Estudo Citogenético Em Aranhas (Mygalomorphae E Araneomorphae) Com Ênfase Na Evolução Dos Genes De Dna Ribossômico

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

ESTUDO CITOGENÉTICO EM ARANHAS (MYGALOMORPHAE E ARANEOMORPHAE) COM ÊNFASE NA EVOLUÇÃO DOS GENES DE DNA RIBOSSÔMICO

TATIANA GIMENEZ-PINHEIRO

Tese apresentada ao Instituto de Biociências, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Rio Claro, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Biologia Celular e Molecular)

Rio Claro, São Paulo, Brasil Outubro de 2015

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

ESTUDO CITOGENÉTICO EM ARANHAS (MYGALOMORPHAE E ARANEOMORPHAE) COM ÊNFASE NA EVOLUÇÃO DOS GENES DE DNA RIBOSSÔMICO

TATIANA GIMENEZ-PINHEIRO

Orientadora: Profa. Dra. Marielle Cristina Schneider

Rio Claro, São Paulo, Brasil Outubro de 2015

595.44 Gimenez-Pinheiro, Tatiana G491e Estudo citogenético em aranhas (Mygalomorphae e Araneomorphae) com ênfase na evolução dos genes de DNA ribossômico / Tatiana Gimenez-Pinheiro. - Rio Claro, 2015 102 f. : il., figs., tabs.

Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro Orientador: Marielle Cristina Schneider

1. Aracnídeo. 2. Araneae. 3. Cariótipo. 4. Hibridação in situ fluorescente. 5. Região organizadora de nucléolo. 6. Sistema cromossômico sexual. I. Título.

Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Rio Claro/SP

“Dedico este trabalho a todas as pessoas que de alguma forma participaram dessa minha jornada direta ou indiretamente”.

AGRADECIMENTOS

Tentarei aqui agradecer a todos que de alguma forma participaram direta ou indiretamente dessa etapa da minha vida. Tenho certeza que palavras irão faltar para expressar todo meu agradecimento. Assim, agradeço de forma muito especial:

À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, campus de Rio Claro (SP), por oferecer a sede e estrutura do Departamento de Biologia para a realização deste trabalho.

À Universidade Federal de São Paulo, campus de Diadema (SP), por ceder as instalações e equipamentos do Laboratório de Genética Evolutiva, para a realização da parte prática dessa pesquisa.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas – Biologia Celular e Molecular, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, campus Rio Claro (SP).

À Universidade Estadual do Piauí, pelas liberações das minhas atividades institucionais para a realização dessa pesquisa.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (2011/19873-9) pelo apoio financeiro cedido para o desenvolvimento do projeto.

À Professora Dra. Marielle Cristina Schneider, minha orientadora, exemplo de profissional e ser humano, pela oportunidade de aprendizado a cada conversa realizada, por toda atenção e dedicação durante o período deste trabalho, apoio, incentivo e amizade durante esses quatro anos. Já te disse uma vez e irei repetir aqui, você sempre será uma inspiração de como devo realizar meu trabalho.

À Professora Dra. Kátia Cristina M. Pellegrino, pelo incentivo, apoio e momentos de descontração no Laboratório de Genética Evolutiva.

A todos os Professores do Curso de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, pelo aprendizado e oportunidades.

Aos funcionários da Seção Técnica de Pós-Graduação do Instituto de Biociências, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, campus Rio Claro (SP), em especial a Felipe M. Guimarães, pelos serviços prestados durante todo o curso, principalmente na finalização do trabalho.

Aos colegas do Departamento de Biologia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, campus de Rio Claro, Rafael Splendore de Borba, Allison Kleiton dos Anjos, Viviane Fagundes de Mattos, Amália Torrezan Lopes e Ana Claudia de Castro Marcato, pelos momentos que passamos juntos, boa convivência, conversas e risadas. Vocês foram muito importantes nesta minha jornada.

Às meninas e meninos do Laboratório de Genética Evolutiva e “agregados”, da Universidade Federal de São Paulo, campus Diadema, em especial à Viviane Fagundes de Mattos, Amália Torrezan Lopes, Crislaine Vanessa Ubinski, Juliana Figueiredo de Lima, Renata Clicia do Santos Costa, Juliete Oliveira Costa, Daniela Maggio, Marcel F. Neves e André Robson Justino, pelo companheirismo, conversas instrutivas, cafés da manhã/tarde, risadas durante todo o dia, trocas de experiências e pela amizade que vou levar para sempre. Vocês fizeram parte dos momentos felizes e angustiantes que passei, com tudo isso tod@s foram muito importantes nesta minha caminhada.

Às meninas da república, Caroline Fernanda de Paula, Tamires Barros Silva, Lídia Durço Coelho, Larissa Silva e Amália Torrezan Lopes, que me deram abrigo todas as vezes que precisei estar em Diadema, pelo carinho, amizade, alegrias e companheirismo nos dias frios dessa cidade.

À amiga Antônia Leidna Silva Brito, por todo o apoio, incentivo e companheirismo. Você foi muito importante para que tudo isso se concretizasse, sem você meus “filhotes” estariam perdidos.

Aos colegas de trabalho, da Universidade Estadual do Piauí, campus Heróis do Jenipapo, em especial aos Professores Rebeca Hennemann Vergara Souza, Ana Gabriela Nunes Fernandes, Hermeson Cassiano de Oliveira e Lucas Ramos Costa Lima, pelo apoio e incentivo a cada vez que eu me desestimulava, pelo companheirismo, boas conversas, vários almoços no laboratório. Sem vocês não conseguiria levar tudo isso até o final.

À amiga e irmã de coração Juliana do Nascimento Bendini, pela confiança, apoio, incentivo, amizade, alegrias e boas conversas. Você faz parte dessa conquista.

Aos meus pais, Neide Gimenez Pinheiro e Modesto Nunes Pinheiro, por todo o amor, exemplo, apoio e confiança. Sem a força de vocês não conseguiria trilhar esse caminho. Amo vocês mais que tudo nessa vida!!!!

À minha irmã Tamaris Gimenez Pinheiro, cunhado Edson Lourenço da Silva e meu querido sobrinho Samuel Lourenço Gimenez Pinheiro, por todo amor, apoio, confiança, trocas de experiências na área de Biologia e Ensino. Vocês são exemplos de profissionais e ser humano, tenho certeza que com o apoio de vocês consegui finalizar mais essa etapa. Amo vocês mais que tudo nessa vida!!!!

Ao meu irmão Wladimir Nunes Pinheiro e sobrinha querida Ana Carolina Dieter Nunes, pelo carinho, incentivo, apoio em tudo o que sempre precisei. Vocês fazem parte desta conquista. Amo vocês mais que tudo nessa vida!!!!

OBRIGADA!!!

A Dona Aranha subiu pela parede Veio a chuva forte e a derrubou Já passou a chuva O sol já vai surgindo E a dona aranha continua a subir

Ela é teimosa e desobediente Sobe, sobe, sobe e nunca está contente.

A Dona Aranha desceu pela parede Veio a chuva forte e a derrubou Já passou a chuva O sol já vai surgindo E a dona aranha continua a descer

Ela é teimosa e desobediente Desce, desce, desce e nunca está contente. (Cultura Popular)

“Mesmo quando tudo parece desabar, cabe a mim decidir entre rir e chorar, ir ou ficar, desistir ou lutar; porque descobri, no caminho incerto da vida, que o mais importante é o decidir” (Cora Coralina)

RESUMO Na ordem Araneae existem 45.741 espécies de aranhas descritas taxonomicamente, as quais estão distribuídas em duas subordens, Mesothelae e Opisthothelae, 114 famílias e 3.965 gêneros. Considerando o número de espécies de aranhas descritas taxonomicamente, as informações citogenéticas são muito escassas, pois menos de 2% dos representantes foram caracterizados até o momento. Dentre as 114 famílias de aranhas, 45 não possuem sequer uma espécie examinada citogeneticamente. Nas aranhas, o número diploide varia de 2n♂=7 a 2n♂=128, com sistema cromossômico sexual simples, como X0 e XY, ou múltiplo, como o X1X20, X1-X130, X1X2Y e X1-X7Y, e cromossomos com morfologia meta/submetacêntrica ou subtelo/telocêntrica. Em relação a regiões cromossômicas específicas, como as regiões organizadoras de nucléolo (RONs), somente cerca de 50 espécies de aranhas foram caracterizadas, principalmente através de impregnação pelo íon prata. Nas Mygalomorphae e Araneomorphae, as RONs estão localizadas predominantemente sobre a região terminal de um a três pares autossômicos. Porém, em algumas espécies foram observadas RONs sobre o cromossomo sexual X. Considerando as particularidades cromossômicas encontradas em Araneae e a escassez de informações citogenéticas, especialmente de regiões específicas como as RONs, este trabalho tem como objetivo estabelecer os mecanismos de evolução cromossômica em espécies de aranhas pertencentes a diferentes famílias de Mygalomorphae e Araneomorphae, levando-se em conta as características cariotípicas básicas e o padrão de distribuição das RONs. As análises cromossômicas foram realizadas através de coloração convencional, impregnação pelo nitrato de prata (Ag-RON) para identificar as RONs ativas e hibridização in situ fluorescente (FISH) para localizar os genes de rDNA 18S. As 17 espécies examinadas neste trabalho pertencem a três famílias de Haplogynae, cinco de Entelegynae (Araneomorphae), e três famílias de Mygalomorphae. Metáfases mitóticas de Sicarius cariri e Sicarius ornatus exibiram 2n♂=16+X1X2Y e em Sicarius tropicus 2n♂=18+XY, com Ag-RONs na região terminal do par 1. Em S. ornatus e S. tropicus, os resultados obtidos com FISH foram semelhantes a Ag-RON, no entanto em S. cariri, os sítios ribossomais foram localizados na região terminal do cromossomo sexual X1. A descrição de um sistema cromossômico sexual simples para Sicariidae preenche uma lacuna na hipótese sobre a evolução cromossômica em aranhas Haplogynae, ajudando a entender como o sistema de cromossomos sexuais XY evoluiu a partir do sistema X1X2Y. O número diploide das outras Araneomorphae aqui estudadas variou de 2n♂=15 a 2n♂=33 e o sistema cromossômico sexual mais comum encontrado foi X1X20. Com relação ao gene ribossomal, foi observada diferença nas outras três espécies do grupo Haplogynae, com marcação em um único par de cromossomos autossômicos em regiões distintas, como na região intersticial em Physocyclus globosus e terminal em Loxosceles amazonica, e marcação em dois pares autossômicos em Scytodes eleonorae. Em Entelegynae, as RONs estão presentes em um par de cromossomos autossômicos para todas as sete espécies estudadas. Podemos observar que RONs em cromossomos autossômicos é o padrão predominante em Araneomorphae, independentemente do tipo de sistema cromossômico sexual, e está presente em diferentes famílias deste clado. Entre as espécies de Mygalomorphae, Diplura sp. exibiu o maior número diploide, variando de 2n♂=78-94. Idiops sp. e Acanthoscurria natalensis apresentaram 2n♂=51- 57 e 2n♂=41-49, respectivamente, e Oligoxystre caatinga mostrou 2n♂=22. Apesar dessa grande diferença de número cromossômico, nas quatro espécies os genes de rDNA 18S apareceram localizados apenas em um par de cromossomos autossômicos.

Palavras-chave: Araneae, cariótipo, hibridação in situ fluorescente, região organizadora de nucléolo, sistema cromossômico sexual

ABSTRACT The order Araneae possesses 45,741 taxonomically described species, which are distributed in two suborders, Mesothelae and Opisthothelae, 114 families and 3,965 genera. The cytogenetic data in this order are scarce, considering that less than 2% of the species were studied up to now. Among the 114 families of Araneae, in 45 there are no species cytogenetically examined. In the spiders, the diploid number ranged from 2n♂=7 to 2n♂=128, with sex chromosome system of the simple (X0 and XY) or multiple (X1X20, X1-X130, X1X2Y e X1-X7Y) types, and chromosomes with meta/submetacentric or subtelo/telocentric morphology. In relation to specific chromosome sites, such as the nucleolar organizer regions (NOR), only 30 species were investigated mainly through silver impregnation. In Mygalomorphae and Araneomorphae, the NORs were predominantly located in the terminal region from one to three autosomal pairs. However, in some species, the NORs occurred in the X sex chromosome. Considering the cytogenetic particularities observed in Araneae and the scarcity of information of specific chromosome regions, the purpose of this work was to establish the mechanism of chromosome evolution in Mygalomorphae and Araneomorphae spiders with the focus of the rDNA genes. The chromosome analyses were accomplished with standard staining, silver nitrate impregnation (Ag-NOR) to identify the active NORs and fluorescent in situ hybridization (FISH) to locate the 18S rDNA genes. The 17 species examined here belong to three families of Haplogynae, five of Entelegynae and three of Mygalomorphae. Mitotic metaphase cells exhibited 2n♂=16+X1X2Y in Sicarius cariri and Sicarius ornatus and 2n♂=18+XY in Sicarius tropicus, with Ag-NORs on the terminal region of pair 1. In S. ornatus and S. tropicus, the FISH technique showed similar results to Ag-NOR, but in S. cariri, the ribosomal cistrons were located in the terminal region of the X1 sex chromosome. The description of a simple sex chromosome in Sicariidae fill a gap in the hypothesis about the chromosome evolution in Haplogynae spiders, clarifying the origin of the XY system from the X1X2Y. In the 10 other Araneomorphae species studied here, the diploid number ranged from 2n♂=15 to 2n♂=33, and the X1X20 was the most common type. The location or number of the rDNA gene differed among the three species of Haplogynae, with signals in the interstitial region of one chromosome pair in Physocyclus globosus, terminal region of one autosomal pair in Loxosceles amazonica, and two chromosomal pairs of Scytodes eleonorae. In all Entelegynae species, the NORs were located in one autosomal pair. In Araneomorphae, autosomal NORs are frequently observed, occurring in species from different clades and with distinct types of sex chromosome system. Among the Mygalomorphae species, Diplura sp. exhibited the high diploid number, which range from 2n♂=78-94. Idiops sp. and Acanthoscurria natalensis presented 2n♂=51-57 and 2n♂=41-49, respectively, and Oligoxystre caatinga showed 2n♂=22. Despite of this high difference in the diploid number, in the four Mygalomorphae species the 18S rDNA genes were located only in one autosomal pair.

Key-words: Araneae, fluorescent in situ hybridization, karyotype, nucleolar organizer region, sex chromosome system.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...... 10 2. OBJETIVOS...... 21 3. MATERIAIS E MÉTODOS...... 22 3.1. Materiais...... 22 3.2. Métodos...... 22 3.2.1. Obtenção das preparações citológicas...... 22 3.2.2. Coloração convencional (Giemsa)...... 23 3.2.3. Técnica de impregnação das regiões organizadoras de nucléolo pelo nitrato de prata (Ag-RON)...... 23 3.2.4. Extração de DNA, amplificação do gene de rDNA 18S e marcação das sondas...... 23 3.2.5. Hibridização in situ fluorescente (FISH) com sonda de rDNA 18S...... 24 3.2.6. Análises Cromossômicas...... 25 4. RESULTADOS...... 30

ARTIGO I 32 Cytogenetic study in sand spiders (Haplogynae, Sicariidae) from the Brazilian Caatinga: sex chromosome system diversity in closely related species Abstract...... 33 Introduction...... 34 Materials and Methods...... 35 Results...... 37 Discussion...... 43 References...... 46

ARTIGO II 51 Mapeamento do gene ribossomal 18S em 10 espécies de Araneomorphae (Haplogynae e Entelegynae) Resumo...... 52 Introdução...... 53 Materiais e Métodos...... 56 Resultados...... 57 Discussão...... 70 Referências Bibliográficas...... 74

ARTIGO III 80 Análise cromossômica em quatro espécies de aranhas Mygalomorphae (Dipluridae, Idiopidae e Theraphosidae) da fauna brasileira Resumo...... 81 Introdução...... 82 Materiais e Métodos...... 83 Resultados...... 84 Discussão...... 91 Referências Bibliográficas...... 94 5. CONSIDERAÇÕES FINAIS...... 96 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 97

1. INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Araneae é uma das mais diversas ordens de animais da Terra e dentro da classe Arachnida é ultrapassada em número de espécies apenas pela ordem Acari (CODDINGTON e LEVI, 1991). Além disso, investigações recentes estimam que menos de um terço do total de espécies de aranhas é conhecido atualmente, estando a maior riqueza ainda para ser descoberta nas regiões Afrotropical e Neotropical. Segundo Brescovit (1999), cerca de 70% da fauna araneológica Neotropical corresponde a espécies novas. Atualmente, existem 45.741 espécies de aranhas descritas taxonomicamente, as quais estão distribuídas em duas subordens, Mesothelae e Opisthothelae, com 114 famílias e 3.965 gêneros. A subordem Opisthothelae engloba as infraordens Mygalomorphae e Araneomorphae (CODDINGTON e LEVI, 1991; WORLD SPIDER CATALOG, 2015). A infraordem Araneomorphae é a que possui a maior riqueza de espécies, sendo que algumas famílias, principalmente as cosmopolitas ou de ocorrência na região dos trópicos, detém mais de 1.500 espécies descritas (WORLD SPIDER CATALOG, 2015). A subordem Mesothelae contém uma única família, Liphistiidae (oito gêneros, 91 espécies), com distribuição limitada as regiões Paleártica (China, Japão) e Oriental (Sudeste Asiático e Sumatra) (WORLD SPIDER CATALOG, 2015). Esta subordem ocupa uma posição basal dentro de Araneae, uma vez que inclui as aranhas com características morfológicas consideradas primitivas, devido a segmentação do abdômen em numerosas placas dorsais e presença sete ou oito fiandeiras, com localização na região mediana do abdômen (CODDINGTON e LEVI, 1991). As Mygalomorphae, com 16 famílias, 335 gêneros e 2.850 espécies, compreendem as aranhas conhecidas popularmente como caranguejeiras, tarântulas, tecelãs de alçapão e túnel, que estão distribuídas em todas as regiões biogeográficas (WORLD SPIDER CATALOG, 2015). As espécies desta infraordem são caracterizadas pela presença de segmentação abdominal não aparente externamente, seis ou menos fiandeiras localizadas na extremidade do abdômen, e garra das quelíceras articuladas no mesmo plano que o eixo longitudinal do corpo (quelíceras ortognatas) (CODDINGTON e LEVI, 1991). Morfologicamente, a monofiletismo de migalomorfas baseia-se principalmente nos caracteres da fiandeira e genitais masculinos. Nas aranhas deste grupo, não há qualquer vestígio de fiandeiras anteriores medianas presentes, diferindo das mesoteles, e as fiandeiras anteriores laterais são muito reduzidas ou até mesmo ausentes (CODDINGTON e LEVI, 1991). A infraordem Araneomorphae é o grupo das “aranhas verdadeiras”, engloba cerca de 90% das espécies descritas (3.622 gêneros e 42.800 representantes), e pode ser encontrada em 11 praticamente todas as regiões biogeográficas. Morfologicamente, as aranhas deste grupo são caracterizadas pela presença de abdômen não segmentado, articulação das quelíceras em ângulo reto com o plano sagital do corpo (quelíceras labidognatas) e fiandeiras anteriores laterais grandes e bem desenvolvidas (CODDINGTON e LEVI, 1991). O clado basal das Araneomorphae é constituído por três famílias, Hypochilidae, Gradungulidae e Austrochilidae, com apenas 12, 16 e nove espécies descritas, respectivamente. A grande maioria das araneomorfas está agrupada nos clados Haplogynae (16 famílias e 5.239 espécies) e Entelegynae (81 famílias e 37.561 espécies). As aranhas haploginas diferenciam-se das enteleginas pelo fato das fêmeas apresentarem genitálias mais simples (CODDINGTON e LEVI, 1991; WORLD SPIDER CATALOG, 2015). Considerando o número de espécies de Araneae descritas taxonomicamente, as informações citogenéticas são ainda muito escassas, pois menos de 2% dos representantes foram caracterizados até o presente momento. Além disso, dentre as 114 famílias existentes, 45 não possuem sequer uma espécie examinada citogeneticamente, o que resulta em uma grande lacuna no conhecimento cromossômico do grupo como um todo (ARAUJO et al., 2015a). Porém, apesar desta carência de estudos, os dados existentes na literatura têm revelado características bastante interessantes em Araneae, do ponto de vista da evolução cromossômica. A subordem Mesothelae possui apenas uma espécie examinada sob o ponto de vista citogenético (Figura 1), a qual exibiu um dos maiores números diploides já registrados nas aranhas, 2n♂=±96, sistema cromossômico sexual múltiplo do tipo X1X20 e cromossomos com morfologia acrocêntrica (SUZUKI, 1954). Dentro da subordem Opisthothelae, Mygalomorphae (Figura 1) apresenta 49 espécies cariotipadas (ARAUJO et al., 2015a), as quais mostraram números diploides bastante discrepantes, como 2n♂=14 (Atypidae e Dipluridae) (ŘEZAČ et al., 2006; KRÁL et al., 2013) e 2n♂=128 (Ctenizidae) (KRÁL et al., 2013), sistemas cromossômicos sexuais do tipo simples, como o XY e X0, ou múltiplos, como o X1X20, X1-X130 e X1-X7Y, e morfologia dos cromossomos variando de meta/submetacêntrica a subtelo/acrocêntrica (SUZUKI, 1954; ŘEZAČ et al., 2006; KRÁL et al., 2011, 2013).

