meeker'. Je srednje bujne rasti, pokončna, s poganjki brez trnov. Zori pozno. Plodovi so veliki in mesnati (Slika 14). Barva je dokaj neprivlačna, svetlo rdeča, kar navajajo tudi kot slabost pri prodaji. Sorta je odporna na uši, dovzetna pa za vektorska virusa (Raspberry Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 49 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

yellow net virus – RYNV in Raspberry leaf mottle virus – RLMV) (OMAFRA 2013, Martin in sod. 2013).

Slika 14: Sorta 'Glen Ample' (Hargreave plants 2014). Figure 14: The variety 'Glen Ample' (Hargreave plants 2014).

'Autumn Bliss' je sorazmerno stara sorta, ki jo v Angliji pridelujejo že od leta 1984. Poganjki so srednje dolgi, z nekaj bodicami. Zori okrog 10 dni prej kot sorta 'Heritage'. Tej sorti pripisujejo izredno velike plodove (Slika 15). V povprečju so težki približno 2,7 g. Dovzetna je za virus pritlikavosti, odporna pa na virus mozaika. Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 50 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Slika 15: Sorta 'Autumn Bliss' (About garden 2013). Figure 15: The variety 'Autumn Bliss' (About garden 2013).

'Heritage' je starejša ameriška sorta iz leta 1969, ki izvira iz New Yorka,. Je križanec med sortami ('Milton' × 'Cuthbert') × 'Durham'. Zori zelo pozno, v sredini septembra. Poganjki so močni, visoki in trnasti. Sorta je izredne kakovosti in dobrega okusa. Plodovi so srednje veliki in težki 1,8–2,2 g (Slika 16). Odporna je na veliko škodljivcev, občutljiva pa na virus pritlikavosti in virus mozaika. Ni odporna na mraz, zato se priporoča za sajenje v južnih in jugozahodnih regijah.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 51 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Slika 16: Sorta 'Heritage' (Poljoprivredni saveti 2013). Figure 16: The variety 'Heritage' (Poljoprivredni saveti 2013).

'Polka' sodi med 2 x rodne malinjake in prihaja iz Poljske. Izvira iz proste oprašitve sorte 'Autumn Bliss'. Poganjki so pokončni in občutljivi na virusne bolezni. Zori zgodaj, sredi junija. Odlikujejo jo odlična kakovost plodov ter veliki, okusni in mesnati plodovi (Slika 17).

Slika 17: Sorta 'Polka' (OMAFRA 2013). Figure 17: The variety 'Polka' (OMAFRA 2013). Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 52 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Sorta 'Himbo' se pojavlja tudi z imenom 'Himbo Top'. Je donosna švicarska sorta, z zelo močnimi stebli, ki navadno potrebujejo oporo. Plodovi so razmeroma majhni, svetlo rdeči (Slika 18). Težave s škodljivci niso znane (OMAFRA 2013).

Slika 18: Sorta 'Himbo' ali 'Himbo Top' (OMAFRA 2013). Figure 18: The variety 'Himbo' or 'Himbo Top' (OMAFRA 2013).

3.1.1.2 Pol-divji, divji in primitivni genotipi

Pol-divje, divje in primitivne genotipe malinjakov smo pobirali predvsem na severovzhodnem delu Slovenije. Tistim, ki smo jih pobrali v okolici srednjeveških gradov in kartuzijanskih samostanov, smo dodatno navedli še mikrolokacijo. Genotipe, ki smo jih pobrali znotraj ali zelo blizu gradu in ob stenah samostana, smo označili s črko A. S črko B smo označili genotipe, ki smo jih pobrali 100–200 m od gradu ali samostanske stavbe, s C pa vzorce, ki so bili pobrani iz naselij oddaljenih do dveh kilometrov stran od gradu ali samostanske zgradbe (Slika 21 in Preglednica 6). Nekaj genotipov smo dobili tudi iz Bolgarije.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 53 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 6: Pol-divji, divji in primitivni genotipi malinjakov, njihov izvor, lokacija, mikrolokacija ter opis vključeni v molekulske analize. Table 6: Samples of wild, semi-wild and primitive genotypes of red raspberries collected at various locations and micro-locations.

Oznaka vzorca Lokacija / Izvor Mikrolokacija Opis kultivarja

R5 Maribor (na vrtu) Najverjetneje pol-divji ali primitivni genotip

R24 Studenški gozd 1 Divji genotip

R25 Studenški gozd 2 Divji genotip

R26 Studenški gozd 3 Divji genotip

R27 Avtobusna postaja, grad Hompoš C Najverjetneje divji genotip

R35 Vila Pivola ob gradu Hompoš ''

R40 Hočko Pohorje C Najverjetneje divji genotip

R41 '' C ''

R42 '' C ''

R43 '' C ''

R48 '' Divji genotip

R49 '' Divji genotip

R50 '' B Najverjetneje pol-divji ali primitivni genotip

R51 '' B ''

R52 '' B ''

R53 '' B ''

R54 '' B ''

R57 Pod Kumom Divji genotip

R58 Kopitnik nad Zidanim Mostom ''

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 54 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 6: se nadaljuje Table 6: (cont.)

Vzorec za analizo Lokacija / Izvor Mikrolokacija Opis kultivarja

R59 Pohorje ''

R67 Ob gradu Borl, Ptuj Divji genotip

R68 Meljski hrib, Maribor ''

R71 Rače, Delavska (na vrtu) Pol-divji genotip

R72 Rački ribniki, Rače Divji genotip

R73 Grad Vurberk, Ptuj ''

R74 Jakobski dol ''

R75 Orehova vas, Piškova ul., Rače(na Pol-divji genotip vrtu )

R76 Pernica ''

R77 Fram 152b, Rače- Fram ''

R78 Piramida Divji genotip

R79 Sv. Tomaž pri Ormožu (na vrtu) Pol-divji genotip

R80 Ješenca, Rače ''

R81 Piramida A ''

R82 Piramida B ''

R83 Trebnje A, Kidričeva 10 (na vrtu) Pol-divji genotip

R84 Trebnje B, Kidričeva 10 ''

R85 Kopivnik nad Framom ''

R86 Pesnica Divji genotip

R87 Malečnik 1 ''

R88 Malečnik 2 ''

R89 Zrkovci '' Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 55 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 6: se nadaljuje Table 6: (cont.)

Vzorec za analizo Lokacija / Izvor Mikrolokacija Opis kultivarja

R90 Bolgarija 1 Divji genotip

R91 Bolgarija 2 ''

R92 Bolgarija 3 ''

R93 Bolgarija 4 ''

R94 Bolgarija 5 ''

R103 Jurklošter (št. 19), Jurklošter pri C Najverjetneje pol-divji Laškem (na vrtu) genotip

R105 '' C ''

R106 '' C ''

R107 Kartuzijanski samostan Jurklošter A Najverjetneje primitivni (na vrtu ob obzidju) genotip

R111 Kartuzijanski samostan Jurklošter A Najverjetneje primitivni (ob obzidju) genotip

R113 '' A ''

R118 Kartuzijanski samostan Žiče A Najverjetneje primitivni (znotraj obzidja) genotip

R119 '' A ''

R121 Kartuzijanski samostan Žiče (ob B Najverjetneje divji ali gozdu) pol-divji genotip

R122 '' B ''

R124 '' B ''

R126 Kartuzijanski samostan Žiče, vas C Najverjetneje pol-divji Špotalič (št.5) (na vrtu) genotip

R127 '' C ''

R128 Grad Negova (grajski vrt) A Najverjetneje primitivni ali pol-divji genotip

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 56 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 6: se nadaljuje Table 6: (cont.)

Vzorec za analizo Lokacija / Izvor Mikrolokacija Opis kultivarja

R129 '' A ''

R130 '' A ''

R131 '' A ''

R132 '' B ''

R133 '' B ''

R134 Grad Negova, Negova (št.5) (na C Najverjetneje divji ali vrtu) pol-divji genotip

R135 '' C ''

R136 '' C ''

R137 Grad Cmurek (Trate 7a) (na vrtu) A Najverjetneje primitivni ali pol-divji genotip

R138 '' A ''

R139 '' A ''

R140 Grad Hrastovec (na vrtu) A Najverjetneje primitivni ali pol-divji genotip

R141 '' A ''

R142 '' A ''

R143 Grad Velika Nedelja (na vrtu) A Najverjetneje primitivni ali pol-divji genotip

R144 '' A ''

R145 Velika Nedelja (št. 3) (na vrtu) B Najverjetneje pol-divji genotip

R151 Grad Velika Nedelja, Sodinci 1 (na C Najverjetneje pol-divji vrtu) genotip

R152 '' C ''

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 57 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 6: se nadaljuje Table 6: (cont.)

Vzorec za analizo Lokacija / Izvor Mikrolokacija Opis kultivarja

R153 Grad Ravno polje, Kungota pri A Najverjetneje primitivni Ptuju ( ob obzidju) ali pol-divji genotip

R158 Grad Ravno polje, Kungota pri B Najverjetneje pol-divji Ptuju (na vrtu) genotip

R159 '' B ''

R160 '' B ''

R161 '' C ''

R162 '' C ''

R163 '' C ''

Ves rastlinski material, vključen v raziskavo, smo posadili v gensko banko na posestvu Fakultete za kmetijstvo in biosistemske vede v Pivoli. Rastline smo posadili na greben, pokrit s črno, perforirano zastirno folijo. Sadili smo jih v različnih terminih v aprilu, maju in juniju v letih 2010, 2011, 2012 in 2013. Ko so stebla zrasla do določene višine, smo jih pritrdili s plastičnimi sponkami, kot je prikazano na spodnjih slikah (Slika 19).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 58 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Slika 19: Genska banka malin FKBV: A – malinjaki, posajeni na črni foliji; B – rastline, pritrjene s plastičnimi sponkami (Foto: Novak 2012). Figure 19: The gene bank of raspberries at the Faculty of Agriculture and Life Sciences: A – A detail from the plot with red raspberries planted on a black foil; B – Plants, attached with plastic clips (Photo: Novak 2012).

3.1.1.3 Opis lokacij

Del naše raziskave je zajemal raziskave hipotetsko srednjeveških malinjakov. Zanimalo nas je, če se oz. v čem se razlikujejo od današnjih kultiviranih sort. Da smo lahko določili vse parametre raziskave, smo vključili tudi kratko zgodovino srednjeveških gradov in kartuzijanskih samostanov, ob katerih smo nabirali vzorce Osredotočili smo se na severovzhodni del Slovenije. Na spodnji sliki (Slika 20) in v preglednici (Preglednica 7) so prikazane lokacije gradov in samostanov s koordinatami, kjer smo pobirali naše vzorce.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 59 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Slika 20: Lokacije pobiranja vzorcev (Foto: Novak 2014). Figure 20: Map indicating the locations of the collected samples (Photo: Novak 2014).

Preglednica 7: Lokacije vzorčenja na osnovi zemljevida (Slika 20). Table 7: Sampling locations based on the map presented in Fig. 20.

Ime gradu ali samostana Lokacija (Slika 22) in koordinate

Grad Cmurek / Mureck A - 46°42′4.68″N 15°47′15.99″E

Grad Hompoš B - 46°30′15.46″N 15°37′25.47″E

Grad Hrastovec C - 46°34′36.15″N 15°45′15.45″E

Grad Negova D - 46°36′32.21″N 15°56′13.51″E

Grad Velika Nedelja E - 46°25′25.81″N 16°6′57.54″E

Grad Ravno polje F - 46°25′50.8″N 15°46′54.49″E

Kartuzijanski samostan Jurklošter G - 46° 05.691'N 15° 20.658'E

Kartuzijanski samostan Žiče H - 46° 18′ 39.96″N 15° 23′ 33.39″E Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 60 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Vzorce za DNA analizo smo pobirali na različnih mestih. Sliki 20 in 21 prikazujeta lokacije in mesta vzorčenja. Mikrolokacija mesta A predstavlja notranjost obzidja oz. neposredno bližino gradu ali samostana, s črko B smo označili vzorce, ki smo jih pobirali 100–200 m od gradu ali samostanske stavbe, mesta, označena s črko C, pa predstavljajo naselje do 2 km proč od gradu ali samostanske zgradbe. Podrobnejši geografski opis rastlinskega materiala, pobranega na določeni lokaciji, je viden v Preglednici 7.

Slika 21: Mesta vzorčenja: A – znotraj ali zelo blizu gradu ali ob stenah samostana, B – 100–200 m od gradu ali samostanske stavbe, C – naselje do 2 km od gradu ali samostanske zgradbe (Foto: Novak 2014). Figure 21: Sampling sites: A – inside or very close to a castle or a monastery walls, B – 100–200 m away from a castle or a monastery building, C – a settlement up to two km away from a castle or a monastery building (Photo: Novak 2014).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 61 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

3.1.2 Laboratorijska oprema

Pri delu smo se držali načel laboratorijske prakse, ki so uveljavljena pri delu, povezanem z molekulskimi markerji. Uporabili smo aseptično komoro, proizvajalca Air Clean, Star Lab, ki omogoča pripravo PCR produktov v sterilnih razmerah.

Za sterilizacijo vode in delovnih raztopin smo uporabili avtoklav proizvajalca Astell.

Pri postopku izolacije DNA smo uporabili vodno kopel proizvajalca Lauda DR R.Wobser, Nemčija. Koncentracijo DNA smo določili s pomočjo fluorometra proizvajalca Hoefer 3DQ 300, San Francisco, ZDA.

Za kvalitativno določanje DNA in PCR produktov smo uporabili agarozno gelsko elektroforezo proizvajalca Bio-rad, Power pack basic, Hercules, Kalifornija, ZDA.

Polimeraza verižne reakcije (PCR) je potekala v cikličnem termostatu Biometra T Professional (Goettinger, Nemčija).

Za shranjevanje vzorcev smo uporabili hladilnik in zamrzovalnik Gorenje. Večino reagentov za molekulske markerje smo shranili pri –20 °C.

Vzorce smo centrifugirali s centrifugo proizvajalca Eppendorf 5430, Hamburg, Nemčija, pri 11.000 obratih na min.

Za tehtanje vzorcev in pripravo raztopin ter reagentov smo uporabili tehtnico proizvajalca Mettler Toledo PB303-S, Švica, in 2 x prečiščeno vodo, dobljeno s pomočjo aparata Millipore. Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 62 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Za pripravo in shranjevanje rastlinskih materialov smo uporabili epruvete velikosti 1,5 ml in 2 ml proizvajalcev Brand ter Starstedt. Za pripravo PCR produktov pa večnamenske plošče (P96) proizvajalca Eppendorf.

3.2 Metode dela

3.2.1 Izolacija DNA

Izolirali smo 161 (Priloga 1) (uporabili 117) različnih DNA iz mladih zelenih listov rastlin, v 2, pri nekaterih vzorcih, pa tudi v več ponovitvah. Za izolacijo celokupne genomske DNA malin smo uporabili CTAB metodo po uveljavljenem protokolu (Kump in sod. 1992). Vsak vzorec smo izolirali v vsaj 2 ponovitvah. V terilnico smo dali 1–2 cm2 svežega tkiva mladih in zdravih listov in ga ob dodatku 2 ml (2 % w/v) CTAB ekstrakcijskega pufra (Sigma) [1,4 M NaCl (Merck), 20 mM EDTA (etilendiamintetraocetna kislina), 100 mM Tris-HCl (pH 8.0) (Sigma), 0,2% β- merkaptoetanol (Fluka AG)], ki smo ga sami pripravili in je bil predhodno segret na 68 °C, ročno homogenizirali v terilnici. Homogenizate smo nato prelili v 2 ml mikrocentrifugirke in jih inkubirali 1,5 h v vodni kopeli pri 68 °C. Vzorce smo občasno premešali. Sledilo je 10 min centrifugiranje pri 11.000 obratih na min (Centrifuga Eppendorf 5430). Supernatante smo odlili v sveže mikrocentrifugirke ter dodali 600 µl mešanice topil kloroform: izoamilalkohol, pripravljene v razmerju 24:1. Nato smo jih ponovno centrifugirali 15 min pri 11.000 obratih na min. Supernatante smo nato odpipetirali v nove 1,5 ml mikrocentrifugirke in DNA oborili z dodatkom 60 µl 3 M natrijevega acetata in 600 µl ledeno-hladnega izopropanola. Vzorce smo 30 min pustili v zamrzovalniku na –20 °C in jih nato ponovno centrifugirali 10 min pri 11.000 obratih na min. Supernatante smo odpipetirali in zavrgli, usedline vsakega vzorca DNA pa sprali s 600 µl 70 % etanola in jih na zraku do suhega posušili ter jih nato raztopili v 100 µl TE pufra [10 mM Tris- HCl, 1 mM EDTA (pH 8,0)]. Tako izolirane vzorce DNA smo za nadaljnjo uporabo shranili v hladilniku na 4 °C, na dolgi rok pa na –20°C.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 63 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

3.2.2 Merjenje koncentracije DNA

Koncentracijo DNA smo merili s fluorometrom proizvajalca (Hoefer DQ 300, Slika 26). Za kalibracijo fluorometra smo uporabili ustrezen standard (2 µl) DNA v koncentraciji 100 ng/µl (raztopina pripravljena v 1 x TNE pufru). Pri merjenju smo uporabili barvilo benzimidiazol, imenovan Hoechst 33258, ki smo ga dali v delovno raztopino 1 × TNE pufer [0,1 M NaCl (Merck), 10 mM Tris HCl (Sigma), 1mM EDTA (etilendiamintetraocetna kislina; pH 7,4] v končni koncentraciji 0,1 µg/ml. Delovno raztopino smo vsakič pripravili svežo. Steklenico z raztopino smo zavili v alufolijo, ker je barvilo občutljivo na svetlobo. V dobro oprano stekleno kiveto smo odpipetirali 2 ml delovne raztopine in dodali 2 µl DNA vzorca. Kiveto smo dali v odprtino in sledili navodilom na aparatu in odčitali koncentracijo v ng/µl. Ta postopek smo ponovili za vsak vzorec posebej.

3.2.3 Agarozna elektroforeza

Za kvalitativno določanje izolirane DNA in PCR produkta smo uporabili agarozno gelsko elektroforezo (Bio-rad power pack basic, Hercules, Kalifornija, ZDA, Slika 27). Za ugotavljanje kvalitete in oceno izolirane DNA, smo vzorce nanesli na 3 % agarozni gel. Za posodo velikosti 15 × 10 cm smo pripravili 80 ml agaroznega gela tako, da smo zatehtali 2,4 g agaroze (Promega, Madison, Wisconsin, ZDA) in dodali 80 ml 3 × TBE pufra. Pufer 3 × TBE smo pripravili z razredčitvijo 10 × TBE pufra [TRIS (hidroksimetilaminometan), borova kislina, EDTA (pH 8)], (Promega, Madison, Wisconsin, ZDA). Agarozo smo raztopili v mikrovalovni pečici in jo nato ohladili na 50–60 °C ter gel previdno vlili na nosilec za gel. Takoj nato smo namestili glavnik in počakali, da se je gel strdil (približno 20 min). Ko smo previdno odstranili glavnik, so v gelu ostale jamice (žepki), v katere smo nanesli vzorce, kar nam prikazuje spodnja slika (Slika 22).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 64 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Slika 22:A – priprava vzorcev DNA; B – nanašanje vzorcev na elektroforezo (Foto: Novak 2012). Figure 22: A – Preparation of DNA samples; B – pipetting of samples (Photo: Novak 2012).

V nastale žepke smo nanašali vzorce DNA (2 µl), ki smo jih predhodno pomešali s 3 µl pripravljenega SYBR Green® barvila (Quigen, Duesseldorf, Nemčija) na koščku parafilma (Slika 22A). S pipeto smo dobro premešali DNA in barvilo ter nato prenesli celoten volumen v žepke na gelu (Slika 22B). Elektroforeza je tekla v 3 × TBE pufru pri sobni temperaturi in napetosti 75 V, 30 min. Po končani elektroforezi smo naredili slike gelov na UV transiluminatorju pri valovni dolžini 302 nm.

3.2.3 Redčenje koncentracij DNA

Izolirano DNA smo za nadaljnje analize razredčili na koncentracijo 4 ng/µl v 2 x destilirani in avtoklavirani vodi. Redčili smo tako, da smo v mikrocentrifugirko dali po 2 µl DNA in dodali potrebno količino vode, ki smo jo izračunali po formuli:

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 65 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Izmerjena koncentracija

‒‒‒‒‒‒‒‒‒‒‒‒‒‒‒‒‒‒‒‒‒‒ * 2 – 2 = Količina vode 4 …(1)

Tako razredčene vzorce smo hranili v hladilniku pri 4 °C.

3.2.4 Mikrosatelitski markerji

Za mikrosatelitske analize smo uporabili 19 začetnih oligonukleotidov (primerjev), ki so jih v predhodnih študijah razvili s pomočjo genskega mapiranja Castillo in sod. (2010) ter Graham in sod. (2004). Seznam 19 začetnih oligonukleotidov z optimalno temperaturo, potrebno za prileganje in cikli, so prikazani v spodnji preglednici (Preglednica 8). Lokusno specifični začetni oligonukleotidi so bili izdelani pri podjetju Sigma (ZDA). Liofilizirane začetne oligonukleotide smo raztopili v TE pufru, v koncentraciji 500 pikomol/µl in jih hranili na –20 °C. Začetni oligonukleotidi so bili označeni s fluorescentnim barvilom Cy 5 oz. Cy 5,5. 2 različni barvili sta bili uporabljeni zaradi lažjega ločevanja produktov, ki imajo podobno velikost alelov.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 66 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 8: 19 SSR začetnih oligonukleotidov uporabljenih v molekulskih analizah. Table 8: A list of 19 SSR primers used in the analyses.

Začetni Nukleotidno zaporedje začetnih Mikrosatelitska Velikost Tm Cikli Referenca oligonukleotid oligonukleotidov (5`- 3`) ponovitev namnoženih fragmentov (bp) (°C)

Rim017 F: GAAACAGGTGGAAAGAAACCTG (TG)6 185-205 59 25 Castillo in sod. 2010 R: CATTGTGCTTATGATGGTTTCG

Rub 262 F:TGCATGAAGGCGATATAAAGG (AG)15 217-225 59 30 Graham in sod. 2004 R:TCCGCAAGGGTTGTATCCTA

Rim015 F: CGACACCGATCAGAGCTAATTC (ATC)5 349-361 59 30 Castillo in sod. 2010 R: ATAGTTGCATTGGCAGGCTTAT

Rub 228 F:TGGACAGCTTTGTGCAGAGT (GA)41 118-150 59 25 Graham in sod. 2004 R:GCTTGCTTGTATCTCCATTGC

Rub 277 F:GCCCCATCCTGTACAAAGAA (A)11 (AG)8 234-250 59 25 Graham in sod. 2004 R:TTGCAACAAAGGTACGTAATGG

Rhm 021 F: CAGTCCCTTATAGGATCCAACG (TC)6 278-294 55 30 Castillo in sod. 2010 R: GAACTCCACCATCTCCTCGTAG

Rhm 023 F: CGACAACGACAATTCTCACATT (CAT)5 116-195 55 30 Castillo in sod. 2010 R: GTTATCAAGCGATCCTGCAGTT

Rhm 001 F: GGTTCGGATAGTTAATCCTCCC (CA)7 233-245 55 30 Castillo in sod. 2010 R: CCAACTGTTGTAAATGCAGGAA

Rhm 011 F: AAAGACAAGGCGTCCACAAC (TC)18 270-319 55 30 Castillo in sod. 2010 R: GGTTATGCTTTGATTAGGCTGG

Rim019 F: ATTCAAGAGCTTAACTGTGGGC (AG)12 167-219 55 30 Castillo in sod. 2010 R: CAATATGCCATCCACAGAGAAA

Rhm003 F: CCATCTCCAATTCAGTTCTTCC (TG)10 191-216 55 30 Castillo in sod. 2010 R: AGCAGAATCGGTTCTTACAAGC

Rhm043 F: GGACACGGTTCTAACTATGGCT (AC)6 344-380 55 30 Castillo in sod. 2010 R: ATTGTCGCTCCAACGAAGATT

Rub 25 F:GCCAAACACACCGTTATCTT (GT)8 144-150 59 30 Graham in sod. 2004 R:CATTACCACACGCTTGATGC

Rub 157 F:ACTCTGCTACCGCCAGAAAT (CT)47 282 59 30 Graham in sod 2004 R:CAATTCCCAAGCTCAGTGAAG Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 67 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 8: se nadaljuje Table 8: (cont.)

Začetni Nukleotidno zaporedje začetnih Mikrosatelitska Velikost Tm Cikli Referenca oligonukleotid oligonukleotidov (5`- 3`) ponovitev namnoženih fragmentov (bp) (°C)

Rhm 018 F: CACCAATTGTACACCCAACAAC (CTT)6 381 55 30 Castillo in sod. 2010 R: GATTGTGAGCTGGTGTTACCAA

Rub 108 F:CCCTACACATCGATCGCTTAC (CT)9 (AT)5 149-174 59 30 Graham in sod. 2004 R:AACACTCCAAATGCCCAATC

Rig 001 F: TGTCCGATCCTTTTCTTTGG (AT) 6 338-349 55 30 Castillo in sod. 2010 R: CGCTTCTTGATCCTTGACTTGT

Rub 223 F:TCTCTTGCATGTTGAGATTCTATT (AT)4 (TA)8 138-151 59 30 Graham in (AT) sod. 2004 R:TTAAGGCGTCGTGGATAAGG 10

Rim036 F: AGCAACCACCACCTCAACTAAT (TG)7 202-339 55 30 Castillo in sod. 2010 R: CTAGCAGAATCACCTGAGGCTT

3.2.5 Kombinacije začetnih oligonukleotidov za starodavne malinjake

Glede na velikosti alelov, smo začetne oligonukleotide združili v 7 skupin, tako da so bili v vsaki skupini 3, v neketerih primerih tudi 2. Razdelili smo jih tako, da se v posamezni skupini dolžine alelov ne prekrivajo, oz. da je sredinski obarvan drugače. Te skupine so zapisane v Preglednici 9.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 68 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 9: Osnovne kombinacije začetnih oligonukleotidov. Table 9: Basic primer combinations.

Oznaka skupine Začetni oligonukleotid Začetni oligonukleotid Začetni oligonukleotid in število v 1. skupini in število v 2. skupini in število v 3. skupini

CE1 Rim 17 (11)* Rub 262 (12) Rim 15 (13)

CE2 Rub 228 (21) Rub 277 (22) Rhm 021 (23)

CE3 Rhm 023 (31) Rhm 001 (32) Rhm 011 (33)

CE4 Rim 19 (41) Rhm 003 (42) Rhm 043 (43)

CE5 Rub 25 (51) Rub 157 (52) Rhm 018 (53)

CE6 Rub 108 (61) Rig 001 (62)

CE7 Rub 223 (71) Rim 36 (72)

* V oklepaju prva številka označuje skupino, druga pa zaporedno številko začetnega oligonukleotida v kombinaciji.

3.2.6 Kombinacije začetnih oligonukleotidov za določanje sort

Za določitev kultiviranih sort smo na podlagi polimorfnosti posameznega začetnega oligonukleotida naredili kombinacije začetnih oligonukleotidov. Te smo izbrali tako, da smo za vsako posamezno sorto od 19 začetnih oligonukleotidov odbrali 6 oz. 7 specifičnih. Zanimale so nas velikosti alelov. Če se je izkazalo, da določena velikost alela izstopa oz. se pojavi samo 1–2 x, smo predpostavili, da je specifična za to sorto. Lahko se je pojavila večkrat, vendar ne v isti kombinaciji in velikosti. Da smo lahko določili sorto, se je moralo ujemati vseh 6 oz. 7 začetnih oligonukleotidov pri istih velikostih alelov.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 69 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Predhodno smo opravili postopek, ki je opisan v poglavju 3.2.8. S pridobitvijo natančnih velikosti alelov s pomočjo kapilarne elektroforeze, smo še 1 x ponovili predhoden postopek, le da smo tokrat vključili izbrane začetne oligonukleotide, ki smo jih na podlagi njihove specifičnosti odbrali za posamezno sorto (Preglednica 10). Na ploščo smo odpipetirali po 1 µl vsakega izbranega začetnega oligonukleotida, v preostanek pa dodali destilirano vodo, tako da je skupni volumen znašal 40 µl.

Preglednica 10: Kombinacije začetnih oligonukleotidov za določevanje posameznih sort.

Table 10: Combinations of primers for determination of individual varieties.

Začetni oligonukleotid Vzorci / Imena kultivarjev

K1A Rub 223 Rub 277 Rub 25 Rub 262 Rim 19 Rim 15 Rim11 'Glen Ample'

K56B Rub 262 Rim 19 Rhm 003 Rim 17 Rub 25 Rub 108 'Rose de Core'

K3A Rub 262 Rhm 043 Rub 108 Rim 15 Rhm 011 Rhm 003 Rim19 'Meeker'

K61A Rim 17 Rhm 011 Rim 19 Rhm 043 Rim 15 Rhm 003 'Dieffenbach'

K60B Rim 17 Rub 262 Rhm 021 Rim 19 Rhm 011 Rim 15 'Sicoly'

K4A Rim 15 Rim 19 Rim 17 Rub 262 Rhm 011 Rim 36 'Polka'

K2A Rhm 011 Rhm 003 Rub 262 Rim 19 Rhm 043 Rub25 'Tulameen'

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 70 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

3.2.7 Verižna reakcija s polimerazo (PCR) in optimizacija postopka namnoževanja

Verižna reakcija s polimerazo – PCR (Polymerase Chain Reaction) je in vitro metoda, s katero namnožujemo kratke fragmente DNA s pomočjo encima DNA polimeraze. Fragment, katerega namnožujemo, določata začetna oligonukleotida. Oligonukleotida sta komplementarna začetnemu in končnemu delu segmenta na vzorčni DNA. Če želimo kopirati, dodamo encim DNA polimerazo, pufer in deoksiribonukleotide. V našem poskusu smo uporabljali PCR komponente proizvajalca Fermentes (EU).

Reakcijske mešanice smo pripravili v 0,5 ml PCR mikrocentrifugirkah, kamor smo najprej odpipetirali ustrezen volumen DNA vzorca, nato pa smo dodali mešanico (mix) vseh potrebnih komponent, ki so naštete spodaj. Skupni volumen produkta za PCR reakcijo je znašala 15 µl.

Sestava PCR reakcijske mešanice (mix):

 4,51 µl deonizirane vode,

 1,5 µl 10 x PCR pufer,

 1,2 µl MgCl2 (Fermentes, EU),

 1,2 µl dNTP (Fermentes, EU),

 0,75 µl začetni oligonukleotid Forward (Sigma, ZDA),

 0,75 µl začetni oligonukleotid Reverse (Sigma, ZDA),

 0,09 µl encima Taq polimeraze (Fermentes, EU),

 5 µl DNA.

Namnoževanje v verižni reakciji s polimerazo je potekalo po optimiziranem postopku (opisano v poglavju 2.9.2) za 19 začetnih oligonukleotidov (Rim 17, Rub 262, Rim 15, Rub 228, Rub 277, Rhm 021, Rhm 023, Rhm 001, Rhm 011, Rim 19, Rhm 003, Rhm 043, Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 71 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Rub 25, Rub 157, Rhm 018, Rub 108, Rig 001, Rub 223, Rim 036) (Castillo in sod. 2010, Graham in sod. 2004). PCR reakcija je potekala v cikličnem termostatu (Biometra T professional, Goettinger Nemčija), ki ga prikazuje Slika 28. Pogoji, pri katerih je potekala PCR reakcija, so prikazani v Preglednici 11.

Preglednica 11: Pogoji in potek PCR reakcije. Table 11: Conditions and the course of the PCR reaction.

PCR pogoji Čas trajanja Temperatura Število Začetni oligonukleotid reakcije (°C) ciklov

Začetna 15 min 94 denaturacija

Denaturacija 30 sek 94

Prileganje 90 sek 59 30 Rub 262, Rim 15, Rub 25, Rub 157, Rub 108, Rub 223

59 25 Rim 17, Rub 228, Rub 277

55 30 Rhm 21, Rhm 023, Rhm 001,

Rhm 011, Rim 19, Rhm 003, Rhm 043, Rhm 018, Rig 001, Rim 036

Podaljševanje 1h 15 min 72

Zaključno 8 min 72 podaljševanje

Ohlajanje neskončno 4

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 72 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

3.2.7.1 Optimizacija začetnih oligonukleotidov

S spodaj opisanimi metodami smo optimizirali kvaliteto PCR produktov, ki smo jih potrebovali za nadaljnje delo.

3.2.7.1.1 Gradientna optimizacija

V publikacijah (Castillo in sod. 2010, Graham in sod. 2004) so navedeni pogoji PCR reakcije, ki veljajo za njihove laboratorije. Ker pa se pogoji dela razlikujejo od laboratorija do laboratorija, smo za vsak par začetnih oligonukleotidov optimizirali temperaturo prileganja in število ciklov v reakciji. Vsak par začetnih oligonukleotidov smo preizkusili pri 12 različnih temperaturah. Temperaturo, pri kateri smo dosegli najboljšo amplifikacijo, smo nato uporabljali pri nadaljnjih postopkih. Razpon temperatur pri preiskušanju je bil 54– 63 °C (Preglednica 12).

Preglednica 12: Gradientni pogoji PCR reakcije. Table 12: Gradient conditions of the PCR reaction.

PCR pogoji Temperatura (°C) Čas trajanja reakcije

Začetna denaturacija 95 15 min

Denaturacija 94 30 sek

Prileganje 54.2, 54.4, 55.1, 56.0, 57.0, 58.1, 90 sek 59.2, 60.3, 61.3, 62.2, 62.9, 63.1

Podaljševanje 72 1h 15 min

Zaključno podaljševanje 72 10 min

Ohlajanje 4 neskončno

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 73 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

3.2.7.1.2 Optimizacija števila ciklov

Začetne oligonukleotide smo optimizirali tudi po številu ciklov. Testirali smo 3 vzorce, v katere je bil vključen vsak začetni oligonukleotid. Spreminjali so se samo cikli (25, 27 in 30), kot prikazuje spodnja preglednica (Preglednica 13). Uspešnost amplifikacije smo preverili na agaroznem gelu.

Preglednica 13: Optimizacija začetnih oligonukleotidov glede na število ciklov. Table 13: Optimization of primers according to the number of cycles.

PCR pogoji PCR reakcija 25, 27 in 30 cikli

Začetna denaturacija 94 °C → 5 min

Denaturacija 94 °C → 30 sek

Prileganje 59 °C → 45 sek

Podaljševanje 72 °C → 1h 15min

Zaključno podaljšanje 72 °C → 8 min

Ohlajanje 4 °C → neskončno

Za mix PCR reakcije smo uporabili kit Qiagen (Qiagen® Multiplex PCR Plus Kit 100, GmbH, Hilden). Pri pripravi mixa za posamezen vzorec smo uporabili naslednje sestavine:

 5,0 µl 10 × PCR mix,

 0,5 µl začetni oligonukleotid forward (10 µM),

 0,5 µl začetni oligonukleotid reverse (10 µM), Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 74 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

 0,5 µl DNA (100 µM),

 3,5 µl deionizirana H2O.

Redčenje DNA (100 µM) za QIAGEN kit je temeljilo na formuli:

(DNA (izmerjena koncentracija) * 10 / 100) – 10 = koliko vode damo na 10 µl DNA

...(2)

3.2.8 Določanje velikosti alelov s kapilarno elektroforezo

Produkte, namnožene s PCR, smo najprej nanesli na agarozno elektroforezo, da smo preverili uspešnost amplifikacije in ocenili količino produkta. Za določanje velikosti posameznih mikrosatelitskih lokusov pa smo uporabili kapilarno elektroforezo (Beckman Coulter CEQ 8000).

Priprava vzorcev za kapilarno elektroforezo

Za kapilarno elektroforezo je potrebno dodati optimalno količino PCR produkta. Optimalno količino smo določili na podlagi slike, ki smo jo dobili z agarozno gelsko elektroforezo. Skupni volumen mixa PCR produkta je znašal 40 µl, od katerega smo odšteli količino vode, s katero smo redčili začetne oligonukleotide v skupini, kar prikazuje spodnja formula:

40 µl – (začetni oligonukleotid (CE1, CE2,…) = količina dH2O …(3)

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 75 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Nato smo pazljivo odpipetirali po 1 µl tega mixa na ploščo, kamor smo predhodno nanesli 40 µl deionizoranega formamida (Sigma, St. Luis, MO, ZDA) in 0,33 µl dolžinskega standarda – sizerja 400, (Beckman Coulter, Brea, Kalifornija, ZDA) za vsak posamezen vzorec 40 µl mešanice. Pazili smo, da se ni naredil kakšen zračni mehurček, na koncu pa dodali še kapljico mineralnega olja (Sigma, ZDA), ki je onemogočilo izhlapevanje.