Figura 1 – Filogenia de Araneae estabelecida com base em caracteres morfológicos (CODDINGTON e LEVI, 1991) e dados cariotípicos registrados para famílias de Mesothelae e Mygalomorphae (ARAUJO et al., 2015a). Entre parênteses é mencionado o número de espécies analisadas citogeneticamente, seguido dos números diploides mais baixo e alto já descritos e tipos de sistemas cromossômicos sexuais. Em negrito a fórmula cariotípica mais frequente. *A família Euctenizidae foi reconhecida apenas recentemente, de acordo com BOND et al. (2012).

Levando-se em conta que um número diploide alto está presente em Mesothelae e também é predominante em espécies de Mygalomorphae, alguns autores sugeriram que o principal mecanismo de diferenciação cariotípica das aranhas foi através da redução do número diploide (SUZUKI, 1954; KRÁL et al., 2006). Porém, a descrição de número diploide extremamente baixo, 2n♂=14 e 2n♀=16 (AKAN et al., 2005; ŘEZAČ et al., 2006; KRÁL et al., 2013), para representantes de Mygalomorphae pertencentes a três diferentes famílias (Atypidae, Dipluridae e Theraphosidae), indica que estudos citogenéticos adicionais devem ser realizados nesses táxons, visando estabelecer as características cariotípicas plesiomórficas para as aranhas e compreender os mecanismos de evolução cromossômica que tem ocorrido nos clados basais e derivados filogeneticamente. Dentre as Araneomorphae basais, há apenas duas espécies caracterizadas pertencentes às famílias Hypochilidae e Austrochilidae (Figura 2), as quais revelaram 2n♂=26+X1X2Y e 2n♂=36+XY, respectivamente (KRÁL et al., 2006). Dentre outras aeromorfas, o grupo das haploginas possui 61 espécies investigadas, com número diploide variando entre 2n♂=7 a 2n♂=40 (Figura 2) (SUZUKI, 1950, 1954; ŘEZÁČ et al., 2007; KOŘÍNKOVÁ e KRÁL, 2013) e cromossomos predominantemente meta/submetacêntrico, com exceção de representantes de duas famílias, Dysderidae e Segestriidae, que exibiram cromossomos holocêntricos (SUZUKI, 1950, 1954; DIAZ e SAEZ, 1966; BENAVENTE e WETTSTEIN, 1980; BENAVENTE, 1982; RODRÍGUEZ-GIL, 2002; KRÁL et al., 2006; ŘEZÁČ et al., 2007, 2014; DIAZ et al., 2010; KOŘÍNKOVÁ e KRÁL, 2013). Os sistemas cromossômicos sexuais já registrados nas haploginas foram do tipo X0 em 56% das espécies, X1X20 em 16%, X1X2Y em 19%, e XY em 4% dos representantes (ARAUJO et al., 2015a). Entelegynae, o grupo mais diversificado da infraordem Araneomorphae, detêm a maioria dos dados cromossômicos das aranhas, com cerca de 679 espécie descritas (ARAUJO et al., 2015a), e número diploide variando de 2n♂=10 (PARIDA e SHARMA, 1987) a 2n♂=52 (WALLACE, 1909). Em contraste com o que é observado nas espécies do grupo-irmão Haplogynae, as aranhas enteleginas exibem cariótipo mais conservado quanto à presença de sistema cromossômico sexual do tipo X1X20 e cromossomos na maioria das vezes acro/telocêntrico (Figura 2). Além das 46 famílias presentes no cladograma proposto por Coddington e Levi (1991) existem atualmente outras 30 famílias reconhecidas para o grupo das Entelegynae, dentre as quais 12 foram examinadas citogeneticamente (ARAUJO et al., 2015a; WORLD SPIDER CATALOG, 2015). Embora em Entelegynae ocorra uma variação do número cromossômico, Král et al.

(2006) sugeriram que o cariótipo 2n♂=40+X1X20, com cromossomos acrocêntricos, poderia ser 14 representativo de um estado ancestral para as aranhas desse grupo. Esta hipótese foi baseada no fato que a fórmula cariotípica acima mencionada está presente em diversas famílias não relacionadas bem como em clados basais de Entelegynae. No entanto, análises citogenéticas adicionais, utilizando técnicas de coloração cromossômica convencional e diferencial, precisam ser realizadas para confirmar esta hipótese e entender os processos de evolução cromossômica das enteleginas.

Figura 2 – Filogenia de Araneomorphae estabelecida com base em caracteres morfológicos (CODDINGTON e LEVI, 1991) e dados cariotípicos registrados para as araneomorfas basais (Hypochilidae e Austrochilidae), e derivadas (Haplogynae e Entelegynae) (ARAUJO et al., 2015a). Entre parênteses é mencionado o número de espécies analisadas citogeneticamente, seguido dos números diploides mais baixo e alto já descritos e tipos de sistemas cromossômicos sexuais. Em negrito a fórmula cariotípica mais frequente. **Famílias do grupo Entelegynae que não constam no cladograma mas possuem estudos citogenéticos. 16

Embora o emprego de técnicas que identificam regiões cromossômicas específicas tem fornecido dados relevantes sobre a organização dos genomas e evolução dos cromossomos em diversos grupos de animais, somente cerca de 60 e 50 espécies de aranhas foram caracterizadas quanto à distribuição das regiões heterocromáticas constitutivas e organizadoras nucleolares, respectivamente (ROY et al., 2005; DATSON e MURRAY, 2006; BOMBAROVÁ et al., 2007; CABRAL-DE-MELLO et al., 2011). As regiões organizadoras de nucléolo (RONs) correspondem a sítios cromossômicos específicos, responsáveis pela formação e manutenção do nucléolo nos núcleos interfásicos; é no nucléolo (porção fibrilar) que ocorre a transcrição dos genes do DNA ribossômico (rDNA) 18S, 5.8S e 28S, e montagem dos ribossomos (porção granular) (VERMA e BABU, 1995). Em todos os organismos eucariontes, o rDNA é composto por uma unidade de transcrição e um espaçador intergênico não-transcrito, denominado de NTS (Figura 3). Este conjunto, rDNA e NTS, está organizado em múltiplas cópias repetidas em tandem, geralmente associado a regiões de heterocromatina constitutiva. Estruturalmente, cada unidade de transcrição é formada pelos genes que codificam o RNA ribossômico (rRNA) 18S, 5.8S e 28S, dois espaçadores transcritos internos, ITS1 e ITS2, localizados entre os genes 18S-5.8S e 5.8S-28S, respectivamente, e um espaçador transcrito externo (ETS), que é adjacente e antecede o gene 18S. Durante a expressão gênica, estas unidades de transcrição são transcritas pela RNA polimerase I em um pré-RNA 45S, que é processado, através da remoção dos ITS e ETS, em moléculas maduras de rRNAs 18S, 5.8S e 28S. Estes rRNAs irão constituir as subunidades ribossomais maiores e menores, através da associação com diversas proteínas e com a molécula de rRNA 5S. Na maioria das espécies, o gene do rDNA 5S está localizado fora da região organizadora de nucléolo, ou seja, não está associado ao rDNA 45S (LONG e DAWID, 1980). Citologicamente, as RONs podem ser visualizadas nos cromossomos corados convencionalmente de algumas espécies, como regiões da cromatina menos coradas e condensadas, denominadas de constrições secundárias. No entanto, nem sempre as RONs aparecem sob a forma de constrição secundária e algumas outras regiões do DNA, como as heterocromáticas constitutivas, também podem apresentar um menor grau de condensação e/ou coloração no decorrer do ciclo celular (VERMA e BABU, 1995). 17

Figura 3 – Representação esquemática da organização do gene de rDNA 45S, modificada de Pisano e Ghigliotti (2009).

A impregnação pelo íon prata é sem dúvida a técnica mais amplamente utilizada para localizar as RONs (Ag-RONs) em diversos organismos, devido ao seu baixo custo, fácil e rápida aplicação e boa qualidade dos resultados (GOODPASTURE e BLOOM, 1975; HOWELL e BLACK, 1980). Contudo, esta metodologia evidencia de forma indireta as RONs, uma vez que se baseia na propriedade argirofílica de certas proteínas, provavelmente daquelas de natureza ácida, que se associam somente as RONs que foram ativas transcricionalmente durante a interfase (VERMA e BABU, 1995). Adicionalmente, há evidências de que algumas regiões cromossômicas marcadas pelo íon prata não correspondem às RONs (DOBIGNY et al., 2002). Com o advento de técnicas citogenéticas moleculares, sequências repetidas do genoma, como os genes de rDNA, são facilmente identificadas através da hibridação in situ com sonda fluorescente (FISH). As RONs são marcadores cromossômicos úteis para o estudo da evolução cariotípica, uma vez que podem representar sinapomorfias para determinados grupos, bem como podem fornecer dados sobre os mecanismos responsáveis pelas diferenciações cromossômicas intra e/ou interespecíficas (ZHANG e SANG, 1999; DATSON e MURRAY, 2006; PISANO e GHIGLIOTTI, 2009; CABRAL-DE-MELLO et al., 2011). A aplicação de ambas as técnicas, impregnação pelo íon prata e FISH com sonda de rDNA, pode evidenciar heteromorfismo de atividade gênica entre diferentes populações de uma espécie ou, até mesmo, entre indivíduos de uma população. Adicionalmente, a análise da FISH e Ag-RON é pertinente para avaliar a atividade dos genes de rRNA e suas possíveis mudanças durante a evolução (PETITPIERRE, 1996), como observado em híbridos interespecíficos de Drosophila, nos quais ocorre uma dominância da atividade da RON de uma espécie sobre a outra, o que pode ser um indício de que o controle da atividade desta região constitui um dos aspectos básicos na divergência das espécies (BICUDO, 1982). Além disso, alguns sítios de RONs ativas 18 detectados através da impregnação pelo íon prata podem não ser revelados pela técnica de FISH, indicando a existência de RONs crípticas. Estas RONs possivelmente correspondem a novos sítios de genes de rDNA nos cromossomos, os quais são muito pequenos para serem detectados pela FISH, mas que possuem uma atividade de transcrição, ou não possuem homologia suficiente com a sonda usada para haver hibridação (CABRERO e CAMACHO, 2008). Nas Mygalomorphae e Araneomorphae derivadas, estudos envolvendo a localização das regiões organizadoras de nucléolo foram realizadas somente em 47 espécies (5,5% das espécies cariotipadas), através da técnica de impregnação pelo íon prata e/ou FISH (Tabela 1). Em migalomorfas, 12 espécies foram caracterizadas quanto a distribuição das RONs, com a maioria das marcações na região terminal de cromossomos autossômicos, com exceção de duas espécies da família Dipluridae, Ischonothele caudata que apresentou marcação na região subterminal dos cromossomos X e Y e Linothele megatheloides com marcação intersticial em um cromossomo X pequeno (KRÁL et al., 2013). Em enteleginas, as RONs foram registradas em apenas 24 espécies e nas haploginas em 11 espécies. Nestes dois grupos, as RONs estão localizadas predominantemente sobre a região terminal de um a três pares autossômicos. Porém, entre as aranhas Haplogynae portadoras de sistema cromossômico sexual simples do tipo X0 e XY, as RONs foram observadas sobre os cromossomos autossomos e sexual X (Dysderidae, Pholcidae e Tetrablemmidae) ou apenas sobre o cromossomo sexual X (Leptonetidae, Ochyroceratidae e Scytodidae). Recentemente, em espécies de Entelegynae portadoras do sistema cromossômico sexual X1X20 foi observada a ocorrência de RONs sobre cromossomos autossômicos e sexuais

(Nephilidae) ou apenas sobre o cromossomo sexual X2 (Tetragnathidae) (WISE, 1983; BARRION et al., 1989; ARAUJO et al., 2005, 2008, 2014, 2015b; KRÁL et al., 2006, 2011, 2013; KRÁL, 2007; OLIVEIRA et al., 2007; RODRÍGUEZ-GIL et al., 2007; STÁVALE et al., 2010, 2011; DOLEJŠ et al., 2011; FORMAN et al., 2013). No entanto, considerando a escassez de dados sobre a distribuição das RONs em aranhas ainda é impossível verificar se: 1) a presença destas regiões sobre os cromossomos autossomos e sexuais constitui um caráter compartilhado pelos grupos basais ou ocorre também em clados derivados; 2) alterações no padrão de distribuição das RONs estão relacionadas com a diferenciação dos sistemas cromossômicos sexuais; 3) existe uma correlação positiva entre o número cromossômico das espécies e o número de RONs; 4) variações na localização desta região podem ser úteis para diferenciar espécies com cariótipos altamente conservados, como a maioria das aranhas Entelegynae.

Tabela 1 – Espécies de aranhas que foram caracterizadas quanto à distribuição das regiões organizadoras de nucléolo (RONs). *Número diploide e sistema cromossômico sexual (SCS) estabelecido somente através da análise de indivíduos fêmeas. +Espécies com RONs através da técnica de FISH. A denominação taxonômica das espécies segue World Spider Catalog, 2015. Espécies Número diploide e Localização das RONs Referência sistema cromossômico sexual (♂) Mygalomorphae Mecicobothriidae Megahexura fulva 43, X0 Região terminal dos pares 2 e 4 Král et al., 2013 Dipluridae Diplura cf. petrunkevitchi 90, X1X2X3X40 Região terminal de dois pares Král et al., 2011 autossômicos Euagrus lynceus 59, X1X2X3X4X50 Dois pares autossômicos Král et al., 2013 Ischnothele caudata 14, XY Pares 1 e 2; Král et al., 2013 Região subterminal do X e Y Linothele megatheloides 86, X1X2X3X4X5X60 Região terminal de um par metacêntrico e Král et al., 2013 um par acrocêntrico; Região intersticial de um cromossomo X Nemesiidae Acanthogonatus pissii 61, X1X2X30 Região terminal dos pares 1 e 14 Král et al., 2013 Iberesia machadoi 76, X1X20(?) Região terminal de um par metacêntrico Král et al., 2013 Theraphosidae + Brachypelma albopilosum 74, X1X2X3X40 Região terminal de um par metacêntrico Král et al., 2013 Idiothele mira 25, X0 Região intersticial do par 7 Král et al., 2013 Pterinochilus murinus 43, X0 Região terminal do par 2 Král et al., 2013 Antrodiaetidae Aliatypus californicus 27, X0 Região terminal dos pares 8 e 11 Král et al., 2013 Antrodiaetus riversi 47, X0 Região terminal de dois pares Král et al., 2013 autossômicos Araneomorphae basal Hypochilidae Hypochilus pococki 29, X1X2Y Região intersticial e terminal de dois Král et al., 2006 pares autossômicos Araneomorphae/Haplogynae Tetrablemmidae Monoblemma muchmorei 23, X0 Região intersticial de um par Král et al., 2006 autossômico; Região subterminal de um braço e região terminal de outro braço do cromossomo X Dysderidae Dysdera crocata 13, X0 Região terminal de um par autossômico; Král et al., 2006 Cromossomo X Pholcidae Crossopriza lyoni 23, X0 Região terminal dos pares 4 e 6; Oliveira et al., 2007 Região terminal do cromossomo X Physocyclus globosus 15, X0 Região intersticial do par 2 Oliveira et al., 2007 Ochyroceratidae Ochyrocera sp. 13, X0 Cromossomo X Král et al., 2006 Leptonetidae Leptoneta infuscata 14, XY Cromossomo X Král et al., 2006 Scytodidae Scytodes fusca 31, X0 Região terminal do par 1 Araujo et al., 2008 Scytodes globula 13, X0 Região terminal dos pares 1 e 2 Araujo et al., 2008 Scytodes itapevi 17, X0 Região terminal do par 4 Araujo et al., 2008 Scytodes thoracica 19, X0 Cromossomo X Král et al., 2006 Araneomorphae/Entelegynae Agelenidae Tegenaria campestres 43, X1X2X30 Região subterminal de um par Král, 2007 autossômico Tegenaria ferruginea 40, X1X2X3X4X5Y Região subterminal de um par Král, 2007 autossômico

Sparassidae Polybetes punctulatus 44, X1X1X2X2* Região terminal de dois pares Rodríguez-Gil et al., autossômicos 2007 Polybetes pythagoricus 42, X1X20 Região terminal de dois pares Rodríguez-Gil et al., autossômicos 2007 Polybetes rapidus 44, X1X1X2X2* Região terminal de dois pares Rodríguez-Gil et al., autossômicos 2007 Ctenidae Ctenus ornatus 28, X1X20 Região terminal do par 10 Araujo et al., 2014 Phoneutria nigriventer 28, X1X20 Região terminal do par 10 Araujo et al., 2014 Viracucha andicola 29, X1X2X30 Região terminal dos pares 10 e 16 Araujo et al., 2014 Lycosidae Arctosa alpigena lamperti 28, X1X20 Região terminal dos pares 3 e 11 Dolejš et al., 2011 Arctosa lutetiana 28, X1X20 Região terminal dos pares 8 e 11 Dolejš et al., 2011 Tigrosa georgicola 28, X1X20 Região terminal de dois pares Wise, 1983 autossômicos Xerolycosa miniata 22, X1X20 Região terminal dos pares 3 e 6 Dolejš et al., 2011 Xerolycosa nemoralis 22, X1X20 Região terminal dos pares 3 e 6 Dolejš et al., 2011 + Wadicosa fidelis 28, X1X20 Região terminal do par 6 Forman et al., 2013 Oxyopidae Hamataliwa sp. 28, X1X20 Região terminal e intersticial de dois Stávale et al., 2011 pares autossômicos Oxyopes javanus 23, X0 Par 8 Barrion et al., 1989 Oxyopes salticus 11, X0 Região terminal dos pares 2, 3 e 5 Stávale et al., 2011 Theridiidae Argyrodes elevatus 21, X0 Região terminal dos pares 2, 3 e 4 Stávale et al., 2010 Nesticodes rufipes 22, X1X20 Região terminal do par 4 Stávale et al., 2010 Nephilidae Nephila clavipes 24, X1X20 Região terminal dos pares 5 e 6 e dos Araujo et al., 2015b cromossomos X1 e X2 Nephila sexpunctata 24, X1X20 Região terminal dos pares 1, 2, 3, 5, 6, 11 Araujo et al., 2015b e dos cromossomos X1 e X2 Nephilingis cruentata 26, X1X1X2X2* Região terminal dos pares 1 e 2 Araujo et al., 2005 Tetragnathidae Meta menardi 24, X1X20 Região terminal do cromossomo X2 Král et al., 2011 Metellina merianae 24, X1X20 Região terminal do cromossomo X2 Král et al., 2011

2. OBJETIVOS Considerando as particularidades cromossômicas encontradas em Araneae, a escassez de informações citogenéticas em representantes deste táxon, especialmente com técnicas que identificam regiões cromossômicas específicas, e o fato das RONs constituírem marcadores importantes para o estudo da evolução cariotípica, o objetivo deste trabalho é contribuir para a discussão dos mecanismos de evolução cromossômica em espécies de aranhas pertencentes a diferentes famílias de Mygalomorphae e Araneomorphae, levando-se em conta as características cariotípicas básicas e o padrão de distribuição das RONs. Para realizar tal análise, espécies de aranhas da fauna brasileira foram caracterizadas citogeneticamente quanto: - número diploide, tipo de sistema cromossômico sexual, morfologia dos cromossomos, e comportamento dos cromossomos na meiose, através da análise de células mitóticas e/ou meióticas. - padrão de distribuição das RONs ativas e do gene de rDNA 18S.

3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Materiais Para a realização deste trabalho, coletas de espécimes de aranhas foram realizadas por captura manual ativa diurna e noturna, durante todos os períodos do ano. Um total de 431 indivíduos pertencentes a diversas famílias de Mygalomorphae e Araneomorphae foram capturados, visando obter dados de uma ampla diversidade de grupos. Dos indivíduos coletados, 207 não estavam em estágio de desenvolvimento com gônadas (ovários/testículos) para a obtenção de preparações citológicas. Dentre os 224 exemplares que apresentaram gônadas para as preparações citológicas, apenas 135 indivíduos possuíam células em divisão, destes 87 apresentaram os melhores resultados para o desenvolvimento deste trabalho, distribuídos em 11 famílias e 17 espécies. Esses indivíduos foram coletados em sete estados diferentes do país (Tabela 2). Os espécimes foram identificados pelos pesquisadores Dr. Antônio Domingos Brescovit, do Instituto Butantan e MSc. Leonardo Sousa Carvalho, da Universidade Federal do Piauí, e depositados no Laboratório Especial de Coleções Zoológicas, do Instituto Butantan, São Paulo, SP (IBSP; curador A.D. Brescovit), Coleções Taxonômicas da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG (UFMG; curador A.J. Santos) e Coleção de História Natural da Universidade Federal do Piauí, Floriano, PI (CHNUFPI; curador M.R.A. Soares)

3.2. Métodos 3.2.1. Obtenção das preparações citológicas As preparações citológicas, para estudo dos cromossomos mitóticos e meióticos, foram obtidas a partir de gônadas de indivíduos adultos ou subadultos, de acordo com a técnica descrita a seguir:

1 - Remover a gônada em solução fisiológica (7,5g de NaCl, 2,38g de Na2HPO4, 2,72g de

KH2PO4, em 1 litro de água destilada). 2 - Colocar o material em solução de colchicina a 0,16%, preparada com solução fisiológica, durante 2 horas, para que ocorra o acúmulo de metáfases. 3 - Adicionar um volume de água de torneira igual ao de colchicina, para atuar como solução hipotônica, deixando agir durante 15 minutos. 4 - Fixar a gônada em Carnoy I (metanol-ácido acético, na proporção de 3:1), durante 30 minutos, no mínimo. 5 - Colocar porções do material em uma lâmina de vidro, juntamente com uma gota de solução de ácido acético a 45% e, em seguida, com o auxílio de um bastão de metal, macerá-las até obter uma suspensão celular. 23

6 - Gotejar mais algumas gotas de ácido acético a 45% e espalhar o material sobre a lâmina. 7 - Secar a lâmina em uma placa de metal, à temperatura de 35 a 40° C.

3.2.2. Coloração convencional (Giemsa) Após a obtenção da preparação cromossômica, deixar a lâmina em temperatura ambiente por pelo menos um dia; corar com solução de Giemsa 3%, contendo 47mL de água destilada, 1,5mL de solução comercial de Giemsa (Merck) e 1,5mL de tampão fosfato pH 6.8, durante 15 minutos, a temperatura ambiente. Lavar rapidamente cada lâmina em água destilada e secar ao ar.

3.2.3. Técnica de impregnação das regiões organizadoras de nucléolo pelo nitrato de prata (Ag-RON) A metodologia utilizada para identificação das RONs ativas foi aquela de Howell e Black (1980), com algumas modificações, de acordo com o descrito a seguir: 1 – Incubar a lâmina em solução de ácido clorídrico (HCl) 0,1 N durante 5 minutos e lavar em água destilada. 2 - Colocar sobre a lâmina uma gota de solução coloidal reveladora (1g de gelatina Sigma dissolvida em 50 ml de água destilada + 0,5 ml de ácido fórmico) e duas gotas de solução de nitrato de prata a 50%. 3 - Cobrir com lamínula e incubar em câmara úmida, durante cerca de 4 minutos, à temperatura de 67°C. 4 - Lavar em água destilada e secar ao ar.

3.2.4. Extração de DNA, amplificação do gene de rDNA 18S e marcação das sondas O DNA nuclear de Physocyclus globosus (Taczanowski, 1874) (Pholcidae), foi extraído a partir da musculatura das pernas do indivíduo, de acordo com a metodologia descrita no Kit Comercial Dneasy Blood and Tissue, Qiagen. Após a extração, a qualidade do DNA foi avaliada através de eletroforese em um gel de agarose 1% corado com Gel Red. As amplificações das regiões do rDNA 18S para obtenção das sondas foram realizadas utilizando os primers 18S-F 5’ CGAGCGCTTTTATTAGACCA e 18S-R 5’ GGTTCACCTACGGAAACCTT (FORMAM et al., 2013). A reação de cadeia da polimerase (PCR) apresentou um volume final de 50µl, com 5µl de tampão 10x; 10µl de dNTP (2mM); 2µl de primer F (10mM); 2µl de primer R (10mM); 2µl de MgCl2 (50mM); 2µl de DNA; 26,4µl de água e 0,6µl de Taq polimerase. A reação de PCR foi realizada em um termociclador Applied 24

Biosystem seguindo o programa abaixo (a Taq polimerase foi colocada na reação um minuto antes do final do estágio 1):

Passo 1 – 15 minutos a 95oC estágio 1 Passo 2 – 35 segundos a 94oC Passo 3 – 90 segundos a 60oC 15 ciclos (-1oC por ciclo) estágio 2 Passo 4 – 90 segundos a 72oC Passo 5 - 35 segundos a 94oC Passo 6 – 90 segundos a 50oC 25 ciclos estágio 3 Passo 7 - 90 segundos a 72oC Passo 8 – 7 minutos a 72oC estágio 4 Passo 9 – infinito a 4oC estágio 5

Para a marcação da sonda de rDNA 18S, foi realizado uma solução com um volume final de 50µl, com 5µl de tampão 10x; 1µl de dATP; 1µl de dGTP; 1µl de dCTP; 0,7µl de dTTP; 0,6µl de digoxigenina ou biotina; 0,5µl de primer F (10mM); 0,5µl de primer R (10mM); 8µl de MgCl2 (50mM); 1µl de DNA (produto de PCR); 30,1µl de água e 0,6µl de Taq polimerase. A reação de marcação da sonda foi realizada em um termociclador Applied Biosystem, seguindo o programa abaixo (a Taq polimerase foi colocada na solução um minuto antes do final do estágio 1):

Passo 1 – 15 minutos a 95oC estágio 1 Passo 2 – 35 segundos a 94oC Passo 3 – 90 segundos a 56oC 35 ciclos estágio 2 Passo 4 – 90 segundos a 72oC Passo 5 – 7 minutos a 72oC estágio 3 Passo 6 – infinito a 4oC estágio 4

3.2.5. Hibridização in situ fluorescente (FISH) com sonda de rDNA 18S A FISH foi realizada de acordo com a metodologia de Pinkel et al. (1986), com as modificações descritas a seguir: 1 – Incubar as lâminas em solução de pepsina 1%, cobrir com parafilm e colocar em câmara úmida por 1 hora a 37ºC. 2 – Lavar as lâminas em tampão PBS 1x durante 5 minutos em temperatura ambiente. 3 – Desidratar as lâminas em série de etanol 70%, 90% e 100%, durante 5 minutos cada e secar. 4 – Incubar as lâminas em 90μL de RNase/2xSSC (40 µg/ml) por 1 hora a 37ºC em câmara úmida. 5 – Lavar as lâminas em três banhos de 2xSSC, por 5 minutos cada. 6 - Lavar as lâminas em um banho de PBS 1x, por 5 minutos. 25

7 – Fixar as lâminas em formaldeído 1% em PBS 1x/50mM MgCl2, durante 10 minutos, em temperatura ambiente. 8 - Lavar as lâminas em um banho de PBS 1x, por 5 minutos. 9 - Desidratar as preparações em série de etanol 70%, 90% e 100%, durante 5 minutos cada, e secar as lâminas. 10 - Desnaturar o DNA cromossômico em formamida 70% diluída em 2xSSC, por cerca de 5 minutos, a 70ºC. 11 - Desidratar as lâminas em uma série de etanol gelada (-20ºC) 70%, 90% e 100%, durante 5 minutos cada. 12 - Enquanto as lâminas são passadas na série alcoólica, desnaturar a solução de hibridação (6µL da sonda marcada e 24µL de tampão de hibridização - 50% de formamida, 20% de sulfato dextrano, 10% de 20xSSC, 20% de sonda) em termociclador por 10 minutos a 95ºC. 13 - Adicionar 30μL da solução de hibridização sobre a lâmina, cobrir com lamínula, e deixar em câmara úmida overnight a 37ºC. 14 – Lavar as lâminas duas vezes em formamida 15%, por 10 minutos cada a 42ºC. 15 – Lavar as lâminas durante 5 minutos em solução de Tween 0,5%, em temperatura ambiente. 16 – Incubar as lâminas em tampão “non fat dry milk” NFDM (20 ml de 20xSSC, 80 ml de água destilada e 5g de leite em pó desnatado) por 15 minutos. 17 – Lavar duas vezes as lâminas com Tween 0,5%, por 5 minutos a temperatura ambiente. 18 – Colocar sobre cada lâmina 30µL de solução de detecção (2µL de anti-digoxigenina conjugada com rodamina ou anti-biotina conjugada com estreptavidina Alexa Fluor-488 e 28µL de tampão bloqueio), cobrir com parafilm, e deixar em câmara úmida por 1 hora a 37ºC. 19 – Lavar as lâminas 3 vezes com Tween 0,5%, por 5 minutos cada, a temperatura ambiente. 20 - Desidratar as lâminas em série de etanol 70%, 90% e 100%, durante 5 minutos cada e secar. 21 - Adicionar sobre cada lâmina 30µL de solução de 4’-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) com antifading e cobrir com lamínula.

3.2.6. Análises Cromossômicas As análises dos cromossomos corados convencionalmente ou submetidos às técnicas de coloração diferencial foram realizadas em microscopia de luz. As imagens das células mitóticas e meióticas foram capturadas em um fotomicroscópio óptico Zeiss Imager A2 com objetiva 100 de imersão, optovar 1.6, utilizando o software Axio Vision. As medidas cromossômicas foram realizadas através do software Image J (Image processing and analysis in Java), desenvolvido pelo Research Services Branch of the US National Institute of Mental Health, com plugin 26

LEVAN de Sakamoto e Zacaro (2009). A classificação morfológica dos cromossomos foi feita de acordo com a nomenclatura proposta de Levan et al. (1964).

Tabela 2 – Espécies de aranhas analisadas citologicamente, com seus respectivos locais de coleta e número de indivíduos. CE=Ceará; MS=Mato Grosso do Sul; MT=Mato Grosso; PB=Paraíba; PI=Piauí; SE=Sergipe; SP=São Paulo. *Espécies cujos dados citogenéticos foram utilizados neste trabalho. A denominação taxonômica das espécies segue World Spider Catalog, 2015. Espécies/Famílias Nº de indivíduos Localidade ARANEOMORPHAE/HAPLOGYNAE Caponnidae Nops sp. 1♀ Sítio do Alemão, Ubajara, CE Pholcidae Sem identificação 2♂ SESC, Baía das Pedras, Poconé, MT Jardim Experimental, Universidade Estadual Paulista, Rio 1♀ Claro, SP 3♂/1♀ Rio Claro, SP 1♂/1♀ Mundo Novo, MS Mesobolivar spinulosus 1♂ Floresta Nacional dos Palmares, Altos, PI (Mello-Leitão, 1939) Micropholcus piaui 1♂ Parque Municipal Pedra de Castelo, Castelo do Piauí, PI Huber, Carvalho & Benjamin, 2014 Micropholcus ubajara 1♂ Gruta do Morcego Branco, Parque Nacional de Ubajara, Huber, Carvalho & Benjamin, 2014 Ubajara, CE Pholcus phalangioides(Fuesslin, 1775) 1♂/1♀ Bairro CPA II, Cuiabá, MT Physocyclus globosus* (Taczanowski, 1874) 1♀ Campo Experimental, UNIVAG-Centro Universitário, Várzea Grande, MT 5♂/3♀ Castelo do Piauí, PI Smeringopus pallidus (Blackwall, 1858) 1♂/2♀ Rio Claro, SP 1♂ Tatuí, SP 1♂/1♀ Mongaguá, SP Scytodidae Scytodes auricula Rheims & Brescovit, 2000 1♂ Trilha da Samambaia, Parque Nacional de Ubajara, Ubajara, CE Scytodes eleonorae* Rheims & Brescovit, 2001 2♂ Gruta do Morcego Branco, Parque Nacional de Ubajara, Ubajara, CE 3♀ Gruta de Ubajara, Parque Nacional de Ubajara, Ubajara, CE 3♂/1♀ Parque Municipal Pedra do Castelo, Castelo do Piauí, PI Scytodes fusca Walckenaer, 1837 2♀ Bairro CPA II, Cuiabá, MT 1♀ Tatuí, SP 1♂ Campo Experimental, UNIVAG-Centro Universitário, Várzea Grande, MT Sicariidae Loxosceles sp. 1♂/2♀ Jardim Experimental, Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, SP Loxosceles amazonica* Gertsch, 1967 3♀ Parque Nacional da Serra da Capivara, São Raimundo Nonato, PI 1♀ Serra de Santo Antonio, Campo Maior, PI 2♂ Horto Florestal, Piripiri, PI 13♂/4♀ Nossa Senhora de Nazaré, PI 27

1♂ Parque Municipal Pedra do Castelo, Castelo do Piauí, PI Loxosceles gaucho Gertsch, 1967 1♂/1♀ Botucatu, SP Sicarius cariri* 18♂ Parque Municipal Pedra de Castelo, Castelo do Piauí, PI Magalhães, Brescovit & Santos, 2013

10♀ Parque Municipal Pedra de Castelo, Castelo do Piauí, PI 2♂ Povoado Saquinho, Ilha Grande do Piauí, PI 4♂/3♀ Parque Nacional da Serra da Capivara, São Raimundo Nonato, PI 2♀ Horto Florestal, Piripiri, PI 2♂ Parque Nacional da Serra das Confusões, Cristino Castro, PI 1♀ Picos, PI Sicarius ornatus* 2♂ Parque Nacional da Serra de Itabaiana, Itabaiana, SE Magalhães, Brescovit & Santos, 2013 Sicarius tropicus* (Mello-Leitão, 1936) 3♂ Reserva Particular de Patrimônio Natural Fazenda Almas, São José dos Cordeiros, PB 3♂ Parque Municipal Pedra de Castelo, Castelo do Piauí,PI ARANEOMORPHAE/ENTELEGYNAE Araneidae Argiope argentata (Fabricius, 1775) 1♀ Várzea Grande, MT Centro de Convivência Infantil (CCI), Universidade 1♀ Estadual Paulista, Rio Claro, SP 1♀ Teresina, PI Metepeira sp. 5♀ Centro de Convivência Infantil (CCI), Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, SP Micrathena sp.* 1♂ Horto Florestal, Piripiri, PI Parawixia sp. 1♀ Cabeceiras do Piauí, PI Corinnidae Sem identificação 1♀ Bairro Bela Vista, Rio Claro, SP Abapeba sp.* 1♂ Nossa Senhora de Nazaré, PI Creugas sp. 1♂ Universidade Federal do Mato Grosso, Cuiabá, MT Xeropigo sp. 1♂ Campo Maior, PI Ctenidae Sem identificação 1♀ Nossa Senhora de Nazaré, PI Nothroctenus sp.* 2♀ SESC, Baía das Pedras, Poconé, MT 3♂/1♀ Horto Florestal, Piripiri, PI Nothroctenus aff. marschi* 1♂ Cachoeira da Conceição, Piripiri, PI Phoneutria nigriventer* (Keyserling, 1891) 1♂ Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, SP Viracucha ridley (F. O. Pickard-Cambridge, 1897) 1♀ Floriano, PI Deinopidae Deinopis sp. 1♂ Rio Claro, SP 2♀ Trilha da Samambaia, Parque Nacional de Ubajara, Ubajara, CE 2♀ Floresta Nacional dos Palmares, Altos, PI Gnaphosidae Vectius niger (Simon, 1880) 1♂ Tatuí, SP 28