V Laboratoriju za medicinsko genetiko Kliničnega centra Maribor, je bila opravljena kapilarna elektroforeza (Beckman Coulter CEQ 8000) za natančno analizo fragmentov (Slika 23).

Slika 23: Kapilarna elektroforeza v UKC Maribor znamke Beckman Coulter CEQ 8000 (Foto: Novak 2012). Figure 23: Capillary electrophoresis Beckman Coulter CEQ 8000 at UKC Maribor (Photo: Novak 2012).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 76 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

3.2.9 Statistična obdelava podatkov

3.2.9.1 Vrednotenje polimorfizma in genetske sorodnosti

Povprečna razdalja med alelnimi pari (Perrier in sod. 2005) je temeljila na podatkih, dobljenih z analizami mikrosatelitskih markerjev in z razvrščanjem genotipov v sorodne skupine. Uporabili smo metodo z algoritmom NJ (neighbor-joining tree), ki je bila narejena s pomočjo računalniškega paketa Darwin (Perrier in sod. 2005). Izdelali smo dendrogram.

Iz podatkov prisotnosti (1) in odsotnosti (0) določenega alela pri genotipu smo sestavili binarno matriko, ki smo jo uporabili kot osnovo za izračunavanje Diceovih koeficientov podobnosti (Dice 1945). Vrednosti Diceovih koeficientov so bile med 0 (ni bilo skupnega markerja) in 1 (2 genotipa sta imela identična markerja). Matrika Diceovih koeficientov podobnosti je bila uporabljena za oceno genetske sorodnosti med 53 genotipi s pomočjo algoritma, ki ga je razvil Saitou in sod. (1987):

D(ij) = (b + c) / [(2a + (b + c ))] …(4)

kjer:

 a pomeni število spremenljivk, ki vsebujejo i + j,  b pomeni število spremenljivk, ki vsebujejo i, ne pa tudi j,  c število spremenljivk, ki vsebujejo j, ne pa tudi i.

Za analizo vrednotenja raznolikosti uporabljenih mikrosatelitskih lokusov, smo z uporabo računalniškega programa »Identity 1.0.« (Wagner in sod. 1999) izračunali naslednje parametre:

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 77 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

 število alelov na lokus (n),

 frekvence posameznih alelov (pi), ki predstavljajo delež posameznega dela v populaciji,

 dejansko heterozigotnost (H0), ki predstavlja delež vseh posameznikov v populaciji, ki so heterozigotni,

 pričakovano heterozigotnost (He) ali genetsko raznolikost (Nei 1973), ki predstavlja delež populacije, ki bi bila heterozigotna, če bi med posamezniki prišlo do naključnega križanja, hkrati pa predstavlja zmožnost markerja za ločevanje med genotipi:

2 He = 1 - ∑ pi , kjer je p frekvenca i - tega alela …(5)

 PI (probability of identity) vrednost (verjetnost enakosti genotipov), ki predstavlja verjetnost, da imata 2 osebka 2 enaka alela na proučevanem lokusu. Višja kot je PI vrednost, nižja je informativnost, kar je navadno posledica majhnega števila alelov ali pa visoke frekvence enega izmed alelov (Paetkau in sod. 1995). Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 78 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

4 REZULTATI Z RAZPRAVO

4.1 Sledenje starodavnim genotipom

4.1.1 Izolacija DNA

DNA smo izolirali iz 161 rastlin. Za nadaljnje molekulske analize smo odbrali 117 vzorcev. Vsak vzorec smo izolirali v 2 ali 3 ponovitvah. Kvaliteto izolirane DNA smo preverili na vseh vzorcih, vključenih v analizo DNA. Na Sliki 24 je prikazanih en del vzorcev.

Slika 24: Izolirana DNA malinjakov 18 vzorcev divjih in pol-divjih genotipov pobranih ob srednjeveških gradovih ter 4 standardnih kultiviranih sort (Foto: Novak 2013). Figure 24: DNA isolated from 18 samples of wild and semi-wild raspberries, collected around selected medieval castles and 4 standards varieties of raspberries (Foto: Novak 2013).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 79 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

4.1.2 Koncentracije izolirane DNA

Pri vseh vzorcih izolirane DNA smo izmerili koncentracijo DNA (Priloga 1, Preglednica 1). Pri vzorcih, kjer smo DNA izolirali v več ponovitvah, smo za nadaljnje analize uporabili DNA vzorca, kjer smo izmerili najvišjo koncentracijo. Vrednosti koncentracij so se gibale 11,23–1485. Tudi pri vzorcih, kjer smo izmerili nizke koncentracije DNA, je količina izolirane DNA zadostovala za nadaljnje analize. Za namnoževanje mikrosatelitskih lokusov smo DNA redčili na koncentracijo 4 ng/µl. Če so bile koncentracije DNA nizke, smo uporabili kar neredčeno DNA.

4.1.3 Namnoževanje mikrosatelitskih lokusov

Mikrosatelitske lokuse smo namnožili s pomočjo verižne reakcije s polimerazo (PCR) (Preglednica 11). Uspešnost amplifikacije smo preverili z elektroforezo na agaroznem gelu. Slika 25 prikazuje namnožene fragmente 8 vzorcev (R103, R105, R106, R107, R111, R113, R117, R118) s 4 mikrosatelitskimi lokusi (Rhm 001, Rhm 003, Rhm 011, Rub 25).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 80 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Slika 25: Namnoženi fragmenti osmih vzorcev za 4 različne mikrosatelitske lokuse (Foto: Novak 2013). Figure 25: Agarose gel electrophoresis of 8 samples for 4 different SSR markers (Photo: Novak 2013).

4.1.4 Določanje velikosti alelov

S kapilarno elektroforezo smo za vse vzorce določili velikosti alelov pri uporabljenih 19 začetnih oligonukleotidih (Rim 15, Rub 262, Rub 277, Rim 17, Rub 228, Rub 223, Rub 157, Rub 25, Rub 108, Rhm 001, Rhm 003, Rhm 011, Rim 19, Rhm 21, Rhm 023, Rhm 043, Rim 36, Rhm 018, Rig 001). Pri pripravi vzorcev za kapilarno elektroforezo smo zaradi optimizacije časa in stroškov hkrati analizirali reakcije s 3 različnimi začetnimi oligonukleotidi. V ta namen smo pripravili skupine z 2 oz. 3 začetnimi oligonukleotidi, (Preglednica 11), tako da se velikosti niso prekrivale. Uporabili smo začetne oligonukleotide, označene z zelenim (Cy 5,5) in modrim (Cy 5) barvilom. 19 začetnih oligonukleotidov smo tako razvrstili v 7 skupin in jih označili s CE1, CE2,…, CE7 (Slika 26–32). Malinjaki so v splošnem diploidi, zelo redko je možna tudi triploidija. Velikosti alelov, dobljene s kapilarno elektroforezo, so zapisane na 2 decimalki natančno. Rezultate smo nato zaokrožili na celo število in pripravili binarno matriko. Izmerjena velikost alelov za vsak posamezni vzorec je vidna v prilogi (Priloga 2, Preglednica 2). Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 81 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Skupino pod oznako CE1 so sestavljali 3 začetni oligonukleotidi (Slika 26). Začetna oligonukleotida Rim 17 in Rim 15, ki sta bila označena z modro barvo (Cy 5), ter začetni oligonukleotid Rub 262, označen z zeleno (Cy 5,5). Velikosti alelov so bile specifične glede na posamezen začetni oligonukleotid. Za začetni oligonukleotid Rim 17 so bile velikosti alelov (185–201 bp), za Rub 262 (205–231 bp) in za Rim 15 pa (352–368 bp).

Slika 26: Velikosti alelov 1. skupine začetnih oligonuleotidov – CE1 (vzorec 94). Figure 26: Allele sizes – 1st group of primers – CE1 (sample 94).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 82 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Na Sliki 27 je prikazana skupina začetnih oligonukleotidov z oznako CE2, v katero so vključeni začetni oligonukleotidi Rub 228, Rhm 021 ter začetni oligonukleotid Rub 277. Izmerjene dolžine alelov so bile pri začetnem oligonukleotidu Rub 228 (112–166 bp), pri Rub 277 (233–243 bp) ter pri Rhm 021 (284–290 bp).

Slika 27: Velikosti alelov 2. skupine začetnih oligonukleotidov – CE2 (vzorec 89). Figure 27: Allele sizes – 2nd group of primers – CE2 (sample 89).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 83 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Skupina pod oznako CE3 (Slika 28) je bila ponazorjena z 2 začetnima oligonukleotidoma zelene barve, Rhm 001 z dolžino alelov (235–239 bp) in Rhm 011 (271–315 bp) ter z modro označenim začetnim oligonukleotidom Rhm 023, ki se je pri vseh vzorcih izkazal za monomorfnega z dolžino 197 bp.

Slika 28: Velikosti alelov 3. skupine začetnih oligonuleotidov – CE3 (vzorec 92). Figure 28: Allele sizes – 3rd group of primers – CE3 (sample 92).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 84 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Skupino pod oznako CE4 (Slika 29) so sestavljali 3 začetni oligonukleotidi: Rim 19, Rhm 043 ter Rhm 003. Izmerjene velikosti alelov pri začetnem oligonukleotidu Rim 19 so bile (165–215 bp), pri Rhm 043 (357–413 bp) ter pri Rhm 003 (189–213 bp). Pri začetnem oligonukleotidu Rhm 043 in Rhm 003 so se pri nekaterih vzorcih namnožili aleli specifičnih velikosti.

Slika 29: Velikosti alelov 4. skupine začetnih oligonukleotidov – CE4 (vzorec 105). Figure 29: Allele sizes – 4th group of primers – CE4 (sample 105).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 85 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

V 5. skupino začetnih oligonukleotidov z oznako CE5 so se uvrstili 3 začetni oligonukleotidi (Slika 30). Začetna oligonukleotida Rub 25 in Rhm 018, ki sta ponazorjena z modro barvo (Cy 5), ter začetni oligonukleotid Rub 157, označen z zeleno (Cy 5,5). Za Rub 25 so bile velikosti alelov (142–156 bp), za Rhm 018 (319–393 bp), pri Rub 157 pa (170–308 bp). Pri začetnem oligonukleotidu Rub 157 so se pri nekaterih vzorcih namnožili aleli specifičnih velikosti.

Slika 30: Velikosti alelov 5. skupine začetnih oligonukleotidov– CE5 (vzorec 122). Figure 30: Allele sizes – 5th. group of primers – CE5 (sample 122).

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 86 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Skupino CE6 sta sestavljala začetna oligonukleotida Rub 108 in Rig 001 (Slika 31). Z modro označen začetni oligonukleotid Rub 108 je imel izmerjeno velikost alelov v intervalu (151–159 bp). Pri začetnem oligonukleotidu Rig 001, ki je prikazan z zeleno barvo, so dolžine alelov nihale (325–343 bp).

2 2 5 0 0 0

2 0 0 0 0 0

1 7 5 0 0 0 153.52 61

1 5 0 0 0 0

1 2 5 0 0 0

1 0 0 0 0 0

7 5 0 0 0

5 0 0 0 0 341.51 62

2 5 0 0 0

Dye Signal Dye 0 0 50 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 S iz e ( n t ) Slika 31: Velikosti alelov 6. skupine začetnih oligonukleotidov – CE6. Figure 31: Allele sizes – 6th group of primers – CE6.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 87 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Na Sliki 32 so prikazane velikosti alelov skupine CE7. V to skupino sta bila vključena 2 začetna oligonukleotida. Rub 223, ki je bil označen z modro (Cy 5), pri katerem je velikost alelov nihala (144–180 bp) in z zeleno (Cy 5,5) označen začetni oligonuleotid Rim 36, z velikostijo alelov (296–312 bp).

Slika 32: Velikosti alelov 7. skupine začetnih oligonukleotidov – CE7 (vzorec 122). Figure 32: Allele sizes – 7th group of primers – CE7 (sample 122).

4.1.5 Vrednotenje polimorfizma

Ugotavljanje prisotnosti 2 ali več različnih alelov 1 gena ( lokusa) v populaciji (polimorfizma) smo vrednotili na podlagi natančno določenih velikosti alelov, izračunali smo Dicove koeficiente in druge parametre genetske variabilnosti posameznih mikrosatelitskih lokusov: frekvenco alelov, (Preglednica 14), število alelov (n), opaženo

(Ho) in pričakovano (He) stopnjo heterozigotnosti (Preglednica 14). Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 88 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 14: Seznam velikosti alelov in frekvenc, dobljenih z uporabo 18 mikrosatelitskih lokusov na 53 genotipih. Table 14: List of alleles of 18 analysed microsatellite loci determined on 53 genotypes, with corresponding allele sizes and frequencies.

Zač. Rim Rub Rim Rub Rub Rhm Rhm Rhm Rim Rhm Rhm Rub Rub Rhm Rub Rig Rub Rim oligo- 17 262 15 228 277 021 001 011 19 003 043 25a 157 18 108a 001 223a 36 nukle otid 185 205 352 112 233 284 235 271 165 189 357 142 170 319 151 325 144 296 (0,0 (0,1 (0,6 (0,0 (0,1 (0,8 (0,0 (0,0 (0,2 (0,0 (0,0 (0,3 (0,0 (0,0 (0,1 (0,0 (0,0 (0,04 83) 66) 57) 27) 94) 51) 27) 46) 40) 18) 09) 61) 09) 37) 01) 18) 09) 6) 189 207 354 116 235 286 237 279 171 195 367 144 178 356 153 341 146 308 (0,0 (0,2 (0,1 (0,0 (0,5 (0,0 (0,6 (0,0 (0,0 (0,0 (0,0 (0,1 (0,0 (0,0 (0,4 (0,4 (0,1 (0,02 09) 22) 75) 55) 09) 64) 85) 46) 09) 83) 37) 94) 09) 09) 16) 90) 75) 7) 193 209 356 120 237 290 239 283 173 197 371 146 192 358 157 343 148 310 (0,0 (0,0 (0,0 (0,0 (0,2 (0,0 (0,2 (0,0 (0,0 (0,2 (0,1 (0,5 (0,0 (0,0 (0,4 (0,4 (0,0 (0,54 46) 74) 74) 18) 12) 83) 87) 18) 18) 22) 94) 55) 18) 27) 16) 90) 27) 69 195 211 358 122 239 285 175 199 373 152 194 375 159 150 312 (0,6 (0,0 (0,0 (0,0 (0,0 (0,1 (0,1 (0,3 (0,6 (0,2 (0,0 (0,0 (0,0 (0,0 (0,37 48) 37) 64) 18) 46) 20) 11) 51) 75) 87) 27) 18) 64) 37) 9) 197 213 362 124 241 287 177 201 375 154 202 377 152 (0,1 (0,0 (0,0 (0,0 (0,0 (0,2 (0,1 (0,0 (0,0 (0,0 (0,0 (0,5 (0,2 20) 37) 09) 18) 18) 59) 11) 09) 27) 83 ) 27) 27) 12) 199 215 364 126 243 289 179 203 377 156 206 379 154 (0,0 (0,1 (0,0 (0,0 (0,0 (0,1 (0,2 (0,1 (0,0 (0,0 (0,3 (0,3 (0,1 64) 01) 09) 92) 18) 20) 22) 38) 37) 18) 05) 61) 11) 201 217 366 136 291 181 207 411 208 393 156 (0,0 (0,1 (0,0 (0,0 (0,0 (0,0 (0,1 (0,0 (0,2 (0,0 (0,0 27) 94) 09) 74) 64) 46) 57) 09) 22) 18) 37) 219 138 293 183 211 413 226 158 (0,0 (0,0 (0,0 (0,0 (0,0 (0,0 (0,2 (0,0 46) 27) 09) 37) 09) 09) 50) 64) 221 140 295 187 213 228 160 (0,1 (0,0 (0,0 (0,0 (0,0 (0,0 (0,0 11) 64) 83) 18) 09) 18) 55) 231 142 297 189 250 162 (0,0 (0,1 (0,0 (0,0 (0,0 (0,0 09) 20) 74) 92) 46) 37) 144 303 191 272 164 (0,0 (0,0 (0,2 (0,0 (0,0 09) 46) 40) 27) 55) 146 307 195 278 166 (0,1 (0,0 (0,0 (0,0 (0,1 01) 46) 09) 27) 48) 148 311 199 308 168 (0,2 (0,0 (0,0 (0,0 (0,0 22) 18) 18) 09) 09) 152 313 213 176 (0,0 (0,1 (0,1 (0,0 09) 20) 11) 09) 156 315 215 180 (0,0 (0,2 (0,1 (0,0 09) 59) 11) 09) 158 (0,0 37) 160 (0,0 27) 162 (0,0 27) 164 (0,0 18) 166 (0,0 18) Št. alelov 7 10 7 20 6 3 3 15 15 9 8 6 13 7 4 3 15 4 Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 89 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

V Preglednici 14 so podane velikosti in frekvence posameznih mikrosatelitskih lokusov. Na 18 lokusih je bilo identificiranih skupaj 155 alelov. Za najmanj polimorfna sta se izkazala lokusa Rhm 021 in Rig 001, s 3 različnimi aleli. Najbolj polimorfen je bil Rub 228, pri katerem smo odkrili 20 različnih alelov.

Preglednica 15: Parametri genetske variabilnosti posameznih mikrosatelitskih lokusov: število alelov (n), opažena stopnja heterozigotnosti (Ho), pričakovana stopnja heterozigotnosti (He), verjetnost enakosti genotipov (PI). Table 15: The parameters of genetic variability calculated for 18 micro-satellite loci of 53

genotypes: number of alleles (n), observed (Ho) and expected (He) heterozygosity, and probability of identity (PI).