2♂/1♀ Parque Nacional da Serra da Capivara, São Raimundo Nonato, PI Hersiliidae Ypypuera crucifera (Vellard, 1924) 1♀ Floresta Nacional dos Palmares, Altos, PI Lycosidae Sem identificação 1♂/2♀ Jardim Experimental, Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, SP 2♂ Tatuí, SP 1♀ SESC, Baía das Pedras, Poconé, MT Miturgidae Teminius sp.* 1♀ Picos, PI Nephilidae Nephila clavipes (Linnaeus, 1767) 3♂ Jardim Experimental, Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, SP Nephilingis cruentata (Fabricius, 1775) 1♀ Tatuí, SP Ochyroceratidae Ochyrocera sp. 1♀ Trilha da Samambaia, Parque Nacional de Ubajara, Ubajara, CE Palpimanidae Otiothops sp. 1♀ Serra da Ibiapaba, Ubajara, CE 1♀ Parque Estadual da Mata do Pau Ferro, Areia, PB 1♂ Floresta Nacional dos Palmares, Altos, PI Salticidae Sem identificação 1♂ SESC, Baía das Pedras, Poconé, MT 1♀ Rio Claro, SP Corythalia sp. 1♂ Tatuí, SP 1♀ Campo Experimental, UNIVAG-Centro Universitário, Várzea Grande, MT Hasarius adansoni (Audouin, 1826) 1♂/2♀ Tatuí, SP 1♀ Bairro CPA II, Cuiabá, MT 2♀ Campo Maior, PI 1♀ Rio Claro, SP Menemerus bivittatus (Dufour, 1831) 1♂ Olho d'água Jagata, Piripiri, PI Plexippus paykulli (Audouin, 1826) 1♂ Bairro Bela Vista, Rio Claro, SP Selenopidae Selenops aff. melanurus* 1♂ Sítio do Alemão, Ubajara, CE Theridiidae Anelosimus sp. 1♀ Jardim Experimental, Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, SP Nesticodes rufipes (Lucas, 1846) 2♂/6♀ Teresina, PI 1♂ Mundo Novo, MS Steatoda sp. 1♀ Jardim Experimental, Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, SP Titanoecidae Goeldia sp. 1♀ Jardim Experimental, Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, SP

Uloboridae Zosis geniculata (Olivier, 1789) 1♂ Campo Experimental, UNIVAG-Centro Universitário, Várzea Grande, MT MYGALOMORPHAE Idiopidae Idiops sp.* 1♂ Floresta Nacional dos Palmares, Altos PI Dipluridae Diplura sp.* 1♂/1♀ Ubajara, CE Ischnothele cf. guianensis 1♀ Parque Municipal Pedra do Castelo, Castelo do Piauí, PI Theraphosidae Sem identificação 1♀ SESC, Baía das Pedras, Poconé, MT Trilha da Samambaia, Parque Nacional de Ubajara, 1♀ Ubajara, CE Acanthoscurria sp. 1♀ Cerrado rupestre, Castelo do Piauí, PI 1♀ Floriano, PI Acanthoscurria natalensis* Chamberlin, 1917 1♀/1♂ Piripiri, PI 2♀ Universidade Estadual do Piauí, Campo Maior, PI 1♀ Nossa Senhora de Nazaré, PI 1♂ Teresina, PI Lasiodora sp. 1♀ Parque Municipal Pedra do Castelo, Castelo do Piauí, PI 1♀ Aroeiras, PB Magulla sp. 1♀ Parque Municipal Pedra do Castelo, Castelo do Piauí, PI Oligoxystre caatinga* Guadanucci, 2007 2♀ Campo Maior, PI 2♂/1♀ Castelo do Piauí, PI 1♂ Parque Nacional da Serra da Capivara, São Raimundo Nonato, PI 1♀ Nossa Senhora de Nazaré, PI Typhochlaena sp. 1♂ Horto Florestal, Ubajara, CE

4. RESULTADOS Os resultados obtidos encontram-se apresentados em três artigos:

Artigo I – Cytogenetic study in sand spiders (Haplogynae, Sicariidae) from the Brazilian Caatinga: sex chromosome system diversity in closely related species

Artigo II – Mapeamento do gene ribossomal 18S em 10 espécies de Araneomorphae (Haplogynae e Entelegynae)

Artigo III - Análise cromossômica em quatro espécies de aranhas Mygalomorphae (Dipluridae, Idiopidae e Theraphosidae) da fauna brasileira

Artigo I

Cytogenetic study in sand spiders (Haplogynae, Sicariidae) from the Brazilian Caatinga: sex chromosome system diversity in closely related species

TATIANA GIMENEZ-PINHEIRO1,2*, LEONARDO SOUSA CARVALHO3,4, ANTONIO DOMINGOS BRESCOVIT5, IVAN LUIZ FIORINI MAGALHAES6, MARIELLE CRISTINA SCHNEIDER7

1Universidade Estadual do Piauí, UESPI, Campus Heróis do Jenipapo, Av. Santo Antônio, s/n, CEP 64280-000, Campo Maior, Piauí, Brasil.

2Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular, Instituto de Biociências, Departamento de Biologia, Universidade Estadual Paulista, UNESP, Rio Claro, São Paulo, Brasil.

3Universidade Federal do Piauí, UFPI, Campus Amílcar Ferreira Sobral, BR 343, km 3.5, CEP 64800-000, Floriano, Piauí, Brasil.

4Programa de Pós-graduação em Zoologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, UFMG, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil.

5Laboratório Especial de Coleções Zoológicas, Instituto Butantan, Av. Vital Brasil, 1500, CEP 05503-900, São Paulo, São Paulo, Brasil.

6 División Aracnología, Museo Argentino de Ciencias Naturales "Bernardino Rivadavia", Av. Angel Gallardo 470, C1405DJR, Buenos Aires, Argentina.

7Universidade Federal de São Paulo, UNIFESP, Departamento de Ciências Biológicas, Av. Prof. Artur Riedel, 275, CEP 09972-270, Diadema, São Paulo, Brasil. E-mail: [email protected]

* Corresponding author. E-mail: [email protected]

Abstract In this study, we investigated the chromosomes of three Sicarius species from the Brazilian Caatinga, using classical and molecular cytogenetic techniques. Sicarius are haplogyne spiders that together with genus Loxosceles constitute the family Sicariidae. In this family, the available cytogenetic data showed a low diploid number range (2n♂=18 to 2n♂=23) and the presence of only multiple sex chromosome systems (X1X2Y and X1X20). Mitotic metaphase cells exhibited

2n♂=16+X1X2Y for S. cariri and S. ornatus, and 2n♂=18+XY for S. tropicus. In the three species, silver impregnation revealed nucleolar organizer region (Ag-NOR) on the terminal region of pair 1. In S. ornatus and S. tropicus, the results obtained with fluorescent in situ hybridization (FISH) using 18S rDNA probe were similar to Ag-NOR, however in S. cariri, the ribosomal sites were localized in the terminal region of the X1 sex chromosome. In this work, the description of a simple sex chromosome system for Sicariidae filled in a gap in the hypothesis about the chromosome evolution on haplogyne spiders, helping to understand how the XY sex chromosome system evolved from the X1X2Y system. Additionally, FISH data incongruous with Ag-NOR indicate that the cytogenetic studies in this family permit to investigate the relation between the karyotype evolution and the distribution and the activity of rDNA genes.

Key words: karyotype – mitosis – nucleolar organizer region – rDNA - Sicarius

INTRODUCTION The spider family Sicariidae is considered of medical importance in the world (Lotz, 2012), including sedentary species, which can be ground-dwelling hunters or web-weavers (Dias et al., 2010). Sicariidae includes 139 species distributed into only two genera: Sicarius Walckenaer, 1847, with 25 species, and Loxosceles Heineken & Lowe, 1832, composed of 114 representatives (World Spider Catalog, 2015). This latter genus is well known due to the toxicity of its venom, causing skin necrosis, renal failure and haemolysis (Silva et al., 2004; Vetter, 2008). The genus Sicarius is less diverse than Loxosceles and it is distributed in South America, Central America and Africa. In South America, there are 18 Sicarius species reported, with occurrence in Peru, Chile, Argentina, Brazil and the Galapagos Islands. For many years, in Brazil only one Sicarius species was known, S. tropicus (Mello-Leitão, 1936). However, recently Magalhaes, Brescovit & Santos (2013) described three additional species, S. cariri, S. ornatus and S. diadorim. All these species occur in semi-arid environments from Brazilian Caatinga (Magalhaes Brescovit & Santos, 2013; World Spider Catalog, 2015). Molecular analyses did not recover Sicarius and Loxosceles as a sister-group (Binford et al., 2008), but the monophyly of the family Sicariidae is well supported through morphological characters (Platnick et al., 1991; Binford et al., 2008; Labarque & Ramírez, 2012; Magalhaes, Brescovit & Santos, 2013). The venom protein sphingomyelinase D, responsible for the envenomation symptoms, could be considered a synapomorphic character for sicariids (Binford & Wells, 2003). Within the Haplogynae spiders, Sicariidae belongs to the monophyletic lineage (Sicariidae (Scytodidae (Periegopidae + Drymusidae))), the superfamily Scytodoidea (Labarque & Ramírez, 2012). In this group, the family Scytodidae is the most diverse, including a total of five genera and 232 known species (World Spider Catalog, 2015), but only five of them, exclusively of the genus Scytodes, were analyzed from the cytogenetic point of view (Araujo et al., 2015). The scytodids present a high variability in diploid number, from 2n♂=13 to 2n♂=31, but a simple and conserved sex chromosome system of the X0 type. The exception is Scytodes globula Nicolet, 1849 that revealed an intraspecific variation due to the occurrence of X0 and

X1X20 systems (Diaz & Saez, 1966; Rodríguez-Gil et al., 2002; Araujo et al., 2008). Drymusidae possesses 16 described species and only Drymusa capensis Simon, 1893, from South Africa, was cytogenetically examined, showing 2n♂=27 and X1X2Y sex chromosome system (Král et al., 2006). Periegopidae is known only for three species from Queensland and New Zealand (World Spider Catalog, 2015), but there are no cytogenetic data for this family. 35

The family Sicariidae has karyotype information for 11 representatives, which revealed low diversity in the diploid number (2n♂=18 to 2n♂=23) and the occurrence of only multiple sex chromosome systems of the X1X2Y and X1X20 types (Araujo et al., 2015). The genus Loxosceles presents nine species chromosomally characterized, in which the following diploid numbers were observed: 2n♂=18 in L. reclusa Gertsch & Mulaik, 1940; 2n♂=19 in L. spinulosa Purcell, 1904; 2n♂=20 in L. rufipes (Lucas, 1834); 2n♂=20-21 in L. rufescens (Dufour, 1820); 2n♂=23 in L. amazonica Gertsch, 1967, L. gaucho Gertsch, 1967, L. intermedia Mello-Leitão,

1934, L. laeta (Nicolet, 1849) and L. similis Moenkhaus, 1898. All these species showed X1X2Y sex chromosomes system, except L. rufipes and L. reclusa that exhibited X1X20 system (Beçak & Beçak, 1960; Diaz & Saez, 1966; Hetzler, 1979; Silva, 1988; Tugmon, Brown & Horner, 1990; Oliveira, Cella & Brescovit, 1996, 1997; Silva et al., 2002; Král et al., 2006; Kumbiçak, 2014, Araujo et al., 2015).

In the genus Sicarius, only two species were investigated, S. tropicus (2n♂=19, X1X2Y) from Brazil and an undetermined species (2n=21, X1X2Y) from Peru (Franco & Andía, 2013; Araujo et al., 2015). Nevertheless, the cytogenetic data of S. tropicus could be considered preliminary because the karyotype information is restricted to a brief description of diploid number and sex chromosome system in the spider cytogenetic database (Araujo et al., 2015). Moreover, all Sicariidae species were examined using standard staining techniques, with the exception of L. intermedia and L. laeta, in which the constitutive heterochromatin distribution has been reported (Silva et al., 2002). In this study, we performed the cytogenetic analysis in three of the four known Sicarius species from the Brazilian fauna, using standard staining, silver impregnation to reveal the active nucleolar organizer regions (NORs), and fluorescent in situ hybridization (FISH) with 18S rDNA probe to map the number and localization of the major ribosomal genes. Among the Scytodoidea spiders only four species with a simple sex chromosome system of the X0 type were examined regarding to the NOR distribution (Král et al., 2006; Araujo et al., 2008). Thus, the present work permits to investigate the change in the localization and activity of ribosomal genes and its relationship with the evolution of the sex chromosomes.

MATERIALS AND METHODS A sample of 35 specimens was analyzed in this work. The data concerning the number of individuals and the collection localities in Brazil are shown in Table 1. The vouchers were deposited in the arachnid collection of the Instituto Butantan, São Paulo, (IBSP; curator A.D. Brescovit), Coleções Taxonômicas of the Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte 36

(UFMG; curator A.J. Santos), and Coleção de História Natural of the Universidade Federal do Piauí, Floriano (CHNUFPI; curator M.R.A. Soares), in Brazil.

Table 1 – Sicarius species cytogenetically analyzed in this work, including the number of specimens and collection localities in Brazil. PI=state of Piauí; SE=state of Sergipe; PB=state of Paraíba. Number of Species individuals Locality Sicarius cariri 3♂/1♀ Parque Nacional da Serra da Capivara (8°49'48.0"S, 42°33'16.0"W), São Raimundo Nonato, PI 1♀ Picos (7°9'39.4"S; 41°28'2.5"W), PI 2♀ Horto Florestal (4°16'19.0"S; 41°41'18.9"W), Piripiri, PI 2♂ Povoado Saquinho (2°46'2.5"S, 41°48'19.3"W), Ilha Grande do Piauí, PI 2♂ Parque Nacional da Serra das Confusões (8°56'16.9"S, 43°51'48.1"W), Cristino Castro, PI 15♂/1♀ Parque Municipal Pedra de Castelo (5°12'5.9"S, 41°41'14.0"W), Castelo do Piauí, PI Sicarius ornatus Parque Nacional da Serra de Itabaiana (10°44'57.3"S, 37°20'20.1"W), 2♂ Itabaiana, SE Sicarius tropicus Reserva Particular de Patrimônio Natural Fazenda Almas (7°23'16.9"S; 3♂ 36°48'31.8"W), São José dos Cordeiros, PB Parque Municipal Pedra de Castelo (5°12'5.9"S, 41°41'14.0"W), Castelo 3♂ do Piauí, PI

The cytological preparations were obtained, following the procedures of Araujo et al. (2005). The chromosome slides were stained with 3% Giemsa solution (3% commercial Giemsa solution and 3% phosphate buffer pH 6.8, in distilled water), silver-impregnated (Howell & Black, 1980) to detect the NORs and submitted to FISH with 18S rDNA probes to localize the major ribosomal gene. The morphological classification of chromosomes followed the nomenclature proposed by Levan, Fredga & Sandberg (1964). The 18S rDNA probes were obtained by PCR using the DNA of Physocyclus globosus (Taczanowski, 1874) (Pholcidae) and the primers 18S-F 5’ CGAGCGCTTTTATTAGACCA and 18S-R 5’ GGTTCACCTACGGAAACCTT (Forman et al., 2013). Probes were labeled with 11-dUTP-digoxigenin by PCR. The FISH technique was performed according Pinkel, Straume & Gray (1986), with the following modifications. The slides were incubated in a 1% pepsin solution and RNase/2xSSC (40 µg/ml) for 1 h at 37ºC each. The chromosome were fixed in 1% formaldehyde (PBS 1X/50mM MgCl2) during 10 min, washed in PBS 1x, for 5 min and dehydrated using an ethanol series 70%, 90% and 100%, during 5 min each. The chromosomal DNA was denatured in 70% formamide/2xSSC for 5 min at 70º C and dehydrated in an ice-cold ethanol series. The hybridization solution (50% formamide, 20% dextran sulfate, 10% 20xSSC, 20% rDNA probe) was denatured in thermocycler for 10 min at 95º C. A total of 30 µL of 37 hybrization solution was applied in each slide, which was incubated in humid chamber overnight at 37ºC. Post-hybridization washes were performed for two times in 15% formamide/2xSSC for 10 min at 42ºC, 0,5% Tween for 5 min. Probes were detected with anti-digoxigenin antibody conjugated to rhodamine. Chromosome spreads were counterstained with 4’-6-diamidino-2- phenylindole (DAPI) and the slides were mounted with antifading solution. The images were captured using a Zeiss Imager A2 microscope, coupled to a digital camera and the Axio Vision software.

RESULTS Mitotic metaphase cells of male and female individuals of S. cariri showed the diploid number and sex chromosome system 2n=16+X1X2Y and 2n=16+X1X1X2X2, respectively (Fig. 1A-B). All the chromosomes exhibited metacentric morphology, with exception of pair 2 that was submetacentric. Regarding to the size, the autososomal chromosomes could be classified into three categories: large (pairs 1 and 2), medium (pairs 3 and 4) and small (pairs 5 to 8). In male cells, the X1 and Y sex chromosome were easily identified as unique elements that corresponded to the largest and smallest chromosomes of the karyotype. The X2 chromosome showed an intermediary size between the 2nd and 3rd pairs of autosomes (Fig. 1A). Sicarius ornatus also presented the 2n♂=19. In the karyotype, three unpaired elements were identified, which were similar to the sex chromosomes of S. cariri. Thus, S. ornatus should also carrier a X1X2Y sex chromosome system. However, in this species all autosome pairs revealed metacentric morphology, the X1 and X2 sex chromosomes were submetacentric and the Y was chromosome tiny acrocentric (Fig. 1C). The autosomal pair 1 exhibited large size, compared to the medium-sized pairs 2 to 5 and the smallest elements of the karyotype, pairs 6 to

8. The X1 chromosome presented a similar size to the pair 1, the X2 chromosome was larger than the pair 2 and the Y was the smallest chromosome of the karyotype (Fig. 1C). In S. tropicus, the mitotic metaphase cells evidenced 2n♂=18+XY and all chromosomes with metacentric morphology. The pair 1 was large-sized, the pairs 2, 3 and 4 medium-sized and the pairs 5 to 9 small-sized. The X and Y sex chromosomes corresponded to the largest and the smallest elements of the karyotype, respectively (Fig. 1D). The analysis of meiotic cells of S. cariri and S. tropicus revealed, in the pachytene, autosomal chromosomes completely paired and a single and very small element, interpreted as Y chromosome (Fig. 2A-B). For both species, the X sex chromosomes were not identified in this meiotic substage. Diplotene cells of S. tropicus presented 9 autosomal bivalents, with up to two interstitial or terminal chiasmata, and one heteromorphic bivalent, formed by the end-to-end 38 paired XY chromosomes (Fig. 2C). Nuclei in metaphase II of this species showed the haploid sets n=9+X and n=9+Y (Fig. 2D). Mitotic metaphase nuclei of the three Sicarius species were silver impregnated for the identification of the active NORs, which were localized on the long arm terminal region of pair 1 (Fig. 3A-F). In S. cariri, the use of the FISH technique with 18S rDNA probe evidenced bright signals localized in the long arm terminal region of X1 sex chromosome (Fig. 4A). In this species, the incongruence between the results of Ag-NOR and FISH were observed among the cells of a same individual as well as in cells of different specimens. However, for S. ornatus and S. tropicus the ribosomal cistrons occurred only in the long arm terminal region of the 1st autosomal pair (Fig. 4B-E), confirming the results of silver impregnation.

Figure 1 – Karyotypes of three Sicarius species. A-B. Sicarius cariri with 2n♂=16+X1X2Y and 2n♀=16+X1X1X2X2, respectively. C. Sicarius ornatus, 2n♂=16+X1X2Y. D. Sicarius tropicus, 2n♂=18+XY. In all species, the chromosomes were predominantly metacentrics. Scale bar=5μm.

Figure 2 – Testicular cells of Sicarius cariri (A) and Sicarius tropicus (B-D) stained with Giemsa. A-B. Pachytene nuclei, showing the univalent and very small Y chromosome. C. Diplotene with nine autosomal bivalents and one heteromorphic XY bivalent. Note the end-to-end association between the sex chromosomes. D. Metaphase II cells, with n=9+X (left) and n=9+Y (right). Scale bar=10μm.

Figure 3 – Mitotic metaphase cells of Sicarius species submitted to Giemsa-staining (A, C, E) and silver impregnation (B, D, F) to reveal the nucleolar organizer regions (arrowhead). A-B. Sicarius cariri. C-D. Sicarius ornatus. E-F. Sicarius tropicus. The cells showed in C and D are with incomplete diploid set. Scale bar=5μm.

Figure 4 – Spermatogonial cells of Sicarius species after fluorescent in situ hybridization with 18S rDNA probe. A.

Mitotic metaphase of Sicarius cariri, indicating rDNA site (arrowhead) in the X1 chromosome. B-C. Pachytene and mitotic metaphase of Sicarius ornatus. Note the bright signal (arrowhead) in the terminal region of one bivalent (B) and in pair 1 (C). D-E. Pachytene and mitotic metaphase of Sicarius tropicus exhibiting rDNA (arrowhead) in the terminal region of one bivalent (D) and in the 1st autosomal pair (E). Scale bar=5μm.

DISCUSSION The diploid number 2n=19, the X1X2Y sex chromosome system and the chromosomal morphology predominantly metacentric herein observed in S. cariri and S. ornatus are similar to those previously described for S. tropicus and one species of the genus Loxosceles, L. spinulosa

(Král et al., 2006; Araujo et al., 2015). Additionally, the X1X2Y sex chromosome system verified in S. cariri and S. ornatus is the most common in Sicariidae, occurring in seven of the 11 species cytogenetically characterized so far (Araujo et al., 2015). However, up to now, Sicariidae is the only family within the Scytodoidea and Haplogynae spiders that seems to have the X1X2Y system as a shared character to all genera. This idea is based on the fact that among the 12 families and

60 species of haplogynes cytogenetically studied, the X1X2Y sex chromosome system was recorded only in Filistata insidiatrix (Forsskal, 1775) and Kukulcania aff. hibernalis (Filistatidae), Pholcus phalangioides (Fuesslin, 1775) and Spermophora senoculata (Duges, 1836) (Pholcidae), and Drymusa capensis Simon, 1893 (Drymusidae) (Král et al., 2006;

Kořínková & Král, 2013). Additionally, it is worth pointing out that the X1X2Y system, such as observed in Haplogynae, was not registered in any of 705 species belonging to 50 families of Entelegynae, Mygalomorphae and Mesothelae spiders (Araujo et al., 2015). Surprisingly, the karyotype found here for S. tropicus (2n=18+XY) differed from that registered for other population of this same species (2n=16+X1X2Y) (Araujo et al., 2015). The description of a simple sex chromosome system of the XY type is original for Sicariidae and among the representatives of Haplogynae it was reported for only one species of Leptonetidae, one of Pholcidae and two species of Diguetidae (Král et al., 2006; Golding & Paliulis, 2011). The high similarity regarding to the size of the Y chromosome among the Sicarius species carrier of the X1X2Y and XY systems indicates that the evolution of the XY system occurred through rearrangements involving only the X chromosome. The XY system probably had origin from the X1X2Y system, in which the ancestral and metacentric X1 and X2 chromosomes were pericentrically inverted, originating subtelo-acrocentric chromosomes, such as verified in

Sicarius sp. (Franco & Andía, 2013). In a subsequent event, the X1 and X2 chromosomes were fused, converting the X1X2Y into a XY system. This hypothesis about XY sex chromosome evolution was proposed by Král et al. (2006), analyzing the behavior of the XY sex chromosomes during the meiosis of Diguetia albolineata (O. Pickard-Cambridge, 1895) (Diguetidae). In this species as well as in S. tropicus analyzed here, the X and Y chromosomes exhibited only one end-to-end association during prophase I, without the presence of chiasma. Nevertheless, the present study in Sicarius species filled in an important gap in the hypothesis of Král et al. (2006) about the evolution of sex chromosomes systems in basal clades 44

of Araneomorphae, taking into account that the hypothetic X1X2Y system with subtelo- acrocentric X1 and X2 chromosomes was exclusively observed in Sicarius sp. (Franco & Andía, 2013). In this latter species, the Y chromosome probably suffered a pericentric inversion or deletion in one arm. This rearrangement gave rise to the lack of homology between the X2 and Y chromosomes and it explains the association involving only the X1Y chromosome during the meiosis of Sicarius sp. The differences related to diploid number and sex chromosome system observed in S. tropicus (present study; Araujo et al., 2015) may represent an interpopulational variation, indicating that the karyotype 2n=18+XY is not well established in all populations of this species or it had an independent origin in the populations analyzed by us. Magalhaes et al. (2014), performing a phylogeographic study in S. cariri, using sequence data of nuclear and mitochondrial genes, revealed highly structured populations, which might be evolving independently. It is possible that S. tropicus populations are also strongly structured geographically, which could explain the differences in the karyotypes. Alternatively, the specimens initially described by Araujo et al. (2015) as S. tropicus could correspond to another species of the genus Sicarius, considering that the cytogenetic study accomplished by Araujo preceded the taxonomical revision and description of three other Sicarius species from Brazil (Magalhaes, Brescovit & Santos 2013). The localization of both active NORs and 18S ribosomal genes in Sicariidae is presented for the first time herein. Among the basal Araneomorphae and Haplogynae spiders, there are Ag- NOR data for Hypochilidae, Dysderidae, Tetrablemmidae, Pholcidae, Ochyroceratidae, Leptonetidae and Scytodidae (Král et al., 2006; Oliveira et al., 2007; Araujo et al., 2008). The species with X0 sex chromosome system revealed the following NOR distribution: 1) on one or two autosomal pair, such as verified in Physocyclus globosus (Taczanowski, 1874) (Pholcidae), Scytodes fusca Walckenaer, 1837, S. globula Nicolet, 1849, S. itapevi Brescovit & Rheims, 2000 (Scytodidae); 2) on X sex chromosome, such as registered in Ochyrocera sp. (Ochyroceratidae) and Scytodes thoracica (Latreille, 1802); 3) on one or two autosomal pairs and X chromosome, such as verified in Dysdera crocata C. L. Koch, 1838 (Dysderidae), Monoblemma muchmorei Shear, 1978 (Tetrablemmidae) and Crossopriza lyoni (Blackwall, 1867) (Pholcidae). The only examined species with the XY and X1X2Y systems were Leptoneta infuscata Simon, 1872 (Leptonetidae) and Hyphochilus pococki Platnick, 1987 (Hypochilidae) respectively, which showed NOR on X chromosome and on two autosomal pairs (Král et al., 2006; Oliveira et al., 2007; Araujo et al., 2008). 45

The results obtained herein using FISH with rDNA probe in three Sicarius species revealed that the changes involving the ribosomal genes can be independent of the differentiation of the sex chromosome system. Moreover, the karyotype evolution related to changes in the number and localization of ribosomal cistrons seems to be more frequent in the basal araneomorphs and haplogynes than in any other group of Araneae, in which the NORs occurred predominantly on autosomal chromosomes. In S. cariri, the localization of active NORs and 18S rDNA showed incongruous data, considering that the silver-impregnated regions were visualized on the terminal sites of the 1st autosomal pair, such as in S. ornatus and S. tropicus, but the FISH evidenced bright signal in the terminal region of the X1 sex chromosome. Therefore, in S. cariri the silver impregnation might have evidenced not true Ag-NORs, taking into account that this technique reveals the NORs indirectly. This occurs due to the affinity of the silver nitrate by acidic proteins associated with the rRNAs or heterochromatic regions (Sanchez et al., 1995; Lorite et al., 1997; Dobigny et al., 2002; Kasahara, 2009; Kavalco et al., 2009; Reis et al., 2012). On the other hand, the impregnation of the terminal region of pair 1 of S. cariri, which is certainly carrier of 18S rDNA genes in the two other closely related species, S. ornatus and S. tropicus, might suggest the presence of cryptic NORs in S. cariri, such as those reported by Cabrero & Camacho (2008) in some grasshopper species. The silver impregnation on pair 1 of S. cariri can represent a vestigial locus of rDNA gene, which was translocated to the X1 sex chromosome; this vestigial rDNA is very small to be detected by FISH technique but it retains its transcriptional activity. In conclusion, the data obtained by us expanded the knowledge of the karyotype diversity already registered for the family Sicariidae and the Haplogynae spiders as a whole. Moreover, we identified an intriguing variation when the results of Ag-NOR and FISH were compared. Therefore, the haplogyne spiders are not only interesting for cytogenetic studies due to the variability in the sex chromosome system, but also because it permits to investigate the evolution of the karyotype and its relationship to the distribution and activity of rDNA genes.

ACKNOWLEDGEMENTS This research was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, FAPESP (2011/19873-9; 2011/21643-1; 2011/50689-0) and by the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq, as part of the Programa de Pesquisas em Biodiversidade do Semiárido (558317/2009-0; 457471/2012-3).

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Artigo II

Mapeamento do gene ribossomal 18S em 10 espécies de Araneomorphae (Haplogynae e Entelegynae)

TATIANA GIMENEZ-PINHEIRO1,2, LEONARDO SOUSA CARVALHO3,4, ANTÔNIO DOMINGOS BRESCOVIT5, MARIELLE CRISTINA SCHNEIDER6

1Universidade Estadual do Piauí, UESPI, Campus Heróis do Jenipapo, Av. Santo Antônio, s/n, CEP 64280-000, Campo Maior, Piauí, Brasil. E-mail: [email protected].

2Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular, Instituto de Biociências, Departamento de Biologia, Universidade Estadual Paulista, UNESP, Rio Claro, São Paulo, Brasil.

3Universidade Federal do Piauí, UFPI, Campus Amílcar Ferreira Sobral, BR 343, km 3.5, CEP 64800-000, Floriano, Piauí, Brasil.

4Programa de Pós-graduação em Zoologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, UFMG, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil.

5Laboratório Especial de Coleções Zoológicas, Instituto Butantan, Av. Vital Brasil, 1500, CEP 05503-900, São Paulo, São Paulo, Brasil.

6Universidade Federal de São Paulo, UNIFESP, Departamento de Ciências Biológicas, Av. Prof. Artur Riedel, 275, CEP 09972-270, Diadema, São Paulo, Brasil.

RESUMO A infraordem Araneomorphae é o grupo das “aranhas verdadeiras” que engloba cerca de 90% das espécies descritas (3.622 gêneros com 42.800 espécies), e pode ser encontrada em praticamente todas as regiões biogeográficas. A grande maioria das araneomorfas está agrupada nos clados Haplogynae (5.239 espécies) e Entelegynae (37.561 espécies). O número diploide nas Araneomorphae varia de 2n♂=7 a 2n♂=49, com sistema cromossômico sexual (SCS) mais comum do tipo X0, X1X20, X1X2Y, XY. No presente trabalho, foram analisadas citogeneticamente, 10 espécies de Araneomorphae da fauna brasileira, com o objetivo de discutir os mecanismos de evolução cromossômica com base nos genes ribossomais, através da técnica de hibridização in situ fluorescente (FISH). O número diploide nas Araneomorphae aqui estudadas variou de 2n♂=15 a 2n♂=33 e o sistema cromossômico sexual encontrado foi X1X20. Com relação a distribuição, número e localização dos genes de rDNA 18S foi observado diferença nas três espécies do grupo Haplogynae, com marcação em um único par de cromossomos autossômicos em regiões distintas, como na região intersticial em Physocyclus globosus e terminal em Loxosceles amazonica, e marcação em dois pares autossômicos em Scytodes eleonorae. Em Entelegynae, as regiões organizadoras de nucléolo (RONs) estão presentes em um par de cromossomos autossômicos para todas as espécies estudadas. Podemos observar que RONs em cromossomos autossômicos é o padrão predominante nas aranhas, independentemente do tipo de sistema cromossômico sexual, e está presente em diferentes famílias deste clado.

PALAVRAS – CHAVE: meiose – mitose – sistema cromossômico sexual – região organizadora de nucléolo - hibridização in situ fluorescente

INTRODUÇÃO Os genes ribossomais tem sido bons marcadores para estudos sobre os processos de evolução cariotípica em vários grupos de animais e plantas (Zhang & Sang, 1999; Roy et al., 2005; Datson & Murray, 2006; Bombarová et al., 2007; Pisano & Ghigliotti, 2009; Cabral-De- Mello et al., 2011). Em eucariotos, o gene ribossomal maior (rDNA 45S) é formado pelo rDNA 18S, 5.8S e 28S, os quais estão organizados em unidades de transcrição e repetidos em tandem (Long & Dawid, 1980). Estes genes podem estar localizados em um ou mais loci cromossômicos e a quantidade de repetição das unidades de transcrição pode também ser variável entre os cromossomos (Verma & Babu, 1995). Os loci cromossômicos onde estão localizados os genes de rDNA 45S são denominados de regiões organizadoras de nucléolo (RONs), as quais, em estudos de citogenética, são comumente detectadas através da impregnação pelo íon prata (Goodpasture & Bloom, 1975; Howell & Black, 1980). No entanto, pelo fato de terem sequencias conservadas e ocorrem em grande número de cópias no genoma, os genes de rDNA podem ser facilmente identificados nos cromossomos pela técnica de hibridização in situ fluorescente (FISH). Devido a sua importância como marcador cromossômico, a localização das RONs ou dos genes de rDNA, se tornou quase que obrigatória nos estudos citogenéticos. No entanto, em Araneomorphae, a maior infraordem dentro de Araneae (cerca de 42.800 representantes) (World Spider Catalog, 2015), somente 35 espécies das 742 citogeneticamente caracterizadas (Wise, 1983; Barrion et al., 1989; Araújo et al., 2005, 2008, 2014, 2015b; Král et al., 2006, 2011; Král, 2007; Oliveira et al., 2007; Rodríguez-Gil et al., 2007; Stávale et al., 2010, 2011; Dolejš et al., 2011; Forman et al., 2013) foram estudas com relação a distribuição das RONs (Tabela 1). Embora em outros grupos, a técnica de FISH para localização dos genes de rDNA seja empregada a bastante tempo, nas araneomorfas o único estudo existente foi realizado em 2013 para apenas uma espécie, Wadicosa fidelis (Lycosidae) (Forman et al., 2013). A infraordem Araneomorphae é o grupo das “aranhas verdadeiras” e engloba cerca de 90% das espécies de aranhas descritas, as quais podem ser encontradas em todas as regiões biogeográficas. Morfologicamente, as aranhas deste grupo são caracterizadas pela presença de abdômen não segmentado, articulação das quelíceras em ângulo reto com o plano sagital do corpo e fiandeiras anteriores laterais grandes e bem desenvolvidas (Coddington & Levi, 1991). O clado basal das Araneomorphae é constituído por três famílias, Hypochilidae, Gradungulidae e Austrochilidae, com apenas 12, 16 e nove espécies descritas, respectivamente. A grande maioria das araneomorfas está agrupada nos clados Haplogynae (5.239 espécies) e Entelegynae (37.561 54 espécies). As aranhas haploginas diferenciam-se das enteleginas pelo fato das fêmeas apresentarem genitálias mais simples (Coddington & Levi, 1991; World Spider Catalog, 2015). As informações citogenéticas mostram que o número diploide nas Araneomorphae varia de 2n♂=7 a 2n♂=52 (Wallace, 1909; Suzuki, 1950, 1954; Kořínková & Král, 2013). As famílias das araneomorfas basais e Haplogynae possuem apenas 63 espécies cariotipadas, porém apresentam uma grande diversidade de sistemas cromossômicos sexuais, dos tipos X0, X1X20,

X1X2Y, XY (Araujo et al., 2015a). Em contraste com o que é observado nas espécies de Haplogynae, as aranhas do grupo-irmão Entelegynae, com 679 representantes examinados citogeneticamente, exibem um cariótipo mais conservado quanto à presença de sistema cromossômico sexual do tipo X1X20 (Araujo et al., 2015a). Embora nas espécies de Araneomorphae como um todo, as RONs estejam localizadas predominantemente sobre a região terminal de um a três pares autossômicos, os poucos estudos existentes mostraram diferenças entre os grupos das haploginas e enteleginas (Tabela 1). Nas aranhas Haplogynae, portadoras de sistema cromossômico sexual simples do tipo X0 e XY, as RONs foram observadas sobre os cromossomos autossomos e sexual X (Dysderidae, Pholcidae e Tetrablemidae) ou apenas sobre o cromossomo sexual X (Leptonetidae, Ochyroceratidae e

Scytodidae). Em três espécies de Entelegynae com sistema cromossômico sexual X1X20, as RONs ocorrem sobre cromossomos autossômicos e sexuais (Nephilidae) ou apenas sobre o cromossomo sexual X2 (Tetragnathidae) (Wise, 1983; Barrion et al., 1989; Araujo et al., 2005, 2008, 2014, 2015b; Král et al., 2006, 2011, 2013; Král, 2007; Oliveira et al., 2007; Rodríguez- Gil et al., 2007; Stávale et al., 2010, 2011; Dolejš et al., 2011; Forman et al., 2013). Em aranhas, nenhum estudo específico sobre a localização das RONs foi realizado até o momento. Neste trabalho, nós determinamos a distribuição das RONs com relação ao número e localização, através da técnica de FISH, em 10 espécies de Araneomorphae, pertencentes a oito famílias, com o objetivo de discutir os mecanismos de evolução cromossômica levando-se em conta a distribuição dos genes de rDNA.