Lokus n Ho He PI

Rim 17 7 0,425 0,551 0,275 Rub262 10 0,833 0,851 0,072 Rim 15 7 0,296 0,526 0,331 Rub228 20 0,870 0,897 0,032 Rub277 6 0,518 0,654 0,264 Rhm021 3 0,296 0,263 0,591 Rhm023 1 0 0 1 Rhm001 3 0,555 0,447 0,540 Rhm011 15 0,796 0,877 0,045 Rim 19 15 0,796 0,853 0,067 Rhm003 9 0,574 0,775 0,145 Rhm043 8 0,444 0,501 0,363 Rub25a 6 0,592 0,739 0,196 Rub157b 13 0,222 0,788 0,133 Rhm018 7 0,240 0,588 0,394 Rub108a 4 0,351 0,638 0,342 Rig001 3 0,055 0,518 0,581 Rub223a 15 0,796 0,873 0,052 Rim 36 4 0,555 0,554 0,464 Skupaj 8,611 0,510 0,661 Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 90 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Iz preglednice 15 je razvidno, da je vseh 18 mikrosatelitskih lokusov imelo povprečje

8,611 alelov na posamezen lokus. Opažena heterozigotnost (Ho) se je gibala med 0,222 (lokus Rub 157b) in 0,870 (lokus Rub 228), s povprečjem 0,510. Pričakovana heterozigotnost (He), se je gibala med 0,263 (lokus Rhm 021) in 0,898 (lokus Rub 228), s povprečjem 0,661. Razlike med opazovano in pričakovano heterozigotnostjo so bile zaznane na vseh lokusih. Največja razlika je bila na lokusu Rub 157b (0,567), najnižja pa pri Rim 036 (0,002). Pri 15 od 18 lokusov je bila opažena heterozigotnost (H0) nižja od pričakovane (He). Izjema so bili lokusi (Rhm 021, Rhm 001 in Rim 036), kjer je bil H0 višji od He.

Iz proučevanega nabora lokusov je bil najbolj informativen Rub 228, z verjetnostjo enakosti (PI) 0,032. Najmanj informativen je bil lokus Rig 001 s PI 0,581. Na splošno si želimo imeti čim večje število lokusov z različnimi aleli s približno enako verjetnostjo, vendar je ta možnost majhna. Pri rastlinah primitivnega videza (hipotetični starodavni genotipi), ki rastejo ob ruševinah zapuščenih samostanov in gradov, ki so zaradi kontinuiranega vegetativnega razmnoževanja verjetno ostali bolj ali manj genetsko nespremenjeni Na genetsko variabilnost vplivajo tudi spremembe, ki so omogočile lažje preživetje genotipov v težkih razmerah in so bile najverjetneje posledica postopne akumulacije mutacij ali epigenetskih sprememb, ki z ekstremnimi ekoliškimi razmerami vplivajo na genetsko spreminjanje starodavnih genotipov malinjakov.

4.1.6 Vrednotenje genetske sorodnosti starodavnih malinjakov

Za genotipe divjih, pol-divjih in primitivnih genotipov malinjakov, ki so bili vzorčeni v Bolgariji, Franciji, v severovzhodnem delu Slovenije in v Švici ter kultiviranih sort, smo iz podatkov prisotnosti (1) ali odsotnosti (0) določenega alela sestavili binarno matriko, ki smo jo kot osnovo uporabili za izračunavanje Diceovih koeficientov podobnosti (Dice 1945). Za razvrščanje genotipov v sorodne skupine smo uporabili metodo NJ (Perrier in sod. 2005). Slika 33 prikazuje dendrogram, narejen na osnovi MS podatkov in Diceovih Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 91 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

koeficientov genetske podobnosti med 53 genotipi, pobranimi ob nekaterih srednjeveških gradovih in samostanih.

144 95 Grad Velika Nedelja (A) 143 36 Grad Velika Nedelja (A) 15 130 Grad Negova (A) 132 21 Grad Negova (B) 131 27 Grad Negova (B) 17 129 Grad Negova (A) 136 Grad Negova (C) 97 29 135 Grad Negova (C) 145 Klaster I. 50 Grad Velika Nedelja (B) 133 Grad Negova (B) 76 142 Grad Hrastovec (A) 40 141 41 Grad Hrastovec (A) 24 128 Grad Negova (A) 134 87 Grad Negova (C) 151 70 Grad Velika Nedelja (C) 140 Grad Hrastovec (A) 43 100 Grad Hompoš (C) 40 34 Grad Hompoš (C) 50 51 Grad Hompoš (B) 43 100 42 40 Grad Hompoš (C) 38 33 76 50 41 52 Grad Hompoš (C) 42 Klaster II. 41 75 27 Grad Hompoš (41A) 25 27 22 53 Grad Hompoš (B) 46 53 49 51 51 98 Grad Hompoš (B) 98 54 75 79 54 Grad Hompoš (B) 88 79 52 52 4 58 Grad Hompoš (B) 2 33 3 4 Polka - Standard 6260 2 1 8 160 Tulameen - Standard 31 43 159 3 Meeker - Standard Klaster III. 82 61 127 50 49 1 126 Glen Ample - Standard 23 1 21 160 Grad 158Ravno polje (B) 71 43 162 159 Grad Ravno polje (B) 163 45 82 161 127 Kartuz. Sam. Žiče (C) 134 51 23 49 126 K107artuz. Sam. Žiče (C) 145 23 46 158 Grad Ravno polje (B) Klaster IV. 12 133 24 136 74 162 Grad Ravno polje (C) 135 7 131 163 Grad Ravno polje (C) 25 44 129 19 161 144 Grad Ravno polje (C) 95 97 35 143 139 Grad Cmurek /Mureck (A) 47 130 138 83 132 Grad Cmurek /Mureck (A) Klaster V. 11 142 77 43 137 Grad Cmurek /Mureck (A) 44 141 128 41 152 Grad Velika Nedelja (C) 32 151 72 106 140 Kartuz. Sam. Jurklošter(C) 95 139 105 Klaster VI. 95 46 Kartuz. Sam. Jurklošter (C) 83 138 78 137 103 Kartuz. Sam. Jurklošter (C) 152 30 119 Kartuz. Sam. Žiče (A) 106 95 100 20 93 105 118 Kartuz. Sam. Žiče (A) 59 103

119 113 Kartuz. Sam. Jurklošter (A) 100 100 19 118 57 111 Kartuz. Sam. Jurklošter (A) 27 113 100 Klaster VII. 122 111 25 Kartuz. Sam. Žiče (B) 65 122 66 121 Kartuz. Sam. Žiče (B) 2526 100100 121 124124 Kartuz. Sam. Žiče (B) 153 153 Grad Ravno polje (A) 0 0.1

0 0.1 Slika 33: NJ dendrogram, narejen na osnovi MS podatkov in Diceovih koeficientov

genetske sorodnosti med 53 genotipi malinjaka. Figure 33: Dendrogram, based on Dice’s coefficient of genetic similarity among 53 red raspberry genotypes. Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 92 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Z analizo sorodnosti, ki temelji na podatkih mikrosatelitskih lokusov, smo razvrstili analizirane vzorce v 7 glavnih skupin. 1. skupina obsega malinjake iz severovzhodne Slovenije, zbrane okoli obzidij gradov Negova, Hrastovec in Velika Nedelja (položaj A in B, Slika 21) ter v sosednjih vaseh (položaj C, Slika 21). Malinjaki 1. skupine predstavljajo tradicionalne, lokalno gojene genotipe. Malinjaki, vključeni v 2. skupino so bili vzorčeni na robovih gozdov, v okolici naselij ter na pobočjih Pohorja (nedaleč od Maribora). Lahko jih prištevamo med primitivne ali pol-divje tipe, za katere so značilna zelo dolga stebla ter zelo aromatični in relativno majhni plodovi. Majhni plodovi so vsaj delno posledica velike gostote rastlin, odsotnost agrotehničnih ukrepov (ni obrezovanja, gnojenja…) ter rasti v senci gozdnih dreves. 3. skupina zajema sodobne kultivarje, ki jih vzdržuje Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede v genski banki. 4. skupina vključuje genotipe, zbrane v okolici gradu Ravno Polje in 2 genotipa, ki sta bila vzorčena v naselju v bližini zapuščene kartuzije Žiče. Malinjaki v 5. skupini so bili zbrani okrog obzidja gradu Cmurek (položaj A, Slika 21). Izjema je le 1 vzorec, ki izvira iz vasi blizu gradu Velika Nedelja. Skupina 6 vključuje genotipe, zbrane v naseljih v bližini zapuščenega kartuzijanskega samostana Jurklošter. Najverjetnejši srednjeveški malinjaki so vključeni v 7. skupino, ki so bili vzorčeni v neposredni bližini obzidja (Slika 21) zapuščenih kartuzijanskih samostanov Žiče in Jurklošter. Izjema je genotip, vzorčen v bližini obzidja gradu Ravno Polje (položaj A, Slika 21), ki bi lahko predstavljal povsem ločeno skupino. Če primerjamo skupini 4 in 6 lahko sklepamo, da je najbrž bila določena »komunikacija« med gradovoma Ravno Polje. V okolico gradu Ravno polje je najbrž nekdo prinesel sadike malinjakov iz kartuzijanskega samostana Žiče, saj je razdalja manjša od 50 km.

Iz dendrograma (Slika 33) lahko sklepamo, da vzorca 118 in 119, pobrana blizu obzidja zapuščenega kartuzijanskega samostana Žiče, predstavljata skupino gensko podobnih rastlin, povezanih z vzorcema 111 in 113, ki sta bila zbrana v bližini opuščenega kartuzijanskega samostana Jurklošter. Med seboj so si tudi morfološko podobni in očitno niso divji genotipi. Najverjetneje predstavljajo zapuščene sorte, ki so se prilagodile na težka naravna okolja. Če se upošteva neugodno okolje, so razmeroma zelo bujne rasti. Rastline so lahko visoke več kot 2 ali 3 m. Stebla so srednje voskasta, spodnji in zgornji del stebla ima redke kratke bodice, srednji del je bolj ali manj povsem gladek (izjema so Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 93 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

kratka stebla, kjer se srednji del ne razlikuje od spodnjega in zgornjega). So brez trnov in imajo sorazmerno velike liste (15–25 cm). Listni pecelj ima redke bodice in zavzema približno 1/3 celotne listne dolžine. Več bodic je na listnem strženu. List je ponavadi 5- delen (3 ali 4–delni listi so redki in se pogosteje pojavljajo na kratkih poganjkih v poznem poletju in v jeseni). Cvetovi so relativno majhni, plodov je malo in so praviloma majhni ter najpogosteje stožčaste oblike, vendar so zelo aromatični (bolj kot pri modernih sortah). Plodovi so srednje mehki, njihova barva se spreminja od svetlo rdeče do rdeče, odvisno od izpostavljenosti sončni svetlobi in se z lahkoto ločijo od peclja.

4.2 Uporaba mikrosatelitskih markerjev za identifikacijo sort

Za določanje kultivarjev 7 znanih sort malinjaka ('Glen Ample', 'Tulameen', 'Meeker', 'Polka', 'Rose de Core', 'Sicoly', 'Dieffenbach') smo poiskali različne kombinacije začetnih oligonukleotidov, s pomočjo katerih smo lahko določili posamezne sorte. Število mikrosatelitskih označevalcev za dovolj zanesljivo identifikacijo sorte je odvisno od narave in moči vsakega markerja (Tessier in sod. 1999). Za razlikovanje med genotipi običajno zadostuje 6 markerjev oz. označevalcev (Zulini in sod. 2005). Tesno povezane sorte zahtevajo večje število označevalcev (Meredith in sod. 1999). SSR markerski sistem se uporablja za dokazovanje visoke stopnje genetske variabilnosti analiziranih genotipov in dokazovanje zanesljivosti pri ugotavljanju genetskih odnosov. Kombinacije smo izbirali na podlagi velikosti alelov na posameznem lokusu, izmerjenih s kapilarno elektroforezo (Slike 34–40). Naredili smo binarno matriko, ki nam je dala rezultate o specifičnosti posameznega lokusa pri določenem kultivarju.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 94 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Na podlagi binarne matrike smo ugotovili, da so za sorto 'Glen Ample' (Slika 34) značilni lokusi: Rub 25 z velikostjo alelov (144, 154 bp), Rub 277 (235, 243 bp), Rhm 011 (287, 291bp), ki so heterozigoti, homozigotnost pa izražajo začetni oligonukleotidi Rim 19 (177 bp), Rub 262 (217 bp), Rub 223 (152 bp) in Rim 15 (354 bp).

175000

144.29

151.53 152.58 150000 153.68

155.17 153.14 125000

177.50

100000

150.68 352.84 149.47

143.39 75000

353.69 352.02

50000 157.21 100.86 151.42 98.97 148.48 97.29 142.44 216.85 96.41 156.35 175.54 96.03 233.92 136.17 147.48 25000 95.30 216.01 285.78 105.59 124.07 243.11 91.59 144.33 289.77 102.55 220 87.84 123.43 141.26 160 180 215.05 320 190 200 240 260 300 280 319.73 340 360 380 400 90 120 140.35

Dye Signal Dye 0 100 150 200 250 300 350 400 Size (nt) Slika 34: Kombinacija začetnih oligonukleotidov, uporabljenih za identifikacijo kultivarja 'Glen Ample'. Figure 34: A combination of primers used for the identification of the variety 'Glen Ample'.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 95 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Za sorto 'Tulameen' (Slika 35) je večina specifičnih začetnih oligonukleotidov povezanih s heterozigotnimi lokusi: Rub 25 (142, 152 bp), Rim 19 (164, 182 bp), Rhm 003 (195, 213 bp), Rub 262 (207, 221 bp), Rhm 011(283, 291 bp). Homozigotnost je samo na lokusu Rhm 043, z velikostjo alelov 373 bp.

45000

40000

142.64 152.30

35000

30000

25000 165.02

20000

15000

195.25 10000 181.52 282.67 290.45 282.06 207.21 60 70 80 140.92 212.90 100 150.70 90 120 140 196.25 160 5000 180 54.25 179.48 190 200 163.03 221.59220 240.29240 260 280 300 56.69 320 73.65 149.04 198.91 280.86 70.36 177.40 205.15 219.51 61.8164.3068.0272.90 90.43 167.02 183.54 193.35 217.55 56.6662.0662.4663.5964.6065.9270.6771.8472.0274.8075.9278.0180.7283.4285.0689.9291.1391.75101.24102.53105.39112.24120.13128.27 139.31142.52146.56147.34148.35149.07149.13149.84151.17152.53159.20161.16164.31165.05 177.84181.35187.24188.14189.11190.27191.38194.50202.85203.42 233.30235.77238.31 266.01269.26276.97280.17 290.09295.38302.58303.58304.43304.64306.16311.29312.12315.62

Dye Signal Dye 0 50 100 150 200 250 300 Size (nt) Slika 35: Kombinacija začetnih oligonukleotidov, uporabljenih za identifikacijo kultivarja 'Tulameen'. Figure 35: A combination of primers used for the identification of the 'Tulameen'.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 96 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Heterozigotnost pri kultivarju 'Meeker' (Slika 36) se kaže pri lokusih Rub 108 (152, 154 bp), Rim 19 (165, 177 bp), Rub 262 (217, 221 bp), Rhm 003 (199, 207 bp) in Rim 15 (354, 365 bp). Lokusa Rhm 011 (287 bp) in Rhm 043 (373 bp) pa sta homozigotna.

110000

151.23 100000

153.27 90000

80000

70000

296.55

60000 311.15

50000

40000 164.69

30000

373.14 177.19 150.18 20000 352.27 207.94 286.25 364.92 200.09 363.97 120 140 220 160 180 300 190 10000 200 217.50 294.76 309.48 240 260 280 320 340 360 380 400 420 137.81

Dye Signal Dye 0 150 200 250 300 350 400 Size (nt) Slika 36: Kombinacija začetnih oligonukleotidov, uporabljenih za identifikacijo kultivarja 'Meeker'. Figure 36: A combination of primers used for the identification of the 'Meeker'.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 97 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Za sorto 'Polka' (Slika 37) so kombinacije začetnih oligonukleotidov Rim19 (179, 181 bp), Rub 262 (207, 209 bp), Rhm 011 (290, 292 bp) in Rim 36 (296, 311 bp) bile povezane s heterozigotnostjo, pri lokusu Rim 17 (193 bp) in Rim 15 (356 bp) pa s homozigotnostjo.

175000

193.54 192.45

150000

125000 357.46

100000

179.02 75000

180.92 205.52

50000

191.26 207.24

192.79 289.63 204.36 25000 291.65 127.45 177.14 193.55 111.87 140 296.43 160 180 190 311.71 200 220 240 260 300 280 320 340 360 380 400 142.77

Dye Signal Dye 0 150 200 250 300 350 400 Size (nt) Slika 37: Kombinacija začetnih oligonukleotidov, uporabljenih za identifikacijo kultivarja 'Polka'. Figure 37: A combination of primers used for the identification of the 'Polka'.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 98 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Lokusi Rub 25 (142, 152 bp), Rim 19 (167, 173 bp), Rim 17 (195, 197 bp) in Rub 262 (201, 211 bp) so specifični in so bili povezani s heterozigotnostjo pri sorti 'Rose de Core' (Slika 38). Lokusa Rub 108 (154 bp) in Rhm 003 (203 bp) pa s homozigotnostjo na vzorcu K56A.

175000

150000 153.57

125000

100000

151.34 75000 142.49

50000

195.17 152.59 197.13 167.04

25000 173.20 141.52 204.09 150.18 202.38 140.50 201.33 211.59 120 140 180 160 190 200 210.49 220 240 260 137.72 153.63

Dye Signal Dye 0 125 150 175 200 225 250 Size (nt) Slika 38: Kombinacija začetnih oligonukleotidov, uporabljenih za identifikacijo kultivarja 'Rose de Core'. Figure 38: A combination of primers used for the identification of the 'Rose de Core'.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 99 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Pri sorti 'Sicoly' (Slika 39) je edini specifični začetni oligonukleotid Rub 262, ki je bil povezan s homozigotnostjo pri velikosti alelov 213. Ostale kombinacije začetnih oligonukleotidov Rim 19 (174, 181 bp), Rim 17 (195, 197 bp), Rhm 021 (284, 294 bp), Rhm011 (290, 292 bp ) in Rim 15 (352, 356 bp) so povezane s heterozigotnostjo.

65000

60000

194.61 55000

50000

284.58 45000 197.47

40000 285.15 175.22 294.25 35000

30000 355.42 352.40 25000 181.34

20000 212.92

15000 292.41 289.66 211.78 180 10000 291.62 160 179.33 190 220 282.72287.72 300 173.23 200 214.75 240 260 280 285.92 297.99 340 320 360 5000 210.48 285.46 297.53 177.30 209.42 284.06 296.26 171.24 183.37 283.04 293.60 318.02

Dye Signal Dye 0 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 Size (nt) Slika 39: Kombinacija začetnih oligonukleotidov, uporabljenih za identifikacijo kultivarja 'Sicoly'. Figure 39: A combination of primers used for the identification of the 'Sicoly'.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 100 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Pri kultivarju 'Dieffenbach' (Slika 40) je večina specifičnih lokusov Rim 19 (179, 181 bp), Rhm 001 (287, 291 bp), Rim 15 (352, 356 bp), Rhm 043 (357, 367 bp) heterozigotih. Homozigotna lokusa sta bila Rhm 003 (velikost alelov 195 bp) in Rim 17 (199 bp).

80000

198.78 70000

60000

355.37 352.64 50000

356.45 40000

353.76 60.38

30000 351.63 179.43 197.52 196.17

20000 195.39 70 181.50 367.42 61.50 359.45 60 80 358.06 100 90 286.77 57.66 10000 120 177.39 194.46 55.16 140 225.39 160 340 180 190 200 320 220 240 260 280 300 138.56 319.46 339.38 360 380

Dye Signal Dye 0 50 100 150 200 250 300 350 Size (nt) Slika 40: Kombinacija začetnih oligonukleotidov, uporabljenih za identifikacijo kultivarja 'Dieffenbach'. Figure 40: A combination of primers used for the identification of the 'Dieffenbach'.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 101 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

5 SKLEPI

Naša raziskava je obsegala 2 dela. V 1. smo preučevali starodavne tipe malinjakov ob gradovih, zapuščenih samostanih in bližnjih naseljih v severovzhodni Sloveniji. Na podlagi dobljenih rezultatov lahko potrdimo domneve, da med populacijami divjih in kultiviranih genotipov malinjakov obstajajo genetske in morfološke razlike. Genetske in morfološke razlike obstajajo tudi med malinjaki, ki rastejo v okolici srednjeveških gradov in opuščenih samostanov ter med kultiviranimi sortami.

V ekstremnih okoljskih razmerah se malinjaki ohranjajo z vegetativnim razmnoževanjem. Razmnoževanje s semeni je redko oz. zanemarljivo. Hipotetični srednjeveški genotipi so najverjetneje rastline primitivnega videza, ki rastejo ob ruševinah zapuščenih samostanov ali gradov. Zaradi kontinuiranega vegetativnega razmnoževanja so te rastline v veliki meri ohranile svojo genetsko strukturo nespremenjeno že več stoletij. Spremembe, ki so nastale (to so spremembe, ki omogočajo lažje preživetje v težkih razmerah), so najverjetneje posledica postopne akumulacije mutacij ali pa so epigenetske narave. Zaradi teh sprememb so se postopno pojavljale dolčene genotipske in fenotipske razlike med posameznimi (mikro) lokacijami.

V 2. delu smo se osredotočili na kultivirane sorte, kjer smo demonstrirali, da lahko z določenimi kombinacijami mikrosatelitskih markerjev določimo sorte malinjakov. Sortna značilnost se ujema ne glede na izvor. Tako se z molekulskimi markerji lahko v praksi preveri identičnost žlahtniteljskih materialov v katerikoli fazi razvoja in neodvisno od okolja ter na ta način pospešijo in poenostavijo procesi potrjevanja novih kultivarjev.

Starodavni genotipi malinjakov ob srednjeveških gradovih in samostanih do sedaj še niso bili sistematično raziskovani. Da bi prišli do natančnejših podatkov, bi bilo dobro vključiti Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 102 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

tudi genotipe iz drugih podobnih lokacij. Prav tako pa bi bile zelo koristne tudi ekološke, citološke in biokemijske analize.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 103 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

6 POVZETEK

6.1 Povzetek

Malinjaki (Rubus idaeus L.) so pomembna kultivirana rastlinska vrsta, razširjena na večini zmernih območij sveta. Zaradi številnih zdravilnih lastnosti se njihovi plodovi uporabljajo v prehrani ter v farmacevtski in kozmetični industriji. Potrebe po malinah se na trgu neprestano povečujejo. Pojavljajo se nove sorte, ki dosegajo višje pridelke, imajo večje in bolj aromatične plodove z višjo vsebnostjo antioksidantskih molekul ter odpornejše na bolezni in škodljivce. Vsaka sorta predstavlja intelektualno lastnino in je zaščitena z žlahtniteljsko pravico, ki pripada kreatorju/kreatorjem sorte. Za zaščito intelektualne lastnine oz. žlahtniteljskih pravic je zelo pomembno, da je na razpolago metoda, ki omogoča hitro in zanesljivo identifikacijo sort.

Genetsko variabilnost lahko vrednotimo na 2 načina: na fenotipski ravni s pomočjo morfoloških deskriptorjev ali pa na molekulski ravni s pomočjo molekulskih markerjev. Za malinjak e je značilna zelo visoka genetska variabilnost in zato je na osnovi morfoloških lastnosti oz. morfoloških markerjev težko identificirati posamezne genotipe. Izraženost morfoloških lastnosti je zelo odvisna od okolja in starosti rastlin. Morfološke razlike med posameznimi genotipi so pogosto premajhne, da bi jih lahko opazili in ovrednotili. Nove metode, povezane z molekulskimi markerji, so neodvisne od okoljskih dejavnikov in stadija razvoja (starosti) rastlin.

1. del naše raziskave je obsegal molekulske analize genetske sorodnosti med malinjaki, zbranimi okoli izbranih srednjeveških gradov, zapuščenih kartuzijanskih samostanov in bližnjih vaseh severovzhodne Slovenije. Predvidevali smo, da bi lahko hipotetične srednjeveške genotipe zasledili ob nekaterih ruševinah srednjeveških zgradb, ki so jih uporabljali v času fevdalne dobe, vendar so jih pozneje opustili. Ti genotipi so preživeli v naravnih razmerah najverjetneje brez generativnega razmnoževanja (razmnoževanja s Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 104 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

semeni) vsaj 3 stoletja. Molekulska analiza je temeljila na mikrosatelitskih markerjih. S pomočjo dendrograma smo razvrstili analizirane genotipe v 7 glavnih skupin. Analize so pokazale, da so bili najverjetnejši srednjeveški genotipi pobrani blizu 2 kartuzijanskih samostanov: v Žičah in Jurkloštru. Rastline so bile morfološko podobne, bujne rasti, primitivnega videza, vendar to niso bili divji genotipi. Njihova višina je presegala 2,3 m, stebla so bila srednje voskasta, spodnji in zgornji deli poganjkov so imeli redke in kratke bodice, srednji del stebla pa je bil bolj ali manj povsem gladek. Listi so bili dolgi 15–25 cm, socvetja pa so bila majhna, s sorazmerno malo in majhnimi cvetovi. Plodovi so bili v primerjavi s kultiviranimi genotipi veliko manjši, ovalno-stožčaste oblike in zelo aromatični.

2. del raziskave je bil povezan z identifikacijo sort s pomočjo molekulskih markerjev. Od 31 lokalnih in kultiviranih sort smo izbrali 7 sort malinjakov (‘Glen Ample’, ‘Tulameen’, ‘Meeker’, ‘Polka’, ‘Rose de Core’, ‘Sicoly’, ‘Dieffenbach’), ter jih identificirali s pomočjo posebej pripravljene metodologije. Pri tem smo uporabili 19 parov začetnih oligonukleotidov. Za identifikacijo vsakega kultivarja smo odbrali 6 ali 7 specifičnih mikrosatelitskih lokusov. Z izbranimi kombinacijami teh lokusov smo dobili 'prstni odtis' za posamezne sorte, ki nam je omogočil njihovo identifikacijo.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 105 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

6.2 Summary

Red raspberries (Rubus idaeus L.) are important commercial fruit plants, widespread throughout temperate regions. They are used for many purposes such as food, medicinal plants as well as in pharmaceutical and cosmetic industry. The demands for raspberries in the market are constantly increasing. There are many traditional and new improved varieties which are characterized by higher yields and are more resistant to pests and diseases. Their fruits are larger and more aromatic, with higher content of antioxidant substances. Each variety is a result of a systematic breeding and presents intellectual property protected by law. For the protection of intellectual property, it is very important to have an efficient method which enables fast and accurate determination of each variety and clear differentiation from other varieties.

The genetic variability can be evaluated in two ways: on the phenotypic level with morphological descriptors and on the molecular level with molecular markers. Particularly DNA markers can provide information about the relationships between different clones or strains that are difficult or impossible to distinguish morphologically. The molecular markers have many advantages and, if properly chosen, they are more accurate than morphological descriptors. The incorporation of new methodologies into plant material certification schemes will accelerate and optimize the identification process by allowing fingerprinting of each genotype at any stage of the development and independently of environmental factors that may influence the phenotype.

The first part of our investigation was based on a molecular study of the genetic relationships amongst raspberry plants collected around selected medieval castles, Carthusian monasteries and nearby villages. We assumed that the hypothetical medieval raspberry genotypes could be traced to isolated medieval settlements that used to be highly prosperous during the feudal era but were later abandoned. These genotypes survived in natural conditions without seed multiplication for at least three centuries. Our molecular genetic analysis was based on micro-satellite data. A total of 155 alleles were detected at Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 106 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

18 micro-satellite loci. The clustering method grouped the analysed genotypes into seven main clusters. The analyses indicated that the most probable medieval genotypes had been collected close to two abandoned Carthusian monasteries: Zice and Jurkloster. They were morphologically similar, vigorous, and primitive but obviously not genuine wild genotypes. The plants could be more than 2.3 m high, the canes were medium waxy, the lower and upper parts of the canes were covered by sparse short spines, the mid part was more or less completely smooth, the fully-developed leaves were 15-25cm long, the inflorescences were loose. In addition, the flowers were relatively small, the fruit settings were poor and the fruits were small, ovoid to conical and very aromatic (more than those of modern cultivars).

In the second part, the aim of our investigation was to choose (from 31 cultivated raspberry varieties) seven varieties (‘Glen Ample’, ‘Tulameen’, ‘Meeker’, ‘Polka’, ‘Rose de Core’, ‘Sicoly’, ‘Dieffenbach’) and identify them by using SSR molecular markers. Nineteen microsatellite primer pairs used in previous studies were selected for the molecular evaluation of the genetic diversity. For a successful analysis, the optimization of primers is essential due to different laboratory working conditions. The optimal annealing temperature for each primer pair was determined by the PCR gradient. Based on the results of the gradient optimization for all nineteen primer pairs, a single common annealing temperature was selected. Seven raspberry varieties were chosen to develop a protocol for identification. Based on the molecular data the most specific microsatellite loci for each of the seven selected cultivars were chosen. For identification of each cultivar, six or seven selected microsatellite loci were used. With the selected microsatellite loci a fingerprint for each individual variety was obtained. The obtained fingerprints were variety specific and could be used for their reliable identification.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 107 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

7 VIRI

Agriculture and Agri-Food Canada 2014 /Elektronski vir/

http://pgrc3.agr.gc.ca/cgi-bin/npgs/html/desclist.pl?85 (16. avgust 2014).

Alice LA, Champbell CS. 1999. Phylogeny of Rubus (Rosaceae) based onnuclar ribosomal

DNA internal transcribed spancer region sequences. Am. J Bot., 86,1: 81–97.

Alice LA, Eriksson T, Eriksen B, Campbell CS. 2001. Hybridization and gene flow

between distantly related species of Rubus (Rosaceae): Evidence from nuclear

ribosomal DNA internal transcribed spacer region sequences. Sys. Bot., 26,4: 769–

778.

Anttonen MJ, Karjalainen RO. 2005. Environmental and genetic variation of phenolicc

ompounds in red raspberry. J Food Compos. Anal., 18: 759–769.

Armour AL, Neumann R, Gobert S, Jeffreys AJ. 1994. Isolation of human simple repeat

loci by hybridization selection. Human Mol. Genet., 4: 599–605.

Berger X. 1953. Untersuchungen ueber die Embryologie partiell apomiktischer

Rubusbastarde Berichte der Schweizerischen Botanischen Gesellschaft, 63: 224–266.

Beridze T. 1980. Properties of satellite DNAs of higher plants. Plant Sci. Lett., 4: 325–338.

Blamey M, Grey-Wilson C. 1989. The illustrated flora of Britain and Northern Europe,

London: 355–367.

Bohanec B. 1992. Tehnike tkivnih kultur. Tehnična založba Slovenije, Ljubljana.

Botanical garden – Rumeni malinjak (Rubus ellipticus L.) /Elektronski vir/

www.botanicalgarden.ubc.ca (11. maj 2014).

Božič B. Zgodovina slovenskega naroda. 1969. Prešernova družba, Ljubljana: 24 str.

Brown TA. 2007. Genomes 2. New York, Garland Science Publishing: 55–71 str. Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 108 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Bushakra JM, Stephens MJ, Atmadjaja AN, Lewers KS, Symonds VV, Udall JA, Chagné

D, Buck EJ, Gardiner SE. 2012. Construction of black (Rubus occidentalis) and red (R.

idaeus) raspberry linkage maps and their comparison to the genomes of strawberry,

apple and peach. Theor. Appl. Genet., 125,2: 311–27.

Castillo NPF, Reed BM, Graham J, Fenandez F, Bassil NV. 2010. Microsatellite markers

for raspberry and blackberry. Soc. Hort. Sct., 271–278.

Chabane K, Ablett G, Cordeiro G, Valkoun J, Henry R. 2005. EST versus genomic derived

microsatellite markers for genotyping wild and cultivated barley. Genet. Res. Crop

Evol., 52: 903–909.

Chapman MA, Hvala J, Strever J, Matvienko M, Kozik A, Michelmore RW, Tang S,

Knapp SJ, Burke JM. 2009. Development, polymorphism, and cross-taxon utility of

EST-SSR markers from safflower (Carthamus tinctorius L.). Theor. Appl. Genet., 120:

85–91.

Chisten X. 1950. Untersuchungen ueber die Embryologie pseudogamer und

sexueller Rubusarten. Berichte der Schweizerischen Botanischen Geselschaft, 60: 153–

198.

Czapik R. 1981. Elementary apomictic processes in Rubus L. Acta Societatis Botanicorum

Poloniae, 50: 201–204.

Črni malinjak (R.occidentalis) – Good earth food alliance - /Elektronski vir/

www.goodearthfoodalliance.com (11. maj 2014).

Debnath SC. 2007. Fruit Science Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) markers and

pedigree information to assess genetic diversity and relatedness within raspberry

genotypes., Int. J Fruit Sci., 7,4: 1–17.

Dice LR, 1945. Measures of the amount of ecologic association between species. Ecol., 26:

297–302. Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 109 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Dossett M, Bassil NV, Finn CE. 2010. Transferability of Rubus microsatellite markers to

black raspberry. Acta Hort., 859: 103–110.

Doyle JJ, Doyle JL. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12: 13–15.

Edwards K, Johnstone C, Thompson C. 1991. A simple andrapid method for the

preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res., 19: 1349.

Eisen JA, Goldtein DB, Schloetterer C. 1999. Mechanistic basis for microsatellite

instability: Microsatellites – evolution and applications. Oxford, Oxford Univerity

Press: 34–48.

Factfish Raspberries - Proizvodnja malin /Elektronski vir/

http://www.factfish.com/statistic-country/russia/raspberries,+production+quantity

(23. marec 2013).

Fann JY, Kovarik A, Hemleben V, Tsirekidze NI, Beridze TG. 2001 Molecular and

structural evolution of Citrus satellite DNA. Theor. Appl. Genet., 103: 1060–1073.

Fedorov AA. 1969. Chromosome numbers of flowering plants. Nauka, Leningrad.

Fernandez-Fernandez F, AntanaviciuteL, Govan CL, Sargent DJ. 2011. Development of a

multiplexed microsatellite set for fingerprinting red raspberry (Rubus idaeus)

germplasm and its transferability to other Rubus species. J Berry Res., 1: 177–187.

Focke WO. 1881. Die Pflanzenmischlinge. Borntraeger, Berlin, Nemčija.

FURS – Ministrstvo za kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano RS; Fitosanitarna uprava RS;

Uradni list RS, št. 27/05 /Elektronski vir/ http://www.furs.si/svn/seme/VarSortEU.asp

(feb 2010)

Garcia A, Barbas C, Aguilar R, Castro M. 1998. Capillary electrophoresis for rapid

profiling of organic acidurias. Clin. Chem., 44: 1905–1911.

Gestrin F. 1991. Slovenske dežele in zgodnji kapitalizem. Slovenska matica Ljubljana: 37 str. Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 110 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Gruden J. Zgodovina slovenskega naroda. 1912. Družba sv. Mohorja v Celovcu: 5, 13

pogl.

Graham J, McNicol RJ. 1995. An examination of the ability of RAPD markers to

determine the relazionships within and between Rubus species. Theor. Appl. Genet.,

90: 1128–1132.

Graham J, Smith K, Woodhead M, Russel J. 2002. Development and use of simple

sequence repeat SSR markers in Rubus species. Mol. Ecol., 2, 3: 250–252.

Graham J, Smith K, MacKenzie K, Jorgenson L, Hackett C, Powell W. 2004. The

construction of a genetic linkage map of red raspberry (Rubus idaeus subsp. idaeus)

based on AFLPs, genomic-SSR and EST-SSR markers. Theor. Appl. Genet., 109: 740–

749.

Graham J,Woodhead M, Smith K, Russell J, Marshall B, Ramsay G, Squire G. 2009. New

Insight into Wild Red Raspberry Populations using Simple Sequence Repeat Markers.

Amer. Soc. Hort. Sci., 134(1): 109–119.

Gross M, Gathof BS, Kolle P, Gresser U. 1995. Capillary electrophoresis for screening of

adenylosuccinate lyase deficiency. Electrophoresis 16: 1927–1929.

Hagelberg E, Gray IC, Jeffreys AJ. 1991. Identification of the skeletal remains of a murder

victim by DBA analysis. Nature, 352: 427–429.

Hamada H, Petrino MG, Kakunaga T. 1982. A novel repeated element with Z-DNA-

forming potential is widely found in evolutionatily diverse eukaryotic genoms. Proc.

Natl. Acad. Sci. Biochem., 79: 6565–6569.

Haskell G. 1960. The raspberry wild in Britain. Watsonia, 4: 238–255.

Hegi G. 2003. Illustrierte flora von mitteleuropa. Parey Buchverlag, Berlin: 231 str.

Hayashi E, Chi HC, Bayer SK, Still DW. 2005. Amplified fragment lenght polymorphism

protocol for plant science on CEQ series genetic analysis system. Beckman Coulter. Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 111 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Hong JH, Kwon YS, Kim Y, Kim EJ, Soh EH, Choi KJ. 2014. Construction of SSR profile

database for variety identification of blueberry in Korea. Korean J. Breed. Sci.,

46(1): 58–65.

Huang H, Lu J, Ren Z, Hunter W, Dowd SE, Dang P. 2011. Minining and vaildating grape

(Vitis. L.) ESTs to develop EST-SSR markers for genotyping and mapping. Mol.

Breed., 28: 241–252.