Tabela 1 – Espécies de Araneomorphae que foram caracterizadas quanto à distribuição das regiões organizadoras de nucléolo ativas (RONs). *Número diploide e sistema cromossômico sexual estabelecido somente através da análise de indivíduos fêmeas. A denominação taxonômica das espécies segue World Spider Catalog, 2015. Espécies Número diploide e Localização das RONs Referência sistema cromossômico sexual (♂) Araneomorphae basal Hypochilidae Hypochilus pococki 29, X1X2Y Região intersticial e terminal de dois Král et al., 2006 pares autossômicos Araneomorphae/Haplogynae Tetrablemmidae Monoblemma muchmorei 23, X0 Região intersticial de um par Král et al., 2006 autossômico; Região subterminal de um braço e região terminal de outro braço do cromossomo X Dysderidae Dysdera crocata 13, X0 Região terminal de um par autossômico; Král et al., 2006 Cromossomo X Pholcidae Crossopriza lyoni 23, X0 Região terminal dos pares 4 e 6; Oliveira et al., 2007 Região terminal do cromossomo X Physocyclus globosus 15, X0 Região intersticial do par 2 Oliveira et al., 2007 Ochyroceratidae Ochyrocera sp. 13, X0 Cromossomo X Král et al., 2006 Leptonetidae Leptoneta infuscata 14, XY Cromossomo X Král et al., 2006 Scytodidae Scytodes fusca 31, X0 Região terminal do par 1 Araujo et al., 2008 Scytodes globula 13, X0 Região terminal dos pares 1 e 2 Araujo et al., 2008 Scytodes itapevi 17, X0 Região terminal do par 4 Araujo et al., 2008 Scytodes thoracica 19, X0 Cromossomo X Král et al., 2006 Araneomorphae/Entelegynae Agelenidae Tegenaria campestres 43, X1X2X30 Região subterminal de um par Král, 2007 autossômico Tegenaria ferruginea 40, X1X2X3X4X5Y Região subterminal de um par Král, 2007 autossômico Sparassidae Polybetes punctulatus 44, X1X1X2X2* Região terminal de dois pares Rodríguez-Gil et al., autossômicos 2007 Polybetes pythagoricus 42, X1X20 Região terminal de dois pares Rodríguez-Gil et al., autossômicos 2007 Polybetes rapidus 44, X1X1X2X2* Região terminal de dois pares Rodríguez-Gil et al., autossômicos 2007 Ctenidae Ctenus ornatus 28, X1X20 Região terminal do par 10 Araujo et al., 2014 Phoneutria nigriventer 28, X1X20 Região terminal do par 10 Araujo et al., 2014 Viracucha andicola 29, X1X2X30 Região terminal dos pares 10 e 16 Araujo et al., 2014 Lycosidae Arctosa alpigena lamperti 28, X1X20 Região terminal dos pares 3 e 11 Dolejš et al., 2011 Arctosa lutetiana 28, X1X20 Região terminal dos pares 8 e 11 Dolejš et al., 2011 Trigosa georgicola 28, X1X20 Região terminal de dois pares Wise, 1983 autossômicos Xerolycosa miniata 22, X1X20 Região terminal dos pares 3 e 6 Dolejš et al., 2011 Xerolycosa nemoralis 22, X1X20 Região terminal dos pares 3 e 6 Dolejš et al., 2011 Wadicosa fidelis 28, X1X20 Região terminal do par 6 Forman et al., 2013 Oxyopidae Hamataliwa sp. 28, X1X20 Região terminal e intersticial de dois Stávale et al., 2011 pares autossômicos Oxyopes javanus 23, X0 Par 8 Barrion et al., 1989 Oxyopes salticus 11, X0 Região terminal dos pares 2, 3 e 5 Stávale et al., 2011

Theridiidae Argyrodes elevatus 21, X0 Região terminal dos pares 2, 3 e 4 Stávale et al., 2010 Nesticodes rufipes 22, X1X20 Região terminal do par 4 Stávale et al., 2010 Nephilidae Nephila clavipes 24, X1X20 Região terminal dos pares 5 e 6 e dos Araujo et al., 2015b cromossomos X1 e X2 Nephilingis cruentata 26, X1X1X2X2* Região terminal dos pares 1 e 2 Araujo et al., 2005 Nephila sexpunctata 24, X1X20 Região terminal dos pares 1, 2, 3, 5, 6, 11 Araujo et al., 2015b e dos cromossomos X1 e X2 Tetragnathidae Meta menardi 24, X1X20 Região terminal do cromossomo X2 Král et al., 2011 Metellina merianae 24, X1X20 Região terminal do cromossomo X2 Král et al., 2011

MATERIAIS E MÉTODOS Um total de 40 exemplares de oito famílias e 10 espécies de Araneomorphae foram coletados em diferentes localidades brasileiras dos estados do Ceará, Mato Grosso, Piauí e São Paulo, todos em estágio de desenvolvimento (adulto ou subadulto) adequados para obtenção das preparações citogenéticas (Tabela 2). Os indivíduos foram depositados no Laboratório Especial de Coleções Zoológicas, do Instituto Butantan, São Paulo (SP) (IBSP; curador A.D. Brescovit), Coleções Taxonômicas da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte (MG) (UFMG; curador A.J. Santos) e Coleção de História Natural da Universidade Federal do Piauí, Floriano (PI) (CHNUFPI; curador M.R.A. Soares)

Tabela 2 – Espécies de Araneomorphae analisadas citogeneticamente neste trabalho, incluindo o local de coleta no Brasil. CE=Ceará; MT=Mato Grosso; PI=Piauí; SP=São Paulo. Família/Espécies Número de indivíduos Localidade ARANEOMORPHAE/HAPLOGYNAE PHOLCIDAE Physocyclus globosus 3♂ Castelo do Piauí, PI (5°19'17.40''S, (Taczanowski, 1874) 41°33'12.96''W)

SICARIIDAE Loxosceles amazonica 4♀/12♂ Nossa Senhora de Nazaré, PI (4°37'45.48''S, Gertsch, 1967 42°10'09.84''W)

3♀ Parque Nacional da Serra da Capivara (8°49'48.0"S, 42°33'16.0"W), São Raimundo Nonato, PI 1♀ Serra de Santo Antônio (5°04'55''S, 42°04'59''W), Campo Maior, PI 1♂ Parque Municipal Pedra de Castelo (5°12'5.9"S, 41°41'14.0"W), Castelo do Piauí, PI Horto Florestal (4°17'10.4''S, 41°46'23.6''W), 2♂ Piripiri, PI SCYTODIDAE Scytodes eleonorae 2♂ Parque Municipal Pedra de Castelo (5°12'5.9"S, Rheims & Brescovit, 2001 41°41'14.0"W), Castelo do Piauí, PI 1♂ Gruta do Morcego Branco (3°50'19.4"S, 40°53'58.6"W), Parque Nacional de Ubajara, Ubajara, CE 57

ARANEOMORPHAE/ENTELEGYNAE CORINNIDAE Abapeba sp. 1♂ Nossa Senhora de Nazaré, PI (4°37'45.48''S, 42°10'09.84''W) CTENIDAE Nothroctenus sp. 2♀/2♂ Horto Florestal (4°17'10.4"S; 41°46'23.6"W), Piripiri, PI 1♀ Serviço Social do Comércio Baía das Pedras (16°29'58.2"S, 56°22'45.0"W), Poconé, MT Cachoeira da Conceição (4°16'20.9''S, Nothroctenus aff. marshi 1♂ 41°46'40.8''W), Piripiri, PI Phoneutria nigriventer 1♂ Universidade Estadual Paulista, Campus Rio (Keyserling, 1891) Claro (22°23'45.17''S, 47°32'49.88''W), Rio Claro, SP

ARANEIDAE Micrathena sp. 1♂ Horto Florestal (4°16'19.0"S; 41°41'18.9"W), Piripiri, PI MITURGIDAE Teminius sp. 1♀ Picos, PI (7°4'55.92''S, 41°26'04.56''W) SELENOPIDAE Sítio do Alemão (3°50'50.7"S, 40°53'18.5"W), Selenops aff. melanurus 1♂ Ubajara, CE

Os exemplares foram dissecados em solução fisiológica (128.3mM NaCl, 16.7 mM

Na2HPO4, 19.9 mM KH2PO4), as gônadas (testículos ou ovários) foram retiradas e as preparações cromossômicas obtidas de acordo com a técnica empregada por Araujo et al. (2005). As lâminas foram coradas com solução de Giemsa 3%. A classificação morfológica dos cromossomos foi feita de acordo com a nomenclatura proposta por Levan et al. (1964). A técnica de FISH foi realizada com sondas de rDNA 18S obtidas por PCR a partir do DNA de Physocyclus globosus (Taczanowski, 1874) (Pholcidae), usando os primers 18S-F 5’ CGAGCGCTTTTATTAGACCA e 18S-R 5’ GGTTCACCTACGGAAACCTT (Forman et al., 2013). As sondas foram marcadas por PCR com 11-dUTP-digoxigenina ou 16-dUTP-biotina. A FISH foi realizada seguindo Pinkel et al. (1986) com as modificações descritas por Gimenez- Pinheiro et al. (2015 - artigo submetido). As imagens das células mitóticas e meióticas foram capturadas em um fotomicroscópio óptico Zeiss Imager A2 com objetiva 100 de imersão, optovar 1.6, utilizando o software Axio Vision.

RESULTADOS Haplogynae Os estudos citogenéticos foram realizados em três espécies de aranhas Haplogynae, Physocyclus globosus (Pholcidae), Loxosceles amazonica (Sicariidae) e Scytodes eleonorae 58

(Scytodidae). Metáfases mitóticas de exemplares machos de Physocyclus globosus mostraram o número diploide e sistema cromossômico sexual, 2n♂=14+X0, como previamente determinado por Oliveira et al. (2007). Células mitóticas e meióticas submetidas a técnica de FISH, com sonda de rDNA 18S, evidenciaram marcação na região intersticial de um par cromossômico (Figura 1A-B). Em Loxosceles amazonica, os núcleos testiculares revelaram o número diploide 2n♂=23, com sistema cromossômico sexual do tipo X1X2Y, como já relatado por Araujo (2007) para esta espécie. As células mitóticas mostraram cístrons ribossomais na região terminal em um par cromossômico. Nos núcleos em metáfases II, a marcação dos genes ribossomais foi observada na região terminal do braço curto de um cromossomo (Figura 2A-C). Nas preparações cromossômicas de exemplares machos de Scytodes eleonorae foi observado uma grande quantidade de células na fase de diplóteno, as quais permitiram determinar o número diploide 2n♂=32+X0. As células submetidas a técnica de FISH, evidenciaram sítios de rDNA 18S em dois bivalentes. Tais resultados foram confirmados com as marcações visualizadas nas células em metáfase II (Figura 3A-C).

Entelegynae Sete espécies de aranhas Entelegynae, pertencentes a cinco famílias, foram investigadas neste trabalho: Abapeba sp. (Corinnidae), Nothroctenus sp., Nothroctenus aff. marshi, Phoneutria nigriventer (Ctenidae), Micrathena sp. (Araneidae), Teminius sp. (Miturgidae) e Selenops aff. melanurus (Selenopidae). Metáfases mitóticas de um exemplar macho de Abapeba sp. evidenciaram o número diploide 2n♂=28 e a morfologia telocêntrica de todos os cromossomos (Figura 4A). Núcleos em paquíteno mostraram filamentos duplos, que correspondem ao bivalentes autossômicos, e dois elementos altamente condensados e corados, identificados como cromossomos sexuais X1 e X2 (Figura 4B). Nos diplótenos, 13 bivalentes e dois cromossomos univalentes, usualmente dispostos lado-a-lado, foram observados. Nesta fase, a maioria dos bivalentes autossômicos exibiu um quiasma terminal ou intersticial (Figura 4C). Células em metáfase II apresentaram n=13 e n=13+X1X2, confirmando a presença do sistema cromossômico sexual múltiplo para esta espécie (Figura 4D). Células meióticas submetidas à técnica de FISH, com sonda de rDNA 18S, revelaram uma marcação brilhante na região terminal de um bivalente autossômico (Figura 4E- G). Células testiculares e ovarianas de Nothroctenus sp. revelaram, respectivamente, os números diploides 2n♂=28 e 2n♀=30, os quais são condizentes com um sistema cromossômico sexual X1X20/X1X1X2X2 (Figura 5A). Os cromossomos possuem morfologia telocêntrica. 59

Células testiculares mostraram que no paquíteno, os cromossomos sexuais aparecem heteropicnóticos positivos e mais condensados em relação aos autossomos (Figura 5B). Células diplotênicas apresentaram 13 bivalentes, com um quiasma terminal ou intersticial em cada, e os univalentes X1 e X2 (Figura 5C). Metáfases II exibiram n=13+X1X2 e n=13 (Figura 5D). Nas metáfases mitóticas tanto de machos quanto de fêmeas, sítios de rDNA 18S, localizados na região terminal de dois cromossomos, foram visualizados. No paquíteno e diplóteno, as marcações dos genes ribossomais apareceram na região terminal de um bivalente autossômico (Figura 5E-H). Metáfases mitóticas de um exemplar macho de Nothroctenus aff. marshi também mostraram 2n♂=28 e a análise das células diplotênicas evidenciou a presença de um sistema cromossômico sexual do tipo X1X20, cujos cromossomos possuem comportamento similar durante a meiose daquele descrito para Nothroctenus sp. (Figura 6A). Através do emprego da técnica de FISH, cístrons de rDNA na região terminal de um bivalente foram observados (Figura 6B). Na amostra analisada de metáfases mitóticas de um espécime macho de Phoneutria nigriventer foi confirmado o número diploide 2n♂=28 e o sistema cromossômico sexual do tipo

X1X20 determinado por Araujo et al. (2014) para esta mesma espécie. Células mitóticas e meióticas submetidas à técnica de FISH permitiram localizar os genes de rDNA 18S sobre a região terminal de um par de cromossomos (Figura 7). Nos diplótenos, ficou evidente que o bivalente portador dos cístrons ribossomais é de tamanho pequeno (Figura 7C). O estudo de células de um espécime macho de Micrathena sp., permitiu determinar o cariótipo 2n♂=24+X1X20, com cromossomos telocêntricos. (Figura 8A-C). Os cromossomos sexuais X1 e X2 são os menores elementos do cariótipo e possuem heteropicnose positiva apenas nas subfases iniciais da prófase I; no diplóteno aparecem como elementos únicos e pequenos, geralmente dispostos lado-a-lado. Nesta espécie, os genes ribossomais 18S estão localizados na região terminal de um par ou bivalente autossômico (Figura 8D-E). Em Teminius sp., as análises citogenéticas foram realizadas apenas em uma fêmea. Apesar do número pequeno de células foi possível determinar o número diploide 2n♀=22 e a morfologia acrocêntrica dos cromossomos (Figura 9A). As células paquitênicas submetidas à técnica de FISH, revelaram uma marcação do gene ribossomal na região terminal de um bivalente (Figura 9B). Através do estudo de células testiculares meióticas, o número diploide 2n♂=28 e o sistema cromossômico sexual do tipo X1X20 foi determinado para Selenops aff. melanurus (Figura 10). No diplóteno, os 13 bivalentes autossômicos apresentaram um quiasma terminal ou intersticial e os cromossomos sexuais foram facilmente identificados como elementos univalentes (Figura 60

10A). Nesta espécie, os sítios de rDNA 18S foram observados na região terminal de um bivalente autossômico, durante o paquíteno e diplóteno, e em um cromossomo, em células em metáfases II, com n=15 (Figura 10B-D).

Figura 1 – Células testiculares de Physocyclus globosus (Pholcidae). A. Metáfase mitótica, submetida a hibridização in situ (FISH), evidenciando marcação intersticial (seta) em um par de cromossomos. B. Dois núcleos em metáfase II, submetidos a hibridização in situ (FISH), mostrando conjuntos haploides n=7 e n=8, com sítio de rDNA 18S (seta) na região intersticial de um cromossomo. Escala=5μm.

Figura 2 – Células testiculares de Loxosceles amazonica (Sicariidae). A. Metáfase mitótica, submetida a hibridização in situ (FISH), com 2n=23, evidenciando marcação terminal de rDNA 18S (seta) em um par cromossômico. B-C. Detalhes de metáfase II, mostrando a marcação de cístrons de rDNA 18S (seta) na região terminal do braço curto de um cromossomo. Escala=5μm.

Figura 3 – Células testiculares de Scytodes eleonorae (Scytodidae). A. Célula diplotênica, com 16II+X0, submetida a hibridização in situ (FISH), evidenciando marcação de rDNA 18S (seta) na região terminal de dois bivalentes. B- C. Detalhe de cromossomos em metáfase II, mostrando a marcação de rDNA 18S (seta) na região terminal em um cromossomo. Escala=5μm.

Figura 4 – Células testiculares de Abapeba sp. (Corinnidae) em coloração convencional (A-D) e após o emprego da técnica de hibridização in situ com rDNA 18S (E-G). A. Metáfase mitótica com 2n=28. B. Núcleo paquitênico, evidenciando o sistema cromossômico sexual X1X20. C. Diplóteno com 13II+X1X20. D. Metáfases II, com n=13

(superior) e n=13+X1X20 (inferior). E-F. Paquíteno e diplóteno, respetivamente, revelando os genes de rDNA 18S (seta) na região terminal de um bivalente autossômico. G. Cromossomos em metáfase II, evidenciando marcação de rDNA 18S (seta). As marcações na parte superior da figura estão em núcleos interfásicos. Escala=5μm.

Figura 5 - Células testiculares e ovarianas de Nothroctenus sp. (Ctenidae), em coloração com Giemsa (A-D) e após a hibridização in situ (FISH) com sonda de rDNA 18S (E-H). A. Metáfase mitótica com 2n♂=28. B. Paquíteno, evidenciando o sistema cromossômico sexual do tipo X1X20. C. Diplóteno com 13II+X1X20. D. Metáfase II com n♂=13+X1X20. E-F. Metáfases mitóticas, com 2n♂=28 e 2n♀=30, respectivamente, mostrando a marcação de rDNA 18S (seta), na região terminal de um par cromossômico. G-H. Paquíteno e diplóteno, respectivamente, exibindo os cístrons de rDNA 18S (seta) na região terminal de um bivalente. Escala=5μm.

Figura 6 – Células testiculares de Nothroctenus aff. marshi (Ctenidae). A. Diplóteno, em coloração convencional, evidenciando 13II+X1X20. B. Diplóteno, mostrando a localização do rDNA 18S (seta), na região terminal de um bivalente autossômico. Escala=5μm.

Figura 7 – Células testiculares de Phoneutria nigriventer (Ctenidae), submetidas a hibridização in situ fluorescente, mostrando a localização dos genes de rDNA 18S (seta). A. Metáfase mitótica com 2n♂=28. B. Paquíteno. C.

Diplóteno, evidenciando 13II+X1X20. D. Metáfase II com n♂=15. Escala=5μm

Figura 8 – Células testiculares de Micrathena sp. (Araneidae). A. Metáfase mitótica, em coloração convencional, com 2n=26. B. Núcleo paquitênico, em coloração convencional, evidenciando o sistema cromossômico sexual do tipo X1X20. C. Célula diplotênica, em coloração convencional, com 12II+X1X20. D-E. Metáfase mitótica e diplóteno respectivamente, submetidos a técnica de FISH, mostrando marcação na região terminal (seta) de um par cromossômico (D) e na região terminal (seta) de um bivalente (E). Escala=5μm.