Hwang JH, Ahn SG, Oh JY, Choi YW, Kang JS, Park YH. 2011. Functional

characterization of watermelon (Citrullus lanatus L.) EST – SSR by gel electrophoresis

and high resolution melting analysis. Scientia Hort., 130: 715–724.

Jacobus M. 1938. Kartuzijani in kartuzija Pleterje. Zagreb: 124 str.

Jazbec M, Vrabl S, Juvanc J, Babnik M, Koron D. 1995. Sadni vrt, Kmečki glas, Svet

knjige, Ljubljana: 152–153.

Jeffreys JA, Wilson V, Neumann R, Keyte J. 1988. Amplification of human minisatellites

by the polymerase chain reaction: towards DNA fingerprinting of single cells. Nucleic

Acids Res., 16: 23.

Jennings DL. 1988. Raspberries and blackberries: their breeding, diseases and growth.

Academic press, London.

Jogan N, T. Bačič T, B. Frajman B, Leskovar I, Štacmar D, Naglič A, Podobnik B,

Rozman S, Strgulc-Krajšek B, Trčak B. 2001. Gradivo za Atlas flore Slovenije. Center

za kartografijo favne in flore, Miklavž na Dravskem Polju, 324 str.

Kalt W, Forney CF, Martin A, Prior RL. 1999. Antioxidant capacity, vitamin C, phenolics,

and anthocyanins after fresh storage of small fruits. J Agr. Food Chem., 47: 4638–

4644.

Karp A, Edwards KJ. 1995. Molecular techniques in the analysis of the extant and

distribution of genetics diversity. V: Molecular genetic techniques for plant genetic Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 112 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

resources. Report of an IPGRI Workshop, 9: 11–22.

Kollmann J, Steigner T, Roy AB. 2000. Evidence of sexuality in European Rubus

(Rosaceae) species based on AFLP and allozyme analysis. Am. J Bot., 87,11:

1592–1598.

Kozjak P. 2001. Opis sorte Refošk (Vitis vinifera L.) z mikrosatelitskimi markerji.

Magistrsko delo. Ljubljana, Biotehniška fakulteta: 94 str.

Krüssmann G. 1986. Manual of cultivated broad-leaved trees & shrubs, 3: 259–268.

Kump B, Svetek S, Javornik B. 1992. Izolacija visoko molekularne DNK iz rastlinskih

tkiv. Zbornik Biotehniške fakultete. Univerza v Ljubljani, 59: 63–66.

Levinson G, Gutman GA. 1987. Slipped-strand mispairing: a major mechanism for DNA

sequence evolution. Mol. Bio. Evol., 4: 203–221.

Lipp M, Brodmann P, Pietsch K, Puwels J, Anklam E. 1999. IUPAC collaborative trial

study of a method to detect genetically modified beans and maize in dried powder. J

AOAC Int., 82 ,4: 923–928.

Lipp M, Bluth A, Eyquem F, Kruse L, Schimmel L, Van den Eede G, Anklam E. 2001.

Validation of a method based on polymerase chain reaction for the detection

genetically modified organisms in various processed foodstuffs. Euro Food Res

Technol, 212: 497–504.

Liu M, Li XQ, Weber C, Lee CY, Brown J, Liu RH. 2002. Antioxidant and

antiproliferative activities of raspberries. J Agr. Food Chem., 50: 2926–2930.

Martin RR, MacFarlane S, Sabanadzovic S,Quito D, Poudel B, Tzanetakis IE. 2013.

Viruses and virus diseases of Rubus. Plant Disease, 97,2: 168–182.

Martinčič A , Wraber T, Jogan N, Ravnik V, Podobnik A, Turk B, Vreš B. 1999. Mala

flora Slovenije. Tehniška založba Slovenije, Ljubljana: 845 str.

McPherson MJ, Møller SG. 2006. PCR. 2nd ed. Abingdon, Taylor & Francis Group: 292 Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 113 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

str.

Medchrome /Elektronski vir/

http://medchrome.com/basic-science/biochemistry/polymerase-chain-reaction-

principles- and-uses-of-pcr/ (12. avgust 2014).

Meredith JE, Kiosses WB, Takada Y, Schwartz MA. 1999. Mutational analysis of cell

cycle inhibition by integrin β1C. J. Biol. Chem., 274: 8111–8116.

Michelis DA. 2003. Parameters affecting pre.cooling, freezing, storage and transport of red

raspberry fruits, individually frozen in discontinuous tunnels. Comparison among five

varietis of Rubus sp. Int. J Refrigeration, 26: 586–592.

Milutinović MD, Nikolić M, Milivojević J, Milutinović MM, Đaković G. 2008. Growing

primocane rasperry cultivars in Serbia. Acta Hort., 777: 443–446.

Mišić PD. Malina. Zajednica za voće i povrće, Beograd, 1998: 147 str.

Murray MG, Thompson WF. 1980. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.

Nucleic Acids Res., 8,19: 4321–4325.

Naruhashi N, Iwatsubo Y, Peng CI. 2002. Chromosome numbers in Rubus (Rosaceae) of

Taiwan, Bot. Bull. Acad Sin., 43: 193–201.

Nei M. 1987. Genetic distance and molecular phylogeny. V: N. Ryman and F. Utter (Eds.),

Population genetics and fishery management. Seattle, University od Washington press:

193–223.

Nikolić M, Milivojević J. 2010. Jagodaste voćke, Zenum, Poljeprivedni fakultet: 145–258.

OMAFRA - Opisi sort s pomočjo morfoloških deskriptorjev /Elektronski vir/

http://www.omafra.gov.on.ca/english/crops/facts/raspvarc.htm (5. junij 2013).

Paetkau D, Calvert W, Stirling I, Strobeck C. 1995. Microsatellite analysis of population

structure in Canadian polar bears. Mol. Ecol., 4: 347–354.

Pashley CH, Ellis JR, McCauley DE, Burke JM. 2006. EST databases as a source for Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 114 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

molecular markers: Lessons from Helianthus. J Hered., 97: 381–388.

Pellegrini N, Del Rio D, Colombi B, Bianchi M, Brighenti F. 2003. Application of the

2,2'– Azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical cation assay to a flow

injection system for the evaluation of antioxidant activity for some pure compounds

and beverages. J Agr. Food Chem., 51: 260–264.

Perrier JA, Samuelian SK, Weber CA. 2005. DARwin-5.0. Dissimilarity analysis and

representation for windows, user's manual. CIRAD, Montpellier.

Pool RA, Ingram R, Abbot RJ, Jennings DL, Topham PB. 1981. Karyotype variation in

Rubus with special reference to R.idaeus L. and R. coreanus Miquel. Cytol, 46: 125–

132.

Rafalski JA, Tingey SV. 1993. Genetic diagnostics in plant breeding: RAPDs,

microsatellites and machines. Trends Genet., 9,8: 275–280.

Rafalski A. 2002. Applications of single nucleotide polymorphisms in crop genetics. Curr

Opin Plant Biol., 5,2: 94–100.

Rdeči malinjak R.idaeus supsp. strigosus - Wildflower / Elektronski vir/

www.wildflower.org (11. maj 2014).

Roizes G. 1976. A posibble structure for calf satellite DNA. Nucleic Acids Res., 3,10:

2677–2696.

Robbins JA, Moore PP. 1990. Color Change in fresh red raspberry fruit stored at 0, 4.5,

or 20 °C. Hort. Sci., 25,12: 1623-1624.

Ryabova D. 2007. Population evaluation in crop wild relatives for in situ conservation: a

case study for raspberry Rubus idaeus L. in the Leningrad region, Russia. Genet.

Resour. Crop Evol., 54: 973–980.

Saitou N, Nei M, 1987. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing

phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol., 4: 406–425. Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 115 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Sargent DJ, Fernandez-Fernandez F, Rys A. 2007. Mapping of A1 conferring resistance to

the aphid Amphorophora idaei and dw (dwarfing habit) in red raspberry Rubus ideaus

using AFLP and microsatellite markers. BMC Plant Bio., l,7: 15.

Schoetterer C. 2000. Evolutionary dynamics of microsatellite DNA. Chromosoma. 109:

365–371.

Schmidt M. 2009. Intraduction to molecular markers and their application in

biotechnology. /Elektronski vir/ http://www.auxinevodevo.org/Site/Outreach/Workshops/June09/Schmidt_Mol_Markers.pd

f (20. dec 2013).

Sorta 'Tulameen' - Trajnice- Carniola /Elektronski vir/

www.trajnice-carniola.com (21. marec 2013).

Sorta 'Autumn Bliss' - About garden /Elektronski vir/

www.about-garden.com (21. marec 2013).

Sorta 'Heritage' - Poljoprivredni saveti /Elektronski vir/

www. poljoprivrednisaveti.webly.com (21. marec 2013).

Sorta 'Glen Ample' - Hargreave plants /Elektronski vir/

www.hargreavesplants.com (21. marec 2013).

Sorte malin 2014 /Elektronski vir/

http://www.rast-bs.si/katalog/jagodicevje/malina/531#sthash.KyoG5ROR.dpuf

(10. mar 2014).

Sorte malin – Predikat /Elektronski vir/

http://www.predikat.si/jagodicje-in-sparglji/sadike-malin (10. mar 2014).

Stafne ET, Clark JR, Weber CA, Graham J, Lewers KS. 2005. Simple sequence repeat

(SSR) markers for genetic mapping of Raspberry and Blackberry. J Amer. Soc. Hort.

Sci., 130: 722–728. Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 116 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Szoke M, Sasvari-Szekelyb M, Guttmana A. 1999. Ultra-thin-layer agarose gel

electrophoresis: I. Effect of the gel concentration and temperature on the separation of

DNA fragments. J. Chromatogr A., 830,2: 465–471.

Šiško M. 2006. Vrednotenje genetske sorodnosti med vrstami in kultivarji hrušk (Pyrus

ssp.) z molekulskimi markerji. Doktorska dizertacija. Ljubljana. Biotehniška fakulteta:

97–108.

Štajner N. 2010. Mikrosatelitski markerji uporabni za identifikacijo vinske trte (Vitis

vinifera L.). Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Acta agruculturea Slovenica, 95: 183–

192.

Štampar F, Lešnik M, Veberič R, Usenik V, Hudina M, Osterc G. 2005. Sadjarstvo,

Kmečki glas.

Tanović B. 2010. Struktura populacije Botrytis cinerea patogena maline, mogućnost

suzbijanja i procena rizika razvoja rezistentnosti na fungicide. Doktorska disertacija.

Poljoprivredni fakultet, Beograd.

Tautz D, Trick M, Dover GG. 1986. Cryptic simplicity in DNA is a major source of

genetic variation. Nature, 322: 652–656.

Tautz D. 1989. Hypervariability of simple sequence as a general source for polymorphic

DNA markers. Nucleic Acids Res., 16: 6463–6471.

Terzi V, Morcia C, Gorrini A, Stanca AM, Shewry PR, Faccioli P. 2005. DNA-based

methods for identification and quantification of small grain cereal mixtures and

fingerprinting of varieties. J Cereal Sci., 41: 213–220.

Tessier C, David J, This P, Boursiquot JM, Charrier A. 1999. Optimization of the choice of

molecular markers for varietal identification in Vitis vinifera L. Theor. Appl. Genet.,

98: 171–177.

The Plant list - Klasifikacija malin /Elektronski vir/ Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 117 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

http://www.theplantlist.org/browse/A/Rosaceae/Rubus/ (20. december 2013).

Thompson MM. 1995 Chromosome Numbers of Rubus Species at the National Clonal

Germplasm Repository. Hort. Sci., 39,7: 1447–1452.

http://sl.wikipedia.org/wiki/Kapilarna_elektroforeza - cite_ref-1Tiselius A. 1964. "Electrophoresis and Adsorption Analysis as Aids in Investigations of

Large Molecular Weight Substances and Their Breakdown Products". Nobel Lectures,

Chemistry, Elsevier Publishing Company, Amsterdam, 1942–1962.

Tovarna organika /Elektronski vir/

www.tovarnaorganika.si (5. marec 2014).

Trček-Kovše N. 2005. Kmetijska pridelava in reja, sadjarstvo in vinogradništvo. Elanda

d.o.o., Plosovo, Velike Lašče, str. 20–24.

USDA–United States Department of Agriculture Klasifikacija malin /Elektronski vir/

http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=display&classid=RUIDI

(12. februar 2010 in 20. december 2013).

Varma A, Padh H, Shrivastava N. 2007. Plant genomic DNA isolation: an art or a science.

Biotech. J., 2,3: 386–392.

Varshney RK, Graner A, Sorrells ME. 2005. Genic microsatellite markers in plants:

Features and applications. Trends Biotechnol., 23: 48–55.

Vijolični malinjak - Agri starts -(Rubus × neglectus Peck.) /Elektronski vir/

www.agristarts.com (10. maj 2014).

Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, Van de Lee T, Hornes M, Friters A, Pot J,

Paleman J, Kuiper M, Zabeau M. 1995. AFLP: a new technique for DNA

fingerprinting. Nucleic Acids Res., 23: 4407–4414.

Vukosavljević P. 2006. Bistrenje soka maline primenom ultrafiltracije i mikrofiltracije.

Doktorska disertacija. Poljovredni fakultet, Beograd, 11–35. Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 118 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Vulić T, Veličković M, Jevtić V. 1999. Klimatske specifičnosti glavnih malinarskih rejona

Srbije. Zbornik radova XIV savetovanja Unapređenje proizvodnje voća i grožđa,

Beograd, 5: 279–286.

Zhang Y, Dai S, Hong Y, Song X. 2014. Application of genomic SSR locus

polymorphisms on the identification and classification of Chrysanthemum cultivars in

China. Plos one, 9,8: 1–12.

Zulini L, Fabro E, Peterlunger E. 2005. Characterisation of the grapevine cultivar Picolit

by means of morphological descriptors and molecular markers. Vitis, 44: 35–38.

Wada S, Reed B. 2011. Standardizing germination protocols for diverse raspbery and

blackberry species. Sci. Hort., 132: 42–49.

Wagner HW, Sefc KM. 1999. IDENTITY 1.0.Centre for Applied Genetics, University od

Agricultural Sciences Vienna.

Wang SY, Lin HS. 2000. Antioxidant activity in fruits and leaves of blackberry, raspberry

and strawberry varies with cultivar and developmental stage. J Agr. Food Chem., 48:

140–146.

Wang SY, Chen CT, Wang CY. 2009. The influence of light and maturity on fruit quality

and flavonoid content of red raspberries. Food Chem., 112: 676–684.

Wang JH, Chuan KC. 2013. Development of novel microsatellite markers for effective

applications in Anthurium cultivar identification. Euphytica, 189:421–431.

Weber C. 2012. Raspberry varieties review. Department of Horticulture, Cornell

University, 1-5 str. /Elektronski vir/

http://www.fruit.cornell.edu/berry/production/pdfs/raspcultreview2012.pdf (21. marec

2014)

Weber JL, May PE. 1989. Abundant class of human DNA polymorphisms which can be

typed using the polymerase chain reaction. Am. J Hum. Genet., 44: 388–396. Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 119 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Wicke S, Costa A, Munoz J, Quandt D. 2011. Restless 5S: The re-arrangement(s) and

evolution of the nuclear ribosomal DNA in land plants. Mol. PhyGenet. Evol., 61: 321–

332.

Woodhead M, McCallum S, Smith LK, Cardle L, Graham ML. 2008. Identification,

characterisation and mapping of simple sequence repeat (SSR) markers from raspberry

rootand bud ESTs. Mol. Breeding, 22: 555–563.

Woodhead M. Williamson S, Smith K, McCallum S, Jennings N, Hackett C, Graham J.

2013. Identification of quantitative trait loci for cane splittingin red raspberry (Rubus

idaeus).Mol. Breed., 31:111–122.

Wöhrmann T, Weising K. 2011. In silico mining for simple sequence repeat loci in

pineapple expressed sequence tag database and cross-species amplification of EST-

SSR markers across Bromeliaceae. Theor. Appl. Genet., 123: 635–647.

Yang J, Yoon, HS, Pak JH. 2012. Phylogeny of Korean Rubus (Rosaceae) based

on the second intron of the LEAFY gene. Can. J Plant Sci., 92: 461–472.

Yildiz E, Kaplankiran M, Demirkeser TH,Uzun A, Toplu C. 2013. Identification of zygotic

and nucellar Individuals produced from several citrus crosses using SSRs markers. Not.

Bot. Hort.Agrobo., 41,2: 478–484.

Yoshimoto T, Chen S, Armour AL, Katsumata Y. 1999. Sequence analysis of alleses at a

microsatellite locus D14S299 (wg1c5) and population genetic comparisons. Int. J Legal

Med., 113: 15–18.

Young JA,Young CG. 2009. Seeds of woody plants in North America. ERevised and

Enlarged Edition, Portland, Oregon, 12: 307–309.

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin. 120 Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

8 ZAHVALA

Za vso podporo, usmerjanje, svetovanje in strokovno pomoč se zahvaljujem mentorjema izr. prof. dr. Metki Šiško in doc. dr. Andreju Šušku.

Posebna zahvala gre tudi red. prof. dr. Antonu Ivančiču, za vso pomoč, usmerjanje ter strokovne napotke pri nastajanju tega dela.

Dipl. inž. kmet. Anji Ivanuš ter uni. dipl. biokem. Andreji Šober se zahvaljujem za vso tehnično pomoč v laboratoriju.

Zahvaljujem se tudi prijateljicam Melisi Kovačević, Klavdiji Gorenčič in Vesni Weingerl za vso podporo in nesebično pomoč.

Največja zahvala pa gre mojim domačim, da ste mi v vseh teh letih truda, odrekanj stali ob strani in verjeli vame.

Iskreno se zahvaljujem tudi vsem tistim, ki ste kakorkoli pripomogli k nastanku tega dela.

Naloga je bila delno sofinancirana iz evropskega projekta QualiRedFruits (New agricultural practices for quality production of red fruits enriched in healthy compounds; Grant Agreement number: 262030, Funding Scheme: FP7-SME-2010. Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

9 PRILOGE

Priloga 1: Koncentracije izolirane DNA 161 genotipov malinjakov

Preglednica 1: Izmerjene koncentracije DNA.

Table 1: Concentrations of DNA.

Vzorec Kultivar / Izvor / Lokacija Koncentracija (ng/ µl)

1213,00 R1A 'Glen Ample' 1485,00 R2A 'Tulameen' 1443,00 R3A 'Meeker' 953,00 R4A 'Polka' 1477,00 R5A Maribor 482,50 R6B 'Samodiva' 135,40 R7D 'Iskra' 576,60 R8D 'Latham' 218,90 R9B 'Schopska alena' 420,60 R10A 'Iskra' 272,10 R11B 'Samodiva' 303,40 R12A 'Schopska alena' 164,50 R13B 'Latham' 431,40 R14A 'Iskra' 529,70 R15A 'Bolgarski rubin' 471,30 R16C 'Schopska alena'

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 1: se nadaljuje Table 1: (cont.)

Vzorec Kultivar / Izvor / Lokacija Koncentracija (ng/ µl)

494,80 R17A 'Eva' 180,10 R18C 'Elida'

R19B 'Coscode Delight' 693,60

R20C 'Glen Ample' 305,10

R21A 'Tula magic' 752,40

R22B 'Willa Mette' 845,50

R23A 'Meeker' 615,80

R24C Studenški gozd 1 874,90

R25B Studenški gozd 2 828,00

R26B Studenški gozd 3 789,80

R27A Avtobusna postaja, grad Hompoš 364,70

R28A '' 256,90

R30A '' 583,70

R31A '' 507,80

R32B '' 475,80

R33A '' 569,80

R34B '' 261,00

R35A Vila Pivola ob gradu Hompoš 700,30

R36A '' 232,80

R37A '' 246,70

R39B '' 207,80

R40A Hočko Pohorje 319,10

R41B '' 273,00 Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 1: se nadaljuje Table 1: (cont.)

Vzorec Kultivar / Izvor / Lokacija Koncentracija (ng/ µl)

R42A '' 349,70

R43A '' 524,30

R44A 'Polka' 148,80

R45A 'Heritage' 342,70

R46A 'Himbo' 307,10

R47A 'Nr 26 TR' 138,50

R48B Hočko Pohorje 220,00

R49A '' 123,60

R50B '' 218,40

R51B '' 95,03

R52A '' 189,80

R53A '' 131,30

R54B '' 137,40

R55A 'Royalty' 263,80

R56B 'Rose de Core' 289,80

R57A Pod Kumom 156,30

R58B Kopitnik nad Z.M '' 172,40

R59A Pohorje. 294,60

R60B 'Sicoly' 162,60

R61A 'Dieffenbach' 547,90

R62B 'Himbo top' 479,90

R63A 'Sugana' 486,80

R64A 'Autam Bliss' 566,90 Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 1: se nadaljuje Table 1: (cont.)

Vzorec Kultivar / Izvor / Lokacija Koncentracija (ng/ µl)

R65A 'Heritage' 476,80

R66A 'Polka' 427,00

R67B Ob gradu Borl, Ptuj 637,50

R68B Meljski hrib, Maribor 577,50

R69A Grad Viltuš, Sp. Slemen 241,00

R70C Muretinci, Ptuj 490,30

R71B Rače, Delavska 290,90

R72B Rački ribniki, Rače 357,90

R73F Grad Vurberk, Ptuj 260,40

R74A Jakobski dol 256,60

R75A Orehova vas, Piškova ul., Rače 335,40

R76A Pernica 340,00

R77B Fram 152b, Rače- Fram 288,20

R78A Piramida 333,20

R79B Sv. Tomaž pri Ormožu 412,10

R80B Ješenca, Rače 415,80

R81B Piramida A 312,50

R82A Piramida B 400,00

R83B Trebnje A, Kidričeva 10 231,00

R84 Trebnje B, Kidričeva 10 200,40

R85B Kopivnik nad Framom 103,60

R86A Pesnica 122,10

R87B Malečnik 1 176,90 Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 1: se nadaljuje Table 1: (cont.)

Vzorec Kultivar / Izvor / Lokacija Koncentracija (ng/ µl)

R88B Malečnik 2 94,99

R89A Zrkovci 116,60

R90A Bolgarija 1 337,30

R91A Bolgarija 2 272,60

R92B Bolgarija 3 112,50

R93A Bolgarija 4 286,80

R94A Bolgarija 5 203,90

R95B 'Polka' 274,80

R96A 'Polka' 174,00

R97B 'Polka' 231,60

R98A 'Tulameen' 721,60

R99B 'Iskra' 211,20

R100A 'Schopska alena' 289,00

R101B 'Schopska alena' 115,00

R102B 'Rose de Core' 536,00

R103A Jurklošter (št. 19), Jurklošter pri 402,00 Laškem

R104A '' 152,60

R105B '' 315,30

R106A '' 582,00

R107B Kartuzijanski samostan Jurklošter 164,10

R108A '' 119,50

R109B '' 106,40 Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 1: se nadaljuje Table 1: (cont.)

Vzorec Kultivar / Izvor / Lokacija Koncentracija (ng/ µl)

R110B '' 119,80

R111B '' 277,50

R112B '' 96,62

R113B '' 295,70

R114A Rifnik (Ljubečna) 92,10

R115A '' 78,44

R116A '' 65,87

R117A Kartuzijanski samostan Žiče 493,16

R118B '' 302,80

R119B '' 296,60

R120B '' 204,90

R121A '' 360,60

R122B '' 568,20

R123A '' 111,80

R124B '' 88,30

R125B '' 284,60

R126A '' 612,60

R127A Kartuzijanski samostan Žiče, vas 397,70 Špotalič (št.5)

R128A '' 94,93

R129B Grad Negova 91,76

R130B '' 104,40

R131A '' 76,48 Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 1: se nadaljuje Table 1: (cont.)

Vzorec Kultivar / Izvor / Lokacija Koncentracija (ng/ µl)

R132B '' 121,50

R133A Grad Negova, Negova (št.5) 96,37

R134B '' 91,01

R135A '' 134,00

R136C Grad Cmurek (Trate 7a) 208,70

R137A '' 108,00

R138B '' 191,40

R139B Grad Hrastovec 357,90

R140A '' 148,70

R141B '' 345,50

R142A Grad Velika Nedelja 330,90

R143A '' 592,00

R144A Velika Nedelja (št. 3) 156,80

R145B '' 104,80

R146B '' 34,50

R147B Grad Velika Nedelja, Sodinci 1 42,74

R148A '' 103,70

R149C '' 168,00

R150B '' 63,79

R151B '' 169,50

R152B Grad Ravno polje, Kungota pri Ptuju 93,96

R153A '' 146,50

R154A '' 11,23 Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 1: se nadaljuje Table 1: (cont.)

Vzorec Kultivar / Izvor / Lokacija Koncentracija (ng/ µl)

R155A '' 18,85

R156B Grad Cmurek, Trate 1 74,47

R157A '' 24,38

R158B Grad Ravno polje, Kungota pri Ptuju 223,30

R159B '' 637,80

R160B '' 620,00

R161B '' 436,10

R162B '' 634,00

R163B '' 399,70

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Priloga 2: Identificirani aleli 117 genotipov malinjakov

Preglednica 2: Aleli Table 2: Alelles

Kultivar Rim 17 Rim 17 Rub Rub Rim 15 Rim 15 Rub Rub Rub Rub Rhm Rhm Rhm Rhm Rhm Rhm 262 262 228 228 277 277 021 021 023 023 001 001

1 195 195 217 217 354 354 136 166 235 243 284 284 197 197 239 239

2 195 195 207 221 354 354 146 148 235 235 284 284 197 197 237 239

3 195 195 217 221 354 366 140 140 235 235 284 284 197 197 237 237

4 193 193 207 209 356 356 140 148 235 235 284 284 197 197 239 239

5 195 195 207 217 354 354 146 158 233 235 284 284 197 197 239 239

10 195 195 207 217 354 356 150 152 233 235 284 284 197 197 237 239

11 195 195 217 219 352 356 126 148 233 233 284 284 197 197 237 239

12 195 195 217 219 352 356 126 152 237 239 284 284 197 197 237 239

13 197 197 213 219 354 356 116 126 233 249 284 288 197 197 237 237

14 193 193 217 219 352 356 126 152 237 239 286 286 197 197 237 239

15 193 193 205 219 352 356 126 148 233 235 284 284 197 197 237 237

16 193 193 205 207 356 356 142 152 235 235 284 284 197 197 237 237

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje Table 2: (cont.)

Kultivar Rim 17 Rim 17 Rub Rub Rim 15 Rim 15 Rub Rub Rub Rub Rhm Rhm Rhm Rhm Rhm Rhm 262 262 228 228 277 277 021 021 023 023 001 001

17 195 195 205 209 354 356 148 148 235 243 284 284 197 197 237 239

18 193 193 217 219 352 356 148 148 233 235 284 284 197 197 237 237

19 195 195 207 221 354 354 148 148 235 235 284 284 197 197 237 239

20 195 195 217 217 354 354 134 134 235 243 284 284 197 197 239 239

21 195 195 207 219 352 352 148 148 235 235 284 284 197 197 237 239

22 195 195 205 217 354 356 126 148 235 235 284 284 197 197 237 237

23 195 195 217 221 352 364 142 148 235 235 284 284 197 197 237 237

24 191 193 217 219 352 352 112 126 255 255 282 288 197 197 231 235

25 191 193 209 223 352 352 112 120 255 307 208 288 197 197 229 235

26 193 193 209 217 350 350 134 134 255 307 282 286 197 197 229 235

27 195 195 207 209 352 352 122 138 233 233 284 284 197 197 237 239

35 185 195 207 221 352 352 136 146 237 237 284 284 197 197 237 239

40 195 195 209 213 354 354 112 112 233 237 284 284 197 197 237 237

41 195 197 209 213 354 354 140 144 235 235 284 284 197 197 237 237

42 193 197 207 211 352 352 140 146 233 233 284 284 197 197 237 237 Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje Table 2: (cont.)

Kultivar Rim 17 Rim 17 Rub 262 Rub 262 Rim 15 Rim 15 Rub 228 Rub 228 Rub 277 Rub 277 Rhm 021 Rhm 021 Rhm 023 Rhm 023 Rhm 001 Rhm 001

43 197 197 209 213 354 354 112 166 233 237 284 284 197 197 237 237

44 195 195 207 209 356 356 142 148 235 235 284 284 197 197 237 239

45 195 195 207 213 352 356 142 148 235 235 284 294 197 197 237 237

46 193 193 217 219 352 356 148 148 235 235 284 284 197 197 237 237

47 199 199 221 221 352 356 148 164 235 235 284 284 197 197 237 239

48 193 195 209 217 354 354 130 158 235 237 284 284 197 197 237 237

49 193 195 209 217 352 352 156 158 235 237 284 284 197 197 237 237

50 195 197 207 209 354 354 162 162 235 235 284 284 197 197 237 239

51 195 195 207 221 352 352 146 158 233 235 284 284 197 197 237 239

52 195 195 207 207 354 354 146 158 233 235 284 284 197 197 237 239

53 193 193 207 207 352 352 146 158 233 235 284 284 197 197 237 239

54 195 195 207 207 354 354 148 158 233 235 284 284 197 197 237 239

55 193 197 203 217 352 352 142 142 233 235 284 284 197 197 239 239

56 195 197 201 211 352 352 116 162 235 235 284 284 197 197 237 237

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje Table 2: (cont.)

Kultivar Rim 17 Rim 17 Rub 262 Rub 262 Rim 15 Rim 15 Rub 228 Rub 228 Rub 277 Rub 277 Rhm 021 Rhm 021 Rhm 023 Rhm 023 Rhm 001 Rhm 001

57 193 193 209 219 362 368 144 156 237 241 284 284 197 197 237 239

58 195 195 215 217 354 362 130 144 233 235 284 284 197 197 235 237

59 197 197 207 215 352 352 136 176 235 235 284 284 197 197 237 237

60 195 197 213 213 352 356 148 148 235 235 284 294 197 197 237 237

61 199 199 221 221 352 356 148 148 235 235 284 284 197 197 237 239

62 193 193 217 219 352 356 146 146 235 235 284 284 197 197 237 237

63 195 195 207 217 352 356 142 152 235 235 284 284 197 197 237 237

64 193 193 217 219 352 356 142 148 235 235 284 284 197 197 237 239

65 195 195 207 213 352 356 142 148 235 235 284 294 197 197 237 237

66 193 193 207 209 356 356 144 148 235 235 284 284 195 197 237 239

67 195 195 207 207 354 354 148 162 233 237 286 286 197 197 237 239

68 195 195 207 221 352 352 136 148 237 237 286 286 197 197 237 239

71 185 195 207 221 354 354 136 148 237 237 284 284 197 197 239 239

72 185 195 207 221 352 352 136 148 237 237 286 286 197 197 237 239 Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje

Table 2: (cont.)

Kultivar Rim 17 Rim 17 Rub 262 Rub 262 Rim 15 Rim 15 Rub 228 Rub 228 Rub 277 Rub 277 Rhm 021 Rhm 021 Rhm 023 Rhm 023 Rhm 001 Rhm 001

73 185 185 207 221 350 350 130 146 255 255 284 284 197 197 247 247

74 185 195 207 221 352 352 136 148 237 237 284 284 197 197 237 239

75 185 195 207 221 352 352 136 148 237 237 284 284 197 197 237 239

76 185 195 207 221 352 352 136 148 237 237 284 284 197 197 237 239

77 185 195 207 221 354 354 136 148 237 237 284 284 197 197 237 239

78 185 195 207 221 352 352 136 148 237 237 284 284 197 197 237 239

79 195 195 205 217 352 356 126 148 235 235 284 284 197 197 237 237

80 185 195 207 221 352 352 136 148 237 237 284 284 197 197 237 239

81 185 195 207 221 352 352 134 148 235 241 284 284 197 197 237 239

82 195 199 215 219 352 358 120 140 235 241 286 286 197 197 235 237

83 195 195 207 209 352 352 120 148 235 237 284 284 197 197 239 241

84 195 195 207 209 352 352 120 148 235 237 284 284 197 197 237 239

85 185 195 207 221 352 352 136 148 237 237 284 284 197 197 237 239

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje Table 2: (cont.)

Kultivar Rim 17 Rim 17 Rub 262 Rub 262 Rim 15 Rim 15 Rub 228 Rub 228 Rub 277 Rub 277 Rhm 021 Rhm 021 Rhm 023 Rhm 023 Rhm 001 Rhm 001

86 195 195 205 217 352 352 142 148 233 235 284 290 197 197 237 237

87 195 199 215 219 352 358 120 140 235 241 284 284 197 197 235 237

88 195 199 215 219 352 358 120 140 235 241 284 284 197 197 235 237

89 195 195 205 217 352 352 120 140 233 237 284 290 197 197 237 239

90 195 195 209 209 352 362 130 140 235 239 284 284 197 197 237 237

91 195 195 209 209 352 362 130 140 235 239 284 284 197 197 237 237

92 195 195 209 209 352 362 130 140 235 239 284 284 197 197 237 237

93 195 195 209 209 352 362 130 140 235 239 284 284 197 197 237 237

94 195 195 209 229 352 362 130 140 235 239 284 284 197 197 237 237

103 195 201 207 211 352 358 140 160 235 235 284 284 197 197 237 237

105 195 201 205 215 352 358 142 160 235 235 284 284 197 197 237 237

106 195 201 205 211 352 358 142 160 235 235 284 284 197 197 237 237

107 195 195 207 211 356 356 142 148 235 235 284 284 197 197 237 237

111 197 197 207 207 352 352 116 124 235 239 284 284 197 197 237 239

113 199 199 209 219 352 352 116 124 235 239 284 284 197 197 237 239 Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje Table 2: (cont.)

Kultivar Rim 17 Rim 17 Rub 262 Rub 262 Rim 15 Rim 15 Rub 228 Rub 228 Rub 277 Rub 277 Rhm 021 Rhm 021 Rhm 023 Rhm 023 Rhm 001 Rhm 001

118 197 197 217 231 352 362 116 116 237 239 284 284 197 197 237 237

119 197 197 205 217 352 352 116 116 237 239 284 284 197 197 237 237

121 195 199 215 215 352 352 146 164 235 237 284 284 197 197 237 237

122 195 197 215 215 352 352 146 164 235 237 284 284 197 197 237 237

124 195 197 213 215 352 352 146 162 235 237 284 284 197 197 237 237

126 185 195 207 221 352 352 136 148 237 237 284 284 197 197 237 239

127 185 195 207 221 352 352 136 148 237 237 284 284 197 197 237 239

128 195 195 205 217 352 356 126 148 235 235 284 284 197 197 237 237

129 185 195 205 217 352 352 126 146 233 235 284 290 197 197 237 239

130 195 195 205 217 352 352 126 148 233 235 284 290 197 197 237 239

131 195 195 205 217 352 352 142 148 233 235 284 290 197 197 237 239

132 195 195 205 217 352 352 142 148 233 235 284 290 197 197 237 237

133 195 195 205 217 352 352 142 148 233 237 284 290 197 197 237 239

134 195 195 217 217 352 356 142 148 235 235 284 284 197 197 237 237

135 195 195 205 217 352 352 142 148 233 235 284 290 197 197 237 239 Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje Table 2: (cont.)

Kultivar Rim 17 Rim 17 Rub 262 Rub 262 Rim 15 Rim 15 Rub 228 Rub 228 Rub 277 Rub 277 Rhm 021 Rhm 021 Rhm 023 Rhm 023 Rhm 001 Rhm 001

136 189 195 205 217 352 352 142 148 233 235 284 290 197 197 237 239

137 195 199 215 219 352 358 126 142 233 239 284 284 197 197 235 237

138 195 199 215 219 352 358 120 138 235 241 284 286 197 197 235 237

139 195 199 215 219 352 358 120 140 235 243 284 284 197 197 235 237

140 195 195 209 217 352 354 126 148 235 235 284 284 197 197 237 237

141 195 195 205 217 352 356 126 148 235 235 284 284 197 197 237 237

142 195 195 205 205 352 356 126 148 235 235 284 284 197 197 237 237

143 195 195 205 217 352 352 142 148 233 235 284 290 197 197 237 239

144 195 195 205 217 352 352 136 148 233 235 284 290 197 197 237 239

145 195 195 205 217 352 352 152 156 233 237 284 286 197 197 237 239

151 195 195 205 217 352 354 126 148 235 235 284 284 197 197 237 237

152 195 199 215 219 352 358 122 138 235 241 284 284 197 197 237 239

153 195 195 215 221 352 364 126 146 235 235 284 286 197 197 237 237

158 185 195 207 221 352 352 126 146 237 237 284 284 197 197 237 239

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje Table 2: (cont.)