Figura 9 – Células ovarianas de Teminius sp. (Miturgidae). A. Metáfase mitótica, em coloração convencional, com 2n=22. B. Núcleo paquitênico, submetido a hibridização in situ (FISH), evidenciando marcação de rDNA 18S (seta) na região terminal de um bivalente. Escala=5μm.

Figura 10 – Células testiculares de Selenops aff. melanurus (Selenopidae), corada com Giemsa (A) e submetidas à técnica de hibridização in situ com sonda de rDNA 18S (B-D). A. Diplóteno com 13II+X1X20. B. Paquíteno. C. Diplóteno e detalhe do bivalente portador do rDNA 18S. D. Metáfase II, com n=15. As setas mostram a localização do gene ribossomal 18S. Escala=5μm.

DISCUSSÃO Número diploide e sistema cromossômico sexual O número diploide e o sistema cromossômico sexual observados em dois representantes de Haplogynae estudados neste trabalho, Physocyclus globosus com 2n♂ =14+X0 e Loxosceles amazonica com 2n♂=20+X1X2Y, foram similares aqueles previamente descritos para estas mesmas espécies de outras populações do Brasil (Araujo, 2007; Oliveira et al., 2007). Dentre as aranhas haploginas, a família Pholcidae é a mais diversificada, com 1.456 espécies distribuídas em 79 gêneros (World Spider Catalog, 2015). Citogeneticamente, esta família é também a que possui a maior quantidade de espécies examinadas, 19 incluídas em oito gêneros, nas quais o número diploide variou entre 2n♂=15 a 2n♂=32 e foram encontrados sistemas cromossômicos sexuais simples e múltiplos dos tipos, X0, XY, X1X2Y e X1X20 (Araújo et al., 2015a). No entanto, com seis espécies analisadas, o gênero Physocyclus parece ser aquele com cariótipo mais conservado dentro da família, uma vez que apenas o 2n♂=14+X0 foi observado (Cokendolpher & Brown, 1985; Cokendolpher, 1989; Oliveira et al., 2007; Golding & Paliulis, 2011). A família Sicariidae possui apenas dois gêneros, Loxosceles e Sicarius, e 139 espécies, das quais apenas 11 foram estudadas citogeneticamente (Araújo et al., 2015a; World Spider Catalog, 2015). Neste grupo, os números diploides já registrados (2n♂=18, 2n♂=19, 2n♂=20, 2n♂=21 e 2n♂=23) demonstram pequena amplitude de variação quando comparados com as demais famílias de Haplogynae e os sistemas cromossômicos sexuais encontrados são apenas múltiplos (X1X2Y e X1X20) (Beçak & Beçak, 1960; Diaz & Saez, 1966; Hetzler, 1979; Silva, 1988; Tugmon et al., 1990; Oliveira et al., 1996, 1997; Silva et al., 2002; Král et al., 2006; Franco & Andía, 2013; Kumbiçak, 2014). Porém, ainda não se exclui a possibilidade de que o sistema

X1X20 seja uma interpretação equivocada do X1X2Y, devido a não identificação do cromossomo Y, pelo seu tamanho reduzido. Scytodidae, com 232 espécies e cinco gêneros, possui informações citogenéticas para cinco representantes, todos pertencentes ao gênero Scytodes (Araújo et al., 2015a; World Spider Catalog, 2015). Neste gênero, os dados disponíveis mostram uma grande variação do número diploide, 2n♂=13 a 2n♂=31, mas uma constância do sistema cromossômico sexual simples do tipo X0 (Diaz & Saez, 1966; Hetzler, 1979; Rodríguez-Gil et al., 2002; Král et al., 2006; Araujo et al., 2008). As características observadas no presente trabalho para Scytodes eleonorae são inéditas e o número diploide é o mais alto registrado para o gênero, o que amplia ainda mais a diversidade cariotípica para esta família. As sete espécies de Entelegynae analisadas neste trabalho, embora pertençam a cinco famílias diferentes, exibiram pouca variação no número diploide, 2n♀=22, 2n♂=26 e 2n♂=28, e todos apresentaram sistema cromossômico sexual do tipo X1X20, com exceção de Teminius sp. 72

(Miturgidae), na qual o sistema não foi determinado pelo fato das análises terem sido realizadas apenas em um exemplar fêmea. A família Miturgidae (159 espécies e 33 gêneros) possui apenas uma espécie estudada cromossomicamente, Prochora lycosiformis (O.Pickard-Cambridge,

1872), que exibiu 2n♂=22+X1X20 (Gorlova et al., 1997; World Spider Catalog, 2015). Ctenidae (512 espécies e 43 gêneros), possui oito espécies incluídas em sete gêneros examinadas sob o ponto de vista citogenético, com 2n♂=22, 2n♂=28 e 2n♂=29 e sistemas cromossômicos sexuais

X1X20 e X1X2X30 (Chen, 1999; Oliveira et al., 1996; Araujo et al., 2014; World Spider Catalog, 2015). O cariótipo observado nos exemplares de Phoneutria nigriventer estudados aqui foi similar aquele descritos por Araujo et al. (2014), mas para as espécies de Nothroctenus sp. houve uma diferença com relação ao tipo de sistema cromossômico sexual, X1X20 (presente trabalho) e X1X2X30 (Araujo et al., 2014). Variações interespecíficas de um ou dois pares cromossômicos e de sistema sexual X1X20/X1X2X30 são relativamente frequentes entre as aranhas enteleginas, tendo sido relatados em espécies das diferentes famílias, como Oecobiidae, Dictynidae, Gnaphosidae, Cubionidae, Salticidae, Pisauridae, Lycosidae, Oxyopidae, Uloboridae, Araneidae, Linyphiidae, Therediidae, Tetragnathidae, Agelenidae, Eutichuridae, Philodromidae (Araujo et al., 2015a). A família Corinnidae (com 729 espécies e 67 gêneros) possui somente dois representantes do gênero Castianeira caracterizados, com 2n♂=24+X1X20 (Bole-Gowda, 1958; Mittal, 1961,

1966; World Spider Catalog, 2015), diferindo do 2n♂=26+X1X20 verificado em Abapeba sp. (presente trabalho). O primeiro representante do gênero Micrathena, um espécime da família Araneidae, está sendo descrito neste estudo. Araneidae (3.096 espécies e 169 gêneros) é a terceira família de Araneae em número de espécies cariotipadas, totalizando 69 espécies e 20 gêneros. No entanto, esta família exibe uma diversidade cariotípica relativamente pequena, sendo que

77% das espécies apresentaram 2n♂=22+X1X20 (Araujo et al., 2015a). Entre as araneides, o número diploide 2n♂=26 encontrado Micrathena sp. foi observado apenas em Argiope bruennichi (Scopoli, 1772), espécie na qual não foi descrito o sistema cromossômico sexual (Zhang & Tong, 1990). Para a família Selenopidae (256 espécies e 10 gêneros) há dados cromossômicos para Makdiops montigenus (Simon, 1889), Selenops radiatus Latreille, 1819 e

Selenops sp. todas com 2n♂=26+X1X2X30 (Sharma et al., 1959; Mittal, 1961, 1966; Srivastava & Shukla, 1986; Anjali & Prakash, 2014). Assim como verificado nas espécies de Ctenidae investigadas neste trabalho, em Selenopidae também ocorreu uma variação interespecífica de sistema cromossômico sexual X1X20/X1X2X30.

Região organizadora de nucléolo Na infraordem Araneomorphae, as regiões organizadoras de nucléolo foram descritas para uma espécie da família basal Hypochilidae, 10 espécies de Haplogynae (Dysderidae, Tetrablemmidae, Pholcidae, Ochyroceratidae, Leptonetidae e Scytodidae) e 24 de Entelegynae (Tetragnathidae, Nephilidae, Theridiidae, Agelenidae, Sparassidae, Oxyopidae, Lycosidae e Ctenidae). Conforme mostra a Tabela 1, nestes grupos há uma predominância de RONs autossômicas. Král et al. (2013), estudando citogeneticamente aranhas Mygalomorphae, que junto com Araneomorphae constitui a subordem Opisthothelae, sugeriu que RONs autossômicas poderiam representar uma simplesiomorfia para essas duas linhagens. Nas aranhas haploginas, a presença de RONs autossômicas e no cromossomo sexual X representa a condição mais frequente, sendo registrada para cinco espécies que possuem sistema X0 e uma espécie com sistema XY (Král et al., 2006; Oliveira et al., 2007; Araujo et al., 2008). É interessante notar que esta presença de RONs nos cromossomos sexuais não está restrita a um determinado grupo de famílias filogeneticamente relacionadas, sendo encontrada nos clados Dysderoidea (Tetrablemmidae e Dysderidae) e Scytodoidea (Pholcidae, Ochyroceratidae, Leptonetidae e Scytodidae) (Král et al., 2006; Oliveira et al., 2007). Além disso, ainda não é possível afirmar que RONs nos cromossomos sexuais corresponda a uma sinapomorfia de determinada família. Tal observação se baseia no fato de que os únicos táxons (Ochyroceratidae e Leptonetidae) que possuem RONs apenas sobre os cromossomos sexuais, tem dados citogenéticos para uma espécie (Král et al., 2006). Em Physocyclus globosus estudada no presente trabalho, os resultados de FISH com sonda de rDNA foram concordantes com aqueles obtidos através de impregnação pelo íon prata por Oliveira et al. (2007). Entre as três espécies de Haplogynae examinadas aqui (P. globosus, L. amazonica e S. eleonorae), ocorreu uma variação tanto no número de sítios de rDNA quanto na posição da marcação. Em Scytodes (Scytodidae), gênero de haploginas, que possui o maior número de espécies caracterizadas com relação a distribuição das RONs, nós constatamos que não há uma correlação direta entre o número diploide e o número de sítios ribossomais, uma vez que quatro RONs foram registradas tanto para a espécie que tem o menor número diploide da família, 2n♂=13 em Scytodes globula (Diaz & Saez, 1966), tanto para aquela que possui o maior número cromossômico, 2n♂=33 em Scytodes eleonorae (presente trabalho). Em Entelegynae, a presença de RONs na região terminal de dois a quatro autossomos é o padrão encontrado em cerca de 75% das espécies (Tabela 1). Entre as sete aranhas enteleginas analisadas por nós, esta conservação no número e localização das RONs também foi verificada. Este resultado indica que, de um modo geral, a evolução cariotípica entre as famílias de 74

Entelegynae não está relacionada com grandes alterações na localização e número de RONs. No entanto, dentro de algumas famílias mudanças no número de RONs ou no par cromossômico carregador desta região, podem ter sido importantes para a diferenciação cariotípica, como em Theridiidae, Lycosidae e Ctenidae. Diferentemente do que é observado em Haplogynae, na linhagem das enteleginas, a presença de RONs sobre os cromossomos sexuais ocorreu apenas em representantes de duas famílias Tetragnathidae e Nephilidae (Král et al., 2011, Araujo et al., 2015b), indicando que esta pode ser uma característica compartilhada entre esses grupos, conforme sugerido por Araujo et al. (2015b).

AGRADECIMENTOS Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, FAPESP (2011/19873-9; 2011/21643-1; 2011/50689-0) e pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq, como parte do Programa de Pesquisas em Biodiversidade do Semiárido (558317/2009-0; 457471/2012-3).

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Artigo III

Análise cromossômica em quatro espécies de aranhas Mygalomorphae (Dipluridae, Idiopidae e Theraphosidae) da fauna brasileira

TATIANA GIMENEZ-PINHEIRO1,2, LEONARDO SOUSA CARVALHO3,4, ANTÔNIO DOMINGOS BRESCOVIT5, MARIELLE CRISTINA SCHNEIDER6

1Universidade Estadual do Piauí, UESPI, Campus Heróis do Jenipapo, Av. Santo Antônio, s/n, CEP 64280-000, Campo Maior, Piauí, Brasil. E-mail: [email protected].

2Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular, Instituto de Biociências, Departamento de Biologia, Universidade Estadual Paulista, UNESP, Rio Claro, São Paulo, Brasil.

3Universidade Federal do Piauí, UFPI, Campus Amílcar Ferreira Sobral, BR 343, km 3.5, CEP 64800-000, Floriano, Piauí, Brasil.

4Programa de Pós-graduação em Zoologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, UFMG, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil.

5Laboratório Especial de Coleções Zoológicas, Instituto Butantan, Av. Vital Brasil, 1500, CEP 05503-900, São Paulo, São Paulo, Brasil.

6Universidade Federal de São Paulo, UNIFESP, Departamento de Ciências Biológicas, Av. Prof. Artur Riedel, 275, CEP 09972-270, Diadema, São Paulo, Brasil.

RESUMO A infraordem Mygalomorphae é representada por 16 famílias, 335 gêneros e 2.850 espécies, mas apenas 49 espécies foram cariotipadas, as quais mostraram números diploides bastante discrepantes, como 2n♂=14 (Atypidae e Dipluridae) e 2n♂=128 (Ctenizidae), sistemas cromossômicos sexuais do tipo simples ou múltiplo e morfologia dos cromossomos variando de meta/submetacêntrica a subtelo/acrocêntrica. Com relação as regiões organizadoras de nucléolo (RONs), apenas em 12 espécies foram estudadas, sendo que a maioria revelou marcações na região terminal de cromossomos autossômicos. No Brasil, há apenas seis espécies de Mygalomorphae citogeneticamente investigadas, todas da família Theraphosidae, com informações somente do número diploide. Neste trabalho, quatro espécies de Mygalomorphae, pertencentes as famílias Dipluridae, Idiopidae e Theraphosidae, foram analisadas através de coloração convencional, impregnação pelo íon prata e hibridização in situ fluorescente com sonda de rDNA. Entre as espécies estudadas, Diplura sp. exibiu o maior número diploide, variando de 2n♂=78-94. Idiops sp. e Acanthoscurria natalensis apresentaram 2n♂=51-57 e 2n♂=41-49, respectivamente, e Oligoxystre caatinga mostrou 2n♂=22. Apesar dessa grande diferença de número cromossômico, nas quatro espécies os genes de rDNA 18S apareceram localizados apenas em um par de cromossomos autossômicos.

Palavras-chave: Araneae, citogenética, número diploide, região organizadora de nucléolo, rDNA 18S

INTRODUÇÃO Mygalomorphae é a infraordem das aranhas conhecidas popularmente como aranhas caranguejeiras, tarântulas, tecelãs de alçapão e túnel, e inclui 16 famílias, 335 gêneros e 2.850 espécies distribuídas em todas as regiões biogeográficas. No Brasil, encontramos 11 famílias com 311 espécies (Coddington & Levi, 1991; World Spider Catalog, 2015). As migalomorfas são caracterizadas pela presença de segmentação abdominal não aparente externamente, seis ou menos fiandeiras localizadas na extremidade do abdômen, e garra das quelíceras articuladas no mesmo plano que o eixo longitudinal do corpo (quelíceras ortognatas). Morfologicamente a monofiletismo das espécies desta infraordem baseia-se principalmente nos caracteres da fiandeira e genitais masculinos (Coddington & Levi, 1991). Até recentemente, as informações cariotípicas de Mygalomorphae estavam restritas a apenas 19 espécies, incluídas em seis diferentes famílias (Painter, 1914; Suzuki, 1949, 1950, 1954; Hetzler, 1979; Srivastala & Shukla, 1986; Akan et al., 2005; Vitková et al., 2005; Řezač et al., 2006; Král et al., 2011). No entanto, em 2013 Král e colaboradores. preencheram uma grande lacuna no conhecimento citogenético deste grupo, publicando dados para mais 30 espécies, pertencentes a todas as famílias de Mygalomorphae que ainda não tinham sido estudadas, com exceção de Actinopodidae. Atualmente, existem 49 espécies de migalomorfas cariotipadas (Araujo et al., 2015), as quais mostram números diploides bastante discrepantes, como 2n♂=14 (Atypidae e Dipluridae) (Řezač et al., 2006; Král et al., 2013) e 2n♂=128 (Ctenizidae) (Král et al., 2013). Porém, a maioria das espécies e/ou famílias exibe uma predominância de números diploides altos, como exemplo, 2n♂=75-110 em Microstigmatidae, 2n♂=77-85 em Hexathelidae, 2n♂=61-76 em Nemesiidae, 2n♂=112-115 em Paratropididae, 2n♂=61 em Idiopidae, e 2n♂= ±80 em Euctenizidae (Hetzler, 1979; Král et al., 2013). Além disso, embora em Mygalomorphae tenham sido descritos sistemas cromossômicos sexuais simples, como o XY e X0, os tipos mais frequentes são aqueles envolvendo múltiplos cromossomos X, como o X1X20, X1X2X30, X1-X130 e X1-X7Y (Painter, 1914; Suzuki, 1949, 1950, 1954; Srivastala & Shukla, 1986; Král et al., 2011, 2013). Nas aranhas migalomorfas, a morfologia dos cromossomos varia de meta/submetacêntrica a subtelo/acrocêntrica (Suzuki, 1954; Řezač et al., 2006; Král et al., 2011, 2013). Neste trabalho, nós analisamos citogeneticamente, através de coloração convencional e diferencial, quatro espécies de Mygalomorphae da fauna brasileira, Diplura sp. (Dipluridae), Idiops sp. (Idiopidae), Acanthoscurria natalensis e Oligoxystre caatinga (Theraphosidae). A família Dipluridae possui 24 gêneros com 188 espécies descritas taxonomicamente, porém, apenas cinco espécies apresentam informações citogenéticas, Diplura cf. petrunkevitchi, com 84

2n♂=90, X1X2X3X40, Euagrus lynceus Brignoli, 1974 2n♂=59, X1X2X3X4X50, Ischnothele caudata Ausserer, 1875 2n♂=14, XY, Ischnothele indicola Tikader, 1969 2n♂=86, X1X20, e

Linothele megatheloides Paz & Raven, 1990 2n♂=86, X1X2X3X4X5X60 (Srivastava & Shukla, 1986; Král et al., 2011, 2013; World Spider Catalog, 2015). Idiopidae, com 22 gêneros e 322 espécies descritas (World Spider Catalog, 2015), possui apenas uma espécie israelense examinada sob o ponto de vista citogenético, Idiops syriacus O.Pickard-Cambridge, 1870, com 2n♂=61 e sistema cromossômico sexual ainda não definido, pois Král et al. (2013) descreveram o sistema como X(?). Theraphosidae é a maior família dentro do grupo das migalomorfas, com 130 gêneros e 979 espécies. Citogeneticamente, este táxon é também o que possui o maior número de representantes caracterizados (18 espécies), os quais evidenciaram número diploide variando entre 2n♀=16 a 2n♂=110, e sistema cromossômico sexual frequentemente múltiplo, dos tipos X1X20, X1X2X30 e X1X2X3X40. As únicas exceções são duas espécies que exibiram sistema sexual simples, do tipo X0 e sete outros representantes, em que o sistema cromossômico sexual não foi identificado (Painter, 1914; Akan et al., 2005; Vitková et al., 2005; Řezač et al., 2006; Král et al., 2011, 2013; Korinkova & Král, 2013; World Spider Catalog, 2015). Nas aranhas migalomorfas, os estudos com relação as regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foram realizadas apenas em 12 espécies, que evidenciaram RONs localizadas na região terminal de um ou dois pares autossômicos, com exceção de duas espécies de Dipluridae, Ischonothele caudata e Linothele megatheloides que exibiram marcação na região subterminal dos cromossomos X e Y, e região intersticial em um cromossomo X pequeno, respectivamente (Král et al., 2011, 2013). Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo localizar o gene ribossomal 18S em espécies pertencentes a três famílias de Mygalomorphae, comparando os dados obtidos com grupos filogeneticamente próximos.