Kultivar Rim 17 Rim 17 Rub 262 Rub 262 Rim 15 Rim 15 Rub 228 Rub 228 Rub 277 Rub 277 Rhm 021 Rhm 021 Rhm 023 Rhm 023 Rhm 001 Rhm 001

159 185 195 207 221 352 352 136 148 237 237 284 286 197 197 237 239

160 185 195 207 221 352 352 148 148 237 237 284 286 197 197 237 239

161 185 195 207 221 352 352 148 148 237 237 284 286 197 197 237 239

162 185 195 207 221 352 352 136 148 237 237 284 284 197 197 237 239

163 185 195 207 221 352 352 136 146 235 235 284 286 197 197 237 239

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje

Table 2: (cont.)

Kultivar Rhm 011 Rhm 011 Rhm Rim 019 Rim 019 Rhm 003 Rhm 003 Rhm 043 Rhm 043 Rub 25a Rub 25a Rub Rub Rhm Rhm Rub Rub 011 157b 157b 018 018 108a 108a

1 287 291 0 177 177 195 199 371 373 144 154 170 178 319 379 151 157

2 283 291 0 165 183 195 213 373 373 144 154 208 208 319 379 157 157

3 287 287 0 165 177 199 207 371 373 144 154 208 208 319 379 151 153

4 291 293 0 179 181 195 195 371 373 144 144 272 308 319 379 157 157

5 287 291 0 179 181 197 199 373 373 144 144 272 280 379 379 151 157

10 287 287 0 165 179 199 213 367 373 144 144 228 228 379 379 151 157

11 287 339 0 179 179 199 213 357 359 144 144 228 228 319 379 151 157

12 287 287 0 179 179 197 213 357 357 144 144 228 228 319 379 151 157

13 287 289 0 179 189 195 213 371 373 144 146 228 228 319 379 151 151

14 287 287 0 179 179 197 213 357 373 144 144 228 228 319 379 151 157

15 285 287 0 175 179 203 213 367 367 144 154 228 228 319 379 151 157

16 287 291 0 175 181 197 213 367 367 144 154 228 228 319 379 151 151

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje Table 2: (cont.)

Kultivar Rhm 011 Rhm 011 Rhm Rim 019 Rim 019 Rhm 003 Rhm 003 Rhm 043 Rhm 043 Rub 25a Rub 25a Rub Rub Rhm Rhm Rub Rub 011 157b 157b 018 018 108a 108a

17 287 289 0 177 181 203 207 373 373 144 144 208 226 319 379 151 153

18 287 291 0 165 179 197 213 357 371 154 154 228 228 319 379 151 157

19 283 291 0 165 181 195 213 357 357 144 154 208 272 319 379 157 157

20 287 289 0 177 177 195 199 371 377 144 154 272 272 319 379 151 157

21 283 317 0 181 217 195 195 367 373 144 154 208 208 319 379 157 157

22 287 287 0 165 181 199 207 367 373 144 154 228 278 319 379 151 157

23 285 287 0 165 177 199 207 359 377 144 154 208 208 319 379 151 153

24 289 289 0 163 179 195 195 359 367 156 154 204 204 379 379 167 183

25 281 281 0 177 179 195 195 359 367 156 154 204 204 379 379 167 171

26 279 283 0 163 177 195 195 357 367 154 156 204 204 379 379 171 179

27 303 303 0 189 215 189 189 367 373 152 154 208 208 379 379 153 157

35 289 291 0 165 195 199 199 357 373 144 144 208 208 379 379 153 153

40 279 291 0 173 187 199 203 371 371 144 144 208 208 379 379 153 157

41 279 295 0 177 189 199 199 367 375 154 154 208 208 379 379 151 157

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje Table 2: (cont.)

Kultivar Rhm 011 Rhm 011 Rhm Rim 019 Rim 019 Rhm 003 Rhm 003 Rhm 043 Rhm 043 Rub 25a Rub 25a Rub Rub Rhm Rhm Rub Rub 011 157b 157b 018 018 108a 108a

42 279 291 0 0 177 189 199 199 367 377 154 154 208 208 379 379 151

43 279 291 0 0 173 187 199 203 371 371 144 144 208 208 379 379 153

44 291 293 0 179 181 195 195 357 367 144 144 208 208 319 379 151 157

45 285 293 0 179 181 197 203 367 367 144 144 208 228 319 379 157 157

46 291 291 0 165 181 195 195 367 367 154 154 228 228 319 379 151 157

47 287 291 0 179 181 195 195 367 367 144 154 228 228 319 379 157 157

48 277 291 0 173 179 195 203 373 377 152 154 208 208 379 379 151 151

49 277 291 0 173 179 203 203 373 377 152 154 208 208 379 379 151 151

50 279 307 0 171 177 199 199 371 377 152 154 208 208 379 379 153 157

51 289 289 0 179 189 197 197 371 373 144 144 208 208 379 379 151 153

52 289 307 0 179 189 197 197 371 373 144 144 208 208 379 379 151 153

53 289 291 0 179 189 197 197 371 373 144 144 208 208 379 379 153 153

54 289 307 0 179 189 197 197 371 373 144 144 208 208 379 379 151 153

55 287 291 0 165 179 197 213 367 367 144 154 228 228 319 379 151 159

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje Table 2: (cont.)

Kultivar Rhm 011 Rhm 011 Rhm Rim 019 Rim 019 Rhm 003 Rhm 003 Rhm 043 Rhm 043 Rub 25a Rub 25a Rub Rub Rhm Rhm Rub Rub 011 157b 157b 018 018 108a 108a

56 301 307 0 167 173 203 203 359 367 144 152 208 208 379 379 153 153

57 277 277 0 167 201 201 201 373 373 142 154 202 208 379 379 151 153

58 295 311 0 179 203 199 199 373 377 144 154 208 208 379 379 151 153

59 279 309 0 161 161 201 205 373 377 144 152 208 208 379 379 153 157

60 291 293 0 175 181 195 199 367 371 144 144 228 228 379 379 151 157

61 287 291 0 179 181 195 195 357 367 144 154 228 228 379 379 157 157

62 287 291 0 165 181 195 195 367 367 154 154 228 228 379 379 151 157

63 283 291 0 165 217 195 197 367 373 144 154 208 228 379 379 157 157

64 281 317 0 181 217 195 197 367 373 144 154 228 272 379 379 157 157

65 285 293 0 179 181 197 203 367 367 144 144 208 228 379 379 151 153

66 291 293 0 179 181 195 195 367 367 144 144 272 208 379 379 157 157

67 285 289 0 179 181 199 201 373 373 142 142 272 278 379 379 151 157

68 289 289 0 165 165 201 201 373 373 142 142 206 272 377 393 153 153

71 289 307 0 165 195 201 201 373 373 142 142 206 206 379 379 153 153

72 289 307 0 165 195 201 201 373 373 142 142 206 206 377 377 153 153 Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje Table 2: (cont.)

Kultivar Rhm 011 Rhm 011 Rhm Rim 019 Rim 019 Rhm 003 Rhm 003 Rhm 043 Rhm 043 Rub 25a Rub 25a Rub Rub Rhm Rhm Rub Rub 011 157b 157b 018 018 108a 108a

73 281 283 0 167 173 197 197 353 353 142 142 216 216 379 379 153 153

74 287 307 0 165 165 199 199 373 373 142 142 206 206 377 377 153 153

75 287 307 0 165 165 199 199 373 373 142 142 206 206 379 379 153 153

76 287 307 0 165 165 199 199 373 373 142 142 206 206 377 377 153 153

77 285 285 0 165 165 201 201 373 373 142 142 208 208 379 379 153 153

78 287 307 0 165 165 199 199 373 373 142 142 206 206 379 379 153 153

79 285 285 0 165 165 199 207 373 373 142 152 226 226 377 377 151 159

80 287 307 0 165 165 199 199 357 373 142 142 206 206 377 377 153 153

81 307 307 0 165 165 199 199 373 373 142 142 206 206 377 377 153 153

82 271 271 0 165 177 195 199 373 373 144 152 206 206 377 377 157 157

83 297 309 0 177 177 197 199 371 371 142 142 208 208 377 393 153 157

84 297 307 0 177 177 195 197 373 373 142 142 206 206 377 393 153 157

85 287 307 0 165 165 199 199 373 373 142 142 206 206 377 377 153 153

86 287 287 0 175 179 197 207 373 373 142 152 226 226 377 377 157 157

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje Table 2: (cont.)

Kultivar Rhm 011 Rhm 011 Rhm Rim 019 Rim 019 Rhm 003 Rhm 003 Rhm 043 Rhm 043 Rub 25a Rub 25a Rub Rub Rhm Rhm Rub Rub 011 157b 157b 018 018 108a 108a

87 271 313 0 165 177 197 201 373 373 144 152 206 206 377 393 157 157

88 271 313 0 163 175 195 199 371 371 142 152 206 206 377 377 157 157

89 287 287 0 175 179 197 207 373 373 142 152 226 226 377 377 157 157

90 287 291 0 165 165 203 205 373 377 152 152 206 206 377 377 151 153

91 287 291 0 165 165 203 205 373 377 152 152 206 206 377 377 151 153

92 287 291 0 165 165 203 205 373 377 152 152 206 206 379 379 151 153

93 287 291 0 165 165 203 205 373 377 152 152 208 208 379 379 151 153

94 287 291 0 165 165 203 205 373 377 152 152 206 206 377 377 151 153

103 297 295 0 183 183 207 211 371 373 152 152 206 206 377 377 153 157

105 295 297 0 199 199 199 199 411 413 152 152 206 206 377 377 153 157

106 295 297 0 183 199 199 199 371 373 152 152 206 206 377 377 153 157

107 283 307 0 181 181 197 199 371 373 142 142 228 228 377 377 153 153

111 297 311 0 179 191 203 203 371 377 142 156 206 206 377 377 153 153

113 297 311 0 179 191 203 203 371 377 142 156 206 206 377 377 153 153

118 311 313 0 165 177 203 203 373 373 142 142 250 250 377 377 153 153 Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje

Table 2: (cont.)

Kultivar Rhm 011 Rhm 011 Rhm Rim 019 Rim 019 Rhm 003 Rhm 003 Rhm 043 Rhm 043 Rub 25a Rub 25a Rub Rub Rhm Rhm Rub Rub 011 157b 157b 018 018 108a 108a

119 311 311 0 165 177 203 203 373 373 142 142 250 250 377 377 153 153

121 287 315 0 179 179 197 203 373 373 142 152 202 206 377 379 153 153

122 287 315 0 179 179 195 203 373 375 142 152 202 206 377 377 153 153

124 285 315 0 179 213 197 203 373 375 142 152 202 206 377 377 153 153

126 287 297 307 165 165 199 199 373 373 142 142 206 206 377 377 153 153

127 287 297 307 165 195 195 199 371 373 142 142 206 206 377 377 153 153

128 285 285 0 165 181 199 207 373 373 142 152 226 226 379 379 151 159

129 285 287 0 175 179 197 207 373 373 142 152 226 226 379 379 157 157

130 285 287 0 175 179 197 207 373 373 142 152 226 226 377 377 157 157

131 285 287 0 175 179 197 207 373 373 142 152 226 272 379 379 157 157

132 285 287 0 175 179 197 207 373 373 142 152 226 272 377 377 157 157

133 287 289 0 175 179 197 207 373 373 142 152 226 226 377 379 157 157

134 287 287 0 165 181 199 207 373 373 142 152 226 226 377 377 153 159

135 287 289 0 175 179 197 207 373 373 142 152 226 226 377 377 157 157 Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje

Table 2: (cont.)

Kultivar Rhm 011 Rhm 011 Rhm011 Rim 019 Rim 019 Rhm 003 Rhm 003 Rhm 043 Rhm 043 Rub 25a Rub 25a Rub Rub Rhm Rhm Rub Rub 157b 157b 018 018 108a 108a

136 287 289 0 175 179 197 207 373 373 142 152 226 226 379 379 157 157

137 271 313 0 165 177 195 199 357 367 144 152 206 206 377 393 157 157

138 271 313 0 165 177 197 199 373 373 144 152 206 206 379 393 157 157

139 271 271 0 165 177 197 201 373 373 144 152 206 206 377 377 157 157

140 287 287 0 165 189 199 207 371 373 142 152 226 278 377 377 159 159

141 287 287 0 165 165 199 207 373 373 142 152 226 226 377 377 151 159

142 285 285 0 165 189 199 207 373 373 142 152 226 226 377 377 151 157

143 285 287 0 175 179 195 207 373 373 142 152 226 226 377 377 157 157

144 285 287 0 175 179 195 207 373 373 142 152 226 226 377 377 157 157

145 287 289 0 175 179 197 207 373 373 142 146 226 278 377 379 157 157

151 287 287 0 175 179 199 199 373 373 142 152 226 278 377 377 159 159

152 289 295 0 175 179 197 199 373 373 144 152 206 206 377 377 157 157

153 271 285 297 165 177 203 203 373 373 142 152 206 206 377 377 157 157

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje

Table 2: (cont.)

Kultivar Rhm 011 Rhm 011 Rhm011 Rim 019 Rim 019 Rhm 003 Rhm 003 Rhm 043 Rhm 043 Rub 25a Rub 25a Rub Rub Rhm Rhm Rub Rub 157b 157b 018 018 108a 108a

158 289 295 307 165 165 199 199 373 373 142 142 206 206 377 379 153 153

159 287 295 307 165 165 199 199 373 373 142 142 206 206 377 379 153 153

160 287 297 307 165 165 199 199 373 373 142 142 206 206 377 379 151 153

161 289 295 307 195 195 197 199 371 373 146 146 192 194 358 358 153 153

162 285 287 165 165 199 199 373 373 142 146 192 250 375 375 153 153

163 289 295 307 165 189 199 199 371 373 146 146 194 194 356 358 153 153

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje Table 2: (cont.)

Kultivar Rig 001 Rig 001 Rub 223a Rub 223a Rim 036 Rim 036 Kultivar Rig 001 Rig 001 Rub 223a Rub 223a Rim 036 Rim 036

1 343 343 152 152 310 310 43 343 343 152 152 310 310

2 343 343 150 150 310 310 44 343 343 146 152 310 310

3 343 343 152 180 310 310 45 343 343 146 150 296 310

4 343 343 146 150 296 310 46 343 343 152 154 310 310

5 343 343 150 150 310 310 47 343 343 150 150 310 310

10 343 343 150 152 310 310 48 343 343 146 146 310 310

11 343 343 150 152 310 310 49 343 343 146 150 310 310

12 343 343 150 152 310 310 50 343 343 152 154 310 310

13 343 343 138 146 296 310 51 343 343 152 166 310 310

14 343 343 150 152 310 310 52 343 343 152 166 310 310

15 343 343 152 152 310 310 53 343 343 152 166 310 310

16 343 343 146 152 310 310 54 343 343 152 166 310 310

17 343 343 152 168 310 310 55 343 343 152 152 310 310

18 343 343 152 154 310 310 56 343 343 166 168 310 310

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje Table 2: (cont.)

Kultivar Rig 001 Rig 001 Rub 223a Rub 223a Rim 036 Rim 036 Kultivar Rig 001 Rig 001 Rub 223a Rub 223a Rim 036 Rim 036

19 343 343 150 150 270 310 57 343 349 152 162 310 310

20 343 343 152 152 310 310 58 343 343 150 162 310 310

21 343 343 150 154 310 310 59 343 343 152 168 310 310

22 343 343 152 152 310 310 60 343 343 150 152 310 310

23 343 343 152 152 310 310 61 343 343 150 150 310 310

24 239 239 138 138 294 316 62 343 343 152 152 310 310

25 239 239 134 134 294 316 63 343 343 158 158 342 342

26 239 239 134 138 294 316 64 343 343 150 154 296 310

27 343 343 152 152 310 310 65 343 343 146 152 310 310

35 343 343 158 166 310 310 66 343 343 146 150 296 310

40 343 343 152 176 310 310 67 341 341 144 162 310 310

41 343 343 146 146 310 310 68 341 341 158 166 310 312

42 343 343 146 152 310 310 71 343 343 158 166 310 312

72 341 341 158 166 310 310 107 343 343 152 166 310 312

73 343 343 150 150 292 294 111 343 343 164 164 310 312 Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje Table 2: (cont.)

Kultivar Rig 001 Rig 001 Rub 223a Rub 223a Rim 036 Rim 036 Kultivar Rig 001 Rig 001 Rub 223a Rub 223a Rim 036 Rim 036

74 341 341 162 166 310 310 113 343 343 164 164 310 312

75 341 341 158 166 310 312 118 341 341 160 166 310 312

76 341 341 162 166 310 312 119 341 341 160 166 312 312

77 343 343 158 166 310 312 121 341 341 148 156 296 312

78 341 341 150 154 310 310 122 341 341 148 156 296 312

79 343 343 152 152 312 312 124 343 343 148 156 296 312

80 341 341 158 158 310 310 127 341 341 158 166 310 312

81 341 341 158 158 310 310 128 343 343 152 160 312 312

82 343 343 146 162 310 310 129 341 341 146 154 310 312

83 343 343 162 166 308 308 130 325 341 146 154 310 312

84 341 341 162 166 310 310 131 341 341 146 154 310 312

85 341 341 158 166 310 310 132 341 343 144 154 310 312

86 341 341 146 154 310 310 133 343 343 146 154 310 312

87 341 341 146 162 310 310 134 343 343 152 152 310 310

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Preglednica 2: se nadaljuje Table 2: (cont.)

Kultivar Rig 001 Rig 001 Rub 223a Rub 223a Rim 036 Rim 036 Kultivar Rig 001 Rig 001 Rub 223a Rub 223a Rim 036 Rim 036

88 343 343 144 162 310 312 135 341 341 146 154 310 312

89 343 343 146 154 310 310 136 341 341 146 154 308 310

90 343 343 150 150 310 312 137 341 341 146 162 310 312

91 343 343 150 150 310 312 138 343 343 146 160 296 312

92 343 343 150 150 310 312 139 341 341 146 146 310 312

93 343 343 150 150 310 312 140 341 341 152 152 312 312

94 343 343 150 150 308 310 141 341 341 150 158 312 312

103 341 341 160 166 312 312 142 325 341 152 158 312 312

105 343 343 162 166 310 310 143 341 341 146 154 310 312

106 343 343 154 162 310 310 144 341 341 146 154 310 312

145 341 341 146 154 310 312 160 341 341 158 166 310 312

151 341 341 152 152 312 312 161 343 343 156 164 310 312

152 341 341 146 162 310 312 162 341 341 160 166 308 312

158 341 341 166 168 310 310 163 341 341 158 166 308 310

159 341 341 158 166 310 312 Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Priloga 3

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Priloga 4

Novak V. Uporaba molekulskih markerjev pri določevanju kultivarjev in sledenju … genotipov malin.

Dokt. disertacija. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2015

Priloga 5