MATERIAIS E MÉTODOS Quatro espécies de Mygalomorphae foram analisadas neste trabalho. As informações sobre o número de indivíduos e as localidades de coleta estão mencionadas na Tabela 1. Os exemplares foram depositados no Laboratório Especial de Coleções Zoológicas, do Instituto Butantan, São Paulo (SP) (IBSP; curador A.D. Brescovit), nas Coleções Taxonômicas da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte (MG) (UFMG; curador A.J. Santos) e Coleção de História Natural da Universidade Federal do Piauí, Floriano (PI) (CHNUFPI; curador M.R.A. Soares).

Tabela 1 – Espécies de Mygalomorphae analisadas citogeneticamente neste trabalho, incluindo o local de coleta no Brasil. CE = Ceará; PI = Piauí. Família/Espécies Número de indivíduos Localidade DIPLURIDAE Diplura sp. 1♂ Ubajara, CE (3°50'50.7"S, 40°53'18.5"W) IDIOPIDAE Floresta Nacional dos Palmares (5°2'54"S, Idiops sp 1♂ 42°35'56"W), Altos, PI THERAPHOSIDAE Acanthoscurria natalensis 1♀ Campo Maior, PI (4°50'16.5''S, 42°11'01''W) Chamberlin, 1917 2♂ Piripiri, PI (4°16'23.5''S, 41°46'39,3''W) 1♂ Teresina (5°2'27"S, 42°45'35"W), PI Oligoxystre caatinga 2♀ Campo Maior, PI (4°50'16.5''S, 42°11'01''W) Guadanucci, 2007 1♀ Nossa Senhora de Nazaré, PI (4°37'45.48''S, 42°10'09.84''W) 2♂ Piripiri, PI (4°16'23.5''S, 41°46'39,3''W) 1♂ Parque Nacional da Serra da Capivara (8°49'48.0"S, 42°33'16.0"W), São Raimundo Nonato, PI

As preparações citológicas foram obtidas a partir das gônadas (testículos ou ovários) de indivíduos adultos. Os exemplares foram dissecados em solução fisiológica (128.3mM NaCl,

16.7 mM Na2HPO4, 19.9 mM KH2PO4). Para obtenção das preparações cromossômicas, as gônadas foram processadas de acordo com a técnica empregada por Araujo et al. (2005), coradas com solução de Giemsa 3% e, posteriormente, impregnadas pelo íon prata, de acordo com Howell & Black (1980), para identificação das RONs ativas. A classificação morfológica dos cromossomos foi feita de acordo com a nomenclatura proposta por Levan et al. (1964). A técnica de FISH foi realizada com sondas de rDNA 18S obtidas por PCR a partir do DNA de Physocyclus globosus (Taczanowski, 1874) (Pholcidae), usando os primers 18S-F 5’ CGAGCGCTTTTATTAGACCA e 18S-R 5’ GGTTCACCTACGGAAACCTT (Forman et al., 2013). As sondas foram marcadas por PCR com 11-dUTP-digoxigenina. A FISH foi realizada seguindo Pinkel et al. (1986), com as modificações descritas por Gimenez-Pinheiro et al. (2015 - artigo submetido). As imagens das células mitóticas e meióticas foram capturadas em um fotomicroscópio óptico Zeiss Imager A2 com objetiva 100 de imersão, optovar 1.6, utilizando o software Axio Vision.

RESULTADOS Diplura sp. (Dipluridae) Um total de 42 células mitóticas e meióticas de macho foram analisadas, as quais mostraram uma variação no número diploide entre 78 e 94 cromossomos (Figura 1). Nos núcleos 86 em metáfase, dois cromossomos grandes que diferiam um pouco em tamanho, foram facilmente visualizados (Figura 1H). Células diplotênicas evidenciaram de 39 a 47 bivalentes, tornando impossível estabelecer o número diploide para esta espécie. Em todos os núcleos em diplóteno, um bivalente extremamente grande, que se destaca em relação aos demais elementos, foi observado (Figura 1B-D). Os cromossomos que constituem este bivalente parecem ser heteromórficos em tamanho, e podem estar associados de forma linear ou em uma configuração semelhante a anel. Células submetidas à impregnação pelo íon prata revelaram RONs ativas na região terminal de dois cromossomos e/ou um bivalente pequeno (Figura 1E-F). No entanto, o número de cromossomos marcados por célula variou de um a dois. Em células paquitênicas, o emprego da técnica de FISH evidenciou marcação fluorescente do rDNA 18S na região terminal de um bivalente, cujos cromossomos estavam totalmente emparelhados (Figura 1G). Em metáfases mitóticas, os cístrons ribossomais ocorreram na região terminal de dois cromossomos pequenos, os quais devem corresponder a um par autossômico (Figura 1H).

Idiops sp. (Idiopidae) A análise de 94 células mitóticas e meióticas de exemplar macho de Idiops sp. evidenciou uma variação no número diploide entre 51 a 57 cromossomos (Figura 2A-C), os quais possuem morfologia predominantemente metacêntrica. Através do estudo do cariótipo foi possível identificar sempre a presença de três pares de cromossomos de tamanho grande, 11 pares de tamanho médio e os demais pequenos. Células mitóticas impregnadas pelo íon prata evidenciaram RONs ativas localizadas sobre a região terminal de um par de cromossomos de tamanho pequeno (Figura 2D-E). A técnica de FISH, com sonda de rDNA 18S, mostrou uma marcação fluorescente em células paquitênicas, e marcações na região terminal de um par de cromossomos metacêntricos de tamanho pequeno em células metafásicas (Figura 2F-G).

Acanthoscurria natalensis (Theraphosidae) O estudo de 74 células em metáfase mitótica de machos e fêmea e em diferentes fases da meiose em machos, revelou número diploide variando entre 41 a 49 cromossomos (Figura 3A- D). A análise do cariótipo mostrou que a maioria dos cromossomos possui morfologia metacêntrica, e que quatro a cinco pares possuem tamanho grande, 11 pares são medianos e os demais são pequenos. Células impregnadas pelo íon prata não evidenciaram marcações características de RONs. No entanto, o emprego da técnica de FISH revelou, em células paquitênicas, uma marcação brilhante na região terminal de um bivalente. No diplóteno, foi 87 possível identificar que os cístrons ribossomais estão localizados na região terminal de um bivalente de tamanho pequeno (Figura 3E-F).

Oligoxystre caatinga (Theraphosidae) Nas metáfases mitóticas de espécimes machos de O. caatinga analisadas foi confirmado o número diploide 2n=22 e o sistema cromossômico sexual do tipo X1Y1+X2Y2 determinado por Paula-Neto (2013) para esta mesma espécie. Nas células testiculares diplotênicas, os bivalentes sexuais X1Y1 e X2Y2 foram reconhecidos pelo fato de se apresentarem como heteromórficos e frequentemente com comportamento diferencial de condensação e/ou coloração em relação aos autossomos. Células mitóticas e meióticas impregnadas pelo íon prata não evidenciaram marcações características de RONs. A técnica de FISH permitiu localizar os genes de rDNA 18S sobre a região terminal de um bivalente autossômico (Figura 4A-C). Nos diplótenos, ficou evidente que o bivalente portador dos cístrons ribossomais é de tamanho pequeno (Figura 4B).

Figura 1 - Células testiculares de Diplura sp. (Dipluridae). A. Metáfase mitótica, em coloração convencional, com 2n=92. B-D. Núcleos em diplóteno, corados com Giemsa, com 39, 40 e 42 bivalentes, respectivamente. A cabeça de seta indica o bivalente de maior tamanho em configuração linear ou semelhante a um anel. E-F. Célula diplotênica corada com Giemsa (E) e impregnada pelo íon prata (F), evidenciando RONs em um cromossomo do bivalente (seta). G-H. Paquíteno e metáfase mitótica, respectivamente, submetidos a hibridização in situ (FISH), exibindo os sítios de rDNA 18S (seta) na região terminal de um bivalente (G) ou de um par cromossômico pequeno (H). Escala=5μm.

Figura 2 - Células testiculares de Idiops sp. (Idiopidae). A-C. Metáfases mitóticas, em coloração convencional, evidenciando 2n=51, 2n=52 e 2n=57, respectivamente. D-E. Célula mitótica corada com Giemsa (D) e impregnada pelo íon prata (E), exibindo RONs na região terminal de dois cromossomos pequenos (seta). Em detalhe o cromossomo portador da RON. F-G. Prófase I inicial e metáfase mitótica, respectivamente, submetidos a hibridização in situ fluorescente, mostrando a marcação do rDNA 18S (seta). Escala=5μm.

Figura 3 - Células testiculares de Acanthoscurria natalensis (Theraphosidae) A-C. Metáfases mitóticas, coradas com Giemsa, evidenciando 2n=41, 2n=45 e 2n=48, respectivamente. D. Metáfase II, com n=22. E-F. Paquíteno e diplóteno, respectivamente, submetidos à hibridização in situ fluorescente, evidenciando a localização dos genes de rDNA 18S (seta). Escala=5μm.

Figura 4 – Células testiculares de Oligoxystre caatinga (Theraphosidae), submetidas a hibridização in situ fluorescente, mostrando a localização dos genes de rDNA 18S (seta). A. Paquíteno. B. Diplóteno. C. Metáfase II. Escala=5μm.

DISCUSSÃO Números diploides altos constituem uma característica comum para as espécies de Mygalomorphae, uma vez que entre os 49 representantes desta infraordem estudados citogeneticamente, 27 evidenciaram número cromossômico maior que 2n♂=50 (Hetzler, 1979; Srivastava & Shukla, 1986; Vítková et al., 2005; Řezač et al., 2006; Král et al., 2011, 2013; Kořínková & Král, 2013). Essa característica difere muito daquela encontrada na infraordem Araneomorphae, grupo das “aranhas verdadeiras”, na qual o maior número diploide registrado foi 2n♂=52 (Walace, 1909). Além disso, as migalomorfas exibem um cariótipo muito mais diferenciado quando comparado com as espécies de Entelegynae, uma linhagem do grupo das araneomorfas que inclui a maior diversidade de espécies de aranhas (cerca de 37.560 espécies). Segundo Král et al. (2013), a grande diversidade cariotípica em Mygalomorphae pode estar relacionada com a menor eficiência na capacidade de dispersão por longas distâncias das espécies, as quais pelo fato de permanecerem isoladas, podem acumular mais rearranjos cromossômicos. Embora no presente trabalho, o número diploide de três espécies (Diplura sp., Idiops sp. e Acanthoscurria natalensis), não tenha sido completamente estabelecido, foi possível verificar que estas também possuem números cromossômicos altos e próximos daqueles já registrados para espécies relacionadas, como 2n♂=90 em Diplura cf. petrunkevitchi (Dipluridae), 2n♂=61 em Idiops syriacus (Idiopidae) e 2n=43-46 em Acanthoscurria gomesiana Mello-Leitão, 1923 (Theraphosidae) (Řezač et al., 2006; Král et al., 2011, 2013). A dificuldade em determinar o número cromossômico mais frequente em preparações cromossômicas de migalomorfas já foi relatada para este grupo (Suzuki, 1949, 1950; Hetzler, 1979; Řezač et al., 2006) e pode ser decorrente de dois fatores: números diploides altos, o que leva a perda cromossômica, e pequena quantidade de células em divisão presente nas gônadas de indivíduos adultos. Conforme constado por Král et al. (2011), o estágio ideal para estudos cromossômicos em aranhas Mygalomorphae é o subadulto, uma vez que em fases mais tardias da vida dos indivíduos não é fácil encontrar células em divisão mitótica ou meiótica. Vale a pena ressaltar que a análise de células em meiose é essencial para estabelecer o tipo de sistema cromossômico sexual em aranhas, especialmente nas Mygalomorphae que possuem sistemas múltiplos, envolvendo diversos cromossomos X. No entanto, para muitas espécies de caranguejeiras da fauna brasileira, o estudo de espécimes subadultos ou jovens é inviável devido as dificuldades na identificação taxonômica dos exemplares. O número diploide e o sistema cromossômico sexual observado nos exemplares de O. caatinga investigados aqui são idênticos aqueles previamente descritos por Paula-Neto (2013) 93 para esta mesma espécie. O número cromossômico 2n♂=22 é um dos menores registrados para a família Theraphosidae, que exibiu 2n♀=16 em Chaetoplema olivaceum (C.L. Koch, 1841) e 2n♂=25 em Idiothele mira Gallon, 2010 (Akan et al., 2005; Král et al., 2013). Esse resultado reforça a ideia de que em Mygalomorphae, uma ampla variação cariotípica pode ocorrer entre representantes de uma mesma família, como em Atypidae com 2n♂=14-46, Ctenizidae com 2n♂=42-128, Dipluridae com 2n♂=14-90, e Theraphosidae com 2n♂=16-110 (Painter, 1914; Suzuki, 1949, 1950, 1954; Hetzler, 1979; Srivastava & Shukla, 1986; Akan et al., 2005; Vítková et al., 2005; Řezač et al., 2006; Král et al., 2011, 2013; Kořínková & Král, 2013). Devido à ausência de muitas células em divisão meiótica, o sistema cromossômico sexual não pode ser determinado para Idiops sp. e Acanthoscurria natalensis. Em Diplura sp., a ocorrência de um bivalente com cromossomos heteromórficos e com comportamento diferencial de emparelhamento na meiose, sugere a presença de um sistema cromossômico sexual do tipo XY. Porém, o estudo de mais exemplares é necessário para confirmar essa ideia. O uso das técnicas de impregnação pelo íon prata e, principalmente, da FISH com sonda de rDNA, nas espécies examinadas neste trabalho, forneceu resultados que permitiram localizar o gene ribossomal maior. Em Mygalomorphae, a identificação das RONs foi registrada para 12 espécies, pertencentes a cinco famílias, as quais revelaram marcações em dois pares autossômicos (Antrodiaetidae, Dipluridae, Mecicobothriidae e Nemesidae), em um par autossômico (Nemesidae e Theraphosidae), em dois pares autossômicos e nos cromossomos sexuais X e Y (Dipluridae), ou em dois pares autossômicos e no cromossomo X (Dipluridae) (Král et al., 2011, 2013). Em Diplura sp., Idiops sp., Acanthoscurria natalensis e Oligoxystre caatinga, apenas um sítio ribossomal, localizado na região terminal de um par autossômico, foi identificado. Esse resultado faz com que a presença de RONs terminais em dois cromossomos represente agora a condição mais frequente para as aranhas Mygalomorphae, ocorrendo em representantes de quatro famílias, Dipluridae, Idiopidae, Nemesidae e Theraphosidae. Porém, dois pares de autossomos portadores de RONs ainda é a característica mais amplamente distribuída entre as famílias da infraordem Mygalomorphae. Assim como observado neste estudo, é interessante ressaltar que as diferenças no número de RONs nos cariótipos das migalomorfas não estão relacionadas com as variações no número diploide, considerando que duas RONs foram observadas tanto em espécies com número diploide baixo, como em O. caatinga (2n♂=22) e Idiothele mira (2n♂=25) quanto naquelas com número diploide alto, como em Diplura sp. (2n♂=78-94) e Iberesia machadoi Decae & Cardoso, 2006 (2n♂=76). O mesmo acontece em espécies portadoras de quatro RONs, 94 como exemplo, Aliatypus californius (Banks, 1896) com 2n♂=27. cf. e D petrunkevitchi com 2n♂=90. Levando em consideração a ocorrência principalmente de número diploide alto e sistema sexual com múltiplos cromossomos X, Král et al. (2013) sugeriram que a evolução cariotípica em Avicularioidea, uma linhagem dentro de Mygalomorphae, ocorreu por duplicação do genoma. No entanto, esta duplicação não foi acompanhada pelo aumento do número de sítios de rDNA, uma vez que espécies com número diploide alto exibem apenas um par portador da RONs. Desta forma, é possível que após a duplicação do genoma, ocorreu uma redução no número de sequências com sítios de rDNA. Esta hipótese pode ser reforçada pelo fato de que em algumas espécies de migalomorfas, grandes constrições secundárias relacionadas as RONs foram observadas por Král et al. (2013), em um ou dois pares autossômicos. Nas espécies analisadas no presente trabalho, os sítios de rDNA não parecem ser maiores do que aqueles encontrados em outras espécies de aranhas (dados pessoais). Assim, análises adicionais que visem elucidar a relação entre a duplicação do genoma em aranhas Mygalomorphae e o número e tamanho das RONs são interessantes de serem realizadas neste grupo.

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5. CONSIDERAÇÕES FINAIS Os resultados obtidos através da análise citogenética das 17 espécies de aranhas estudadas no presente trabalho permitiram verificar que: - Através das análises realizadas em três espécies do gênero Sicarius foi observado a presença de um sistema cromossômico sexual simples, do tipo XY, o qual é inédito para a família Sicariidae, auxiliando no entendimento dos processos de evolução dos cromossomos sexuais em aranhas Haplogynae. - Nas espécies de Sicarius, a comparação entre os resultados obtidos com impregnação com o íon prata e hibridação in situ, revelou que nem todas as marcações de Ag-RON correspondem a sítios de rDNA. Alternativamente, essa incongruência dos dados obtidos com essas duas técnicas pode estar relacionada com a presença de RONs crípticas. - Em Haplogynae, a diversidade do número diploide e sistema cromossômico sexual é acompanhada pela variação no número e localização dos sítios de rDNA. - Nas aranhas do clado Entelegynae, os sítios de rDNA presente nos cromossomos autossômicos corresponde ao padrão mais frequente. No entanto, variação em número e localização das RONs ocorre entre espécies da mesma família. - No grupo Mygalomorphae, a ocorrência de número diploide alto não é condizente com um aumento de sítios de rDNA, uma vez que a presença de duas RONs foi observada em espécies com número cromossômico discrepantes. - Houve um aumento de 1/3 nas informações sobre os sítios de rDNA para os clados de Araneomorphae e Mygalomorphae. Além disso, esse é o primeiro estudo em aranhas onde todas as espécies foram analisadas através da técnica de FISH para a determinação do número e localização do gene de rDNA 18S.

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